DE3881691T2 - Polydeoxyribonukleotide, pharmazeutische zusammensetzungen, verwendung und herstellung von polydeoxyribonukleotiden. - Google Patents

Polydeoxyribonukleotide, pharmazeutische zusammensetzungen, verwendung und herstellung von polydeoxyribonukleotiden.

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Description

  • Die Erfindung betrifft Polydesoxyribonucleotide mit 8 oder mehr Desoxyribonucleosideinheiten, die über Phosphatgruppen miteinander verbunden sind.
  • Alle lebenden Organismen enthalten Desoxyribonucleinsäure (DNA) in Form großer Moleküle, die aus als Desoxyribonucleoside bezeichneten Einheiten aufgebaut sind. Jede Desoxyribonucleosideinheit besteht aus einem Zuckermolekül, nämlich β-D-2-Desoxyribofuranose, an deren C¹-Atom eine Base aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin, Thymin und Cytosin über das N&sup9;-Atom von Adenin oder Guanin oder das N¹-Atom von Thymin oder Cytosin gebunden ist. In der polymeren DNA sind die Desoxyribonucleosideinheiten über Phosphatgruppen zwischen der 3'-OH-Gruppe eines Nucleosids und der 5'-OH-Gruppe des anderen Nucleosids verbunden. Die Untereinheiten der polymeren DNA, die aus einer Phosphatgruppe, einem Zuckermolekül und einer Base bestehen, werden Desoxyribonucleotide, oder kurz Nucleotide, genannt. Die polymere DNA dient in allen Lebewesen als Träger der genetischen Information, die durch die Reihenfolge (oder Sequenz) der Basen im Molekül bestimmt wird.
  • Seit den Strukturanalysen von Watson und Crick in den frühen 50er Jahren war es klar, daß DNA in der Natur in Form einer Doppelhelix (oder Duplex) vorkommt, die aus zwei Strängen besteht, die durch Wasserstoffbindungen zwischen komplementären Basen zusammengehalten werden, d.h. zwischen A und T und zwischen G und C. Seither wurden verschiedene Duplexformen von DNA bekannt, unter denen die von Watson und Crick gefundene D-Form am besten bekannt ist. Unter anderem ist die Tatsache charakteristisch, daß die zwei komplementären Stränge in gegenseitige Richtung verlaufen, d.h. antiparallel sind. Die Stabilität der Duplex-Struktur wird durch verschiedene Faktoren bestimmt, wie z.B. die Länge der Duplex- Struktur, das Verhältnis zwischen der Zahl der C-G-Paare (jedes Paar hat 3 Wasserstoffbindungen) und der A-T-Paare (jedes Paar hat nur 2 Wasserstoffbindungen), die Basensequenz und die elektrostatische Abstoßung der Phosphatgruppen, die unter physiologischen Bedingungen eine negative Ladung tragen. Die elektrostatische Wechselwirkung zwischen den Phosphatgruppen und den anorganischen Kationen, wie z.B. Mg²&spplus;, oder basischen Proteinen, wie z.B. den Histonen, führt zu einer höheren Stabilität der Duplex-Struktur. Ein Maß für die Stabilität der Duplex-Struktur ist die Schmelztemperatur Tm, die bestimmt werden kann, indem man die Absorption bei 260 nm gegen die Temperatur aufträgt. Ein hoher Tm-Wert zeigt eine hohe Stabilität der Duplex-Struktur an.
  • Inzwischen wurden verschiedene Methoden entwickelt, mit denen DNA- Moleküle synthetisiert werden können. Eine elegante, automatisch durchführbare Methode verwendet einen Träger aus einem geregelten Porenglas (CPG), an den ein erstes Nucleosid über einen Spacer kovalent gebunden ist. Dieses Nucleosid ist über die 3'-OH-Gruppe gebunden und besitzt eine durch die säurelabile Di-p-Methoxytrityl (DMTr)-Gruppe geschützte 5'-OH- Gruppe. Dazu wird in ebensoviel Zyklen eine Untereinheit der herzustellenden DNA zugegeben. Jeder Zyklus beginnt mit einer Entfernung der das 5'-OH schützenden DMTr-Gruppe und Umsetzung mit einer Verbindung, die durch Behandlung mit Tetrazol aktiviert ist, und die Formel 3 des Formelblattes besitzt, in der NR&sub2; eine Diisopropylaminogruppe bedeutet, D die das 5'-OH schützende DMTr-Gruppe ist, und X* Thymin, Benzyoladenin, Benzyolcytosin oder Isopropylcarbonylguanin ist. Nach Blockierung des unumgesetzten Substrats durch Acetylierung wird die Methylphosphitgruppe mit Jod oxidiert, um eine Methylphosphatgruppe zu bilden, bevor der nächste Zyklus durchgeführt wird. Nachdem alle gewünschten Zyklen stattgefunden haben, werden die das Phosphat schützenden Methylgruppen durch Behandlung mit Thiophenol entfernt, und die Bindung zum CPG-Träger wird durch Behandlung mit Ammoniak gespalten, und die Basen-schützenden Gruppen werden entfernt. Zur Klarstellung wird angemerkt, daß das vorstehend beschriebene Verfahren nur eines vieler möglicher Synthesevarianten ist. Es gibt auch Synthesevarianten mit anderen Schutzgruppen, und Varianten, in denen die Komponenten keine Phosphit-, sondern eine Phosphatgruppe enthalten.
