CZ294650B6 - Léčivo pro léčení angiogeneze v tkáni, regresi vyvinutého nádoru v tkáni nebo indukci apoptózy v neovaskulaturní tkáni - Google Patents

Léčivo pro léčení angiogeneze v tkáni, regresi vyvinutého nádoru v tkáni nebo indukci apoptózy v neovaskulaturní tkáni Download PDF

Info

Publication number
CZ294650B6
CZ294650B6 CZ19962711A CZ271196A CZ294650B6 CZ 294650 B6 CZ294650 B6 CZ 294650B6 CZ 19962711 A CZ19962711 A CZ 19962711A CZ 271196 A CZ271196 A CZ 271196A CZ 294650 B6 CZ294650 B6 CZ 294650B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
angiogenesis
antagonist
tumor
cam
tissue
Prior art date
Application number
CZ19962711A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ271196A3 (cs
Inventor
Peter Brooks
David A. Cheresh
Original Assignee
The Scripps Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22783992&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ294650(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by The Scripps Research Institute filed Critical The Scripps Research Institute
Publication of CZ271196A3 publication Critical patent/CZ271196A3/cs
Publication of CZ294650B6 publication Critical patent/CZ294650B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70546—Integrin superfamily
    • C07K14/70557—Integrin beta3-subunit-containing molecules, e.g. CD41, CD51, CD61
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2848—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta3-subunit-containing molecules, e.g. CD41, CD51, CD61
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Oncology (AREA)

Abstract

Použití .alfa..sub.v.n..beta..sub.3.n. antagonisty pro přípravu léčiva pro léčení artritidy, diabetické retinopatie, makulární degenerace, restenózy, hemangiomu nebo pevného nádoru plic, pankreatu, prsu, tlustého střeva, hrtanu nebo vaječníků.ŕ

