DD141836A5

DD141836A5 - Verfahren zur herstellung von polynucleotiden mit bestimmter sequenz

Info

Publication number: DD141836A5
Application number: DD78208919A
Authority: DD
Inventors: Keiichi Itakura
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1977-11-08
Filing date: 1978-11-07
Publication date: 1980-05-21
Also published as: NO783721L; EP0002322A2; IL55893A0; PL210786A1; AU4136078A; ZM9478A1; JPS5473787A; BR7807288A; PT68754A; FR2407939A1; NL7811043A; FI783364A; SE7811459L; OA06003A; DK493678A; DE2848054A1; GB2007670A; LU80483A1; EP0002322A3; ZA786303B

Description

Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden mit bestimmter Sequenz

Anwendungsgebiet der Erfindung; .

Es wird ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden (Oligonucleotiden) mit bestimmter Sequenz nach Kj der sogenannten Triester-s-Methode beschrieben. Das Verfahren eignet sich insbesondere zur Herstellung von Oligodeoxyribonucleotiden. Die Oligodeoxyribonucleotide können in DlIA-Segmente überführt werden, welche sich in Plasma-DNA einbauen lassen, um auf diese Weise das Plasma-DEA mit einem Schlüssel für vorbestimmte Zwecke zu versehen. Hierdurch läßt sich das Plasma-DNA beispielsweise mit einem Schlüssel versehen, der die Synthese von Polypeptidhormonen durch ein Bakterium, beispielsweise durch E. coli, anregt.

Die Erfindung betrifft demnach ganz allgemein Oligonucleotide. Sie bezieht sich auf synthetisch hergestellte Deoxyribonucleinsäure (DEfA). Weiter ist sie auf Oligodeoxyribo-

nucleotide gerichtet, welche Vorläufer für DEiA sind. Ferner betrifft sie Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden mit einer bestimmten Sequenz, und sie ist insbesondere auf Verfahren zur Synthese von Oligodeoxyribonucleotiden gerichtet«

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

Synthesemöglichkeiten für Oligodeoxyribonucleotide mit einer vorgegebenen Sequenz der vier verschiedenen Nucleotide der DHA werden zunehmend wichtiger, da man heute die Möglichkeit hat, in Plasma-DNA verhältnismäßig kurze DNA-Segmente einzubauen, um auf diese Weise das Plasma-DNA mit einem Schlüssel für eine Reihe von Zwecken zu versehen, so daß hierdurch beispielsweise die Bildung von Säugetierpeptidhormonen angeregt wird.

3?ür die obige Synthese hat sich beispielsweise die sogenannte Diester-Methode zur Bildung eines dimeren Nucleotide als gangbar erwiesen, die wie folgt abläuft:

ο ο

O=P-O · R¹

o~ 6

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Der Rest B stellt dabei eine aus Thymin oder geschütztem Adenin, Cytosin und Guanin ausgewählte Gruppe dar, während

2 X eine Schutzgruppe für die 5'-Hydroxylfunktion ist und R eine Schutzgruppe für die 3'-Hydroxylfunktion bedeutet. Durch nachfolgende Kupplung des erhaltenen dimeren Nucleotide mit einem Mononucleotid oder mit längeren Nucleotiden lassen sich immer längere Oligonucleotidketten-aufbauen. Eine wohlüberlegte Auswahl der Reaktanten erlaubt die Bildung von Ketten, bei denen die Gruppe B über die gewünschte Sequenz verfügt. Die Bezeichnung Diester-Methode rührt natürlich von der Tatsache her, daß das gekuppelte Produkt ein Phosphatdiester ist.

__H_ 20 8919

Die Sequenz der Gruppe B ergibt den Schlüssel für DNA. Jede Aminosäure in einem Polypeptid hat daher bekanntlich einen entsprechenden Schlüssel in der DNA₇ die aus einer speziellen Sequenz von drei Nucleotiden besteht. Diese Gruppe aus drei Nucleotiden bezeichnet man als Kodone.

Die Diester-Methode ist für den gewünschten Zweck zwar geeignet, hat jedoch den großen Nachteil, daß bei ihr die Ausbeute mit zunehmender Kettenlänge rasch abfällt, langwierige Reinigungsverfahren erforderlich sind und sich der gesamte Reaktionsablauf nur schwer in einem größeren Maßstab durchführen läßt.

