ES2321991T3 - Receptor de adhesion alfavbet3 recombinante soluble. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN NUEVO RECEPTOR DE ADHESION {AL}{SUB,V}{BE}{SUB,3} PURIFICADO RECOMBINANTE QUE MUESTRA UNA ACTIVIDAD DE UNION A LIGANDO NO IMPEDIDA, Y UN PROCESO PARA LA PREPARACION DE DICHO RECEPTOR NO UNIDO A MEMBRANA SOLUBLE CON EXCELENTES RENDIMIENTOS MEDIANTE TECNICAS RECOMBINANTES EMPLEANDO UN SISTEMA DE EXPRESION EMPLEANDO BACULOVIRUS EN CELULAS DE INSECTO. EL RECEPTOR SINTETIZADO DE ESTE MODO PUEDE SER UTILIZADO MUY FACILMENTE COMO HERRAMIENTA DE ESCRUTINIO PARA NUEVOS COMPUESTOS TERAPEUTICOS QUE PUEDEN INHIBIR EL RECEPTOR DE ADHESION {AL}{SUB,V}{BE}{SUB,3} NATURAL. DICHOS COMPUESTOS TERAPEUTICOS QUE PUEDEN SER DESCUBIERTOS MUY FACIL Y RAPIDAMENTE, Y SIN RIESGO PARA LA SALUD MEDIANTE LOS RECEPTORES SOLUBLES DE ACUERDO CON LA INVENCION PUEDEN SER POR EJEMPLO PEPTIDOS RGD O COMPUESTOS NO PEPTIDICOS QUE MIMETIZAN LOS EPITOPOS DE LIGANDOS NATURALES. LA INVENCION SE REFIERE ADICIONALMENTE A UN PROCESO CORRESPONDIENTE PARA LA PREPARACION DE RECEPTOR DE ADHESION {AL}{SUB,V}{BE}{SUB,3} DE LONGITUD COMPLETA CON EXCELENTES RESULTADOS , UTILIZANDO ADICIONALMENTE DETERGENTES PARA SOLUBILIZAR EL RECEPTOR UNIDO A MEMBRANA DE LA SUPERFICIE DE LA CELULA HOSPEDADORA.
Description
Receptor de adhesión \alpha_{V}\beta_{3}
recombinante soluble.
La invención se refiere a un nuevo receptor de
adhesión \alpha_{V}\beta_{3} recombinante, purificado, que
muestra una actividad enlazante con los ligandos no disminuida, y a
un procedimiento para la preparación de dicho receptor de enlace no
membranal soluble con excelentes rendimientos, por medio de las
técnicas recombinantes, empleándose un sistema de expresión de
baculovirus en células de insectos.
El receptor soluble, sintetizado de este modo,
puede ser empleado, de una manera muy fácil, como herramienta para
la selección de nuevos compuestos terapéuticos, que pueden inhibir
al receptor de adhesión \alpha_{V}\beta_{3} natural.
Del mismo modo, se describe un procedimiento
correspondiente para la preparación del receptor de adhesión
\alpha_{V}\beta_{3} recombinante, de longitud completa, con
excelentes rendimientos, empleándose, adicionalmente, detergentes
para disolver el receptor de enlace con la membrana a partir de la
superficie de la célula huésped.
Las integrinas son una superfamilia de
receptores de adhesión de la superficie celular, que controla el
enlace de las células con el medio ambiente extracelular sólido,
tanto con la matriz extracelular (ECM), así como, también, con
otras células. La adhesión tiene una importancia fundamental para
una célula; ésta proporciona el anclaje y señaliza la migración y
las señales para el crecimiento y para la diferenciación. Las
integrinas participan directamente en numerosos acontecimientos
normales y patológicos tales como el enlace celular, la migración
para producir la coagulación de la sangre, la inflamación, la
embriogénesis o el crecimiento del cáncer y las metástasis y, como
tales, son dianas primarias para la intervención terapéutica.
Los integrinas son glicoproteínas
transmembranales integrales heterodímeras, que están constituidas
por subunidades \alpha y \beta enlazadas de manera no
covalente. Las integrinas se clasifican en cuatro subfamilias
solapantes, que contienen las cadenas \beta1, \beta2, \beta3
o \alpha_{V}, y una célula particular puede expresar varias
integrinas diferentes de cada subfamilia.
En la última década se ha puesto de manifiesto,
que las integrinas son receptores importantes que participan en la
adhesión celular y, de este modo, pueden ser una diana adecuada para
la intervención terapéutica. Informes relativos a las integrinas
han sido dados, por ejemplo, por los autores E. Ruoslahti (J. Clin.
Invest., 1991, 87) y R. O. Hynes (Cell, 1992, 69).
Las integrinas de la serie \alpha_{V} son
consideradas ahora como una subfamilia importante, tanto con
funciones clásicas así como, también, con funciones nuevas. En
líneas celulares de melanoma, por ejemplo, la expresión reforzada
de la integrina \alpha_{V}\beta_{3} relacionada con la
tumorigenicidad y las propiedades metastásicas (por ejemplo
Felding-Habermann et al. 1992, J. Clin.
Invest. 89, 2018; Marshall et al. 1991, Int. J. Cancer 49,
924), sugiere la participación de las integrinas, que contienen
\alpha_{V}, en algunas de las etapas del proceso de metástasis
de las células tumorales. Se ha tratado un papel similar para la
adhesión y la propagación del carcinoma y del cáncer colorrectal,
respectivamente, que es uno de los tumores malignos epiteliales más
comunes.
Parece ser que las integrinas de la serie
\alpha_{V} reconocen exclusivamente a aquellos ligandos que
portan las secuencias tripéptidas RGD-
(NH_{2}-arginina-glicina-ácido
aspártico- COOH), incluyendo aquellas en la vitronectina
(\alpha_{v}\beta_{1}, \alpha_{V}\beta_{3},
\alpha_{V}\beta_{5}), en la fibronectina
(\alpha_{v}\beta_{1}, \alpha_{V}\beta_{3},
\alpha_{V}\beta_{5}, \alpha_{V}\beta_{6}) y en el
factor de Willebrand, en el fibrinógeno, y en la osteopontina
(\alpha_{V}\beta_{3}) (por ejemplo Busk et al. 1992,
J. Biol. Chem. 267, 5790; Smith y Cheresh 1990, J. Biol. Chem. 265,
2168). De igual modo, se conocen anticuerpos
anti-integrina que bloquen la función, por ejemplo
anticuerpos dirigidos contra la integrina
\alpha_{V}\beta_{3} (por ejemplo Cheresh y Spiro 1987, J.
Biol. Chem. 262, 17703; Chuntharapai et al. 1993, Exp. Cell
Res. 205, 345; EP 95 119 233).
La disrupción de la interacción
ligando-integrina por parte de los péptidos y de los
anticuerpos ha puesto de manifiesto los papeles importantes de la
integrina \alpha_{V}\beta_{3}, "el receptor de
vitronectina", en procesos tan diversos como el crecimiento y la
metástasis tumorales, la infección viral, la osteoporosis y la
angiogénesis (Felding-Habermann y Cheresh 1993,
Curr. Opin. Cell Biol. 5, 864; Brooks et al. 1994, Cell 79,
1157; Brooks et al. 1994, Science 264, 569). La aparición de
la \alpha_{V}\beta_{3} como una diana potencial para la
intervención terapéutica ha conducido, por lo tanto, a la búsqueda
de antagonistas de \alpha_{V}\beta_{3} - un proceso que
requiere \alpha_{V}\beta_{3} purificada. De manera usual, la
fuente de cantidades bioquímicas de \alpha_{V}\beta_{3} ha
sido el tejido de la placenta humana. Las integrinas pueden ser
obtenidas, junto con la mayoría de las proteínas membranales,
únicamente en forma de moléculas solubilizadas activas en presencia
de detergentes no iónicos y, por lo tanto, la purificación de la
\alpha_{V}\beta_{3} a partir de la placenta, para la
selección de fármacos es tanto complicada como costosa y presenta un
considerable riesgo para la salud (Mitjans et al. 1995, J.
Cell Sci. 108, 2825).
Aún cuando ya han sido expresadas las integrinas
recombinantes en sistema eucariotas, tales como células CHO
(O'Toole et al. 1990, Cell Regul. 1, 883) y en células 293 de
riñón embrionario (King et al. 1994, J. Bone Miner Res. 9,
381), no se ha conseguido la preparación de cantidades
bioquímicamente satisfactorias mediante la tecnología
recombinante.
\global\parskip0.930000\baselineskip
Por otra parte, ha sido divulgada la
purificación a partir de la \alpha_{V}\beta_{3} recombinante
de longitud completa mediante comparación con la expresión en
células CHO con células VNRC3. La purificación de extractos
celulares de \alpha_{V}\beta_{3} VNRC3 da como resultado un
rendimiento elevado en la \alpha_{V}\beta_{3}
inmunorreactiva, con propiedades enlazantes con las proteínas de la
matriz extracelular (Marcinkiewicz et al. 1996, Prot. Ex. a.
Pur. 8, 68). Finalmente, se han descrito versiones truncadas de la
subunidad \beta_{3} del receptor de vitronectina recombinante de
ratón, así como su expresión (Duong Le et al. WO97/08316,
August 31, 1995).