Description

Předkládaný vynález se obecně vztahuje k lékařské oblasti a týká se použití antagonistů vitronektinového receptoru ανβ3 pro přípravu léčiva pro léčení angiogeneze v tkáni, regresi vyvinutého nádoru v tkáni nebo indukci apoptózy v neovaskulámí tkáni.
Dosavadní stav techniky
Integriny jsou třídou buněčných receptorů, o kterých je známo, že se vážou na extracelulámí proteiny matrixu, a proto zprostředkovávají interakce buňka-buňka a buňka-extracelulámí matrix, které patří obecně k buněčným adhezním dějům. Ale i když je v literatuře popsáno mnoho integrinů a ligandů, které vážou integrin, biologická funkce mnoha z těchto integrinů zůstává stále neznámou. Integrinové receptory tvoří rodinu proteinů, které vykazují strukturální charakteristiky nekovalentních heterodimemích glykoproteinových komplexů, tvořených podjednotkami a a b.
O vitronektinovém receptoru, pojmenovaném tak pro jeho originální charakteristiky, týkající se preferenční vazby vitronektinu, je nyní známo, že se vztahuje ke třem odlišným integrinům, označeným ανβι, ανβ3 a ανβ5. Viz Horton: Int. J. Exp. Pathol., 71, 741-759 (1990). ανβι váže fíbronektin a vitronektin. ανβ3 váže širokou škálu ligandů včetně fíbrinu, fíbrinogenu, lamininu, trombospondinu, vitronektinu, von Willebrandova faktoru, osteospontinu a kostního sialoproteinu I. ανβ5 váže vitronektin. Specifická role buněčné adheze, kterou tyto tři integriny hrají v mnoha buněčných interakcích v tkáních, je ještě předmětem vyšetřování, ale je jasné, že jsou to tři odlišné integriny s odlišnými biologickými funkcemi.
Jedním důležitým rozpoznávacím místem ligandů pro mnoho integrinů je tripeptidická sekvence arginin-glycin-kyselina asparagová (RGD). RGD se nalézá ve všech ligandech identifikovaných viz výše pro integriny s vitronektinovým receptorem. Toto rozpoznávací místo RGD mohou napodobit polypeptidy („peptidy“), které obsahují sekvenci RGD, a takové RGD peptidy jsou známými inhibitory funkce integrinů Je však důležité si všimnout, že se v závislosti na sekvencia struktuře RGD peptidu může specificita inhibice přizpůsobit cílovým specifickým integrinům.
K diskuzi rozpoznávacího místa RGD viz Pierschbacher a kol., Nátuře: 309, 30-33 (1984) a Pierschbacher a kol., Proč. Nati. Acad. Aci. USA: 81, 5985-5988 (1984). Různé RGD polypeptidy o různé integrinové specifitě byly také popsány Grantem a kol., Cell. 58, 933-943 (1989), Cheresh a kol., Cell. 58, 945-953 (1989), Aumailley a kol., FEBS Letts.: 291, 50-54 (1991) a Pfaff a kol., J. Biol. Chem.: 269, 20233-20238 (1994) a US patent č. 4 517 686,
578 079, 4 5 89 881, 4 614 517, 4 661 111, 4 792 525 , 4 683 291, 4 879 237, 4 988 621,
041 380 a 5 061 693.
Angiogeneze je proces prokrvování tkáně cévami, který zahrnuje růst nových vyvíjecích se krevních cév v tkáni a je také znám jako neovaskularizace. Tento proces je zprostředkován infiltrací endoteliálních buněk a buněk hladkého svalstva. Má se za to, že tento proces probíhá kterýmkoliv ze tří způsobů: cévy mohou růst zjiž existujících cév, vývoj cév de-novo může nastat z prekurzorových buněk (vaskulogeneze), nebo se existující malé cévy mohou zvětšit v průměru. Viz Blood a kol., Bioch. Biophys. Acta: 1032, 89-118 (1990). Cévní endoteliální buňky obsahují nejméně 5 RGD-dependentních integrinů včetně vitronektinového receptoru (ανβ3 nebo ανβ5), kolagenový receptor typu I a IV (ανβι), lamininový receptor (α2βι), fíbronektin/laminin/kolagenový receptor (α3βι) a fibronektinový receptor (α5βι). Viz Davis a kol., J.
-1 CZ 294650 B6
Cell. Biochem.: 51, 206-218 (1993). Buňka hladkého svalstva obsahuje nejméně šest RGDdependentních integrinů včetně α5βι, ανβ3 a ανβ5.
Angiogeneze je důležitý proces v neonatálním růstu, ale také při hojení poranění a v patogenezi široké škály klinických onemocnění, včetně zánětu tkáně, artritidy, nádorového bujení, diabetické retinopatie, svalové degenerace, způsobené neovaskularizací sítnice apod. Tyto klinické projevy, spojené s angiogenezí, jsou uváděny jako angiogenní onemocnění. Viz Folkman a kol., Science: 235, 442-447 (1987). Angiogeneze obecně neprobíhá u dospělých nebo ve zralých tkáních, ačkoliv ji lze pozorovat při hojení poranění a v růstovém cyklu corpu leuteum. Viz např. Moses a kol., Science: 248, 1408-1410 (1990).
Bylo navrhnuto využít inhibice angiogeneze v terapii, omezující nádorový růst. Provedení inhibice angiogeneze bylo plánováno provést (1) jako inhibici uvolňováním „angiogenních molekul“ jako bFGF (fíbroblastový růstový faktor), (2) neutralizaci angiogenních molekul použitím antibFGF protilátek a (3) inhibici odpovědi endoteliálních buněk na angiogenní podnět. Posledně jmenované strategii byla věnována pozornost a Folkman a kol., Cancer Biology: 3, 89-96 (1992) popsali několik inhibitorů odpovědi endoteliálních buněk, včetně inhibitoru kolagenázy, inhibitorů přeměny základní stavby membrány, angiostatických steroidů, angiogenních inhibitorů pocházejících z hub, faktoru 4 krevních destiček, trombospondinu, léčiv určených k léčbě artritidy jako D-penicillaminu a thiomalátu zlatitého, analog vitaminu D3, alfa-interferonu apod., které lze využít k inhibici angiogeneze. Další navržené inhibitory angiogeneze viz Blood a kol., Bioch. Biophys. Acta: 1032, 89-118 (1990), Moses a kol., Science: 248, 1408-1410 (1990), Ingber a kol., Lab. Invest.: 59, 44-51 (1988) a patent US 5 092 885, US 5 112 946, US 5 192 744 a US 5 202 352. Žádný z inhibitorů angiogeneze, popsaný v předchozích referencích, není zaměřen na inhibici ανβ3.
Peptidy, obsahující RGD, které inhibují vitronektinový receptor ανβ3, byly také popsány. Viz Aumailley a kol., FEBS Letts.: 291, 50-54 (1991), Choi a kol., J. Vasc. Surg.: 19, 125-134 (1994), Smith a kol., J. Biol. Chem.: 265, 12267-12271 (1990) a Pfaff a kol., J. Biol. Chem.: 269, 20233-20238 (1994). Až do předložení tohoto vynálezu však nikdy nebyla navržena ani určena role integrinů ανβ3 v angiogenezí.
Inhibice buněčné adheze in vitro za použití monoklonálních protilátek, imunospecifických pro různé podjednotky integrinů a nebo b, prokázala účast ανβ3 v buněčné adhezi mnoha buněčných typů, včetně mikrovaskulárních endoteliálních buněk. Davis a kol., J. Cell. Biol.: 51, 206-218 (1993).
Podobně dokument EP 5 788 083 uvádí integriny αιπ>β3 a ανβ3 a jejich receptory, popisuje inhibici adheze nádorových buněk, ale uvádí, že „sloučeniny inhibují adhezi buněk, ...a jsou vhodnými činidly, které podporují angiogenezí...“.
Dokument WO 93/20 229 popisuje přípravu monoklonální protilátky, specifické ρΓοανβ3 integrinový receptor, který specificky váže osteoklasty bez vazby k jiným známým buňkám, exprimujícím ανβ3. Uvádí se rovněž, že protilátky by mohly být vhodné pro inhibici růstu nádorů, ale inhibici angiogeneze nezmiňuje.
Navíc Nicosia a kol., Am. J. Pathol.: 138, 829-833 (1991) popsali, že použití RGD peptidu GRGDS inhibuje in vitro tvorbu „mikrocév“ z krysí aorty, kultivovaných v kolagenovém gelu. Inhibice tvorby „mikrocév“ in vitro v kulturách v kolagenovém gelu však není modelem inhibice angiogeneze v tkáni, protože není ukázáno, že struktury mikrocév jsou stejné jako výrůstky kapilár, nebo že tvorba mikrocév v kultuře v kolagenovém gelu je stejná jako neovaskulámí růst v intaktní tkáni, jako např. artritické tkáni, nádorové tkáni nebo nemocné tkáni, kde je žádoucí inhibice angiogeneze.
-2CZ 294650 B6
Proto si předkladatelé nejsou kromě již zde uvedených studií vědomi žádné další demonstrace toho, že by angiogeneze mohla být inhibována vtkáni za použití inhibitorů buněčné adheze. Zvláště pak nikdy dříve nebylo demonstrováno, že k angiogenezi v tkáni je vyžadována funkce ανβ3, nebo že angiogenezi mohou vtkáni inhibovat antagonisté ανβ3.
Podstata vynálezu
Tento vynález se týká použití antagonisty ανβ3 pro přípravu léčiva pro léčení artritidy, diabetické retinopatie, makulámí degenerace, restenózy, hemangiomu nebo pevného nádoru plic, pankreatu, prsu, tlustého střeva, hrtanu nebo vaječníků, kde léčivo obsahuje takové množství antagonisty ανβ3, které inhibuje angiogenezi.
Předkládaný vynález demonstruje, že angiogeneze v tkáních vyžaduje integrin ανβ3 a že inhibitory ανβ3 mohou angiogenezi inhibovat. Vynález také demonstruje, že antagonisté dalších integrinů, jako ανβ5 nebo ανβι, angiogenezi neinhibují patrně proto, že tyto další integriny nejsou pro výskyt angiogeneze esenciální.
Předkládaný vynález proto popisuje použití ανβ3 antagonisty pro přípravu léčiva pro inhibici angiogeneze v tkáni včetně podání prostředku do tkáně, zahrnujícího množství ανβ3 antagonisty, inhibující angiogenezi.
Tkání určenou k léčbě může být jakákoliv tkáň, ve které je žádoucí inhibovat angiogenezi, jako je např. nemocná tkáň s výskytem neovaskularizace. Příklady tkání zahrnují zanícenou tkáň, pevné nádory, metastázy, tkáně s restenózou apod.
Antagonista ανβ3 k použití podle předkládaného vynálezu je schopen vazby na ανβ3 a kompetitivně inhibovat schopnost ανβ3 vázat přirozený ligand. Výhodně antagonista vykazuje specifítu pro ανβ3 před ostatními integriny. Ve zvláště výhodném provedení inhibuje antagonista ανβ3 vazbu fíbrinogenu nebo jiných RGD-obsahujících ligandů na ανβ3, ale zásadně neinhibuje vazbu fíbronektinu na απνβ3· Výhodným antagonistou ανβ3 může být polypeptid nebo monoklonální protilátka, nebo jejich funkční fragment, který imunoreaguje s ανβ3.
Shrnutí obsahu vynálezu
Předkládaný vynález popisuje způsoby inhibice angiogeneze v tkáních a použití vitronektin-a^3 antagonistů a zvláště inhibice angiogeneze v zanícených a nádorových tkáních a metastázách za využití terapeutických prostředků, obsahujících antagonisty ανβ3.
Popis obrázků
Obrázky ilustrují část předkládaného vynálezu.
Obrázky 1A až ID znázorňují distribuci podjednotek integrinů β3 a β1? v tkáni, a to v normální pokožce a pokožce s probíhajícím hojením poranění, označené jako granulační tkáň. Imunohistochemie s protilátkami proti β3 a βι byla prováděna podle popisu v příkladu 3A. Obrázky lAa 1B znázorňují imunoreaktivitu anti-$3 v normální pokožce a granulační tkáni. Obrázky 1C a ID znázorňují imunoreaktivitu anti-βι v normální pokožce a granulační tkáni.
Obrázky 2A až 2D znázorňují distribuci vtkáni pro von Willebrandův faktor a laminovaný ligand, které vážou β3 a βι podjednotky integrinů v normální pokožce a v pokožce s probíhajícím hojením poranění, označené jako granulační tkáň. Imunohistochemie s protilátkami proti von
-3 CZ 294650 B6
Willebrandovu faktoru (anti-vWF) a lamininu (anti-laminin) byla prováděna podle popisu v příkladu 3B. Obrázky 2A a 2B znázorňují imunoreaktivitu anti-vWF v normální pokožce a granulační tkáni. Obrázky 2C a 2D znázorňují imunoreaktivitu anti-lamininu v normální pokožce a granulační tkáni.
Obrázky 3A až 3D znázorňují distribuci integrinu s vitronektinovým receptorem, ανβ3, v biopsované tkáni rakoviny močového měchýře, rakoviny tračníku, rakoviny prsu a rakoviny plic. Imunohistochemie s protilátkou LM609 proti ανβ3 byla prováděna podle popisu v příkladu 3C.
Obrázek 4 znázorňuje typickou mikrofotografíi CAM podle předkládaného vynálezu, nemající krevní cév v 10 dní starém kuřecím embryu, nepodrobeném působení. Preparát je popsán v příkladu 5B.
Obrázky 5A až 5C znázorňují distribuci integrinů βι a ανβ3 v tkáni v CAM preparátu podle předkládaného vynálezu. Obrázek 5A ukazuje distribuci βι podjednotky v 10 dní starém CAM preparátu, který nebyl podroben působení, přičemž distribuce byla detekována imunofluorescencí imunoreaktivity s CSAT, tj. anti-βι protilátkou. Obrázek 5B ukazuje distribuci ανβ3 receptoru v 10 dní starém CAM preparátu, který nebyl podroben působení, přičemž distribuce byla detekována imunofluorescencí imunoreaktivity sLM609, tj. anti-avB3 protilátkou. Obrázek 5C ukazuje distribuci ανβ3 receptoru v 10 dní starém CAM preparátu, který byl podroben působení bFGF, přičemž distribuce byla detekována imunofluorescencí imunoreaktivity sLM609, tj. anti-avB3 protilátkou. Působení a výsledky jsou popsány v příkladu 5C.
Obrázek 6 znázorňuje ve sloupcovém grafu kvantifikaci relativní exprese ανβ3 a βι v preparátu, nepodrobeném působení a v 10 dní starém CAM preparátu, který byl podroben působení bFGF, jak je popsáno v příkladu 6A. Průměrná intenzita fluorescence je vynesena na ose Y a profily integrinu na ose X.
Obrázky 7A až C znázorňují vzhled 10 dní starého CAM preparátu, nepodrobeného působení, CAM preparátu, podrobeného působení bFGF a CAM preparátu, podrobeného působení TNFa, přičemž způsoby a výsledky jsou popsány v příkladu 6A.
Obrázky 8A až 8E znázorňují účinek působení aktuální protilátky na FGF-indukovanou angiogenezi v 10 dní starém CAM preparátu (popsáno v příkladu 7A1). Obrázek 8A ukazuje CAM preparát, nepodrobený působení, který nemá krevní cévy. Obrázek 8B ukazuje infiltraci nových cévních svazků do místa dříve bez cév, indukovanou působením bFGF. Obrázky 8C, 8D a 8E ukazují účinky protilátek proti βι (anti-β]; CSAT), ανβ5 (anti-civBs; P3G2) a ανβ3 (anti-avB3; LM609).
Obrázky 9A až 9C znázorňují účinek intravenózní injekce syntetického peptidu 66203 na angiogenezi indukovanou nádory, jak popisuje příklad 7D2). Obrázek 9A ukazuje, že u intravenózního působení kontrolním peptidem (kontrolní peptid, nádor) chybí inhibiční účinek na angiogenezi, vyplývající z indukce nádoru. Inhibice takové angiogeneze intravenózní injekcí peptidu 66203 (cyklický RGD, nádor) je ukázána na obrázku 9B. Chybějící inhibiční účinky nebo cytotoxicita na zralých již existujících cévách následně po intravenózní infuzi peptidu 66203 v místě sousedícím s místem, kde je působení podroben nádor, ukazuje obrázek 9C (cyklický RGD, sousedství s CAM).
Obrázky 10A až 10C znázorňují účinek intravenózní aplikace monoklonálních protilátek na angiogenezi, indukovanou růstovým faktorem, jak popisuje příklad 7B1). Obrázek 10A ukazuje bFGF-indukovanou angiogenezi, nevystavenou působení protilátky (kontrola). Působením anti-avB5 protilátky P3G2 na podobný preparát nedošlo k žádné inhibici angiogeneze, jak ukazuje obrázek 10B. K inhibici angiogeneze došlo působením anti-avB3 protilátky LM609, jak ukazuje obrázek 10C.
-4CZ 294650 B6
Obrázky 11A až 11C znázorňují účinek na angiogenezi embrya, následující po místní aplikaci anti-integrinovými protilátkami, jak popisuje příklad 7C. Angiogeneze nebyla inhibována působením anti-β] a anti-av$3 protilátkami na 6 dnů starý CAM preparát, jak ukazují obrázky 11A a 11B. Oproti tomu působení anti-avp3 protilátkou LM609 vedlo k inhibici tvorby krevních cév, jak ukazuje obrázek 11C.
Obrázek 12 znázorňuje kvantifikaci množství cév, vstupujících do nádoru v CAM preparátu, jak popisuje příklad 7D1). Graf ukazuje počet cév, vynesený na ose Y, vyplývající z místí aplikace buď CSAT (anti-β!), LM609 (αηΐί-ανβ3) nebo p3G2 (anti-a^s).
Obrázky 13A až 13D znázorňují srovnání hmotností čerstvých nádorů 7 dnů po působení a hmotností počátečních nádorů, jak popisuje příklad 9Al)a. Každý sloupec reprezentuje průměrně +/— standardní odchylky 5 až 10 nádorů na skupinu. Nádory pocházely z lidského melanomu (M21L) (obr. 13A), nádoru pankreatu (Fg) (obr. 13B), nádoru plic (UCLAP-3) (obr. 13C) a nádoru hrtanu (HEp3) (obr. 13D) CAM preparátů a byly podrobeny intravenóznímu působení PBS, CSAT (anti-βι) nebo LM609 (anti-<x^3). Na grafech jsou na ose Y vyneseny hmotnosti nádoru, vyplývající z intravenózní aplikace buď CSAT (anti-βι), LM609 (anti-a^3) nebo PBS, vyznačených na ose X.
Obrázek 14A a 14B znázorňují histologické řezy nádorů, podrobených působení P3G2 (anti-av$5) (obr. 14A) a LM609 (anti-a^3) (obr. 14B), barvené hematoxylinem a eosinem, jak popisuje příklad 9Al)a. Jak je vidět z obrázku 14A, nádory, podrobené působení kontrolní protilátky (P3G2), vykazují množství životaschopných a aktivně se dělících nádorových buněk, jak indikují mitotické buňky (viz klínky) i mnohočetné krevní cévy (šipky) skrz stroma nádoru. Naopak (viz obr. 14B) v nádorech podrobených působení LM609 (anti-cc^3) je velmi málo (pokud vůbec) životaschopných nádorových buněk nebo krevních cév.
Obrázky 15A až 15E odpovídají M21-L nádorům podrobeným, na které se působilo peptidy, jak popisuje příklad 9Al)b, a jsou následující: obr. 15A, kontrolní cyklický peptid (69601); obr. 15B, cyklický RGD peptid (66203); obr. 15C, sousední CAM tkáň odebraná ze stejných embryí, podrobených působení cyklickým RGD peptidem (66203) a velké zvětšení (13x) nádorů, podrobených působení kontrolním RAD (69601) na obr. 15D nebo cyklickým RGD peptidem (66203) na obr. 15E. Obrázek 15D znázorňuje normální cévy v nádoru, podrobeném působení RAD kontrolního peptidu (69601). Obrázek 15E znázorňuje příklady rozrušených krevních cév v nádoru, podrobeném působení cyklického RGD peptidu (66203) (viz šipky). Obrázky 16A až 16E znázorňují inhibici angiogeneze antagonisty angiogeneze stanovením in vivo v králičím modelu oka, jak popisuje příklad 10. Obrázek 16A a 16B znázorňují angiogenezi králičího oka v přítomnosti bFGF a mAb LM609 (anti-av^3).
Obrázek 17 znázorňuje postupový diagram, kde je zaznamenán postup generování modelu chimérická myš in vivo: člověk, jak je popsáno v příkladu 11 A. Část kůže SCID myši byla nahrazena lidskou neonatální předkožkou a byla ponechána 4 týdny odhojovat. Po odhojení štěpu byla lidská předkožka zaočkována lidskými nádorovými buňkami. Během následující periody 4 týdnů se vytvořil měřitelný nádor, který zahrnoval lidský nádor s lidskou sítí cév, prorůstající z lidské kůže do lidského nádoru.
Obrázek 18 znázorňuje procenta jednotlivých buněk, pocházejících z CAM preparátů, podrobených působení mAb a peptidu, barvených Apop Tag a stanovených analýzou FACS, jak popisuje příklad 12A a 12B. Černé a tečkované sloupce znázorňují buňky z embryí, podrobených působení po dobu 24 hodin, respektive 48 hodin před stanovením. Každý sloupec znázorňuje průměrnou +/- střední odchylku tří kopií. CAM preparáty byly podrobeny působení mAb LM609 (antiανβ3) nebo CSAT (anti-β^ nebo pBS, jak popisuje příklad 12A2. CAM preparáty byly také podrobeny působení cyklického peptidu 66203 (cyklo-RGDfV, označeného jako peptid 203)
-5 CZ 294650 B6 nebo kontrolního cyklického peptidu 66203 (cyklo-RGDfV, označeného jako peptid 203) nebo kontrolního cyklického peptidu 69601 (cyklo-RADfV, označeného jako peptid 601), jak popisuje příklad 12B.
Obrázky 19A a 19B znázorňují kombinované výsledky jednotlivých buněčných suspenzí CAM preparátů z embryí, podrobených působení buď CSAT (anti-β]) (obr. 19A) nebo LM609 (anti-av33) (obr: 19B), barvených Apop Tag a propidiumjodidem a analyzovaných FACS, jak popisuje příklad 12C. Na ose Y je vyneseno barvení Apop Tag v počtu buněk (apoptóza), na ose X je vyneseno barvení propidiumjodidem (obsah DNA). Horizontální čára znázorňuje negativní přívody pro Apop Tag barvení. Levý a pravý obrázek vyznačují buňky CAM z embryí, podrobených působení CSAT (anti-βι) (obr. 19A), respektive LM609 (anti-a^3) (obr. 19B). Analýza buněčného cyklu byla provedena analýzou přibližně 8000 cyklů za daných podmínek. Obrázky 20A až 20C znázorňují CAM tkáň z embiyí, podrobených působení CSAT (anti-βι) a obrázky 20D až 20F znázorňují CAM tkáň z embryí, podrobených působení LM609 (anti—«νβ3), jak popisuje příklad 12C. Obrázky 20a a 20D znázorňují tkáně, barvené Apop Tag a vizualizované fluorescencí (FITC) vrstvenou na D.I.C. obrazu. Obrázky 20B a 20E znázorňují stejné tkáně, barvené mAb LM609 (anti-avp3) a vizualizované fluorescencí rhodaminu). Obrázky 20C a 20F znázorňují spojené obrazy stejných tkání, barvených Apop Tag a LM609, kde žluté barvivo znázorňuje kolokalizaci. Čárka vyznačuje 15 a 50 mm v levém i pravém panelu.
Provedení vynálezu
A. Definice
Aminokyselinový zbytek: Aminokyselina vzniklá chemickým štěpením (hydrolýzou) polypeptidu v jeho peptidické vazbě. Aminokyselinové zbytky zde popsané jsou výhodně v „L“ izomerní formě. Ovšem zbytky v „D“ izomerní formě lze nahradit jakýmkoliv L-aminokyselinovým zbytkem za předpokladu zachování požadovaných funkčních vlastností polypeptidu. NH2 se vztahuje k volné aminokyselinové skupině, přítomné na aminokonci polypeptidu. COOH se vztahuje k volné karboxyskupině, přítomné na karboxylovém konci polypeptidu. V souladu se standardním názvoslovím polypeptidů (viz J. Biol. Chem.: 243, 3552-59 (1969) a přijatý CFR 1.822(b)(2)) jsou zkratky aminokyselinových zbytků uvedeny v následující tabulce.
Tabulka přiřazení zkratky názvu aminokyseliny
Symbol Aminokyselina
Y Tyr tyrosin
G Gly glycin
F Phe fenylalanin
M Met methionin
A Ala alanin
S Ser serin
I Ile izoleucin
L Leu leucin
T Thr threonin
V Val valin
P Pro prolin
K Lys lysin
H His histidin
-6CZ 294650 B6
Tabulka - pokračování
Symbol Aminokyselina
Q Gin glutamin
E Glu kyselina glutamová
Z Glx Glu a/nebo Gin
w Trp tryptofan
R Arg arginin
D Asp kyselina asparagová
N Asn asparagin
B Asx Asn a/nebo Asp
C Cys cystein
X Xaa neznámá/jiná
Další zkratky znamenají:
BOC /erc-butoxykarbonyl
DCCI dicyklohexylkarbodiimid
DMF dimethylformamid
OMe methoxy
HOBT 1 -hydroxybenzthiazol
Za povšimnutí stojí, že všechny sekvence aminokyselinových zbytků jsou zde uvedeny vzorcem, jehož levá a pravá orientace je v konvenčním směru od amino-konce ke karboxy-konci. Dále, že pomlčka na začátku nebo konci sekvence aminokyselinového zbytku označuje peptidickou vazbu k další sekvenci jednoho nebo více aminokyselinových zbytků.
Polypeptid: vztahuje se k lineární řadě aminokyselinových zbytků, napojených jeden k druhému peptidickými vazbami mezi alfa-aminoskupinou a karboxyskupinou navazujících aminokyselinových zbytků.
Peptid: tento termín zde označuje lineární řadu ne více než 50 aminokyselinových zbytků, napojených jeden k druhému jako v polypeptidu.
Cyklický peptid (cyklopeptid): je odvozen od odpovídajícího lineárního peptidu a označuje peptid, který nemá volný N- nebo C-konec a kde N-konec odpovídajícího lineárního peptidu tvoří amidovou vazbu s karboxylem C-konce tohoto odpovídajícího lineárního peptidu.
Protein: vztahuje se k lineárním řadám více než 50 aminokyselinových zbytků, napojených jeden k druhému jako v polypeptidu.
Syntetický peptid: vztahuje se k chemicky vyrobenému řetězci aminokyselinových zbytků, spojem ných k sobě peptidickými vazbami, který nemá proteiny a jejich fragmenty, vyskytující se v přírodě.
B. Obecné úvahy
Předkládaný vynález se týká obecně objevu, že angiogeneze je zprostředkována pomocí specifického vitronektinového receptoru ανβ3 a že inhibice funkcí θνβ3 inhibuje angiogenezi. Tento objev je důležitý kvůli roli, kterou angiogeneze hraje v široké škále onemocnění a jejich průběhu. Inhibicí angiogeneze lze zasahovat do onemocnění, zlepšit symptomy a v některých případech onemocnění léčit.
V případě, že růst nových krevních cév je příčinou, nebo k ní přispívá, patologických projevů spojených s onemocněním, inhibice angiogeneze sníží Škodlivé účinky onemocnění. Příklady zahrnují revmatoidní artritidu, diabetickou retinopatii, zánětlivá onemocnění, restenózu apod.
V případě, že je růst nových krevních cév vyžadován k podpoře růstu zhoubné tkáně, inhibice angiogeneze sníží přívod krve do tkáně a tím přispěje ke snížení hmoty tkáně, založené na požadavku přívodu krve. Příklady zahrnují růst nádorů, kde je neovaskularizace kontinuálním požadavkem z důvodu, že nádor roste do tloušťky přes několik milimetrů a k vytvoření pevných nádorových metastáz. Způsoby podle předkládaného vynálezu jsou zvláště účinné, protože terapie je vysoce selektivní pro angiogenezi a ne pro ostatní biologické pochody. Jak je uvedeno v příkladech, pouze nově rostoucí cévy obsahují značné množství ανβ3, a proto nemají terapeutické způsoby nepříznivé účinky na zralé cévy. Navíc ανβ3 není široce distribuován v normálních tkáních, ale v dostatečném množství se selektivně nalézá v nových cévách, což zajišťuje, že terapii lze selektivně cílit na nově rostoucí cévy.
Objev, že inhibice ανβ3 samotného bude účinně inhibovat angiogenezi, umožňuje vývoj terapeutických prostředků s potenciálně vysokou specifítou, a proto nízkou toxicitou. Takže ačkoliv předkládaný vynález popisuje použití prostředků, založených na peptidech, které mají schopnost inhibovat jeden nebo více integrinů, lze navrhnout i další prostředky, které selektivněji inhibují ανβ3, a proto nemají vedlejší účinky, vyvolané inhibicí dalších biologických pochodů kromě pochodů zprostředkovaných ανβ3.
Jak ukazuje předkládaný vynález, je např. možné připravit monoklonální protilátky vysoce selektivní k imunoreakci s ανβ3, které podobně selektivně inhibují funkci ανβ3. Navíc lze peptidy, obsahující RGD, navrhnout tak, aby selektivně inhibovaly ανβ3, jak je popsáno dále.
V době před objevy předkládaného vynálezu nebylo známo, že by angiogeneze, a jakýkoliv proces závislý na angiogenezi, mohla být inhibována in vivo použitím prostředků, které bymohly mít opačný účinek na biologickou funkci ανβ3·
C. Způsoby inhibice angiogeneze
Předkládaný vynález poskytuje způsob inhibice angiogeneze v tkáni, a tím inhibice dějů v tkáni, které závisejí na angiogenezi. Obecně tento způsob zahrnuje podání prostředku do tkáně, který zahrnuje ανβ3 antagonistu v množství, inhibujícím angiogenezi.
Jak již bylo popsáno dříve, angiogeneze zahrnuje množství pochodů, do kterých patří neovaskularizace tkáně včetně „pučení“, vaskulogeneze nebo rozrůstání cév, přičemž všechny tyto pochody angiogeneze jsou zprostředkovány a závislé na expresi ανβ3· S výjimkou traumatického hojení poranění, tvorby corpusu luteum a embryogeneze se věří, že většina pochodů angiogeneze je spojena s průběhy onemocnění, a proto jsou terapeutické způsoby podle předkládaného vynálezu selektivní pro onemocnění a nemají škodlivé vedlejší účinky.
Existuje mnoho onemocnění, u kterých se předpokládá důležitost angiogeneze, která zahrnují, ale nejsou na ně omezena, zánětlivá onemocnění jako je imunitní a neimunitní zánět, chronický artikulární revmatismus a psoriáza, poruchy spojené s nepřiměřenou a nevhodnou invazí cév, jako je diabetická retinopatie, neovaskulámí glaukom, restenóza, kapilární proliferace v aterosklerotických plácích a osteoporóza a poruchy spojené s rakovinou, jako jsou pevné nádory, pevné nádorové metastázy, angiofíbromy, retrolentální fíbroplazie, hemangiomy, Kaposiho sarkom a podobné rakoviny, které vyžadují neovaskularizaci jako podporu nádorového růstu.
Takže způsoby, které inhibují angiogenezi v nemocné tkáni, zlepšují symptomy onemocnění a, v závislosti na typu onemocnění, lze přispět i k léčbě onemocnění. V jednom provedení předkládaného vynálezu je uvažováno o inhibici angiogeneze, per se, v tkáni. Rozšíření angiogeneze v tkáni, a poté rozšíření inhibice dosažené způsoby podle předkládaného vynálezu, lze vyhodnotit
-8CZ 294650 B6 mnoha způsoby (popsanými v příkladech) detekce avp3-imunopozitivních nezralých a nascentních cévních struktur pomocí imunohistochemie.
Jak je zde popsáno, jakákoliv z mnoha tkání nebo orgánů, sestávajících z organizovaných tkání, může za podmínek onemocnění podporovat angiogenezi, a to včetně kůže, svalů, střev, pojivových tkání, kostí a podobných tkání, do kterých mohou po angiogenním podnětu pronikat krevní cévy.
V jednom podobném provedení předkládaného vynálezu je tkání, určenou k léčbě, zanícená tkáň a angiogenezi určenou k inhibici je angiogeneze zanícené tkáně, kde probíhá neovaskularizace zanícené tkáně. V tomto případě daný způsob očekává inhibici angiogeneze v artritických tkáních, tedy u pacientů s chronickým artikulárním revmatem, v imunitně nebo neimunitně zánětlivých tkáních, v tkáních postižených psoriázou apod.
Pacient podrobený léčbě podle předkládaného vynálezu v jeho mnoha provedeních je nejlépe lidský pacient, ačkoliv je zřejmé, že principy předkládaného vynálezu indikují, že předkládaný vynález je účinný, pokud jde o všechny savce, zahrnuté do termínu „pacient“. V tomto kontextu je savcem myšlen jakýkoliv druh savce, u kterého je žádoucí provést léčbu onemocnění, spojených s angiogenezi, zvláště druhy zemědělských a domácích druhů savců.
V jiném podobném provedení je tkání určenou k léčbě tkáň sítnice pacienta, trpícího diabetickou retinopatii, rozkladem svalové hmoty nebo neovaskulámím glaukomem a angiogenezi určenou k inhibici je angiogeneze v tkáni sítnice, kde probíhá neovaskularizace tkáně sítnice.
V dalším podobném provedení předkládaného vynálezu je tkání určenou k léčbě nádorová tkáň pacienta, majícího pevný nádor, metastázy, rakovinu kůže, nádor prsu, hemangiom nebo angiofíbrom a podobné typy rakoviny, a angiogenezi určenou k inhibici je angiogeneze nádorové tkáně, kde probíhá neovaskularizace nádorové tkáně. Typickými tkáněmi s pevným nádorem, léčitelnými způsoby podle předkládaného vynálezu, jsou plíce, slinivka, prsy, tračník, hrtan, vaječníky a podobné tkáně. Příklady angiogenezi nádorových tkání a jejich inhibice jsou popsány v příkladech.
Inhibice angiogeneze nádorové tkáně je zvláště výhodným provedením předkládaného vynálezu kvůli důležitosti role neovaskularizace, kterou hraje při nádorovém růstu. Chybí-li děj neovaskularizace v nádorové tkáni, nemůže nádorová tkáň získat potřebné živiny, zpomaluje svůj růst, zastavuje další růst, dochází kjejí regresi a konečně nastává nekróza, vedoucí k umrtvení nádoru.
Jinými slovy řečeno předkládaný vynález poskytuje způsob inhibice neovaskularizace nádoru inhibici angiogeneze nádoru v souladu se způsoby podle předkládaného vynálezu. Podobně předkládaný vynález poskytuje způsob inhibice nádorového růstu použitím způsobů, inhibujících angiogenezi.
Tyto způsoby jsou také zvláště účinné proti tvorbě metastáz, protože (1) jejich tvorba vyžaduje vaskularizaci primárního nádoru, takže mestatické nádorové buňky mohou opustit primámínádor a (2) jejich usazení v sekundárním místě vyžaduje neovaskularizaci kpodpoře růstu metastáz.
V podobném provedení předkládaný vynález předpokládá použití tohoto způsobu ve spojení s dalšími terapiemi, jako je běžná chemoterapie, cílená proti pevným nádorům, a ke kontrole tvorby metastáz. Podání inhibitoru angiogeneze je obvykle prováděno během nebo po ukončení chemoterapie, ačkoliv je výhodné inhibovat angiogenezi po chemoterapii v době, kdy bude nádorová tkáň odpovídat na toxický atak indukcí angiogeneze, aby si opět zajistila zásobování krví a živinami. Dále je výhodné použít způsob inhibice angiogeneze po chirurgickém zákroku, kdy byl odstraněn pevný nádor, jako prevenci před vznikem metastáz.
-9CZ 294650 B6
Pokud jsou způsoby podle předkládaného vynálezu použity k inhibici neovaskularizace nádoru, tyto způsoby lze také použít k inhibici růstu nádorové tkáně, k inhibici tvorby nádorových metastáz a ústupu již vzniklých nádorů. Příklady znázorňují regresi vzniklého nádoru s následným podáním antagonisty ανβ3 podle předkládaného vynálezu.
Restenóza je proces migrace a proliferace buněk hladkého svalstva (BHS) v místě perkutánní transluminální koronární angioplazie, která brání úspěšné angioplazií. Migrace a proliferace BHS během restenózy může být uvažována jako pochod angiogeneze, který je inhibován způsoby podle předkládaného vynálezu. Předkládaný vynález proto také počítá s inhibici restenózy inhibici angiogeneze v souladu se způsoby podle předkládaného vynálezu u pacienta následně po procedurách angioplazie. K inhibici restenózy je výhodně podáván antagonista ανβ3, a to po procedurách angioplazie po dobu od 2 do 28 dní, výhodněji po dobu prvních 14 dnů po proceduře.
Tento způsob inhibice angiogeneze v tkáni, a proto také použití způsobů léčby chorob, týkajících se angiogeneze, zahrnuje kontaktování tkáně, kde se angiogeneze vyskytuje nebo existuje riziko jejího výskytu, s prostředkem zahrnujícím terapeuticky účinné množství antagonisty ανβ3, schopným inhibovat ανβ3 vazbou na jeho přirozený ligand. Takže tento způsob zahrnuje podání terapeuticky účinného množství fyziologicky tolerovatelného prostředku pacientovi, přičemž prostředek obsahuje antagonistu ανβ3 podle předkládaného vynálezu.
Rozsah dávkování pro podávání antagonisty θνβ3 závisí na formě antagonisty a jeho účinnosti, jak je popsáno dále, a množství jsou dostatečně velká tak, aby došlo ke vzniku požadovaného účinku, při kterém se angiogeneze a symptomy onemocnění zprostředkované angiogenezí zlepší. Dávkování by nemělo být tak velké, aby nezpůsobilo nepříznivé vedlejší účinky, jako jsou hyperviskozitní syndromy, pulmonární edém, selhání srdce v důsledku jeho překrvení apod. Obecně se bude dávkování lišit podle věku, kondice, pohlaví a rozsahu onemocnění pacienta a lze je určit odborníkem. Dávkování může také upravit sám lékař vpřípadě jakékoliv komplikace.
Terapeuticky účinné množství je množství antagonisty ανβ3, dostatečné k produkci měřitelné inhibice angiogeneze v tkáni určené k léčbě, tj. množství inhibující angiogenezi. Inhibice angiogeneze lze měřit in šitu imunohistochemicky, jak je zde popsáno, nebo dalšími způsoby známými osobě, obeznámené s problematikou oboru.
Takže pokud je antagonista ανβ3 schopen přijmout mimetickou formu ανβ3, peptid obsahující RGD, anti-o^3 monoklonální protilátku nebo jejich fragment, je nutné si uvědomit, že účinnost, a tedy i výraz „terapeuticky účinné“ množství se může lišit. Ovšem jak ukazují způsoby stanovení podle předkládaného vynálezu, osoba obeznámená s technikou může snadno odhadnout účinnost možného antagonisty ανβ3.
Účinnost antagonisty ανβ3 lze měřit mnoha způsoby, zahrnujícího inhibici angiogeneze v CAM stanovení, v in vivo stanovení v králičím oku, v in vivo stanovení chimérická myšxlověk a měřením inhibice vazby přirozeného ligandu nac^3 (všechny tyto způsoby jsou popsány zde) apod.
Výhodný antagonista ανβ3 má schopnost značně inhibovat vazbu přirozeného ligandu, jako je fíbrinogen nebo vitronektin na ανβ3 v roztoku o koncentraci antagonisty menší než 0,5 mikromolární (mm), výhodně menší než 0,1 mm a výhodněji menší než 0,05 mm. Výrazem „značně“ je míněno to, že je v důsledku inhibice v přítomnosti antagonisty ανβ3 pozorováno nejméně 50% snížení vázání fibrinogenu a 50% inhibice je zde označena jako hodnota IC50·
Výhodnější antagonista ανβ3 vykazuje selektivitu k ανβ3 na rozdíl od ostatních integrinů. Takže výhodný antagonista ανβ3 značně inhibuje fíbrinogen vázající ανβ3, ale neinhibuje dostatečně vazbu fibrinogenu na jiný integrin, jako je ανβι, «νβδ nebo αιπ>β3. Zvláště výhodný je antagonista ανβ3, který vykazuje lOx až lOOx nižší IC50 aktivitu při inhibici vazby fibrinogenu na ανβ3 ve
-10CZ 294650 B6 srovnání s IC50 aktivitou při inhibici vazby fíbrinogenu na jiný integrin. Příklady stanovení použitých k měření IC5o aktivity při inhibici vazby fíbrinogenu na integrin jsou popsány v příkladech.
Terapeuticky účinné množství antagonisty ανβ3 podle předkládaného vynálezu ve formě monoklonální protilátky je obvykle množství, které je, je-li podáváno ve fyziologicky tolerovatelném prostředku, dostatečné k dosažení koncentrace v plazmě od 0,01 mikrogramu (mg) na mililitr (ml) do 100 mg/ml, výhodně od 1 mg/ml do 5 mg/ml a obvykle 5 mg/ml. Jinak vyjádřeno může být dávkování v rozsahu od 0,1 mg/kg do 300 mg/kg, výhodně od 0,2 mg/kg do 200 mg/kg, nejvýhodněji od 0,5 mg/kg do 20 mg/kg, v jedné nebo více dávkách podávaných denně, po dobu jednoho nebo několika dní.
Je-li antagonista ve formě fragmentu monoklonální protilátky, lze množství snadno upravit způsobem, založeným na relativní hmotnosti fragmentu vzhledem k hmotnosti celé protilátky. Výhodná plazmatická koncentrace, uvedená jako molarita, je od 2 mikromolární (μΜ) do 5 milimolární (mM) a výhodně od 100 μΜ do 1 mM antagonisty ve formě protilátky.
Terapeuticky účinné množství antagonisty ανβ3 podle předkládaného vynálezu ve formě polypeptidu nebo další velikostí podobné malé molekuly jako mimetické formy ανβ3 je obvykle množství polypeptidů takové, které je, je-li podáváno ve fyziologicky tolerovatelném prostředku, dostatečné k dosažení koncentrace v plazmě od 0,1 mikrogramu (pg) na mililitr (ml) do 200 mg/ml, výhodně od 1 pg/ml do 150 pg/ml. Vztaženo k polypeptidů o hmotnosti 500 g/mol je výhodná koncentrace plazmy v molaritě od 2 mikromolární (μΜ) do 5 milimolární (mM) a výhodně od 100 μΜ do 1 mM antagonisty ve formě peptidu. Jinak vyjádřeno se může dávkování, vztažené na tělesnou hmotnost, pohybovat v rozsahu od 0,1 mg/kg do 300 mg/kg, výhodně od 0,2 mg/kg do 200 mg/kg, v jedné nebo více dávkách podávaných denně, po dobu jednoho nebo několika dní.
Monoklonální protilátky nebo polypeptidy podle předkládaného vynálezu lze podávat parenterálně injekcí nebo postupnou infuzí během určené doby. Ačkoliv tkáň určená k léčbě může být v těle obvykle dosažitelná pomocí podání do krevního oběhu, a proto mnohem častěji léčena intravenózním podáním terapeutických prostředků, ale v případě, že existuje pravděpodobnost, že cílená tkáň obsahuje cílovou molekulu, uvažuje se o jiných tkáních a způsobech doručení. Takže monoklonální protilátky nebo polypeptidy podle předkládaného vynálezu lze podávat intravenózně, intraperitoneálně, intramuskulámě, subkutánně, dovnitř dutin, transdermálně a lze je doručovat peristaltickými způsoby.
Terapeutické prostředky, obsahují monoklonální protilátku nebo polypeptid podle předkládaného vynálezu, jsou běžně podávány intravenózně, např. injekcí dávkové jednotky. Termín „dávková jednotka“, je-li použit ve vztahu k terapeutickému prostředku podle předkládaného vynálezu, se týká fyzikálně oddělených jednotek, vhodných jako jednotkové dávkování pro daný subjekt, přičemž každá jednotka obsahuje předem určené množství aktivního materiálu vypočtené tak, aby bylo dosaženo požadovaného terapeutického účinku, spolu s požadovaným rozpouštědlem, tj. nosičem nebo vehikulem.
V jednom výhodném provedení předkládaného vynálezu je v příkladech ukázáno, že antagonista ανβ3 je podáván intravenózně v jednotlivé dávce.
Prostředky jsou podávány způsobem kompatibilním s dávkovou formou a v terapeuticky účinném množství. Množství určené k podání a časové rozložení závisí na subjektu, který má být léčen, kapacitě oběhového systému subjektu využít aktivní složku a stupni požadovaného terapeutického účinku. Přesná množství aktivní složky, nutné k podání, závisejí na posudku osoby obeznámené s technikou a jsou individuální pro každého jednotlivce. Vhodné dávkové rozsahy pro aplikaci do krevního oběhu jsou však uvedeny zde a závisejí na způsobu podávání. Vhodné
- 11 CZ 294650 B6 režimy podávání jsou také variabilní, ale typickým případem je počáteční podání následované opakovanými dávkami v intervalech jedné nebo více hodin, a to postupnou injikací nebo dalším podáním. Alternativně je uvažováno o kontinuální intravenózní infuzi, dostatečné k dosažení koncentrací v krvi v rozsahu specifických pro terapie in vivo.
Jak znázorňují předkládané příklady, k inhibici angiogeneze a regresi nádoru dochází nejdříve 7 dní po počátečním kontaktu s antagonistou. Další nebo prodloužené působení antagonistou je výhodné po dobu od 7 dní do 6 týdnů, výhodně od 14 do 28 dní.
V obdobném provedení příklady znázorňují vztah mezi inhibici ανβ3 a indukcí apoptózy v neovaskulárních buňkách, dopravujících ανβ3· Předkládaný vynález tedy také počítá s využitím způsobů inhibice apoptózy v neovaskulámí síti tkáně. Tento způsob je prováděn zásadně, jak je popsáno zde, k inhibici angiogeneze ve všech tkáních a za podmínek zde popsaných. Jediným důležitým rozdílem je účinek v čase, který u apoptózy probíhá rychle, obvykle 48 hodin po kontaktu s antagonistou, zatímco inhibice angiogeneze a regrese nádoru probíhá mnohem pomaleji, jak je popsáno zde. Tento rozdíl má nepříznivý vliv na terapeutický režim vzhledem k času podání a požadovanému účinku. Obvykle lze provést podání pro apoptózu neovaskulámí sítě od 24 hodin do 4 týdnů, i když výhodně je 48 hodin až 7 dní.
