ES2234099T3 - Anticuerpos monoclanales humanizados anti-alfa beta 3. - Google Patents
Anticuerpos monoclanales humanizados anti-alfa beta 3.Info
- Publication number
- ES2234099T3 ES2234099T3 ES98909183T ES98909183T ES2234099T3 ES 2234099 T3 ES2234099 T3 ES 2234099T3 ES 98909183 T ES98909183 T ES 98909183T ES 98909183 T ES98909183 T ES 98909183T ES 2234099 T3 ES2234099 T3 ES 2234099T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- antibody
- human
- antibodies
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
- C07K16/2848—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta3-subunit-containing molecules, e.g. CD41, CD51, CD61
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Abstract
La invención se refiere a huevos anticuerpos humanizados y otros anticuerpos obtenidos por recombinación o ingeniería genética o anticuerpos monoclonales contra el receptor {al}{sub,V}{be}{sub,3} de vitronectina y contra los genes que lo codifican. Dichos anticuerpos se utilizan para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de trastornos inducidos por {al}{sub,V}{be}{sub,3}, tales como restenosis en pacientes humanos.
Description
Anticuerpos monoclonales humanizados
anti-\alpha_{v}\beta_{3}.
Esta invención se refiere a nuevos anticuerpos
monoclonales humanizados (mAb) y a los genes que codifican los
mismos. De manera más específica, esta invención se refiere a
anticuerpos monoclonales humanos reactivos de manera específica
reactivos con un epítopo del receptor de la vitronectina humana,
\alpha_{v}\beta_{3}. Dichos anticuerpos son útiles para el
tratamiento terapéutico y/o profiláctico de restenosis, enfermedades
angiogénicas asociadas (por ejemplo, cáncer, metástasis de cáncer,
artritis reumatoide, aterosclerosis) entre otras enfermedades.
Las integrinas son una superfamilia de receptores
de adhesión celular que son glicoproteínas heterodiméricas
transmembrana que gran variedad de células expresan. Estos
receptores de adhesión de la superficie celular incluyen el receptor
de la vitronectina \alpha_{v}\beta_{3}. El receptor de la
vitronectina \alpha_{v}\beta_{3} se expresa sobre varias
células, entre las que se incluyen las células del endotelio,
músculo liso, osteoclasto y tumores y, por tanto, tiene varias
funciones.
Por ejemplo, se ha teorizado que el receptor
\alpha_{v}\beta_{3}, que se expresa sobre la membrana de
las células de osteoclasto, media en el proceso de resorción del
hueso y contribuye al desarrollo de la osteoporosis [Ross, et
al., J. Biol. Chem., 1987, 262: 7703]. Otro
ejemplo, se ha teorizado que el receptor
\alpha_{v}\beta_{3}, que se expresa en las células de la
musculatura lisa de la aorta humana, estimula su migración a
neointima, lo que conduce a la formación de aterosclerosis y
restenosis tras una angioplastia [Brown, et al., Cardiovascular
Res., 1994, 28: 1815].
Se ha descrito por Choi et al, J. Vasc.
Surg., 1994, 19:125-34, la
conexión entre el antagonismo del receptor de la vitronectina y la
restenosis tras un procedimiento. La Publicación de Patente
Internacional nº WO95/25543, publicada el 9 de Marzo de 1995 se
refiere a un procedimiento de inhibición de la angiogénesis por la
administración de un antagonista del receptor de la
vitronectina.
De forma adicional, un reciente estudio describe
un antagonista \alpha_{v}\beta_{3} como promotor de
regresión tumoral por inducción de apoptosis de los vasos sanguíneos
angiogénicos [P. C. Brooks, et al., Cell, 1994,
79: 1157-1164]. De manera similar, un
anticuerpo monoclonal de murina LM609 desarrollado para el receptor
de la vitronectina del que se informa en la Publicación de Patente
Internacional nº WO89/05155, publicada el 15 de Junio de 1995, se
describió como útil para la inhibición del crecimiento tumoral. Ver
también D. UN. Cheresh et al, Cell, 1989,
57:59-69,
Aunque se ha sugerido que la inmunoterapia pasiva
que emplea anticuerpos monoclonales procedentes de especies
heterólogas, (por ejemplo, murina) es un mecanismo útil para tratar
o prevenir diferentes enfermedades o trastornos, una alternativa
para reducir el riesgo de una respuesta inmune indeseable por parte
del paciente dirigida contra el anticuerpo extraño es emplear
anticuerpos "humanizados". Estos anticuerpos son esencialmente
de origen humano, siendo únicamente de origen no humano las
Regiones Complementarias Determinantes (CDR) y ciertos marcos
residuales que tienen influencia sobre la conformación de las CDR.
Ejemplos particularmente útiles de esta hipótesis para el
tratamiento de algunos trastornos se describen la solicitud PCT
PCT/GB91/01554, Publicación Nº WO 92/04381 y solicitud PCT
PCT/GB93/00725, Publicación Nº WO93/20210.
Una segunda hipótesis, y más preferida, es
emplear mAb completamente humanos. Desafortunadamente, se han
producido pocos éxitos en la producción de anticuerpos monoclonales
humanos a través de la tecnología clásica de hibridomas. Así, no se
han identificado compañeros aceptables para la fusión humana, y los
compañeros de fusión de mieloma de murina no funcionan bien con
células humanas, produciendo líneas de hibridoma inestables y de
baja producción.
Los mAb humanos o anticuerpos humanizados son
particularmente útiles solos o en combinación con moléculas
existentes para formar composiciones inmunoterapéuticas. Sigue
existiendo una necesidad en la técnica de mAb completamente humanos
para el receptor de la vitronectina \alpha_{v}\beta_{3} o
anticuerpos humanizados del anterior que puedan bloquear de manera
selectiva la integrina \alpha_{v}\beta_{3} y tener un suero
con vida media prolongada.
En un aspecto, esta invención se refiere a un
nuevo anticuerpo monoclonal humanizado dirigido a
\alpha_{v}\beta_{3} y a los fragmentos funcionales del
anterior. Este anticuerpo humanizado es reactivo de manera
específica con el \alpha_{v}\beta_{3} humano (receptor de
la vitronectina) y capaz de neutralizar su función.
En un aspecto relacionado, la presente invención
proporciona modificaciones para neutralizar fragmentos Fab o
fragmentos F(ab')_{2} específicos del receptor humano
\alpha_{v}\beta_{3}, producido a partir de clonación
combinatoria aleatoria de secuencias de anticuerpos humanos, y
aislados de una librería de fago Fab filamentoso.
En otro aspecto más, se proporciona un anticuerpo
humano reconformado que contiene regiones constantes con cadenas
humanas ligeras y pesadas de un cebador donante humano, y regiones
variables con cadenas ligeras y pesadas o CDR de las anteriores
derivadas de anticuerpos monoclonales humanos neutralizantes del
receptor \alpha_{v}\beta_{3} humano, derivados de un segundo
donante humano.
En otro aspecto más, la presente invención
proporciona una composición farmacéutica que contiene uno (o más)
anticuerpos alterados y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona un procedimiento de inmunoterapia pasiva para un
trastorno mediado por el receptor \alpha_{v}\beta_{3}, tal
como restenosis, metástasis de cáncer, artritis reumatoide o
aterosclerosis, entre otros, en un ser humano por administración al
mencionado ser humano de una cantidad efectiva de la composición
farmacéutica de la invención, para la profilaxis o tratamiento
terapéutico del trastorno.
En otro aspecto más, la invención proporciona un
procedimiento para tratar una enfermedad mediada por el receptor de
la vitronectina en un ser humano, por administración al ser humano
de una cantidad inmunoterapéuticamente efectiva del anticuerpo de la
invención, seguido por la administración al mencionado ser humano
de una cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula química
pequeña, que es un antagonista del receptor.
En otro aspecto más, la presente invención
proporciona procedimientos para, y componentes útiles en, la
producción recombinante de anticuerpos humanizados y alterados (por
ejemplo, anticuerpos de diseño, CDR, Fab o fragmentos
F(ab')_{2}, o análogos de los anteriores) que se derivan de
neutralizar anticuerpos monoclonales (mAb) del receptor
\alpha_{v}\beta_{3} humano. Estos componentes incluyen
secuencias aisladas de ácido nucleico que codifican los mismos
plásmidos recombinantes que contienen las secuencias de ácido
nucleico bajo el control de secuencias regulatorias seleccionadas
que son capaces de dirigir la expresión de los anteriores en las
células huésped (de mamífero de forma preferible) transfectadas con
los plásmidos recombinantes. El procedimiento de producción implica
cultivar una línea huésped de células transfectadas de la presente
invención bajo condiciones tales que el anticuerpo humano o alterado
se expresa en las mencionadas células, y aislar el producto
expresado a partir de las anterio-
res.
res.
Otro aspecto adicional de la invención es un
procedimiento para diagnosticar la presencia de sobreexpresión del
receptor humano \alpha_{v}\beta_{3} en un ser humano que
comprende poner en contacto una muestra de biopsia con los
anticuerpos y anticuerpos alterado de la presente invención, y
realizar ensayos para buscar la incidencia del enlace entre el
mencionado anticuerpo (o anticuerpo alterado) y el receptor
\alpha_{v}\beta_{3}.
Otra forma adicional de realización de la
invención es una composición farmacéutica que comprende al menos
una dosis de una cantidad inmunoterapéuticamente efectiva de los
anticuerpos de esta invención en combinación con al menos un
anticuerpo monoclonal o alterado adicional. Una composición
particularmente deseable comprende como anticuerpo adicional un
anticuerpo anti-humano del receptor
\alpha_{v}\beta_{3} que se distingue del anticuerpo sujeto
en virtud de ser reactivo con un epítopo diferente del receptor
\alpha_{v}\beta_{3} humano.
Otros aspectos y ventajas de la presente
invención se describen mejor en la descripción detallada y las
formas de realización preferidas de la anterior.
La Fig. 1 es un gráfico que ilustra el enlace del
mAb al receptor \alpha_{v}\beta_{3} humano mediante ELISA
tal como se describe en el Ejemplo 3 para D12 y LM609.
La Fig. 2 es un gráfico que ilustra el enlace de
mAb al receptor \alpha_{v}\beta_{3} mediante una etiqueta
Origen para D12 y LM609 y MU19 como control (ver el Ejemplo 9).
La Fig. 3 es un gráfico que representa datos
BIAcore de D12 y LM609 (6 nM) enlazando con
\alpha_{v}\beta_{3} inmovilizado tal como se describe en el
Ejemplo 8.
La Fig. 4 es un gráfico que ilustra las
propiedades de los anticuerpos (D12 y los anticuerpos de respaldo
que se listan en la Tabla I) según la capacidad de evitar que 1
\mug/ml de LM609 se enlace con 1 \mug/ml
\alpha_{v}\beta_{3} en un experimento con marca ORIGEN. Ver
el Ejemplo 9.
La Fig. 5 es un gráfico que ilustra el efecto de
la concentración de D12 humanizado en el ensayo de adhesión celular
HEK293.
La Fig. 6 es un gráfico de barras que ilustra la
inhibición del enlace de 1 \mug/ml de LM609 a 1 \mug/ml de
\alpha_{v}\beta_{3} por preincubación con LM609 o D12.
La Fig. 7 es un gráfico de barras que ilustra la
inhibición del enlace de 1 \mug/ml de D12 a 1 \mug/ml de
\alpha_{v}\beta_{3} por preincubación con LM609 o D12,
La Fig. 8 es un gráfico de barras que ilustra los
resultados de citometría de flujo de anticuerpos de murina y D12
humanizado frente a dos tipos de células humanas y un tipo de
célula de conejos. Ver el Ejemplo 6,
La Fig. 9 es un gráfico de barras que ilustra la
inhibición de las células de la musculatura lisa del conejo en el
ensayo del Ejemplo 10 por la murina D12 mAb (barras negras) y el HZ
D12 IgG_{1} humanizado (barras blancas).
La Fig. 10A es un gráfico de barras que ilustra
los resultados del ensayo de restenosis del conejo del Ejemplo 15,
midiendo el efecto sobre el área del lumen de un vaso sanguíneo
dañado de tratamiento con un control o tratamiento con murina D12,
entregada con una dosificación de 3 mg/kg, i. v. N es el número de
animales tratados.
La Fig. 10B es un gráfico de barras que ilustra
los resultados del ensayo de restenosis del conejo midiendo el
efecto sobre el área total del vaso dañado, tratado como en la Fig.
10A.
La Fig. 10C es un gráfico de barras similar al de
la Fig. 10A, excepto en que la murina D12 se entregó en una
dosificación de 9 mg/kg, i.v.
La Fig. 10D es un gráfico de barras similar al de
la Fig. 10B, excepto en que la murina D12 se entregó en una
dosificación de 9 mg/kg, i.v.
La presente invención proporciona anticuerpos
útiles, que incluyen anticuerpos monoclonales, recombinantes y
sintéticos (y fragmentos de los anteriores) reactivos con el
receptor de la vitronectina \alpha_{v}\beta_{3} humana,
ácidos nucleicos aislados que codifican los mismos y diferentes
sistemas para su producción recombinante, así como los usos
terapéuticos, profilácticos y diagnósticos de dichos anticuerpos y
fragmentos de los anteriores.
Los anticuerpos de esta invención inhiben el
enlace de vitronectina y otros ligandos al receptor de la
vitronectina (\alpha_{v}\beta_{3}). Estos anticuerpos
pueden bloquear de forma selectiva la integrina
\alpha_{v}\beta_{3} y presentar un suero con una vida media
prolongada in vivo en modelos animales (por ejemplo,
aproximadamente 21 días). Presentan funciones adicionales tales
como fijación complementaria. De manera específica, los anticuerpos
entre los que se incluyen la murina monoclonal D12 y el anticuerpo
humanizado HuD12, que de manera específica neutralizan
\alpha_{v}\beta_{3}, son deseables para uso como reactivos
terapéuticos agudos y subagudos para el tratamiento de los
trastornos mediados por el receptor de la vitronectina. La
inhibición del receptor de la vitronectina mediante los anticuerpos
de esta invención permite el tratamiento terapéutico o la
profilaxis de enfermedades tales como restenosis y angiogénesis.
Los números de Secuencia ID 1 y 2 son las
secuencias de ADN y aminoácidos con región variable de cadena
pesada, respectivamente, del mAb D12 de murina. Los CDR se
localizan en los residuos de AA 31-35, nucleótidos
91-105; AA 50-66, nucleótidos
148-198; y AA 99-106, nucleótidos
295-318 de SEC ID Nº: 1 y 2.
Los números de Secuencia ID 6 y 7 son las
secuencias de ADN y aminoácidos con región variable de cadena
ligera, respectivamente, del mAb D12 de murina. Los CDR se
localizan en AA24-34, nucleótidos
70-102; AA50-56, nucleótidos
148-168; y AA89-97, nucleótidos
265-291 de SEC ID Nº: 6 y 7.
La secuencia ID Nº 3 es la secuencia de
aminoácidos con región variable de cadena pesada de la secuencia de
consenso del subgrupo I del VH humano, en el que los CDR se
localizan en los AA31-35; AA49-64; y
AA97-104, SEC ID Nº: 8 es secuencia de aminoácidos
de cadena ligera de la secuencia de consenso del subgrupo III
humano kappa V, en el que los CDR se localizan en los
AA24-35, AA51-57 y
AA90-99.
Los números de Secuencia ID 4 y 5 son las
secuencias de ADN y aminoácidos sintéticos con región variable de
cadena pesada, respectivamente, de la cadena pesada de consenso
humanizado D12HZHC1-0. Los CDR se localizan en los
AA31-35, nucleótidos 91-115;
AA50-66, nucleótidos 148-198; y
AA99-106, nucleótidos 295-318. Los
residuos de marco de la murina que se retienen en las cadenas
pesadas sintéticas son los residuo de AA 28, 48, 67, 68, 70, 72 y
74.
Los números de Secuencia ID 9 y 10 las secuencias
de ADN y aminoácidos sintéticos con región variable de cadena
ligera, respectivamente, de la cadena ligera de consenso humanizado
D12HZLC-1-0. Los CDR se localizan en
los AA24-34, nucleótidos 70-102;
AA50-56, nucleótidos 148-168; y
AA89-97, nucleótidos 265-291. Los
residuos de marco de la murina preferidos son los residuos de 1, 49
y 60.
Números de Secuencia ID 11 y 12 son las
secuencias de ADN y aminoácidos, respectivamente, de la región
variable de cadena pesada de la región del murina D12 que se ha
alterado. Los números de Secuencia ID 13 y 14 son las secuencias de
ADN y aminoácidos, respectivamente, de la región variable de cadena
ligera de la región del murina D12 que se ha alterado, entre los
que se incluyen los primeros cinco aminoácidos de la región
constante humana kappa.
La secuencia ID Nº 15 es la secuencia de
aminoácidos de la marco de cadena kappa modificada REI humana.
Los números de Secuencia ID 16 y 17 son las
secuencias de ADN y aminoácidos, respectivamente, del gen Jk y sus
productos de gen.
Los números de Secuencia ID 18 y 19 son las
secuencias de ADN y aminoácidos, respectivamente, de la secuencia de
señal CAMPATH.
Los números de Secuencia ID 20 y 21 son las
secuencias de ADN y aminoácidos, respectivamente, de la cadena
sintética humanizada kappa basada en una marco de cadena REI kappa
humana modificada.
Los números de Secuencia ID.
22-25, 30-31, 36-39,
y 44-45 son primeras secuencias usadas en Ejemplos
13 y 14.
