CZ2010180A3 - Identifikace lidských T2R receptoru, které reagují na horké slouceniny, které vyvolavají horkou chut v kompozicích, a jejich použití v testech pro identifikaci sloucenin, které inhibují (blokují) horkou chut v kompozicích a jejich použití - Google Patents

Identifikace lidských T2R receptoru, které reagují na horké slouceniny, které vyvolavají horkou chut v kompozicích, a jejich použití v testech pro identifikaci sloucenin, které inhibují (blokují) horkou chut v kompozicích a jejich použití Download PDF

Info

Publication number
CZ2010180A3
CZ2010180A3 CZ20100180A CZ2010180A CZ2010180A3 CZ 2010180 A3 CZ2010180 A3 CZ 2010180A3 CZ 20100180 A CZ20100180 A CZ 20100180A CZ 2010180 A CZ2010180 A CZ 2010180A CZ 2010180 A3 CZ2010180 A3 CZ 2010180A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
substituted
unsubstituted
compound
assay
alkyl
Prior art date
Application number
CZ20100180A
Other languages
English (en)
Inventor
Li@Xiaodong
Patron@Andrew
Tachdjian@Catherine
Xu@Hong
Li@Qing
Pronin@Alexey
Servant@Guy
Zhang@Lan
Brady@Thomas
Darmohusodo@Vincent
Arellano@Melissa
Selchau@Victor
Weylan Ching@Brett
S. Karanewsky@Donald
Brust@Paul
Ling@Jing
Zhao@Wen
Priest@Chad
Original Assignee
Senomyx, Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Senomyx, Inc filed Critical Senomyx, Inc
Publication of CZ2010180A3 publication Critical patent/CZ2010180A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/15—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C311/16—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the sulfonamide groups bound to hydrogen atoms or to an acyclic carbon atom
    • C07C311/17—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the sulfonamide groups bound to hydrogen atoms or to an acyclic carbon atom to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing three or more hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/86—Addition of bitterness inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/485—Morphinan derivatives, e.g. morphine, codeine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/60—Salicylic acid; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/46—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing sulfur
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/46—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing sulfur
    • A61K8/466—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing sulfur containing sulfonic acid derivatives; Salts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
    • A61K8/4906—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with one nitrogen as the only hetero atom
    • A61K8/4933—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with one nitrogen as the only hetero atom having sulfur as an exocyclic substituent, e.g. pyridinethione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
    • A61K8/494—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with more than one nitrogen as the only hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
    • A61K8/4973—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with oxygen as the only hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
    • A61K8/4973—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with oxygen as the only hetero atom
    • A61K8/498—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with oxygen as the only hetero atom having 6-membered rings or their condensed derivatives, e.g. coumarin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
    • A61K8/4986—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with sulfur as the only hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C211/00—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton
    • C07C211/01—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C211/02—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C07C211/14—Amines containing amino groups bound to at least two aminoalkyl groups, e.g. diethylenetriamines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/64—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C233/67—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C233/68—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/73—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom of a carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/01—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C311/02—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C07C311/03—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton having the nitrogen atoms of the sulfonamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C311/04—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton having the nitrogen atoms of the sulfonamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to acyclic carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/01—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C311/12—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an unsaturated carbon skeleton containing rings
    • C07C311/13—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to acyclic carbon atoms of an unsaturated carbon skeleton containing rings the carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/15—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C311/16—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the sulfonamide groups bound to hydrogen atoms or to an acyclic carbon atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/15—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C311/16—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the sulfonamide groups bound to hydrogen atoms or to an acyclic carbon atom
    • C07C311/18—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the sulfonamide groups bound to hydrogen atoms or to an acyclic carbon atom to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/15—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C311/16—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the sulfonamide groups bound to hydrogen atoms or to an acyclic carbon atom