  • Es wurden bereits mehrere Versuche gemacht, um Polydesoxyribonucleotide ohne negativ geladene Phosphatgruppe zu synthetisieren. Miller et al, J.A.C.S. 93 (1971) 6657-6665, und Pless und Ts'O, Biochem. 16 (1977) 1239-1250, beschreiben Versuche mit Alkylphosphotriestern, nämlich die Herstellung von d([Tp(OEt)]&sub7;T) enthaltenden Ethylphosphatgruppen zwischen den Nucleosideinheit. Als Ergebnis der chiralen Phosphoratome besteht das Reaktionsprodukt aus einer Mischung von 128 Diastereomeren, die während Hybridisierung mit Polydesoxyadenylat Duplex-Strukturen mit verschiedenen Stabilitäten bilden. Es wird angemerkt, daß keine korrespondierenden Methylphosphotriester beschrieben werden, die aufgrund des Fehlens eines geeigneten Syntheseverfahrens im allgemeinen nicht hergestellt werden könnten.
  • Die gleichen Forscher führten dann eine Synthese von Polydesoxyribonucleotiden durch, in denen Methylphosphonat-Gruppen der Formel -O- P(O) (CH&sub3;)-O- als Verbindungselemente zwischen den Nucleosideinheiten fungieren: siehe Miller et al, Biochimie 67 (1985) 769-776; Miller et al, Jerus. Symp. Quantum Chem. Biochem. 18 (1985) 207-219; Miller et al, in "Nucleic Acids: The Vectors of Life", Ed. Pullman und Jortner, Reidel Publishing Company, (1983), 521-535; Ts'O et al, in "Development of Target-Oriented Anticancer Drugs", Ed. Cheng et al, Raven Press, New York (1983), 189-206; Agris et al, Biochem. 25 (1986) 6268-6275.
  • Hybridisierungsversuche solcher Methylphosphonat-Oligonucleotide mit komplementären normalen Oligonucleotiden haben gezeigt, daß Duplex- Strukturen gebildet werden, deren Stabilität im Fall von Tetranucleotiden größer ist als im Fall von Dinucleotiden. Die Duplexstabilität nimmt jedoch mit längeren Molekülen ab, und bei Oligonucleotiden mit mehr als 9 Nucleotideinheiten ist sie geringer als im Fall von Dinucleotiden. Offensichtlich kann ein Methylphosphonat-DNA-Strang nicht leicht die rechtsgängige Konformation des Zucker-Phosphat-Gerüstes annehmen, die zur Bildung einer stabilen Duplex-Struktur erforderlich ist.
  • Unser Team hat das Hexanucleotid d([Tp(OMe)]&sub5;T) synthetisiert, in dem Methylphosphatgruppen der Formel -O-P(O) (OMe)-O- als Verbindungselemente zwischen den Nucleotideinheiten fungieren. Koole et al, Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen, series B, 89 (1986) 51-55 beschreiben, daß diese Substanz zur Ausbildung einer stabilen parallelen Duplex-Struktur mit sich selbst, d.h. mit Wasserstoffbindungen zwischen Thyminbasen, fähig ist. Der Tm- Wert der aus einer Mischung von Diastereomeren bestehenden Substanz beträgt ca. 67ºC. Weil die Substanz nur Thyminbasen enthält, die keine primäre Aminogruppe tragen, kann die Substanz durch Methylierung der Phosphatgruppen mit Methylmethansulfonat, wie von Rhaese und Freese, Biochim. Biophys Acta 190 (1969) 418-433 beschrieben, hergestellt werden.
  • Konventionelle Acylblockiergruppen der Aminogruppen der Basen A, C und G müssen durch Behandlung mit konzentriertem Ammoniak entfernt werden, wobei diese Behandlung auch zu einem Abbau der basenlabilen Phosphattriestergruppen führt. Dies stellt ein Problem bei der Synthese von Polydesoxyribonucleotiden mit methylierten Phosphatgruppen, die A, C und/oder G-Basen umfassen, dar.
  • Das Problem kann vermieden werden, indem man zur Maskierung der Aminogruppen der Basen die 9-Fluorenylmethyloxicarbonyl (Fmoc)-Gruppe verwendet. Diese Fmoc-Gruppe wird von Heikkilä und Chattopadhyaya in Acta Chem. Scand. B37 (1983) 263-265 beschrieben und kann über eine milde β- Elimination abgespalten werden. Diese β-Elimination basiert auf der sauren Natur des Protons am β-Kohlenstoffatom und wird durch Behandlung mit z.B. Triethylamin bewirkt, das die methylierten Phosphatgruppen im DNA- Gerüst nicht angreift. Auf diese Weise wurde es möglich, irgendein gewünschtes Polydesoxyribonucleotid mit methylierten Phosphatgruppen herzustellen.