Los números de Secuencia ID.
26-29, 32-35, y
40-43 son oligosintéticos usados en los Ejemplos 13
y 14.
Tal como se usa en esta especificación y las
reivindicaciones, los siguientes términos se definen como
sigue:
La frase "trastornos mediados por el receptor
\alpha_{v}\beta_{3}", incluye, pero no se limita a,
trastornos cardiovasculares o trastornos angiogénicos relacionados,
tales como angiogénesis asociada con retinopatía diabética,
aterosclerosis y restenosis, trastornos crónicos de inflamación,
degeneración macular, retinopatía diabética, y cáncer, por ejemplo,
metástasis de tumores sólidos, y enfermedades en las que la
resorción del hueso está asociada con patologías tales como la
osteoporosis. Los anticuerpos de esta invención son útiles también
como agentes anti-metastáticos y antitumorales.
"Anticuerpo alterado" se refiere a una
proteína que se codifica mediante una región codificante de
inmunoglobulina que se altera a partir de su forma natural, que
puede obtenerse mediante expresión en una célula huésped
seleccionada. Dichos anticuerpos alterados son anticuerpos de
diseño (por ejemplo, anticuerpos humanos quiméricos, humanizados, o
reformados, o editados inmunológicamente o fragmentos de los
anteriores que carecen en todo o en parte de una región constante de
la inmunoglobulina, por ejemplo, F_{v}, Fab, o F(ab')_{2}
y similares.
"Región codificante de inmunoglobulina
alterada" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que
codifica un anticuerpo alterado de la invención o un fragmento del
anterior.
"Anticuerpo humano reformado " se refiere a
un anticuerpo alterado en el que mínimamente al menos un CDR
procedente de un anticuerpo monoclonal procedente de un cebador
donante humano se sustituye por un CDR en un segundo anticuerpo
humano aceptor. De forma preferible se reemplazan los seis CDR. De
forma más preferible, una región combinante de antígeno entera, por
ejemplo, un Fv, Fab o F(ab')_{2}, procedente de un cebador
anticuerpo monoclonal humano donante se sustituye por la
correspondiente región de un segundo anticuerpo monoclonal humano
aceptor. De forma más preferible, la región Fab procedente de un
cebador donante humano se enlaza de manera operativa con las
regiones constantes apropiadas procedentes de un segundo anticuerpo
monoclonal humano aceptor para formar un anticuerpo monoclonal de
longitud completa.
"Primer compañero de inmunoglobulina" se
refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una marco
humana o una región variable de inmunoglobulina humana en la que
las regiones codificantes CDR nativas (o que aparecen de forma
natural) se sustituyen por regiones codificantes CDR procedentes de
un anticuerpo humano donante. La región variable humana puede ser
una cadena pesada de inmunoglobulina, una cadena ligera (o ambas
cadenas), un análogo o fragmento funcional de los anteriores. Dichas
regiones CDR, que se localizan en el interior de las regiones
variables de los anticuerpos (inmunoglobulinas) pueden determinarse
mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Kabat
el al, Sequences of Proteins of Immunological
Interest, 4ª Ed., U.S. Department de Health y Human Services,
National Institutes de Health (1987), describe reglas para localizar
los CDR. Además, se conocen programas informáticos que son útiles
para identificar regiones / marcos CDR.
"Segundo compañero de fusión" se refiere a
otra secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o péptido
con el que se fusiona el primer compañero de inmunoglobulina en una
marco o mediante una secuencia de un enlazante opcional convencional
(es decir, enlazado de forma operativa). De forma preferible el
compañero de fusión es un gen de inmunoglobulina gene y, cuando esto
es así, se denomina como "segundo compañero de
inmunoglobulina". El segundo compañero de inmunoglobulina puede
incluir secuencia de ácido nucleico que codifica la región constante
entera del mismo (es decir, homologo - el cebador y segundo
anticuerpo alterados se derivan de la misma fuente) o un anticuerpo
adicional (es decir, heterólogo) de interés. Puede ser una cadena
pesada o una cadena ligera de inmunoglobulina (o ambas cadenas como
parte de un único polipéptido). El segundo compañero de
inmunoglobulina no se limita a una clase o isotipo particular de
inmunoglobulina. Además, el segundo compañero de inmunoglobulina
puede comprender parte de una región constante inmunoglobulina, tal
como la que se encuentra en un Fab o F(Fab')_{2} (es decir,
una parte discreta de una región constante o región de marco humana
apropiada). Un segundo compañero de fusión puede comprender también
una secuencia que codifique una proteína integral de membrana
expuesta sobre la superficie externa de una célula huésped, por
ejemplo, como parte de una librería de fagos, o una secuencia que
codifique una proteína para detección analítica o de diagnóstico,
por ejemplo, peroxidasa de rábano,
\beta-galactosidasa, etc.
Los términos Fv, Fc, Fd, Fab, o
F(ab')_{2} se usan con sus significados habituales [ver,
por ejemplo, Harlow et al, Antibodies A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)].
Tal como se usa en el presente documento, un
"anticuerpo de diseño" describe un tipo de anticuerpo
alterado, es decir, anticuerpo sintético de longitud completa (por
ejemplo, un anticuerpo humano quimérico, humanizado, reformado, o
editado inmunológicamente, en oposición a un fragmento de
anticuerpo) en el que una porción de las regiones variables de
cadena ligera o pesada de un anticuerpo aceptor seleccionado se
sustituye por partes análogas procedentes de uno o más anticuerpos
donantes que tengas especificidad para un epítopo concreto. Por
ejemplo, dichas moléculas pueden incluir anticuerpos caracterizados
en que un cadena pesada humanizada asociada con una cadena ligera no
modificada (o una cadena ligera quimérica), o viceversa. Los
anticuerpos de diseño pueden también caracterizarse en que la
alteración de las secuencias de ácido nucleico que codifican las
marcos con regiones variables ligeras o pesadas del anticuerpo
aceptor con el objetivo de retener la especificidad de enlace del
anticuerpo donante. Estos anticuerpos pueden comprender la
sustitución de uno o más CDR (de forma preferible todos) procedentes
del anticuerpo aceptor con CDR procedentes de un anticuerpo donante
que se describe en el presente documen-
to.
to.
Un "anticuerpo quimérico " se refiere a un
tipo de anticuerpo de diseño que contiene región variable de
aparición natural (cadena ligera y cadena pesada) que se deriva de
un anticuerpo donante en asociación con regiones constantes de
cadena ligera y pesada que se derivan de un anticuerpo aceptor de
una especie heteróloga.
Un "anticuerpo humanizado" se refiere a un
tipo de anticuerpo de diseño que tenga sus CDR derivados de una
inmunoglobulina donante no humana, el resto de las partes de la
molécula derivada de la inmunoglobulina se derivan de uno (o más)
inmunoglobulina(s) humana(s). Además, los residuos de
soporte de la marco se pueden alterar para conservar la afinidad de
enlace [ver, por ejemplo, Queen et al., 1991,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
86:10029-10032 y Hodgson et al.,
1991, Bio/Technology, 9:42 1].
Un "anticuerpo inmunológicamente editado" se
refiere a un tipo de anticuerpo de diseño en el que los cambios se
realizan en las secuencias de donante y/o aceptor para editar
regiones que implican artefactos de clonación, mejoras de líneas
germinales, etc., con el fin de reducir la posibilidad de una
respuesta inmunológica al anticuerpo por parte de un paciente que
está siendo tratado con el anticuerpo editado.
El término "anticuerpo donante" se refiere a
un anticuerpo (monoclonal o recombinante que contribuye a las
secuencias de ácido nucleico de sus regiones variables, CDR, u otros
fragmentos funcionales o análogos de los anteriores a un primer
compañero de inmunoglobulina, de forma que proporcione la región
codificante de inmunoglobulina alterada y dando como resultado la
expresión del anticuerpo alterado con las especificidad antigénica
y neutralizando las características de actividad del anticuerpo
donante. Un anticuerpo donante adecuado para uso en esta invención
es un anticuerpo monoclonal de murina
anti-\alpha_{v}\beta_{3} neutralizante,
designado como D12. D12 se define como que tenga las secuencias de
aminoácidos de cadena pesada variable y cadena ligera variable como
las que se muestran en SEC ID Nº: 2 y 7, respectivamente.
El término "anticuerpo aceptor" se refiere a
un anticuerpo (monoclonal o recombinante) procedente de una fuente
que nos está genéticamente relacionada con el anticuerpo donante,
que contribuye con toda (o cualquier porción, pero forma preferible
toda) la secuencias de ácidos nucleicos que codifica sus regiones de
marco de cadena pesada y y/o ligera y/o sus regiones constantes de
cadena pesada y/o ligera al primer compañero de inmunoglobulina. De
forma preferible un anticuerpo humano es el anticuerpo aceptor.
Las regiones "VH de consenso" o "VK de
consenso" se refieren a secuencias de aminoácidos que pueden
funcionar en una forma similar a las regiones de marco del
anticuerpo aceptor, pero que se seleccionan mediante técnicas
convencionales de computación. En breve, dada una secuencia de
aminoácidos VH o VK, las secuencias VH y VK humanas más cercanas a
la secuencia dadas se ensamblan para identificar el subgrupo de
anticuerpo más cercano. Una vez seleccionado el subgrupo, se
comparan todos los anticuerpos humanos del mencionado subgrupo, y se
prepara una secuencia de consenso de las cadenas VH y VK. Las
secuencias de consenso se usan para generar una región de marco
sintética deseable para el anticuerpo e humanizado.
"CDR" son las secuencias complementarias de
aminoácidos determinantes de una región de un anticuerpo. Las CDR
son las regiones hipervariables de las cadenas ligeras y pesadas de
inmunoglobulina. Ver por ejemplo, Kabat et al, Sequences
of Proteins of Immunological Interest, 4º Ed., U.S. Department
de Health and Human Services, National Institutes de Health (1987).
Existen tres CDR de cadenas pesadas y tres CDR de cadenas ligeras
(o regiones CDR) en las porciones variables de una inmunoglobulina.
Así, "CDR" tal como se usa en el presente documento, se refiere
a las tres CDR de la cadena pesada, o a las tres CDR de la cadena
ligera (o a todas CDR de las cadenas pesada y ligera, si es
apropiado). Las CDR proporcionan la parte de los residuos de
contacto para el enlace del anticuerpo al antígeno o epítopo. Las
CDR de interés en esta invención se derivan de secuencias variables
de cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo donante e incluye
análogos de CDR de aparición natural, dichos análogos también
comparten o retienen la misma especificidad de enlace con el
antígeno y/o capacidad neutralizante que el anticuerpo donante del
que se derivan.
Por "compartir la misma especificidad de enlace
con el antígeno y/o capacidad neutralizante" se define, por
ejemplo, que aunque el mAb D12 pueda caracterizarse por un
determinado nivel de afinidad con el antígeno, un CDR codificado
mediante un secuencia de ácido nucleico de mAb D12 en un ambiente
marco adecuado puede tener una afinidad menor o superior. Se espera
que las CDR de mAb D12 en dichos ambienten no reconozca nunca
el(los) mismo(s) epítopo(s) que el mAb D12
intacto.
Un "fragmento funcional" es una secuencia
variable parcial de cadena pesada y ligera (por ejemplo, borrados
menores en el término amino o carboxi de la región variable de la
inmunoglobulina) que retiene la misma especificidad de enlace con el
antígeno y/o capacidad neutralizante que el anticuerpo del que el
fragmento se deriva.
Una "análogo" es una secuencia de
aminoácidos modificada en al menos un aminoácido, en el que la
mencionada modificación puede ser una modificación química o una
sustitución en un aminoácido o una sustitución o una reordenación de
unos pocos aminoácidos (es decir, no más de 10), esta modificación
permite que la secuencia de aminoácidos retenga las propiedades
biológicas, por ejemplo, especificidad y elevada afinidad por el
antígeno, de la secuencia no modificada. Por ejemplo, se pueden
construir mutaciones (silenciosas) mutaciones mediante
sustituciones, cuando ciertos emplazamientos de restricción de
endonucleasa se crean emplazamientos de restricción en o alrededor
de las regiones que codifican CDR.
Cuando en este texto, las secuencias de proteína
y/o ADN se definen en función de su porcentaje de homologías o
porcentaje de identidades respecto de las secuencias identificadas,
los algoritmos que se usan para calcular el porcentaje de
homologías o porcentaje de identidades incluyen los siguientes: el
algoritmo Smith-Aguaman [J. F. Collins et
al, 1988, Comput. Appl. Biosci.,
4:67-72; J. F. Collins et al,
Molecular Secuence Comparison and Alignment, (M. J. Bishop et
al, eds.) en Practical Approach Series: Nucleic Acid y Protein
Secuencia Analysis XVIII, IRL Press: Oxford, England, UK
(1987) pp.417], y los programas BLAST y FASTA [E. G. Shpaer
et al, 1996, Genomics,
38:179-191]. Estas referencias se incorporan
en el presente documento como referencia.
Los análogos pueden también como variaciones de
alelos. Una "variación o modificación de alelos" es una
alteración en la secuencia del ácido nucleico que codifica las
secuencias del aminoácido o péptido de la invención. Dichas
variaciones o modificaciones pueden deberse a la degeneración en el
código genético, o puede diseñarse de manera deliberada para
proporcionar características deseadas. Estas variaciones o
modificaciones pueden o no dar como resultado alteraciones en
cualquier secuencia de aminoácidos codificada.
El término "agentes efectores" se refiere a
moléculas transportadoras no proteínicas a las que los anticuerpos
alterados, y/o las cadenas ligeras o pesadas, naturales o
sintéticas, del anticuerpo donante u otros fragmentos del anticuerpo
donante pueden asociarse promedios convencionales. Dichos
transportadores no proteínicos pueden incluir transportadores
convencionales usados en el campo del diagnóstico, como poliestireno
y otras perlas de plástico, polisacáridos, por ejemplo, tal como se
usa en el sistema BIAcore (Pharmacia), u otras sustancias no
proteínicas útiles en el campo médico y seguros para la
administración a seres humanos y animales. Otros agentes efectores
pueden incluir macrociclo, para quelar una átomo de metal pesado o
radioisótopos. Dichos agentes efectores pueden también ser útiles
para incrementar la vida media de los anticuerpos alterados, por
ejemplo, polietilén glicol.
Para uso en la construcción de los anticuerpos
humanizados, fragmentos y proteínas de fusión de esta invención, se
puede emplear una especie no humana para generar una
inmunoglobulina deseable tras presentación con receptor humano
placentario \alpha_{v}\beta_{3} como antígeno. Se emplean
técnicas convencionales de hibridoma para proporcionar una línea
celular de hibridoma que secrete un anticuerpo monoclonal no humano
(mAb) al receptor \alpha_{v}\beta_{3}. Como ejemplo, la
producción del mAb D12 de murina, y otros mAb anti
\alpha_{v}\beta_{3} de murina se describe con detalle en el
Ejemplo 2 a continuación. Para facilitar la discusión siguiente, el
término D12 puede referirse al mAb D12 o a cualquiera del resto de
mAb del Ejemplo 2.
D12 es un anticuerpo donante deseable para uso en
el desarrollo de un anticuerpo quimérico o humanizado de esta
invención. Las propiedades del mAb D12 de murina neutralizante
obtenidas tal como se describe en Ejemplo 2 incluyen una
especificidad de enlace con el antígeno para el
\alpha_{v}\beta_{3} humano y las propiedades que se
relacionan en la Tabla I a continuación. El isotipo del mAb D12 del
Ejemplo 2 es IgG_{1}, y tiene una afinidad de entre
aproximadamente 1 y 3 nM, dependiendo del ensayo empleado. El
anticuerpo reconoce los epítopos heterodiméricos \alpha y \beta
de \alpha_{v}\beta_{3} y no reconoce las subunidades
\alpha o \beta individuales. El enlace se ilustra por la
actividad enlazante y funcional (neutralización) en los ensayos
in vitro de los Ejemplos 3-12 a
continuación).
Dadas las secuencias proporcionadas, es decir, la
región variable de cadena ligera D12 [SEC ID Nº: 6 y 7] y la región
variable de cadena pesada de D12 [SEC ID Nº: 1 y 2], alguien experto
en la técnica puede obtener las porciones restantes de la cadena
pesada usando, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa,
y obteniendo de esta forma una molécula mAb completa. De forma
alternativa, se puede construir una molécula D12 usando técnicas
análogas a las que se describen seguidamente para los mAb sintéticos
y recombinantes de la invención y empleando otras cadena pesadas del
subtipo murina IgG.
Pueden desarrollarse otros anticuerpos
anti-\alpha_{v}\beta_{3} mediante selección
de hibridomas o de librerías combinatorias o presentaciones de
anticuerpos de fago [W. D. Huse et al., 1988,
Science, 15 246:1275-1281] usando el mAb de
murina que se describe en el presente documento y sus epítopos
\alpha_{v}\beta_{3}. Se puede seleccionar una colección de
anticuerpos, entre los que se incluyen productos de hibridoma o
anticuerpos derivados de cualquier catálogo de especies de
inmunoglobulina en un ensayo convencional de competición tal como el
que se describe en los Ejemplos 5, 8 y 9 siguientes, con uno o más
epítopos descritos en el presente documento. Así, la invención puede
proporcionar un anticuerpo diferente de D12 que es capaz de
enlazarse y neutralizar el receptor \alpha_{v}\beta_{3}.