D. Terapeutické prostředky
Předkládaný vynález se zabývá terapeutickými prostředky, vhodnými k použití terapeutickými způsoby zde popsanými. Terapeutické prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují fyziologicky tolerovatelný nosič spolu s antagonistou ανβ3, jak je zde popsáno, rozpuštěným nebo dispergovaným jako aktivní složka. Ve výhodném provedení terapeutický prostředek, obsahující antagonistu ανβ3, není imunogenní, je-li podáván savcům nebo lidským pacientům za terapeutickými účely.
Zde použité termíny „farmaceuticky přijatelný“, „fyziologický tolerovatelný“ a jeho gramatické obměny se týkají prostředků, nosičů, rozpouštědel a reagencií, jsou zaměnitelné a znamenají, že dané materiály jsou vhodné k podávání savcům bez nežádoucích fyziologických účinků, jako je nechutenství, závratě, žaludeční nevolnost apod.
Příprava farmakologického prostředku, který obsahuje aktivní složky v něm rozpuštěné nebo dispergované, je dobře známa v oboru a není omezena typem prostředku. Takové prostředky jsou obvykle připravovány jako injikovatelné, a to buď jako kapalné roztoky nebo suspenze, ale lze také připravit pevné formy vhodné k rozpuštění nebo k vytvoření suspenze v roztoku před vlastním použitím. Prostředek také může být emulgovaný.
Aktivní složku lze smíchat s excipienty, které jsou farmaceuticky přijatelné a kompatibilní s aktivní složkou a v množství vhodném k použití v terapeutických způsobech zde popsaných. Vhodnými excipienty je např. voda, fyziologický roztok, dextróza, glycerol, ethanol nebo podobně a jejich kombinace. Dále může prostředek obsahovat, je-li to požadováno, minoritní množství pomocných látek, jako jsou zvlhčovadla nebo emulgační činidla, tlumivé roztoky k udržování pH apod., které zesilují účinnost aktivní složky.
Terapeutický prostředek podle předkládaného vynálezu zahrnuje farmaceuticky přijatelné soli jeho složek. Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují příspěvky solí kyselin (tvořené volnými aminoskupinami polypeptidu), které jsou tvořeny anorganickými kyselinami, jako je např. kyselina chlorovodíková nebo orthofosforečná nebo organickými kyselinami, jako je kyselina octová, vinná, mandlová apod. Soli tvořené volnými karboxylovými skupinami mohou také pocházet z anorganických bází, jako jsou např. sodné, draselné, amonné, vápenaté nebo železité hydroxidy a z organických bází, jako je izopropylamin, trimethylamin, 2-ethylaminoethanol, histidin, prokain apod.
- 12CZ 294650 B6
Zvláště výhodné jsou soli TFA a HC1, jsou-li použity při přípravě cyklického polypeptidů antagonisty ανβ3· Reprezentativní soli peptidů jsou popsány v příkladech.
Fyziologicky tolerovatelné nosiče jsou v oboru dobře známé. Příkladem kapalných nosičů jsou sterilní vodné roztoky, které kromě aktivních složek a vody neobsahují žádné další materiály, nebo obsahují pufr, jako fosforečnan sodný o fyziologickém pH, fyziologický roztok nebo obojí jako je fosforečnanem pufrovaný fyziologický roztok. Dále mohou vodné nosiče obsahovat také více než jednu pufrovací sůl a nebo soli, jako je chlorid sodný a draselný, dextróza, polyethylenglykol a další.
Kapalné prostředky mohou také obsahovat kapalné fáze jako přídavek k vodě nebo na úkor vody. Příklady takových přídavných kapalných fází jsou glycerin, rostlinné oleje jako bavlníkový olej, a emulze voda-olej.
Terapeutický prostředek obsahuje množství antagonisty ανβ3 podle předkládaného vynálezu, které inhibuje angiogenezi, obvykle v množství nejméně 0,1 % hmotnostního antagonisty na celkovou hmotnost terapeutického prostředku. Hmotnostní procenta jsou poměr hmotnosti inhibitoru ku celkové hmotnosti prostředku. Takže např. 0,1 % hmotnostního je 0,1 gramu inhibitoru na 100 gramů prostředku.
E. Antagonisté integrinu ανβ3
Antagonisté ανβ3 jsou ve způsobech podle předkládaného vynálezu použity k inhibici angíogeneze v tkáních a mohou se vyskytovat v mnoha formách, které zahrnují sloučeniny, interagující s ανβ3 tak, že funkční interakce s přirozenými ligandy ανβ3 jsou rušeny. Příklady antagonistů zahrnují analogy ανβ3, odvozené z vazebného místa pro ligand na ανβ3, mimetika buď ανβ3 nebo přirozeného ligandu ανβ3, které napodobují strukturní oblast, zahrnutou ve vazebných interakcích CA$3-ligand, polypeptidy, mající sekvenci, odpovídající funkční vazebné doméně přirozeného ligandu, specifického pro ανβ3, zvláště odpovídající doméně, obsahující RGD přirozeného ligandu ανβ3 a protilátky, které imunoreagují buď s ανβ3 nebo s přirozeným ligandem, přičemž všechny vykazují aktivitu antagonisty, jak je zde definováno.
1. Polypeptidy
Jedno provedení předkládaného vynálezu předpokládá použití antagonistů ανβ3 ve formě polypeptidů. Polypeptidický (peptidický) antagonista ανβ3 má sekvenční charakteristiky buď přirozeného ligandu ανβ3 nebo vlastní ανβ3 v oblasti zahrnuté v interakcích o^$3-ligand a vykazuje aktivitu antagonisty ανβ3, jak je zde popsáno. Výhodný peptidický antagonista ανβ3 obsahuje RGD tripeptid a jeho sekvence odpovídá přirozenému ligandu v oblasti obsahující RGD.
Výhodné polypeptidy obsahující RGD mají sekvenci odpovídající sekvenci aminokyselinových zbytků oblasti, obsahující RGD přirozeného ligandu ανβ3, jako je fibrinogen, vitronektin, von Willebrandův faktor, laminin, trombospondin a podobné ligandy. Takže peptidický antagonista ανβ3 může být odvozen z jakýchkoliv přirozených ligandů, i když výhodný je fibrinogen a vitronektin.
Zvláště výhodný peptidický antagonista ανβ3 přednostně inhibuje ανβ3 tak, že se váže na jeho přirozený ligand (ligandy), je-li sdílen s dalšími integriny, jak bylo popsáno již dříve. Tyto peptidy specifické pro ανβ3 jsou zvláště výhodné nejméně proto, že jejich specifická k ανβ3 snižuje výskyt nežádoucích vedlejších účinků, jako je inhibice dalších integrinů. Identifikace výhodných peptidických antagonistů ανβ3, majících selektivitu k Ονβ3, lze provést snadno použitím obvyklé inhibice při stanovení vazebnosti, jako je stanovení ELISA, popsané v příkladech.
-13CZ 294650 B6
V jednom provedení zahrnuje polypeptid podle předkládaného vynálezu ne více než 100 aminokyselinových zbytků, výhodně ne více než 60 zbytků, výhodněji ne více než 30 zbytků. Peptidy mohou být lineární nebo cyklické, ale zvláště výhodné peptidy jsou cyklické.
Výhodné cyklické a lineární peptidy a jejich označení jsou uvedeny v tabulce 1 v příkladech.
Je zřejmé, že polypeptid nemusí být identický se sekvencí aminokyselinových zbytků přirozeného ligandu ανβ3, pokud zahrnuje požadovanou sekvenci a je schopen fungovat jako antagonista ocvp3 ve stanovení zde popsaném.
Polypeptid zahrnuje jakýkoliv analog, fragment nebo chemický derivát polypeptidu, jehož aminokyselinová sekvence je zde uvedena, pokud polypeptid je antagonista ανβ3. Proto může polypeptid podle předkládaného vynálezu podléhat různým změnám, substitucím, inzercím a delecím, přičemž použití polypeptidu s takovými změnami má určité výhody. V tomto ohledu polypeptidový antagonista ανβ3 podle předkládaného vynálezu odpovídá, spíše než je identický s, sekvenci uvedeného peptidu, kde byly provedeny jedna nebo více změn a přitom si ponechává schopnost fungovat jako antagonista ανβ3 v jednom nebo více stanoveních zde definovaných.
Takže polypeptid může být v některé z mnoha forem peptidových derivátů, které zahrnují amidy, konjugáty s proteiny, cyklopeptidy, polymemí peptidy, analogy, fragmenty, chemicky modifikované peptidy a podobné deriváty.
Termín „analog“ zahrnuje jakýkoliv polypeptid, mající sekvenci aminokyselinových zbytků významně z velké části identickou se sekvencí specificky zde uvedenou, v které byl jeden nebo více zbytků konzervativně nahrazen funkčně podobným zbytkem a která vykazuje aktivitu antagonisty ανβ3, jak je zde popsáno. Příklady konzervativních substitucí zahrnují substituci jednoho nepolárního (hydrofobního) zbytku, jako je izoleucin, valin, leucin nebo methionin za jiný, substituci jednoho polárního (hydrofilního) zbytku za jiný, jako je arginin a lysin, glutamin a asparagin, glycin a serin, substituci jednoho bazického zbytku, jako je lysin, arginin nebo histidin za jiný, nebo substituci jednoho kyselého zbytku, jako je kyselina asparagová nebo glutamová za jiný.
Termín „konzervativní substituce“ také zahrnuje použití chemicky derivatizovaného zbytku v místě nederivatizovaného zbytku, přičemž takový polypeptid vykazuje požadovanou inhibiční aktivitu.
„Chemický derivát“ se vztahuje k polypeptidu, majícímu jeden nebo více zbytků chemicky derivatizovaných reakcí funkční strany skupiny. Takové derivatizované molekuly zahrnují např. molekuly, v kterých byly volné aminoskupiny derivatizovány za vzniku aminhydrochloridů, p-toluensulfonylskupin, benzylkarbonátových skupin, t-butyloxykarbonylskupin, chloracetylskupin nebo formylskupinu. Volné karboxylové skupiny lze derivatizovat za vzniku solí, methyla ethylesterů nebo dalších typů esterů nebo hydrazidů. Volné hydroxylové skupiny lze derivatizovat za vzniku O-acyl- nebo O-alkylderivátů. Imidazolový dusík histidinu lze derivatizovat za vzniku N-im benzylhistidinu. Jako chemické deriváty jsou zde zahrnuty také ty peptidy, které obsahují jeden nebo více přirozeně se vyskytujících derivátů dvaceti standardních aminokyselin. Např. 4-hydroxyprolinem lze substituovat prolin; 5-hydroxylysinem lze substituovat lysin; 3-methylhistidinem lze substituovat histidin; homoserinem lze substituovat serin; a ornitinem lze substituovat lysin.
Polypeptidy podle předkládaného vynálezu také zahrnují jakýkoliv polypeptid, mající jednu nebo více připojených skupin a/nebo delecí nebo zbytků, blízkých sekvenci polypeptidu, jehož sekvence je uvedena zde, pokud vykazuje požadovanou aktivitu.
- 14CZ 294650 B6
Termín „fragment“ se vztahuje k jakémukoliv polypeptidu, majícímu aminokyselinovou sekvenci kratší než polypeptid, jehož aminokyselinová sekvence je uvedena zde.
Má-li polypeptid podle předkládaného vynálezu sekvenci, která není identická se sekvencí přirozeného ligandů ανβ3, je to obvykle díky jedné nebo více konzervativním nebo nekonzervativním substitucím, které byly provedeny, obvykle je substituováno ne více než 30 procent potu, výhodně ne více než 10 procent počtu aminokyselinových zbytků. Další zbytky lze připojit buď na konec polypeptidu pro účely vytvoření „linkeru“, pomocí kterého lze polypeptidy podle předkládaného vynálezu běžně uchytit na značený nebo pevný matrix, nebo nosič.
Značky, pevné matrice nebo nosiče, které lze použít spolu s polypeptidy podle předkládaného vynálezu, jsou uvedeny viz níže.
Aminokyselinové linkery mají obvykle nejméně jeden zbytek a mohou mít 40 nebo více zbytků, častěji od 1 do 10 zbytků, ale netvoří epitopy ligandů ανβ3· Typické aminokyselinové zbytky, používané ke spojování, jsou tyrosin, cystein, lysin, kyselina glutamová a asparagová apod. Navíc se polypeptid může lišit, není-li specifikováno jinak, od přirozené sekvence ligandů ανβ3 sekvencí, modifikovanou acylací koncové NH2-skupiny, např. acetylací, nebo amidací thioglykolovou kyselinou, koncovou karboxyamidací, např. amoniakem, methylaminem a podobnými koncovými modifikacemi. Koncové modifikace jsou vhodné, jak je známo, ke snížení náchylnosti ke štěpení proteázou, a proto slouží k prodloužení poloviční doby existence polypeptidu v roztocích, zvláště biologických kapalinách, kde mohou být proteázy přítomné. V tomto ohleduje cyklizace polypeptidu také vhodná koncová modifikace a je zvláště výhodná také kvůli stabilitě struktur, vzniklých cyklizací a z hlediska biologických aktivit pozorovaných pro takové cyklické peptidy, jak je zde popsáno.
Jakýkoliv peptid podle předkládaného vynálezu lze použít ve formě farmaceuticky přijatelné soli. Vhodné kyseliny jsou schopné tvorby solí s peptidy podle předkládaného vynálezu včetně anorganických kyselin, jako je trifluoroctová kyselina (TFA), kyselina chlorovodíková (HC1), kyselina bromovodíková, kyselina chloristá, kyselina dusičná, kyselina thiokyanatá, kyselina orthofosforečná, kyselina propionová, kyselina glykolová, kyselina mléčná, kyselina pyrohroznová, kyselina šťavelová, kyselina malonová, kyselina jantarová, kyselina maleinová, kyselina fumarová, kyselina anthranilová, kyselina skořicová, kyselina naftalensulfonová, kyselina sulfanilová apod. Zvláště výhodné jsou soli HC1 a TFA.
Vhodné báze schopné tvorby solí s peptidy podle předkládaného vynálezu zahrnují anorganické báze, jako je hydroxid sodný, hydroxid amonný, hydroxid draselný apod.; a organické báze, jako mono-, di- a trialkyl- a arylaminy (např. triethylamin, diizopropylamin, methylamin, dimethylamin apod.) a volitelně substituované ethanolaminy (např. ethanolamin, diethanolamin apod.).
Peptid podle předkládaného vynálezu se také vztahuje k polypeptidu, který lze syntetizovat jakýmkoliv způsobem známým v oboru polypeptidů, včetně technik rekombinantní DNA.
Způsoby chemické syntézy, jako je Merrifieldova syntéza na pevné fázi, jsou výhodné z důvodů čistoty, antigenní specifity, nepřítomnosti nežádoucích vedlejších produktů, snadnosti přípravy apod. Výborné shrnutí mnoha dostupných způsobů lze nalézt v pracích Stewarda a kol. „Solid Phase Peptide Synthesis“, W. H. Freeman Co., San Francisco (1969); Bodanszky a kol., „Peptide Synthesis“, John Wiley & Sons, second edition (1976); J. Meienhofer, „Hormonal Proteins and Peptides“, Vol. 2, str. 46, Academie Press (New York) (1983); Merrifield, Adv. Enzymol.: 32, 221-96 (1969); Fields a kol., Int. J. Peptide Protein Res.: 35. 161-214 (1990); a patent US 4 244 946, týkající se syntézy peptidů na pevné fázi, a Schroder a kol., „The Peptides“, Vol. 1, Academie Press (New York) (1965), týkající se klasické syntézy v roztoku, přičemž všechny práce jsou zde uvedeny jako reference. Vhodné chránící skupiny, použitelné při takových syntézách, jsou popsány v pracích uvedených výše a v práci J. F. W. McOmieho, „Protective Groups in Organic Chemistry“, Plenům Press, New York (1973), uvedené zde jako reference.
-15CZ 294650 B6
Obecně syntézy na pevné fázi předpokládají zahrnutí postupného přidávání jednoho nebo více aminokyselinových zbytků nebo vhodně chráněných aminokyselinových zbytků k rostoucímu peptidickému řetězci. Obvykle je buď aminoskupina nebo karboxylová skupina prvního aminokyselinového zbytku chráněna vhodnou, selektivně odstranitelnou skupinou. Nebo je selektivně odstranitelná chránící skupina použita pro aminokyseliny, obsahující reaktivní vedlejší skupinu, jako např. lysin.
Syntéza na pevné fázi se provádí tak, že chráněná nebo derivatizovaná aminokyselina je připojena k inertnímu pevnému nosiči přes její nechráněnou karboxylovou skupinu nebo aminoskupinu. Chrániči skupina aminoskupiny nebo karboxylové skupiny je poté selektivně odstraněna a je přimíšena následující aminokyselina v sekvenci, mající vhodně chráněnou komplementární (amino- nebo karboxy-) skupinu a je zreagována za podmínek, vhodných ke vzniku amidového spojení se zbytkem již napojeným k pevnému nosiči. Chrániči skupina amino- nebo karboxyskupiny je poté z tohoto nově přidaného aminokyselinového zbytku odstraněna, a pak se přidá další aminokyselina (vhodně chráněná) a tak dále. Poté, co byly k vhodné sekvenci připojeny všechny požadované aminokyseliny, byly postupně nebo současně odstraněny zbylé koncové a postranní chránící skupiny (a pevný nosič) za získání konečného lineárního polypeptidu.
Výsledné lineární polypeptidy, připravené podle příkladu, popsaného výše, mohou být podrobeny reakci za vzniku jejich odpovídajících cyklopeptidů. Příklad způsobu cyklizace peptidů je popsán Zimmerem a kol., Peptides, str. 393-394 (1992), ESCOM Science Publishers, B.V. (1993). Obvykle je /-butoxykarbonylem chráněný methylester peptidu rozpuštěn v methanolu, přidá se roztok hydroxidu sodného a směs je ponechána reagovat při teplotě 20 °C, přičemž se hydrolyticky odstraní methylesterová chránící skupina. Po odpaření rozpouštědla je /-butoxykarbonylem chráněný peptid z okyseleného vodného roztoku extrahován ethylacetátem. T-butoxykarbonylová chránící skupina je poté za slabě kyselých podmínek odstraněna v roztoku dioxanu, přidaného k rozpouštědlu. Takto získaný nechráněný lineární peptid s volnými N- a C-konci je na odpovídající cyklopeptid převeden reakcí zředěného roztoku lineárního peptidu ve směsi dichlormethanu a dimethylformamidu s dicyklohexylkarbodiimidem v přítomnosti 1-hydroxybenzotriazolu a N-methylmorfolinu. Výsledný cyklopeptid je poté chromatografícky purifíkován.
Zvláště výhodné způsob syntézy cyklopeptidů je popsán Guarrathem a kol., Eur. J. Biochem., 210, 911-921 (1992) a je popsán v příkladech. Zvláště výhodné peptidy k použití způsobu podle předkládaného vynálezu jsou c-(GrGDFV) (SEQ ID NO 4), c-(RGDfV) (SEQ ID NO 5), c-(RADfV) (SEQ ID NO 6), c-(RGDFv) (SEQ ID NO 7) a lineární peptid YTAECKPQVTRGDVF (SEQ ID NO 8), kde „c“- označuje cyklopeptid, velká písmena jsou jednopísmenné kódy pro L-aminokyseliny a malá písmena jsou jednopísmenné kódy pro D-aminokyseliny. Sekvence aminokyselinových zbytků těchto peptidů jsou také ukázány v SEQ ID NO 4, 5, 6, 7 a 8.
2. Monoklonální protilátky
Předkládaný vynález popisuje (v jednom jeho provedení) antagonisty ανβ3 ve formě monoklonálních protilátek, které imunoreagují s ανβ3 a inhibují vazbu ανβ3 na jeho přirozený ligand, jak je zde popsáno. Vynález také popisuje buněčné linie, které produkují protilátky, způsoby získání buněčných linií a způsoby produkce monoklonálních protilátek.
Monoklonální protilátka podle předkládaného vynálezu zahrnuje molekuly protilátky, které 1) imunoreagují s izolovaným ανβ3 a 2) inhibují vazbu fíbrinogenu na ανβ3. Výhodné monoklonální protilátky, které se přednostně vážou na ανβ3, zahrnují monoklonální protilátku, mající imunoreakční charakteristiky mAb LM609, sekretovanou hybridomovou buněčnou linií č. ATCC HB 9537.
-16CZ 294650 B6
Hybridomová buněčná linie ATCC BH 9537 byla uložena shodně s požadavky Budapešťské dohody v Američan Type Culture Collection (ATCC), 1301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA, 15. 9. 1987.
Termín „protilátka nebo molekula protilátky“ v různých gramatických tvarech je zde použit jako kolektivní podstatné jméno, které se vztahuje k populaci molekul imunoglobulinu a/nebo imunologicky aktivním částem molekul imunoglobulinu, tj. k molekulám, které obsahují doménu, tvořící vazebné místo pro protilátku nebo paratop.
„Doména tvořící vazebné místo pro protilátku“ je strukturní část molekuly protilátky, tvořená variabilními a hypervariabilními oblastmi těžkého a lehkého řetězce, která specificky váže antigen.
Příklady protilátek vhodných k použití podle předkládaného vynálezu jsou intaktní imunoglobulinové molekuly, značně intaktní imunoglobulinové molekuly a části imunoglobulinové molekuly, které obsahují paratop, včetně strukturních fragmentů, známých v oboru jako Fab, Fab, F(ab)2 a F(v) a nazývaných také fragmenty protilátky.
V jiném výhodném provedení předkládaný vynález uvažuje zkrácenou imunoglobulinovou molekulu, zahrnující fragment Fab, pocházející z monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu. Fragment Fab, který nemá Fc receptor, je rozpustný a poskytuje terapeutické výhody z hlediska poloviční doby existence v séru a diagnostické výhody, vyplývající ze způsobu použití rozpustného fragmentu Fab. Příprava rozpustného fragmentu Fab je obecně v imunologii známá a lze ji provést mnoha způsoby.
Např. fragmenty protilátek Fab a F(ab)2 jsou připraveny proteolytickou reakcí papainu, respektive pepsinu, a značně intaktních protilátek dobře známými způsoby. Viz např. US patent č. 4 342 566 Theofílopolouse a Dixona. Fragmenty protilátky Fab jsou také velmi dobře známé a vzniknou z fragmentů F(ab)2, podrobených redukci disulfidických můstků, pojících dvě části těžkého řetězce za použití merkaptoethanolu, a poté alkylaci vzniklého merkaptanu proteinu za použití reakčního činidla, jako je jodacetamid. Výhodné jsou protilátky, obsahující intaktní imunoglobulinové molekuly a jsou použity, jak je zde uvedeno.
Termín „monoklonální protilátka“ v mnoha jeho gramatických tvarech se týká populace molekul protilátky, které obsahují pouze jeden druh domény, tvořící vazebné místo pro protilátku schopné imunoreagovat s určitým epitopem. Monoklonální protilátka tak obvykle vykazuje jednoduchou vazebnou afinitu k jakémukoliv epitopu, se kterým imunoreaguje. Monoklonální protilátka proto může obsahovat molekulu protilátky, mající velké množství domén, tvořících vazebné místo pro protilátku, každou z nich imunospecifíckou pro odlišný epitop, jako např. bispecifícká monoklonální protilátka.
Monoklonální protilátka je obvykle tvořena protilátkami produkovanými klony jedné buňky zvané hybridom, které sekretují (produkují) pouze jeden druh molekuly protilátky. Hybridomová buňka je tvořena fúzí protilátku-produkující buňky a myelomu nebo další samoobnovující se buněčné linie. Příprava takových protilátek byla poprvé popsána v práci Kohlera a Milsteina, Nátuře: 256, 495-497 (1975), uvedené zde jako reference. Další způsoby jsou popsány v práci Zoly, Monoklonální protilátky: Manuál technik, CRC Press, lne. (1987). Supematanty hybridomu takto připravené lze podrobit testům na přítomnost molekul protilátky, které imunoreagují s ανβ3, a testům inhibice vazby ανβ3 na přirozené ligandy.
Krátce k vytvoření hybridomu, který pak produkuje prostředek obsahující monoklonální protilátku, je myelom nebo další samoobnovující se buněčná linie fúzována s lymfocyty, získanými ze sleziny savců, hyperimunizovaných zdrojem ανβ3, jako je ανβ3 izolovaný z lidských melanomo
- 17CZ 294650 B6 vých buněk M21, jak je popsáno v práci Chereshe a kol., J. Biol. Chem.: 262, 17703-17711 (1987).
Je výhodné použít k přípravě hybridomu myelomovou buněčnou linii ze stejného druhu, jako jsou lymfocyty. Obvykle je výhodným savcem myš kmene 129 GIX+. Vhodné myší myelomy k použití podle předkládaného vynálezu zahrnují hypoxanthin-aminopterin-tymidin-citlivé (HAT) buněčné linie P3X63-Ag8.653 a Sp2/0-Agl4, které jsou dostupné v Američan Type Culture Collection, Rockville, MD, pod označením CRL 1580 a CRL 1581.
Splenocyty jsou obvykle fúzovány s buňkami myelomu za použití polyethylenglykolu (PEG) 1500. Fúzované hybridy jsou selektovány pomocí jejich citlivosti na HAT. Hybridomy produkující monoklonální protilátku podle předkládaného vynálezu jsou identifikovány za použití stanovení ELISA, popsaného v příkladech.
Monoklonální protilátku podle předkládaného vynálezu lze také produkovat iniciací monoklonální hybridomové kultury, zahrnující médium s živinami, obsahující hybridom, který sekretuje molekuly protilátky o příslušné specifitě. Tato kultura je udržována za podmínek a po dobu dostatečnou ktomu, aby hybridom sekretoval molekuly protilátky do média. Médium obsahující protilátku je poté shromážděno. Molekuly protilátek lze pak dále izolovat dobře známými způsoby.
Média využitelná k přípravě těchto prostředků jsou obě dobře známá v oboru a komerčně dostupná a zahrnují syntetické kultivační médium, inbrední myši apod. Příkladem syntetického média je Dulbeccovo minimální esenciální médium (DMEM; Dulbecco a kol., Virol.: 8, 396 (1959)) doplněné 4,5 g/1 glukózy, 20 mM glutaminu a 20 % fetálního telecího séra. Příkladem inbredního myšího kmene je Balb/c.
Další způsoby produkce monoklonální protilátky, hybridomové buňky nebo hybridomové buněčné kultury jsou také dobře známé. Viz např. způsob izolace monoklonálních protilátek z imunologické sbírky, jak je popsáno Sastrym a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA: 86, 5728-5732 (1989); a Huse a kol., Science: 246, 1275-1281 (1989).
Předmětem předkládaného vynálezu je také hybridomová buňka a kultury, obsahující hybridomovou buňku, které produkují monoklonální protilátku podle předkládaného vynálezu. Zvláště výhodná je hybridomová buněčná linie, která sekretuje monoklonální protilátku mAb LM609, označenou ATCC HB 9537. mAb LM609 byla připravena podle práce Chereshe a kol., J. Biol. Chem.: 262, 17703-17711 (1987) a její příprava je také popsána v příkladech.
Předkládaný vynález v jednom provedení počítá s monoklonální protilátkou, která má imunoreakční charakteristiky mAb LM609.
Je také možné určit, bez dlouhých experimentů, zdali má monoklonální protilátka stejnou (tj. ekvivalentní) specifitu (imunoreakční charakteristiky) jako monoklonální protilátka podle předkládaného vynálezu, a to zjištěním, jestli ta první předchází tu druhou při vazbě na předem vybranou cílovou molekulu. Jestliže testovaná monoklonální protilátka bude podle testu kompetovat s monoklonální protilátkou podle předkládaného vynálezu, což se ukáže poklesem vazby monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu ve standardním kompetitivním stanovení vazby na cílovou molekulu, a je-li přítomná v pevné fázi, pak je pravděpodobné, že tyto dvě monoklonální proti 1 átky vážou tentýž, nebo velmi příbuzný, epitop.
Jiným způsobem, jak určit, má-li monoklonální protilátka specifitu monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu, je předem inkubovat monoklonální protilátku podle předkládaného vynálezu s cílovou molekulou, s kterou reaguje normálně, a poté přidat testovanou monoklonální protilátku, aby se určilo, je-li u testované monoklonální protilátky inhibovánajejí schopnost vázat se na cílovou molekulu. Je-li testované monoklonální protilátka takto inhibována, má se vší
-18CZ 294650 B6 pravděpodobností tutéž, nebo funkčně ekvivalentní, specifítu epitopu jako monoklonální protilátka podle předkládaného vynálezu.
Dalším způsobem určení, jestli má monoklonální protilátka specifítu monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu je určení sekvence aminokyselinových zbytků CDR oblastí zkoumaných protilátek. Molekuly protilátky, mající identické nebo funkčně ekvivalentní sekvence aminokyselinových zbytků vjejich CDR oblastech, mají tutéž vazebnou specifítu. Způsoby sekvencování polypeptidů jsou v oboru dobře známé.
Imunospecifíta protilátky, její kapacita vázat cílovou molekulu a doprovodná afinita, kterou protilátka vykazuje pro epitop, je definována epitopem, s kterým tato protilátka imunoreaguje. Specifíta epitopu je definována alespoň částečně sekvencí aminokyselinových zbytků variabilní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinové protilátky a částečně sekvencí aminokyselinových zbytků variabilní oblasti lehkého řetězce.
Použití termínu „mající vazebnou specifítu“ znamená, že odpovídající monoklonální protilátky vykazují stejné nebo podobné imunoreakční (vazebné) charakteristiky a kompetují o vazbu na předem vybranou cílovou molekulu.
Humanizované monoklonální protilátky mají určité výhody oproti myším monoklonálním protilátkám, zvláště pokud je lze terapeuticky použít u lidí. Konkrétně lidské protilátky nejsou vyplaveny z oběhu tak rychle jako „cizí“ antigeny a neaktivují imunitní systém stejným způsobem jako cizí antigeny a cizí protilátky. Způsoby přípravy „humanizovaných“ protilátek jsou v oboru obecně velmi dobře známé a lze je snadno aplikovat na protilátky podle předkládaného vynálezu.
Takže předkládaný vynález v jednom svém provedení zahrnuje monoklonální protilátku podle předkládaného vynálezu, která je humanizována tím, že se naštěpí, aby se mohly vložit složky lidského imunitního systému bez toho, že by zásadně rušily schopností protilátky vázat se na antigen.
3. Mimetika specifická pro ανβ3
Předkládaný vynález demonstruje, že antagonisty ανβ3 lze obecně použít podle předkládaného vynálezu, přičemž antagonisté zahrnují polypeptidy, protilátky a další molekuly, označené jako „mimetika“, která mají schopnost rušit funkci ανβ3. Zvláště výhodní jsou antagonisté, kteří specificky ruší funkci ανβ3 a neruší funkci dalších integrinů.
V tomto kontextu je zvláště ceněno to, že k použití ve způsobech podle předkládaného vynálezu lze použít množství vhodných reakčních činidel, pokud mají požadovanou biologickou aktivitu. Tato činidla se obecně nazývají mimetika, protože mají schopnost napodobovat vazebnou doménu buď na ανβ3 nebo ανβ3 ligandu, zahrnutou ve funkčních interakcích receptor a ligand, a tím ruší (tj. inhibují) normální funkci.
Mimetikum ανβ3 je jakákoliv molekula, jiná než protilátka nebo peptid pocházející z ligandu, která vykazuje výše popsané vlastnosti. Může to být syntetický analog peptidu, sloučenina, která je ve tvaru vazebné kapsy výše popsané vazebné domény, nebo jiná molekula.
Návrh mimetika ανβ3 lze odvodit mnoha strukturními analýzami pro návrhy léčiv známými v oboru, včetně molekulárního modelování, dvojrozměrné nukleární magnetické rezonance (2-D NMR), X-paprskové krystalografie, náhodného testování polypeptidů, peptidových analogů nebo dalších chemických polymerních knihoven a podobných způsobů návrhů léčiv.
-19CZ 294650 B6
V pohledu tohoto širokého strukturního důkazu, uváděného v předkládaném vynálezu, který ukazuje, že antagonista ανβ3 může být malý polypeptid nebo monoklonální protilátka, dvě zcela odlišné chemické struktury, které sdílejí funkční vlastnost selektivně inhibovat ανβ3, a struktura antagonisty ανβ:>, použitelného ve způsobech podle předkládaného vynálezu, tak nemusí být omezena, ale zahrnuje jakékoliv mimetikum definované výše.
F. Způsoby identifikace antagonistů ανβ3
Předkládaný vynález také popisuje způsoby a stanovení identifikace uvažovaného antagonisty ανβ3 k použití v souladu s předkládanými způsoby. V těchto stanoveních jsou molekuly uvažovaných látek vyhodnocovány z hlediska jejich síly inhibovat angiogenezi v tkáni.
První stanovení měří inhibici přímé vazby přirozeného ligandu na ανβ3 a výhodné provedení je detailně popsáno v příkladech. Stanovení obvykle měří stupeň inhibice vazby přirozeného ligandu, jako je fibrinogen, na izolovaný ανβ3 v pevné fázi pomocí ELISA testu.
Stanovení lze také použít k identifikaci sloučenin, které vykazují specifitu pro ανβ3α neinhibují vazbu přirozených ligandů na další integriny. Stanovení specifity je prováděno tak, že se pustí paralelní ELISA stanovení, kde jsou ανβ3 a další integriny vyhodnocovány současně v oddělených stanovovacích komůrkách a stanovují se jejich schopnosti vázat se na přirozený ligand a zjišťuje se možná sloučenina, inhibující schopnosti integrinů vázat se na předem vybraný ligand. Výhodné formáty screeningového stanovení jsou popsány v příkladech.
Druhé stanovení měří angiogenezi v kuřecí chorioallantoidní membráně (CAM) a nazývá se CAM stanovení. CAM stanovení bylo podrobně popsáno jinými autory a bylo použito k měření angiogeneze i neovaskularizace nádorových tkání. Viz Ausprunk a kol., Am. J. Pathol.: 79, 597-618 (1975) a Ossonski a kol., Cancer. Res.: 40, 2300-2309 (1980).
CAM stanovení je velmi dobrý model rozeznávání anigogeneze in vivo, protože je pozorována neovaskularizace celé tkáně a aktuální krevní cévy kuřecího embrya prorůstají do CAM nebo do tkáně rostoucí na CAM.
Jak je zde demonstrováno, CAM stanovení znázorňuje inhibici neovaskularizace a je založeno na množství a rozsahu růstu nových cév. Navíc je snadné sledovat růst jakékoliv tkáně, transplantované na CAM, jako je nádorová tkáň. A konečně je toto stanovení zvláště vhodné díky tomu, že v systému stanovení je interní kontrola toxicity. Kuřecí embryo je vystaveno některému testovacímu reakčnímu činidlu, a proto je zdraví embrya indikací toxicity reakčního činidla.
Třetím stanovením, měřícím angiogenezi, je in vivo králičí model oka a nazývá se stanovení v králičím oku. Stanovení v králičím oku bylo detailně popsáno jinými autory a bylo použito k měření angiogeneze a neovaskularizace v přítomnosti angiogenních inhibitorů, jako je thalidomid. Viz D Amato a kol., Proč. Nati. Acad. Sci.: 91, 4082-4085 (1994).
Stanovení v králičím okuje velmi dobrý model rozeznávání angiogeneze in vivo, protože proces neovaskularizace, znázorněný králičími krevními cévami, rostoucími zkraje rohovky dovnitř rohovky je snadno vizualizovaný díky přirozeně transparentní rohovce oka. Navíc lze rozsah a množství stimulace nebo inhibice neovaskularizace nebo regrese neovaskularizace v průběhu času snadno sledovat.
Nakonec je králík vystaven některému testovacímu reakčnímu činidlu, a proto je zdraví embrya indikací toxicity testovaného reakčního činidla.
Čtvrté stanovení měří angiogenezi v modelu chimérická myš: člověk a nazývá se stanovení v chimérické myši. Stanovení bylo detailně popsáno jinými autory a dále zde bylo popsáno
-20CZ 294650 B6 k měření angiogeneze, neovaskularizace a regrese nádorových tkání. Viz Yan a kol., J. Clin. Invest.: 91, 986-996 (1993). Stanovení v chimérické myši je vhodný model pro angiogenezi in vivo, protože transplantované kousky kůže se histologicky velmi podobají normální lidské kůži a neovaskularizace celé tkáně probíhá tam, kde rostou aktuální lidské krevní tkáně z transplantované lidské kůže do lidské nádorové tkáně na povrchu transplantované lidské kůže. Původ neovaskularizace v lidském transplantátu lze demonstrovat imunohistochemickým barvením neovaskulámí sítě markéry, specifickými pro lidské endoteliální buňky.
Jak je zde ukázáno, stanovení v chimérické myši demonstruje ústup neovaskularizace, založené na množství i rozsahu regrese růstu nových cév. Dále je snadné sledovat účinky na růst jakékoliv tkáně, transplantované na již transplantovanou kůži, jako je nádorová tkáň. A konečně je stanovení vhodné, protože v systému stanovení je interní kontrola toxicity. Chimérická myš je vystavena některému testovacímu reakčnímu činidlu, a proto je zdraví myši indikací toxicity reakčního činidla.
Příklady
Následující příklady, vztahující se k předkládanému vynálezu, jsou ilustrativní a neměly by, samozřejmě, být sestaveny tak, aby konkrétně omezovaly předkládaný vynález. Navíc jsou takové variace předkládaného vynálezu, známé nyní nebo vyvinuté později, které by spadaly do rozsahu znalostí osoby obeznámené soborem, zahrnuty v rámci předkládaného vynálezu a uvedeny v nárocích dále.
Příklad 1. Příprava syntetických peptidů
Lineární a cyklické polypeptidy, uvedené v tabulce 1, byly syntetizovány za použití standardních syntetických způsobů na pevné fázi, jak např. popisuje Merrifield, Adv. Enzymol.: 32, 221-96 (1969) a Fields, G. B. a Noble, R. L., Int. J. Peptide Protein. Res.: 35,161-214 (1990).
Dva gramy (g) BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OMe (SEQ ID NO: 1) byly nejprve rozpuštěny v 60 ml methanolu, do kterého bylo přidáno 1,5 ml 2M roztoku hydroxidu sodného za vzniku směsi. Směs pak byla míchána po dobu 3 hodin při teplotě 20 °C. Po odpaření byl odparek rozpuštěn ve vodě, roztok byl zředěnou HC1, okyselen na pH 3 a extrahován ethylacetátem. Extrakt byl sušen nad Na2SO4, odpařen a výsledný BOC-Gly-D-Arg-Gly-AspPhe-Val-OH (SEQ ID NO:2) byl míchán při teplotě 20 °C po dobu 2 hodin s 20 ml 2M HC1 v dioxanu. Výsledná směs byla odpařena za získání H-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH (SEQ ID NO: 3), odparek byl postupně rozpuštěn ve směsi 1800 ml dichlormethanu a 200 ml dimethylformamidu (DMF), a směs byla poté ochlazena na 0 °C. Pak bylo postupně za míchání přidáno 0,5 g dicyklohexylkarbodiimidu (DCC1), 0,3 g 1-hydroxybenzotriazolu (HOBt) a 0,23 ml N-methylmorfolinu.
Výsledná směs byla míchána dalších 24 hodin při teplotě 0 °C, a pak ještě dalších 48 hodin. Roztok byl pak zkoncentrován a smísen se smíšeným ložem ionexu, aby byl očištěn od solí. Po odstranění zbývající pryskyřice filtrací byl vyčištěný roztok odpařen, odparek byl purifikován chromatograficky a byl získán cyklo(-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val) (SEQ ID NO: 4). Následující peptidy, uvedené v tabulce 1 s použitím jednopísmenného kódu zkratek aminokyselinových zbytků a identifikované podle čísla peptidu, byly získány obdobně: cyklo(ArgGly-Asp-D-Phe-Val) (SEQ ID NO: 5); cyklo(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val) (SEQ ID NO: 6); cyklo(Arg-D-Ala-Asp-Phe-Val) (SEQ ID NO: 9); cyklo(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val) (SEQ ID NO: 7). Peptid označený jako 66203 má identickou sekvenci s peptidem 62184, lišící se od něho tím, že obsahuje sůl HC1, kdežto 62184 obsahuje sůl TFA. Ve stanoveních inhibice angiogeneze, popsaných v příkladu 7, kde byly použity syntetické peptidy, byl peptid 66203 mající HC1 o něco účinnější při inhibici angiogeneze, než identický peptid s TFA.
-21 CZ 294650 B6
Tabulka 1
Peptid č. Aminokyselinová sekvence SEQ ID No.
62181 cyklo(GrCGFV) 4
62184 cyklo(RGDfV) 5
62185 cyklo(RADfV) 6
62187 cyklo(RGDfV) 7
62880 YTAECKPQVTRGDVF 8
62186 cyklo(RaDFV) 9
62175 cyklo(ARGDfL) 10
62179 cyklo(GRGDfL) 11
624111 TRQWCDLGNPM 12
62503 GVVRNNEALARLS 13
62502 TVDNGDGRHDL 14
* Malá písmena označují D-aminokyseliny; velká písmena označují L-aminokyseliny.
Peptid označený jako 69601, mající identickou sekvenci s peptidem 62185, se od něj liší pouze tím, že obsahuje sůl HC1 na rozdíl od peptidu 62184, obsahujícího sůl TFA.
Bylo zjištěno, že cyklopeptid c-RADfV (69601) inhibuje vazbu fibrinogenu na integrin ανβ3 aneinhibuje vazbu fibrinogenu na integriny αιη,β3 nebo α5βι (Pfaff a kol., J. Biol. Chem.: 269, 20233-20238 (1994)). Takže peptid c-RADfV je specifický pro ανβ3.
2. Monoklonální protilátky
Monoklonální protilátka LM609, sekretovaná hybridomem ATCC HB 9537, byla produkována za použití standardních hybridomových způsobů imunizací izolovaným ανβ3, adsorbovaným na lektinovou matrici se Sepharosovými čočkami. ανβ3 byl izolován z lidských melanomových buněk, označených M21 a protilátka byla produkovaná podle popisu v práci Chereshe a kol., J. Biol. Chem.: 262. 17703-17711 (1987). M21 buňky byly poskytnuty Dr. D. L. Mortonem (University of Califomia, Los Angeles, CA) a ponechány růst v suspenzních kulturách v kultivačním médiu RPMI 1640, obsahujícím 2 mM L-glutamin, 50 mg/ml gentamicinsulfátu a 10 % fetálního telecího séra.
Bylo zjištěno, že monoklonální protilátka LM609 specificky imunoreaguje s Ονβ3 komplexem a neimunoreaguje s av podjednotkou, s β3 podjednotkou nebo s ostatními integriny.
3. Charakterizace tkáňové distribuce exprese ανβ3
A. Imunofluorescence s protilátkami proti integrinovému receptoru
-22CZ 294650 B6
Během uzdravování poranění exprimují základní stavby membrány krevních cév různé adhezivní proteiny včetně von Willebrandova faktoru, fibronektinu a fibrinu. Navíc jsou na povrchu kultivovaných buněk hladkého svalstva a endoteliálních buněk exprimovány různé členy integrinové rodiny adhezních receptorů. Viz Cheresh, Proč. Nati. Acad. Sci., USA: 84, 6471 (1987); Janat a kol., J. Cell Physiol.: 151, 588 (1992); a Cheng a kol., J. Cell. Physiol.: 139, 275 (1989). Mezi těmito integriny je ανβ3, endoteliální buněčný receptor pro von Willebrandův faktor, fíbrinogen (fíbrin) a fibronektin, jak popisuje Cheresh, Proč. Nati. Acad. Sci., USA: 84, 6471 (1987). Tento integrin iniciuje vápník-dependentní signální cestu, vedoucí k migraci endoteliálních buněk, a proto se zdá, že hraje zásadní roli v biologii cévní buňky, jak popisuje Leavelsey a kol., J. Cell. Biol.: 121, 163 (1993).
K prozkoumání exprese ανβ3 během angiogeneze byla od pacientů s jejich souhlasem získána lidská zdravá granulační tkáň nebo sousední normální kůže, která byla promyta 1 ml fosfátového pufrovaného fyziologického roztoku a vložena do O.T.C. média (Tissue Tek.) Tyto tkáně byly zmrazený v kapalném dusíku po dobu 30 až 45 sekund. Ze zmrazených bločků byly na kryostatovém mikrotomu nařezány řezy o tloušťce 6 mikronů, které se postupně barvily itnunoperoxidázou s protilátkami specifickými buď pro β3 integriny (θνβ3 nebo αιη,β3) nebo βι podrodinu integrinů.