  • In der Zwischenzeit haben McBride et al, J.A.C.S. 108 (1986) 2040- 2048 bei der Synthese von Oligonucleotiden die Verwendung von basenschützenden Amidingruppen vorgeschlagen, die leicht und selektiv durch Behandlung mit 1,2-Ethandiamin/Phenol/Wasser entfernt werden können, ohne gleichzeitig Schutzgruppen von den methylierten Phosphatgruppen abzuspalten. Indem davon Verwendung gemacht wurde, haben wir ein Syntheseverfahren entwickelt, das es möglich macht, irgendein gewünschtes Polydesoxyribonucleotid mit methylierten Phosphatgruppen herzustellen. Mit Hilfe dieses Syntheseverfahrens haben wir eine Anzahl von Polydesoxyribonucleotiden mit methylierten Phosphatgruppen hergestellt, und während Hybridisierungsversuchen wurde überraschenderweise gefunden, daß die Verbindungen mit komplementären DNA-Molekülen antiparallele Duplex-Strukturen bilden, deren Stabilität mit steigenden Kettenlängen weiter zunimmt. Im Hinblick auf die Instabilität von Duplex-Strukturen mit größeren Kettenlängen, wie sie in Methylphosphonat-Polynucleotiden gefunden wird, ist es in der Tat überraschend, daß der Ersatz der an Phosphor gebundenen Methylgruppe durch eine Methoxygruppe einen solchen drastischen Effekt auf die Stabilität der Duplex-Struktur besitzt. Im Falle von Methylphosphat/Polynucleotiden zeigen Duplex-Strukturen mit einer Länge von 2, 3, 6 und 8 Nucleotideinheiten pro Kette Tm-Werte von ca. 30ºC, 41ºC, 67ºC bzw. 85ºC.
  • Diese überraschend hohe Stabilität, insbesondere im Fall langer Moleküle, kann auf vielerlei Weise verwendet werden, z.B. in Hybridisierungsstufen, in denen die Notwendigkeit zur Ausbildung stabiler Duplex- Moleküle unter Verwendung eines Methylphosphat-Polynucleotids als Sonde besteht. Solche Hybridisierungsstufen bilden nicht nur einen Teil verschiedener wissenschaftlicher und praktischer Verfahren zur Herstellung rekombinierter DNA, sondern können auch bei diagnostischen Applikationen verwendet werden, um die Gegenwart einer bestimmten DNA-Sequenz in zu analysierenden Proben zu bestimmen. Weil auch längere Duplex-Moleküle stabil sind, können Moleküle verwendet werden, die eine Basensequenz besitzen, die spezifisch für einen bestimmten DNA-Typ ist, z.B. für die DNA eines bestimmten Bakteriums, eines bestimmten Virus, eines bestimmten eukaryontischen Parasiten, einer bestimmten Art einer Tumorzelle, oder im allgemeineren Sinne von Zellen mit einer veränderten DNA, wie sie im Zusammenhang mit Dementia, Muskeldystrophie, Autoimmunkrankheiten und anderen Krankheitserscheinungen auftreten. Die erfindungsgemäßen Methylphosphat-Polydesoxyribonucleoside können nicht nur für diagnostische Zwecke verwendet werden, sondern auch für therapeutische Zwecke. Weil sie im Fall von Kettenlängen mit 3 oder mehr Nucleosideinheiten mit in der Zelle vorhandener DNA stabile Duplex-Strukturen bilden, die einen Tm-Wert oberhalb der Körpertemperatur besitzen, sind sie dazu fähig, eine Replikation (und deshalb Zellvermehrung) und Transkription (und deshalb eine normale Aktivität der Zelle) zu behindern, während im Falle von Substanzen mit einer Basensequenz, die für eine bestimmte DNA spezifisch ist, eine gezielte Behandlung bakterieller oder Virus-Infektionen, eukaryontischer Parasiten, Krebszellen und anderen Krankheitszuständen, die mit einer veränderten DNA assoziiert sind, wie z.B. Dementia, Muskeldystrophie und Autoimmunkrankheiten, durchgeführt werden kann. Die erfindungsgemäßen Methylphosphat-Polydesoxyribonucleotide werden in vivo nicht zersetzt, und aufgrund ihres nicht-anionischen Charakters können sie leicht durch Zellmembranen hindurchtreten, und damit die in der Zelle vorhandene DNA in aktiver Form erreichen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch für gentherapeutische Zwecke verwendet werden. Was den zu behandelnden Organismus betrifft, so ist die Erfindung nicht auf Menschen beschränkt, sondern gleichermaßen auf Tiere und Pflanzen anwendbar.
  • Es kann außerdem auch in Betracht gezogen werden, von der Eigenschaft Gebrauch zu machen, daß die Verbindungen eine temperaturabhängige UV-Absorption zeigen, die über eine Selektion der Moleküllänge auf das gewünschte Temperaturverhalten eingestellt werden kann.
  • In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung die neuen Verbindungen selbst, d.h. Polydesoxyribonucleotide mit 8 oder mehr Desoxyribonucleosideinheiten, die über Phosphatgruppen miteinander verbunden sind, und die dadurch charakterisiert sind, daß mindestens ein Teil der Phosphatgruppen methyliert ist, mit der Maßgabe, daß Polydesoxyribonucleotide, die kovalent an einen festen Träger gebunden sind, ausgenommen sind.
  • Längere Moleküle sind aufgrund einer höheren Stabilität der Duplex- Struktur und der Möglichkeit, daß sie für eine bestimmte DNA spezifisch sind, bevorzugt. Moleküle mit 8 oder mehr Nucleosideinheiten zeigen einen Tm-Wert, der klar oberhalb der Körpertemperatur von Säugern, einschließlich Menschen, liegt. Bei Kettenlängen von 8 oder mehr, und vorzugsweise von 10 oder mehr, z.B. von 15 bis 18 Nucleosideinheiten, ist eine hohe Spezifität für bestimmte DNA erhältlich.