Otros mAb generados frente a un epítopo \alpha_{v}\beta_{3}
deseado y producido mediante técnicas convencionales, incluyen sin
limitación, genes que codifican mAb de murina, mAb de ser humano, y
anticuerpos combinatorios.
Esta invención no se limita al uso del mAb D12 o
sus secuencias hipervariables. Se anticipa que cualquier
anticuerpos neutralizante \alpha_{v}\beta_{3} apropiado y
el correspondiente CDR
anti-\alpha_{v}\beta_{3} descritos en la
técnica puede sustituirse por el anterior. Aunque en la siguiente
descripción el anticuerpo donante se identifique como D12, esta
designación es está hecha únicamente como ilustración y simplicidad
de la descripción.
Tal como se ha mencionado anteriormente,
numerosos problemas impiden la aplicación directa de la tecnología
de hibridomas de G. Kohler y C. Milstein, 1975,
Nature, 256: 495-497 para la
generación y aislamiento de anticuerpos monoclonales humanos. Entre
estos están la falta de líneas de células de mieloma adecuadas como
compañeros de fusión para formar líneas celulares de hibridoma así
como la mala estabilidad de dichos hibridomas incluso cuando se han
formado. Por tanto, se prefiere la hipótesis de biología molecular
que proporciona la clonación combinatoria.
La clonación combinatoria se describe de manera
general en la Publicación PCT Nº WO90/14430. Definido de forma
simple, el objetivo de la clonación combinatoria es transferir a una
población de células bacterianas la capacidad genética inmunológica
de una célula, tejido u órgano humano. Se prefiere emplear células,
tejidos u órganos que sean inmunocompetentes. Entre las fuentes
particularmente útiles se incluyen, sin limitación, bazo, timo,
ganglios linfáticos, médula ósea, amígdalas, y linfocitos de sangre
periférica. Las células pueden estimularse de forma opcional con el
receptor \alpha_{v}\beta_{3} humano in vitro, o
seleccionado a partir de donantes conocidos por haber desencadenado
una respuesta inmune, o donantes que sean VIH^{+} pero
asintomáticos.
La información genética (es decir, los
anticuerpos humanos producidos en los tejidos en respuesta a la
estimulación por \alpha_{v}\beta_{3} como antígeno) aislado
de las células del donante puede estar en forma de ADN o ARN y se
amplifica de manera conveniente con técnicas de PCR o similares.
Cuando se aísla como ARN, la información genética se convierte de
forma preferible en ADNc mediante transcripción inversa entes de la
amplificación. La amplificación puede ser genérica o hecha a medida
de manera más específica. Por ejemplo, mediante una selección
cuidadosa de las secuencias iniciadoras en la PCR, se puede
conseguir la amplificación selectiva de los genes o subconjuntos de
inmunoglobulina dentro del tipo de genes que se quieren
conseguir.
Una vez que se han obtenido las secuencias de los
genes componentes, en este caso los, genes que codifican las
regiones variables de las distintas cadenas ligeras y pesadas del
anticuerpo, los genes de las cadenas ligera y pesada se asocian en
combinaciones aleatorias para formar una librería combinatoria
aleatoria. Se han descrito diferentes sistemas vectores de ADN
recombinante para facilitar la clonación combinatoria [ver por
ejemplo, Publicación PCT Nº WO90/14430 supra, Scott y Smith,
1990, Science, 249:386-406 o
la Patente de los Estados Unidos Nº 5.223.409]. Una vez generada la
librería combinatoria, los productos pueden, tras su expresión,
seleccionarse de manera conveniente mediante ciclos de selección
con el receptor \alpha_{v}\beta_{3} humano o, si es
necesario, mediante ciclos de selección de epítopo bloqueado tal
como se describe con más detalle a continuación.
Inicialmente se prefiere por lo general usar
fragmentos de Fab de mAb, tales como D12, para la clonación
combinatoria y selección y a continuación convertir los Fabs en mAb
de longitud completa tras la selección de las moléculas candidatas
deseadas. Sin embargo, los anticuerpos de cadena sencilla pueden
también usarse para clonación y selección.
La presente invención contempla el uso de
fragmentos de Fab o fragmentos de F(ab')_{2} para derivar
mAb de longitud completa dirigidos contra el receptor
\alpha_{v}\beta_{3} humano. Aunque estos fragmentos pueden
usarse de manera independiente como agentes protectores y
terapéuticos in vivo frente a dolencias mediadas por el
receptor \alpha_{v}\beta_{3} humano o in vitro como
parte de un diagnóstico de una enfermedad mediada por el receptor
\alpha_{v}\beta_{3} humano, se emplea en el presente
documento como un componente de de un anticuerpo reformado humano.
Un fragmento de Fab contiene la cadena ligera completa y porción
amino terminal de la cadena pesada; y un fragmento
F(ab')_{2} es el fragmento formado por dos fragmentos Fab
enlazados mediante puentes disulfuro adicionales. El enlace de los
anticuerpos monoclonales del receptor \alpha_{v}\beta_{3}
humano de la presente invención proporciona fuentes de fragmentos
Fab y de fragmentos F(ab')_{2}, estos últimos fragmentos
se pueden obtener a partir de librerías combinatorias de fagos [ver
por ejemplo, Winter et al., 1994, Ann. Rev.
Immunol., 12:433-455 o Barbas et
al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
89:10164-10168 que se incorporan como
referencia en su totalidad en el presente documento]. Estos
fragmentos Fab y F(ab').sub.2 son ellos mismos útiles como
agentes terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico, y como
donantes de secuencias entre las que se incluyen las regiones
variables y secuencias CDR útiles en la formación de anticuerpos
recombinantes o humanizados tal como se describe en el presente
documento.
El mAb D12 u otros anticuerpos descritos en el
presente documento pueden proporcionar secuencias, tales como
secuencias variables de péptido de cadena pesada y/o ligera,
secuencias marco, secuencias CDR, fragmentos funcionales, y análogos
de los anteriores, y las secuencias de ácidos nucleicos que los
codifican, útiles para diseñar y obtener diferentes anticuerpos
alterados que se caracterizan por la especificidad de enlace con el
antígeno del anticuerpo donante.
Como ejemplo, la presente invención proporciona
por tanto secuencias variables de cadena ligera [SEC ID Nº: 6 y 7]
y de cadena pesada [SEC ID Nº: 1 y 2] a partir del mAb D12
\alpha_{v}\beta_{3} anti-humano, y
secuencias derivadas del anterior.
Las secuencias de ácidos nucleicos de esta
invención, o fragmentos de los anteriores, que codifican las
secuencias variables de péptido de cadena ligera y cadena pesada
son también útiles para la introducción mutagénica de cambios
específicos en las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los
CDR o regiones marco, y para incorporación de la secuencia de ácido
nucleico resultante modificada o de fusión en un plásmido para su
expresión. Por ejemplo, las sustituciones silentes en la secuencia
de nucleótido del marco y regiones que codifican CDR pueden usarse
para crear emplazamientos de enzimas de restricción que facilitarían
la inserción de regiones CDR mutagénicas (y/o marco). Estos
Regiones que codifican CDR pueden usarse para la construcción de
los anticuerpos reformados humanos de esta invención.
Teniendo en cuenta la degeneración del código
genético, pueden construirse varias secuencias que codifiquen
secuencias variables de aminoácidos de cadena pesada y ligera, y
secuencias CDR de la invención así como fragmentos funcionales y
análogos de los anteriores que comparten la especificidad frente al
antígeno del anticuerpo donante. Las secuencias aisladas de los
ácidos nucleicos de esta invención, o fragmentos de los anteriores,
que codifican las secuencias variables de la cadena de péptido o
CDR pueden usarse para producir anticuerpo alterados, por ejemplo,
anticuerpos quiméricos o humanizado, u otros anticuerpos de diseño
de esta invención cuando se combinan de forma operativa con un
segundo compañero de inmunoglobulina.
Debe tenerse en cuenta que además de las
secuencias aisladas de ácidos nucleicos que codifican las porciones
de anticuerpos alterados y de los anticuerpos que se describen en
el presente documento, otras tales como secuencias de ácidos
nucleicos quedan abarcadas por la presente invención, tales como las
que son complementarias de las secuencias nativas que codifican CDR
o complementarias de las regiones marco humanas modificadas que
rodean las regiones que codifican CDR. Dichas secuencias incluyen
todas las secuencias de ácidos nucleicos que por virtud de la
redundancia del código genético son capaces de codificar las mismas
secuencias de aminoácidos que se proporcionan en SEC ID Nº: 2 y 7.
Una secuencia de ADN humanizado de cadena ligera variable de ejemplo
se ilustra en SEC ID Nº: 9. Una secuencia de ADN humanizado de
cadena pesada variable de ejemplo se ilustra en SEC ID Nº: 4. Estas
regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera tienen tres
secuencias CDR que se describen con detalle en las secuencias de
murina SEC ID Nº: 1, 2, 6 y 7.
Otros secuencias útiles de ADN que se abarcan en
esta invención incluyen aquellas secuencias que se hibridan bajo
condiciones de hibridización rigurosas [ver por ejemplo, T.
Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning (A
Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory páginas 387 a
389] a las secuencias de ADN que codifican las regiones variables de
cadena ligera y pesada de SEC ID Nº: 1 y 6 (también entre los que
se incluyen SEC ID Nº: 4 y 9 para las secuencias humanas sintéticas)
y que retienen las propiedades enlazantes del antígeno de aquellos
anticuerpos. Un ejemplo de estas condiciones rigurosas de
hibridación es la hibridización en 4X SSC a 65ºC, seguido por un
lavado en 0,1X SSC a 65ºC durante una hora. De forma alternativa, un
ejemplo de condición rigurosa de hibridación es en formamida al 50%,
4X SSC a 42ºC De forma preferible, estas secuencias de ADN
hibridante tienen al menos aproximadamente 18 nucleótidos de
longitud, es decir, aproximadamente el tamaño de un CDR. Otras
secuencias todavía útiles son aquellas secuencias de ADN que son
aproximadamente 80% a aproximadamente 99% homologas o idénticas a
las secuencias de ADN de SEC ID Nº: 1, 4, 6, 9, 11, 13, y 20 en el
presente documento, de acuerdo con cualquiera de los algoritmos
relacionados anteriormente, que codifican secuencias que comparten
las funciones o actividades biológicas de SEC ID Nº: 2, 5, 7, 10,
12, 14 y 21,
Las regiones codificantes de inmunoglobulina
alterada codifican anticuerpo alterados que incluyen anticuerpos de
diseño tales como anticuerpos quiméricos, humanizados, reformados y
anticuerpos humanos inmunológicamente editados. Una región
codificante deseada de inmunoglobulina alterada contiene regiones
que codifican CDR en forma de regiones Fab que codifican péptidos
que tengan las especificidad del antígeno del anticuerpo
\alpha_{v}\beta_{3} anti-humano, de forma
preferible un anticuerpo de elevada afinidad tal como el que se
proporciona mediante la presente invención, insertado en un
compañero aceptor de la inmunoglobulina.
Cuando el aceptor es un compañero de
inmunoglobulina, como se ha definido anteriormente, incluye una
secuencia que codifica una segunda región de interesen el
anticuerpo, por ejemplo una región Fc. Los compañeros de
inmunoglobulina pueden incluir también secuencias que codifiquen
otra inmunoglobulina a la que se fusiona la región constante de
cadena ligera o pesada, en marco o mediante una secuencia enlazante.
Pueden diseñarse anticuerpos de diseño para dirigirse contra
fragmentos funcionales o análogos de la proteína humana
\alpha_{v}\beta_{3} para elicitar un enlace mejorado con el
mismo anticuerpo.
El compañero de inmunoglobulina puede asociarse
también con agentes efectores como se ha definido anteriormente,
entre los que se incluyen moléculas transportadoras no proteicas, a
las que puede enlazarse de forma operativa el compañero de
inmunoglobulina por medios convencionales.
La fusión o enlace entre los compañeros de
inmunoglobulina, por ejemplo, secuencias de anticuerpo, y el agente
efector puede ser mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo,
mediante enlaces covalentes o iónicos convencionales, fusiones de
proteína, o entrecruzadotes heterofuncionales, por ejemplo,
carbodiimida, glutaraldehido, y similares. Dichas técnicas son
conocidas en la técnica y se describen fácilmente en los textos
convencionales de química y bioquímica.
De forma adicional, pueden también construirse en
una región codificante de inmunoglobulina alterada secuencias
enlazantes convencionales que simplemente proporcionan una cantidad
deseada de espacio entre el segundo compañero de inmunoglobulina y
el agente efector. El diseño de dichos enlazantes es bien conocido
de aquellas personas expertas en la técnica.
Además, pueden modificarse las secuencias señal
de las moléculas de la invención para mejorar la expresión. Por
ejemplo el anticuerpo reformado humano que tenga la secuencia señal
y los CDR derivados de la secuencia de la cadena pesada del mAb
D12, pueden tener la señal original del péptido sustituida con otra
secuencia señal, tales como la secuencia líder Campath [Page, M. J.
et al., 1991, BioTechnology,
9:64-68; SEC ID Nº: 18 y 19].
Un anticuerpo alterado de ejemplo, un anticuerpo
reformado humano, contiene una secuencia variable pesada y la cadena
ligera completa del péptido o proteína que tenga la especificidad
de antígeno del mAb D12 fusionada en las regiones constantes
pesadas
C_{H-1}-C_{H-3}
derivadas de un segundo anticuerpo humano.
En otra forma de realización más, el anticuerpo
de diseño de la invención puede tener ligado en sí un agente
adicional. Por ejemplo, puede usarse el procedimiento de la
tecnología del ADN recombinante para producir un anticuerpo de
diseño de la invención en el que el fragmento Fc o región CH2 CH3
de una molécula completa de anticuerpo se haya sustituido por una
enzima u otras moléculas detectables (es decir, un polipéptido
efector o molécula informadora).
Otra proteína deseable de esta invención puede
comprender un molécula completa de anticuerpo, que tenga cadenas
ligeras y pesadas de longitud completa, o cualquier fragmento
discreto de los anteriores, tal como los fragmentos Fab o
F(ab')_{2}, un dímero de cadena pesada, o cualquier mínimo
fragmento recombinante de los anteriores tal como un F_{v} o un
anticuerpo de cadena simple (SCA) o cualquiera otra molécula con la
misma especificidad que el donante seleccionado mAb D12. Dichas
proteínas pueden usarse en forma de un anticuerpo alterado, o pueden
usarse en su forma no fusionada.
Aunque el compañero de inmunoglobulina se derive
de un anticuerpo diferente del anticuerpo donante, por ejemplo,
cualquier isotipo o clase de marco de inmunoglobulina o regiones
constantes, o se selecciona mediante un programa informático como
una secuencia de consenso, como se ha definido anteriormente, dando
como resultado un anticuerpo de diseño. Los anticuerpos de diseño
pueden comprender regiones constantes de inmunoglobulina (Ig) y
regiones marco variables procedentes de una fuente, por ejemplo, el
anticuerpo aceptor o las secuencias de consenso, y uno o más (de
forma preferible todos) los CDR del anticuerpo donante, por ejemplo,
el anticuerpo \alpha_{v}\beta_{3}
anti-humano que se describe en el presente
documento. Además, pueden hacerse alteraciones, por ejemplo,
borrados, sustituciones, o adiciones, de la región marco de región
variable ligera y/o pesada del mAb aceptor en los niveles de ácido
nucleico o aminoácido, o las pueden fabricarse regiones CDR del
donante made con el objetivo de retener la especificidad de enlace
con el antígeno del anticuerpo donante o reducir la inmunogenicidad
potencial.
Dichos anticuerpos de diseño se diseñan para
emplear una (o ambas) de las cadenas variables pesadas y/o ligeras
del mAb \alpha_{v}\beta_{3} humano (modificado
opcionalmente tal como se describe) o una o más de las cadenas CDR
pesadas y/o ligeras que se identifican a continuación. Los
anticuerpos de diseño de la invención son neutralizantes, es decir,
inhiben de forma deseable en enlace de ligando con el receptor de la
vitronectina in vitro y in vivo en modelos animales de
enfermedades mediadas por el receptor \alpha_{v}\beta_{3},
por ejemplo, restenosis.
Dichos anticuerpos de diseño pueden incluir un
anticuerpo reformado humano que contiene las regiones constantes
humanas de cadena pesada y ligera fusionadas con fragmentos
funcionales del anticuerpo \alpha_{v}\beta_{3} humano. Un
anticuerpo aceptor adecuado humano (u otro animal) puede
seleccionarse a partir de una base de datos convencional por
ejemplo, la base de datos KABAT(R), la base de datos Los
Alamos, y la base de datos Swiss Protein, por homología al
nucleótido y secuencias de aminoácidos del anticuerpo donante. De
forma alternativa, puede usarse una secuencia de consenso formada
por todas las secuencias humanas conocidas en la base de datos de
un subgrupo cercano al del anticuerpo donante para suministrar las
regiones marco. Un anticuerpo humano caracterizados por una
homología en las regiones marco del anticuerpo donante (en una
aminoácido base) puede ser adecuado para proporcionar una región
constante de cadena pesada y/o una región marco variable de cadena
pesada para la inserción de los CDR del donante. Puede
seleccionarse en forma similar un anticuerpo aceptor adecuado capaz
de donar las regiones marco de cadena ligera constantes o variables.
Debe tenerse en cuanta que cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo
aceptor no se necesitan para originarse a partir del mismo
anticuerpo aceptor.