No existen informes sobre la actividad biológica
de los constructos de la \alpha_{V}\beta_{3} soluble
truncada y, aparentemente, no ha sido producido en cantidades
bioquímicamente importantes, mediante tecnología recombinante, el
receptor \alpha_{V}\beta_{3} de longitud completa.
Por lo tanto, sería deseable proporcionar un
receptor \alpha_{V}\beta_{3} recombinante soluble que
pudiese ser producido en cantidades bioquímicamente aprovechables y
en calidad purificada con ayuda de un procedimiento
comparativamente sencillo y sin riesgos. Por otra parte, un
procedimiento de este tipo sería también ventajoso para la
producción del receptor \alpha_{V}\beta_{3} de longitud
completa.
Esta invención describe por primera vez la
expresión y la purificación a alto nivel de la
\alpha_{V}\beta_{3} soluble biológicamente competente,
mediante el empleo del sistema de expresión de baculovirus en
células de insectos. Para conseguir elevados rendimientos de las
proteínas recombinantes, procesadas de una manera similar a la de
las células de los mamíferos, se consiguió la sobreexpresión de la
\alpha_{V}\beta_{3} mediante la utilización el gene
poliédrico del baculovirus a manera de potente promotor viral. La
molécula soluble retiene la actividad enlazante con los ligandos y
la especificidad de los receptores nativos de la placenta y de los
receptores recombinantes de longitud completa, y puede ser
purificada en ausencia de detergentes, por lo tanto se eliminan
muchos posibles artefactos de enlace y se produce una molécula
adecuada para llevar a cabo una selección de alto rendimiento y un
análisis estructural de alta resolución.
El receptor, de conformidad con la invención,
comprende la cadena \alpha_{V} y la cadena \beta_{3} de
dicho receptor, estando acortada cada una de ellas en su extremo C
por una porción que contiene el dominio transmembranal y el dominio
citoplasmático completo de cada cadena individual. Se conocen las
secuencias de aminoácidos y las secuencias de ADN de la cadena de
las proteínas \alpha_{V} y \beta_{3} humanas maduras, así
como sus dominios transmembranal y citoplasmático.
De manera especial, un objeto preferente de la
invención consiste en proporcionar un receptor recombinante humano
soluble, que comprende una cadena \alpha_{V} truncada, que
contiene 957 aminoácidos y una cadena \beta_{3} truncada, que
contiene 692 aminoácidos, estando calculada cada una de ellas a
partir del extremo N de la cadena de la proteína madura
correspondiente. Se ha eliminado de este receptor soluble,
preferido, el dominio transmembranal esencialmente completo así
como el dominio citoplasmático completo de las cadenas de la
proteína madura. Sin embargo, la invención incluye, así mismo, los
receptores solubles que comprenden porciones del dominio
transmembranal (véase más adelante). Sin embargo, la invención no
está limitada al receptor \alpha_{V}\beta_{3} humano. De
conformidad con el procedimiento, aquí
descrito reivindicado, no existe ningún problema para generar receptores \alpha_{V}\beta_{3}, que se deriven de un origen no humano.
descrito reivindicado, no existe ningún problema para generar receptores \alpha_{V}\beta_{3}, que se deriven de un origen no humano.
Por otra parte, puede ser producido un receptor
humano correspondiente por la presente invención, que puede ser
obtenido mediante un procedimiento tal como se ha definido más
adelante y en las reivindicaciones.
Este procedimiento, de conformidad con la
invención, proporciona el receptor de adhesión
\alpha_{V}\beta_{3} humano recombinante soluble purificado,
con una actividad enlazante con los ligandos no disminuida y se
caracteriza por las siguientes etapas:
- (i)
- la subclonación, en un vector de transferencia de baculovirus de un sistema de expresión de baculovirus, un primer ADNc, que codifica la cadena \alpha_{V} de dicho receptor, acortada en una porción que comprende, al menos, 52 aminoácidos, calculado desde el extremo C, y un segundo ADNc, que codifica la cadena \beta_{3} de dicho receptor, acortada en una porción que comprende, al menos, 61 aminoácidos, calculado desde el extremo C,
- (ii)
- la transferencia de dicho vector, que comprende dicho primer ADN y/o dicho segundo ADN, en el ADN genómico de un baculovirus de dicho sistema de expresión,
- (iii)
- la infección de células de insectos con dicho baculovirus recombinante completo,
- (iv)
- el cultivo de dichas células de insectos infectadas en un medio de cultivo y la expresión de dicho receptor \alpha_{V}\beta_{3} truncado heterómero en el medio, y
- (v)
- el aislamiento de dicho receptor expresado a partir del medio y su purificación por cromatografía de afinidad de anticuerpos, siendo el anticuerpo, empleado en este caso, específico para el receptor de adhesión \alpha_{V}\beta_{3} humano o para las cadenas individuales que lo componen.
\global\parskip1.000000\baselineskip
De igual modo, se ha descrito un procedimiento
similar para la preparación del receptor \alpha_{V}\beta_{3}
recombinante en toda su longitud, especialmente de origen humano.
Este procedimiento se caracteriza por las etapas siguientes:
- (i)
- la subclonación de un primer ADNc, que codifica la cadena \alpha_{V} completa de dicho receptor y un segundo ADNc, que codifica la cadena \beta_{3} completa de dicho receptor, en un vector de transferencia de baculovirus de un sistema de expresión de baculovirus,
- (ii)
- la transferencia de dicho vector, que comprende dicho primer ADN y/o dicho segundo ADN, hasta el ADN genómico de un baculovirus de dicho sistema de expresión,
- (iii)
- la infección de células de insectos con dicho baculovirus recombinante completo,
- (iv)
- el cultivo de dichas células de insectos infectadas en un medio de cultivo, solubilizándose con un detergente dicho receptor, expresado, de enlace con la membrana celular, y
- (v)
- la purificación de dicho receptor solubilizado a partir del medio, exento de células, por medio de la cromatografía de afinidad de anticuerpos, siendo el anticuerpo empleado específico para el receptor de adhesión \alpha_{V}\beta_{3} humano o para las cadenas individuales que lo componen.
\vskip1.000000\baselineskip
Los receptores \alpha_{V}\beta_{3}, de
conformidad con la invención, son adecuados de manera óptima para
el descubrimiento de compuestos terapéuticos que sean capaces de
inhibir al receptor natural. Por lo tanto, la invención se refiere
al empleo de dichos receptores solubles para el descubrimiento de
dichos compuestos. Tal como se ha mencionado precedentemente, tales
compuestos son, ante todo, péptidos lineales o cíclicos, que
comprenden una o más unidades RGD o son análogos no peptídicos, que
muestran las mismas actividades biológicas frente al receptor de
adhesión \alpha_{V}\beta_{3} que los péptidos RGD (véase más
adelante).
Por último, la invención se refiere a un
procedimiento para la selección de compuestos terapéuticos por su
capacidad para inhibir al receptor \alpha_{V}\beta_{3}
natural mediante el empleo de dicho receptor
\alpha_{V}\beta_{3} soluble, como se ha definido más arriba
y como se define a continuación. De igual modo, se describe un
compuesto terapéutico, especialmente péptidos RGD, o análogos no
peptídicos de los mismos, que pueden ser capaces de inhibir dicho
receptor \alpha_{V}\beta_{3}.
- \alpha_{V}\beta_{3}
- integrina
- 17E6
- anticuerpo monoclonal (mAb)
- AP3
- anticuerpo monoclonal (mAb)
- LM609
- anticuerpo monoclonal (mAb)
- P4C19
- anticuerpo monoclonal (mAb)
- P1F6
- anticuerpo monoclonal (mAb)
- \alpha_{V}(FL)
- cadena \alpha_{V} de longitud completa
- \alpha_{V}(SL)
- cadena \alpha_{V} de longitud corta (truncada)
- \beta_{3} (FL)
- cadena \beta_{3} de longitud completa
- \beta_{3} (SL)
- cadena \beta_{3} de longitud corta (truncada)
- BacPAK
- sistema de expresión de baculovirus
- SF9, High Five
- células de insectos
- M.O.I.
- multiplicidad de la infección.
Los microorganismos, las líneas celulares, los
plásmidos, los fagémidos, los promotores, los marcadores de
resistencia, los orígenes de replicación u otros fragmentos o
vectores, que han sido mencionados en esta solicitud, pueden ser
normalmente adquiridos en el comercio o están disponibles, en
general, de otro modo. En algunos casos los materiales, que han
sido precedentemente citados, no pueden ser adquiridos directamente.
Sin embargo, estos materiales son empleados aquí únicamente como
ejemplos, con objeto de demostrar las propiedades o los efectos de
los objetos de conformidad con la invención y no son esenciales para
cumplir los requisitos de descripción. Estos materiales pueden ser
substituidos, como norma general, por otras herramientas adecuadas,
que pueden ser obtenidas en general, y por otros materiales
biológicos.
La invención incluye, por lo tanto, las
secuencias de ADN y las secuencias de aminoácidos, que tienen
secuencias ligeramente modificadas o alteradas o los mutantes y las
variantes que puedan ser obtenidos de manera intencionada o de
manera aleatoria por medio de procedimientos químicos o físicos. En
general, quedan incluidos todos aquellos mutantes y variantes que
muestren las propiedades y las funciones que han sido descritas.