Die Diester-Methode wurde daher durch ein verbessertes Verfahren abgelöst, und hierbei handelt es sich um die sogenannte Triester-Methode. Dieses Verfahren besteht darin, daß man ein_ eine maskierte 3'-Phosphatgruppe aufweisendes Nucleotid mit einem Nucleosid oder einem Nucleotid kuppelt, das eine verfügbare 5'-Hydroxylgruppe aufweist. Formelmäßig läuft dieses Verfahren wie folgt ab:

x-o - ^ß

ex ο.

X-O

Λ ⁶ "V⁰Nl	H -Ο-	β V⁰Nl
Tj	4-	ρ
O j		O I
0=ρ—Ο~ I		R^
I O

Die Substituenten X, B und R„ haben darin die bereits oben angegebenen Bedeutungen, während .es sich beim Substituenten um eine organische Gruppe handelt, durch die die 3'-Phosphat gruppe maskiert wird und die sich durch eine Base abspalten läßt. Am besten handelt es sich bei einer derartigen Gruppe um eine p-Chlorphenylgruppe. ·

-j--' 2 0 8919

Die Bezeichnung "Triester-Methode" rührt davon her, daß es sich bei dem gekuppelten Produkt um einen Phosphattriester handelt.

Bezüglich weiterer Einzelheiten über dieses Verfahren wird verwiesen auf Can. J. Chem. 51, 3649 (1973), J. Biol. Chem. 250, 4592 (1975); Proc. Nat. Ac.ad. Sei. USA, 91 (1976) und J. Am. Chem. Soc. 97, 7327 (1975).

Die Triester-Methode stellt zwar eine beachtliche Verbesserung gegenüber der Diester-Methode dar, hat jedoch den lachteil, daß sie unter einer verhältnismäßig niedrigen Gesamtausbeute verläuft, da jeder Block an Oligodeoxyribonucleotid nach seiner Bildung einer umfassenden chromatographischen Reinigung unterzogen v/erden muß. Diese Reinigung ist für eine Abtrennung des gekuppelten Produkts von der nichtumgesetzten 5^f~Hydroxylkomponente notwendig. .Gelegentlich ist auch noch eine weitere chemische Reaktion und Reinigung erforderlich, damit man ein gekuppeltes Produkt erhält, das über eine für die weiteren Kupplungsreaktionen ausreichende Reinheit verfügt.

Ziel der Erfindung;

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur chemischen Synthese von Oligonucleotiden, insbesondere Oligodeoxyribonucleotiden, zu schaffen, durch das sich synthetische Oligodeoxyribonucleotide günstiger herstellen lassen.

Darlegung, des Wesens der Erfindung:

Diese Aufgabe wird in der im folgenden angegebenen Weise erfindungsgemäß gelöst.

Die Erfindung ist dabei insbesondere auf eine Verbesserung der sogenannten Triester-Methode zur Synthese von Oligonucleotiden gerichtet, die über eine Sequenz von Nucleotideinheiten verfügen und bei denen die Basisgruppen in Abhängigkeit

-6- £ U 0 7 ϊ

von der jeweils gewünschten Sequenz verschieden sind. Diese Verbesserung wird erreicht, indem man als ersten Baustein ein eine maskierte 3'-Phosphatdiestergruppe aufweisendes Nucleotidemit einem eine verfügbare freie 5'-Hydroxylgruppe aufweisenden Nucleosid oder Nucleot.id als zweitem Baustein kuppelt und dabei den ersten Baustein in einem wesentlichen Molüberschuß einsetzt. Bei der Kupplungsreaktion, die in Lösung durchgeführt wird, werden herkömmliche Kupplungsmittel verwendet. .

Durch Arbeiten mit einem wesentlichen Überschuß des ersten Bausteins wird der zweite Baustein vollständig oder praktisch vollständig verbraucht. Da es sich beim ersten Bauteil um ein geladenes Molekülteil handelt, läßt sich- das durch die Kupplungsreaktion gebildete gewünschte Produkt ohne weiteres aus dem Reaktionsgemisch abtrennen. Ausführun:'sb ei spiele : .

.Die Erfindung wird anhand der Zeichnung weiter beschrieben. In ihr zeigen:

Figur 1 erfindungsgemäß geeignete Reaktanten,·

Figur 2-4 erfindungsgemäße Reaktionsabläufe, nach denen sich Di-, Tri- und höhere Oligonucleotide herstellen lassen.