De forma deseable, el marco heterólogo y las
regiones constantes se seleccionan a partir de clases e isotipos de
inmunoglobulina humana, tales como IgG (subtipos 1 a 4), IgM, IgA e
IgE. Las regiones Fc no se limitan a las secuencias nativas, sino
que incluyen variantes mutantes conocidas en la técnica que alteran
la función. Por ejemplo, se han descrito mutaciones en los donantes
Fc de ciertos anticuerpos IgG que reducen el complemente
Fc-mediado y el enlace al receptor Fc [ver por
ejemplo, A. R. Duncan et al., 1988, Nature,
332:563-564; UN. R. Duncan y G. Winter, 1988,
Nature, 332:738-740; M. L. Alegre
et al., 1992, J. Immunol.,
148:3461-3468; M. -H. Tao et al.,
1993, J. Exp. Med.,
178:661-667; V. Xu et al, 1994,
J. Biol. Chem., 269:3469-2374] y
alteran la velocidad de rotura [J. -K. Kim et al.,
1994, Eur. J. Immunol.,
24:542-548] y reducen la heterogeneidad
estructural [S. Angal et al., 1993, Mol.
Immunol., 30:105-108]. Igualmente, son
posibles otras modificaciones tales como oligomerización del
anticuerpo por adición de un segmento de la parte terminal de IgM y
otras mutaciones [R. I. F. Smith y S. L. Morrison, 1994,
Biotechnology, 12:683-688; R. I. F.
Smith et al., 1995, J. Immunol., 154:
2226-2236] o la adición del segmento de la parte
terminal IgA [I. Kariv et al., 1996, J.
Immunol., 157: 29-38]. Sin embargo, el
anticuerpo aceptor no necesita comprender solo secuencias de
proteínas de la inmunoglobulina humana. Por ejemplo, se puede
construir un gen en el que una secuencia de ADN que codifica parte
de una cadena de inmunoglobulina humana se fusiona con una secuencia
de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos de no
inmunoglobulina tales como un polipéptido efector o molécula
informadora.
Un ejemplo de un anticuerpo alterado
particularmente deseable es un anticuerpo humanizado que contiene
todo o una parte de las secuencias de aminoácidos de región
variable de D12, y algunas partes de las regiones marco del
anticuerpo donante, o CDR de los anteriores insertados en las
regiones marco de un anticuerpo humano seleccionado. Este anticuerpo
humanizado se dirige al receptor \alpha_{v}\beta_{3}. De
forma adecuada, en estos anticuerpos humanizados, dos o de forma
preferible tres CDR procedentes de las regiones variables de cadena
pesada y/o cadena ligera del anticuerpo D12 se insertan en las
regiones marco de un anticuerpo humano seleccionado o secuencia de
consenso, sustituyendo los CDR nativos del último anticuerpo o
secuencia de consenso.
De forma preferible, en un anticuerpo humanizado,
las regiones variables en ambas cadenas ligeras y pesadas humanas
se han diseñado mediante una o más sustituciones de CDR. Es posible
usar los seis CDR, o diferentes combinaciones de menos de seis CDR.
Por ejemplo, es posible sustituir los CDR únicamente en la cadena
pesada humana, usando como cadena ligera la cadena ligera no
modificada procedente del anticuerpo humano aceptor. De forma
alternativa, se puede seleccionar una cadena ligera compatible de
otro anticuerpo humano por recurso a las bases de datos
convencionales de anticuerpo. El resto del anticuerpo de diseño
puede derivarse de cualquier aceptor adecuado de inmunoglobulina
humana.
El anticuerpo alterado por tanto de forma
preferible tiene la estructura de un anticuerpo humano natural o un
fragmento del anterior, y posee la combinación de propiedades que se
requiere para un uso terapéutico efectivo, por ejemplo, tratamiento
de las enfermedades mediadas por el receptor
\alpha_{v}\beta_{3} humano, o en usos diagnósticos.
Deberá entenderse por aquellas personas expertas
en la técnica que un anticuerpo alterado puede modificarse además
mediante cambios en los aminoácidos de la región variable sin que
necesariamente afecten a la especificidad y elevada afinidad del
anticuerpo donante (es decir, un análogo). Se anticipa que los
aminoácidos de cadena pesada y ligera pueden sustituirse por otros
aminoácidos tanto en los marcos de región variable o en los CDR, o
en ambos. Se prefiere particularmente la edición inmunológica
dichas secuencias reconstruidas como se ilustra en los ejemplos en
el presente documento.
Además, la región variable o constante puede
alterarse para mejorar o disminuir las propiedades selectivas de
las moléculas de la presente invención. Entre dichas propiedades se
pueden incluir, por ejemplo, la dimerización, enlace con los
receptores Fc, o la capacidad de ligarse y activar complementos [ver
por ejemplo, Angal et al., 1993, Mol.
Immunol., 30:105-108; Xu et al.,
1994, J. Biol. Chem.,
269:3469-3474; Winter et al., EP
307,434-B].
Dichos anticuerpos son útiles en la prevención y
tratamiento de las enfermedades mediada por el receptor
\alpha_{v}\beta_{3} humano tal como se describe a
continuación.
Los anticuerpos reformados y diseñados humanos,
humanizados y quiméricos de esta invención pueden expresarse en
células huésped recombinantes, por ejemplo, COS, CHO o células de
mieloma, con ayuda de la tecnología del ADN recombinante que usa
técnicas de diseño genético. Pueden emplearse también las mismas
técnicas, o similares, para generar otras formas de realización de
esta invención.
Brevemente descrito, se produce a un vector de
expresión convencional o plásmido recombinante situando estas
secuencias de codificación del anticuerpo alterado en asociación
operativa con secuencias de control de regulación convencional
capaces de controlar la replicación y expresión y/o secreción de una
célula huésped. Las secuencias reguladoras incluyen secuencias de
promotor, por ejemplo, promotor CMV, y secuencias señal, que se
pueden derivar de otros anticuerpos conocidos De manera similar, se
puede producir un segundo vector de expresión vector que tenga una
secuencia de ADN que codifique una cadena ligera o pesada en un
anticuerpo complementario. De forma preferible, este segundo vector
de expresión es idéntico al primero, excepto en que puesto que las
secuencias de codificación y u marcadores seleccionables están
implicados, de forma que para asegurar tanto como sea posible que
cada cadena de polipéptido se expresa de forma funcional. De forma
alternativa, las secuencias de codificación de las cadenas pesada y
ligera del anticuerpo alterado puede descansar en un único
vector.
Una célula huésped seleccionada se
co-transfecta mediante técnicas convencional con
ambos vectores primero y segundo (o se transfecta simplemente con un
único vector) para crear la célula huésped transfectada de la
invención que comprende ambas cadenas ligera y pesada, ambas
recombinantes o sintéticos. La célula transfectada se cultiva a
continuación mediante técnicas convencionales para producir el
anticuerpo de diseño de la invención. La producción del anticuerpo
que incluye la asociación de ambas cadenas recombinantes de cadena
pesada y ligera se mide en el cultivo con un ensayo adecuado, tales
como ELISA o RIA. Se pueden emplear técnicas convencionales
similares para construir otros anticuerpos alterados y moléculas de
esta invención.
Los vectores adecuados para las etapas de
clonación y subclonación que se emplean en los procedimiento y en
la construcción de las composiciones de esta invención pueden
seleccionarse por alguien experto en la técnica. Por ejemplo, se
pueden usar las series pUC convencionales de vectores clonantes. Un
vector usado es pUC19, que está comercialmente disponible da casas
suministradoras tales como Amersham (Buckinghamshire, Reino Unido) o
Pharmacia (Uppsala, Suecia). De forma adicional, puede usarse para
la clonación cualquier vector que sea capaz de replicarse con
facilidad, tenga abundancia de emplazamientos de clonación y genes
seleccionables (por ejemplo, resistencia a los antibióticos), y que
se manipulen con facilidad. De esta forma, la selección del vector
de clonación no es un factor limitante en esta invención.
De manera similar, los vectores empleados para la
expresión de los anticuerpos de diseño de acuerdo con esta
invención pueden seleccionarse por alguien experto en la técnica a
partir de cualesquiera vectores convencionales. Los vectores
preferidos incluyen, por ejemplo, plásmidos pCD o pCN. Los vectores
pueden contener también secuencias regulatorias seleccionadas (tales
como promotores CMV) que dirigen la replicación y expresión de
secuencias de ADN heterólogo en células huésped seleccionadas. Estos
vectores contienen las secuencias de ADN anteriormente descritas
que codifican el anticuerpo de diseño o la región codificante de la
inmunoglobulina alterada. Además, los vectores pueden incorporar las
secuencias de inmunoglobulina seleccionadas modificadas por la
inserción de emplazamientos de restricción deseables para una
manipulación rápida.
Los vectores de expresión pueden caracterizarse
también por genes adecuados para amplificar la expresión de las
secuencias de ADN heterólogo, por ejemplo, el gen de la hidrofolato
reductasa (DHFR) de mamíferos. Otras secuencias preferibles del
vector incluyen una secuencia de señal de poliadenilación (poli A),
tal como al que procede de la hormona bovina del crecimiento (BGH)
y la secuencia del promotor de la betaglobina (betaglopro). Los
vectores de expresión útiles en el presente documento pueden
sintetizarse mediante técnicas bien conocidas de los expertos en la
técnica.
Los componentes de dichos vectores, por ejemplo,
replicones, genes de selección, mejoradotes, promotores secuencias
de señal, y similares, pueden obtenerse de fuentes comerciales o
naturales, o sintetizadas mediante procedimientos conocidos para
usar en la dirección de la expresión y/o secreción del producto el
ADN recombinante en el huésped seleccionado. Otros vectores de
expresión adecuados de los que se conocen números tipos en la
técnica para expresión en mamíferos, bacterias, insectos, levaduras
y hongos pueden seleccionarse también con este objeti-
vo.
vo.
La presente invención también incluye una célula
transfectada con un plásmido recombinante que contendrá las
secuencias de codificación de los anticuerpos de diseño o moléculas
de inmunoglobulina alterada de los anteriores. Las células huésped
útiles para la clonación y otras manipulaciones de estos vectores
clonantes son convencionales también. Sin embargo, se usan células
de diferentes cepas de E. Coli para la replicación de los
vectores de clonación y otras etapas de la construcción de los
anticuerpos alterados de esta invención.
Las células huésped o líneas de células adecuadas
para la expresión del anticuerpo de diseño o anticuerpo alterado de
la invención son de forma preferible células de mamífero tales como
CHO, COS, una célula de fibroblasto (por ejemplo, 3T3), y células
mieloides, y de forma más preferible un CHO o una célula mieloide.
Pueden usarse células humanas, permitiendo de esta forma que la
molécula se modifique con rutas humanas de glicosilación. De forma
alternativa, pueden emplearse otras líneas celulares eucariotas. La
selección de las células huésped de mamífero adecuadas y los
métodos de transformación, cultivo, amplificación, selección y
producción y purificación del producto son conocidas en la técnica.
Ver por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular
Cloning (A Laboratory Manual), 2ª ed., Cold Spring Harbor
Laboratory (New York).
Las células bacterianas han demostrado ser útiles
como células huésped adecuadas para la expresión de los Fab
recombinantes de la presente invención [ver por ejemplo, Pluckthun,
A., 1992, Immunol. Rev.,
130:151-188]. La tendencia de las proteínas
expresadas en las bacterias celulares para estar en una forma
desplegada, o plegada de forma inapropiada, o en forma no
glicosilada no resulta un problema grave puesto que los Fab no
están normalmente glicosilados, y pueden diseñarse para exportar la
expresión a la vez que reducen la elevada concentración que
facilitan un plegado erróneo. Por esta razón, cualquier Fab
recombinante producido en una célula bacteriana deberá
seleccionarse buscando la retención de la capacidad enlazante con el
antígeno. Si la molécula expresada por la célula bacteriana se
produce y exporta en la forma adecuadamente plegada, dicha célula
bacteriana será un huésped deseable. Por ejemplo, varias cepas de
E. Coli usadas para expresión son bien conocidas como
células huésped en el campo de la biotecnología. Pueden emplearse
también varias cepas de B. subtilis, Streptomyces,
otros bacilos y similares en este procedimiento.
Si se desea, están disponibles como células
huésped varias cepas de levaduras conocidas por aquellas personas
expertas en la técnica, así como células de insectos, s, por
ejemplo Drosophila y Lepidoptera y sistemas de
expresión viral. Ver por ejemplo Miller et al., 1986,
Genetic Engineering, 8:277-298 y las
referencias que se citan en el mencionado documento.
Los procedimientos generales mediante los que se
construyen los vectores de la invención, los procedimientos de
transfectación requeridos para producir las células huésped de la
invención, y los procedimientos de cultivo necesarios para producir
el anticuerpo alterado de la invención a partir de dichas células
huésped son todas técnicas convencionales. De forma similar, una
vez producidos, los anticuerpos alterados de la invención pueden
purificarse del contenido del cultivo celular de acuerdo con
procedimientos habituales en la técnica, entre los que se incluyen
precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad,
cromatografía en columna, electroforesis en gel, y similares.
Dichas técnicas están entre las habilidades de los expertos en la
técnica, y no limitan la invención.
Otro procedimiento más para las expresión de
anticuerpos reformados puede utilizar la expresión en un animal
transgénico, tal como el que se describe en la Patente de los
Estados Unidos Nº 4.873316, que se incorpora como referencia en el
presente documento.
Una vez expresado según el procedimiento deseado,
el anticuerpo de diseño se examina buscando su actividad in
vitro mediante un ensayo apropiado. Se emplean formatos
convencionales en la actualidad como ELISA para evaluar cualitativa
y cuantitativamente el enlace del anticuerpo alterado con el
receptor \alpha_{v}\beta_{3} humano. Ver el Ejemplo 3 a
continuación. De forma adicional, pueden usarse otros ensayos in
vitro (tales como el Ejemplo 12) y modelos animales in
vivo (tales como Ejemplo 15) para verificar la eficacia
neutralizante antes de los siguientes estudios clínicos con seres
humanos realizados para evaluar la persistencia del anticuerpo
alterado en el cuerpo, a pesar de los mecanismos de rotura
habituales.
Como ejemplo específico del proceso de producción
descrito anteriormente, se genera y expresa un anticuerpo
humanizado D12 tal como se describe en detalle en Ejemplo 13 a
continuación.
Esta invención también se refiere a un
procedimiento para tratar seres humanos que experimenten síntomas
relacionados con enfermedades mediadas por el receptor
\alpha_{v}\beta_{3} humano, que comprende administrar una
dosis efectiva de anticuerpos incluyendo uno o más de los
anticuerpos alterados que se describen en el presente documento, o
fragmentos de los anteriores. Los anticuerpos de esta invención son
útiles para tratar enfermedades en las que las patologías
subyacentes se pueden atribuir al ligando que interactúa con el
receptor de la vitronectina. Por ejemplo, estos anticuerpos son
útiles como agentes antitumorales,
anti-angiogénicos,
anti-inflamatorios y
anti-metastáticos, y son particularmente útiles para
el tratamiento de aterosclerosis, restenosis, metástasis de cáncer,
artritis reumatoide, retinopatía diabética y degeneración
macular.
De manera similar, estos anticuerpos son útiles
para el tratamiento de dolencias en las que la pérdida de matriz
ósea origina patologías. Así, estos anticuerpos son útiles para el
tratamiento de la osteoporosis, hiperparatiroidismo, enfermedad de
Paget, hipercalcemia de malignidad, lesiones osteolíticas
producidas por metástasis del hueso, pérdida de hueso debida a
inmovilización o deficiencia de hormonas sexuales.
Los anticuerpo alterados y mAb de esta invención,
que son específicos frente al receptor \alpha_{v}\beta_{3}
de la integrina receptor son útiles terapéuticos debido a su
"elevada vida media" (\sim 21 días) y funciones adicionales
de efector (por ejemplo, fijación de complemento). El receptor
\alpha_{v}\beta_{3} expresado en los vasos sanguíneos
proporciona un acceso sencillo con mAb. Además, estos anticuerpos de
la presente invención son útiles para la liberación de fármacos
diana, en cuyo caso pueden mejorar la liberación de fármacos (es
decir, como inmunoconjugados, o inmunoliposomas). Puede bloquearse
la restenosis bloqueando la formación de neointima; o promoviendo el
remodelado. Las migración de las células vasculares de la
musculatura lisa (USMC) se media a través del receptor
\alpha_{v}\beta_{3} que se sobreregula después de una lesión
vascular (documentado por histología) y osteopontina, un ligando de
\alpha_{v}\beta_{3}, que también se sobreregula después de
una lesión vascular. Por tanto, los antagonistas del receptor
\alpha_{v}\beta_{3}, es decir, los anticuerpos y anticuerpos
alterados descritos en el presente documento pueden bloquear la
formación de neointima y mejorar el remodelado favorable del
vaso.
La angiogénesis es el proceso de formación de
nuevos vasos sanguíneos a partir de un vaso sanguíneo preexistente
en respuesta a un estímulo angiogénico. Se pueden también usar los
anticuerpos y composiciones de esta invención para tratar
enfermedades que tengan componentes angiogénicos, entre los que se
incluyen, sin limitación, tumores sólidos, metástasis de cáncer,
artritis reumatoide, enfermedades inflamatorias crónicas,
aterosclerosis, retinopatía diabética y degeneración macular. En
cáncer, tratar la angiogénesis representa marcar (tratar) el propio
huésped que es independiente del fenotipo de las células
cancerosas. Las composiciones de esta invención que son antagonistas
del receptor \alpha_{v}\beta_{3} son eficaces frente a
enfermedades con componentes angiogénicos porque el
\alpha_{v}\beta_{3} se sobreregula en la neovasculatura
durante la angiogénesis. Un
anti-\alpha_{v}\beta_{3} inhibe la
angiogénesis en la membrana corioalantoide en huevos de gallina
(CAM) promueve la apoptosis en células endoteliales, e inhibe el
crecimiento tumoral en el modelo de ratón
humano-SCID. La inhibición de
\alpha_{v}\beta_{3} evita el crecimiento de neovasculatura
(sin efecto sobre los vasos madu-
ros).
ros).