  • Um eine hohe Stabilität zu erzielen, ist es nicht immer notwendig, daß alle Phosphatgruppen methyliert sind, und aus ökonomischen Gründen kann es wünschenswert sein, daß nur ein Teil der Substanz Methylphosphatgruppen enthält. Verbindungen, die keine geladenen Phosphatgruppen enthalten, sind jedoch bevorzugt, weil sie die höchste Duplex-Stabilität zeigen und am leichtesten durch Zellmembranen hindurchtreten.
  • Bevorzugt sind Verbindungen mit der Formel 1 des Formelblattes, worin n eine ganze Zahl von 7 oder mehr bedeutet, R¹ und R² unabhängig voneinander Wasserstoff, -CH&sub3;, -C&sub2;H&sub5;, -COCH&sub3; oder -PO(OCH&sub3;)&sub2; bedeuten und jedes X unabhängig voneinander eine Base aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin, Thymin und Cytosin ist.
  • Die erfindungsgemäßen Polydesoxyribonucleotide besitzen vorzugsweise eine Basensequenz, die für die DNA eines Bakteriums oder Virus oder eukariontischen Parasiten, oder für die DNA einer Tumorzelle spezifisch ist.
  • Die Erfindung betrifft außerdem pharmazeutische Zusammensetzungen, die zusätzlich zumindestens einem für die therapeutische Verwendung geeigneten Träger mindestens ein erfindungsgemäßes Polydesoxyribonucleotid enthalten. Die Form dieser pharmazeutischen Zusammensetzung hängt vom gewählten Verabreichungsweg ab. Die Wahl der Trägersubstanz und anderer konventioneller Komponenten der Zusammensetzung liegt innerhalb des Wissens eines Fachmanns. Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden vorzugsweise in Form von Lösungen, Emulsionen, Suspensionen für z.B. intravenöse, intramuskuläre oder intralesionale Verabreichung verwendet.
  • Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen neuen Verbindungen für diagnostische Zwecke, und in breiterem Sinn für Hybridisierungszwecke.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der neuen erfindungsgemäßen Verbindungen, umfassend
  • a. die Herstellung eines Desoxyribonucleosids der Formel 2 des Formelblattes, worin Y eine 3'-OH-Schutzgruppe ist, und X* Thymin, Adenin, Guanin oder Cytosin mit einer Basen-schützenden Amidin- oder Fmoc-Gruppe ist,
  • b. die Herstellung einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 3 des Formelblattes, worin NR&sub2; eine aktivierbare austretende Gruppe ist, D eine 5'-OH-Schutzgruppe ist, und X* Thymin, Adenin, Guanin oder Cytosin mit einer Basen-schützenden Amidin- oder Fmoc-Gruppe ist,
  • c. Aktivierung einer Verbindung der Formel 3 und Kupplung an die freie 5'-OH-Gruppe der Verbindung der Formel 2,
  • d. Oxidation der Phosphitgruppe im resultierenden Reaktionsprodukt in eine Phosphatgruppe,
  • e. Entfernung der 5'-OH-Schutzgruppe D,
  • f. Kettenverlängerung, wenn erforderlich, durch wiederholte Addition einer neuen Desoxyribonucleosid-Methylphosphat-Untereinheit, gemäß den Stufen c, d, und e,
  • g. Überführung, wenn erwünscht, der 5'-OH-Gruppe in eine OR¹-Gruppe,
  • h. Überführung, wenn erwünscht, der geschützten 3'-OH-Gruppe in eine -OR²-Gruppe, und
  • i. Entfernung der Basen-schützenden Amidin- oder Fmoc-Gruppen, wenn vorhanden.
  • In Stufe a dieses Verfahrens kann jede geeignete 3'-OH-Schutzgruppe verwendet werden. Vorzugsweise ist Y jedoch eine Acetylgruppe. In Stufe b kann jede geeignete 5'-OH-Schutzgruppe verwendet werden, aber eine Di-p- Methoxytritylgruppe wird bevorzugt. Die austretende Gruppe NR&sub2; ist eine Gruppe mit hoher Stabilität, die aber auch leicht aktiviert werden kann. Bevorzugt wird eine Diisopropylaminogruppe, die leicht mit heterocyklischen Verbindungen, wie vorzugsweise Tetrazol, aktiviert werden kann.
  • In diesem Verfahren kann eine Amidingruppe zum Schutz der Basen Adenin, Guanin und Cytosin verwendet werden. Diese Amidingruppe hat vorzugsweise die Forml -N=C(R³)-NR&sup4;R&sup5;, worin R³ und R&sup4; unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl mit 1-6 Kohlenstoffatomen bedeuten, und R&sup5; eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen ist. R&sup4; und R&sup5; oder R³ und R&sup5; können jedoch auch zusammen mit dem Stickstoffatom oder den Stickstoff- und Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, einen heterocyklischen Ring mit 4-7 Ringatomen bilden.
  • Die Basen-schützende Amidingruppe besitzt vorzugsweise die Formel - N=C(CH&sub3;)-N(CH&sub3;)&sub2;, die durch Umsetzung mit der Verbindung 1-Dimethylamino- 1,1-dimethoxy-ethan eingeführt werden kann.