Wie bereits erwähnt, ist die Erfindung auf eine Verbesserung der sogenannten Triester-Methode zur Synthese von Oligonucleotiden gerichtet, bei denen die die Oligonucleotidkette bildenden Nucleotide in einer vorgegebenen Sequenz variieren. Die bevorzugte Triester-Synthese besteht in einer Kupplung zweier kleiner Fragmente, nämlich einem Nucleotid mit einer maskierten, jedoch reaktionsfähigen 3'-Phosphatdiestergruppe •und einem Nucleosid oder Nucleotid mit einer verfügbaren freien 5 '-Hydroxylgruppe, in Gegenwart herkömmlicher Kupplungsmittel, wie 2,4,6-Triisopropylbenzolsulfonyltetrazolid, in Lösung. Pyridin ist dabei das Lösungsmittel der Wahl. Bei

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den. beiden verwendeten Reaktanten kann es sich selbstverständlich bereits um Oligonucleotide handeln, die sich unter Bildung einer.längeren Oligonucleotidkette kuppeln lassen.

Das herkömmliche Verfahren besteht im Einsatz der Reaktanten in stöchiometrischer oder nahezu stöchiometrischer Menge. Eine solche Maßnahme führt jedoch, wie bereits erwähnt, zu einem Reaktionsgemisch, aus dem sich das gewünschte Produkt nur schwer abtrennen läßt. Die bei der Abtrennung auftretende Schwierigkeit ist weitgehend eine Folge der Tatsache, daß die Reaktanten bei der Reaktion nicht vollständig verbraucht werden. Infolgedessen enthält das Reaktionsgemisch den reaktionsfähigen Baustein mit der freien 5'-Hydroxylgruppe sowie das gewünschte Produkt. Bei beiden handelt es sich um neutrale Verbindungen, die häufig schwierig voneinander zu trennen sind.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß sich eine derarti-" ge Kupplungsreaktion sogar in Lösung bis zur vollständigen oder praktisch vollständigen Beendigung in bezug'auf den die verfügbare 5'-Hydroxylgruppe aufweisenden Baustein führen läßt, wenn man mit einem ziemlichen Überschuß des anderen Bausteins arbeitet. Das bei einer derartigen Durchführung der Umsetzung er-.haltene Reaktionsgemisch enthält als einzig wesentliche Produkte das gekuppelte Produkt und den nichtumgesetzten Baustein mit der maskierten 3'-Phosphatdxestergruppe. Nachdem es sich bei letzterem um ein geladenes Produkt handelt, läßt sich dieses ohne weiteres von dem bei der Kupplungsreaktion anfallenden nicht geladenen Produkt abtrennen.

Die Triester-Methode läßt sich am besten zur Synthese von Oligonucleotiden einsetzen, welche man durch Entfernung der zum Schutz der verschiedenen möglichen raktionsfähigen Stellen vorhandenen Schutzgruppen in OligodeoxyribGnucleinsauren mit bestimmten Sequenz überführen kann. Das erfindungsgemäße Verfahren wird daher im einzelnen im Zusammenhang mit entsprechenden Versuchsbeispielen zu entsprechenden Oligodeoxyribonucleotiden weiter beschrieben. In für den Fachmann selbstverständlicher

-β- 208919

Weise läßt sich die gleiche Reaktion jedoch auch zur Herstellung von Olxgoribonucleotiden verwenden, wenn man durch geeignete Maßnahmen„die bei Oligoribonucleotiden vorhandene 2'-Hy- droxylgruppe entsprechend schützt.

Im einzelnen geht aus Figur 1 eine Formel I und eine Formel II hervor, nämlich Mononucleotide und Oligonucleotide, die sich beim erfindungsgemäßen Verfahren als Bausteine mit maskierter 3'-Phosphatdiestergruppe einsetzen lassen. Bei der Gruppe B-handelt es sich hierbei um Thymin oder geschütztes Adenin, Cytosin oder Guanin. Thymin, Adenin, Cytosin und Guanin sind natürlich die vier Grundgruppen, die die Nucleotidfragmente in einer Deoxyribonucleinsäure (DNA) unterscheiden. Adenin und Cytosin sind dabei zum Schutz ihrer freien Aminogruppe am besten bezoyliert, während die Aminogruppe von Guanin gewöhnlich durch eine Isobutyrylgruppe geschützt ist. Thymin verfügt über keine freie Aminogruppe, so daß es auch nicht derart geschützt werden braucht.