Así, la respuesta terapéutica que se induce por
el uso de las moléculas de esta invención se produce por el enlace
al receptor de la vitronectina \alpha_{v}\beta_{3} y por
tanto bloqueando así la progresión de la enfermedad. Por tanto, las
moléculas de la presente invención, cuando están en preparaciones y
formulaciones adecuadas para uso terapéutico, son altamente
deseables para aquellas personas que experimentan enfermedades
mediadas por el receptor \alpha_{v}\beta_{3} humano. Por
ejemplo, pueden ser deseables tratamientos más prolongados cuando se
tratan enfermedades crónicas, o similares. La dosis y duración del
tratamiento están relacionadas con la duración relativa de las
moléculas de la presente invención en el torrente sanguíneo humano,
y puede ajustarse por un experto en la técnica dependiendo de la
dolencia a tratar y de la salud general del paciente.
Los anticuerpos alterados, anticuerpos y
fragmentos de los anteriores de esta invención pueden también usarse
en solitario o combinados con otros anticuerpos, particularmente
humanos o humanizados, o anticuerpos humanos reactivos con otros
epítopos del receptor de la vitronectina como agentes
profilácticos.
El modo de administración de los agentes
terapéuticos y profilácticos de la invención puede ser cualquier
ruta adecuada que presente el agente al huésped. Los anticuerpos
alterados, anticuerpos, anticuerpos de diseño, y fragmentos de los
anteriores, y composiciones farmacéuticas de la invención son
particularmente útiles para administración parenteral, es decir, por
vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, o intranasal.
Los agentes terapéuticos y profilácticos de la
invención pueden prepararse en forma de composiciones farmacéuticas
que contengan una cantidad efectiva del anticuerpo alterado de la
invención como ingrediente activo en un vehículo farmacéuticamente
aceptable. Se prefiere una suspensión o solución acuosa que contenga
el anticuerpo, de forma preferible tamponada a pH fisiológico, en
forma apta para la inyección. Las composiciones para administración
parenteral comprenderán habitualmente una solución del anticuerpo de
diseño de la invención o un cocktail de los anteriores disueltos en
un vehículo farmacéuticamente aceptable, de forma preferible un
vehículo acuoso. Pueden emplearse diferentes vehículos acuosos, por
ejemplo solución salina al 0,4%, glicina al 0,3%, y similares.
Estas soluciones son estériles, prácticamente libres de materia
particulada. Estas soluciones pueden esterilizarse mediante técnicas
de esterilización convencionales y bien conocidas (por ejemplo,
filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares
farmacéuticamente aceptables que se necesitan para aproximar las
condiciones fisiológicas, tales como agentes ajustadores del pH,
tampones, etc.
La concentración del anticuerpo de la invención
en dicha formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es
decir, de menos de aproximadamente 0,5%, usualmente o al menos
aproximadamente 1%, como máximo 15 ó 20% en peso y se seleccionará
principalmente en función del los volúmenes de fluidos,
viscosidades, etc., de acuerdo con el modo concreto de
administración seleccionado.
Así, puede prepararse una composición
farmacéutica de la invención para inyección intramuscular para
contener 1ml de agua tamponada estéril, y entre aproximadamente 1
ng a aproximadamente 100 mg de un anticuerpo de diseño de la
invención. De forma deseable, las composiciones pueden contener de
aproximadamente 50 ng a aproximadamente 80 mg de anticuerpo, o de
forma más preferible, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 75
mg de anticuerpo de acuerdo con esta invención. De manera similar,
se puede preparar una composición farmacéutica de la invención para
infusión intravenosa para contener aproximadamente 250 ml de
solución de Ringer estéril, y de aproximadamente 1 a aproximadamente
75 y de forma preferible de 5 a aproximadamente 50 mg/ml de un
anticuerpo de diseño de la invención. Los procedimientos actuales
para preparar composiciones que se pueden administrar por vía
parenteral son bien conocidas o evidentes para aquellos que sean
expertos en la técnica, y se describen con mayor detalle en, por
ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 15ª ed., Mack
Publishing Company, Easton, Pa.
Se prefiere que los agentes terapéuticos y
profilácticos de la invención, cuando se encuentran en una
preparación farmacéutica, lo hagan en forma de dosis unitaria. La
dosis terapéuticamente efectiva apropiada se determinará fácilmente
por aquellos que sean expertos en la técnica- Para tratar de forma
efectiva un trastorno inflamatorio en un ser humano u otros
animales, se deberá administrar por vía parenteral una dosis de
aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 20 mg por 70 kg de peso
corporal de una proteína o anticuerpo de esta invención, de forma
preferible i.v. o i.m. (intramuscular). Dichas dosis pueden, si es
necesario, repetirse en los intervalos apropiados de tiempo que
seleccionará el médico a cargo del paciente.
Los anticuerpos, anticuerpos alterados o
fragmentos de los anteriores descritos en el presente documento
pueden liofilizarse para el almacenamiento y reconstituirse en un
vehículo adecuado antes del uso. Esta técnica ha demostrado ser
efectiva con inmunoglobinas convencionales, y se pueden utilizar las
técnicas de liofilización y reconstitución.
En otro régimen terapéutico alternativos, los
anticuerpos alterados y anticuerpos monoclonales de esta invención
pueden usarse en terapia combinada para las enfermedades descritas
anteriormente con moléculas pequeñas no peptídicas antagonistas del
receptor de la vitronectina. Dichas pequeñas moléculas
antagonistas, sus dosis y regímenes de administración se describen
en, por ejemplo, Publicación de patente internacional PCT Nº
WO96/00730, publicada el 11 de enero de 1996 y Publicación de
patente internacional PCT Nº WO96/00574, publicada el 11 de enero de
1996, ambas se incorporan como referencia en el presente documento.
Dichas terapias de combinación pueden implicar la administración de
un anticuerpo de esta invención a un paciente durante un corto
periodo, es decir, de pocos meses a seis meses, seguido de un
tratamiento terapéutico crónico con la pequeña molécula antagonista
durante un periodo de tiempo más largo. En otra forma de
realización, esta forma de realización de un procedimiento de
tratamiento puede implicar alternar periodos de tratamiento de
administración de inmunoterapia con los anticuerpos de esta
invención seguido de tratamientos con antagonistas no peptídicos de
pequeño tamaño. Dicha combinación de procedimientos terapéuticos
emplearía las mismas dosificaciones que se han descrito
anteriormente para la inmunoterapia, y las dosificaciones
especificadas en las anteriormente citadas solicitudes de patente
para terapias no peptídicas.
Los anticuerpos alterados y anticuerpos de diseño
de esta invención pueden también usarse en regímenes de
diagnóstico, tales como para la determinación de trastornos
mediados por el receptor \alpha_{v}\beta_{3} humano, o el
seguimiento del progreso del tratamiento de dichos trastornos. Como
reactivos para diagnóstico, estos anticuerpos alterados pueden
marcarse de forma convencional para usarse en ELISA y otros formatos
de ensayo convencionales para la medida de los niveles del receptor
\alpha_{v}\beta_{3} humano en suero, plasma u otros tejidos
apropiados, o la liberación por células humanas en cultivo. La
naturaleza del ensayo en el que se unan los anticuerpos alterados
es convencional, y no limita esta descripción.
Los siguientes ejemplos ilustran diferentes
aspectos de esta invención entre los que se incluyen la
construcción de anticuerpos de diseño de ejemplo y la expresión de
los anteriores en vectores y células huésped adecuados, y no deben
entenderse como limitantes del alcance de esta invención. Todos los
aminoácidos se identifican mediante códigos convencionales de tres
letras o de letra única. Todos los enzimas de restricción,
plásmidos, y otros reactivos y materiales necesarios se obtuvieron
de fuentes convencionales, a no ser que se indique otra cosas. Todas
las ligaduras de clonación y el resto de la metodología de ADN
recombinante fueron como se realiza en T. Maniatis et al. o
en Sambrook et al., ambas referencias citadas
anteriormente.
El receptor de la proteína humana
\alpha_{v}\beta_{3} y el resto de receptores de proteína se
purificaron a partir de placenta humana como sigue. Las placentas se
congelaron inmediatamente después del nacimiento, a continuación se
descongelaron parcialmente, y se cortaron en trozos pequeños que se
picaron en trocitos usando una picadora de carne convencional.
Normalmente, se picaron a la vez de cinco a diez placentas, las
piezas se colocaron en tubos de centrífuga de 50 ml (6 tubos por
placenta) y se almacenan congeladas a -20ºC hasta uso.
Se preparó una columna de immunoafinidad para
cada integrina usando anticuerpos monoclonales individuales. El mAb
anti-\alpha_{v}\beta_{3} (LM609) se
purificó a partir de ascitis de ratón conseguidos de Chemicon
Internacional, Inc. (Temecula, CA.). Los anticuerpos monoclonales
23C6 o D12 se purificaron a partir de medio de hibridoma. El mAb
anti-\alpha_{v}\beta_{5} (P1F6) y el mAb
anti\alpha_{v}\beta_{1} (mAb16) se consiguieron de Becton
Dickinson. LM609 o 23C6 o D12 (50 mg), P1F6 (25 mg), y el mAb16 (25
mg) se inmovilizaron en AffiGel 10 (BioRad) a 5 mg de mAb/ml de
resina siguiendo las instrucciones del fabricante. Con el objetivo
de eliminar las proteínas ligantes no específicas, se trataron
aproximadamente 20 ml de AffiGel 10 con Tris HCl 1 M pH 7,5 y se
empaquetaron en una Econo Column. El mAb inmobilizado se empaquetó
en una Econo Column (BioRad), 10 ml de columna para LM609 o 23C6 o
D12, una de 5 ml para P1F6 y una de 5 ml para mAb16. Las columnas se
conectaron en tándem: la primera columna contenía AffiGel 10 para
enlace no específico, la segunda columna contenía mAb
\alpha_{v}\beta_{3}, la tercera columna contenía el mAb
\alpha_{v}\beta_{1} mAb y la cuarta columna contenía el mAb
\alpha_{v}\beta_{5}. Las columnas se equilibraron con
tampón T (TrisHCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,1 M, CaCl_{2} mM, octil
glucósido al 1%) en una cámara refrigerada.
La placenta picada (9 tubos) se descongeló
parcialmente y se dispersó completamente con una espátula en tampón
T + octil glucósido al 6% (la concentración final de OG fue de 3%).
La mezcla se almacenó durante 5 horas o durante la noche a 4ºC. El
volumen de solución se transfirió a botellas de centrífuga de 250
ml, que se centrifugaron a 13.000 rpm durante una hora. El
sobrenadante se transfirió a tubos de centrífuga de 50 ml que se
centrifugaron a 20.000 rpm durante una hora. El sobrenadante
transparente se combinó y cargó a un caudal de 30 ml/hora a las
columnas colocadas y preequilibradas con tampón T en modo tándem
como se ha descrito anteriormente. Al final de la carga, las
columnas se lavaron con >250 ml de tampón T. A continuación, las
columnas individuales se separaron, y las integrinas ligadas se
eluyeron con ácido acético 0,2 M hasta que el pH del eluato alcanzó
<3,0. Las soluciones eluídas de integrina se neutralizaron
rápidamente a >pH 7 con base Trizma 1M. La columna se neutralizó
también por lavado con tampón T.
Las soluciones eluídas de integrina (\sim25 ml)
se concentraron hasta aproximadamente.1 ml usando Aquaside III
(Calbiochem) en una bolsa para diálisis con un corte de 5000. Las
integrinas concentradas se dializaron durante la noche de nuevos
frente a tampón T. El rendimiento final fue aproximadamente de 1 mg
para cada integrina por placenta.
Se generaron mAb de murina con actividad
anti-\alpha_{v}\beta_{3} según la
tecnología clásica del hibridoma, de acuerdo con Lane el al,
1986, Proceedings in Enzymol., 121:183. Por lo
general, 20-50 \mug de receptor
\alpha_{v}\beta_{3} se administró ip, sc, e iv a dos
ratones Balb/c. Se ensayó suero procedente de los animales
inmunizados buscando su actividad de enlace
anti\alpha_{v}\beta_{3} y neutralizante en los ensayos de
los Ejemplos 3, 4 y 5 siguientes. Bazo de ratón procedente de
ratones que presentaron suero positivo se fusionaron con células
SP2 de mieloma de ratón de acuerdo con los procedimientos de Lane
et al, citados anteriormente. Se obtuvieron diecisiete líneas
celulares de hibridoma, secretando posibles anticuerpos de la
proteína anti-\alpha_{v}\beta_{3} humana.
Estos mAb anti-\alpha_{v}\beta_{3} se
generaron y aislaron a partir del cultivo mediante procedimientos
convencionales, y ensayados en los ensayos de los siguientes
ejemplos.
La Tabla I es un resumen de muchos de los
primeros datos recogidos de los Ejemplos 3-12
siguientes sobre el mAb de murina LM609 de la técnica anterior y el
mAb de murina de esta invención. Los datos muestran que el mAb D12
que funciona adecuadamente en estos ensayos se selecciono
posteriormente para su humanización como se describe en el Ejemplo
13, y además se ensayó en los modelos animales de los Ejemplos 16 y
17. El mAb D12 tuvo reacciones cruzadas con conejo, por tanto, solo
son aplicables para la eficacia del ensayo los modelos de conejo
para la restenosis, angiogénesis o aterosclerosis.
Se determinó el enlace de diferentes
construcciones de anticuerpo frente a la proteína del receptor
\alpha_{v}\beta_{3} de la placenta humana purificada como
antígeno. (el receptor se enlaza bien a la meseta o a las perlas
mediante biotina-avidina) en un ensayo ELISA
normalizado de fase sólida.
Se adsorbió antígeno diluido en CO_{3} pH 9,2
sobre microplacas de fondo redondo de poliestireno (Dynatech,
Immunolon II) durante18 horas. A continuación, los pocillos se
lavaron una vez con solución salina tamponada (PBS) que contenía
Tween 20 al 0,05%. Los anticuerpos (50 \mu/pocillo) se diluyeron
hasta concentraciones variables en PBS/Tween 20 al 0,05% y se
añadieron a pocillos recubiertos de antígeno durante dos horas a
temperatura ambiente. Las placas se lavaron cuatro veces con PBS que
contenía Tween 20 al 0,05%, usando un lavador de microplacas
Titertek 320, seguido de la adición de IgG anti-
HRP-de -ratón (100 \mul/pocillo) dilución
1:10,000,
Después de lavar cinco veces, se añadió
diclorhidrato de o-fenilendiamina (OPD) (1 mg/ml),
y las placas se incubaron 10 minutos más. La reacción se detuvo
mediante adición de NaF 0,1M, y se leyó la absorbancia a 450 nm
usando un lector Dynatech MR 7000 ELISA.
Los mAb positivos del ensayo del Ejemplo 3 se
seleccionaron usando los mismos protocoles, excepto en que el
antígeno fue otro receptor humano, \alpha_{v}\beta_{3},
\alpha_{v}\beta_{5},\alpha_{v}\beta_{1}
\alpha_{II}\beta_{3}. Estos ensayos se realizaron para
determinar la selectividad respecto del antígeno heterodimérico
\alpha_{v}\beta_{3}, en oposición a la selectividad para
una subunidad \alpha o \beta sola. Los resultados de estos
ensayos se muestran en la Tabla 1 para todos los mAb del Ejemplo 2,
y para LM609.
Se añadió receptor de la vitronectina
\alpha_{v}\beta_{3} (0,2 ug/pocillo), purificado a partir
de placenta humana a placas ELISA de 96 pocillos (Corning, New York,
N.Y.). Las placas se incubaron durante la noche a 4ºC. En el
momento del experimento, los pocillos se aspiraron e incubaron en
0,1 ml de Tampón UN (Tris50 mM, NaCl 100 mM, CaCl_{2} 1 mM,
MgCl_{2} 1 mM, MnCl_{2}1 mM, pH 7,4) conteniendo albúmina de
suero bovino al 3% (BSA) durante 1 hora a temperatura ambiente para
bloquear los enlaces no específicos. Tras aspirar la solución
bloqueante, se añadieron diferentes concentraciones de mAb a los
pocillos, y se continuó con la adición de fibrinógeno biotilinado en
0,1 ml de Tampón UN que contenía BSA al 0,1%. Las placas se
incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente.
Tras la incubación, los pocillos se aspiraron
completamente y se lavaron dos veces con 100 \mul de tampón
enlazante. El fibrinógeno ligado se cuantifico por adición de 0,1
ml de un anticuerpo anti-biotina conjugado a
fosfatasa alcalina (dilución 1:2000, Sigma), seguido de dos lavados
con tampón enlazante y la adición 100 \mul del substrato
p-nitrofenil fosfato preparado diariamente de
acuerdo con las instrucciones del fabricante (kit de sustrato
fosfato alcalino, Bio-Rad). Se siguió el desarrollo
de la cinética del color usando un microtiter lector de placas.