    • C07C311/19—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the sulfonamide groups bound to hydrogen atoms or to an acyclic carbon atom to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/15—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C311/20—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/15—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C311/21—Sulfonamides having sulfur atoms of sulfonamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/22—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C311/29—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound oxygen atoms having the sulfur atom of at least one of the sulfonamide groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C311/00—Amides of sulfonic acids, i.e. compounds having singly-bound oxygen atoms of sulfo groups replaced by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/30—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C311/45—Sulfonamides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by singly-bound nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups at least one of the singly-bound nitrogen atoms being part of any of the groups, X being a hetero atom, Y being any atom, e.g. N-acylaminosulfonamides
    • C07C311/46—Y being a hydrogen or a carbon atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/23—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/46—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton having at least one of the nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, further bound to other hetero atoms
    • C07C323/49—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton having at least one of the nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, further bound to other hetero atoms to sulfur atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C335/00—Thioureas, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C335/04—Derivatives of thiourea
    • C07C335/16—Derivatives of thiourea having nitrogen atoms of thiourea groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C335/00—Thioureas, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C335/04—Derivatives of thiourea
    • C07C335/16—Derivatives of thiourea having nitrogen atoms of thiourea groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton
    • C07C335/18—Derivatives of thiourea having nitrogen atoms of thiourea groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of a carbon skeleton being further substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/24—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D213/36—Radicals substituted by singly-bound nitrogen atoms
    • C07D213/42—Radicals substituted by singly-bound nitrogen atoms having hetero atoms attached to the substituent nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/62—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D213/70—Sulfur atoms
    • C07D213/71—Sulfur atoms to which a second hetero atom is attached
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D217/00—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems
    • C07D217/02—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems with only hydrogen atoms or radicals containing only carbon and hydrogen atoms, directly attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring; Alkylene-bis-isoquinolines
    • C07D217/08—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems with only hydrogen atoms or radicals containing only carbon and hydrogen atoms, directly attached to carbon atoms of the nitrogen-containing ring; Alkylene-bis-isoquinolines with a hetero atom directly attached to the ring nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D223/00—Heterocyclic compounds containing seven-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D223/14—Heterocyclic compounds containing seven-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D223/18—Dibenzazepines; Hydrogenated dibenzazepines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/10—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D307/14—Radicals substituted by nitrogen atoms not forming part of a nitro radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/38—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D307/52—Radicals substituted by nitrogen atoms not forming part of a nitro radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D317/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D317/08—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3
    • C07D317/44—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3 ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D317/46—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3 ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with one six-membered ring
    • C07D317/48—Methylenedioxybenzenes or hydrogenated methylenedioxybenzenes, unsubstituted on the hetero ring
    • C07D317/50—Methylenedioxybenzenes or hydrogenated methylenedioxybenzenes, unsubstituted on the hetero ring with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to atoms of the carbocyclic ring
    • C07D317/58—Radicals substituted by nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/06—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D333/14—Radicals substituted by singly bound hetero atoms other than halogen
    • C07D333/20—Radicals substituted by singly bound hetero atoms other than halogen by nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/26—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D333/30—Hetero atoms other than halogen
    • C07D333/34—Sulfur atoms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Vynález se týká zjištení, že specifické lidské receptory ve skupine chutových receptoru T2R reagují na konkrétní horké slouceniny prítomné napr. v káve. Vynález se také týká nalezení konkrétních sloucenin a kompozic obsahujících funkci blokování horké chuti a jejich použití jako blokátoru horké chuti nebo modulátoru príchuti, napr. v káve a v potravinách, nápojích a lécivech s príchutí kávy. Vynález se také týká nalezení slouceniny, která antagonizuje mnoho ruzných lidských T2R a jejího použití v testech a jako blokátoru horké chuti v kompozicích pro požití lidmi nebo zvíraty.