Die Gruppe X in den Formeln I und II ist eine Schutzgruppe für aas 5'-Hydroxyl, und es handelt sich dabei um eine organische Gruppe. Vorzugsweise ist die Gruppe durch ein mildes saures Medium entfernbar. Beispiele für derartige Gruppen sind Tetrahydropyranyl, 1-Methoxycyclohexyl, 4-Monomethoxytrityl und 4,4'-Dimethoxytrityl. 4,4'-Dimethoxytrityl wird hiervon am meisten bevorzugt, und es läßt sich durch ein mildes saures Medium, beispielsweise durch 2-prozentige Benzolsulfonsäure, ohne weiteres abspalten.

Der Substituent R ist eine Maskiergruppe für die 3'-Phosphatgruppe. Vorzugsweise läßt sich dieser Substituent mit ei- ' nem basischen Medium entfernen. Beispiele derartiger Gruppen sind Phenyl, o-Chlorphenyl,' 2,4-Dichlorphenyl urid Thiophenyl. Eine besonders bevorzugte Gruppe ist p-Chlorphenyl. Bei der Formel II steht der Index η für O oder eine ganze Zahl. Die Formel II umfaßt daher dimere und höhere Oligonucleotide.

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Bei den Formeln III und IV von Figur I handelt es sich um Nucleoside und Nucleotide unter Einschluß von Oligonucleotiden, die sich als'reaktionsfähiger Baustein mit der. verfügbaren 5'-Hydroxylgruppe verwenden lassen. Bei den Formeln III und IV hat der Substituent B die oben angegebene Bedeutung,

während es sich bei dem Substituenten R entweder um eine in einem basischen Medium abspaltbare Schutzgruppe für die 3'-Hydroxylgruppe oder um eine gewöhnlich ebenfalls in einem basischen Medium abspaltbare Gruppe der Formel

O=P-O-R³

worin R die oben angegebene Bedeutung besitzt und R eine

3

abspaltbare Gruppe bedeutet, handelt. Der Substituent R ist vorzugsweise eine Gruppe, die sich ohne Entfernung der

12 Gruppen R und R selektiv abspalten läßt. Im einzelnen wird hierzu auf J. Am. Chem. Soc. 97, 7327 (1975) verwiesen. Eine besonders leicht abspaltbare Gruppe ist eine ß-Cyanoethylgruppe, und diese Gruppe ist daher die Gruppe der Wahl für den Substituenten R . Als derartige Gruppen sind jedoch auch 1-Methyl-3-ketobutyl und 2,2,2-Tribromethyl (unter Verwendung

von Zink abspaltbar) geeignet. Die Gruppe R ist vorzugsweise Benzoyl, stattdessen sind jedoch auch andere Gruppen geeignet, wie beispielsweise Acetyl, p-Methoxybenzoyl oder Monochloracetyl. Bei der Formel IV steht η für 0 oder eine ganze Zahl, so daß hiervon dimere und höhere Oligonucleotide umfaßt werden.

Beim vorliegenden Verfahren geeignete Kupplungsmittel sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugt wird hierzu das bereits erwähnte 2,4, 6-Ti"iisopropylbenzolsulfonyltetrazolid. Weitere geeignete Kupplungsmittel sind p*-Nitrobenzolsulfonyltriazolid, Benzolsulfonyltriazolid, Benzolsulfonyl-4-nitroimidazolid, 2,4,6-Trimethylbenzolsulfonyltetrazolid, 2,4,6-Triisopropylbenzolsulfonylchlorid und 2,4,6-Trimethylbenzolsulfonylchlorid.

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Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird, wie bereits angegeben, der erste Baustein mit einer maskierten 3'-Phosphatdiestergruppe in einer Molmenge eingesetzt, die wesentlich über der Molmenge des zweiten Bausteins mit der freien 5'-Hydroxylgruppe liegt. Die jeweils zu verwendende Menge kann je nach der Art der Reaktanten verschieden sein, es wird jedoch in jedem Fall mit einer Menge des ersten Bausteins-gearbeitet, der für einen praktisch vollständigen Verbrauch des zweiten Reaktanten ausreicht; Das Kupplungsmittel wird in einer molaren Menge eingesetzt, d.h. einer Menge, die mit der Menge des ersten Bausteins wenigstens etwa gleich ist, wobei man vorzugsweise mit einer Molmenge hiervon arbeitet, die wenigstens das zweifache der Molmenge des ersten Bausteins ausmacht.