Las técnicas y los procedimientos que son
esenciales, de conformidad con la invención, están relatados en
detalle en la descripción. Otras técnicas, que no están descritas en
detalle, corresponden a los métodos estándar conocidos, que son
perfectamente conocidos por el técnico en la materia, o que están
descritos con mayor detalle en las referencias y en las solicitudes
de patente que han sido citadas y en la literatura estándar (por
ejemplo en las publicaciones Sambrook et al. 1989: Clonación
Molecular, un manual de laboratorio -Molecular Cloning, a
laboratory manual-, Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor
Laboratory Press; Harlow y Lane 1988: Anticuerpos -Un Manual de
Laboratorio -Antibodies - A Laboratory Manual-, Cold Spring Harbor:
Cold Spring Harbor Laboratory Press).
Se conocen y pueden ser adquiridos los ADNc de
la integrina \alpha_{V} y \beta_{3} (por ejemplo: Fitzgerald
et al 1987, J. Biol. Chem. 262, 3936 (\beta_{3}) o
Suzuki et al. 1987, J. Biol. Chem. 262, 14080
(\alpha_{V})), o pueden ser producidos según métodos conocidos,
por ejemplo por medio de sintetizadores de nucleótidos.
La cadena de la proteína \alpha_{V} madura
humana, en su longitud completa, tiene 1.018 aminoácidos, el
dominio transmembranal tiene 29 aminoácidos y el dominio
citoplasmático tiene 32 aminoácidos. Las regiones citoplasmática y
transmembranal tienen, aproximadamente, 61 aminoácidos. Las regiones
citoplasmática y transmembranal están localizadas en el extremo N
de la cadena. De este modo, la preferida cadena \alpha_{V}
truncada tiene, de conformidad con la invención, 957
aminoácidos.
La cadena de la proteína humana \beta_{3}
madura, de longitud completa, tiene 762 aminoácidos, el dominio
transmembranal tiene, igual que la cadena \alpha_{V}, 29
aminoácidos y el dominio citoplasmático tiene 41 aminoácidos. Las
regiones citoplasmática y transmembranal tienen, por lo tanto, 70
aminoácidos. Las regiones citoplasmática y transmembranal están
localizadas en el extremo N de la cadena. De este modo, la cadena
\beta_{3} truncada preferida tiene, de conformidad con la
invención, 692 aminoácidos.
De conformidad con la invención, son preferentes
aquellas cadenas en las que se haya eliminado el dominio
citoplasmático completo y el dominio transmembranal completo. Sin
embargo, es posible, así mismo, eliminar el dominio citoplasmático
completo y únicamente una porción de los aminoácidos del dominio
transmembranal. De manera preferente, la cadena \alpha_{V} o
\beta_{3} truncada comprenden, adicionalmente, entre 1 y 10
aminoácidos, de manera especial comprende entre 1 y 5 aminoácidos
derivados de dicho dominio transmembranal de cada cadena.
De conformidad con su naturaleza, las cadenas
receptoras \alpha_{V}\beta_{3} truncadas están glicosiladas.
El grado de glicosilación depende de su origen y del sistema
celular huésped utilizado.
Así mismo, el sistema de expresión de
baculovirus empleado, de conformidad con la invención, es
perfectamente conocido y está comúnmente disponible. Como sistema
de expresión de baculovirus preferido, es empleado el sistema
Backpack de la firma Clontech Laboratories, Inc (suministrado por la
firma Cambridge Bioscience, UK). Sin embargo, en principio pueden
ser empleados otros sistemas de baculovirus.
De conformidad con la invención, las células de
insectos son infectadas con ADN de baculovirus recombinante. En
principio, son adecuados todos los sistemas de células de insectos,
sin embargo, son preferentes aquellos sistemas que garanticen una
elevada infección por parte del sistema vírico y una expresión buena
y estable. Las células de insectos adecuadas son las células SF9,
y, de manera preferente, las células High Five, estando
comercialmente disponibles ambas. De conformidad con la invención,
las células SF9 son empleadas preferentemente, de conformidad con
la invención, para las etapas de subclonación, mientras que las
células High Five son empleadas, de manera preferente, para las
etapas de expresión final (véanse los ejemplos).
Las células Sf9 (que pueden ser adquiridas, por
ejemplo, en la firma Invitrogen Corporation) están mantenidas, por
ejemplo, en TC100 suplementado con un 10% de suero bovino fetal
cualificado para células de insectos (FBS, Life Technologies, Inc.)
y las células High Five (por ejemplo
BTI-TN-5B1-4 de la
firma Invitrogen Corporation) están mantenidas, por ejemplo, en el
medio Express Five (Life Technologies, Inc.) suplementado con 16,5
mM de L-glutamina (Life Technologies, Inc.), con
penicilina (50 IU/ml) y con estreptomicina (50 \mug/ml).
La generación del receptor
\alpha_{V}\beta_{3} humano recombinante por medio de un
sistema de expresión de baculovirus en células de insectos se lleva
a cabo, por ejemplo, de la manera siguiente: el sistema de
baculovirus es empleado de manera análoga a la del método dado en la
publicación de Kidd y Emery (1993, Appl. Biochem. Biotechno.l 42,
137; O'Reilly et al., 1992: Vectores de expresión de
baculovirus: un manual de laboratorio -Baculovirus expression
vectors: a laboratory manual-. Oxford University Press, Inc., New
York).
\newpage
Los ADNc \alpha_{V} y \beta_{3}
truncados en las posiciones, que codifican la interfase
transmembranal y extracelular (figura 1), se preparan por medio de
la reacción en cadena de la polimerasa (RCP). Se subclonan los ADNc
de \alpha_{V} y de \beta_{3} truncados
(\alpha_{V}(SL) y \beta_{3}(SL)) y los ADNc
de \alpha_{V} y de \beta_{3} de longitud completa
\alpha_{V}(FL) y \beta_{3}(FL) en el vector
de transferencia de baculovirus pBacPAK9. De la misma manera, es
posible, de conformidad con la invención, llevar a cabo la
clonación del ADNc de cada cadena en vectores separados, con el fin
de evitar problemas de estabilidad. Sin embargo, es preferente la
clonación en un solo vector, puesto que esto garantiza de mejor
manera el que sean producidas cantidades equimolares de cada cadena.
De manera sorprendente, los resultados presentes muestran que el
vector, que comprende las secuencias de ADN de ambas cadenas es
suficientemente estable, aún cuando es bastante extenso.
De manera usual, los ADNc de \alpha_{V} y de
\beta_{3} truncados comprenden una secuencia de señal (por lo
tanto, en el caso en que el truncamiento comprenda el dominio
completo transmembranal y el dominio completo citoplasmático, que
codifica 987 aminoácidos de la cadena \alpha_{V} [957 para la
proteína madura + 30 para el péptido señal] y 718 aminoácidos de la
cadena \beta_{3} [692 para la proteína madura + 26 para el
péptido señal]). Los baculovirus recombinantes, que expresan tanto
las cadenas de longitud completa como las cadenas truncadas de
\alpha_{V} o de \beta_{3}, son preparados mediante
cotransfección con ADN genómico de baculovirus linealizado BacPAK6
seguido por el enriquecimiento mediante purificación en placa y
amplificación vírica en células Sf9 o en células High Five (O'Reilly
et al., 1992: Vectores de expresión de baculovirus: un
manual de laboratorio -Baculovirus expression vectors: a laboratory
manual-. Oxford University Press, Inc., New York). Se ha confirmado
la integración exacta de los plásmidos de transferencia, por medio
de la RCP y por medio de la transferencia de Southern del ADN
genómico viral recombinante.
El marcaje metabólico de las células Sf9/High
Five, que expresa la cadena \alpha_{V} de longitud completa,
muestra dos proteínas recombinantes principales de, aproximadamente,
110 kDa y de 150 kDa (figura 2A, línea 3). De manera similar, las
células Sf9, que expresan la \beta_{3} de longitud completa,
muestran dos bandas de, aproximadamente, 90 kDa y de 125 kDa
(figura 2A, línea 4). Así mismo, la comparación entre infectado
falso (línea 1) e infectado con virus recombinante nulo (línea 2)
muestra el grado de supresión del genoma de la célula huésped
durante la última fase del ciclo de vida viral. El tratamiento de
las células, que expresan, o bien formas individuales de longitud
completa, o bien formas truncadas de \alpha_{V} o de
\beta_{3} con tunicamicina (figura 2 B, líneas 1, 3, 5 y 7)
inhibe la producción de la banda que migra más lentamente, lo que
indica que las bandas de 150/110 kDa (figura 2 B, líneas 2 y 4) y
que las bandas de 125/90 kDa (figura 2 B, líneas 6 y 8)
corresponden a las formas glicosilada y no glicosilada de las
proteínas recombinantes. Este resultado confirma varios informes,
que han sugerido que la proporción de la proteína recombinante en
sistemas de expresión de baculovirus, que está sometida a
modificaciones post traducción, tal como la
N-glicosilación, disminuye durante las etapas
finales del ciclo de la vida viral (Jarvis y Finn 1995, Virology
212, 500). La diferencia, relativamente amplia, entre el tamaño de
las formas glicosiladas y el de las formas no glicosiladas de
\alpha_{V} y de \beta_{3}, indica que las proteínas están
sometidas a una glicosilación substancial, lo cual está en
concordancia, también, con la presencia en \alpha_{V} de trece
sitios de N-glicosilación potencial y en
\beta_{3} de diez sitios de N-glicosilación
potencial.