Výsledky barvení normální lidské kůže a zdravé granulační tkáně jsou ukázány na obrázcích 1A až ID. Monoklonální protilátky AP3 a LM534, směrované proti β3 a βι integrinům, byly použity k imunohistochemickým analýzám zmrazených řezů. Experimenty s tkání od čtyř různých lidských dárců poskytly stejné výsledky. Mikrofotografie jsou ukázány ve zvětšení 300x.
Integrin ανβ3 byl hojně exprimován v krevních cévách v granulační tkáni (obr. 1B), ale nebyl detekovatelný v dermis a epitelu normální kůže stejného dárce (obr. 1A). Naopak integriny β] byly hojně exprimovány v krevních cévách a stromálních buňkách jak v normální kůži (obr. 1C), tak i v granulační tkáni (obr. ID) a vbazálních buňkách epitelu, jak již dříve popsal Adams a kol., Cell: 63, 425(1991).
B. Imunofluorescence s anti-ligandovými protilátkami
Další řezy lidské normální kůže a granulační tkáně, připravené viz výše, byly také testovány na přítomnost ligandů pro β3 a βι integriny, von Willebrandův faktor a laminin. Von Willebrandův faktor byl lokalizovaný v krevních cévách v normální kůži (obr. 2A) a granulační tkáni (obr. 2B), zatímco laminin byl lokalizovaný ve všech krevních cévách i vepiteliální základní stavbě membrány u obou tkáňových preparátů.
C. Distribuce 3ηίϊ-ανβ3 protilátek v nádorové tkáni
Kromě analýz, uvedených výše, byly také testovány biopsie nádorových tkání od lidských pacientů na přítomnost a distribuci ανβ3. Tkáně byly připraveny, jak je popsáno v příkladu 1A s tou výjimkou, že byly barveny monoklonální protilátkou LM609, připravenou v příkladu 2, která je specifická pro integrinový receptorový komplex, ανβ3. Navíc nádory byly také připraveny pro mikroskopické histologické analýzy fixací reprezentativních vzorků nádorů ve fixativu Bulins, a to po dobu 8 hodin a byly nařezány na řezy a barveny H&E.
Výsledky imunoperoxidázového barvení nádoru močového měchýře, tračníku, prsu a plic jsou ukázány na obrázcích 3A až 3D. ανβ3 je hojně exprimován pouze v krevních cévách, přítomných ve čtyřech analyzovaných nádorových biopsiích a ne v žádných jiných buňkách, přítomných v tkáni.
Výsledky zde popsané tak ukazují, že ανβ3 integrinový receptor je selektivně exprimován ve specifických typech tkání, jmenovitě granulovaných, metastázických tkáních a ostatních tkáních,
-23 CZ 294650 B6 v kterých probíhá angiogeneze, a ne v normální tkáni, kde byla zastavena tvorba nových krevních cév. Tyto tkáně jsou proto ideální pro terapeutické účely podle předkládaného vynálezu.
4. Identifikace avP3-specifíckých syntetických peptidů, detekovaných stanovením vazby ligand-receptor
Syntetické peptidy, připravené v příkladu 1, byly testovány měřením jejich schopností antagonizovat ανβ3 a anbp3 receptorovou vazebnou aktivitu v purifikovaných stanoveních vazby ligandreceptor. Způsob vhodný pro tyto vazebné studie byl popsán Barbasem a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA: 90, 10 003-10 007 (1993), Smithem a kol., J. Biol. Chem.: 265, 11 008-11 013 (1990) a Pfaffem a kol., J. Biol. Chem.: 269, 20 233-20 238 (1994) a tyto práce jsou zde uvedeny jako reference.
Zde je popsán způsob identifikace antagonistů ve stanovení vazby ligand-receptor, ve kterém je receptor imobilizován na pevný nosič a ligand a antagonista jsou rozpustné. Je také popsáno stanovení vazby ligand-receptor, v kterém je ligand imobilizován na pevný nosič a receptor a antagonista jsou rozpustné.
Krátce řečeno, vybrané purifikované integriny byly odděleně imobilizovány v mikrotitračních jamkách Titertek v koncentraci potahu 50 nanogramů (ng) na jamku. Purifíkace receptorů, použitých ve stanoveních vazby ligand-receptor, jsou v oboru dobře známé a lze je snadno získat způsoby, známými osobě obeznámené s technikou. Po inkubaci trvající 18 hodin při teplotě 4 °C byla nespecifická vazebná místa v potahu blokována 10 mg/ml hovězího sérového albuminu (BSA) ve fyziologickém roztoku pufrovaném Tris. Pro použití inhibičních studií byly testovány různé koncentrace vybraných peptidů z tabulky 1 na schopnost blokovat vazbu 125I-vitronektinu nebo 125I-fibrinogenu na integrinové receptory, ανβ3 a απι,βί- Ačkoliv tyto ligandy vykazují optimální vaznost pro určité integriny, vitronektin pro ανβ3 a fibrinogen pro am$3, inhibice vazebných studií, používajících peptidy k blokování vazby fibrinogenu na druhý receptor, umožnila přesné určení množství peptidů v mikromolech (μΜ), nutného k inhibici vazby receptorů na ligand s poloviční maximální hodnotou. Radioaktivně značené ligandy byly použity v koncentracích 1 nM a vazba byla imunologicky testována odděleně s neznačenými syntetickými peptidy.
Po následujících třech hodinách inkubace byl volný ligand odstraněn promýváním a navázaný ligand byl detekován gama čítačem. Data z těchto stanovení, kde byly vybrané cyklopeptidy, uvedené v tabulce 1, použity k inhibici vazby receptorů a radioaktivně značeného fibrinogenu na odděleně imobilizované ανβ3 a αιη,β3 receptory, byla vysoce reprodukovatelná s chybou menší než 11 %. Hodnoty IC50 v mikromolech (IC5o μΜ) jsou vyjádřeny jako průměr ze dvou naměřených hodnot +/- standardní odchylka, viz tabulka 2.
-24CZ 294650 B6
Tabulka 2
Peptid č. «v^3 (|C50 allb#3 ΟθδΟ/'Μ)
62181 1,96 + 0,62 14,95 + 7,84
62184 0,05 + 0,001 0,525 + 0,10
62185 0,885 + 0,16 100 ±0,001
62187 0,05 + 0,001 0,26 ± 0,056
62186 57,45 + 7,84 100 ± 0,001
62175 1,05 + 0,07 0,63 +0,18
62179 0,395 ±0,21 0,055 ± 0,007
Takže RGD-obsahující nebo zRGD odvozené cyklopeptidy 62181, 62184, 62185 a 62187, přičemž každý má jeden D-aminokyselinový zbytek, vykazovaly přednostní inhibici fibrinogenu, 5 vázajícího se na ανβ3 receptor, jak bylo změřeno nízkou koncentrací peptidu, požadovanou ke snížení inhibice na polovinu maximální hodnoty, ve srovnání s receptorem αιπ>β3. Naopak ostatní RGD-obsahující nebo zRGD odvozené cyklopeptidy, 62186, 62175 a 62179 buď nebyly tak účinné v blokování fibrinogenu, vázajícího se na ανβ3, nebo vykazovaly přednostní inhibici fibrinogenu, vázajícího se na αιΐόβ3 ve srovnání s receptorem avp3.Tyto výsledky jsou v souladu 10 s výsledky, publikovanými v práci Pfaffa a kol., J. Biol. Chem.: 269, 20233-20238 (1994), v které cyklopeptid RGDFV (kde F znamená D-aminokyselinový zbytek) specificky inhiboval vazbu fibrinogenu na integrin ανβ3 a ne na αιπ>β3 nebo Ονβι integriny. Podobné inhibice při vazebných stanoveních bylo dosaženo s linearizovanými peptidy, majícími nebo postrádajícími motiv RGD, tedy sekvence pocházející z av podjednotky receptoru, ctnb podjednotky receptoru 15 nebo aminokyselinové sekvence vitronektinového ligandu. Sekvence lineárních peptidů 62880 (aminokyselinové zbytky 35-49 pocházející zVN), 62411 (aminokyselinové zbytky 676-687 pocházející z av), 62 503 (aminokyselinové zbytky 655-667 pocházející z av) a 62 502 (aminokyselinové zbytky 296-306 pocházející z av) jsou uvedeny v tabulce 1. Každý z těchto peptidů byl použit v samostatném stanovení inhibice vazby buď vítronektinu (VN) nebo 20 fibrinogenu (FG), buď na αιη,β3 nebo na ανβ3. Hodnoty IC50 v mikromolech (μΜ) z každého stanovení pro každý experiment jsou uvedeny v tabulce 3.
Tabulka 3
Peptid č. avZ?3 lc50 «|lb^3 lc50 ^M)
FG VN FG VN
62880 42 0,98 < 0,01 0,5
62411 > 100 > 100 > 100 > 100
62503 >100 > 100 > 100 > 100
62502 90 5 >100 > 100
-25 CZ 294650 B6
Výsledky inhibice ve stanoveních vazby ligandu na vybrané integrinové receptory s linearizovanými peptidy ukazují, že pouze peptid 62880 byl účinný při inhibici s poloviční maximální hodnotou vazby buď FG nebo VN na ανβ3, což bylo změřeno nižší koncentrací peptidu, požadovanou k inhibici na polovinu maximální hodnoty ve srovnání s receptorem ανβ3· Žádný z dalších linearizovaných peptidů nebyl účinný při inhibici vazby ligandu na ανβ3, i když peptid 62502 byl účinný při blokování vazby VN na α^β^.
Takže stanovení vazby ligand-receptor zde popsané lze použít k testování jak cyklických, tak i linearizovaných syntetických peptidů, které vykazují selektivní specifítu k určitému integrinovému receptoru, konkrétně ανβ3, použité jako antagonisty vitronektinového receptoru (ανβ3) podle předkládaného vynálezu.
5. Charakterizace kuřecí chorioallantoidní membrány (CAM), která nebyla podrobena žádnému působení
A. Příprava CAM preparátů
Angiogenezi lze indukovat na kuřecí chorioallantoidní membráně (CAM) poté, co normální embryonická angiogeneze vedla k vytvoření zralých krevních cév. Ukázalo se, že angiogeneze je indukována v odpovědi na specifické cytokiny nebo nádorové fragmenty, jak popsal Leibovich a kol., Nátuře: 329, 630 (1987) a Ausprunk a kol., Am. J. Pathol.: 79, 597 (1975). CAM preparáty byly připraveny z kuřecích embryí a následně byly podrobeny postupně indukci angiogeneze a její inhibici, jak je popsáno v příkladu 6 a 7. 10 dní stará kuřecí embrya byla získána od Mclntyre Poultry (Lakeside, CA) a inkubována při teplotě 37 °C a 60% vlhkosti. Na konci vejce byla skrz skořápku udělána malá dírka přímo přes vzduchový vak za použití malých vrtáčků (Dremel, Division of Emerson Electric Co. Racine Wl). Druhá dírka byla vyvrtána na boku vejce v oblasti nemající embryonální krevní cévy, určené dříve prosvícením vejce. Na původní dírku byl aplikován negativní tlak, což vedlo k vytlačení CAM (chorioallantoidní membrány) ven z membrány skořápky a vytvoření falešného vzduchového vaku přes CAM. Skrz skořápku přes vyjmutou CAM byl vyříznut otvor o ploše 1,0 cm x 1,0 cm za použití malého modelu mlecího kola (Dremel). Malý otvor umožnil přímý přístup do vlastní CAM.
Výsledný preparát CAM byl pak použit buď k 6 dní trvající embryogenezí, přičemž toto stadium se vyznačovalo aktivní neovaskularizací, bez dalšího působení na CAM zobrazující model použitý k vyhodnocení účinků na embryonální neovaskularizací, nebo byl použit k 10 dní trvající embryogenezí, kde angiogeneze poklesla. Tento druhý preparát byl tak použit v předkládaném vynálezu k indukci obnovené angiogeneze v odpovědi na působení cytokinem nebo kontaktem s nádorem, jak popisuje příklad 6.
B. Histologie CAM preparátů
K analýze mikroskopické struktury kuřecích embryonálních CAM a/nebo lidských nádorů, vyjmutých z kuřecích embryí, jak popisuje příklad 8, byly CAM preparáty a nádory připraveny tak, aby mohly být zmraženy a nařezány na řezy, jak popisuje příklad 3A. 6 mikronů silné řezy byly nařezány ze zmrazených bločků na kryostatovém mikrotomu, aby pak byly podrobeny imunofluorescenční analýze.
Obr. 4 ukazuje typický mikrograf oblasti postrádající krevní cévy v 10 dní starém CAM preparátu, nepodrobeném působení. Protože angiogeneze v CAM systému v tomto stadiu embryogeneze poklesla, systém je v předkládaném vynálezu vhodný ke stimulaci produkce nové sítě cév z již existujících cév ze sousedních oblastí do oblastí CAM, současně postrádajících jakékoliv cévy.
-26CZ 294650 B6
C. Integrinové profily v CAM detekované imunofluorescencí
Aby bylo možno vidět distribuci integrinových receptorů přítomných v CAM tkáních, byly zmrazené řezy o tloušťce 6 mikronů z nádorové tkáně i kuřecích embryonálních CAM tkání fixovány v acetonu po dobu 30 sekund a barveny imunofluorescenčně 10 mg/ml mAb CSAT, monoklonální protilátkou, specifickou pro βι podjednotku integrinů, jak popisuje Buck a kol., J. Cell. Biol.: 107, 2351 (1988), a tím vhodnou pro kontroly, nebo LM609, připravenou v příkladu 2. Primární barvení následovalo barvení kozím anti-myším rhodaminem ve zředění 1:250, značeným sekundární protilátkou (Tágo) k umožnění detekce primárního imunoreakčního produktu. Řezy pak byly analyzovány pomocí imunofluorescenčního kombinovaného mikroskopu Zeiss.
Výsledky imunofluorescenční analýzy ukazují, že zralé krevní cévy, přítomné v 10 dní starém kuřecím embryu, nepodrobeném působení, exprimuji^i podjednotku integrinů (obr. 5Α). Na rozdíl od řezu tkáně, ukázaného na obr. 5Α, nebyla u dalšího řezu zaznamenána žádná imunoreaktivita s LM609 (obr. 5B). Takže integrin ανβ3 detekovaný LM609 protilátkou nebyl zralými krevními cévami, přítomnými v 10 dní starém kuřecím embryu, nepodrobeném působení, aktivně exprimován. Jak je ukázáno na modelu CAM a v následujících příkladech, zatímco krevní cévy v normální embryogenezi procházejí novým růstem nebojsou indukovány cytokiny nebo nádory, krevní cévy exprimují ανβ3. Ovšem po následující aktivní neovaskularizaci, poté, co cévy byly zastaveny ve vývoji, exprese ανβ3 klesá na úroveň nedetekovatelnou imunofluorescenční analýzou. Touto regulací exprese ανβ3 v krevních cévách prochází angiogeneze v kontrastu s tím, že exprese ve zralých cévách chybí, což poskytuje jedinečnou možnost podle předkládaného vynálezu kontrolovat a inhibovat angiogenezí, jak je ukázáno v následujících příkladech, kde modely byly vytvořeny za použití stanovení angiogeneze v CAM systému.
6. Stanovení angiogeneze s využitím CAM
a. Angiogeneze indukovaná růstovými faktory
Ukázalo se, že angiogeneze je indukována cytokiny nebo růstovými faktory, viz reference v příkladu 5A. Ve zde popsaných experimentech byla angiogeneze v CAM preparátu, popsaném v příkladu 5, indukována růstovými faktory, které byly podány místně do CAM krevních cév, jak je popisováno zde.
Angiogeneze byla indukována vložením Whatmanova filtračního kroužku o rozměrech 5 mm x 5 mm (Whatman filter páper No. 1), nasyceného Hanksovým roztokem s vyváženými solemi - Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) nebo HBSS, obsahujícím 150ng/ml rekombinantního základního fibroblastového růstového faktoru (bFGF) (Genzyme, Cambridge, ΜΑ), na CAM 10 dní starého kuřecího embrya v oblasti, nemající krevné cévy, a otvor byl později zalepen páskou. V dalším stanovení bylo při indukci růstu krevních cév použité množství 125 ng/ml bFGF také účinné. Angiogeneze byla sledována fotomikroskopicky po 72 hodinách. CAM byly zmraženy a kryostatové řezy o tloušťce 6 mm byly fixovány acetonem a barveny imunofluorescenčně, jak je popsáno v příkladu 5C 10 mg/ml buď anti-βι monoklonální protilátkou CSAT, nebo LM609.
Imunofluorescenční mikrofotografie na obr. 5C ukazuje zesílenou expresi ανβ3 během angiogeneze, indukované bFGF v kuřecím CAM v kontrastu s absencí exprese ανβ3 v kuřecím CAM, nepodrobeném působení, jak ukazuje obr. 5B. ανβ3 byl snadno detekovatelný v mnoha (75 % až 80 %) cévách v CAM preparátech, podrobených působení bFGF. Navíc exprese integrinů βι se nelišila od výsledku v CAM, nepodrobeném působení, a βι byl ve stimulovaných krevních cévách také snadno detekovatelný.
-27CZ 294650 B6
Pak byla kvantifikována relativní exprese ανβ3 a βι integrinů během angiogeneze, indukované bFGF, a to laserovou konfokální analýzou CAM kryostatových řezů. Barvené řezy byly poté analyzovány laserovým konfokálním mikroskopem Zeiss. Z náhodných polí bylo vybráno 25 cév, barvených LM609 a 15 barveních CSAT (průměrná velikost - 1200 mm2, rozsah 350 až 3500 mm2), a byla v libovolných jednotkách měřena průměrná rhodaminová fluorescence pro každou cévu na jednotku plochy pomocí laserové konfokální analýzy. Data jsou vyjádřena v libovolných jednotkách jako průměr intenzity fluorescence cév +/- standardní odchylka (SO).
Výsledky vynesené na obr. 6 ukazují, že barvení ανβ3 byl významně zesíleno (4x více) u CAM, podrobených působení bFGF, jak bylo určeno Wilcoxonovým testem (p<0,0001), zatímco barvení βι se zásadně nelišilo od působení bFGF.
Stanovení využívající CAM byl dále použito k vyzkoušení účinku jiného silného induktoru angiogeneze, faktoru-α nekrózy tkáně (tumor necrosis factor-alpha; TNF-α) na expresi integrinů β] a β3. Ukázalo se, že filtrační kroužky, napuštěné buď bFGF nebo TNFa a umístěné na CAM preparáty z 10 dní starých embryí, zesilují lokální angiogenezi po 72 hodinách.
Výsledky jsou ukázány na mikrofotografíích CAM preparátů buď nepodrobených působení (obr. 7A), podrobených působení bFGF (obr. 7B) nebo podrobených působení TNFa (obr. 7C). Krevní cévy jsou zjevně patrné u preparátů podrobených působení bFGF i TNFa, ale nejsou přítomné v preparátech, nepodrobených působení. Takže místní aplikace růstového faktoru/cytokinu vedla k indukci angiogeneze ze zralých cév v sousední oblasti do oblasti původně nemající krevní cévy. Z hlediska krevních cév indukovaných bFGF a doprovodné exprese ανβ3, jak je ukázáno na obr. 5C, vede působení TNFa ke srovnatelným aktivitám.
Tato zjištění ukazují, že jak u lidí, tak i u zvířat krevní cévy zahrnuté v angiogenezi vykazují zesílenou expresi ανβ3. V souladu s tím lze indukovat expresi ανβ3 v kultivovaných endoteliálních buňkách různými cytokiny in vitro, jak popisuje Janat a kol., J. Cell. Physiol.: 151. 588 (1992); Enenstein a kol., Exp. Cell. Res.: 203 499 (1992) a Swerlick a kol., J. Invest. Derm.: 99, 715(1993).
Účinek protilátky a peptidických inhibitorů na angiogenezi, indukovanou růstovým faktorem, je předložen v příkladech 7A a 7B.
B. Embryonální angiogeneze
CAM preparátem použitým k vyhodnocení účinku inhibitorů angiogeneze na přirozenou tvorbu embryonální neovaskulatury bylo 6 dní staré kuřecí embryo, popsané dříve. V tomto stadiu vývoje podstupující krevní cévy růst de novo a tak poskytují vhodný systém pro určení, jestli se ανβ3 účastní embryonální angiogeneze. Systém CAM byl připraven podle popisu výše s výjimkou, že stanovení bylo prováděno spíše v šestém dni stáří embrya než v desátém. Účinek působení protilátek a peptidů podle předkládaného vynálezu na embryonální angiogenezi je prezentován v příkladu 7C.
C. Angiogeneze indukovaná nádory
Za účelem prozkoumání role ανβ3 v angiogenezi indukované nádorem byly v CAM stanovení použity různé avB3-negativní lidské melanomové a nádorové fragmenty, kde CAM předtím rostly a byly vyizolovány z CAM 17 dní starého embrya, jak popisuje Brooks a kol., J. Cell Biol.: 122, 1351 (1993) a jak je popsáno zde. Fragmenty indukovaly rozsáhlou neovaskularizaci pouze v přítomnosti samotného pufru.
Angiogeneze byla ve stanovení v CAM systému indukována přímým připojením nádorového fragmentu na CAM. Příprava kuřecího embryonálního preparátu CAM byla identická s postupem
-28CZ 294650 B6 popsaným výše. Místo filtračního papírového kroužku byl na CAM v oblasti původně nemající krevní cévy umístěn 50 až 55 mg vážící fragment jednoho z nádorů: lidského melanomového nádoru M21-L, lidského plicního rakovinného nádoru UCLAP-3, lidské pankreatické rakovinné buněčné linie FG (Cheresh a kol., Cell: 58, 945-953, 1989) nebo lidské hrtanové rakovinné buněčné linie HEp3, což jsou všechno avp3-negativní nádory.
M21-L lidská melanomová buněčná linie, UCLAP-3 lidská plicní rakovinná buněčná linie nebo Hep3 lidská hrtanová rakovinná buněčná linie, všechny avp3-negativní, byly použity k růstu pevných lidských nádorů na CAM preparátech z kuřecích embryí. Jednotlivé buněčné suspenze o počtu buněk 8 x 106 M21-L, UCLAP-3 a FB nebo 5 x 105 HEp3 buněk byly nejprve naneseny na CAM preparáty v celkovém objemu 30 mikrolitrů (ml) sterilního HBSS. Otvory byly zalepeny páskou a embrya byla inkubována po dobu 7 dní, aby se mohl projevit růst lézí lidského nádoru. Na konci doby 7 dní bylo embryo staré již 17 dní a nádory byly z CAM vyjmuty a očištěny od okolní CAM tkáně. Nádory byly nařezány na fragmenty, vážící 50 až 55 mg a připraveny tak k použití bud’ ve stanovení angiogeneze nebo stanovení nádorového růstu. Nádorové fragmenty byly umístěny na novou sadu CAM preparátů 10 dní starého kuřecího embrya, jak je popsáno v příkladu 6A, v oblasti nemající krevní cévy.
Nádory, které in vivo vyrostly na kuřecích embryonálních preparátech, byly za účelem stanovení ανβ3 exprese barveny mAb LM609, jak popisuje příklad 3A. Nebylo pozorováno žádné specifické barvení nádorových buněk, které by indikovalo, že chybí expreseανβ3.
Nádorové preparáty CAM pak byly potupně podrobeny působení podle příkladů 7D a 7E, aby se změřily účinky protilátek a peptidů na angiogenezi, indukovanou nádorem. Nádorové preparáty CAM byly také podrobeny působení podle příkladů 8, 9 a 12 za účelem měření účinků protilátek a peptidů na potlačení nádorů a apoptózy angiogenních krevních cév a vaskulárních buněk.
7. Inhibice angiogeneze měřená v CAM stanovení
A. Inhibice angiogeneze indukované růstovým faktorem místní aplikací inhibitorů
1) Působení monoklonálních protilátek
Aby bylo možno určit, zdali ανβ3 hraje aktivní roli v angiogenezi, byly filtrační kroužky, nasycené bFGF nebo TNFa, umístěny na preparáty CAM, a pak byly monoklonální protilátky (také nazývané jako mAb) LM609 (specifická pro ανβ3), CSAT (specifická pro βι) nebo P3G2 (specifická pro ανβ5) k preparátu.
Angiogeneze byla na CAM preparátech, pocházejících z 10 dní starých kuřecích embryí, indukována filtračními kroužky nasycenými bFGF. Kroužky pak byly podrobeny působení 50ml HBSS, obsahujícího 25 mg mAb v celkovém objemu 25 ml sterilního HBSS v 0,24 a 48 hodinách. Po uplynutí 72 hodin byly CAM preparáty odebrány, umístěny v Petriho miskách o průměru 35 mm a jednou promyty 1 ml fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku. Spodní strana filtračního papíru a CAM tkáně pak byla analyzována pod stereomikroskopem. Olympus se dvěma okuláry s dvojím slepým pokusem. Inhibice angiogeneze byla pokládána za významnou, když CAM preparáty vykazovaly >50% snížení pronikání krevních cév z CAM přímo pod kroužek. Experimenty byly opakovány 4x pro každou protilátku, s 6 až 7 embryi podle podmínek.
Výsledky účinků působení mAb na angiogenezi indukovanou bFGF jsou uvedeny na obrázcích 8A až 8B. Preparát CAM, nepodrobený působení, nemající krevní cévy, je ukázán na obr. 8A pro srovnání s indukcí krevních cév bFGF, ukázanou na obr. 8B a účinků mAb na obrázcích 8C až 8E. Asi 75 % těchto preparátů CAM, podrobených působení mAb LM609, vykazovalo >50% inhibice angiogeneze, jak je ukázáno na obr. 8E a u mnoha z nich se zdá, že postrádají pronikání
-29CZ 294650 B6 cév. Naopak kontrola spufrem (obr. 8C) a P3G2 (obr. 8D) souhlasně ukazuje rozsáhlou vaskularizaci.
Identické výsledky byly získány při indukci angiogeneze TNFa. K prozkoumání účinků stejných protilátek na již dříve existující zralé krevní cévy v normálním cévním vývoji, sousedící s oblastmi nemajícími cévy, byly filtrační kroužky nasycené mAb umístěny na vaskularizované oblasti CAM preparátů, pocházejících z 10 dní starých embryí bez místní aplikace cytokinu. Žádná ze tří mAb neměla vliv na již existující cévy, což bylo určeno vizualizací pod stereomikroskopem. Takže mAb LM609 selektivně inhibovala pouze růst nových krevních cév a naúčinkovala na zralé krevní cévy v sousedící oblasti. Stejný účinek byl pozorován při aplikaci syntetických peptidů, aplikovaných buď místně nebo intravenózně, jak popisují příklady 7A2) a 7E2).
2) Působení syntetických peptidů
CAM stanovení podle předkládaného vynálezu bylo také prováděno se syntetickými peptidy podle předkládaného vynálezu k určení účinku cyklických a linearizovaných peptidů na angiogenezi, indukovanou růstovým faktorem. Peptidy byly připraveny podle popisu v příkladu 1 a v celkovém objemu 25 ml sterilního HBSSS bylo přítomno 80 mg peptidů. Peptidický roztok byl ihned nanesen na preparát CAM, a poté opět po 24 a 48 hodinách. Po uplynutí 72 hodin byl filtrační papír a okolí CAM tkáně rozděleny na kousky a vizualizovány podle popisu viz výše.
Výsledky z tohoto stanovení byly podobné těm z obrázků 9A až 9C, jak popisuje příklad 7E2), kde byly syntetické peptidy intravenózně injikovány do krevních cév indukovaných nádorem. Zde, s kontrolním peptidem 62 186, zůstaly krevní cévy indukované bFGF neporušené, jak ukazuje obr. 9A. Naopak byl-li na filtr nanesen cyklický RGD peptid 62814, tvorba krevních cév byla inhibována a zůstala oblast nemající novou vaskulaturu. Tento účinek byl podobný jevu, ukázanému na obr. 9B, jak popisuje příklad 7E2) viz níže. Navíc, jak je také ukázáno na obr. 9C pro intravenózně injikované peptidy, v oblastech, kde již byly přítomné zralé krevní cévy, vzdálených od umístění filtrů nasycených růstovým faktorem, nebyl pozorován žádný účinek vyvolaný místním působením syntetických peptidů na tyto vzdálené cévy. Inhibiční aktivita těchto peptidů na angiogenezi je tak omezena na oblasti angiogeneze, indukované růstovými faktorya nemá vliv na sousední již existující zralé cévy nebo vede ke škodlivé cytotoxicitě v okolní oblasti.
Podobná stanovení byla prováděna s ostatními syntetickými peptidy, připravenými v příkladu 1 a uvedené v tabulce 1.
B. Inhibice angiogeneze indukované růstovým faktoiem intravenózní aplikací inhibitorů
1) Působení monoklonálních protilátek
Účinek monoklonálních protilátek, intravenózně injikovaných do CAM preparátů, na angiogenezi, indukovanou růstovým faktorem, byl pro použití předkládaného vynálezu také vyhodnocován.
Příprava kuřecích embryonálních preparátů CAM pro intravenózní injikace byla v zásadě stejná jako v příkladu 7A jen s některými modifikacemi. Během prodlužování byly vybrány vyčnívající krevní cévy a na skořápku vejce byly udělány značky, označující jejich pozice. Ve skořápce byly vyvrtány dírky a CAM byly vytlačeny ven a filtrační papíry, nasycené bFGF, byly vloženy na CAM, jak je popsáno výše. Otvory byly uzavřeny sterilní páskou a embrya byla umístěna v inkubátoru. O 24 hodin později bylo na boční straně skořápky vejce opatrně vyříznuto druhé malé okénko přímo přes dříve vybrané vyčnívající krevní cévy. Vnější skořápka vejce byla opatrně odstraněna a zůstaly intaktní embryonální membrány. Membrána skořápky byla zprůhledněna malou kapkou minerálního oleje (Perkin-Elmer Corp, Norwalk, CT), což umožnilo snadno vizualizovat krevní cévy. Purifíkované sterilní mAB nebo syntetické polypeptidy (popsané níže) byly jedenkrát přímo inokulovány do krevních cév za použití jehly kalibru
-30CZ 294650 B6 v dávce 200 mg IgG na embryo v celkovém objemu 100 ml sterilního PBS. Otvory byly uzavřeny páskou a embrya byla inkubována po dobu 72 hodin. Filtrační kroužky a okolní CAM tkáně byly analyzovány, jak bylo popsáno výše.
K určení lokalizace LM609 mAb v CAM tkáních nebo nádorových tkáních, jak je ukázáno zde a v následujících příkladech, které byly již dříve intravenózně inokulovány LM609, byly fixované řezy blokovány 2,5% BSA v HBSS po dobu 1 hodiny za laboratorní teploty a následovalo barvení roztoku kozího anti-myšího rhodaminu ve zředění 1:250, značeného sekundární protilátkou (Tágo). Řezy pak byly analyzovány pomocí imunofluorescenčního kombinovaného mi kro skopu Zeiss.
Výsledky intravenózního působení protilátky na krevní cévy v CAM preparátu indukované bFGF jsou uvedeny na obr. 10A až 10C. Na obr. 10A je ukázána angiogeneze, indukovaná v důsledku působení bFGF. Při intravenózním působení mAb P3G2, anti-cCyPs protilátky, nebyly pozorovány žádné změny v přítomnosti vaskulatury indukované bFGF, jak je ukázáno na obr. 10B. Naopak působení LM609, anti-avp3 protilátky, na angiogenezi indukovanou bFGF v CAM preparátu vedlo ke kompletní inhibici růstu nových cév do oblasti cév do oblasti filtru, jak je ukázáno na obr. 10C. Inhibiční účinek na angiogenezi tak vyplývá z inhibice avp5-receptorové aktivity protilátkou LM609, specifickou proti Ονβ3. Protože blokování ανβ5 neinhibuje tvorbu neovaskulatury v místě CAM filtru, ανβ5 tak není pro růst nových krevních cév ve srovnání s ανβ3 esenciální.
2) Působení syntetických peptidů
Syntetické peptidy, připravené v příkladu 1, byly odděleně intravenózně injikovány do krevních cév indukovaných růstovým faktorem v CAM preparátu, jak je popsáno výše. Účinek peptidů na životaschopnost cév byl určen podobně.
C. Inhibice embryonální angiogeneze místní aplikací
1) Působení monoklonálních protilátek
Aby bylo možno určit, zdali se ανβ3 účastní embryonální angiogeneze, byl zkoumán účinek LM609 na de nuovo růst krevních cév v CAM preparátech 6 dní starých embryí, přičemž toto stadium se vyznačovalo aktivní neovaskularizací, jak je popsáno v příkladu 5A. CAM stanovení bylo připraveno podle popisu v příkladu 6C s následnou místní aplikací kroužků nasycených mAb, umístěných na CAM 6 dní starých embryí bez přítomnosti cytokinů. Po 3 dnech byly CAM vyjmuty a vyfotografovány. Každý experiment zahrnoval 6 embryí na skupinu a byl 2x opakován.
Protilátka LM609 (obr. 11C), ale ne CSAT (obr. 11 A) nebo P3G2 (obr. 11B), zamezila za těchto podmínek růstu cév; to znamená, že ανβ3 hraje významnou roli v embryonální neovaskularizací, která byla nezávislá na přidaných růstových faktorech, určených k indukci angiogeneze.
2) Působení syntetických peptidů
Syntetické peptidy, připravené v příkladu 1, byly odděleně přidány do embryonálních CAM preparátů připravených výše a popsaných v příkladu 5A2), a to buď místní aplikací do CAM nebo intravenózně do krevních cév. Účinek peptidů na životaschopnost cév byl vyhodnocen podobně.
D. Inhibice angiogeneze indukované nádorem místní aplikací
1) Působení monoklonálních protilátek
-31 CZ 294650 B6
Kromě stanovení angiogeneze, popsaných výše, kde byly vyhodnoceny účinky anti-avP3 antagonistů, LM609 a peptidů 62181, 62184, 62185, 62187 a 62880 na embryonální angiogenezi, byla také prozkoumána role ανβ3 v angiogenezi indukované nádorem. Jak induktor byly použity ανβ3negativní lidské ML21-L melanomové fragmenty, vypěstované a izolované již dříve z CAM 17 dní starého kuřecího embrya. Fragmenty byly připraveny podle příkladu 6C.
Jak popisuje příklad 7A1), byly mAb odděleně místně aplikovány do nádorových fragmentů v koncentraci 25 mg v 25 ml HBSS a otvory pak byly uzavřeny páskou. Po 24 a 48 hodinách byly opět stejným způsobem přidány mAb. Po 72 hodinách byly analyzovány nádory a okolní CAM tkáně, jak popisuje příklad 7A1).
Jak popisuje příklad 6C, nádoiy byly nejprve připraveny transplantací kultivovaných M21-L buněk, které neexprimují integrin ανβ3, jak popisuje Felding-Haberman a kol., J. Clin. Invest.: 89, 2018 (1992), do CAM preparátů 10 dní starých kuřecích embryí. Tyto c^3-negativní fragmenty indukovaly rozsáhlou neovaskularizaci pouze v přítomnosti samotného pufru nebo mAb CSAT (anti-βι) nebo P3G2 (anti-a^5). Naopak mAb LM609 (anti-a^3) odstranila pronikání většiny cév do nádoru a okolí CAM.
Aby mohl být kvantifikován účinek mAB na angiogenezi indukovanou nádorem, byly pod stereomikroskopem dvěma osobami spočítány krevní cévy, vstupující do nádoru v ohniskové rovině CAM s dvojím slepým pokusem. Každý sloupec dat, uvedený na obr. 12, reprezentuje průměrný počet cév +/- SO z 12 CAM preparátů v každé skupině, reprezentující zdvojené experimenty.
Tato kvantitativní analýza ukázala trojnásobné snížení počtu cév vstupujících do nádorů, podrobených působení mAb LM609, ve srovnání s nádory, podrobenými působení pufru nebo ostatních mAb, P3G2 nebo CSAT (P<0,0001), určeno Wilcoxonovým testem. Fakt, že nádory M21-L neexprimují ανβ3, naznačuje, že mAb LM609 inhibuje angiogenezi přímým působením na krevní cévy než na nádorové buňky. Tyto výsledky odpovídají histologické distribuci ανβ3 v biopsiích nádorové tkáně, ukázaných na obr. 3A až 3D, kde byla distribuce ανβ3 omezena na krevní cévy v nádoru a ne na nádorové buňky.
2) Působení syntetických peptidů
Syntetické peptidy, připravené v příkladu 1, byly místně aplikovány do systému pro CAM stanovení, do CAM s angiogenezi indukovanou nádorem, jak je popsáno výše, Účinek peptidů na životaschopnost cév byl hodnocen podobně.
E. Inhibice angiogeneze indukované nádorem intravenózní aplikací
1) Působení monoklonálních protilátek
Krevní cévy, indukované nádorem, připravené podle popisu v příkladu 7D1), byly také podrobeny působení mAb aplikovaných intravenózní injekcí. Nádory byly umístěny na CAM preparáty podle popisu v příkladu 7D1) a otvory byly uzavřeny páskou. Po 24 hodinách bylo 200 mg purifikovaných mAb inokulováno jednou intravenózně do krevních cév kuřecího embrya, jak bylo popsáno dříve. Kuřecí embrya pak byla inkubována po dobu 7 dní. Rozsah angiogeneze byl pak pozorován podle popisu, uvedeného výše. Jak popisuje příklad 8 níže, po této době byly nádory vyjmuty a určena jejich hmotnost za účelem určení účinku protilátky na růst nádoru nebo potlačení jeho růstu.
-32CZ 294650 B6
2) Působení syntetických peptidů
Byly také určeny účinky peptidů, působících na vaskulaturu indukovanou nádorem v systému CAM. Preparáty CAM-nádor byly použity podle popisu, uvedeného výše s tou výjimkou, že místo intravenózní injekce mAb byly do viditelných krevních cév jednotlivě injikovány syntetické peptidy, připravené v příkladu 1 a v příkladu 7A2).
Výsledky CAM stanovení s cyklopeptidem 66203, obsahujícím HC1 sůl a kontrolním peptidem 62186 jsou uvedeny na obr. 9A až 9C. Na obr. 9A nemělo působení kontrolním peptidem vliv na značně rozrostlé krevní cévy, které byly indukovány působením nádoru k růstu do oblasti CAM, původně nemající krevní cévy. Naopak byl-li aplikován cyklický RGD peptid 66203, antagonista ανβ3, na filtr, tvorba krevních cév byla inhibována a zůstala oblast nemající novou vaskulaturu, jak je vidět na obr. 9B. Inhibiční účinek peptidu, obsahujícího RGD, byl specifický a byl lokalizován tam, kde chyběly škodlivé účinky na cévy v sousedství místa nádoru. Takže na obr. 9C, v případě intravenózní injikace inhibičních peptidů do systému CAM, nebyl pozorován žádný účinek na již dříve existující zralé cévy v CAM v oblastech ještě vzdálených od místa nádoru. Již dříve existující cévy v tomto místě nebyly zasáhnuty vlivem inhibičního peptidu, proudícího v těchto cévách, ačkoliv generování nových cév z těchto již drive existujících cév do nádoru bylo inhibováno. Takže syntetické peptidy, zahrnující 66203 a 62184, které již dříve stanovení ligand-receptor v příkladu 4 prokázalo jako antagonisty ανβ3, se nyní projevily jako inhibitory angiogeneze, přičemž tato inhibice je omezená na cévy ve vývoji a ne na již dříve existující cévy. Navíc intravenózní infuze peptidů nevede k žádné škodlivé cytotoxicitě na sousedící oblast, jak je vidět z intaktní vaskulatury na obr. 9C.
Podobná stanovení byla provedena i ostatními syntetickými peptidy, připravenými v příkladu 1 a uvedenými v tabulce 1.
8. Inhibice růstu nádorové tkáně pomocí antagonistů ανβ3 a měřené pomocí CAM stanovení
Jak je popsáno v příkladu 7D1), kromě vizuálního stanovení účinku ηηΐί-ανβ3 antagonistů na angiogenezi, indukovanou růstovým faktorem nebo nádorem, byl účinek těchto antagonistů také určován měřením jakýchkoliv změn hmotnosti nádoru, podrobeného působení. Pro tuto analýzu byl připraven CAM systém s angiogenezi indukovanou nádorem, jak popisuje příklad 6C až 7D. Na konci sedmého dne inkubační periody byly výsledné nádory vyjmuty z CAM preparátů a očištěny od zbytkové CAM tkáně, promyty 1 ml fosforečnanem pufrovaným fyziologickým roztokem a byly určeny vlhké hmotnosti každého nádoru.
Navíc příprava nádoru pro mikroskopickou histologickou analýzu zahrnovala fixaci reprezentativních vzorků nádorů ve fíxativu Bulins po dobu 8 hodin a zapuštění v parafinu. Byla nařezána série řezů a barvena hematoxylinem a eosinem (H&E) pro mikroskopickou analýzu. Gladson a kol., J. Clin. Invest.: 88, 1924 (1991). Řezy byly vyfotografovány kombinovaným mikroskopem Olympus při zvětšení 250x.
A. Místní aplikace
Výsledky hmotnosti typických lidských melanomových nádorů (M21-L), vyplývající z místní aplikace kontrolního pufru (HBSS), P3G2 (anti-c^s) nebo LM609 (anti-a^3), jsou uvedeny v tabulce 4. Pro každý experiment bylo vyhodnoceno množství embryí, s průměrnou hmotností nádoru v mg, přičemž pro každé byla hodnota vypočtená s SO průměru, jak je uvedeno na konci tabulky.
-33CZ 294650 B6
Tabulka 4
Embryo č. Léčeni mAb Hmotnost nádoru
1 HBSS 108
2 152
3 216
4 270
5 109
6 174
1 P3G2 134
2 144
3 408
4 157
5 198
6 102
7 124
8 99
1 LM609 24
2 135
3 17
4 27
5 35
6 68
7 48
8 59
Léčení mAb Průměrná hmotnost nádoru (mg)
HBSS kontrola 172 ± 26
P3G2 171 ±36
LM609 52 ± 13
-34CZ 294650 B6
Vystavení o^-negativního lidského melanomového nádoru ve stanovení v CAM systému působení LM609 způsobilo pokles průměrné hmotnosti nádoru, nepodrobeného působení z 172 mg +/- 26 na 52 mg +/- 13. Protilátka P3G2 neměla na hmotnost nádoru vliv. Takže 5 blokování receptoru ανβ3 místní aplikací a^-specifické protilátky LM609 vedlo ke snížení hmoty nádoru spolu s inhibicí angiogeneze, jak je uvedeno v předchozích příkladech. Průměr nádoru, změřený po působení P3G2, byl přibližně 8 mm až 1 cm v průměru. Naopak nádory podrobené působení LM609 měly průměrně 2 až 3 mm v průměru.
Zmrazené řezy těchto nádorů odhalily intaktní nádorovou cytoarchitekturu nádoru, vystaveného působení P3G2, v kontrastu s nádorem, vystaveným působení LM609, který ji postrádal nebo měl organizovanou buněčnou strukturu. Aktivita receptoru ανβ3 je tedy zásadná pro c^3-negativní nádor k udržení jeho hmoty, vyživované vyvíjející se neovaskulaturou, exprimující ανβ3. Blokování ανβ3 antagonistou ανβ3 podle předkládaného vynálezu vede k inhibici angiogeneze v nádoru 15 a nakonec vede ke snížení hmoty nádoru.
B. Intravenózní aplikace
Výsledky hmotnosti typického rakovinného nádoru (UCLAP-3), vyplývající z intravenózní 20 aplikace kontrolního pufru (PBS, fosforečnanem pufrovaného fyziologického roztoku), CSAT (anti-βι) nebo LM609 (anti-avp3) jsou uvedeny v tabulce 5. Pro každý experiment bylo vyhodnoceno množství embryí, s průměrnou hmotností nádoru v mg, přičemž pro každé byla hodnota vypočtená s SO průměru, jak je uvedeno na konci tabulky.
Tabulka 5
Embryo č. Léčení mAb Hmotnost nádoru
1 PBS 101
2 80
3 67
4 90
1 CSAT 151
2 92
3 168
4 61
5 70
1 LM609 16
2 54
3 30
4 20
5 37
6 39
7 12
Léčení mAb Průměrná hmotnost nádoru (mg)
PBS kontrola 85 ±7
CSAT 108 ±22
LM609 30 ±6
Vystavení avp3-negativního lidského melanomového nádoru ve stanovení v CAM systému 30 působení LM609 způsobilo pokles průměrné hmotnosti nádoru, nepodrobeného působení, z 85 mg +/- 7 na 30 mg +/- 6. Protilátka CSAT neměla na hmotnost nádoru významný vliv.
-35 CZ 294650 B6
Takže blokování receptorů ανβ3 intravenózní aplikací a^-specifické protilátky LM609 vedlo ke snížení hmoty rakovinného nádoru jako u melanomového nádoru, uvedeného výše spolu s inhibicí angiogeneze, jak je uvedeno v předchozích příkladech. Navíc byl růst lidského melanomového nádoru podobně inhibován intravenózní injikací LM609.
9. Snížení růstu nádorové tkáně působením antagonisty ανβ3, měřené v CAM stanovení
Aby bylo možno stanovit účinky antagonistů ανβ3 na růst nádorové tkáně a její přežití, byly fragmenty lidského melanomu a fragmenty karcinomůplic, pankreatu a hrtanu umístěny na CAM preparáty 10 dní starých embryí, jak popisuje příklad 5A.
A. Intravenózní aplikace
1) Působení monoklonálních protilátek
a) Působení LM609 (anti-axfi3) a CSAT (anti-βι) hodin po implantaci CAM s fragmenty avfi3-negativního lidského melanomu M21-L, karcinomu FG z pankreatu, lidského plicního karcinomu UCLAP-3 nebo lidského hrtanového karcinomu HEp3 byla embrya injikována intravenózně samotným PBS nebo jednotlivými dávkami (300 mg/100 ml) bud’ mAb LM609 (anti-ανβ3) nebo CSAT (anti-βι). Nádory byly ponechány růst po dobu dalších 6 dnů. Na konci této inkubační doby byly nádory opatrně vyjmuty a očištěny od okolní CAM tkáně. Vyjmutí nádorů bylo provedeno dvěma nezávislými pracovníky, kteří odstranily pouze snadno definovatelnou hmotu pevného nádoru. Nádory měly velmi dobře definované okraje, takže tloušťka poloprůhledné membrány (CAM), která je snadno rozlišitelná od hmoty pevného nádoru, byla odstraněna bez poškození vlastní hmoty nádoru. Vyjmuté nádory byly zváženy a morfologicky a histologicky prozkoumány.