Der relative Überschuß des ersten Bausteins, den man zum Verbrauch des zweiten Bausteins braucht, erhöht sich mit zunehmender Kettenlänge der bei der Kupplungsreaktion verwendeten Nu- · cleotide. Zwar läßt sich somit nach diesen Verfahren theoretisch jede Kettenlänge herstellen, die praktische obere Grenze für die durch Kupplung kürzerer Fragmente erhältliche Kettenlänge liegt jedoch bei etwa 21 Nucleotideinhexten. Diese praktische obere Grenze ist ferner auch eine Funktion dessen, wie schwierig sich die entsprechenden Schutzgruppen vom maskierten Phosphat mit zunehmender Kettenlänge des Oligonucleotids entfernen lassen. Gewöhnlich beträgt das Molverhältnis'aus dem ersten Baustein zu dem zweiten Baustein wenigstens etwa 2:1. Dieses Molverhältnis kann natürlich auch größer sein, es braucht jedoch beispielsweise nicht einmal dann bei über etwa 4:1 liegen, wenn man ein Fragment, das bis zu.etwa 18 Nucleotideinhexten enthält, kuppelt. .

Die bis zu einem praktisch vollständigen Verbrauch des zweiten Bausteins erforderliche Reaktionszeit ist ebenfalls abhängig von der Art der Reaktanten, und sie stellt insbesondere eine Funktion der Kettenlänge der zu kuppelnden Nucleotideinheiten dar. Eine Kupplung unter Bildung dimerer Nucleotide kann daher gewöhnlich innerhalb von 60 Minuten oder weniger beendet sein. Im Gegensatz dazu können zu einer Kupplung zweier trimerer Blöcke bis zur Beendigung der Reaktion drei oder mehr Stunden erforderlich sein. Die jeweils geeignete Reaktionszeit läßt sich ohne weiteres bestimmen, da man den Fortgang der Umsetzung ohne weiteres beispielsweise durch Dünnschichtchromatographie überwachen kann.

Der große Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Leichtigkeit, in der sich das Reaktionsgemisch zu einem reinen oder praktisch reinen gekuppelten Produkt auftrennen läßt. Dieser Vorteil ergibt sich_durch die Tatsache, daß die beiden Komponenten des Reaktionsgemisches das gekuppelte Produkt sind, nämlich eine neutrale Verbindung, während der nicht-. umgesetzte erste Baustein eine geladene Verbindungsart darstellt. Ist die jeweilige geladene Verbindungsart in Wasser löslich, dann läßt sie sich von dem gekuppelten Produkt durch einfache Extraktion unter Verwendung eines wäßrigen Extraktionsmittels, beispielsweise wäßriger Natriumbicarbonatlösung, abtrennen. Hat man es dagegen mit einem Reaktonsgemisch zu tun, bei dem die geladene Verbindungsart nicht in Wasser löslich ist, dann läßt sich das jeweilige gekuppelte Produkt nach einer anderen Technik abtrennen, beispielsweise durch Kurzsäuienchromatographie über Silicagel.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel"! Synthese von Di- und Trinucleotiden

Die Figuren 2 und 3 besehreiben den Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Di- und Trideoxyribonucleotiden. Als Kupplungsmittel wird das bevorzugte Triisopropylbenzolsulfonyltetrazolid (TPSTe) verwendet. Die 5'-Hydroxylgruppe wird mit der 4,4'-Dimethoxytritylgruppe (DMTr) geschützt. Bei den durchgeführten Reaktionen ist der Substituent R_ entweder Benzoyl

(Gruppe b) oder die Gruppe

O=P-OCH₂CH₂CN

(Gruppe a), während als Lösungsmittel für die Kupplungsreaktionen Pyridin eingesetzt wird.

Nach Figur 2, gemäß der mit einem Überschuß der Verbindung 1 (2 mM) gearbeitet wird, ist die Kupplungsreaktion mit der Verbindung 2 (1 mM) innerhalb von etwa 60 Minuten praktisch vollständig beendet, wenn man als Kupplungsmittel TPSTe (4 mM) verwendet, wodurch ein Reaktionsgemisch entsteht, das das Kupplungsprodukt 3 im Gemisch mit nichtumgesetzter Verbindung 1 enthält. •Das Reaktionsgemisch wird dann zur Abspaltung der 4,4'-Dimethoxy-•tritylgruppen von den Verbindungen 1 und 3 10 Minuten bei 0 ⁰C mit 2-prozentiger Benzolsulfonsäurelösung behandelt, wodurch man zu den Verbindungen 4 und 5 gelangt. Aufgrund der Entfernung der Schutzgruppe ist die Verbindung 4 in wäßriger Natrxumbicarbonatlösung löslich. Die Verbindungen 4 und 5 lassen sich daher durch einfache Extraktion der Verbindung 4 aus Chloroform unter Verwendung einer wäßrigen Natrxumbicarbonatlösung voneinander trennen.