  • Die Entfernung dieser Amidingruppe in Stufe i erfolgt vorzugsweise mit Ethylendiamin.
  • Wenn die Basen Adenin, Guanin und/oder Cytosin mittels der Fmoc- Gruppe geschützt werden, kann die Entfernung vorzugsweise durch die Behandlung mit Triethylamin erfolgen.
  • Es können jedoch auch andere Herstellungsverfahren verwendet werden, z.B. eine automatische Phosphittriestermethode wie vorstehend beschrieben, die jedoch eine Modifizierung erfordert, um zu vermeiden, daß, wenn das synthetisierte Molekül vom festen Träger freigesetzt wird, aufgrund der vorhandenen Methylphosphatgruppen eine Kettenspaltung auftritt. Die konventionelle Behandlung mit Ammoniak ist aus diesem Grund nicht geeignet. Dieses Problem kann überwunden werden, indem man ein anderes Reagens verwendet, das das Molekül vom Träger freisetzt, ohne die Integrität des synthetisierten Moleküls anzugreifen, oder indem man einen anderen Spacer verwendet, der zum gewünschten Zeitpunkt selektiv entfernbar ist, ohne die Integrität des synthetisierten Moleküls anzugreifen.
  • Ähnliche Überlegungen gelten hinsichtlich anderer Verfahren, wie z.B. der allgemein bekannten Phosphattriestermethode: Geeignete Modifikationen können sie zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polydesoxyribonucleotide brauchbar machen.
  • Die Erfindung wird nun detaillierter mittels eines experimentellen Teiles veranschaulicht.
    • Herstellung von: d(acAp(OMe)Ap(OMe)Aac) der Formel 4 und d(acAp(OMe)Ap(OMe)Ap(OMe)Aac) der Formel 10 (siehe Schema A).
  • Ausgehend von dem Phosphoramidit der Formel 5, hergestellt nach McBride et al. (J. Am. Chem. Soc. 105 (1986) 2040) und dem modifizierten Nucleosid der Formel 6 wird in einer Drei-Stufen-Synthese das Dinucleotid der Formel 7 hergestellt. Die drei Stufen sind: 1. Kupplung; 2. Oxidation von Phosphit zu Phosphat; 3. Entfernung der Schutzgruppe vom 5'-Ende (Detritylierung). Die drei Stufen werden wie folgt durchgeführt:
    • (1). Kupplung
  • Die Verbindungen (5) und (6) werden in equimolaren Mengen verwendet. Trockenes Toluol wird zweimal zugegeben, um das gesamte Wasser azeotrop zu entfernen. Die Reagentien werden dann in trockenem Pyridin gelöst. Die Zugaben von 5 Äquivalenten Tetrazol bedingt den Start der Umsetzung. Nach 1 Stunde ist die Umsetzung vervollständigt.
    • (2) Oxidation
  • Das Phosphit wird durch Zugabe von J&sub2; (1,5 Äquivalente), gelöst in Acetonitril/Lutidin/Wasser (3:2:1. Volumenverhältnis) oxidiert. Nach 10 Minuten wird zur Reaktionsmischung Ethylacetat zugegeben. Dann wird mit einer 1%igen Lösung von NaHSO&sub3; in Wasser eine Extraktion durchgeführt.
  • Die organische Phase wird getrocknet, filtriert, und bis zur Bildung eines viskosen Öls konzentriert. Die Reinigung des Produktes efolgt mittels Säulenchromatographie mit Dichlormethan/Methanol (95:5) als Eluens. Ausbeute: 84%.
  • Rf (Dichlormethan/Methanol 90:10) : 0,40.
  • Rf (Dichlormethan/Methanol 95:5) : 0,05.
    • (3) Detritylierung
  • Das Produkt der Oxidationsreaktion wird in Essigsäure/Wasser (4:1) gelöst, und nachfolgend 2 Stunden lang bei 50ºC gerührt. Dann wird 5% Ammoniumacetat in Wasser zugegeben, wobei Dimethoxytritylalkohol ausfällt. Der Niederschlag wird durch Filtration entfernt. Die Reinigung des Produktes erfolgt durch Säulenchromatographie. Ausbeute an (7): 81%. Rf (Dichlormethan/Methanol 90:10) : 0,26.
  • Ausgehend von (7) kann die Drei-Stufen-Synthese wiederholt werden, wobei das Trinucleotid (8) erhalten wird. Die nächste Wiederholung ergibt das Tetranucleotid (9).
  • Während der Synthese des Trinucleotids wurden gefunden:
  • Rf des Produkts nach Oxidation (Dichlormethan/Methanol 90:10) : 0,24.
  • Rf nach Detritylierung (8) (Dichlormethan/Methanol 90:10) : 0,14.
  • Während der Synthese des Tetranucleotids wurden gefunden:
  • Rf des Produkts nach Oxidation (Dichlormethan/Methanol 95:5) : 0,09.
  • Rf nach Detritylierung (9) (Dichlormethan/Methanol 90:10) : 0,11.
  • (8) und (9) werden am 5'-Ende durch Umsetzung mit dem zweifachen Überschuß an Essigsäureanhydrid in trockenem Pyridin acetyliert. Die Amidingruppen der Adeninbasen werden gemäß der Vorschrift von McBride et al. (J. Am. chem. Soc. 108, 2040) durch Umsetzung mit 1,2-Ethandiamin/Phenol/Wasser entfernt.