Description

IDENTIFIKACE LIDSKÝCH T2R RECEPTORŮ, KTERÉ REAGUJÍ NA HOŘKÉ SLOUČENINY, KTERÉ VYVOLÁVAJÍ HOŘKOU CHUŤ V KOMPOZICÍCH, A JEJICH POUŽITÍ V TESTECH PRO IDENTIFIKACI SLOUČENIN, KTERÉ INHIBUJÍ (BLOKUJÍ) HOŘKOU CHUŤ V KOMPOZICÍCH ,Γ<^Η P<H ŽITÍ
PŘÍBUZNÉ PŘIHLÁŠKY
10001J Tato přihláška nárokuje prioritu z US prozatímní přihlášky δ. 60/957,129 podané 21.srpna 2007 a US prozatímní přihlášky č. 61/047,187 podané 23.dubna 2008 a vztahuje se kUS přihlášce δ. 11/766,974, která je pokračovací přihláškou US přihlášky δ. 11/555,617 podané 1.listopadu 2006, která je pokračovací přihláškou US přihlášky č. 10/191,058 podané lO.července 2002 a také pokračovací přihláškou US přihlášky č. 10/742,209 podané Lprosince 2003, která je vyloučenou přihláškou z US přihlášky č. 09/825,882 podané 5 dubna 2001 a nyní US patentu č. 7,105,650, přičemž všechny tyto prihlášky jsou zde celé začleněny tímto odkazem.
OBLAST TECHNIKY
10002] Tato přihláška se týká identifikace lidských chuťových receptorů typu 2 (hT2R) a jejich použití v testech pro identifikaci ligandů, které aktivují specifické T2R. Tyto ligandy jsou užitečné pro modulaci chuťového vjemu, zejména hořké chuti. V našich předchozích přihláškách vynálezů jsme popsali funkční expresi lidských receptorů hořké chuti, včetně hT2R8 a hT2R14. V této přihlášce vynálezu uvádíme, že hT2R8 a hT2R14 jsou aktivovány frakcí kávy se zesílenou hořkostí, dále uvádíme identifikaci antagonist hT2R8 a hT2R14 za použití vysokopropustného screeningového testu a že kombinace antagonist může snížit horkou chuť kávy a kávových frakcí. Tento vynález poskytuje způsob modifikace a zlepšení chuti kávových nápojů.
I0O0JI Zejména se ^nález lýká použiti hT2RS a/nebo hT2Rl 4 ve screeningovýeh testech . chuťových testech pro identifikaci sloninám, které inhibuji (blokuji) hořkou chuť kávy a dalších potravin a nápojů.
10004) Vynález se rovnéž týká nalezeni llgandu. kletý má Símké antagonistické vlastnosti veil horkost·. tj. Významné blokuje nebo inhibuje aktivaci mnoha (13) různých receptorů hořkost, tížnými skupinami hořkých Ugandů a blokuje nebo iuhibuje aktivaci šesti dalších receptorů hořké chuti, jakož í hořkost vyvolanou trékterými hořkými sloučeninami, pro nůž doposud nebyl(y) objasněny) receplorty) hořkosti, s nimž(nimiž) interaguji.
I0M5I Konkrétněji se vynález týká nalezeni ligandu, který je zde označován jako sloučenina C, kteří má široké antagonistické vlastnost, vůči hořkosti, (j. významné blokuje nebo inhibuje aktivaci receptorů hořké chuti hT2R3, 7, 10, 14, 16, 44, 51, 55, 61, 63, 64,65 a 71 různými skupinami ligandů a blokuje nebo inhibuje aktivaci šesti dalších receptorů hořké chuti, tj. hT2R5, 9, 13, 54, 67 a 75, jakož i hořkost vyvolanou některými hořkými sloučeninami, pro něž doposud nebyl(y) objasněn(y) receptový) hořkosti, s nímž(nimiž) interaguji.