Este ensayo detectó la inhibición del enlace
entre el receptor purificado \alpha_{v}\beta_{3} y su
ligando, la fibronectina. Los resultados de estos ensayos se recogen
en la Tabla I anterior para todos los mAb del Ejemplo 2 y para
LM609.
Para caracterizar varios de los mAb de murina
obtenidos tal como se describe anteriormente para el mAb de murina
conocido anterior LM609, se realizó este ensayo para detectar en
enlace con los receptores de la superficie de una célula nativa, y
la reactividad cruzada de las especies.
Brevemente descrito, las células se lavan 10 ml
de PBS frío, y se resuspenden en PBS frío para dar entre 1 X
10^{7} a 2 X 10^{7} células/ml. Se añadieron alícuotas de 0,1
ml/pocillo a placas de 96 pocillos con fondo en "V". A
continuación, se añadieron 25 \mul de anticuerpo primario. Las
placas se agitaron durante cinco minutos, y a continuación se
incubaron en hielo durante 25 minutos. Después de esto, los
contenidos de cada pocillo se resuspendieron en 50 \mul de PBS
frío, y se centrifugaron y vaciaron. Se repitió el lavado, y los
contenidos se resuspendieron en 50 \mul de PBS frío. Se añadió a
cada pocillo anticuerpo secundario marcado con isotiocianato de
fluoresceína (FICT) (50 \mul). Las placas se agitaron durante
cinco minutos, y se incubaron en hielo en la oscuridad durante 20
minutos. Se añadió un \mul de yoduro de propidio (PI) (1
mg/ml)/PBS hasta una concentración final de 10 \mug/ml (1 \mug
en 0,1 ml). Se continuó con la incubación durante cinco minutos,
seguido de centrifugación y lavado por dos veces con PBS frío.
Las células se resuspendieron en 0,1 ml de PBS
frío, y se transfirieron a tubos Falcoln de 12 X 75 limpios. El
volumen se ajustó a 1 ml, y las células se mantuvieron en frío en
la oscuridad hasta la lectura mediante FLUJO.
El anticuerpo secundario:cabra
Anti-Ratón IgG,M,UN se marcó con FITC 1:25/PBS- 0,2%
BSA-0,1% NaN_{3} (Sigma F1010 lote#045H8822) y se
mantuvo en frío en la oscuridad hasta la lectura mediante FLUJO.
Los resultados de estos ensayos se recogen en la
Tabla I anterior para todos los mAb del Ejemplo 2 y para LM609,
citometría de flujo usando células de musculatura lisa de conejo y
ser humano (SMC) indicando que tanto el mAb LM609 como el D12
presenten una gran capacidad para enlazar un receptor nativo en la
superficie celular.
Los mAb de murina y humanizado del Ejemplo 13 se
ensayaron mediante citometría de flujo usando procedimientos que
esencialmente se han establecido con anterioridad para su capacidad
de detectar el receptor \alpha_{v}\beta_{3} sobre células
endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), células de riñón de
embrión humano (HEK 293), y células del músculo liso de conejo
(RSMC). La Fig. 8 indica que las afinidades del mAb de murina D12,
y el mAb humanizado HZ-D12 IgG_{1} y
HZ-D12 IgG_{4} (ver el Ejemplo 13) son
comparables a las de las células humanas (HUVEC y HEK 293). El mAb
humanizado pierde parte de su afinidad cuando se ensaya sobre el SMC
de conejo. Este resultado se esperaba porque el mAb D12 tiene una
afinidad 10 veces superior frente al \alpha_{v}\beta_{3}
humano que frente al receptor del conejo.
A. Se llevó a cabo inmunohistología sobre los
tejidos que expresan elevados niveles de receptores, tales como
osteoclastoma humano. Los datos de la inmunohistología
(osteoclastoma humano) muestran que D12 puede presentar una
capacidad de detección ligeramente superior a la del LM609, Ver la
Tabla I.
Las posterior inmunohistología en otros tejidos
humanos tumorales como indica la tabla II muestra que los tumores
humanos expresan el receptor \alpha_{v}\beta_{3} y por
tanto, representan buenas dianas para inmunoterapia con los
anticuerpo humanizados y otras composiciones de esta invención. El
mAb D12, entre los que se incluyen el mAb humanizado del Ejemplo 13,
también dieron positivo en un ensayo con sangre humana. En la Tabla
II siguiente, (+) indica que la detección de un ligando, por
ejemplo, el receptor \alpha_{v}\beta_{3} del mAb en el
tejido (-) indica la ausencia dicho ligando.
Se llevó a cabo un análisis BIAcore (Pharmacia)
para medir la afinidad del enlace de los mAb D12 y LM609 (6nM) con
\alpha_{v}\beta_{3} inmovilizado. Las interacciones de
\alpha_{v}\beta_{3} con D12 y LM609 se estudiaron usando
tecnología BIAcore por inmovilización del receptor sobre la
superficie del sensor, y haciendo pasar soluciones del mAb sobre
esta superficie. Las descripciones de la instrumentación y la
superficie del sensor se describen [Brigham-Burke,
Edwards y O'Shannessy, 1992, Analytical Biochem.,
205:125-131]. El \alpha_{v}\beta_{3}
se inmovilizó insertando el \alpha_{v}\beta_{3} en una
vesícula de fosfolípido, y produciendo una membrana de bicapa
lipídica sobre la superficie hidrófoba de un sensor. Una DESCRIPCIÓN
más completa de la generación de membranas de bicapa híbridas sobre
las superficies de un sensor BIAcore se proporciona en Plant et
al, 1995, Analyt. Biochem.,
226:342-348. Las muestras de mAb se pasaron
sobre esta superficie, y se determinaron y analizaron mediante el
software que proporciona el instrumento las velocidades con las que
se enlazan y disocian de la superficie.
La Fig. 3 es una gráfica que representa estos
datos. Las constantes cinéticas y la constante de afinidad
calculada (K_{D}) se derivaron del análisis de tres
concentraciones de mAb (100, 25, 6 nM) realizadas por triplicado.
Los datos BIAcore muestran que la afinidad de enlace (K_{D}) de
D12 es 530 pM, que es comparable a 460 pM parar LM609,
El mAb murina D12 se humanizó tal como se
describe con detalle en los Ejemplos 13 y 14 a continuación. Los
anticuerpos Humanizado IgG_{1}, e IgG_{4} HZ-D12
se generaron tal como se describe en aquellas ejemplos.
Las medidas de afinidad de los mAb s de murina
D12 y humanizado se determinaron mediante BIAcore tal como se
describe en la parte A anterior. Los resultados recogidos en la
Tabla III indican que la clase que la clase conmutada del mAb D12
humanizado no tuvo efecto medible. Los datos indican que tras la
humanización, no se alteró la afinidad del D12
A. Se marcó LM609 (marca
ORIGEN-TAG). ORIGEN es una fracción
electroquimioluminiscente que se puede detectar y cuantificar
mediante el bien conocido análisis ORIGEN. El enlace
anti-\alpha_{v}\beta_{3} del LM609 se
comparó con otros mAb
anti-\alpha_{v}\beta_{3} del Ejemplo 2.
Estos ensayos ensayan los anticuerpos respecto de su capacidad para
evitar que 1 \mug/ml de LM609 se enlace con 1 \mug/ml de
\alpha_{v}\beta_{3} marcado con biotina en ORIGEN. Los
anticuerpos estudiados fueron D'' y los anticuerpos auxiliares
relacionados en la Tabla 1,
Los resultados que aparecen en la Fig. 2 ilustran
el enlace del receptor del mAb \alpha_{v}\beta_{3} mediante
Origen para D12 y LM609, con Mu19 (una IgG_{2a}) como control.
Estos resultados muestran que 1 \mug/ml de LM609 marcado muestra
un 90% de inhibición cuando compite con 10 \mug/ml, y 70% de
inhibición cuando compite con 1 \mug/ml del mAb D12. Estos
resultados sugieren que el mAb D12 se enlaza a un epítopo similar a
LM609 sobre el receptor. Estos datos indican que el mAb D12 tiene
una actividad enlazante superior a LM609,
B. Los resultados de la Fig. 4 muestran el enlace
comparativo del D12 y otros mAb del Ejemplo 2 en competición con
LM609 para \mug/ml de \alpha_{v}\beta_{3} en Origen. Los
anticuerpos relacionados en la Tabla I muestran que el epítopo de
enlace del receptor \alpha_{v}\beta_{3} es distinto para
LM609 y D12, Por ejemplo, el mAb 346 inhibió SMC y mostró buen
flujo y perfil histológico (Tabla I), pero no compite con LM609,
C. La Fig. 6 también demuestra la afinidad de
enlace de estos anticuerpos. Se mezclaron durante 30 minutos
veinticinco microlitros de
\alpha_{v}\beta_{3}-biotina y 25 \mul de
LM609 o D12 sin marca. Se añadieron durante 30 minutos veinticinco
microlitros de Tag-LM609, seguido de 50 \mul de
perlas magnéticas de estreptavidina a 0,6 ng/ml. A continuación, la
mezcla se leyó en un analizador ORIGEN. Los resultados se
representan en el gráfico de barras de la Fig. 6. D12 mostró una
afinidad de enlace considerablemente superior para el receptor que
LM609.
D. La Fig. 7 ilustra otro ensayo en que se
determina la inhibición del enlace de 1 \mug/ml de D12 a 1
\mug/ml del receptor \alpha_{v}\beta_{3} receptor,
preincubando con LM609 o D12. De nuevo D12 demostró tener una
afinidad de enlace superior a la de LM609,
La migración de células de la musculatura lisa
(SMC) desde el medio a la zona lesionada para iniciar el crecimiento
de neointima es una respuesta esencial de remodelación que sigue a
una lesión vascular. La inhibición de la migración de SCM atenúa la
formación de neointima. La migración de las SMC vasculares se media
mediante el receptor \alpha_{v}\beta_{3} humano, que se
expresa en el VSMC y sobreregula tras una lesión vascular.
Osteopontina, un ligando del receptor \alpha_{v}\beta_{3}
humano, se sobreregula después de una angioplasia, y promueve la
migración de VSMC vía integrina. Este experimento se llevó a cabo
para demostrar la capacidad de VSMC in vitro.
Se usaron células de la musculatura lisa aórtica
de ser humano o conejo. La migración celular se monitorizó en una
cámara de cultivo celular Trasnwell usando una membrana de
policarbonato con poros de 8 um (Costar). La superficie inferior del
filtro se recubrió con vitronectina u osteopontina. Las células se
suspendieron en medio esencial mínimo de Difco (DMEM) suplementado
con BSA al 0,2% a una concentración de 2,5 - 5,0 X 10^{6}
células/mL, y se pretrataron con anticuerpo de ensayo a diferentes
concentraciones, durante 20 minutos a 20ºC. El solvente sólo se uso
como control. Se colocaron 0,2 ml de la suspensión celular en el
compartimiento superior de la cámara. El compartimiento inferior
contenía 0,6 ml de DMEM suplementado con BSA al 0,2%. La incubación
se llevó a cabo a 37ºC en atmósfera con 95% de aire / 5% de CO_{2}
durante 24 horas.
Después de la incubación, las células que no
habían migrado de la superficie del filtro se eliminados rascando
suavemente. El filtro se fijó seguidamente con metanol, y se tiñó
con tinción Giemsa al 10%. La migración se midió mediante a)
contando el número de células que han migrado hasta la superficie
inferior del filtro, o b) extrayendo las células teñidas con ácido
acético al 10% seguido de determinación de la absorbancia a 600
nm.
La inhibición de la migración de SMC (humano y
conejo) demostró que LM609 es más potente que D12. Ver la Tabla
I.
En un ensayo posterior, y antes de ensayar la
eficacia del mAb D12 de murina y del HZ-D12
(IgG_{1}) humanizado del Ejemplo 13 en el modelo de conejo de
restenosis, estos mAb se ensayaron de nuevo respecto de la
inhibición de la migración de SMC en conejos. Los resultados que se
muestran en la Fig. 9 indican que murina D12 tiene mayor potencia
que su versión HZ-D12 (IgG_{1}) humanizado.
Se obtuvieron células de riñón embrionario
(células HEK293) de ATCC (Catálogo Nº CRL 1573). Se hicieron crecer
las células en medio esencial mínimo de Earl (EMEM) que contenía
sales de Earl, suero fetal bovina al 10%, glutamina al 1% y
penicilina -estreptomicina al 1%.
Un fragmento de 3,2 kb EcoRI-KpnI
de la subunidad \alpha_{v} y un fragmento de 2,4 kb
XbaI-XhoI de la subunidad \beta_{3} se
insertaron en los emplazamientos de clonación
EcoRI-EcoRV del vector pCDN que contiene un promotor
CMV y un marcador seleccionable G418 mediante enlace de extremos
romos. Para una expresión estable, se electrotransformaron 80 X
10^{6} células HEK 293 con constructos de
\alpha_{v}\beta_{3} (20 \mug ADN de cada subunidad) usando
un Gene Pulser [P. Hensley et al., 1994, J. Biol.
Chem., 269:23949-23958] y se plaquearon en
placas de 100 mm (5 X 10^{5} células/placa). después de 48 horas,
el medio de cultivo se resuplementó con 450 \mug/ml de Geneticin
(G418 Sulfate, GIBCO-BRL, Bethesda, Md.). Las
células se mantuvieron en medio de selección hasta que las colonias
fueron lo suficientemente largas para ensayarse.
Placas ELISA de 96-pocillos
Corning placas se prerecubrieron durante toda la noche a 4ºC con
0,1 ml de vitronectina humana (0,2 \mug/ml en medio RPMI). En el
momento del experimento, las placas se lavaron una vez con medio
RPMI y se bloquearon con BSA al 3,5% en medio RPMI durante 1 hora a
temperatura ambiente. Las 293 células transfectadas se
resuspendieron en medio RPMI, se suplementaron con Hepes 20 mM, pH
7,4 y BSA al 0,1% a una densidad de 0,5 X 10^{6} células/ml. Se
añadió 0,1 ml de suspensión de células a cada pocillo, y se
incubaron durante 1 hora a 37ºC, en presencia o ausencia de
diferentes antagonistas \alpha_{v}\beta_{3}. Tras la
incubación se añadieron, 0,025 ml de una solución de formaldehído al
10%, pH 7,4 y las células se fijaron a temperatura ambiente durante
10 minutos. Las placas se lavaron 3 veces con 0,2 ml de medio RPMI,
y las células adherentes se tiñeron con 0,1 ml de azul de toluidina
al 0,5% durante 20 minutos a temperatura ambiente.
El exceso de tiente se elimino mediante lavado
intenso con agua desionizada. El azul de toluidina incorporado a
las células se eluyó por adición de 0,1 ml de etanol al 50% que
contenía HCl 50 mM. La adhesión celular se cuantifico mediante
densidad óptica a 600 nm en un lector de placas microtiter
(Titertek Multiskan MC, Sterling,
Va.).
Va.).
La neutralización de la inhibición de la adhesión
de las células al receptor demostró que D12, otros anticuerpos
auxiliares del ejemplo 2 y LM609 inhiben la adhesión celular (ver la
Tabla I y la Fig. 5)
Se uso el ensayo de membrana corioalantoidea del
embrión de pollo (CAM) para evaluar el papel de los antagonistas
\alpha_{v}\beta_{3} antagonistas en la angiogénesis. La
proteína \alpha_{v}\beta_{3} humana se expresó y sobrereguló
en la vasculatura durante la angiogénesis. El bloqueo del receptor
\alpha_{v}\beta_{3} humano inhibiría la migración de las
células del endotelio (EC), una etapa clave en el proceso de
angiogénesis, y promueve la apoptosis de neovasos sin afectar las
los vasos sanguinos maduros. LM609 o D12 inhiben la angiogénesis
inducida por el factor de crecimiento de los
\beta-fibroblastos (\beta-FGF) o
de forma espontánea en la CAM de un embrión en desarrollo. Las
características claves del procedimiento del ensayo CAM se describen
a continuación.
El ensayo Cam se lleva a cabo con una CAM
procedente de huevos fertilizados con 10 días de vida. Los filtros
Whatman #1 de 5 mm de diámetro se humedecieron en una solución de
de 3 mg/ml de cortisona (en etanol al 95%), y se secaron al aire. Se
usa la cortisona para hacer descender la respuesta inflamatoria a
los filtros. Los filtros se saturaron con una solución
1-6 ug/ml de B-FGF para estimular la
angiogénesis (la solución salina tamponada Hepes (HBSS) se usa como
control) y se colocó en una zona avascular de la CAM.
Se aplicaron LM609 o D12 (\sim100 ug) en un
volumen de <20 \mul al disco del filtro en los días 0, 1, 2 y
3 tras la estimulación con \beta-FGF. El cuarto
día, las CAM se diseccionaron, y se cuantificó la angiogénesis
contando el número de bifurcaciones en un vaso bajo el filtro,
usado un estereomicroscopio.
Este ensayo demuestra una correlación positiva
entre la afinidad de enlace al receptor un la inhibición de la
migración EC. Este ensayo, aunque bastante complicado de llevar a
cabo, mostró que el receptor \alpha_{v}\beta_{3} humano
juega un papel importante en la angiogénesis. Los anticuerpos anti
\alpha_{v}\beta_{3} de esta invención han demostrado que
inhiben la angiogénesis inducida por \beta-FGF en
este ensayo. Ver la Tabla I.