Las integrinas determinan y modulan la forma de
la célula por medio de su acción como enlaces estructurales entre
la matriz extracelular y el citoesqueleto (Schwartz et al.
1995, Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 549; Montgomery et al.
1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8856). En las últimas fases de
la infección por baculovirus, las células Sf9/High Five están
usualmente redondeadas y enlazadas de manera suelta (figura 3 A),
como si fuesen células infectadas, bien sólo con el baculovirus
recombinante que expresa la \alpha_{V} o la \beta_{3}, o
bien con el virus recombinante nulo (figura 3A). Sin embargo, las
células de insectos coinfectadas con \alpha_{V}(FL) +
\beta_{3}(FL) o con \alpha_{V}(SL) +
\beta_{3}(FL) están firmemente enlazadas y presenta una
forma celular más extensa (figura 3B y 3C). No se observa cambio de
forma en las células coinfectadas con \alpha_{V}(FL) +
\beta_{3}(SL) o con \alpha_{V}(SL) +
\beta_{3}(SL). Estos resultados fundamentan la idea de
que el dominio citoplasmático de la cadena \alpha es responsable
de la regulación negativa de la afinidad para el citoesqueleto del
dominio citoplasmático de la cadena \beta (Filardo y Cheresh 1994,
J. Biol. Chem. 269, 4641; Akiyama et al. 1994, J. Biol.
Chem. 269, 15961; LaFlamme et al. 1994, J. Cell Biol. 126,
1287). La \alpha_{V}\beta_{3} se enlaza con un gran número
de ligandos, que tienen la secuencia peptídica
Arg-Gly-Asp (RGD). De manera
correspondiente, se inhibe el cambio de la forma celular de las
células Sf9, infectadas con virus la \alpha_{V} y con la
\beta_{3} sobre placas revestidas con vitronectina, cuando son
atacadas con péptidos RGD (tabla 1)
Los péptidos de control, cyc(RGEfV) y
cyc(R\betaADfV), en los que se ha substituido el glutamato
por aspartato, o la \beta-alanina por glicina, no
tienen efecto sobre la forma de la célula.
Se han coinfectado células High Five, que son
conocidas por soportar un nivel de producción de baculovirus de
proteínas secretadas, expresadas, mayor que el de las células Sf9
(Davis et al. 1993, In Vitro Cell Dev. Bio. Anim.
29A, 388), con diversas combinaciones de baculovirus recombinantes,
que expresan la \alpha_{V} y la \beta_{3} de longitud
completa y truncada. La inmunoprecipitación del complejo
\alpha_{V}\beta_{3} con el anticuerpo monoclonal LM609,
procedente de extractos celulares o procedente de medio celular
acondicionado (figura 4), muestra que el recombinante
\alpha_{V}\beta_{3} es heterodímero sobre la superficie
celular, cuando una o ambas cadenas individuales tengan la longitud
completa (figura 4, líneas 1-3). De una manera más
importante, la coexpresión de la \alpha_{V} truncada con la
\beta_{3} truncada da como resultado la secreción de un
heterodímero soluble (figura 4, línea 9). La producción de la
\alpha_{V}\beta_{3} soluble en este medio, que está exento
de suero, simplifica en gran medida el procesamiento en el sentido
descendente (5' hacia 3') y, por lo tanto, introduce un grado de
flexibilidad para el establecimiento de procedimientos de selección
a gran escala de compuestos
anti-\alpha_{V}\beta_{3}.
Los nuevos receptores trancados de la
\alpha_{V}\beta_{3}, de conformidad con la invención, así
como las variantes de longitud completa, se purifican tras la
expresión recombinante mediante cromatografía de afinidad de
anticuerpos. Puesto que el sistema de expresión, de conformidad con
la invención, es muy efectivo para la producción de grandes
cantidades de dicho receptor y únicamente de cantidades muy pequeñas
de proteínas exógenas, es suficiente, por regla general, una sola
etapa de purificación para obtener un producto altamente
purificado.
La cromatografía de afinidad de anticuerpos es
una técnica perfectamente conocida: un anticuerpo, con una
especificidad deseada para un cierto epitopo antígeno, es copulado
por vía enzimática o por vía química con una matriz de soporte
activada, que sea adecuada, por ejemplo agarosa modificada,
sefarosa, etc. Los anticuerpos adecuados, de conformidad con la
invención, deben tener una buena especificidad con el receptor
\alpha_{V}\beta_{3} o con la cadena simple de
\alpha_{V} o con la cadena simple de \beta_{3}.
Se conoce un gran número de tales anticuerpos,
algunos de los cuales son anticuerpos de dominio público y, por lo
tanto, están disponibles sin problemas. Se han caracterizado en
detalle el AP3 (anti-\beta_{3}), el LM609
(anti-\alpha_{V}\beta_{3}), el P4C10
(anti-\beta_{1}), el P1F6
(anti-\alpha_{V}\beta_{5}) y el 17E6
(anti-\alpha_{V}) (por ejemplo Mitjans et
al. 1995, J. Cell Sci. 108, 2825). El anticuerpo monoclonal
17E6 es un anticuerpo que es producido por una línea celular de
hibridoma, que tiene la designación 272-17E6. La
línea celular fue depositada con el número de registro DSM ACC2160
en la Colección Alemana de Microorganismos -Deutsche Sammlung für
Mikroorganismen-, Braunschweig, RFA). El anticuerpo monoclonal 17E6
constituye, además, el objeto de la solicitud de patente europea
0719 859. Se ha depositado el anticuerpo AP3
anti-\beta_{3} en la ATCC con el número de
registro HB-242. Los anticuerpos 17E6 y AP3 son
especialmente adecuados, de conformidad con la invención, debido a
que están fácilmente disponibles. Así mismo, tiene un interés
especial el LM609 (Cheresh y Spiro 1987, J. Biol. Chem. 262, 17703)
puesto que está dirigido a la cadena alfa así como, también, a la
cadena beta.
Una vez que ha sido copulado dicho anticuerpo
con el soporte, se dispone el medio exento de células, purificado,
de las células de insectos infectadas y lisadas, que contiene el
receptor truncado, de conformidad con la invención, o que contiene
el receptor recombinante de longitud completa, solubilizado, en la
parte superior de una columna cargada con dicho soporte, y se hace
recircular varias veces sobre la columna con objeto de enlazar el
receptor expresado con el anticuerpo inmovilizado. El receptor der
la \alpha_{V}\beta_{3} purificado se lava a continuación
por medio de un tampón iónico, procedente de la columna, y puede ser
empleado directamente para experimentos de enlace con los ligandos
y para otros experimentos.
\newpage
La vitronectina humana, la fibronectina humana y
el fibrinógeno humano pueden ser purificados a partir del plasma
humano (por ejemplo: Yatohgo et al. 1988, Cell Struct. Funct.
13, 281; Ruoslahti et al. 1982, Methods Enzymol 82 Pt A,
803; Ruoslahti 1988, Ann. Rev. Biochem. 57, 375; Kazal et al.
1963, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 113, 989).
En detalle, la purificación y la caracterización
de la \alpha_{V}\beta_{3} humana recombinante se lleva a
cabo, por ejemplo, de la manera siguiente:
- \quad
- Se lleva a cabo la cromatografía de afinidad de anticuerpos en el anticuerpo 17E6, AP3 o LM609. De manera ejemplificativa, se purifica el receptor \alpha_{V}\beta_{3} procedente de la placenta humana, por medio de la cromatografía de afinidad, de acuerdo con el método de Smith y Cheresh (1988, J. Biol. Chem. 263, 18726).
- \quad
- La \alpha_{V}\beta_{3} recombinante de longitud completa puede ser purificada a partir de extractos solubilizados con detergente no iónico de células High Five coinfectadas con \alpha_{V}(FL) + \beta_{3}(FL). La \alpha_{V}\beta_{3} truncada soluble puede ser purificada a partir de células High Five coinfectadas con \alpha_{V}(SL) + \beta_{3}(SL) sin la utilización de ningún detergente.
- \quad
- En el análisis ELISA son reconocidas por los mismos anticuerpos (LM609, 17E6 y AP3) tanto la \alpha_{V}\beta_{3} recombinante soluble truncada como la \alpha_{V}\beta_{3} recombinante solubilizada de longitud completa y con una afinidad similar, como puede juzgarse por los títulos ELISA, como \alpha_{V}\beta_{3} de placenta solubilizada. Cada fracaso para reaccionar con anticuerpos anti-\beta_{1} (P4C10) o con anticuerpos anti-\alpha_{V}\beta_{5}-específico (P1F6), indica la conservación de epitopos y la baja contaminación con otras integrinas (figura 5).