  • Die Produkte werden mittels einer zweidimensionalen Dünnschichtchromatographie in reiner Form erhalten.
  • Für Vergleichszwecke wurde via Standardphosphoramiditweg in einem automatisierten DNA-Synthesizer ein unmodifiziertes Trinucleotid d(ApApA) hergestellt.
    • Vergleich der Verbindungen
  • Neutrale Lösungen von d(acAp(OMe)Ap(OMe)Aac) und d(ApApA) in Wasser zeigten nahezu identische UV-Absorptionsspektren (Fig. 1). In beiden Fällen war das typische Absorptionsmaximum bei 257 nm. Für die erfindungsgemäße Verbindung war das Minimum bei 236 nm; A&sub2;&sub5;&sub0;/A&sub2;&sub6;&sub0; betrug 0,94; und A&sub2;&sub8;&sub0;/&sub2;&sub6;&sub0; betrug 0,12. Für das normale Trinucleotid war das Minimum bei 236 nm; A&sub2;&sub5;&sub0;/A&sub2;&sub6;&sub0; betrug 1,08; und A&sub2;&sub8;&sub0;/A&sub2;&sub6;&sub0; betrug 0,22.
  • Die Hybridisierungstests mit Poly(dT) umfaßten eine Analyse der UV- Hyperchromizität als Funktion der Temperatur der Probe. Mit Poly(dT) bildete die erfindungsgemäße Verbindung eine Duplex-Struktur, die bei einer Schmelztemperatur Tm von 41ºC dissoziierte. Der Duplex von d(ApApA) mit Poly(dT) dissoziierte unter denselben Testbedingungen bei Tm von 20ºC (Fig. 2).
  • Aus Fig. 2 ist ersichtlich, daß die Schmelzübergänge in beiden Fällen gleich scharf sind, d.h. die Helix Knäuel-Umwandlung war in beiden Fällen innerhalb eines Temperaturbereichs von ca. 20ºC abgeschlossen. Alle vier verschiedenen Diastereomeren der erfindungsgemäßen Verbindung haben deshalb den gleichen Tm-Wert von 41ºC, woraus geschlossen werden kann, daß die Konfiguration der Methylphosphatgruppen (Rp und Sp) auf die Stabilität der Duplex-Struktur keinen Einfluß hat.
  • Aus Fig. 2 ist ferner ersichtlich, daß die Methylierung der Phosphatgruppen eine Verschiebung der Schmelzkurve um +21ºC ergibt.
  • Ähnliche Versuche zeigten, daß der Tm-Wert von erfindungsgemäßen Verbindungen mit steigender Moleküllänge ansteigt. Der Tm-Wert einer Duplex-Struktur mit einem erfindungsgemäßen Dinucleotid lag bei ca. 30ºC, während Duplex-Strukturen mit einem erfindungsgemäßen Hexanucleotid einen Tm-Wert von ca. 67ºC besaßen, und Duplex-Strukturen mit einem erfindungsgemäßen Octanucleotid einen Tm-Wert von ca. 85ºC aufwiesen.
  • Aus Fig. 3 ist ersichtlich, daß der Tm-Wert der erfindungsgemäßen Verbindungen mit steigender Kettenlänge ansteigt, während die Phosphonate (die Kurven mit offenen Quadraten) mit größeren Kettenlängen weniger und weniger stabile Duplex-Strukturen bilden.
  • Ausgedehnte UV-Hyperchromizitätsversuche bei der Hybridisierung von d(acAp(OMe)Ap(OMe)Aac) haben gezeigt, daß die Duplex-Bildung ausschließlich mit Poly(dT) und nicht mit Poly(U) (die komplementäre RNA) auftritt. Diese Spezifität basiert im wesentlichen auf der Tatsache, daß Methylphosphat-DNA an sich zur rechtsgängigen B-DNA-Geometrie paßt. Zur Bestimmung des Einflusses von d(acAp(OMe)Ap(OMe)Aac) auf die DNA-Synthese und die Protein-Synthese in Ratten-Fibroblastzellen wurde ein biologischer Versuch durchgeführt. Es wurde gefunden, daß die DNA-Synthese beträchtlich verzögert wird (80% Inhibierung bei einer Konzentration von d(acAp(OMe)Ap(OMe)Aac) von 10 uM), während die Proteinsynthese im wesentlichen unbeeinflußt bleibt. Dies wird durch die Affinität von d(acAp(OMe)Ap(OMe)Aac) für natürliche DNA, aber nicht für natürliche RNA, erklärt.