Das in der Chloroformlösung befindliche 5'-Hydroxyldinucleotid der Formel 5 wird dann aus Ether ausgefällt, wodurch man zu einem homogenen farblosen Produkt gelangt, das durch Dünnschicht- Chromatographie über Silicagel identifiziert wird. Möchte man beim gekuppelten Produkt die 4,4'-Dimethoxytritylgruppe beibehalten, dann läßt sich der Reaktant 1 selbstverständlich vom gekuppelten Produkt 3 säulenchromatographisch unter Verwendung von beispielsweise Silicagel als feste Phase abtrennen.

In Figur 3 wird die Herstellung-des vollständig geschützten Trimerblocks 6 ausgehend vom Dinucleotid 5 (1 mM) und der Verbindung 1(2 mM) in Gegenwart von TPSTe (4 mM) beschrieben. Die Abtrennung von 1 erfolgt durch KurzSäulenchromatographie über Silicagel. Das hierbei nach Abtrennen erhaltene Produkt erweist sich sowohl durch Dünnschichtchromatographie über . Silicagel als auch nach Abtrennung der Schutzgruppen durch Dünnschichtchromatographie über Cellulose als homogen. Die Ausbeuten der erhaltenen vollständig geschützten Trimeren 6, bezogen auf die als Ausgangsmaterial verwendeten Verbindungen 2, gehen aus der folgenden Tabelle I hervor. Hieraus ergibt sich, daß die erfindungsgemäße Abwandlung der Triester-Methode unter Verwendung eines Überschusses der 3'-Phosphodiesterverbindung 1 im Vergleich zur herkömmlichen Triester-Methode sowohl zu einer Erhöhung der Gesamtausbeute als auch zu einer Abnahme der Arbeitszeit um wenigstens einen Faktor führt.

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Tabelle

Ausbeuten	an vollständig	geschützten Triineren	(VI)	Ausbeute
Sequenz	Ausbeute	Sequenz	69 %
TTT(b)	81 %	ATG(b)	61 %
TTT(a)	75 %	GCC(a)	72 %
GGA(a)	41 % .	CCA(a)	72 %
AGA(a)	49 % ·	" CAA(a)·	71 %
ATC(a)	71 %	TTA(a)	52 %
CCT(a)	61 %	CAT(a)	73 %
ACA(a)	63 %	CCC(a)	59 %
ACC(a)	65 %	AAC(a)	60 %
CGT(b)	51 %	GAT(a)

Die- Identität des Nucleotids ist in jeder Sequenz durch den großen Buchstaben gekennzeichnet, der den Substituenten B bedeutet. Durch den jeweils in Klammern befindlichen kleinen Buchstaben wird die Gruppe R gemäß obiger Definition angegeben.

Die Möglichkeit zur Synthese von Trinucleotxdblöcken in hoher Ausbeute nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist insofern von besonderer Bedeutung, da durch die saubere Anordnung von Trimerblöcken in der DNA ein Schlüssel aufgegeben wird, der die Bildung einer speziellen Aminosäure als Teil einer Polypeptidkette anregt. So regt beispielsweise der Block TTT die Bildung von Phenylalanin an. In ähnlicher VJeise stimuliert der Block. GGA die Bildung von Glycin. Die durch das erfindungsgemäße Verfahren gebildeten Trimerblöcke können.demnach der Reihe nach unter Bildung eines Oligonucleotids gekuppelt werden, das nach Entfernung von

- Λ5-

Schutzgruppen ein DNA-Molekül bildet, welches bei entprechend sauberem Einbau in Plasma-DNA die Bildung einer Polipeptidkette stimuliert, welche über eine jeweils gewünschte Sequenz an Aminosäuren verfügt. Die Kupplung von Trimerblöcken unter Bildung längerer Oligonucleotide mit vorgegebener Sequenz geht aus folgendem Beispiel 2 hervor.

Beispiel 2 Synthese von Oligodeoxyribonucleotiden

Figur 4 zeigt die Synthese von Oligodeoxyribonucleotiden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. Hiernach läßt sich die Kupplung eines Überschusses an 3'-Phosphodiestertrimerblock X (n = 1, 1,5 mM) mit dem 5' -Hydroxyl tr interblock Y (m = 1, 0,5 mM) in Gegenwart von TPSTe (3 mM) in Pyridin als Lösungsmittel innerhalb von etwa 3 Stunden praktisch zuendefuhren.