[0006| Dále se vynález také týká zjištění, že tato antagonistická sloučenina snižuje hořkou chuť salicinu, antagonisty hT2R16, a fenylthiomočoviny, antagonisty hT2R51,
[0007| Vynález konkrétněji také poskytuje zjištění, že tato stejná antagonistická sloučenina blokuje hořkou chuť vyvolanou hořkými sloučeninami, které aktivují mnohonásobné receptory hořké chuti, včetně omeprazolu, který aktivuje hT2R10, 14 a 75; Rebaudiosidu A, přírodního sladidla, které aktivuje alespoň 7 receptorů hořké chuti; a že tato stejná antagonistická sloučenina dále také inhibuje hořkou chuť vyvolanou hořkými sloučeninami, kde receptorfy) hořkosti, s nímž(nimiž) interaguje, je(jsou) neznámý(é), včetně dextromethorfanu a difenhydraminu.
[0008] Na základě toho se vynález týká použití této sloučeniny v potravinách, nápojích, léčivech a dalších poživatin za účelem zmírněni jejích hořké chuti, včetně hořké chuti vyvolané neidentifikovanými hořkými ligandy nebo sloučeninami, přičemž hořkost zahrnuje aktivaci mnohonásobných receptorů hořkosti, nebo pro hořké sloučeniny, u nichž není stanovena specifita jejich receptorů.
[0009] Na základě toho se vynález také týká použití tohoto antagonisty za účelem objasnění zachovaného motivu přítomného v různých lidských T2R, který se zapojuje do vázání ligandu a aktivace T2R, a návrhu chimérických a zmutovaných receptorů navázaných na G protein (GPCR), které jsou sestaveny tak, aby tento motiv obsahovaly.
[0010| Dále se vynález týká kterékoli sloučeniny identifikované za použití těchto screeningových testů a jejího použití v potravinách, nápojích a léčivech, včetně kávy a potravin a nápojů a léčiv s příchutí kávy,
POPIS SOUVISEJÍCÍHO STAVU TECHNIKY
[0011] Jedním ze základních chutových vjemů, které lidé umí rozpoznat, je hořkost. Fyziologie hořké chuti nebyla donedávna zcela pochopena. Nedávné studie začaly objasňovat biologii chuti (Lindemann, Nature (2001)). Nyní je známo, že mnoho hořkých sloučenin produkuje hořkou chul interakcí s receptory na buněčném povrchu. Tyto receptory patří do skupiny sedmi transmembránových doménových receptorů, které interaguji s vnitrobuněčnými G proteiny. U lidí a hlodavců byla identifikována nová skupina GPCR, označovaná jako T2R (Adler a kol., Cell 100(6):693-702 (2000); Chandrashekar a kol.. Cell
100(6): 703-711 (2000); Matsunami H, Montmaycur J P, Buck L B. Nature 404(6778): 601-4 (2000)). Pár řádků dokumentace před tímto vynálezem naznačilo, že T2R zprostředkovávají odpovědi na hořké sloučeniny. Za prvé, geny T2R jsou specificky exprimovány v podskupině buněk chuťových receptorů jazyka a epitelu patra. Za druhé, gen pro jeden z lidských T2R (hT2Rl) je umístěn v chromozomálním loku, který je spojen s citlivostí k hořké sloučenině 6n-propyl-2-thiouracilu u lidí (Adler a kol., (Id.) (2000)). Za třetí, jeden z myších T2R (mT2R5) je umístěn v chromozomálním loku, který je spojen s citlivostí k hořké sloučenině cykloheximid u myší. Bylo rovněž známo, že mT2R5 mohou aktivovat gustducin, G protein specificky exprimovaný v chuťových buňkách a spojený s transdukci horkých stimulů (Wong a kol., Nature 381:796-800 (1996)). Aktivace gustducinu receptorem mT2R5 se odehrává pouze v odpověď na cykloheximid (Chandrashekar a kol., (Id.) (2000)). Proto bylo navrženo, že skupina mT2R zprostředkovává hořkou chuťovou odezvu u myší, zatímco skupina hT2R zprostředkovává hořkou chuťovou odezvu u lidí. Byl navržen pouze jeden lidský T2R, jakožto receptor, který má identifikovaný hořký ligand - bylo prokázáno, že hT2R4 je aktivován denatoniem (Chandrashekar a kol., (Id.) 2000). Avšak koncentrace denatonia použité ve studii (1,5 mM) byly neobvykle vysoké, tj. byly 105-krát vyšší než je udávaná prahová hodnota hořkosti denatonia pro lidi (Sadili, Naturwissenschaften 71:428-429 (1984)). Proto nebyl k žádnému hT2R přesvědčivě přiřazen žádný konkrétní hořký ligand. Bylo také naznačeno, že každý hT2Rje schopen vázat mnohonásobné hořké ligandy. Tato hypotéza je založena na skutečnosti, že skupina hT2R sestává pouze z 25 identifikovaných členů, zatímco lidé umí rozpoznat stovky různých sloučenin jakožto hořkých. O sekvencích hT2R bylo již dříve referováno a jsou popsány ve zveřejněných PCT přihláškách Zuckera a kol. (WO 01/18050 A2, (2001)) a Adlera a kol. (WO 01/77676 Al (2001)), které jsou zde celé začleněny tímto odkazem.