Jak ukazuje obr. 13, byly na konci sedmého dne určeny hmotnosti vlhkých nádorů a srovnány s hmotnostmi nádorů na začátku před působením. Každý sloupec reprezentuje střední hodnotu +/- SO 5 až 10 nádorů ve skupině. mAb LM609 inhibovala růst nádoru významně (P<0,001) ve srovnání s kontrolami ve všech testovaných nádorech. Nádory podrobené působení PBS nebo CSAT proliferovaly ve všech případech. Naopak mAb LM609 nejen zabránila růstu těchto nádorů, ale ve většině případů indukovala rozsáhlou regresi. Je důležité, že tyto nádorové buňky neexprimují integrin ανβ3, což ukazuje, že inhibice růstu byla způsobena protiangiogenními účinky této protilátky na neovaskulaturu více než přímo na nádorové buňky.
b) Působení LM609 (anti-oq$3) a P3G2 (anti-cCvfis). Nádory byly ponechány růst, jak popisuje příklad 9Al)a výše, a poté byly morfologicky a histologicky prozkoumány, jak je zde popsáno.
Reprezentativní vzorky nádorů M21-L, podrobené působení mAb P3G2 (anti-o^s) nebo LM609 (anti-a^3), byly morfologicky zkoumány. Nádory, podrobené působení P3G2, byly velké (8 mm v průměru) a dobře vaskularizované, zatímco nádory, podrobené působení mAb LM609, byly mnohem menší (3 mm v průměru) a neměly detekovatelné krevní cévy.
Nádory byly dále zkoumány tak, že byly připraveny histologické řezy, které byly barveny hematoxylínem a eosinem, jak popisuje příklad 9Al)a. Jak ukazuje, obr. 14 (horní část), nádory podrobené působení mAb P3G2 (anti-avfi5) měly mnoho viditelných a aktivně se dělících nádorových buněk, jak je indikováno mitotickými útvary (klínky) stejně jako mnohočetnými krevními cévami (šipky) procházejícími stromatem nádoru. Oproti tomu bylo v nádorech podrobených působení mAb LM609 (anti-a^) (obr. 14, spodní část) detekováno jen málo, pokud byly vůbec viditelné, nádorových buněk nebo krevních cév. Tyto výsledky demonstrují, že antagonisté integrinu ανβ3 inhibují angiogenezi indukovanou nádorem, což vede k zástavě růstu a omezení růstu různých lidských nádorů in vivo. Je důležité zaznamenat, že se embrya zkoumaná
-36CZ 294650 B6 po sedmi dnech nádorového růstu (17. den embryonálního vývoje) jevila normální po necitlivém testování zkoumajícím, jestli na embrya působil vliv antagonistů ανβ3 nebo ne. Tato zjištění znamenají, že se antagonisté tohoto integrinu zdají být netoxickými vůči vyvíjejícím se embryím.
2) Působení syntetických peptidů
Fragmenty lidského melanomového nádoru (M21-L) (50 mg) byly implantovány na CAM preparáty 10 dní starých embryí, jak popisuje příklad 5A. O 24 hodin později byla embrya intravenózně jednotlivě injikována 300 mg/100 ml buď cyklo-RADfV (69601) a nebo cyklo-RGDfV (66203). Po uplynutí celkové doby 72 hodin byly nádory odstraněny, morfologicky zkoumány a vyfotografovány pomocí stereomikroskopu, jak popisuje přklad 9A1).
Jednotlivé obrázky na obr. 15A až 15E znázorňují: obr. 15A - dva stejné vzorky, podrobené působení cyklo-RADfV peptidu (69601); obr. 15B - dva stejné vzorky, podrobené působení cyklo-RGDfV peptidu (66203); obr. 15C - tkáň sousedící s CAM, odebraná ze stejných embryí, podrobených působení cyklo-RGDfV peptidu (66203) a obr. 15D a 15E - velké zvětšení (13x) nádorů, podrobených působení peptidu. Obr. 15D znázorňuje normální krevní cévy z nádoru, podrobeného působení kontrolního peptidu (69601). Obr. 15E znázorňuje příklady rozrušených krevních cév z nádoru, podrobeného působení cyklo-RGDfV peptidu (66203) (šipky).
Výsledky znázorňují, že pouze peptid 66203 inhibovat tvorbu cév a dále že cévy v CAM tkáni, sousedící s nádorem, nebyly poškozeny.
10. Omezení růstu nádorové tkáně působením antagonistů ανβ3 a měřené stanovením in vivo v králičím modelu oka
Účinek antagonistů ανβ3 na angiogenezi, indukovanou růstovým faktorem, lze pozorovat v přirozeně průhledných strukturách, příkladem je rohovka oka. Nové krevní cévy rostou z okraje rohovky a jsou bohatě zásobovány krví oproti centru rohovky, které normálně nemá přívod krve. Jsou-li stimulátory angiogeneze, jako je bFGF, aplikovány do rohovky, indukují růst nových krevních cév zkraje rohovky. Antagonisté angiogeneze, aplikované do rohovky, inhibují růst nových krevních cév z kraje rohovky. Takže rohovka podstupuje angiogenezi přes napadnutí endoteliálních buněk z kraje rohovky do tuhé kolagenem obalené tkáně rohovky, která je snadno viditelná. Stanovení v králičím modelu oka proto poskytuje model in vivo pro přímé pozorování stimulace a inhibice angiogeneze, následující po implantaci látek přímo do rohovky oka.
A. Stanovení in vivo v králičím modelu oka
1) Angiogeneze indukovaná růstovými faktory
Angiogeneze byla indukovaná ve stanovení in vivo v králičím modelu oka růstovým faktorem bFGF a je popsána následovně.
a) Příprava hydronových pelet, obsahujících růstový faktor a monoklonální protilátky
Hydronové polymemí pelety, obsahující růstový faktor a mAb, byly připraveny podle práce D. Amata a kol., Proč. Nati. Acad. Sci.: 91, 4082-4085 (1994). Jednotlivé pelety obsahovaly 650 ng růstového faktoru bFGF, vázaného na sukralfát (Carafet, Marion Merrell Dow Corporation) ke stabilizaci bFGF a zajištění jeho pomalého uvolňování do okolní tkáně. Navíc byly hydronové pelety připraveny tak, že obsahovaly buď 40 mg mAb LM609 (anti-a^3) nebo mAb P1F6 (anti-o^s) v PBS. Pelety byly odlity ve speciálně připravených teflonových kolíčkách, které měly 2,5 mm jádro provrtané na jejich povrchy. Přibližně 12 ml odlitého materiálu bylo umístěno do každého kolíčku a přes noc polymerizováno ve sterilní digestoři. Pelety byly pak sterilizovány ultrafialovým zářením.
-37CZ 294650 B6
b) Působení monoklonálních protilátek
Každý experiment zahrnoval tři králíky, kde do jednoho oka byla vpravena peleta zahrnující bFGF a LM609, a do dalšího peleta zahrnující bFGF a myší mAb P1F6 (anti-o^$5). Použití páru očí testovaných na srovnání LM609 (anti-av33) s jinou mAb a kontrolou PBS poskytuje způsoby přesného testování k demonstrování zásadních rozdílů mezi testovanými mAb.
P1F6 imunoreaguje s integrinem ανβί, který se nalézá na povrchu vaskulárních endoteliálních buněk, ale není pravděpodobně zahrnut v angiogenezi. Aby bylo možno určit, byla-li mAb P1F6 zahrnuta v angiogenezi, byly připraveny pelety, obsahující pouze tuto mAb a testovány podle popisu viz níže k potvrzení toho, že tato mAb neindukuje angiogenezi.
Všechny testované mAb byly purifikovány zascitové kapaliny za použití afínitní kolonové chromatografie na Protein-A-Sepharose CL-4B podle dobře známých způsobů. Eluovaný imunoglobulin byl pak dialyzován proti PBS a podroben působení Detoxi-gelu (Pierce Chemicals) k odstranění endotoxinu. Endotoxin byl potvrzen jako silný stimulátor angiogeneze a zánětu. mAb byly proto testovány na přítomnost endotoxinu pomocí Chromogenic Limulus Amebocyte Lysáte Assay (Bio-Whittaker) a pouze mAb bez detekovatelného endotoxinu byly použity ve stanovení v králičím modelu oka.
Hydronová peleta, zahrnující bFGF a mAb LM609 (anti-a.ůí) nebo P1F6 (anti-o^s), byla vložena do rohovkové kapsy, vytvořené v oku králíků. Hydronová peleta také obsahovala sukralfát ke stabilizaci bFGF během stanovení. Jednotlivé pelety byly implantovány do chirurgicky vytvořené „kapsy“, vytvořené ve středu stromatu rohovky králíka. Chirurgická procedura byla provedena sterilně za použití Wildova modelu M691 operačního mikroskopu, opatřeného děličem světelného paprsku, na který byla namontována kamera, která fotograficky zaznamenávala jednotlivé rohovky. „Kapsa“ o velikosti 3 až 5 mm byla vytvořena ve stromatu rohovky provedením 3 mm řezu do poloviny tloušťky rohovky 69 Beaverovým nožem. Stroma bylo periferně rozříznuto za použití duhovkové špachtličky a peleta byla implantována do periferního okraje 2 mm od limbu.
Během následujících 14 dní bFGF a mAb difundovaly z implantované pelety do sousední tkáně a tím ovlivňovaly angiogenezi z okraje rohovky.
Reprezentativní výsledky z každého působení jsou znázorněny na obr. 16A až 16E. Množství přítomných cév bylo kvantifikováno a popsáno termínem hodin podle ciferníku, definovaným následovně. Oko je rozděleno na 12 ekvivalentních dílů stejným způsobem, jako jsou na ciferníku rozděleny hodiny. „Jedna hodina cév“ se vztahuje k množství cév, které vyplňují oblast oka, odpovídající jedné hodině na ciferníku hodin. Pět králíků, kteří obdrželi pouze bFGF, vykazovalo plně rozvinutou angiogenezi, kde nové krevní cévy rostly z kraje rohovky proti centru rohovky, které normálně nemá krevní cévy. Jeden z těchto králíků měl cévy v oblasti, odpovídající pouze jedné hodině. Dva z králíků, kteří obdrželi bFGF a mAb LM609, vykazovali absolutně nedetekovatelnou angiogenezi 14 dní po chirurgickém zákroku. Jeden z těchto králíků měl ve 14. dni 3 foci hemoragických a rašících cév. Dva z králíků, kteří obdrželi bFGF a mAb P3G2 (antiανβ5), vykazovali rozsáhlou vaskularizaci, kdy nové krevní cévy rostly z kraje rohovky dovnitř rohovky. Jeden z těchto králíků měl pouze oblast 1 až 2 hodin.
Jak bylo zjištěno ve stanovení v králičím modelu oka, nebyl pozorován žádný angiogenní účinek na normální paralimbální cévy v přítomnosti růstového faktoru bFGF u králíků, kteří obdrželi mAb LM609 (anti-a^3). Oproti tomu byla angiogeneze pozorována u paralimbálních cév v přítomnosti růstového faktoru bFGF u králíků, kteří obdrželi mAb P3G2 (anti-a^5). Kompletní inhibice rohovkové angiogeneze působením protilátky LM609 je podstatně větší než působením jakéhokoliv dříve popsaného anti-angiogenezního reakčního činidla.
-38CZ 294650 B6
11. In vivo snížení růstu nádorové tkáně působením antagonistů ανβ3, měřeno ve stanovení v modelu chimérická myš/ělověk
In vivo model chimérická myš/ělověk byl připraven nahrazením části kůže SCID myši lidskou neonatální předkožkou (obr. 17). Poté, co se transplantát kůže uchytil, byla lidská předkožka inokulována buňkami karcinomu. Poté, co se vytvořil měřitelný nádor, byla do myší ocasní žíly injikována buď protilátka LM609 (anti-avÚ3) nebo PBS. Po uplynutí 2-3 týdenní doby byl nádor vyříznut, zvážen a histologicky analyzován.
A. Stanovení in vivo v modelu chimérická myš/člověk
In vivo model chimérická myš/člověk byl připraven v podstatě podle práce Yana a kol., J. Clin. Invest.: 91. 986-996 (1993). Krátce shrnuto, 2 cm2 plochy kůže bylo chirurgicky odstraněno z SCID myši (staré 6-8 týdnů) a nahrazeno lidskou předkožkou. Myš byla anestezována a z plochy 5 cm2 na každé straně podél břišní oblasti byla vyholena srst. Odstraněním kůže v plné tloušťce dolů k fascii byly připraveny dva kroužkové odřezky o velikosti 2 cm2. Transplantáty lidské kůže v plné tloušťce o stejné velikosti, pocházející z lidské neonatální předkožky, byly umístěny na poraněná místa a přišity. Transplantát byl přikryt leukoplastí, která byla také přišita ke kůži. K překrytí poranění byla také použita látková páska s mikropóry.
Ke vzniku pevného nádoru na transplantátu lidské kůže na SCID myši byla použita M21-L lidská melanomová buněčná linie nebo MDA 23.1 buněčná linie prsního karcinomu (ATCC HTB 26; ανβ3 s mAb LM609). Suspenze jednotlivých buněk o počtu 5xl06 M21-L nebo MDA 23.1 buněk byla injikována intradermálně do transplantované lidské kůže. Myši pak byly pozorovány po dobu 2 až 4 týdnů tak, aby mohly vyrůst měřitelné lidské nádory.
B. Intravenózní aplikace
1) Působení monoklonálních protilátek
Poté, co SCID myším, injikovaným M21-L nádorovými buňkami, vyrostly měřitelné nádory, bylo myším intravenózně injikováno do ocasní žíly 250 mg buď mAb LM609 (anti-c^3) nebo PBS, a to dvakrát týdně po dobu 2 až 3 týdnů. Po uplynutí této doby byly nádory vyjmuty z kůže a očištěny od okolní tkáně. Pro každé působení bylo vyhodnoceno několik myší, byla vypočtena průměrná hmotnost nádoru pro každé působení a tyto hodnoty jsou uvedeny v tabulce 6.
-39CZ 294650 B6
Tabulka 6
Embryo č. Léčení mAb Hmotnost nádoru
1 PBS 158
2 192
3 216
4 227
5 LM609 195
6 42
7 82
8 48
9 37
10 100
11 172
Léčení Průměrná hmotnost nádoru (mg)
PBS 198
LM609 113
Podrobení M21-L cq$3-negativního lidského rakovinného nádoru v systému chimérická myš/člověk působení LM609 (anti-avp3) způsobilo snížení průměrné hmotnosti nádoru oproti působe5 ní PBS ze 198 na 113 mg.
Reprezentativní příklady nádorů M21-L, podrobených působení mAb LM609 (anti-avp3) a PBS, byly morfologicky testovány. Nádory, podrobené působení PBS, byly velké (8 až 10 mm v průměru) a dobře vaskularizovány, zatímco nádory, podrobené působení mAb LM609 10 (anti-avPa), byly mnohem menší (3 až 4 mm v průměru) a postrádaly detekovatelné krevní cévy.
Nádory vzniklé na transplantované kůži, které byly injikovány MDA 23.1 buňkami, byly detekovatelné a měřitelné. Morfologické testování vzniklých nádorů ukázalo, že probíhala neovaskularizace z transplantované lidské tkáně do MDA 23.1 nádorových buněk.
Takže blokování receptoru ανβ3 intravenózní aplikací o^3-specifické protilátky LM609 vedlo ke snížení růstu karcinomu v tomto modelovém systému stejným způsobem jako v CAM a králičím modelu oka, jak popisuje příklad 9, respektive 10.
-40CZ 294650 B6
12. Stimulace vaskulárních buněk ke vstupu do buněčného cyklu a podstoupení apoptózy v přítomnosti antagonistů integrinu avp3, měřeno v CAM stanovení
Angiogenní proces zjevně závisí na kapacitě cytokinů, jako je bFGF a VEGF, stimulovat proliferaci vaskulárních buněk. Mignatti a kol., J. Cell. Biochem.: 471, 201 (1991); Takeshita a kol., J. Clin. Invest., 93, 662 (1994); a Koyama a kol., J. Cell. Physiol.: 158, 1 (1994). Ovšem je také zřejmé, že signální děje mohou regulovat diferenciaci těchto vaskulárních buněk ve zralé krevní cévy. Takže je možné, že interference se signály, týkajícími se buď růstu nebo diferenciace vaskulárních buněk, podstupujících nový růst nebo angiogenezi, může vést k perturbaci angiogeneze.
Ukázalo se, že se ligační integrinové děje účastní jak buněčné proliferace, tak i apoptózy nebo programované buněčné smrti in vitro. Schwartz, Cancer Res.: 51, 1503 (1993) Meredith a kol., Mol. Biol. Cell.: 4, 953 (1993); Frisch a kol., J. Cell. Biol.: 124, 619 (1904); a Ruoslahti a kol., Cell: 77, 477 (1994). Podobné zkoušky účinků antagonistů ανβ3 na angiogenezi ukázaly přítomnost diskontinuálních a rozrušených krevních cév, asociovaných s nádorem. Proto je možné, že ztráta kontinuity krevních cév může nastat v důsledku selektivní nekrózy nebo apoptózy vaskulárních buněk.
K ověření této možnosti byly testovány CAM preparáty po indukci angiogeneze růstovým faktorem bFGF a podrobení působení mAb a cyklopeptidy podle předkládaného vynálezu.
A. Působení monoklonálních protilátek
Apoptózu lze detekovat různými způsoby, které zahrnují přímé testování DNA izolované z tkáně na detekci fragmentace DNA a detekci 3 OH v intaktní tkáni protilátkou, která specificky detekuje volné 3 OH skupiny nebo fragmentovanou DNA.
1) Analýza fragmentace DNA
Angiogeneze byla indukována tak, že byly filtrační kroužky nasycené bFGF umístěny na CAM preparáty 10 dní starých embryí, jak popisuje příklad 6A. Imunohistologická analýza CAM preparátů s M609 (anti-a^) ukázala maximum exprese ανβ3 v krevních cévách 12 až 24 hodin po iniciaci angiogeneze bFGF. Takže 24 hodin po stimulaci bFGF byla embrya inokulována intravenózně 100 ml samotného PBS nebo PBS, obsahujícího 300 mg buď mAb CSAT (anti-βι) nebo LM609 (anti- ανβ3).
Fragmentace DNA byla detekována vyjmutím CAM tkáně přímo pod filtračními kroužky nasycenými bFGF 24 nebo 48 hodin po inokulaci mAb LM609 (anti-a^), CSAT (anti-βι) nebo PBS. Vyříznuté CAM tkáně byly třikrát promyty sterilním PBS a nakonec nadrobno rozkrájeny, resuspendovány v 0,25% bakteriální kolagenáze (Worthington Biochemical; Freehold, NH) a inkubovány po dobu 90 min při teplotě 37 °C za občasného promíchání. DNA byla extrahována z ekvivalentního počtu CAM buněk z jednotlivých buněčných suspenzí, jak bylo popsáno viz výše. Bissonette a kol., Nátuře: 359, 552 (1992). Krátce řečeno, určitý počet buněk CAM byl lyžován v 10 mM TRIS-C1, pH 8,0, 10 mM EDTA v 0,5% (objemových) Triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO). Buněčné lyzáty byly centrifugovány při 16 000 gpo dobu 15 min při teplotě 4 °C až do oddělení rozpustné fragmentované DNA od intaktní chromatinové pelety. Fragmentovaná DNA byla promyta, vysrážena a analyzována na 1,2% (hmotnostní/objemová) agarózovém gelu.
Rozpustná fragmentovaná DNA byla izolována z ekvivalentního počtu CAM buněk z každého působení, elektroforeticky rozdělena na agarózovém gelu a vizualizována barvením v ethidiumbromidu. V relativním množství fragmentace DNA nebyl určen žádný rozdíl od tří různých působení v době 24 hodin po působení. Ovšem 48 hodin po působení mAb LM609 (anti-a^)
-41 CZ 294650 B6 byl pozorován významný vzrůst fragmentace DNA ve srovnání s embryi, podrobenými působení buď mAb CSAT (anti-βι) nebo samotného PBS.
2) Stimulace vaskulámích buněk ke vstupu do buněčného cyklu
Aby bylo možno experimentálně ověřit roli ανβ3 v těchto pochodech, byly buňky, pocházející z CAM preparátů, podrobené nebo nepodrobené působení bFGF, barveny propidiumjodidem a ponechány imunoreagovat (anti-av$3).
CAM preparáty izolované z embryí 24 a 48 hodin po působení mAb LM609 (anti-a^3), CSAT (anti-βι) nebo PBS byly disociovány v jednotlivých buněčných suspenzích inkubací s bakteriální kolagenázou, jak je popsáno výše. Jednotlivé buňky pak byly permeabilizovány a barveny za použití detekční sady Apop Tag In šitu podle instrukcí výrobce (Oncor, Gaithersburg, MD). Apop Tag je protilátka, která specificky detekuje volné 3 OH skupiny fragmentované DNA. Detekce takových volných 3 OH skupin je zavedeným způsobem detekce apoptotických buněk. Gavrieli a kol., J. Cell. Biol.: 119, 493 (1992).
Buňky barvené Apop Tag byly opláchnuty 0,1% (objemová %) Triton X-100 v PBS a resuspendovány v pufru FACS, obsahujícím 0,5 % (hmotnostní/objemová) BSA, 0,02 % (hmotnostní/objemová) azidu sodného a 200 mg/ml RNázy A v PBS. Buňky byly inkubovány po dobu 1,5 hodiny, promyty a analyzovány fluorescenčně aktivovaným třídičem buněk. Buněčná fluorescence byla měřena za použití FACScan průtokového cytometru a data byla analyzována podle popisu viz dále.
Buněčná fluorescence byla měřena za použití FACScan průtokového cytometru (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Boční rozptyl (SSC) a přední rozptyl (FSC) byly určovány simultánně a všechna data byla shromažďována počítačem Hewlett Packard (HP9000), vybaveným softwarem FACScan pro výzkumné účely (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Data byla analyzována za pomoci softwaru P. C. Lysis verze I (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Negativní kontrolní přívody byly nastaveny za použití buněčných suspenzí bez přídavku primárních protilátek ze sady Apop Tag. Identický průtok byl aplikován na obě buněčné populace, což vedlo k analýze asi 8000 buněk pro různá buněčná působení.
Procenta jednotlivých buněk, pocházejících z mAb podrobených působení CAM a barvených Apop Tag, určená analýzou FACS, jsou uvedena na obr. 18. Černý sloupec reprezentuje buňky z embryí, podrobených působení 24 hodin před analýzou. Tečkovaný sloupec reprezentuje buňky z embryí, podrobených působení 48 hodin před analýzou. Každý sloupec reprezentuje střední průměr +/- SO ze tří opakovaných pokusů.
Jak ukazuje obr. 18, CAM preparáty, podrobené působení mAb LM609 (anti-o^3) dva dny před analýzou, vykazovaly 3 až 4-násobné zvýšení intenzity barvení Apop Tag ve srovnání s CAM preparáty, podrobenými působení buď samotného PBS nebo CSAT (anti-βι).
B. Působení syntetickými peptidy
CAM stanovení angiogeneze, indukované růstovým faktorem, jak popisuje příklad 6A, byla také prováděna se syntetickými peptidy podle předkládaného vynálezu za účelem určení účinku cyklopeptidů na apoptózu. Peptidy cyklo-RGDfV (66203) a cyklo-RADfV (69601) byly připraveny podle popisu v příkladu 1. Roztoky peptidů nebo PBS byly injikovány do CAM preparátů v koncentraci 300 mg/ml. Po 24 a 48 hodinách byl oddělen filtrační papír a okolní tkáň CAM a barven Apop Tag za účelem detekce apoptózy, jak je popsáno viz výše vpříkladu 12A2).
-42CZ 294650 B6
Jak ukazuje obr. 18, CAM preparáty, podrobené působení peptidu 66203 (cyklo-RGDfV) dva dny před analýzou, vykazovaly až 3-násobné zvýšení intenzity barvení Apop Tag ve srovnání se samotným PBS nebo kontrolním cyklopeptidem 69601 (cyklo-RADfV).
C. Účinek působení monoklonálních protilátek na apoptózu a buněčný cyklus
Jednotlivé buněčné suspenze byly testovány také na počet kopií chromozomální DNA, a to barvením propidiumjodidem k určení účinku působení monoklonálních protilátek na buněčný cyklus a apoptózu barvením Apop Tag.
Podle popisu v příkladu 12A1) byly připraveny jednotlivé buněčné suspenze CAM preparátů, podrobené 24 nebo 48 hodin předtím působení mAb LM609 (anti-avp3), CSAT (anti-βι) nebo PBS.
Buněčné suspenze byly promyty třikrát pufrem, obsahujícím 2,5 % (hmotnostní/objemová) BSA a 0,25 % (hmotnostní/objemová) azidu sodného v PBS, aby pak mohly být barveny Apop Tag. Buňky byly poté fixovány v 1% (hm./obj.) paraformaldehydu v PBS po dobu 15 minut a následovaly tři promytí, jak bylo uvedeno výše. Aby se předešlo nespecifickým vazbám, byly jednotlivé buněčné suspenze blokovány 5 (hm./obj.) BSA v PBS přes noc při teplotě 4 °C. Buňky pak byly promyty podle popisu výše, barveny Apop Tag a byla měřena fluorescence buněk za pomoci FACScan, jak popisuje příklad 12A.
Buňky ze všech experimentálních podmínek byly barveny propidiumjodidem (Sigma, St. Louis, MO) v 10 mg/ml v PBS po dobu 1 hodiny, dvakrát promyty PBS a byly analyzovány jaderné charakteristiky, typické pro apoptózu, včetně kondenzace a segmentace chromatinu. Procentní zastoupení apoptických buněk bylo stanoveno morfologickou analýzou buněk nejméně 10 až 15 náhodně vybraných mikroskopických polí.
Kombinované výsledky jednotlivých buněčných suspenzí CAM z embryí, podrobených působení buď CSAT (anti-βι) nebo LM609 (anti-cc^3), barvených Apop Tag a propidiumjodidem a analyzovaných FACS, jsou uvedeny na obr. 19. Osa Y vyznačuje barvení Apop Tag (apoptóza), osa X vyznačuje barvení propidiumjodidem (obsah DNA). Horizontální linie vyznačuje negativní přívody pro barvení Apop Tag. Oba obrázky vyznačují CAM buňky z embryí, podrobených působení CSAT, respektive LM609. Analýza buněčného cyklu byla provedena analýzou asi 8000 cyklů za daných podmínek a data jsou vynesena ve vrstevnicovém diagramu.
Vzorky jednotlivých buněk, barvených propidiumjodidem, tj. barvivém DNA, ukázaly, že 25 až 30 % CAM buněk, podrobených působení LM609 (anti-cc^3) 48 hodin po působení, prokázalo jadernou kondenzaci a/nebo segmentaci. Tyto pochody jsou charakteristické pro buňky, podstupující apoptózu. To je v kontrastu sCAM preparáty, podrobenými působení CSAT (anti-βι), kde vykazovalo 90 až 95 % buněk normální jaderné barvení.
Jak ukazuje obr. 19, v souladu s indukcí apoptózy působením LM609 byl pozorován významný počet buněk v maximu, obsahujícím méně než jednu kopii DNA (AO). Toto maximum bylo dříve uvedeno jako reprezentace fragmentované DNA v pozdním stadiu apoptotických buněk. Telford a kol., Cytometry: 13, 137 (1992). Dále lze tyto AO buňky snadno barviv Apop Tag, což potvrzuje schopnost této látky detekovat apoptotické buňky. Ovšem kromě barvení buněk v AO byl také pomocí Apop Tag barven významný počet buněk, obsahujících více než jednu kopii DNA (obr. 19). Tyto výsledky znázorňují schopnost LM609 podporovat apoptózu mezi vaskulárními buňkami, které už vstoupily do buněčného cyklu. Naopak buňky, pocházející z kontrolních preparátů CAM, které již vstoupily do buněčného cyklu, vykazují minimální barvení Apop Tag, což je v souladu s několika apoptotickými buňkami, detekovanými u kontrolních preparátů CAM podrobených působení.
-43CZ 294650 B6
Mezi buňkami z CAM stimulovanými bFGF, které vstoupily do buněčného cyklu (S a G2/M fáze), vykazovalo 70 % pozitivní barvení LM609 (anti-av33). To bylo srovnáno s 10 % LM609 barvených buněk CAM mezi buňkami v cyklu, které nebyly podrobeny působení bFGF. Toto zjištění ukazují, že po stimulaci bFGF vykazoval hlavní podíl buněk nesoucích ανβ3 aktivní proliferaci.
Tato zjištění společně naznačují, že intravenózní injekce mAb LM609 nebo cyklického peptidového antagonisty ανβ3 podporují apoptózu v kuřecích CAM následně po indukci angiogeneze.
U CAM preparátů byla také histologicky testována exprese ανβ3, a to imunoreaktivně s LM609, a buňky podstupující apoptózu, a to imunoreaktivně s Apop Tag. CAM řezy vyříznuté z embryí 48 hodin před podrobením působení LM609 (anti-av33), CSAT (anti-βι) nebo PBS, připravené v příkladu 5A, byly promyty, usazeny do OTC (Baxter) a zamrazeny v kapalném dusíku. Z CAM tkání byly nařezány 6 mikronů silné řezy, fixovány v acetonu po dobu 30 sekund a uchovány při teplotě -70 °C až do použití. Řezy tkáně byly připraveny k barvení krátkým opláchnutím v 70% (obj.) ethanolu (EtOH) a následným trojím promytím v PBS. Dále byly řezy blokovány v 5% (hm./obj.) roztoku BSA po dobu 2 hodin, následovala inkubace s 10 mg/ml mAb LM609 po dobu 2 hodin. Řezy pak byly promyty a inkubovány v roztoku rhodaminu, zředěném 1:50, konjugovaném s kozím anti-myším IgG (Fisher Sientific, Pittsburg, PA) po dobu 2 hodin. Nakonec byly tytéž řezy opláchnuty a barveny Apop Tag, jak popisuje příklad 12A2). Obarvené řezy tkáně byly připevněny a analyzovány pomocí konfokálního imunofluorescenčního mikroskopu.
Na obr. 20A až 20C jsou uvedeny CAM tkáně z embryí, podrobených působení CSAT (anti-βι) a na obr. 20D až 20F jsou CAM tkáně z embryí, podrobených působení LM609 (anti-av33)· Obr. A a D znázorňuje tkáně barvené Apop Tag a vizualizované fluorescencí (FITC) na sebe vrstvených DIC obrazů. Obr. B a E znázorňuje stejné tkáně barvené mAb LM609 (anti-o^) a vizualizované fluorescenčně (rhodamin). Obr. C a F znázorňuje splynuté obrazy stejných tkání, barvených Apop Tag i LM609, kde žluté zbarvení znamená kolokalizaci. Sloupec vyznačuje 15 na levé a 50 mm na pravé straně.
Jak ukazuje obr. 20 (A až C), po intravenózní injekci CSAT nebo kontroly PBS ukázalo barvení Apop Tag minimální a rozptýlenou intenzitu indukující minimální úroveň apoptózy vtkáni. Naopak CAM preparáty z embryí, předtím podrobených působení LM609 nebo cyklopeptidu 203, ukázaly většinu cév intenzivně zbarvených Apop Tag, zatímco u okolních nevaskulámích buněk byla pozorována minimální reaktivita (obr. 20D až F). Navíc byly-li k barvení těchto tkání použity Apop Tag i LM609 (obr. 19C a 19F), byla významná kolokalizace pozorována pouze mezi těmito markéry v CAM, pocházejících z embryí, podrobených působení antagonistů ανβ3 (obr. 20F). Tato zjištění ukazují, že po indukci angiogeneze in vivo inhibitory integrinu ανβ3 selektivně podporují apoptózu krevních cév, nesoucích ανβ3.
Zatímco angiogeneze je komplexní proces, zahrnující mnoho molekulárních a buněčných biologických dějů, některé z důkazů předpokládají, že integrin ανβ3 vaskulámích buněk v tomto pochodu hraje relativně pozdní roli. Za prvé imunohistologická analýza ukázala, že exprese ανβ3 ve vaskulámích buňkách dosáhla maxima 12 až 24 hodin po indukci angiogeneze bFGF. Za druhé antagonisté ανβ3 vnesly zmatek do angiogeneze, indukované mnohonásobnými aktivátory, což naznačuje, že tento receptor je zahrnut v běžných cestách ve směru od asi všech primárních signálních dějů, vedoucích k angiogenezi. Za třetí CAM preparáty, podrobené působení mAb LM609 nebo cyklopeptidu, nevykazovaly významné zvýšení apoptózy, což bylo měřeno pomocí DNA žebříčkování po 48 hodin po podrobení působení těmito antagonisty. A konečně antagonisté ανβ3 podporují apoptózu vaskulámích buněk, které už byly indukovány ke vstupu do buněčného cyklu.
-44CZ 294650 B6
Předkládané výsledky poskytují první přímý důkaz, že ligační integrinové děje mohou regulovat přežití buněk in vivo. Tato hypotéza vznikla proto, že jakmile angiogeneze jednou začne, jednotlivé vaskulární buňky se dělí a začínají se pohybovat proti angiogennímu zdroji, a potom ligace ανβ3 poskytuje signál, umožňují přetrvávající buněčné přežití, což vede k diferenciaci a tvorbě zralých krevních cév. Ovšem jestliže je ligaci ανβ3 bráněno, pak buňky nedokážou přijmout tento molekulární podnět a v důsledku toho zahájí apoptózu. Tato hypotéza by také předpovídala, že poté, co došlo k diferenciaci, zralé krevní cévy už dále k přežití nepotřebují signalizaci ανβ3, a tak na antagonisty tohoto integrinu nereagují.
A konečné výsledky zde předkládané poskytují důkaz, že antagonisté integrinu ανβ3 mohou poskytovat důležitý terapeutický přístup k léčbě rakoviny nebo dalších onemocnění, charakterizovaných angiogenezí. Za prvé antagonisté ανβ3 rozrušují nově tvořené krevní cévy bez škodlivého vlivu na již dříve existují vaskulaturu. Za druhé tyto antagonisté nemají významný účinek na životaschopnost kuřecího embrya, takže lze předpokládat, že jsou netoxické. Za třetí byla angiogeneze významně blokována bez ohledu na angiogenní stimulaci. A konečně podávání antagonistů ανβ3 do krevního oběhu zapříčinila dramatickou regresi různých histologicky jasných lidských nádorů.
Takže výše uvedené příklady znázorňují, že integrin θνβ3 hraje klíčovou roli v angiogenezí, indukované různými stimuly a jako takový lze ανβ3 spolu s antagonisty ανβ3 podle předkládaného vynálezu hodnotě terapeuticky využít při léčbě onemocnění, charakterizovaných výskytem neovaskularizace.
Předcházející popis je považován za dostačující ktomu, aby osoba, obeznámená s technikou, předkládaný vynález uskutečnila v praxi. Předkládaný vynález není omezen na uvedené buněčné linie, protože uvedené provedení je zamýšleno jako jednoduchá ilustrace jednoho aspektu předkládaného vynálezu a jakákoliv funkčně ekvivalentní buněčná linie je v souladu s předkládaným vynálezem. Uvedený materiál nepřipouští, že by zde uvedené provedení vynálezu neposkytovalo možnosti uskutečnit jakýkoliv aspekt předkládaného vynálezu v praxi, včetně jeho nejlepší varianty, ani není omezen rozsahem nároků a specifických ilustrací, které ho reprezentují. Naopak osobě obeznámené s technikou budou z dříve uvedeného provedení a obsahu připojených nároků zřejmé různé modifikace předkládaného vynálezu kromě již uvedených a popsaných.
Průmyslová využitelnost
Předkládaný vynález popisuje způsoby inhibice angiogeneze v tkáních a použití vitronektin-a^3 antagonistů a zvláště inhibice angiogeneze v zanícených a nádorových tkáních a metastázách za využití terapeutických prostředků, obsahujících ανβ3 antagonisty. Tyto prostředky jsou tedy využitelné jako léčiva.
Přehled sekvencí
1) Obecné informace:
i) předkladatel:
A) jméno: The Scripps Research Institute
B) ulice: 10666 North Torrey Pines Road
C) město: La Jolla
D) stát: Kalifornie
E) země: USA
F) PSČ: 92037
-45 CZ 294650 B6
G) telefon: 619 554 2937
H) fax: 619 554 6312 ii) název vynálezu: Způsoby a prostředky využitelné k inhibici angiogeneze iii) počet sekvencí: 14 iv) použitá počítačová technika:
A) typ média: floppy disk
B) počítač: IBM PC kompatibilní
C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS
D) software: Patent In Release #1.0, Version #1.25 (EPO)
v) současné údaje žádosti:
A) číslo žádosti: PCT/US 95/
B) datum registrace: 9. 3. 1995 vi) dřívější údaje žádosti:
A) číslo žádosti: US 08/210, 715
B) datum registrace: 18. 3. 1994 vii) dřívější údaje žádosti:
A) číslo žádosti: US 08/366, 665
B) datum registrace: 30. 12. 1994
2) Informace k SEQ ID NO: 1:
i) charakteristiky sekvence:
A) délka: 6 aminokyselin
B) typ: aminokyselina
C) vlákno: jednoduché
D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetická: ne iv) anti-sense: ne
v) typ fragmentu: vnitřní ix) charakteristické znaky:
A) jméno/klíč: peptid
B) umístění: 1..6
D) další informace: /označení = BOC-GRGDFV-OMe /poznámka = „BOC znamená N-koncovou chránící skupinu butyloxykarbonyl; OMe znamená C-koncový methylester; arginin ve druhé pozici ix) charakteristické znaky:
A) jméno/klíč: Peptid
B) umístění: 1..6
D) další informace: /označení = OMe /poznámka = „OMe znamená C-koncovou chránící skupinu methylester“.
-46CZ 294650 B6 ix) charakteristické znaky:
A) jméno/klíč: Peptid
B) umístění: 1..6
D) další informace: /označení = D-Arg /poznámka = „Prefix D u D—Arg znamená, že arginin v pozici 2 je D-aminokyselina“.
xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
Gly Arg Gly Asp Phe Val
5
2) Informace kSEQIDNO:2:
i) charakteristiky sekvence:
A) délka: 6 aminokyselin
B) typ: aminokyselina
C) vlákno: jednoduché
D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetická: ne iv) anti-sense: ne
v) typ fragmentu: vnitřní ix) charakteristické znaky:
A) jméno/klíč: peptid
B) umístění: 1..6
D) další informace: /označení = BOC /poznámka = „BOC znamená N-koncovou blokující skupinu terc-butyloxykarbonyl.
ix) charakteristické znaky:
A) jméno/klíč: Peptid
B) umístění: 1..6
D) další informace: /označení - OH /poznámka = „OH znamená volnou C-koncovou karboxylovou kyselinu“.
ix) charakteristické znaky:
A) jméno/klíč: Peptid
B) umístění: 1..6
D) další informace: /označení = D-Arg /poznámka = „Prefix D u D-Arg znamená, že arginin v pozici 2 je D-aminokyselina“.
xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
Gly Arg Gly Asp Phe Val
5
2) Informace k SEQ ID NO:3:
i) charakteristiky sekvence:
-47CZ 294650 B6
A) délka: 6 aminokyselin
B) typ: aminokyselina
C) vlákno: jednoduché
D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetická: ne iv) anti-sense: ne
v) typ fragmentu: vnitřní ix) charakteristické znaky:
A) jméno/klíč: peptid
B) umístění: 1..6
D) další informace: /označení = H /poznámka = „H znamená volný N-koncový amin“.
ix) charakteristické znaky:
A) jméno/klíč: Peptid
B) umístění: 1..6
D) další informace: /označení = OH /poznámka = „OH znamená volnou C-koncovou karboxylovou kyselinu“.
ix) charakteristické znaky:
A) jméno/klíč: Peptid
B) umístění: 1..6
D) další informace: /označení = D-Arg /poznámka - „Prefix D u D-Arg znamená, že arginin v pozici 2 je D-aminokyselina“.
xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
Gly Arg Gly Asp Phe Val
5
2) Informace k SEQ ID NO:4:
i) charakteristiky sekvence:
A) délka: 6 aminokyselin
B) typ: aminokyselina
C) vlákno: jednoduché
D) topologie: cirkulární ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetická: ne i v) anti-sense: ne
v) typ fragmentu: vnitřní ix) charakteristické znaky:
A) jméno/klíč: peptid
-48CZ 294650 B6
B) umístění: 1..6
D) další informace: /označení = cyklo /poznámka = „cyklo znamená cyklopeptid; malá písmena označují D-aminokyselinu; velká písmena označují L-aminokyselinu“.
xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
Gly Arg Gly Asp Phe Val
5
2) Informace k SEQ ID NO:5:
i) charakteristiky sekvence:
A) délka: 5 aminokyselin
B) typ: aminokyselina
C) vlákno: jednoduché
D) topologie: cirkulární ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetická: ne iv) anti-sense: ne
v) typ fragmentu: vnitřní ix) charakteristické znaky:
A) jméno/klíč: peptid
B) umístění: 1 ..5
D) další informace: /označení = cyklo /poznámka = „cyklo znamená cyklopeptid; malá písmena označují D-aminokyselinu; velká písmena označují L-aminokyselinu.“ xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
Arg Gly Asp Phe Val
5
2) Informace k SEQ ID NO:6:
i) charakteristiky sekvence:
A) délka: 5 aminokyselin
B) typ: aminokyselina
C) vlákno: jednoduché
D) topologie: cirkulární ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetická: ne iv) anti-sense: ne
v) typ fragmentu: vnitřní
-49CZ 294650 B6 ix) charakteristické znaky:
A) jméno/klíč: peptid
B) umístění: 1..5
D) další informace: /označení = cyklo /poznámka = „cyklo znamená cyklopeptid; malá písmena označují D-aminokyselinu; velká písmena označují L-aminokyselinu.“ xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 6:
Arg Ala Asp Phe Val
5
2) Informace k SEQ ID NO:7:
i) charakteristiky sekvence:
A) délka: 5 aminokyselin
B) typ: aminokyselina
C) vlákno: jednoduché
D) topologie: cirkulární ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetická: ne iv) anti-sense: ne
v) typ fragmentu: vnitřní ix) charakteristické znaky:
A) jméno/klíč: peptid
B) umístění: 1..5
D) další informace: /označení = cyklo /poznámka = „cyklo znamená cyklopeptid; malá písmena označují D-aminokyselinu; velká písmena označují D-aminokyselinu.“ xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 7:
Arg Gly Asp Phe Val
5
2) Informace k SEQ ID NO:8:
i) charakteristiky sekvence:
A) délka: 15 aminokyselin
B) typ: aminokyselina
C) vlákno: jednoduché
D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetická: ne
-50CZ 294650 B6 iv) anti-sense: ne
v) typ fragmentu: vnitřní xi) popis sekvence: SEQ ID NO:8:
Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gin Val Thr Arg Gly Asp Val Phe
5 10 15
2) Informace k SEQ ID NO:9:
i) charakteristiky sekvence:
A) délka: 5 aminokyselin
B) typ: aminokyselina
C) vlákno: jednoduché
D) topologie: cirkulární ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetická: ne iv) anti-sense: ne
v) typ fragmentu: vnitřní ix) charakteristické znaky:
A) jméno/klíč: peptid
B) umístění: 1..5
D) další informace: /označení = cyklo /poznámka = „cyklo znamená cyklopeptid; malá písmena označují D-aminokyselinu; velká písmena označují L-aminokyselinu.“ xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 9:
Arg Ala Asp Phe Val
5
2) Informace k SEQ ID NO: 10:
i) charakteristiky sekvence:
A) délka: 6 aminokyselin
B) typ: aminokyselina
C) vlákno: jednoduché
D) topologie: cirkulární ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetická: ne iv) anti-sense: ne
v) typ fragmentu: vnitřní
-51 CZ 294650 B6 ix) charakteristické znaky:
A) jméno/klíč: peptid
B) umístění: 1..6
D) další informace: /označení = cyklo /poznámka = „cyklo znamená cyklopeptid; malá písmena označují D-aminokyselinu; velká písmena označují L-aminokyselinu.“ xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 10:
Ala Arg Gly Asp Phe Leu
5
2) Informace k SEQ ID NO: 11:
i) charakteristiky sekvence:
A) délka: 6 aminokyselin
B) typ: aminokyselina
C) vlákno: jednoduché
D) topologie: cirkulární ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetická: ne iv) anti-sense: ne
v) typ fragmentu: vnitřní ix) charakteristické znaky:
A) jméno/klíč: peptid
B) umístění: 1..6
D) další informace: /označení = cyklo /poznámka = „cyklo znamená cyklopeptid; malá písmena označují D-aminokyselinu; velká písmena označují L-aminokyselinu.“ xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 11:
Gly Arg Gly Asp Phe Leu
5
2) Informace k SEQ ID NO: 12:
i) charakteristiky sekvence:
A) délka: 12 aminokyselin
B) typ: aminokyselina
C) vlákno: jednoduché
D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetická: ne iv) anti-sense: ne
-52CZ 294650 B6
v) typ fragmentu: vnitřní xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 12:
Thr Arg Gin Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met
5 10
2) Informace k SEQ ID NO: 13:
i) charakteristiky sekvence:
A) délka: 13 aminokyselin
B) typ: aminokyselina
C) vlákno: jednoduché
D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetická: ne iv) anti-sense: ne
v) typ fragmentu: vnitřní xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 13:
Gly Val Val Arg Asn Asn Glu Ala Leu Ala Arg Leu Ser
5 10
2) Informace k SEQ ID NO: 14:
i) charakteristiky sekvence:
A) délka: 11 aminokyselin
B) typ: aminokyselina
C) vlákno: jednoduché
D) topologie: lineární ii) typ molekuly: peptid iii) hypotetická: ne iv) anti-sense: ne
v) typ fragmentu: vnitřní xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 14:
Thr Asp Val Asn Gly Asp Gly Arg His Asp Leu 1 5 10