Versuche zur Entfernung des nichtumgesetzten Ausgangsmaterials X vom Produkt Z, bei dem es sich um ein Hexamer handelt, durch Schütteln des Reaktionsgemisches mit einem Ionenaustauscherharz, wie Dowex 1-X8 und DEAE-Cellulose, in verschiedenen flüssigen organischen Lösungsmitteln unter anschließender Filtration verlaufen ohne Erfolg, da sich hierbei der Reaktant X nicht vollständig entfernen läßt. Die zugesetzte Komponente X läßt sich jedoch entfernen, wenn man das Reaktionsgemisch durch eine sehr kurze (3 cm lang) und weite (7 cm Durchmesser) Silicagelsäule führt.

Die Säule wird zur Eluierung von Nebenprodukten und dem Kupplungsreagens zuerst mit Chloroform (100 ml) gewaschen,.

worauf man sie zur praktisch vollständigen Elution des ganz geschützten Hexamers Z mit einem polareren Lösungsmittel, nämlich mit CHCl₃-MeOH (95:5 V/V, 250 ml) eluiert. Die geladene Komponente X bleibt dabei auf der Säule.

¹ Durch Eindampfen der das Hexamer enthaltenden Fraktion gelangt man zu einem farblosen Feststoff, aus dem man durch Behandeln mit 2-prozentiger Benzolsulfonsäurelösung in CHCl_-MeOH (7:3 V/V) zur Entfernung der 5'-Hydroxylschutzgruppe eine Verbindung Y (m = 4) erhält. Dieses Hexamer läßt sich aus Ether ausfällen, und es kann ohne weitere Reinigung für eine spätere Kupplungsreaktion verwendet werden.

Durch viermalige Wiederholung des obigen Verfahrenszyklus, nämlich unter aufeinanderfolgender Umsetzung einer Verbindung X, worin η für 1 steht, mit jeweils einer Verbindung Y, worin m für 1,4, 7 und 10 steht, erhält'man das vollständig geschützte Pentadecamer Z (n=1,m=12) in Gesamtausbeuten von etwa 40 bis 50 % aus dem 5'-Hydroxyltrimerblock Y (m = 1) in lediglich etwa 4 Tagen. Das Endprodukt, nämlich das Pentadecamer, wird nach Entfernen aller Schutzgruppen durch.Hochdruckflüssigchromatographie gereinigt. Auf diese Weise werden die Oligonucleotide d (Tp)₁₄T und d ÄpCpApCpCpCpApAp GpApCpCpCpGpT und d_ TpTpTpGpTpCpApApTpCpApGpGpApC synthetisiert.

Die Struktur der Pentadecameren wird durch Homochromatographie auf Dünnschicht-DEAE-Cellulose und durch Gelelektrophorese auf einer 20-prozentigen Acrylamidplatte nach Inkubation der Penta-

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decameren mit /gamma- P_/-Adeno;

von T4-Phosphokinase bestätigt.

32

decameren mit /gamma- P/-Adenosin-5'-triphosphat in Gegenwart

Weiter unterzieht man die markierten Produkte einem Teilabbau mit Venomphosphodiesterase und unterwirft die dabei erhaltenen Verdauungsprodukte einer zweidimensionalen Homochromatographie, wodurch sich das erwartete Sequenzrauster für die beiden Penta-. decameren ergibt.

ζ υ ο y ι

Die nach obigem Beispiel erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß Kupplungsreaktionen zwischen einem kurzen Oligomerblock (dem Trimer X, η = 1) und längeren Oligomerblöcken unter Verwendung eines Überschusses an Trimerblock praktisch vollständig ablaufen und daß sich hiernach höhere Oligomere rasch und ohne Notwendigkeit der Vornahme umfangreicher Reinigungsstufen bei den entsprechenden Zwischenprodukten synthetisieren lassen. Durch entsprechende Auswahl der bei den jeweiligen aufeinanderfolgenden Kupplungsreaktionen eingesetzten Trimerblöcke lassen sich rasch Oligonucleotide herstellen, die Kodone für spezielle Aminosäuren in einer gewünschten Sequenz enthalten.