Se adoptó una estrategia de humanización para
obtener un mAb humanizado al máximo que retuviera completamente a
avidez de enlace con el antígeno. Se clonaron y secuenciaron los
ADNc de la cadena pesada variable (VH) y de la cadena ligera
variable (VK) del mAb murina D12. La secuencia de VHD12 se muestra
en SEC ID Nº: 1 y 2, con los CDR identificados tal como se describe,
y la secuencia de VKD12 se muestra en SEC ID Nº: 6 y 7 con los CDR
identificados.
Después de la clonación de ADNc y del análisis de
secuencia, se encontró que VH D12 y VK D12 eran los más similares al
Kabat VH subgrupo I [SEC ID Nº: 3] y Kabat VK subgrupo III [SEC ID
Nº: 8], respectivamente. Se sintetizaron las regiones VH y VL
humanizadas combinando las regiones marco de las secuencias de
consenso de la región V humano juntamente con las regiones CDR de
D12.
El modelado molecular de D12 usando estructuras
cristalinas conocidas revela ciertos residuos marco en VH y VK que
pueden entrar en contacto con anillos de CRD, y por tanto tener
influencia sobre su conformación. Dichos residuos marco pueden
contribuir por tanto de forma directa a la formación de una
especificidad de antígeno concreta. Se introdujeron siete d estos
residuos marco de murina VH y tres residuos marco de murina VK en
las regiones marco de consenso humanas en D12HZHC
1-0 [SEC ID Nº: 4 y 5] y D12HZLC 1-0
[SEC ID Nº: 9 y 10].
Se purificó ARN completo usando el reactivo
TRizol Reagent (Life Technologies Cat. # 15596-026)
de acuerdo con el protocolo del fabricante- El ARN se precipitó con
isopropanol, y se disolvió en agua tratada con dietilpirocarbonato
(DEPC). Se aisló poli A^{+} ARN usando un Poly-A
Quik mRNA Isolation Kit. (Stratagene Cat. # 200349) de de acuerdo
con el protocolo del fabricante.
Diez alícuotas de 100 ng de ARN transcribieron de
forma reversa con un kit RT-PCR de acuerdo con el
protocolo del fabricante (Boehringer Mannheim Cat. Nº
1483-188) usando un oligo dT como cebador. Para la
cadena pesada, se llevaron a cabo amplificaciones PCR de 5 híbridos
ARN/ADN en 25 ciclos usando un cebador flexible IgG_{1} de ratón
5'
TCT-TGT-CCA-CCT-TGG-TGC-TGC-TG
3' [SEC ID Nº: 22] y un cebador degenerado de cadena pesada basado
en la secuencia de la proteína N-terminal 5'
(G/C)(UN/T)(G/UN)-GT
(C/T)-CA(G/UN)-CT(G/T/C)-CA(UN/G)-CA
3' [SEC ID Nº: 23].
De manera similar, para la cadena ligera, se
llevaron a cabo amplificaciones PCR de 5 híbridos ARN/ADN en 25
ciclos usando un cebador de ratón kappa 5'
GCA-CCT-CCA-GAT-GTT-AAC-TGC
3' [SEC ID Nº: 24] y un cebador basado en la secuencia de la
proteína N-terminal 5'
GAC-ATT-GTG-CTG-ACT-CAG-TCT-CCA-GCC-A
3' [SEC ID Nº: 25]. El PCR ADN se analizó sobre un gel de agarosa al
0,8%. Los insertos de PCR del tamaño adecuado, es decir, \sim700
bp para la cadena pesada y \sim700 bp para la cadena ligera se
secuenciaron a través de una modificación del procedimiento de
Sanger.
La secuencia de los 10 de la cadenas ligeras y
pesadas se compararon para generar una secuencia de consenso D12
para la región variable de cadena pesada, mostrada en SEC ID Nº: 4
y 5 y una secuencia de consenso D12 para la variable región de
cadena ligera, mostrada en SEC ID Nº: 9 y 10. En SEC ID Nº: 4, 5, 9
y 10, los CDR están identificados, y las primeras 17 bases de la
secuencia de ADN para ambas cadenas ligeras y pesadas se generan
mediante el cebador de PCR. Sin embargo, la secuencia de proteína
traducida es exacta.
El anticuerpo humanizado D12 tal como se describe
en el presente documento consiste de la cadena pesada de consenso
sintética D12HZHC 1-0 [SEC ID Nº: 4 y 5] y la cadena
ligera de consenso sintética D12HZLC 1-0 [SEC ID Nº:
9 y 10]. El anticuerpo se construyó como sigue:.
Se diseñó una región variable sintética
humanizada de cadena pesada usando un marco de consenso humano del
subgrupo I, según se define por Kabat y el CDR de cadena pesada de
murina D12 murina cadena pesada como se ha descrito anteriormente.
Se introdujeron siete sustituciones en los aminoácidos de murina que
pueden tener influencia sobre la presentación CDR en AA 28, 48, 67,
68, 70, 72 y 74 de SEC ID Nº: 5. Se generaron cuatro
oligonucleótidos sintéticos solapantes que codifican las siguientes
estructuras:
Cuando se emparejan y extienden las secuencias
del oligonucelótido codifican los aminoácidos que representan la
región variable humanizada de la cadena pesada que está siendo
alterada. Las SEC ID Nº: 11 y 12, respectivamente, son las
secuencias de ADN y aminoácidos del intermedio de la cadena pesada
sintética, es decir, representan la región variable de cadena
pesada que está siendo alterada en la región de D12. Este gen
sintético se amplificó a continuación usando los cebadores de PCR
SBA883: TGCAACTAGT GCAGTCTGGA GCTGAGGT [SEC ID Nº: 30] y SBA884:
CCAGGGTACC TTGGCCCCAG [SEC ID Nº: 31] y se ligaron al vector final
pCR2000 (kit de clonación TA, Invitrogen, Cat. Nº
K2000-01), y se aisló después de un digestión
restrictiva Spel, KpnI.
Este fragmento de ADN se ligó al vector final de
restricción F9HZHC1-1 digerido con SpeI y KpnI.
F9HZHC1-1 es una variante de los plásmidos pCDN [A.
Nambi et al, 1994, Mol. Cell. Biochem.,
131:75-85] y pPHZHC2-3pcd
[Publicación de Patente Internacional nº. WO94/05690]. Estos
vectores pCD variantes de plásmido contienen, en general, un gen de
la beta lactamasa, un origin de replicación SV40, una secuencia
promotora de citomegalovirus, una cadena pesada humanizada
seleccionada, una señal polyA de la hormona bovina del crecimiento,
un promotor de betaglobina, un gen de dihidrofolato reductasa y
otra secuencia de señal polyA de BGH en un pUC19 base. El
F9HZHC1-1 además contiene la secuencia de señal
Campath en la que se incluyen los primeros 3 aminoácidos de la
cadena pesada madura, el residuo de un marco de consenso humano 4, y
la región constante humana IgG_{1}. El vector
F9HZHC1-1 vector contiene una mutación simple del
aminoácido del vector pFHZHC2-3pcd en que el
residuo final del marco 2 (aminoácido 49 reflejado en las solicitud
internacional) se mutó de Ser a Ala. Cuando se transfecta y cultiva
en una célula huésped, el vector resultante pD12HZHC
1-0pcd produce una cadena pesada humanizada D12HZHC
1-0 que se muestra en SEC ID Nº: 4 y 5,
Se diseñó una región variable sintética
humanizada de cadena ligera usando un marco de consenso del
subgrupo III kappa humano como se define por Kabat y los CDR de
cadena ligera de murina D12 descritos anteriormente. Se hicieron
tres sustituciones en aminoácidos del marco sustituciones que
pueden afectar a la presentación de los CDR en los residuos de AA
1, 49 y 60 [SEC ID Nº: 9 y 10]. Se generaron cuatro oligonucleótidos
sintéticos solapantes
Cuando se emparejas y extiendes, estas secuencias
codifican los aminoácidos que representan la porción de la región
variable de cadena ligera que está siendo alterada, entre los que
se incluyen los cinco primeros aminoácidos de la región constante
humana kappa. Las SEC ID Nº: 13 y 14, respectivamente, son las
secuencias de ADN y aminoácidos del intermedio de la cadena ligera
sintética, es decir, representan la región variable de cadena
ligera que está siendo alterada en la región de D12, entre los que
se incluyen los primeros cinco aminoácidos de la región constante
humana kappa. Estos genes sintéticos gene se amplificaron a
continuación usando los cebadores de PCR SBA1277: GACATAGTAC
TGACTCAGTC TCCAGGC [SEC ID Nº: 36] y SBA1278: GGCGCCGCCA CAGTACG
[SEC ID Nº: 37] y se ligaron al vector final pCR2000 descrito
anteriormente, y se aislaron después de una digestión de
restricción con ScaI, NarI.
El fragmento de ADN que codifica la secuencia de
la señal Campath [SEC ID Nº: 18 y 19] entre los que se incluyen los
tres primeros aminoácidos de la región variable se hizo
amplificando por PCR el vector F9HZLCI-1 con
cebadores concretos. El vector F9HZLC1-1 es otra
variante de los vectores pCDN [Nambi et al, anteriormente
citado] y pFHZLCL-1-pcn [Publicación
de Patente Internacional nº. WO94/05690]. Estos vectores variantes
del plásmido pCN contienen por lo general, un gen de la beta
lactamasa, un origin de replicación SV40, una secuencia promotora de
citomegalovirus, una cadena pesada humanizada seleccionada,
una señal polyA de la hormona bovina del crecimiento, un promotor
de betaglobina, un gen de dihidrofolato reductasa y otra secuencia
de señal polyA de BGH en un pUC19 base. F9HZLC1-1
además contiene el residuo de un marco 4 humano y región constante
kappa y una mutación simple del aminoácido del vector
pFHZLCL-1pcn en el marco (de Ser a Pro). Los
cebadores PCR usados fueron SB8694: GGAGACGCCA TCGAATTCTG UN [SEC ID
Nº: 38] y SBAI224: AGACTGTGTC AGTACTATGT CGGAGTGGAC ACC [SEC ID Nº:
39] y F9HZLC1-1 se sometieron a digestión con
restricción mediante EcoRI y Scal. Estos dos fragmentos se ligaron
en un vector final, pFHZLCL-1-pcn,
se sometieron a digestión con restricción mediante EcoRI y NarI. El
vector resultante pD12HZLC1-1-pcn,
cuando se cultivó en una célula huésped produjo el D12HZLC
1-0 humanizado [SEC ID Nº: 9 y 10].
El vector de cadena pesada pD12HZHC
1-0pcd y el vector de cadena ligera pD12HZLC
1-1-pcn anteriormente descritos se
usaron para producir un anticuerpo HuD12 en células COS y en células
CHO.
Para la caracterización inicial, las cadenas
ligeras y pesadas del HuD 12 humanizado se expresaron en células
COS esencialmente tal como se describe en Current Protocols in
Molecular Biology (editado por F. M. Ausubel et al. 1988,
John Wiley & Sons, vol. 1, sección 9.1). Brevemente descrito,
las células COS se co transfectaron con 10 \mug de cada plásmido.
En el día 1 después de la transfección, el medio de cultivo se
sustituyó con un medio libre de suero, que se cambió en el día 3. el
suero libre de medio fue una formulación patentada, pero se
obtienen resultados satisfactorios usando DMEM suplementado con
ITS^{TM} Premix (insulina, transferrina, mezcla de selenio
-Collaborative Research, Bedford, MA.) y 1 mg/ml de BSA. El mAb se
aisló y preparó a partir de medio condicionado del día 3 + día 5
mediante procedimientos convencionales de cromatografía de afinidad
de la proteína A (por ejemplo, tal como se describe en Protocols en
Molecular Biology) usando, por ejemplo, la resina de afinidad
Prosep UN (Bioprocessing Ltd., UK).
El D12 humanizado se expresó en forma de una
molécula \gamma_{1}, kappa en células COS transfectadas de
forma transitoria. los sobrenadantes de este cultivo resultaron
enlazantes con el receptor \alpha_{v}\beta_{3} en los
ensayos ELISA y BIAcore anteriormente descritos.
Para producir cantidades mayores del mAb HuD12
mAb (100-200 mg), los plásmidos se introdujeron en
un sistema de células patentadas CHO, la línea celular
CHO-E1a. Esta línea celular proporciona grandes
cantidades de mAb (aproximadamente 10 mg de cada uno) y permite
ensayar el perfil de actividad tanto de los anticuerpos quiméricos
como de los humanizados. Sin embargo, se pueden producir resultados
similares usando células dhfr^{-} CHO como se ha descrito
anteriormente [P. Hensley et al., anteriormente citado].
Brevemente, un total de 30 \mug de plásmido linearizado de ADN (15
ug cada de plásmidos de cadena pesada y ligera) se
electroincorporan a 1 X 10^{7} células. Las células se
seleccionan inicialmente en medio libre de nucleósido en placas de
96 pocillos. Después de tres a cuatro semanas, el medio de cultivo
de los pocillos positivos se selección respecto de la
inmunoglobulina humana usando el ensayo del Ejemplo 3. Las colonias
que expresaban con mayor intensidad se expandieron y seleccionaron
en concentraciones crecientes de metotrexato para amplificar los
vectores transfectados. El anticuerpo se purificó a partir del
medio condicionado usando cromatografía de afinidad de la proteína
A (Protein A sepharose, Pharmacia) seguido de cromatografía de
exclusión de tamaños (Superdex 200, Pharmacia).
La concentración y la actividad enlazante del
antígeno del anticuerpo eluído se midieron mediante los ensayos
ELISA de los Ejemplos 3 y 4. Las fracciones que contienen el
anticuerpo se mezclan y purifican adicionalmente mediante
cromatografía de exclusión de tamaños.
Se generaron dos de los mencionados anticuerpos
D12 humanizados, el anticuerpo IgG_{1} anteriormente descrito y
una versión IgG_{4} (preparada de manera análoga a la que se ha
descrito anteriormente, pero usando una región constante IgG_{4}).
El HZ-D12 (IgG_{1} se produce en una línea
celular de expresión estable CHO. Se generó una línea Pts 50 nM que
es aceptable para la producción en Fase I (300 mg). Se están
evaluando líneas adicionales, es decir, línea Pts 150 nM (400 mg/L)
y línea Pts 450 nM. La murina y el D12 humanizado reaccionan de
forma cruzada con VSMC procedente de babuíno, e inhiben SMC. La
murina y D12 humanizado inhiben la migración de EC humanas.
Un segundo constructo tiene una cadena ligera
basada en el marco de consenso REI para proporcionar una cadena
ligera alternativa en el caso de expresión inestable en líneas
celulares de producción de D12 humanizado. La principal variante
introduce cinco residuos marco de murina que se predice que hacen
contacto con distintos residuos VK CDR.
Brevemente descrito, se diseñó una cadena
sintética humanizada kappa basada en un marco de cadena kappa REI
humana, y los CDR de D12 anteriormente descritos. La SEC ID Nº: 15
es la secuencia de aminoácidos del marco de cadena kappa REI humana
modificada. Se introdujeron residuos marco de cinco donantes (murina
D12), en las posiciones identificadas en los experimentos de
modelación, que podrían tener influencia sobre la presentación de
los CDR. Se generaron cuatro oligonucleótidos sintéticos
solapantes:
Cuando estas secuencias de oligonucleótidos
sintéticos se emparejan y extienden, codifican los aminoácidos que
representan la región variable de cadena ligera que está siendo
alterada, incluyendo la región altamente conservada KpnI que se
encuentra en el segmento genético Jk, y SEC ID Nº: 17 es la
secuencia de aminoácidos de este producto genético.
Este gen sintético se amplificó a continuación
usando dos cebadores de PCR SBA 3170: 5'gac atA GTA CTG ACT CAG TCT
CCA AGC 3'[SEC ID Nº: 44]; y SBA 3171: 5'ttc cac ctt GGT ACC CTG GCC
GAA CGT GAA AGG 3'[SEC ID Nº: 45], y se ligaron en un vector final
pCR2000 vector anteriormente descrito, y aislado mediante digestión
Scal, KpnI.
Se aisló un fragmento de ADN correspondiente a la
secuencia de señal CAMPATH, mostrada en SEC ID Nº: 18 y 19 que se
aislaron por digestión con EcoRI, Scal del vector de la cadena
ligera vector pD12HZLC 1-1-pcn,
anteriormente descrito. Estos dos fragmentos se ligaron
conjuntamente con el fragmento grande aislado del mismo vector
digerido con EcoRI y KpnI que contienen la región constante k. La
secuencia resultante fue la de la cadena ligera sintética D12HZREI.
SEC ID Nº: 20 y 21 son la secuencia de ADN y la secuencia de
aminoácidos, respectivamente, de la cadena sintética humanizada
kappa basada en un marco de cadena kappa REI humana modificada,
D12HZLCREI. Los emplazamiento de rotura por el enzima de restricción
endonucleasa se localizan en las secuencias siguientes: ScaI
(AGTACT; nucleótidos 6-11), AvrII (CCTAGG;
nucleótidos 130-135); EcoRI (GAATTC; nucleótidos
273-278) y KpnI (GGTACC; nucleótidos
310-306).
Tal como se describe en el Ejemplo 10, la
osteopontina, un ligando del receptor \alpha_{v}\beta_{3}
humano, se sobreregula después de una angioplasia y promueve la
migración de VSMC mediante la integrina. Los anticuerpos del
receptor \alpha_{v}\beta_{3} humano deberían evitar la
formación de neointima in vivo.
El modelo de conejo funciona como sigue. En el
día 0 se toman muestras de plasma de conejos normales de 3 kg. A
continuación, los conejos se sedan, y los animales reciben una
lesión (es decir, una denudación endotelial de la arteria ilíaca).