- \quad
- La \alpha_{V}\beta_{3} de placenta, purificada, se disocia en dos bandas de la cadena \alpha a partir de 160 kDa y de la cadena \beta a partir de 95 kDa cuando se resuelve mediante la electrofóresis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y bajo condiciones no reductoras (figura 6, línea 2). La \alpha_{V}\beta_{3} recombinante de longitud completa, purificada, (línea 3) se disocia en la cadena \alpha_{V} de aproximadamente 140 kDa y una cadena \beta_{3} a partir de 90 kDa. Los bajos pesos moleculares pueden deberse a que es incompleta o a que varía la glicosilación de las proteínas recombinantes, expresadas en las células de insectos infectadas con baculovirus. La \alpha_{V}\beta_{3} recombinante soluble, purificada se disocia en una cadena \alpha_{V} truncada de, aproximadamente, 120 kDa y en una cadena \beta_{3} truncada de 80 kDa.
\vskip1.000000\baselineskip
La cadena \alpha_{V} sufre normalmente una
segmentación post traducción en cadenas pesadas y en cadenas
ligeras, enlazadas a través de un puente de disulfuro (figura 1)
(Hynes 1992, Cell 69, 11). Por lo tanto, la cadena \alpha de la
\alpha_{V}\beta_{3} de la de placenta se disocia
ulteriormente, bajo condiciones reductoras, en una cadena pesada de
140 kDa y en una cadena ligera de 25 kDa (figura 6, línea 6),
mientras que la cadena \beta migra a partir de 110 kDa. Puesto
que el truncamiento transmembranal en la cadena \alpha se
encuentra dentro de la cadena ligera, deberían migrar ambas cadenas
\alpha recombinantes de longitud completa y truncada, bajo
condiciones reductoras a partir de aproximadamente 140 kDa. Sin
embargo, las cadenas de \alpha_{V} de los receptores de
longitud completa y de los receptores solubles presentan los mismos
pesos moleculares, tanto bajo condiciones reductoras así como,
también, bajo condiciones no reductoras (línea 7 y 8), lo cual
sugiere que se ha producido únicamente una segmentación post
traducción parcial de la cadena \alpha_{V}. La banda débil de
aproximadamente 120 kDa en las líneas 7 y 8 puede representar la
cadena pesada de \alpha_{V}. Esta discrepancia entre la
\alpha_{V}\beta_{3} de la placenta y la
\alpha_{V}\beta_{3} recombinante puede deberse que el
procesamiento proteolítico es ineficaz durante la última fase de la
infección con baculovirus (O'Reilly et al. 1992, Expresión
de baculovirus: un manual de laboratorio -Baculovirus Expression
Vectors: A Laboratory Manual-. Oxford University Press, Inc., New
York).
La tabla 2 representa una recopilación de los
resultados SDS-PAGE:
De conformidad con el procedimiento de la
invención puede prepararse el receptor \alpha_{V}\beta_{3}
recombinante acortado. Con objeto de demostrar que los receptores
preparados de este modo presentan las especificidades de los
ligando del receptor natural, que fue aislado, por ejemplo, a partir
de placenta humana y que se empleó como realización comparativa,
debe ser establecido un ensayo de enlace. Con esta finalidad son
empleados ligandos conocidos por ser inhibidores competitivos del
receptor \alpha_{V}\beta_{3}. Tal como se ha mencionado
precedentemente, los péptidos lineales y cíclicos, que contienen la
secuencia de aminoácidos RGD (arginina, glicina, asparagina) son
excelentes inhibidores de dicho receptor.
Los péptidos adecuados son, por ejemplo:
- \quad
- GRGDSPK, Echistatin, cíclico-RGDfV, cíclico-RGDfNMeV, cíclico-R\betaADfV, KTADC(Trt)PRNPHKGPAT, GRGESPK, cíclico-KGDfV, y cíclico-RGEfV. De manera adicional, pueden ser empleados compuestos no peptídicos, que puedan imitar a los péptidos RGD y que se enlacen con el receptor \alpha_{V}\beta_{3}.
- \quad
- Tales péptidos RGD y tales análogos no peptídicos son conocidos (por ejemplo por la solicitud de patente europea No. 96 113 972, por las solicitudes de patente europeas con los números 0578 083, 0632 053, 0478 363, 0710 657, 0741 133 y la publicación PCT No. WO 94/ 12181) y/o pueden ser sintetizados según métodos estándar conocidos. Los ligandos son modificados por medio de moléculas marcadoras o por medio de átomos marcadores de conformidad con los métodos conocidos en el arte previo. De manera preferente son utilizados ligandos biotinilizados.
\vskip1.000000\baselineskip
El receptor \alpha_{V}\beta_{3} truncado
recombinante, o su versión de longitud completa, es inmovilizado,
por ejemplo, mediante adsorción sobre placas de microtitulación, y
se hace reaccionar con dichos ligandos marcados. Los receptores
\alpha_{V}\beta_{3} truncados, de conformidad con la
invención, se enlazan con dichos ligandos con gran fuerza, de
manera muy similar a lo que ocurre con el receptor natural aislado
a partir de la placenta humana, mientras que los péptidos
no-RGD no son enlazados. Este resultado demuestra
que los receptores, que pueden ser obtenidos por medio del
procedimiento reivindicado, están funcionalmente intactos con
respecto a su capacidad específica de enlace con los ligandos.
En detalle, la medida de la actividad biológica
del receptor \alpha_{V}\beta_{3} truncado recombinante se
lleva a cabo, por ejemplo, de la manera siguiente:
- \quad
- Se inmovilizan la \alpha_{V}\beta_{3} recombinante truncada y de longitud completa y la \alpha_{V}\beta_{3} de placenta y se examina el enlace con los ligandos biotinilizados. Son utilizados tres ligandos purificados, que contienen RGD - vitronectina, fibrinógeno y fibronectina - que son conocidos por enlazarse con la \alpha_{V}\beta_{3}. Los ligandos se enlazan tanto con las preparaciones de receptor de longitud completa como con el receptor soluble en una manera que depende de la concentración, y con dependencias de concentración solapantes y concentraciones de saturación similares a las de la \alpha_{V}\beta_{3} de placenta (figura 7). La vitronectina es empleada para ensayar la interacción específica con la \alpha_{V}\beta_{3} recombinante. Sen incuban en paralelo la vitronectina biotinilizada y concentraciones crecientes de los péptidos que han sido indicados precedentemente o de los análogos no peptídicos, con receptor inmovilizado. Los compuestos son capaces de inhibir el enlace de la vitronectina con la \alpha_{V}\beta_{3} de placenta, con la \alpha_{V}\beta_{3} recombinante de longitud completa y con la \alpha_{V}\beta_{3} recombinante soluble (figura 8) y tienen una actividad 4 a 5 veces mayor que la del péptido de control \beta-alanina-para-glicina. Cada receptor presenta un valor IC_{50} para cyc(RGDfV) en el rango de bajo peso molecular (1-5 nM).
\vskip1.000000\baselineskip
De la misma manera, a la que se ha descrito aquí
para ligandos conocidos específicos del receptor
\alpha_{V}\beta_{3}, es posible seleccionar nuevos fármacos
y nuevos compuestos terapéuticos, que son considerados como potentes
inhibidores de la \alpha_{V}\beta_{3}.
Esta invención muestra que el sistema de
expresión de baculovirus en células de insectos puede ser empleado
para expresar grandes cantidades de las integrinas
\alpha_{V}\beta_{3} recombinantes humanas completamente
funcionales como receptores solubles secretados en el medio. Las
formas dobles (SL)-truncadas del receptor son
secretadas en forma de un complejo en el medio como se observa por
precipitación y purificación sobre un anticuerpo específico
\alpha_{V}\beta_{3}-complejo (LM609, 17E6,
AP3).
Bajo condiciones óptimas pueden obtenerse
rendimientos (receptor soluble así como receptor de longitud
completa) comprendidos entre 1 y 10 mg, de manera preferente
comprendidos entre 2 y 5 mg/L de medio de cultivo (sobrenadante).
Esta rutina para la producción en cantidades bioquímicas de
\alpha_{V}\beta_{3} soluble abre la vía para la selección
con alto rendimiento empleándose la \alpha_{V}\beta_{3} y
para el análisis estructural de este importante receptor. El
rendimiento del receptor natural, aislado a partir de tejido de
placenta es, aproximadamente, de 1 a 2 mg/kg de tejido. Las
proteínas \alpha_{V}\beta_{3} recombinantes truncadas,
obtenidas por el procedimiento de conformidad con la invención,
tienen una pureza comprendida entre el 95 y el 99%, de manera
preferente comprendida entre el 97 y el 99%, tal como se ha
demostrado mediante el ensayo por SDS-PAGE y
mediante el análisis ELISA. El receptor recombinante soluble tiene
una sensibilidad para el inhibidor aproximadamente 4 veces menor
que la de las moléculas recombinantes de longitud completa. Otra
ventaja del receptor soluble truncado consiste en que éste puede
ser preparado sin la utilización de detergentes. Los necesarios
detergentes no iónicos son, de manera usual, muy costosos (por
ejemplo: aproximadamente 500 dólares/10 g de
octil-\beta-D-glico-piranósido).
Aproximadamente se requieren 25 g de detergente para la
solubilización de 3-4 mg de receptor a partir del
tejido de placenta.