    • Verwendung der Fmoc-Gruppe
  • Es wurde die Brauchbarkeit der Fmoc-Gruppe bei der Synthese der Phosphat-methylierten Dinucleotide 11 und 12 getestet. 5'-(4-Methoxytriphenylmethyl)-dC-Fmoc (14) war der Vorläufer für 11 (Schema B). Die Verbindung 14 wurde aus dC-Fmoc (13) und 4-Methoxytriphenylmethylchlorid in trockenem Pyridin hergestelllt. Danach wurde 14 mit Essigsäureanhydrid unter Bildung von 15 behandelt, aus dem der 3'-terminale Baustein 16 durch Detritylierung in 80%iger Essigsäure erhalten wurde. Ein anderer Teil von 14 wurde mit 1,1 Äquivalenten Methoxy-bis-(diisopropylamino)phosphin (δ 31p in CDCl&sub3;, 131,6 ppm) in Gegenwart von 1H-Tetrazol in einem strikt wasserfreien Pyridin-Medium umgesetzt, unter in situ-Bildung von 17. Dies war aus dem ³¹P NMR-Spektrum einer Probe der Reaktionsmischung ersichtlich, die aufgrund zwei diastereomerer Formen von 17 zwei Peaks bei δ 150,0 und 149,4 ppm im Verhältnis 1 : 1 zeigte. Es wurde keine restliche ³¹P NMR-Resonanz bei δ 131,6 ppm gefunden. Die Bildung von 17 basiert im wesentlichen auf der Tatsache, daß Alkoxy-bis- (dialkylamino)-phosphine durch schwache Säuren, wie z.B. 1H-Tetrazol, selektiv aktiviert werden. Die Lösung von 17 wurde sofort mit einer Lösung von 16 (1,05 Äquivalent, bezogen auf 17) und Tetrazol in trockenem Pyridin weiter umgesetzt. Dies ergab den diastereomeren Phosphittriester 18, beurteilt durch ³¹P NMP (δ 140,8 und 140,5 ppm in CDCl&sub3;) und Dünnschichtchromatographie. Die entsprechenden Methylphosphattriester (δ 0,4 und 0,3 ppm in CDCl&sub3;) wurden bei der Umsetzung mit tert.-Butylhydroperoxid quantitativ gebildet. Nachfolgende Detritylierung mit 80%iger Essigsäure ergab das teilweise geschützte Dinucleotid 19, das nach Säulenchromatographie unter Verwendung einer Mischung von Chloroform und Methanol (9 : 1) als Eluens (Rf = 0,65) als weißes Pulver isoliert wurde. Die zwei diastereomeren Formen von 19 zeigten ³¹P NMR-Resonanzen bei δ 0,1 und -0,4 ppm in CDCl&sub3;. Die Verbindung 19 wurde 14 Stunden lang in einer 1 : 1-Mischung von Chloroform und Triethylamin gerührt, was zur Deblockierung der C-Basen führte. Die Zielverbindung 11 fiel während dieser Umsetzung aus (δ ³¹P in CD&sub3;OD, 4,0 und 3,4 ppm).
  • Die Synthese des Phosphat-methylierten Dinucleotids 12 wurde in im wesentlichen der gleichen Weise durchgeführt, unter Verwendung von 5'-(4- Methoxytriphenylmethyl)-dA-Fmoc und 3'-O-Acetylthymidin als Bausteine. Die erste Verbindung wurde zuerst mit 1,2 Äquivalenten Methoxy-bis- (diisopropylamino)-phosphin in einem wasserfreien Medium aus Dichlormethan und Acetonitril in Gegenwart von 1H-Tetrazol umgesetzt. Dies ergab in situ ohne weiteres das Syntheseprodukt (δ ³¹P in CDCl&sub3;, 149,7 und 149,5 ppm). Eine Lösung von 3'-O-Acetylthymidin (1,2 Äquivalenten bezogen auf 5'-(4-Methoxytriphenylmethyl)-dA-Fmoc) und 1H-Tetrazol wurden dann zur Reaktionsmischung zugegeben, um das Dinucleosidphosphit dA-5'-P-3'-dT (δ ³¹P in CDCl&sub3;, -141,3 und 140,4 ppm) zu liefern. Nach Oxidation mit tert.-Butylhydroperoxid wurde der entsprechende Methylphosphattriester (δ ³¹P in CECl&sub3;, -0,05 und -0,53 ppm) erhalten. Dieses Produkt wurde nach Säulenchromatographie unter Verwendung von 2-Butanon als Eluens (Rf = 0,28) als weißer Feststoff erhalten. Die 4'-Methoxytriphenylmethylgruppe wurde in 80%iger Essigsäure abgespalten. Schließlich wurde die Fmoc-Gruppe durch Behandlung mit einer Mischung aus Triethylamin (10 Äquivalente, bezogen auf das Substrat) und Pyridin entfernt, und ergab Verbindung 12, mit ³¹P NMR-Signalen bei -0,4 und -0,7 ppm in CDCl&sub3;.
  • Der Rahmen des Fmoc-Verfahrens bei Phosphat-methylierten DNA-Oligomeren kann offensichtlich auf Systeme einer willkürlichen Nucleotid-Sequenz erweitert werden.
  • Nach dem Fmoc-Verfahren wurden ebenfalls die folgenden Methylphosphat DNA-Framente synthetisiert: d(Cp(OMe)Cp(OMe)Cac), d(Tp(OMe)Cp(OMe)Cac) und d(Tp(OMe)Tp(OMe)pAp(OMe)pAac). Versuche zur UV- Hyperchromizität bei der Hybridisierung von d(Cp(OMe)Cp(OMe)Cac) mit natürlichem Poly(dG) zeigten einen Tm-Wert von 55ºC (vergleiche: Tm = 41ºC für d(acAp(OMe)Ap(OMe)Aac) und Poly(dT)). Es kann geschlossen werden, daß die Hybridisierung via C - G-Basenpaaren wesentlich stärker ist als die Hybridisierung via A - T-Basenpaaren. Die Stabilität des Komplexes ist deshalb eine Funktion der Länge und der Basensequenz.