[0012| Jedna z obtíží studia funkce T2R je, že tyto receptory se neexprimují snadno v kultivovaných savčích buněčných liniích. Pro zlepšení exprese T2R se k sekvencím T2R připojda N-koncová sekvence z dobře exprimovaného GPCR, rhodopsinu (Chandrashekar a kol., (Id.) 2000). Tato N-koncová značka rovněž umožnila snadné monitorování exprese proteinu díky dostupné protilátce. Navíc se pro zlepšení exprese T2R použila značka SSTR3 (Bufě a kol., Nat. Genet. 32:397-400 (2002)), jiná N-koncová značka. Zatímco začlenění rhodopsinové značky zlepšilo expresi některých T2R v savčích buněčných liniích, mnoho z nich stále nebylo exprimováno dostatečně pro fimkční studie. V jiné koncepci byl mT2R5 úspěšně exprimován ve hmyzích S19 buňkách a použit pro funkční studie za použití biochemického GTPyS vazebném testu (Chandrashekar a kol., (Id.) 2000).
[0013] Ve dřívější přihlášce vynálezu přihlašovatelů, US přihlášce č. 09/825,882, nyní patentu US £. 7,105,650, přihlašovatelé identifikovali a poskytli sekvence nukleových kyselin a polypeptidové sekvence pro mnoho tehdy nových lidských chuťových receptorů, včetně hT2R51, hT2R54, hT2R55, hT2R61, hT2R63, hT2R64, hT2R65, hT2R67, hT2R71 a hT2R75. Navíc v US přihláškách č. 11/182,942 a 10/628,464, které jsou zde celé začleněny tímto odkazem, poskytli přihlašovatelé polypeptidovou a DNA sekvenci pro další identifikovaný nový lidský chuťový receptor nazvaný hT2R76.
[0014] Také v US přihlášce č. 10/191,058, která je zde celá začleněna tímto odkazem, objevili přihlašovatelé ligandy, které specificky aktivují tři různé lidské T2R. Navíc přihlašovatelé nedávno podali US přihlášku vynálezu č. 11/455,693, která je zde celá začleněna tímto odkazem, která dále identifikovala hořké ligandy, které se specificky vážou na další lidské T2R, a poskytli příslušné testy.