Las células coinfectadas con virus recombinante
con una cadena \alpha de longitud completa y con una cadena
\beta truncada y con una cadena \beta de longitud completa y con
una cadena \alpha truncada (\alpha_{V}(FL) x
\beta_{3}(SL) o \alpha_{V}(SL) x
\beta_{3}(FL)) expresan en su superficie al receptor
heterodímero. Pero únicamente las células que contienen tanto ambas
cadenas de longitud completa o que contienen la cadena \beta de
longitud completa y la cadena \alpha truncada, presentan cambios
de la forma cuando se adhieren sobre vitronectina. Se demostró que
esta adhesión y propagación era específica de la
\alpha_{V}\beta_{3} por adición de péptidos, que contienen
RGD, que bloquean de manera específica la interacción entre el
ligando y el receptor nativo, mientras que los péptidos RGE o RAD
no lo hacen. Las células con cadena \alpha de longitud completa y
con cadena \beta truncada no producen propagación.
El análisis ELISA muestra que el anticuerpo AP3
específico de \beta_{3} (Newman et al. 1985, Blood 65,
227) y que el anticuerpo 17E6 específico de \alpha_{V} (Mitjans
et al. 1995, J. Cell Sci. 108, 2825) y que el anticuerpo
LM609 específico del complejo (Cheresh y Spiro 1987, J. Biol. Chem.
262, 1770323) reconocen tanto a los receptores de longitud completa
como a los receptores truncados, lo que indica que las integrinas
recombinantes tienen los mismos epitopos que la
\alpha_{V}\beta_{3} de placenta. El ensayo por
SDS-PAGE muestra, bajo condiciones no reductoras,
las bandas típicas para las cadenas de \alpha_{V} y de
\beta_{3}. La cadena recombinante \alpha de longitud completa
tiene un peso molecular menor en comparación con el de la cadena
\alpha de longitud completa de placenta (aproximadamente 140 kDa
en comparación con 160 kDa) lo cual podría explicarse por medio de
una glicosilación disminuida o diferente en las células de insectos.
Tanto los receptores de \alpha_{V}\beta_{3} recombinante de
longitud completa como los receptores \alpha_{V}\beta_{3}
recombinantes solubles son capaces de enlazarse específicamente con
los ligandos constituidos por la vitronectina, el fibrinógeno y la
fibronectina, siendo inhibido de manera específica el enlace de
vitronectina por los péptidos que contienen RGD con la misma
dependencia de la concentración que el receptor de placenta.
Con esta demostración de la especificidad y de
las concentraciones de saturación similares para el enlace de los
ligandos con el receptor \alpha_{V}\beta_{3} humano de
longitud completa y con el receptor \alpha_{V}\beta_{3}
humano truncado, es posible ahora embarcarse en la preparación, a
gran escala, de la \alpha_{V}\beta_{3} soluble recombinante
funcional en el sistema de baculovirus en células de insectos sin
la elaboración y sin los riesgos para la salud asociados, cuando se
utiliza tejido de placenta humano. Por otra parte, el sistema
descrito por medio de esta divulgación permite, así mismo, la
expresión de receptores modificados o de receptores quiméricos que
podrían revelarse muy útiles para la investigación, a nivel
molecular, del enlace con los ligando y de los procedimientos
subsecuentes de transducción de señal.
Diagrama de la \alpha_{V}\beta_{3}
heterodímera que muestra los puntos para el truncamiento de las
cadenas de \alpha_{V} y de \beta_{3}. La cadena
\alpha_{V} es normalmente segmentada post traducción en cadenas
pesadas (\alpha_{V}HC) y en cadenas ligeras (\alpha_{V}LC),
que están unidas a través de un enlace disulfuro
(S-S). EC = extracelular; PM = membrana de plasma;
IC = intracelular; IAC = citoesqueleto asociado con la integrina;
Lig = ligando.
(A) Se marcaron, por vía metabólica, células Sf9
infectadas en falso (línea 1) o células Sf9 infectadas con
recombinante nulo (línea 2), con \alpha_{V}(FL) (línea 3)
o con \beta_{3}(FL) (línea 4) con aminoácidos marcados
con ^{35}S durante 2 horas hasta 40 horas post infección. Los
extractos celulares se resolvieron mediante el ensayo de
SDS-PAGE bajo condiciones reductoras. Los pesos
moleculares en kDa de los marcadores de proteína estándar están
indicados en el lado de la derecha.
(B) Se trataron células Sf9 infectadas con
\alpha_{V}(FL) (líneas 1 y 2), con
\alpha_{V}(SL) (líneas 3 y 4), con
\beta_{3}(FL) (líneas 5 y 6) y con
\beta_{3}(SL) (líneas 7 y 8) bien con tunicamicina 10
\muM en DMSO (líneas 1, 3, 5 y 7) o bien solo con DMSO (líneas 2,
4, 6 y 8). Las células infectadas fueron marcadas con impulsos por
vía metabólica, como en el caso precedente. Los marcadores de
proteína estándar están indicados en el lado de la derecha.
Figura 3: Cambio de la forma celular tras
coinfección
Se fotografiaron bajo contraste de fase células
Sf9 infectadas bien con virus recombinante nulo (A), con
\alpha_{V}(FL) + \beta_{3}(FL) (B) o bien con
\alpha_{V}(SL) + \beta_{3}(SL) (C) al cabo de
48 horas post infección.
Figura 4: Inmunoprecipitación de la
superficie celular y de la \alpha_{V}\beta_{3}
soluble
Extractos celulares (líneas 1-5)
y medio acondicionado celular (líneas 6-10)
preparados a partir de células High Five coinfectadas con
\alpha_{V}(FL) + \beta_{3}(FL) (líneas 1 y 6),
con \alpha_{V}(rL) + \beta_{3}(SL) (líneas 2
y 7), con \alpha_{V}(SL) + \beta_{3}(FL)
(líneas 3 y 8), con \alpha_{V}(SL) +
\beta_{3}(SL) (líneas 4 y 9) o con recombinante nulo
(líneas 5 y 10). Se sometió a inmunoprecipitación el complejo
\alpha_{V}\beta_{3} empleándose el anticuerpo monoclonal
LM609 y se resolvió por medio del ensayo de
SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras, se
transfirió sobre membrana de PVDF y se detectó con conjugado de
estreptavidina-HRP.
Figura 5: Análisis de los receptores
purificados
Análisis de los epitopos y de pureza de la
\alpha_{V}\beta_{3} purificada de longitud completa y
truncada por medio de anticuerpos monoclonales.
Se inmovilizaron concentraciones crecientes de
receptor y se analizaron con los anticuerpos LM609
(anti-\alpha_{V}\beta_{3}), 17E6
(anti-\alpha_{V}), AP3
(anti-\beta_{3}), P4C10
(anti-\beta_{1}) y P1F6
(anti-\alpha_{V}\beta_{5}). Eje vertical:
densidad óptica a 450 nm; eje horizontal: concentración de
revestimiento del receptor (\mug/ml).
(\medcirc) \alpha_{V}\beta_{3} de
placenta, (\blacksquare) \alpha_{V}(FL) x
\beta_{3}(FL), (\blacklozenge)
\alpha_{V}(SL) x \beta_{3}(SL)
Figura 6: Análisis de los receptores
purificados
Análisis de los receptores purificados por medio
del ensayo SDS-PAGE, líneas 1 y 5 HMW, líneas 2 y 6
\alpha_{V}\beta_{3} de placenta, líneas 3 y 7
\alpha_{V}(FL) x \beta_{3}(FL), líneas 4 y 8
\alpha_{V}(SL) x \beta_{3}(SL). Las líneas 1,
3, 5, 7 se encuentran bajo condiciones no reductoras, las líneas 2,
4, 6, 8 se encuentran bajo condiciones reductoras.
Figura 7: Ensayo de actividad de la
\alpha_{V}\beta_{3} recombinante purificada
Enlace de los ligando con los receptores
inmovilizados.
Se permitió que se enlazasen con los receptores
inmovilizados la vitronectina, el fibrinógeno y la fibronectina
biotinilizados. Se detectó el enlace con el ligando mediante el
empleo de anticuerpo anti-biotina. Eje vertical:
enlace de los ligandos en unidades de densidad óptica (405 nm), eje
horizontal: concentración de vitronectina, de fibrinógeno, de
fibronectina (\mug/ml).
(\medcirc) \alpha_{V}\beta_{3} de
placenta, (\blacksquare) \alpha_{V}(FL) x
\beta_{3}(FL), (\blacksquare)
\alpha_{V}\Delta(SL) x
\beta_{3}\Delta(SL).
Figura 8: Efecto de diferentes péptidos RGD
sobre la vitronectina que se enlaza con diversas preparaciones del
receptor
Se incubó vitronectina biotinilizada en paralelo
con concentraciones crecientes de diversos péptidos, tal como se ha
indicado. Eje vertical: enlace VN en %del control, eje horizontal:
concentración peptídica;
-\medbullet- \alpha_{V}\beta_{3} de
placenta
-\blacksquare- \alpha_{V}\beta_{3}
recombinante truncada (primera preparación)
-\ding{115}- \alpha_{V}\beta_{3}
recombinante truncada (segunda preparación).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cortó el ADNc de la \alpha_{V} como un
fragmento EcoRI a partir de \alpha_{V}pcDNA-1Neo
(Felding-Habermann 1992, J. Clin. Invest. 89, 2018)
y se clonó en el plásmido de transferencia pBacPAK8 (Clontech). El
recombinante resultante se denominó
\alpha_{V}(FL)(pBac8). Se cortó el ADNc de la integrina
\beta_{3} como un fragmento XbaI a partir de
\beta_{3}pcDNA-1Neo y se clonó en el plásmido de
transferencia pBacPAK9 (Clontech). Se construyeron los ADNc
transmembranales truncados de la \alpha_{V} y de la
\beta_{3} empleándose la reacción en cadena de la polimerasa
(RCP) con empleo de Pfu Thermostable DNA polimerasa
(Stratagene).