Claims (22)

1. Použití antagonisty ανβ3 pro přípravu léčiva pro léčení artritidy, diabetické retinopatie, makulární degenerace, restenózy, hemangiomu nebo pevného nádoru plic, pankreatu, prsu, tlustého střeva, hrtanu nebo vaječníků, kde léčivo obsahuje takové množství antagonisty ανβ3, které inhibuje angiogenezi.
2. Použití antagonisty ανβ3 podle nároku 1, kde léčivo je pro léčení nádoru a angiogeneze je angiogeneze nádoru.
3. Použití antagonisty ανβ3 podle nároku 1, kde léčivo je pro léčení artritidy.
4. Použití antagonisty ανβ3 podle nároku 3, kde léčivo je pro léčení revmatické artritidy.
5. Použití antagonisty ανβ3 podle nároku 1, kde léčivo je pro léčení diabetické retinopatie nebo makulární degenerace a angiogeneze je retinální angiogeneze.
6. Použití antagonisty ανβ3 podle nároku 1, kde léčivo je pro léčení hemangiomu.
7. Použití antagonisty ανβ3 podle nároku 2, kde léčivo je určeno pro podávání při chemoterapii.
8. Použití antagonisty ανβ3 podle nároku 1, kde léčivo je pro léčení při riziku restenózy po koronární angioplastice.
9. Použití antagonisty ανβ3 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, kde je dávka léčiva připravena tak, aby koncentrace ανβ3 v plazmě byla od 2 μΜ do 5 mM.
10. Použití antagonisty ανβ3 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, kde je dávka léčiva připravena tak, aby obsahovala 0,1 mg/kg až 300 mg antagonisty c^3/kg pacienta.
11. Použití antagonisty Ονβ3 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, kde je léčivo připraveno ve formě pro zevní, intravenózní, transdermální, intrasynoviální, intramuskulámí nebo orální podávání.
12. Použití antagonisty ανβ3 podle nároku 7, kde je léčivo připraveno ve formě jediné intravenózní dávky.
13. Použití antagonisty ανβ3 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kde antagonista ανβ3 inhibuje vazbu fibrinogenu na ανβ3, a vykazuje alespoň 10-násobnou aktivitu IC50 při inhibici navázání fíbrinogenu na ανβ3, ve srovnání s aktivitou IC5o při inhibici navázání fibrinogenu na αιπ>β3 nebo ανβι·
14. Použití antagonisty ανβ3 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kde antagonista ανβ3 je monoklonální protilátka imunospecifická pro ανβ3.
15. Použití antagonisty ανβ3 podle nároku 14, kde monoklonální protilátka je humanizovaná.
16. Použití antagonisty ανβ3 podle nároku 14, kde monoklonální protilátka je LM609 uložená pod označením ATCC HB 9537.
-54CZ 294650 B6
17. Použití antagonisty ανβ3 podle nároku 14, kde monoklonální protilátka je humanizovaná LM609 uložená pod označením ATCC HB 9537.
18. Použití antagonisty ανβ3 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kde antagonista ανβ3 je polypeptid, obsahující sekvenci RGD.
19. Použití antagonisty ανβ3 podle nároku 18, kde polypeptid je cyklický peptid.
20. Použití antagonisty ανβ3 podle nároku 18, kde polypeptid je vybrán ze skupiny, skládající se z c-(GrGDFV) (SEQ ID NO: 4), c-(RGDfV) (SEQ ID NO:5), c-(RGDFv) (SEQ ID NO:7) a YTAECKPQVTRGDVF (SEQ ID NO:8) a jejich solí.
21. Použití antagonisty ανβ3 podle nároku 20, kde sůl je hydrochlorid nebo trifluoracetát.
22. Použití antagonisty ανβ3 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 21, kde je léčivo připraveno pro léčení humánního pacienta.
CZ19962711A 1994-03-18 1995-03-09 Léčivo pro léčení angiogeneze v tkáni, regresi vyvinutého nádoru v tkáni nebo indukci apoptózy v neovaskulaturní tkáni CZ294650B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/210,715 US5753230A (en) 1994-03-18 1994-03-18 Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
US08/366,665 US5766591A (en) 1994-03-18 1994-12-30 Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ271196A3 CZ271196A3 (cs) 1998-01-14
CZ294650B6 true CZ294650B6 (cs) 2005-02-16