Claims

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Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden mit bestimmter Sequenz durch Kupplung eines eine maskierte 3'-Phosphatdiestergruppe aufweisenden Nucleotide als erstem Baustein mit; einem eine verfügbare freie 5'-Hydroxylgruppe enthaltenden' Nucleosid oder Nucleotid als zweiten Baustein in Gegenwart eines Kupplungsmittels, dadurch gekennzeichnet, daß man den ersten Baustein gegenüber dem zweiten Baustein in einem ziemlichen molaren Überschuß einsetzt.
2. Verfahren nach Punkt 1, d a-d u r ch g e kennzeichnet, daß der zweite Baustein während der Kupplungsreaktion praktisch vollständig verbraucht wird.
3. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekenn zeichnet , daß man bei einem Molverhältnis von erstem Baustein zu zweitem Baustein von wenigstens etwa 2:1 arbeitet.
4. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekenn zeichnet , daß man die Kupplungsreaktion in Lösung durchführt.
5. Verfahren nach Punkt 4, dadurch gekennzeichnet , daß man als Kupplungsmittel Triisopropylbenzolsulfonvltetrazolxd verwendet.

-13-
6. Verfahren nach Punkt 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kupplungsreaktion in Pyridin als Lösungsmittel durchführt.
7. Verfahren nach Punkt 1, da d u r c h g e k e η η zeichnet , daß man als ersten Baustein eine Verbindung der Formel

TI

I
O=P-O"

und als zweiten Baustein eine Verbindung der Formel

HO

und/oder

verwendet, worin

gleich oder verschieden ist und für Thymin oder geschütztes Adenin, Cytosin oder Guanin steht,

eine in einem saurem Medium stabile organische Gruppe bedeutet,

eine in einem basischen Medium, labile organische Gruppe darstellt, . .

für in einem basischen Medium labile organische Gruppen und Gruppen der Formel -

Il

-P-O-R ι

R¹ .

steht, worin
R¹

obige Bedeutung hat und

eine in einem basischen Medium unter Bedingungen,

die zu keiner Entfernung der Gruppen R und

R führen, labile Gruppe darstellt und

die Indizes
η sowie m

unabhängig voneinander 0 oder eine ganze Zahl bedeuten. .
8. Verfahren nach Punkt 7, dadurch gekennzeichnet , daß X Tetrahydropyrenyl, 1-Methoxycyclohexy1, 4-Monomethoxytrityl und/oder 4,4'-Dimethoxytrityl ist.
9. Verfahren nach Punkt 8, dadurch gekennzeichnet, daß X 4,4'-Dimethoxytrityl ist.
10. Verfahren nach Punkt η _t dadurch gekenn-

2
zeichnet , daß R unabhängig Phenyl, o-Chlorphenyl, 2,4-Dichlorphenyl, p-Nitrophenyl, 2,2,2-Trichlorethyl und/oder p-Chlorphenyl bedeutet,
11. Verfahren nach Punkt 10, dadurch gekennzeichnet,, daß R für p-Chlorphenyl steht.
12. Verfahren nach Punkt 7, dadurch geken. n-

· ' 2

zeichnet , daß es sich bei R um eine der folgenden in einem basischen Medium labile Gruppe handelt:. Acetyl,

p-Methoxybenzoyl, Monochloracetyl, 2,2,2-Tribroinethyl

und/oder

CH

und/oder Benzoyl. 3
13. Verfahren nach Punkt 12, d a d u rc h gekenn-

2 -

zeichnet, daß R für Benzoyl steht.
14. . Verfahren nach Punkt 7, dadurch gekenn-

2

zeichnet, daß R für ,

O=P-O-R³ I
0

und R³ für -0-CH₂CH₂CN steht.
15. Verfahren nach Punkt 14, dadurch gekennzeichnet , daß R für p-Chlorphenyl steht.
16. Verfahren nach Punkt η _t dadurch gekennzeichnet , daß man als Kupplungsmittel Triisopropylbenzolsulfonyltetrazolid verwendet, X für 4,4'-Dimethoxytrityl steht. R für p-Chlorphenyl steht, :
von 1, 4, 7 und 10 bedeutet.

R für p-Chlorphenyl steht, η für 1.steht und m eine ganze Zahl
17. Verfahren nach Punkt Λ§, dadurch gekenn-

ze i c h η e t , daß R für Benzoyi steht.

- 33-

2 0 8919
18.. Verfahren nach Punkt 16, dadurch gekenn-

zeichnet , daß R für .

. . \ ' . ' '

O=P-O-CH₂CH₂CN

steht.

Hierzu 4- Seiten Zeichnungen