Se generó el ADNc truncado de la \alpha_{V},
que codifica los aminoácidos 1-987 de la
\alpha_{V} madura (con inclusión de la secuencia de señal)
mediante el empleo de cebadores oligonucleótidos
5'-GAC CAG CAT TTA CAG
TGA-3' [ascendente] y
5' CA CAG GTC TAG
\underbar{A}CT ATG GCT GAA TGC CCC
AGG-3' [cebador inverso, que contiene el codón de
terminación de la traducción (negrita) después de lo cual codifica
987 aminoácidos seguido por el punto de restricción XbaI
(subrayado)].
El producto de la RCP se sometió a digestión con
los enzimas de restricción SalI y XbaI y el fragmento se clonó en
SalI/XbaI sometido a digestión con
\alpha_{V}pcDNA-1Neo. Se subclonó el ADNc
truncado de la \alpha_{V} en puntos EcoRI/XbaI de pBacPAC9 y el
clon resultante se denominó \alpha_{V}(SL) (pBac9). Se
generó el ADNc truncado de la \beta_{3}, que codifica los
aminoácidos 1-718 de la \beta_{3} madura (con
inclusión de la secuencia de señal), mediante la utilización de
cebadores oligonucleótidos
5'-GCG CGC AAG CTT GCC
GCC ACC ATG CGA GCG CGG CCG-3' [cebador
ascendente, que contiene el codón de iniciación de la traducción
(negrita) y el punto de restricción HindIII (subrayado)] y
5'-GAT CGA TCT AGA
CTA GGT CAG GGC CCT TGG GAC ACT-3' [cebador
inverso, que contiene también el codón de detención de la
traducción (negrita) después de lo cual codifica 718 aminoácidos y
el punto de restricción XbaI (subrayado)]. El producto de la RCP se
sometió a digestión con HindIII y con XbaI y se clonó en puntos
HindIII/XbaI de pSK+ (Stratagene). El clon resultante, denominado
\beta_{3}(SL)(pSK+), sometió a digestión con HindIII y
los extremos se pulieron a continuación mediante relleno con
fragmento Klenow de DNA polimerasa I (Boehringer Mannheim). A
continuación se sometió a digestión el plásmido linealizado con
extremo despuntado con el enzima de restricción XbaI y el fragmento
se subclonó en puntos SmaI/XbaI de pBacPAK9. El clon resultante se
denominó \beta_{3}(SL)(pBac9). Las regiones amplificadas
por medio de la RCP de ambos \alpha_{V}(SL)(pBac9) y
\beta_{3}(SL)(pBac9) se verificaron mediante
secuenciación de ADN y todos los constructos se ensayaron con
respecto a la expresión de la proteína correctamente dimensionada
por medio de la transcripción in vitro y de la traducción a
partir del promotor bacteriófago T7, empleándose el sistema de
lisado de reticulocitos acoplados TNT Coupled Reticulocyte Lysate
System (Promega).
Se preparó ADN genómico de baculovirus BacPAK6
(Clontech) a partir de cepa de virus de elevado título (Page y
Murphy 1990: Métodos en la biología molecular -Methods in Molecular
Biology. Humana Press, Clifton, New Jersey, USA) y se linealizó con
Bsu36I (Kitts y Possee 1993, Biotechniques 14, 810). Se prepararon
clones de baculovirus recombinante, que expresan las integrinas
\alpha_{V} y \beta_{3} de longitud completa y las
integrinas \alpha_{V} y \beta_{3} truncadas, de conformidad
con el protocolo del producto Clontech BacPAK. Así mismo, se
preparó un baculovirus recombinante nulo empleándose pBacPAK9 como
plásmido de transferencia para ser empleado como control negativo.
Se identificaron los clones virales recombinantes correctos mediante
la RCP y el virus se propagó y se titulo en células Sf9 (O'Reilly
et al. 1992, Vectores de expresión de baculovirus: un manual
de laboratorio -Baculuvirus expression vectors: a laboratory manual.
Oxford University Press, Inc., New York).
Se llevó a cabo el marcaje metabólico de células
Sf9 como se ha descrito (Summer y Smith 1987: Un manual de métodos
para vectores de baculovirus y procedimientos en células de insectos
-A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell
procederes-. Texas Agricultural Experiment Station Bulletin
B-1555). Cuando se consideró oportuno, estaba
presente tunicamicina (Sigma) a una concentración de 10 \mug/ml
durante 16 horas, antes y durante el marcaje por impulsos. Las
células se sometieron a lisis con 100 \mul de tampón [1% de
Nonidet® P-40, 1 mM de CaCl_{2}, 150 mM de NaCl,
0,4 mM de Pefabloc® (Boehringer Mannheim), 10 \mug/ml de Leupeptin
y E64 (Sigma), 10 mM de Tris/HCl; pH 7,4; el Nonidet
P-40 es un detergente y el Pefabloc es un inhibidor
de proteasa]. El lisado se centrifugó a 14.000 x g en un
dispositivo Eppendorf microfuge a 4ºC durante 10 minutos y se
resolvió mediante electrofóresis en SDS-gel de
poliacrilamida al 8% bajo condiciones reductoras, se fijó y se secó
como paso previo a la realización de la autorradiografía (Sambrook
et al. 1989: Clonación molecular: un manual de laboratorio
-Molecular Cloning: A Laboratory Manual-. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Sring Harbor, New York).
Se expresaron proteínas recombinantes en células
High Five, bien en forma de monocapa o bien en suspensión. Las
células fueron coinfectadas con baculovirus recombinante que expresa
la \alpha_{V} y la \beta_{3}, cada uno de los cuales con
una M.O.I. comprendida entre 5 y 20 (esto significa que: una célula
es infectada con el ADN de 5 a 20 virus), en una cantidad mínima de
medio con ligera agitación. Al cabo de dos horas se retiró el
inoculum viral y se substituyó por medio fresco Express Five, las
células infectadas se incubaron a 27ºC durante 48 hasta 64 horas.
Para el aislamiento de la integrina recombinante enlazada con la
membrana, se recolectaron las células mediante centrifugación
(1.000 x g, 10 minutos) y se empleó el pellet celular. Para el
aislamiento de la integrina recombinante soluble se utilizó el
sobrenadante exento de células.
Se llevó a cabo la inmunoprecipitación del
extracto celular biotinilizado en la superficie y del medio celular
acondicionado con el anticuerpo monoclonal LM609, que reconoce los
dominios extracelulares del complejo \alpha_{V}\beta_{3}
intacto, enlazado en perlas de Affigel® (BIO-RAD)
(Mitjans et al. 1995, J. Cell Sci. 108, 2825). Tras el ensayo
de SDS-PAGE y del ensayo por transferencia Western
sobre membrana Hybond-PVDF (Towbin et al.
1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350), se detectaron las
proteínas biotinilizadas mediante quimiluminiscencia reforzada
empleándose el reactivo para la detección de la transferencia
Western ECL Western Blotting Detection Reagents (Amersham) según
las instrucciones del fabricante.
Se permitió que se adhiriesen células Sf9 (1 x
10^{6} células/pocillo) en placas de seis pocillos, bien vírgenes
o bien revestidas con vitronectina de plasma humano purificado (5
\mug/ml en PBS; 2 horas), seguido por el bloqueo de los puntos no
específicos (3% de BSA (p/v) en PBS), a continuación se infectaron
con combinaciones de varios virus. Las células se observaron al
cabo de 48 horas post infección con respecto al cambio en la forma
de la célula. Cuando se consideró oportuno, el medio se suplementó
con 10 \muM de péptidos cíclicos como inhibidores competitivos de
la interacción
\alpha_{V}-integrina-ligando
[cyc(RGDfV), cyc(R\betaADfV) o cyc(RGEfV),
significando las letras minúsculas
D-aminoácidos].
Se recolectaron células High Five, que expresan
la \alpha_{V}\beta_{3} de longitud completa, se lavaron con
PBS y, a continuación, se sometieron a lisis en tampón para lisis
enfriado con hielo [100 mM de
n-octil-\beta-D-glucósido,
1 mM de CaCl_{2}, 2 mM de Pefabloc en PBS, pH 7,4] durante 1 h a
4ºC. El lisado se centrifugó (10.000 x g; 45 min a 4ºC) y el
sobrenadante se recirculó durante la noche a 4ºC a través de una
columna de afinidad del anticuerpo 17E6, que había sido previamente
equilibrada con tampón para lisis. Tras lavado [volúmenes del lecho
20 ml, columna de 2 x 10 cm, 50 mM de
n-octil-\beta-D-glucósido,
2 mM de Pefabloc, 2 mM de CaCl_{2} en PBS, pH 7,4] se eluyó la
proteína enlazada [50 mM de OG, 2 mM de Pefabloc®, 2 mM de
CaCl_{2}, 50 mM de acetato de Na, pH 3,1], el eluato se controló
a 280 nm, y se neutralizaron inmediatamente las fracciones (1:50 en
volumen, 3 M de Tris-HCl, pH 8,8). Se recogieron las
fracciones de los picos, se sometieron a diálisis [10 mM de OG, 1
mM de CaCl_{2} en PBS, pH 7,4] y se concentraron, a continuación
se analizaron mediante el ensayo de SDS-PAGE. Se
almacenaron alícuotas de aproximadamente 1 mg/ml de proteína a
-80ºC. Se determinó la concentración en proteína contra patrones de
BSA con el ensayo de proteínas BCA (Pierce).