Family

ID=22783992

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19962711A CZ294650B6 (cs) 1994-03-18 1995-03-09 Léčivo pro léčení angiogeneze v tkáni, regresi vyvinutého nádoru v tkáni nebo indukci apoptózy v neovaskulaturní tkáni

Country Status (25)

Country Link
US (7) US5753230A (cs)
EP (3) EP1468695B1 (cs)
JP (2) JP4268222B2 (cs)
KR (1) KR100327081B1 (cs)
CN (1) CN1161152C (cs)
AT (3) ATE490784T1 (cs)
AU (1) AU709645B2 (cs)
CA (1) CA2184493C (cs)
CZ (1) CZ294650B6 (cs)
DE (2) DE69536128D1 (cs)
DK (3) DK1410807T3 (cs)
ES (3) ES2211901T5 (cs)
FI (1) FI121916B (cs)
HK (1) HK1013960A1 (cs)
HU (1) HU221988B1 (cs)
MX (1) MX9604145A (cs)
NO (1) NO322441B1 (cs)
NZ (3) NZ511293A (cs)
PT (2) PT754059E (cs)
RU (1) RU2162712C2 (cs)
SI (1) SI0754059T2 (cs)
SK (1) SK284586B6 (cs)
UA (1) UA44729C2 (cs)
WO (1) WO1995025543A1 (cs)
ZA (1) ZA952214B (cs)