La denudación del endotelio se realiza con tres pasadas de un
catéter de balón para embolectomía 3fr. Los estudios piloto indican
que la incidencia de la lesión es del 100%, y que se necesitan 10 -
12 conejos en cada grupo para detectar una 35% de reducción en el
área de la neointima.
Se administró el mAb murina D12 a los conejos en
los días 1, 2 y 3. La dosis fue de 9 mg/kg ó 3 mg/kg en
administración intravenosa. Se tomaron muestras de plasma para
determinaciones de mAb en los días 0, 1, 2 y 21, y se realizaron
análisis morfométricos sobre secciones histológicas preparadas a
partir de cada arteria. El incremento en el área del lumen y del
área total del vaso es indicativo del remodelado después de la
lesión.
Las Fig. 10A-10D ilustran los
resultados de dos estudios diferentes. Las Fig. 10A y 10C miden el
área del lumen tratados con el control del mAb D12 en el días 21 en
dos estudios (2 dosis). Las Fig. 10B y 10D miden el área total del
vaso tratado mediante el mAb del D12 en dos estudios (2 dosis).
Estos datos indican que el mAb de murina D12 muestra eficacia en el
modelos de conejo de restenosis, lo que da como resultado un
remodelado resultante del vaso dañado (agrandamiento del lumen).
El modelo combinado de ratón inmunodeficiente
(SCID), en el que la piel humana de injerta y no se rechaza [ver
por ejemplo, P. W. Soballe et al, 1996, Cancer
Res. 56:757-764] puede servir como fuente
de neovascularización angiogénica, y posteriormente puede aceptar
un tumor humano. Este modelo se utiliza para ensayar la eficacia de
los anticuerpos mAb D12 y HuD12.
Brevemente descrito, en este modelo humano, la
piel se injerta en el ratón. Se injertan células tumorales humanas
se inyectan en el injerto de piel humana, y se mide el crecimiento
del tumor. El injerto de piel humana suministra la neovasculatura
necesaria para el crecimiento tumoral. Los animales se trataron con
murina D12 o D12 humanizado, y se comparó el retraso en el
crecimiento tumoral comparado con el que se observa en los
controles no tratados.
La inhibición del crecimiento tumoral indica que
el mAb D12 (humano anti\alpha_{v}\beta_{3} positivo, murina
anti-\alpha_{v}\beta_{3} negativo) juega
una papel importante den la inhibición de la angiogénesis
dependiente de \alpha_{v}\beta_{3}. Los datos preliminares
muestran que el crecimiento tumoral se retrasa en los animales
tratados en el mAb D12. Estos datos soportan la hipótesis de que
tratar la "angiogénesis" previene el crecimiento tumoral.
La Tabla IV siguiente indica que la
inmunohistología de la piel humana no tiene respuesta
anti-\alpha_{v}\beta_{3} positiva. Sin
embargo, cuando un tumor crece en la piel, la neovasculatura
muestra D12 positivo, indicando que el \alpha_{v}\beta_{3}
se expresa en esta lesión tumoral.
| Tejido Hu-SCID | mAb D12 |
| Injerto de piel humana en SCID | - |
| Crecimiento de tumor humano en el injerto de piel | + |
Los resultados de los Ejemplos 3 a 16 establecen
que los anticuerpos D12 y HuD12 muestran una potente actividad
antireceptora in vitro y muestran eficacia profiláctica y
terapéutica en modelos animales in vivo.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE. SmithKline Beecham Corporation
\hskip3.9cmJonak Zdenka, L
\hskip3.9cmJohanson, Kyung O.
\hskip3.9cmTaylor, Alexander H.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: anticuerpos monoclonales humanizados
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 45
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORREO
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SmithKline Beecham Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- STREET: 709 Swedeland Road
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CITY: King of Prussia
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- STATE: PA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- COUNTRY: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 19406-2799
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- MEDIO INFORMÁTICO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO PC-DOS / MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn realase #1.0, versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FECHA DE LA SOLICITUD ACTUAL
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: WO
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACION
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FECHA DE LA SOLICITUD ANTERIOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 60/038.609
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN 12 de marzo de 1997
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- INFORMACIÓN DEL AGENTE / REPRESENTANTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: King, William T.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 30.954
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA / REGISTRO: P50629
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 610-270-5015
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 610-270-5090
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 351 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..351
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 117 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 115 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 351 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- LOCALIZACIÓN: 1..351
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 117 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 324 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..324
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 108 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 109 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 8
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 321 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- LOCALIZACIÓN: 1..321
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 107 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 333 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3..332
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 11
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 110 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 12
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 338 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..336
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 13
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 112 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 14
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 107 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 351 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..351
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 105 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 94 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- LOCALIZACIÓN: 27..92
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val
Ala Thr Ala Thr Gly}
\sac{Val His Ser Asp Ile Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 315 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..315
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 105 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "ratón IG1 cebador flexible"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTTGTCCAC CTTGGTGCTG CTG
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "cebador degenerado de la cadena pesada"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipSWRGTYCARC TBCARCA
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 24
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "cebador ratón kappa"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCACCTCCAG ATGTTAACTG C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACATTGTGC TGACTCAGTC TCCAGCCA
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 100 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "SBA885"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCAACTAGT GCAGTCTGGA GCTGAGGTGA AGAAGCCTGG GGCCTCAGTG AAGGTATCCT
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCAAAGCTTC TGGTTATGCA TTCACTAGCT ACAACATGTA
\hfill100
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 114 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "SBA886"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGCCCTTGA ATTTCTGGTT GTAGAAAGTA TCACCATTGT AAGGATCAAT ATATCCAATC
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACTCTAGAC CCTGTCCAGG GGCCTGCCGC ACCCAGTACA TGTTGTAGCT AGTG
\hfill114
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "SBA887"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTACAACCAG AAATTCAAGG GCAAGGCCAC ATTGACTGTC GACAAGTCCA CCAGCACAGC
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTACATGGAA CTCAGCAGCC TGAGATCTGA GGACACTGCA GT
\hfill102
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 89 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "SBA888"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCAGGGTACC TTGGCCCCAG TAAGCAAAAC TACCGTAGTT CTGTCTTGCA CAGTAATAGA
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGCAGTGTC CTCAGATCTC AGGCTGCTG
\hfill89
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "SBA883"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCAACTAGT GCAGTCTGGA GCTGAGGT
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "SBA884"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCAGGGTACC TTGGCCCCAG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 108 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "SBA1327"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACATAGTAC TGACTCAGTC TCCAGGCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGAGA AAGAGCCACC
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTTCCTGCA GGGCCAGCCA AAGTATTAGC AACCACCTAC ACTGGTAT
\hfill108
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 114 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "SBA1328"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCACTGAAC CTGGAGGGGA TCCCAGAGAT GGACTGGGAA GCATACTTGA TGAGAAGCCG
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGAGCCTGG CCAGGTTTTT GTTGATACCA GTGTAGGTGG TTGCTAATAC TTTG
\hfill114
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 101 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "SBA1329"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTCTGGGAT CCCCTCCAGG TTCAGTGGCA GTGGATCAGG GACAGATTTC ACTCTCACCA
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCAGCCGTCT AGAGCCTGAA GATTTTGCGG TTTATTACTG T
\hfill101
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 98 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "SBA1330"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCGCCGCCA CAGTACGTTT TATTTCCACC TTGGTACCCT GGCCGAACGT GAAAGGCCAG
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGTTACTCT GTTGACAGTA ATAAACCGCA AAATCTTC
\hfill98
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "SBA1277"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACATAGTAC TGACTCAGTC TCCAGGC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "SBA1278"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCGCCGCCA CAGTACG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "SBA694"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAGACGCCA TCGAATTCTG A
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "SBA1224"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGACTGTGTC AGTACTATGT CGGAGTGGAC ACC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 40
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 90 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "SBA3166"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACATAGTAC TGACTCAGTC TCCAAGCAGC CTGTCTGCGT CTGTAGGAGA TAGAGTCACC
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTACCTGCA GGGCCAGCCA AAGTATTAGC
\hfill90
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 101 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "SBA3167"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCGAGATGG ACTGGGAAGC ATACTTGATG AGAAGCCTAG GAGCCTTGCC AGGTTTTTGT
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGATACCAGT GTAGGTGGTT GCTAATACTT TGGCTGGCCC T
\hfill101
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 99 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "SBA3168"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTTCCCAGT CCATCTCTGG GATCCCCTCC AGGTTCAGTG GCAGTGGATC AGGGACAGAT
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCACTTTCA CCATCAGCAG TCTACAGCCT GAAGATATT
\hfill99
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 90 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "SBA3169"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCCACCTTG GTACCCTGGC CGAACGTGAA AGGCCAGGAA TTCGACTGTT GACAGTAATA
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTCGCAATA TCTTCAGGCT GTATACTGCT
\hfill90
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.800000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "SBA3170"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACATAGTAC TGACTCAGTC TCCAAGC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID Nº 45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /dsc = "SBA3171"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCCACCTTG GTACCCTGGC CGAACGTGAA AGG
\hfill33
Claims (2)
1. Un anticuerpo humanizado reactivo de manera
específica con el receptor de la proteína humano
\alpha_{v}\beta_{3} y capaz de neutralizar el mencionado
receptor, que comprende una cadena pesada de SEC ID Nº: 5 y una
cadena ligera de SEC ID Nº: 10
2. Una composición farmacéutica que comprende el
anticuerpo de la reivindicación 1.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US3960997P | 1997-03-12 | 1997-03-12 | |
| US39609P | 1997-03-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2234099T3 true ES2234099T3 (es) | 2005-06-16 |
Family
ID=21906403
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98909183T Expired - Lifetime ES2234099T3 (es) | 1997-03-12 | 1998-03-12 | Anticuerpos monoclanales humanizados anti-alfa beta 3. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7230083B2 (es) |
| EP (2) | EP0968290B1 (es) |
| JP (1) | JP2002508656A (es) |
| AU (1) | AU6702998A (es) |
| CA (1) | CA2284518A1 (es) |
| DE (1) | DE69828154T2 (es) |
| ES (1) | ES2234099T3 (es) |
| WO (1) | WO1998040488A1 (es) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69828154T2 (de) * | 1997-03-12 | 2005-06-23 | Smithkline Beecham Corp. | Anti-alphavbeta3 humanizierte monoklonale antikörper |
| GB9823071D0 (en) * | 1998-10-21 | 1998-12-16 | Affibody Technology Ab | A method |
| US6160099A (en) * | 1998-11-24 | 2000-12-12 | Jonak; Zdenka Ludmila | Anti-human αv β3 and αv β5 antibodies |
| US7306925B2 (en) | 2001-11-09 | 2007-12-11 | Vanderbilt University | Phage antibodies to radiation-inducible neoantigens |
| US7906102B2 (en) | 2001-10-03 | 2011-03-15 | Vanderbilt University | Ligands to radiation-induced molecules |
| AR045563A1 (es) | 2003-09-10 | 2005-11-02 | Warner Lambert Co | Anticuerpos dirigidos a m-csf |
| US7674884B2 (en) * | 2003-12-10 | 2010-03-09 | Novimmune S.A. | Neutralizing antibodies and methods of use thereof |
| US7351739B2 (en) | 2004-04-30 | 2008-04-01 | Wellgen, Inc. | Bioactive compounds and methods of uses thereof |
| DE102004059357B8 (de) * | 2004-12-03 | 2009-12-03 | Universität Leipzig | Antikörper, welcher die Interaktion von humanem Thy-1 und dessen Liganden blockiert, sowie dessen Verwendung |
| WO2006138739A2 (en) | 2005-06-17 | 2006-12-28 | Tolerx, Inc. | Ilt3 binding molecules and uses therefor |
| AU2007345745C1 (en) | 2006-06-19 | 2013-05-23 | Merck Sharp & Dohme Corp. | ILT3 binding molecules and uses therefor |
| EP2043603A4 (en) | 2006-07-11 | 2010-10-27 | Arubor Corp | PREVENTION AND THERAPY OF RHINOSINUSITIS WITH PROINFLAMMATORY CYTOKINHERMERS |
| LT2068889T (lt) | 2006-08-10 | 2020-02-10 | Roy C. Levitt | Anakinra, naudojama bronchiolito obliteranso sindromo gydymui |
| WO2010002862A2 (en) * | 2008-07-01 | 2010-01-07 | Aveo Pharmaceuticals, Inc. | Fibroblast growth factor receptor 3 (fgfr3) binding proteins |
| WO2013019730A1 (en) | 2011-07-29 | 2013-02-07 | The Washington University | Antibodies to tip-1 and grp78 |
| US10449261B2 (en) | 2014-07-24 | 2019-10-22 | Washington University | Compositions targeting radiation-induced molecules and methods of use thereof |
| US11352436B2 (en) | 2017-02-10 | 2022-06-07 | Washington University | Antibodies to TIP1 and methods of use thereof |
| CA3172092A1 (en) * | 2020-04-23 | 2021-10-28 | David Cheresh | Compositions and methods for treating cancer |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989005155A1 (en) * | 1987-11-19 | 1989-06-15 | Scripps Clinic And Research Foundation | Monoclonal antibody against the rgd-directed adhesion receptor of endothelial cells |
| AU680411B2 (en) * | 1992-04-03 | 1997-07-31 | Genentech Inc. | Antibodies to alphavbeta3 integrin |
| ES2135711T4 (es) * | 1994-03-08 | 2000-01-01 | American Home Prod | Derivados de tiazolidindiona como agentes antihiperglucemicos. |
| US5753230A (en) * | 1994-03-18 | 1998-05-19 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
| DE69828154T2 (de) * | 1997-03-12 | 2005-06-23 | Smithkline Beecham Corp. | Anti-alphavbeta3 humanizierte monoklonale antikörper |
| US6160099A (en) * | 1998-11-24 | 2000-12-12 | Jonak; Zdenka Ludmila | Anti-human αv β3 and αv β5 antibodies |
-
1998
- 1998-03-12 DE DE69828154T patent/DE69828154T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1998-03-12 EP EP98909183A patent/EP0968290B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-12 JP JP53986098A patent/JP2002508656A/ja active Pending
- 1998-03-12 CA CA002284518A patent/CA2284518A1/en not_active Abandoned
- 1998-03-12 AU AU67029/98A patent/AU6702998A/en not_active Abandoned
- 1998-03-12 ES ES98909183T patent/ES2234099T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-12 WO PCT/US1998/004987 patent/WO1998040488A1/en active IP Right Grant
- 1998-03-12 EP EP04077315A patent/EP1491632A3/en not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-08-20 US US10/223,880 patent/US7230083B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-10-18 US US11/582,745 patent/US7504102B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-04-25 US US11/739,755 patent/US20080160576A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1491632A2 (en) | 2004-12-29 |
| WO1998040488A1 (en) | 1998-09-17 |
| DE69828154T2 (de) | 2005-06-23 |
| EP1491632A3 (en) | 2006-01-04 |
| CA2284518A1 (en) | 1998-09-17 |
| US20070053902A1 (en) | 2007-03-08 |
| EP0968290B1 (en) | 2004-12-15 |
| US7504102B2 (en) | 2009-03-17 |
| JP2002508656A (ja) | 2002-03-19 |
| EP0968290A1 (en) | 2000-01-05 |
| DE69828154D1 (de) | 2005-01-20 |
| US7230083B2 (en) | 2007-06-12 |
| AU6702998A (en) | 1998-09-29 |
| US20030152571A1 (en) | 2003-08-14 |
| US20080160576A1 (en) | 2008-07-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2279646T3 (es) | Anticuerpos de integrina monoclonales humanizados. | |
| US7504102B2 (en) | Anti-αvβ3 humanized monoclonal antibodies | |
| JP4695133B2 (ja) | 抗ミオスタチン抗体 | |
| US10584172B2 (en) | Humanized monoclonal antibodies and methods of use | |
| KR101078459B1 (ko) | 항 수초 관련 당단백질 항체 | |
| AU707440B2 (en) | Antibodies against E-selectin | |
| CN103153331B (zh) | 靶向于钙粘着蛋白‑11的ec1结构域的人源化抗体及相关组合物和方法 | |
| CZ299452B6 (cs) | Monoklonální, pozmenená, humanizovaná a chimerická protilátka a farmaceutický prostredek obsahujícípozmenenou protilátku | |
| ES2307301T3 (es) | ANTICUERPO LO-CD2a Y USOS DEL MISMO PARA INHIBIR LA ACTIVACION Y PROLIFERACION DE CELULAS T. | |
| JP4660189B2 (ja) | 抗血小板自己抗体およびそのインヒビターに関連する組成物、方法およびキット | |
| PL180125B1 (pl) | Bialko fuzyjne o swoistosci wiazania przeciwko ludzkiej IL-4, PL PL PL PL PL PL | |
| ES2646792T3 (es) | Anticuerpos monoclonales contra bucles extracelulares de C5aR | |
| WO1998040488A9 (en) | Anti-alphabeta3 humanized monoclonal antibodies | |
| ES2296952T3 (es) | Metodo para tratar el mieloma multiple. | |
| CN107074951A (zh) | 拮抗性抗‑ox40l抗体及其使用方法 | |
| JP4860877B2 (ja) | シアロアドへジンファクター−２抗体 | |
| CN116113433A (zh) | 结合人cd38的抗体、其制备方法和用途 | |
| JP4808841B2 (ja) | Ｔ細胞活性化および増殖を阻害するＬＯ−ＣＤ２ａ抗体およびその使用法 |