La \alpha_{V}\beta_{3} recombinante
truncada soluble se purificó mediante recirculación del medio,
exento de células, de las células High Five infectadas sobre de una
columna de afinidad de 17E6 a 4ºC. El lavado, la elución y el
análisis se llevaron a cabo como se ha descrito en el caso de la
\alpha_{V}\beta_{3} de longitud completa, con la excepción
de que en los tampones no estuvo presente detergente. En el análisis
ELISA de los receptores purificados se utilizó como substrato
conjugado de cabra-anti-ratón IgG
(H+L) HRP (BIO-RAD) así como el dihidrocloruro de
3,3',5,5'-tetrametilbencidina (Sigma).
La purificación del receptor
\alpha_{V}\beta_{3} soluble y transmembranal de longitud
completa se llevó a cabo mediante el empleo de una columna con el
anticuerpo LM609.
Se lavó la matriz de soporte (Affigel® BIORAD)
con 500 ml de PBS frío. El anticuerpo purificado se incubó, junto
con la matriz de soporte (5 mg/ml de gel), con rotación circular
durante 12 horas aproximadamente. El sobrenadante fue retirado y se
bloquearon los grupos todavía activos sobre la matriz con 0,1 M de
etanolamina. La matriz de soporte se lavó alternativamente varias
veces con 0,01 M de Tris-HCl, pH 8,0 y con 0,01 M de
acetato de sodio, pH 4,5 y, a continuación, se utilizó
directamente.
Se diluyeron las proteínas en PBS con un tampón
enlazante concentrado 5 veces [500 mM de NaCl, 500 mM de
NaHCO_{3}] hasta 1 mg/ml de proteína. Se añadió
N-hidroxisuccinimidobiotina (Sigma) recién preparada
[1 mg/ml en DMSO] para dar 0,1 mg/ml y se incubó durante 2 horas a
20ºC. Tras diálisis [PBS, 0,025% de NaN_{3}] se determinó la
concentración en proteína. Las proteínas biotinilizadas se
almacenaron a 4ºC. Ensayos de enlace de los ligandos: Las
integrinas se diluyeron hasta 1 \mug/ml en tampón de revestimiento
[150 mM de NaCl, 1 mM de CaCl_{2}, 1 mM de MgCl_{2}, 10 \muM
de MnCl_{2}, 20 mM de Tris-HCl; pH 7,4) y se
adsorbieron 100 \mul durante la noche a 4ºC en placas de
microtitulación con 96 pocillos. Las placas se lavaron una vez con
tampón de enlace [0,1% (p/v) de BSA en tampón de revestimiento] y
se bloquearon con tampón bloqueante (tampón de revestimiento que
contiene 3% (p/v) de BSA) durante 2 horas a 37ºC. Tras enjuagado con
tampón enlazante, se añadieron ligandos biotinilizados diluidos en
serie. Tras incubación (3 horas, 37ºC), el ligando no enlazado se
eliminó por lavado de la placa con tampón enlazante y la biotina
enlazada se detectó mediante incubación con anticuerpo conjugado de
anti-biotina-alcalina-fosfatasa
y detección del anticuerpo enlazado con substrato de
p-nitrofenil-fosfato
(BIO-RAD).
Las integrinas se inmovilizaron como se ha
descrito precedentemente. Se añadieron péptidos cíclicos diluidos
en serie en paralelo con vitronectina biotinilizada (1 \mug/ml).
Al cabo de 3 horas de incubación a 37ºC se detectó el enlace de los
ligandos como se ha descrito precedentemente. Los ensayos se
llevaron a cabo por triplicado y fueron repetidos varias veces.
Claims (13)
1. Receptor de adhesión
\alpha_{V}\beta_{3} recombinante soluble purificado, que
tiene actividad enlazante con los ligandos no disminuida, que
comprende la cadena \alpha_{V} y la cadena \beta_{3} de
dicho receptor, estando acortada cada una de ellas en el extremo C
por una porción que contiene el dominio transmembranal y el dominio
citoplasmático completo de cada cadena individual, teniendo la
cadena \alpha_{V} truncada un peso molecular de 120 kD (\pm
12 kD) y teniendo la cadena \beta_{3} truncada un peso molecular
de 80 kD (\pm 8 kD), habiéndose determinado cada uno de ellos
mediante el ensayo de SDS PAGE bajo condiciones no reductoras.
2. Receptor según la reivindicación 1, en el que
la cadena \alpha_{V} truncada contiene 957 aminoácidos y la
cadena \beta_{3} contiene 692 aminoácidos, estando calculada
cada una de ellas a partir del extremo N de la correspondiente
proteína de longitud completa.
3. Procedimiento para la preparación de receptor
de adhesión \alpha_{V}\beta_{3} humano recombinante soluble
purificado con actividad enlazante con los ligandos no
disminuida,
caracterizado porque
- (i)
- se subclona un primer ADNc, que codifica la cadena \alpha_{V} de dicho receptor, acortada en una porción que comprende, al menos, 52 aminoácidos, calculado a partir del extremo C, y un segundo ADNc, que codifica la cadena \beta_{3} de dicho receptor, acortada en una porción que comprende, al menos, 61 aminoácidos, calculado a partir del extremo C, en un vector de transferencia de baculovirus de un sistema de expresión de baculovirus,
- (ii)
- se transfiere dicho vector, que comprende dicho primer ADN y/o dicho segundo ADN, al ADN genómico de un baculovirus de dicho sistema de expresión,
- (iii)
- se infectan células de insectos con dicho baculovirus recombinante completo,
- (iv)
- se cultivan dichas células de insectos infectadas en un medio de cultivo y es expresado en el medio dicho receptor \alpha_{V}\beta_{3} truncado heteromérico, y
- (v)
- se purifica dicho receptor expresado a partir del medio por cromatografía de afinidad de anticuerpos, siendo el anticuerpo, empleado con esta finalidad, específico para el receptor de adhesión \alpha_{V}\beta_{3} humano, o para las cadenas individuales que lo componen.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que el primer ADNc y el segundo ADNc son subclonados en el mismo
vector de baculovirus.
5. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que el sistema de expresión de baculovirus es el sistema
BacPAK.
6. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que las células de insectos infectadas son células High Five
(BTI-TN-5B1-4).
7. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que el anticuerpo específico, que puede ser empleado para la
cromatografía de afinidad de anticuerpos, es el anticuerpo
monoclonal 17E6 producido por una línea celular de hibridoma que
tiene la designación 272-17E6 (DSM ACC2160).
8. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que se utiliza un primer ADNc, que codifica la cadena
\alpha_{V} de dicho receptor, acortada en una porción que
contiene 61 aminoácidos, calculado desde el extremo C (que
corresponde a la cadena proteica madura, que contiene 957
aminoácidos), y se utiliza un segundo ADNc, que codifica la cadena
\beta_{3} de dicho receptor, acortada en una porción que
contiene 70 aminoácidos, calculado a partir del extremo C (que
corresponde a la cadena proteica madura, que contiene 692
aminoácidos).
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que se genera el ADNc de la cadena \alpha_{V} truncada por
medio de la reacción en cadena de la polimerasa empleándose
cebadores oligonucleótidos 5'-GAC CAG CAT TTA CAG
TGA-3' y 5'-CA CAG GTC TAG ACT ATG
GCT GAA TGC CCC AGG-3', y se genera el ADNc de la
cadena \beta_{3} truncada por medio de la reacción en cadena de
la polimerasa empleándose los cebadores oligonucleótidos
5'-GCG CGC AAG CTT GCC GCC ACC ATG CGA GCG CGG
CCG-3' y 5'GAT CGA TCT AGA CTA GGT CAG GGC CCT TGG
GAC ACT-3'.
10. Empleo de un receptor
\alpha_{V}\beta_{3} recombinante soluble, tal como se ha
definido en las reivindicaciones 1 y 2, para el descubrimiento de
compuestos terapéuticos, que pueden inhibir a dicho receptor.
11. Empleo como se ha definido en la
reivindicación 10, en el que el compuesto terapéutico es un péptido
RGD o un análogo no peptídico.
12. Procedimiento para la selección de
compuestos terapéuticos por su capacidad para inhibir al receptor
\alpha_{V}\beta_{3} natural, mediante la utilización de un
receptor \alpha_{V}\beta_{3} soluble, tal como se ha
definido en las reivindicaciones 1 y 2, y un compuesto terapéutico,
que puede inhibir a dicho receptor \alpha_{V}\beta_{3}.
13. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque se modifica un péptido RGD o un análogo
no peptídico como compuesto terapéutico por medio de un marcador
detectable y se hace reaccionar con dicho receptor
\alpha_{V}\beta_{3} soluble purificado inmovilizado y se
mide la cantidad de enlace de los ligandos con dicho receptor.
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