Families Citing this family (176)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4310643A1 (de) * 1993-04-01 1994-10-06 Merck Patent Gmbh Cyclische Adhäsionsinhibitoren
US5753230A (en) * 1994-03-18 1998-05-19 The Scripps Research Institute Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
US5945403A (en) 1997-05-30 1999-08-31 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
US5837682A (en) 1996-03-08 1998-11-17 The Children's Medical Center Corporation Angiostatin fragments and method of use
US6949511B1 (en) 1994-04-26 2005-09-27 The Children's Medical Center Corporation Methods of inhibiting angiogenesis via increasing in vivo concentrations of kringle region fragments of plasminogen
US6660842B1 (en) 1994-04-28 2003-12-09 Tripep Ab Ligand/receptor specificity exchangers that redirect antibodies to receptors on a pathogen
EP0719859B1 (en) * 1994-12-20 2003-07-02 MERCK PATENT GmbH Anti-alpha V-integrin monoclonal antibody
US6440729B1 (en) * 1995-06-30 2002-08-27 University Of Kansas Medical Center Treating angiogenesis-mediated diseases with the α2 monomer of type IV collagen
US6358735B1 (en) 1995-06-30 2002-03-19 University Of Kansas Medical Center Method for inhibiting angiogenesis and tumors with the isolated NC1 α3 chain monomer of type IV collagen
CA2754102C (en) * 1995-08-14 2012-12-18 The Scripps Research Institute Monoclonal antibodies and compositions comprising such useful for inhibition of .alpha.v.beta.5 mediated angiogenesis
NZ318926A (en) 1995-08-30 1999-04-29 Searle & Co Alpha v beta 3 integrin (vitronectin) inhibitors or anatagonists derived from benzoic acid for treating diseases of cell adhesion
US6100423A (en) * 1995-08-30 2000-08-08 G. D. Searle & Co. Amino benzenepropanoic acid compounds and derivatives thereof
US5854205A (en) * 1995-10-23 1998-12-29 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic compositions and methods
BR9611174A (pt) 1995-10-23 1999-09-14 Childrens Medical Center Proteína de endostatina isolada, e composições terapêuticas antiangiogénicas formadas com a mesma.
US6346510B1 (en) 1995-10-23 2002-02-12 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic endostatin compositions
US5854221A (en) * 1996-12-12 1998-12-29 The Children's Medical Center Corporation Endothelial cell proliferation inhibitor and method of use
US6589755B1 (en) * 1996-08-15 2003-07-08 Novartis Ag Assay for quantifying arthritic conditions
GB9708265D0 (en) * 1997-04-24 1997-06-18 Nycomed Imaging As Contrast agents
ES2321991T3 (es) * 1996-12-09 2009-06-15 Merck Patent Gmbh Receptor de adhesion alfavbet3 recombinante soluble.
US6590079B2 (en) 1997-01-30 2003-07-08 Ixsys, Incorporated Anti-αvβ3 recombinant human antibodies, nucleic acids encoding same
US6596850B1 (en) 1998-01-30 2003-07-22 Ixsys, Incorporated Anti-αv3β3 recombinant human antibodies, nucleic acids encoding same
US5837283A (en) 1997-03-12 1998-11-17 The Regents Of The University Of California Cationic lipid compositions targeting angiogenic endothelial cells
US7112338B2 (en) 1997-03-12 2006-09-26 The Regents Of The University Of California Cationic liposome delivery of taxanes to angiogenic blood vessels
ES2234099T3 (es) 1997-03-12 2005-06-16 Smithkline Beecham Corporation Anticuerpos monoclanales humanizados anti-alfa beta 3.
US5994388A (en) * 1997-03-18 1999-11-30 The Children's Medical Center Corporation Cytochalasin and isoindolinone derivatives as inhibitors of angiogenesis
DE69840046D1 (de) 1997-03-19 2008-11-06 Lucid Inc Zellchirurgie unter benutzung konfokaler mikroskopie
US6193968B1 (en) * 1997-04-11 2001-02-27 The Burnham Institute Methods for using anti-αvβ3 integrin antibody
DK0973550T3 (da) * 1997-04-11 2003-02-10 Searle & Co Antagonistiske anti-AVB3-integrin-antistoffer
US6596276B1 (en) * 1997-09-30 2003-07-22 Beth Israel Deaconess Medical Center Method for inhibiting tumor angiogenesis in a living subject
US6172256B1 (en) * 1998-03-04 2001-01-09 G.D. Searle & Co. Chiral-β-amino acid compounds and derivatives thereof
US6372719B1 (en) * 1998-03-04 2002-04-16 Jay Cunningham ανβ3 integrin antagonists in combination with chemotherapeutic agents
US6537520B1 (en) 1998-03-31 2003-03-25 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Pharmaceuticals for the imaging of angiogenic disorders
US6548663B1 (en) 1998-03-31 2003-04-15 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Benzodiazepine vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
US6524553B2 (en) * 1998-03-31 2003-02-25 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Quinolone vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
EE200000574A (et) 1998-03-31 2002-10-15 Dupont Pharmaceuticals Company Farmatseutilised ühendid angiogeensete häirete kuvamiseks
US6852318B1 (en) * 1998-05-08 2005-02-08 The Regents Of The University Of California Methods for detecting and inhibiting angiogenesis
US6759047B1 (en) 1998-06-17 2004-07-06 Beth Israel Deaconess Hospital Corp. Anti-angiogenic proteins and methods of use thereof
US7387779B2 (en) * 1998-06-17 2008-06-17 Beth Israel Deaconess Medical Center Anti-angiogenic proteins and fragments and methods of use thereof
US6962974B1 (en) 1998-06-17 2005-11-08 Beth Israel Deaconess Medical Center Anti-angiogenic proteins and fragments and methods of use thereof
JP4743672B2 (ja) 1998-07-13 2011-08-10 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム アミノリン脂質に対する抗体を用いる癌処置方法
RU2167425C2 (ru) * 1998-07-17 2001-05-20 Малышев Игорь Юрьевич Способ определения белков
US6164281A (en) * 1998-07-20 2000-12-26 Zhao; Iris Ginron Method of making and/or treating diseases characterized by neovascularization
EP1104304A1 (en) * 1998-08-13 2001-06-06 G.D. Searle & Co. Multivalent avb3 and metastasis-associated receptor ligands
US6979697B1 (en) * 1998-08-21 2005-12-27 Point Therapeutics, Inc. Regulation of substrate activity
US6703050B1 (en) * 1998-09-04 2004-03-09 The Regents Of The University Of Michigan Methods and compositions for the prevention or treatment of cancer
US6537554B1 (en) 1998-09-10 2003-03-25 Curagen Corporation Nucleotide sequences and amino acid sequences of secreted proteins involved in angiogenesis
US6248327B1 (en) 1998-09-11 2001-06-19 Vanderbilt University Modulation of endothelial cell surface receptor activity in the regulation of angiogenesis
US7176289B1 (en) * 1998-09-11 2007-02-13 Vanderbilt University Modulation of endothelial cell surface receptor activity in the regulation of angiogenesis
US6235877B1 (en) * 1999-08-04 2001-05-22 Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. Peptido-mimetic compounds containing RGD sequence useful as integrin inhibitors
US20030202977A1 (en) * 1998-11-16 2003-10-30 New York University Treatment of osteoarthritis
JP2002530350A (ja) * 1998-11-20 2002-09-17 ジェネンテック・インコーポレーテッド 血管障害を処置するためのＥｐｈレセプターのアンタゴニストおよびアゴニストについての使用
US6339062B1 (en) * 1998-11-23 2002-01-15 Inkine Pharmaceutical Company, Inc. Retroinverso polypeptides that mimic or inhibit thrombospondin activity
US6160099A (en) * 1998-11-24 2000-12-12 Jonak; Zdenka Ludmila Anti-human αv β3 and αv β5 antibodies
US6569402B1 (en) * 1998-12-18 2003-05-27 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
NZ511677A (en) 1998-12-18 2003-10-31 Du Pont Pharm Co Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
US6794518B1 (en) * 1998-12-18 2004-09-21 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
WO2000035887A2 (en) 1998-12-18 2000-06-22 Du Pont Pharm Co Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
US6511649B1 (en) 1998-12-18 2003-01-28 Thomas D. Harris Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
KR20010110310A (ko) * 1998-12-23 2001-12-12 로저 에이. 윌리암스 종양 치료에 사이클로옥시게나제-2 억제제와 하나 이상의항종양제를 조합치료법으로서 사용하는 방법
US20050281821A1 (en) * 1999-01-06 2005-12-22 Flavia Pernasetti Method and composition for angiogenesis inhibition
US6521593B1 (en) * 1999-02-01 2003-02-18 Childrens Hospital Los Angeles Methods for inhibiting brain tumor growth
CN1192796C (zh) * 1999-02-12 2005-03-16 斯克里普斯研究学院 联合应用抗血管生成和免疫治疗以***和转移的方法
WO2000059532A1 (en) * 1999-04-01 2000-10-12 Biostratum, Inc. The use of domains of type iv collagen t inhibit angiogenesis an tumour growth
AU4982200A (en) * 1999-05-06 2000-11-21 Burnham Institute, The Antiangiogenic endostatin peptides, endostatin variants and methods of use
US6890904B1 (en) * 1999-05-25 2005-05-10 Point Therapeutics, Inc. Anti-tumor agents
US6531580B1 (en) * 1999-06-24 2003-03-11 Ixsys, Inc. Anti-αvβ3 recombinant human antibodies and nucleic acids encoding same
US6685914B1 (en) * 1999-09-13 2004-02-03 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Macrocyclic chelants for metallopharmaceuticals
CN1399554A (zh) * 1999-09-23 2003-02-26 斯克里普斯研究学院 抑制粘连形成的方法和组合物
US20080038274A1 (en) * 1999-09-23 2008-02-14 Foster Keith A Inhibition of secretion from non-neuronal cells
DE60035057T2 (de) * 1999-10-04 2008-01-31 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc., Emeryville CD40 Antagonist zur Behandlung von Psoriasis
PL356815A1 (en) 1999-12-22 2004-07-12 The Scripps Research Institute Angiogenesis and vascular permeability modulators and inhibitors
US7740841B1 (en) 2000-01-28 2010-06-22 Sunnybrook Health Science Center Therapeutic method for reducing angiogenesis
EP1258252B1 (en) 2000-02-03 2010-04-21 Eisai R&D Management Co., Ltd. Integrin expression inhibitors
US7361643B2 (en) 2000-02-09 2008-04-22 University Of Puerto Rico Methods for inhibiting angiogenesis
US20010053766A1 (en) * 2000-02-11 2001-12-20 Janardan Kumar Method of treating disorders of the eye
US6573096B1 (en) * 2000-04-01 2003-06-03 The Research Foundation At State University Of New York Compositions and methods for inhibition of cancer invasion and angiogenesis
US6835806B2 (en) 2000-04-03 2004-12-28 Phoenix Pharmaceuticals, Inc. Cell growth regulation system
EP1272507B1 (en) 2000-04-12 2005-06-29 Amersham Health AS Integrin binding peptide derivatives
US10293056B1 (en) * 2000-05-24 2019-05-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for non-viral gene therapy for treatment of hyperproliferative diseases
US7163681B2 (en) * 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
US7288390B2 (en) * 2000-08-07 2007-10-30 Centocor, Inc. Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
US20030104573A1 (en) * 2000-09-11 2003-06-05 Shimkets Richard A. Nucleotide sequences and amino acid sequences of secreted proteins involved in angiogenesis
NO20004795D0 (no) 2000-09-26 2000-09-26 Nycomed Imaging As Peptidbaserte forbindelser
WO2002028355A2 (en) * 2000-10-02 2002-04-11 The Scripps Research Institute Methods and compositions for enhancing angiogenesis
US6632835B2 (en) 2001-02-22 2003-10-14 Nanodesign Inc. Dibenzo[c]chromen-6-one derivatives as anti-cancer agents
DE10109136A1 (de) * 2001-02-26 2002-09-12 Cytotools Gmbh Mittel, die die Apoptose bei an der Wundheilung beteiligten Zellen inhibieren
WO2002070007A1 (en) * 2001-03-02 2002-09-12 Medimmune, Inc. Methods of preventing or treating inflammatory or autoimmune disorders by administering integrin alphav beta3 antagonists
RU2316337C2 (ru) 2001-04-24 2008-02-10 Мерк Патент Гмбх КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ, ИСПОЛЬЗУЮЩАЯ АНТИАНГИОГЕННЫЕ СРЕДСТВА И TNF-α
SE0101854L (sv) * 2001-05-28 2002-11-29 Bioneris Ab Användning av en förening med en negativt laddad region av grupper för behandling av restenos.
EP1414491A4 (en) * 2001-07-09 2005-07-06 Elan Pharm Inc METHOD OF INHIBITING THE TOXICITY OF AMYLOID
US7829087B2 (en) * 2001-07-09 2010-11-09 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating cognitive impairment
ES2719088T3 (es) 2001-07-10 2019-07-08 Ge Healthcare Ltd Compuestos con base peptídica para localizar receptores de integrina
MXPA04000204A (es) * 2001-07-27 2004-03-18 Univ Kansas Medical Center Estructura cristalizada de colageno tipo iv del hexamero de dominio nc1.
US20060014697A1 (en) * 2001-08-22 2006-01-19 Travis Mickle Pharmaceutical compositions for prevention of overdose or abuse
EP1434584A2 (en) * 2001-09-05 2004-07-07 Minerva Biotechnologies Corporation Compositions and methods of treatment of cancer
KR101159061B1 (ko) 2001-10-22 2012-06-22 더 스크립스 리서치 인스티튜트 항체 표적화 화합물
CA2476120A1 (en) * 2002-02-14 2003-08-21 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Methods and compositions for the treatment of eye diseases
WO2003068258A1 (en) * 2002-02-15 2003-08-21 Richard Brunner 7s immunoglobulin for treatment of choroidal neovascularisation_
JP2005525368A (ja) * 2002-03-04 2005-08-25 メディミューン，インコーポレーテッド インテグリンαｖβ３アンタゴニストをＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤またはビスフォスフォネートと併用投与する障害の予防または治療方法
WO2003075957A1 (en) * 2002-03-04 2003-09-18 Medimmune, Inc. The prevention or treatment of cancer using integrin alphavbeta3 antagonists in combination with other agents
AU2003226065B2 (en) 2002-04-12 2009-02-26 Ludwig Institute For Cancer Research, Ltd Recombinant anti-interleukin-9 antibodies
NZ596825A (en) 2002-07-15 2013-06-28 Univ Texas Duramycin peptides and their use in imaging
JP2005538093A (ja) * 2002-07-23 2005-12-15 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ ミシガン 抗血管形成療法のための、テトラポリアンモニウムテトラチオモリブデートおよび関連化合物
GB0217018D0 (en) * 2002-07-23 2002-08-28 Bioacta Ltd Peptide 1
US7411048B2 (en) 2002-11-19 2008-08-12 Drg International, Inc. Diagnostic method for diseases by screening for hepcidin in human or animal tissues, blood or body fluids
US8017737B2 (en) 2002-11-19 2011-09-13 Hasan Kulaksiz Diagnostic methods for diseases by screening for hepcidin in human or animal tissues, blood or body fluids; monoclonal antibodies specific to human hepcidin and associated uses therefor
CA2506668C (en) 2002-11-19 2014-08-19 Drg International, Inc. Diagnostic method for diseases by screening for hepcidin in human or animal tissues, blood or body fluids and therapeutic uses therefor
US20040208869A1 (en) * 2003-01-30 2004-10-21 Medimmune, Inc. Uses of anti-integrin alphanubeta3 antibody formulations
AU2004207002A1 (en) * 2003-01-30 2004-08-12 Medimmune, Inc. Uses of integrin alphavbeta3 antagonists
AU2004209457A1 (en) 2003-02-06 2004-08-19 Tripep Ab Antigen/antibody or ligand/receptor glycosylated specificity exchangers
US7335359B2 (en) * 2003-02-06 2008-02-26 Tripep Ab Glycosylated specificity exchangers
EP1613273B1 (en) * 2003-04-11 2012-06-13 MedImmune, LLC Recombinant il-9 antibodies and uses thereof
JP2007523839A (ja) * 2003-04-18 2007-08-23 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア 血管新生性障害の治療法
EP1626988A2 (en) * 2003-05-16 2006-02-22 Receptor Biologix, Inc. Intron fusion proteins, and methods of identifying and using same
US9708410B2 (en) 2003-05-30 2017-07-18 Janssen Biotech, Inc. Anti-tissue factor antibodies and compositions
US7605235B2 (en) 2003-05-30 2009-10-20 Centocor, Inc. Anti-tissue factor antibodies and compositions
BRPI0410875A (pt) * 2003-05-30 2006-07-04 Centocor Inc método de inibição do crescimento de tumor com anticorpos de fator antitecido
US20050170455A1 (en) * 2003-06-20 2005-08-04 Qun-Yong Zhou Novel prokineticin receptor isoforms and methods of use
WO2005053683A1 (en) * 2003-11-26 2005-06-16 Duke University A method of preventing or treating glaucoma
KR20140041909A (ko) 2004-01-22 2014-04-04 유니버시티 오브 마이애미 국소용 코-엔자임 큐10 제형 및 그의 사용 방법
US7271245B2 (en) * 2004-02-13 2007-09-18 The Scripps Research Institute Methods and compositions for inhibition of metastasis
JP2007523092A (ja) * 2004-02-17 2007-08-16 キャンサーバックス コーポレイション 新脈管形成阻害のための方法および組成物
US7351739B2 (en) * 2004-04-30 2008-04-01 Wellgen, Inc. Bioactive compounds and methods of uses thereof
US8187595B2 (en) 2004-05-07 2012-05-29 The University Of North Carolina At Chapel Hill Monoclonal antibodies for enhancing or inhibiting insulin-like growth factor-I
WO2005117936A2 (en) * 2004-05-07 2005-12-15 The University Of North Carolina At Chapel Hill Method for enhancing or inhibiting insulin-like growth factor-i
WO2005113596A2 (en) * 2004-05-14 2005-12-01 Receptor Biologix, Inc. Cell surface receptor isoforms and methods of identifying and using the same
PL1765362T3 (pl) 2004-06-04 2012-08-31 Scripps Research Inst Kompozycje i sposoby do leczenia chorób związanych z neowaskularyzacją
EP1771565B1 (en) * 2004-07-20 2012-09-05 The Feinstein Institute for Medical Research Rage protein derivatives
US20060029544A1 (en) * 2004-08-06 2006-02-09 The Regents Of The University Of California Office Of Technology Transfer Receptor-binding cyclic peptides and methods of use
EP1784424A4 (en) * 2004-08-16 2009-03-18 Medimmune Inc EPH RECEPTOR BINDING FC VARIANTS HAVING CELLULAR CELLULAR ACTIVITY DEPENDENT ANTIBODIES
WO2006047639A2 (en) 2004-10-27 2006-05-04 Medimmune, Inc. Modulation of antibody specificity by tailoring the affinity to cognate antigens
KR100679100B1 (ko) * 2004-10-29 2007-02-06 엘지.필립스 엘시디 주식회사 수평 전계 인가형 액정 표시 패널 및 그 제조방법
EP2364995A1 (en) * 2004-12-23 2011-09-14 Molmed SpA Conjugation product
WO2006111925A2 (en) * 2005-04-18 2006-10-26 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Inhibition of tumorigenesis by inhibition of a6b4 integrin
US20090170769A1 (en) * 2005-05-13 2009-07-02 Pei Jin Cell surface receptor isoforms and methods of identifying and using the same
US20060286148A1 (en) * 2005-05-18 2006-12-21 Ppd, Inc. Method of forming implants
WO2006138429A2 (en) 2005-06-16 2006-12-28 The Feinstein Institute For Medical Research Antibodies against hmgb1 and fragments thereof
US20070110757A1 (en) 2005-06-23 2007-05-17 Ziping Wei Antibody formulations having optimized aggregation and fragmentation profiles
CA2619654A1 (en) * 2005-08-24 2007-03-01 Cell Matrix Combination therapies for inhibiting integrin-extracellular matrix interactions
CA2637387A1 (en) 2006-01-18 2007-07-26 Simon Goodman Specific therapy using integrin ligands for treating cancer
CN102294016B (zh) 2006-01-19 2014-05-21 爱吉恩公司 治疗血管相关疾病的包含肽的药物组合物
NZ574093A (en) * 2006-06-12 2011-03-31 Symphogen As Pan-cell surface receptor- specific therapeutics
CA2657581A1 (en) 2006-07-11 2008-01-17 Roy C. Levitt Rhinosinusitis prevention and therapy with proinflammatory cytokine inhibitors
EP2068889B1 (en) 2006-08-10 2019-10-23 Roy C. Levitt Anakinra for use in the treatment of bronchiolitis obliterans syndrome
WO2008045252A2 (en) 2006-10-04 2008-04-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Engineered integrin binding peptides
EA017864B1 (ru) 2007-01-18 2013-03-29 Мерк Патент Гмбх Специфическая терапия и лекарственное средство на основе интегриновых лигандов для лечения рака
DK2025685T3 (da) * 2007-08-15 2013-09-02 Canadian Blood Services Monoklonale antistoffer mod BETA3-integriner.
US20100278801A1 (en) * 2007-10-16 2010-11-04 Shepard H Michael Compositions comprising optimized her1 and her3 multimers and methods of use thereof
EP2614837A1 (en) 2007-11-09 2013-07-17 Affitech Research AS Anti-VEGF antibody compositions and methods
EP2285960B1 (en) 2008-05-08 2015-07-08 Asuragen, INC. Compositions and methods related to mir-184 modulation of neovascularization or angiogenesis
WO2010011347A2 (en) 2008-07-25 2010-01-28 The Regents Of The University Of Colorado Clip inhibitors and methods of modulating immune function
DK2352817T3 (en) 2008-10-31 2016-04-18 Univ Louisville Res Found OLFACTORY EPITAL DERIVATIVE STEM CELLS AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
WO2010075058A1 (en) 2008-12-23 2010-07-01 Ge Healthcare Limited Application of 99mtc peptide-based compound as a bone marrow imaging agent
EP2395992A2 (en) 2009-02-10 2011-12-21 The Scripps Research Institute Chemically programmed vaccination
CN102448497A (zh) 2009-05-25 2012-05-09 默克专利有限公司 在癌症治疗中的西仑吉肽的持续给药
FR2949782B1 (fr) * 2009-09-04 2015-10-16 Isp Investments Inc Peptide activateur de la transglutaminase et composition cosmetique ou pharmaceutique le contenant.
US8778888B2 (en) * 2009-11-06 2014-07-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Cystine knot peptides binding to alpha IIb beta 3 integrins and methods of use
AU2011278700A1 (en) 2010-07-16 2013-02-28 Merck Patent Gmbh Peptide for use in the treatment of breast cancer and/or bone metastases
AU2012216145B2 (en) 2011-02-11 2016-11-17 Merck Patent Gmbh Anti-alpha-v integrin antibody for the treatment of prostate cancer
US8722044B2 (en) 2011-03-15 2014-05-13 Janssen Biotech, Inc. Human tissue factor antibody and uses thereof
RU2531502C2 (ru) * 2011-08-09 2014-10-20 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Способ повышения ангиогенной активности стромальных клеток жировой ткани
RU2481115C1 (ru) * 2011-10-13 2013-05-10 Общество с ограниченной ответственностью Научно-Производственное Объединение "Тюменькриобанк" Средство для заживления ран "целльгель", способ его получения и способ лечения ран различной этиологии полученным средством
US9775803B2 (en) 2011-10-19 2017-10-03 Samsung Electronics Co., Ltd. Liposome comprising elastin-like polypeptide and tumor cell targeting material and use thereof
US20140350087A9 (en) 2012-03-22 2014-11-27 Halozyme, Inc. Oncovector Nucleic Acid Molecules and Methods of Use
IN2015MN00027A (cs) * 2012-06-07 2015-10-16 Dcb Usa Llc
JP2015533117A (ja) 2012-08-31 2015-11-19 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル インスリン様成長因子１（ｉｇｆ−１）を増強または阻害するためのモノクローナル抗体
US9587001B2 (en) 2012-10-19 2017-03-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Conjugated knottin mini-proteins containing non-natural amino acids
EP2928871B1 (en) 2012-12-07 2017-02-01 Council of Scientific & Industrial Research Histidinylated cationic amphiphiles, process for preparation thereof and their liposomal formulation
JP6457999B2 (ja) * 2013-03-14 2019-01-23 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション 処置に関してがんの対象を識別するためのｃｄ３６の使用
JP7034914B2 (ja) 2015-11-23 2022-03-14 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 線維症および／または線維性疾患の治療のための抗α－ｖインテグリン抗体
US10786471B2 (en) 2017-02-06 2020-09-29 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to glutaminase inhibitors
US20200109205A1 (en) 2017-03-31 2020-04-09 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for targeting and killing alpha-v beta-3-positive cancer stem cells (cscs) and treating drug resistant cancers
KR102171433B1 (ko) * 2018-05-25 2020-11-02 고려대학교 산학협력단 조직 재생을 위한 Substance P 펩타이드가 고정된 피브린 젤 및 이의 제조방법
US20220133913A1 (en) * 2019-07-24 2022-05-05 Korea Basic Science Institute SINGLE DOMAIN ANTIBODY TARGETING aVB3 INTEGRIN
MX2022000990A (es) * 2019-08-02 2022-02-16 Univ California Composiciones y metodos que se dirigen y eliminan celulas madre cancerosas (csc) positivas para alfa-v beta-3 (av?3) y tratan canceres resistentes a farmacos y metastasicos.
EP4204094A1 (en) 2020-08-27 2023-07-05 Enosi Therapeutics Corporation Methods and compositions to treat autoimmune diseases and cancer

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5092885A (en) * 1987-02-12 1992-03-03 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Peptides with laminin activity
EP0341303A4 (en) * 1987-11-19 1990-06-27 Scripps Clinic Res MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST THE RGD-DIRECTED ADHESION RECEPTOR OF ENDOTHELIAL CELLS.
JPH01169343A (ja) 1987-12-25 1989-07-04 Nippon Sheet Glass Co Ltd ガラス板の切口欠点検出装置
US5135919A (en) 1988-01-19 1992-08-04 Children's Medical Center Corporation Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis
EP0398925B1 (en) * 1988-01-19 1993-10-20 Children's Hospital Corporation Growth inhibiting agent and the use thereof
US5575815A (en) 1988-08-24 1996-11-19 Endoluminal Therapeutics, Inc. Local polymeric gel therapy
IE901736L (en) * 1989-05-17 1990-11-17 Fuller H B Licensing Financ Polypeptide-antibody conjugate for inhibiting cell adhesion
US5686569A (en) 1989-06-16 1997-11-11 Cor Therapeutics, Inc. Platelet aggregation inhibitors
US5112946A (en) * 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
US5262520A (en) * 1989-12-01 1993-11-16 The Scripps Research Institute Peptides and antibodies that inhibit integrin-ligand binding
US5192744A (en) * 1990-01-12 1993-03-09 Northwestern University Method of inhibiting angiogenesis of tumors
EP0470569B1 (en) * 1990-08-08 1995-11-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Intravascular embolizing agent containing angiogenesis inhibiting substance
CA2048078A1 (en) * 1990-11-15 1992-05-16 Wolfgang A. Wrasidlo Chemical modification of antibodies for creation of immunoconjugates
EP0940468A1 (en) * 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
AU680411B2 (en) * 1992-04-03 1997-07-31 Genentech Inc. Antibodies to alphavbeta3 integrin
SK57693A3 (en) * 1992-06-18 1994-07-06 Merck Patent Gmbh Linear peptides and pharmaceutical agents on their base
UA43823C2 (uk) 1992-07-06 2002-01-15 Мерк Патент Геселлшафт Міт Бесшренктер Хафтунг ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ ДЛЯ ІНГІБУВАННЯ ІНТЕГРИН <font face="Symbol">a</font><sub>V</sub><font face="Symbol">b</font><sub>3</sub>-ОПОСЕРЕДКОВАНОЇ КЛІТИННОЇ АДГЕЗІЇ КЛІТИН ССАВЦІВ, СПОСІБ ЛІКУВАННЯ ТА ПРОФІЛАКТИКИ ЗАХВОРЮВАННЯ, АСОЦІЙОВАНОГО З ПОРУШЕННЯМ АДГЕЗІЇ КЛІТИН, СПОСІБ БЛОКУВАННЯ ЗВ'ЯЗУВАННЯ ФІБРИНОГЕНОМ ІНТЕГРИНУ, КОМПОЗИЦІЯ ДЛЯ ЗАГОЄННЯ РАН
EP0669988B2 (en) 1992-10-29 2009-07-08 The Australian National University Angiogenesis inhibitory antibodies
US6955900B1 (en) * 1993-02-02 2005-10-18 The Scripps Research Institute Methods for producing polypeptide binding sites, monoclonal antibodies and compositions thereof
DE4310643A1 (de) 1993-04-01 1994-10-06 Merck Patent Gmbh Cyclische Adhäsionsinhibitoren
JPH09504795A (ja) † 1993-11-05 1997-05-13 セントコール，インコーポレイテッド 血小板特異的キメラ免疫グロブリン及びその使用方法
US5981478A (en) 1993-11-24 1999-11-09 La Jolla Cancer Research Foundation Integrin-binding peptides
US5753230A (en) 1994-03-18 1998-05-19 The Scripps Research Institute Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
US5770565A (en) 1994-04-13 1998-06-23 La Jolla Cancer Research Center Peptides for reducing or inhibiting bone resorption
DE19534177A1 (de) 1995-09-15 1997-03-20 Merck Patent Gmbh Cyclische Adhäsionsinhibitoren
DE19538741A1 (de) 1995-10-18 1997-04-24 Merck Patent Gmbh Cyclopeptidderivate

Also Published As

Publication number Publication date
EP1410807A1 (en) 2004-04-21
KR970701564A (ko) 1997-04-12
US7482007B2 (en) 2009-01-27
SI0754059T2 (sl) 2011-12-30
AU1995295A (en) 1995-10-09
ATE255907T1 (de) 2003-12-15
NO963894L (no) 1996-11-18
NO322441B1 (no) 2006-10-09
NO963894D0 (no) 1996-09-17
US7595051B2 (en) 2009-09-29
US20080175840A1 (en) 2008-07-24
PT754059E (pt) 2004-04-30
NZ283022A (en) 2001-05-25
CZ271196A3 (cs) 1998-01-14
NZ511293A (en) 2005-06-24
AU709645B2 (en) 1999-09-02
ES2355074T3 (es) 2011-03-22
NZ548433A (en) 2008-04-30
DE69532279D1 (de) 2004-01-22
US20050002936A1 (en) 2005-01-06
US7329406B2 (en) 2008-02-12
WO1995025543A1 (en) 1995-09-28
US20040265317A1 (en) 2004-12-30
US5766591A (en) 1998-06-16
ES2376850T3 (es) 2012-03-20
JP4758281B2 (ja) 2011-08-24
ZA952214B (en) 1996-02-08
SI0754059T1 (en) 2004-06-30
HU221988B1 (hu) 2003-03-28
HUT76086A (en) 1997-06-30
EP1410807B1 (en) 2010-12-08
DK1410807T3 (da) 2011-03-07
FI963692A0 (fi) 1996-09-18
EP0754059A1 (en) 1997-01-22
CA2184493C (en) 2010-05-11
ATE534403T1 (de) 2011-12-15
SK119096A3 (en) 1997-07-09
DE69532279T2 (de) 2004-09-16
EP1468695B1 (en) 2011-11-23
JPH10500398A (ja) 1998-01-13
JP2006273862A (ja) 2006-10-12
PT1468695E (pt) 2012-02-09
ATE490784T1 (de) 2010-12-15
ES2211901T3 (es) 2004-07-16
HK1013960A1 (en) 1999-09-17
DK1468695T3 (da) 2012-02-27
DE69536128D1 (de) 2011-01-20
DE69532279T3 (de) 2011-11-17
US20040258691A1 (en) 2004-12-23
SK284586B6 (sk) 2005-07-01
CN1161152C (zh) 2004-08-11
DK0754059T4 (da) 2011-09-19
EP0754059B2 (en) 2011-08-24
KR100327081B1 (ko) 2002-10-18
EP0754059B1 (en) 2003-12-10
CA2184493A1 (en) 1995-09-28
FI121916B (fi) 2011-06-15
JP4268222B2 (ja) 2009-05-27
US5753230A (en) 1998-05-19
CN1151120A (zh) 1997-06-04
FI963692A (fi) 1996-09-18
RU2162712C2 (ru) 2001-02-10
EP1468695A1 (en) 2004-10-20
UA44729C2 (uk) 2002-03-15
EP0754059A4 (en) 1997-07-30
DK0754059T3 (da) 2004-04-13
US6887473B1 (en) 2005-05-03
ES2211901T5 (es) 2011-12-12
US7354586B2 (en) 2008-04-08
HU9602541D0 (en) 1996-11-28
MX9604145A (es) 1998-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4268222B2 (ja) 脈管形成の抑制に有用な方法および組成物
RU2194528C2 (ru) Способы и композиции, используемые для ингибирования ангиогенеза
CA2256543C (en) Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis
US20030176334A1 (en) Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20140309