    • Biologische Aktivität
  • Die behauptete biologische Aktivität von Methylphosphat-DNA wurde durch zwei in vitro Zellwachstumsversuche bestätigt: (i) 100 uM d(acAp(OMe)Ap(OMe)Aac) mit E.Coli-Zellen (K12AB 3292 und K12JM 101A) ergaben eine 100%ige Inhibierung der Koloniebildung. Die niedrige Inhibierungskonzentration zeigt, daß der Einfluß über den allgemeinen toxischen Effekt hinausgeht: (ii) Eine kleine, aber signifikante Inhibierung (15 - 20%) des Zellwachstums von menschlichen malignen Ovariumzellen wurde durch Methylphosphat d(acAp(OMe)Ap(OMe)Aac) in einer Konzentration von 150 uM induziert. Die Verlängerung der Methylphosphat-DNA steigert sicher die Aktivität und Selektivität im Hinblick auf die Inhibierung des Zellwachstums.

Claims (12)

1. Polydesoxyribonucleotide mit 8 oder mehr Desoxyribonucleosideinheiten, die über Phosphatgruppen miteinander verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Teil der Phosphatgruppen methyliert ist, mit der Maßgabe, daß Polydesoxyribonucleotide, die kovalent an einen festen Träger gebunden sind, ausgenommen sind.
2. Polydesoxyribonucleotide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Formel 1 besitzen:
worin n eine ganze Zahl von 7 oder mehr bedeutet, R¹ und R² unabhängig voneinander Wasserstoff, -CH&sub3;, -C&sub2;H&sub5;, -COCH&sub3; oder -PO(OCH&sub3;)&sub2; bedeuten, und jedes X unabhängig voneinander eine Base aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin, Thymin and Cytosin bedeutet.
3. Polydesoxyribonucleotide nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Basensequenz besitzen, die spezifisch für die DNA eines Bakteriums oder Virus oder eukaryontischen Parasiten oder einer Tumorzelle ist.
4. Pharmazeutische Zusammensetzungen umfassend mindestens einen für die therapeutische Applikation geeigneten Träger und mindestens ein Polydesoxyribunucleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3.
5. Verwendung von Polydesociribonucleotiden nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für diagnostische Zwecke.
6. Verwendung von Polydesoxyribonucleotiden nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für Hybridisierungszwecke.
7. Verfahren zur Herstellung von Polydesoxyribonucleotiden nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt
(a) die Herstellung eines Desoxyribonucleosids der Formel 2:
worin Y eine 3'-OH-Schutzgruppe und X* Thymin, Adenin, Guanin oder Cytosin mit einer Basen-schützenden Amidin- oder Fmoc-Gruppe ist,
(b) Herstellung einer oder mehrerer Verbindungen der Formel 3:
worin NR&sub2; eine aktivierbare austretende Gruppe ist, D eine 5'-OH-Schutzgruppe ist, und X* Thymin, Adenin, Guanin oder Cytosin mit einer Basenschützenden Amidin- oder Fmoc-Gruppe ist,
(c) Aktivierung einer Verbindung der Formel 3 und Kuppeln an die freie 5'-OH-Gruppe der Verbindung der Formel 2,
(d) Oxidation der Phosphitgruppe in dem resultierenden Reaktionsprodukt zu einer Phosphatgruppe.
(e) Entfernung der 5'-OH-Schutzgruppe D,
(f) Kettenverlängerung durch wiederholte Addition weiterer Desoxyribonucleosidmethylphosphat-Untereinheiten gemäß den Stufen (c) bis (e),
(g) Umwandlung, wenn erwünscht, der 5'-OH-Gruppe in eine -OR¹- Gruppe,
(h) Umwandlung, wenn erwünscht, der geschützten 3'-OH-Gruppe in eine -OR³-Gruppe, und
(i) Entfernung der Basen-schützenden Amidin- oder Fmoc-Gruppen, wenn vorhanden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt: in Stufe (a) die Verwendung einer Acetylgruppe als 3'-OH-Schutzgruppe Y und in Stufe (b) die Verwendung einer Di-p-Methoxytritylgruppe als 5'-OH-Schutzgruppe D und die Verwendung einer Diisopropylaminogruppe als austretende Gruppe NR&sub2;.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt: in Stufe (c) die Aktivierung der Verbindung der Formel 3 mit Tetrazol.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es den Schutz der Basen Adenin, Guanin und Cytosin durch Überführung der primären Aminogruppe in eine Gruppe der Formel
-N=C(R³)-NR&sup4;R&sup5;
umfaßt, worin R³ und R&sup4; unabhängig voneinander Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub6;- Alkyl bedeuten, R&sup5; C&sub1;-C&sub6;-Alkyl ist, oder R&sup4; und R&sup5;, oder R³ und R&sup5;, zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, oder zusammen mit den Stickstoff- und Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, einen heterocyklischen Ring mit 4-7 Ringatomen bilden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es den Schutz der Basen Adenin, Guanin und Cytosin durch Umsetzung mit der Verbindung 1-Dimethylamino-1,1-dimethoxyethan zur Überführung der primären Aminogruppe der Basen in eine Gruppe der Formel
-N=C(CH&sub3;)-N(CH&sub3;)&sub2;
umfaßt.
12. Vefahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es die Entfernung der Basen-schützenden Amidingruppen in Stufe (i) durch Behandlung mit Ethylendiamin umfaßt.
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