[0015] Pokud jde o praktické využití vynálezu, je známo, že jak chuťové receptoiy T2R, tak T1R, se exprimují v gastrointestinálním systému. Například Wu a kol., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 99(4):2392-7(2002) uvádějí, že T2R jsou exprimovány v enterendokrinálních buňkách (STC1 buňky), jakožto i gustducinové a transducinové podjednotky, a že tyto buňky pravděpodobně odpovídají na hořké ligandy v gastrointestinálním traktu. Také bylo zaznamenáno Chen a kol., AM J. Physiol, Cell Physiol. 291(4):C723-39 (2006), že podněty hořké chuti vyvolávají signalizaci Ca^ a uvolňování cholecystokininu (CCK) v enterendokrinálních buňkách STC-1. Také Rozengurt, A J Physiol Gastrointes Liver Physiol 291(2):G171-7 (2006) uvádí, že chuťové receptory ve střevě pravděpodobně hrají roli v molekulární detekci řízení trávicích funkcí a hormonálních a/nebo neuronových cestách a že mohou hrát roli v detekci škodlivých léčiv a přežívacích odpovědích. Dále Stemini Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292(2):G457-61 (2007) uvádí, že chuťové receptory ve střevě se mohou účastnit gastrointestinálních funkcí, např. molekulární detekce, absorpce živin, ochrana před škodlivými látkami, a dále naznačují, že porozumění těmto mechanismům může být důležité pro chorobné stavy, např. poruchy stravováni a záněty. Dále bylo nedávno naznačeno v Mace a kol., J. Physiol. 2007 (Epub), že T2R a T1R aktivují fosfolipázu C beta 2, PLC beta 2, a že ve střevě je pravděpodobně molekulami intestinální kontrolní systém podobný systému, který je v buňkách jazyku, a že gastrointestinální buňky, např. kartáčové buňky nebo osamocené chemosenzorické buňky exprimující chuťové receptory, mohou způsobit zvýšení GLUT2 a mohou hrát roli v detekci živin a ve výživě při léčbě obezity a diabetů. Také Cui a kol., Curr Pharm Des. 12(35):4591-600 (2006) naznačují, že T1R exprimované ve střevě mohou být použity v testech pro sloučeniny při léčbě obezity a diabetů, jakož i jako umělá sladidla.
[0016] Avšak nehledě na to, co bylo zaznamenáno, a nehledě na poznání, že členové T2R regulují hořkou chuť, a na jejich možnou roli v gastrointestinálních funkcích, stále zde existuje potřeba identifikace specifických lígandů, které aktivují lidské receptory T2R hořké chuti. Větší porozumění vazebným vlastnostem různých T2R, zejména lidského T2R, by bylo velmi prospěšné, protože to ohromně usnadní jejich použití při výběru sloučenin, které mají požadované vlastnosti modulace chuti, tj. které blokují nebo inhibují chuť specifických hořkých sloučenin. Také to zajistí identifikaci sloučenin pro léčbu a modulaci gastrointestinálních funkci a příbuzných onemocnění, např. obezity, diabetes, absorpce potravy, vnímání potravy, poruch jedení, a pro regulaci příbuzných hormonů a peptidů, např. GLUT2, cholecystokinu atd.
PODSTATA VYNÁLEZU
[0017] Vynález se týká zjištění, že hT2R8 a hT2Rl4 jsou aktivovány frakcí kávy obohacenou hořkou chutí.
|0018| Vynález se rovněž týká jejich použití pro identifikaci antagonists hT2R8 a hT2R14, které inhibují nebo blokují hořkou chuť kávy nebo potravin, nápojů a léčiv s příchutí kávy.
[0019| Dále se vynález týká specifických antagonistických sloučenin (blokátorů hořkosti), které inhibují horkou chuť kávy a dalších potravin, nápojů a léčiv s příchuti kávy.
[0020] Tento vynález se také týká nalezeni ligandu, který má široké antagonistické vlastnosti vůči hořkosti, tj. významně blokuje nebo inhibuje aktivaci mnoha (13) různých receptorů hořkosti různými skupinami hořkých ligandů a blokuje nebo inhibuje aktivaci šesti dalších receptorů hořké chuti a inhibuje hořkost vyvolanou některými hořkými sloučeninami, jejichž receptory hořkosti, s nimiž interagují, zatím nebyly objasněny.
[0021] Konkrétněji se tento vynález týká objevení ligandu, který je zde nazýván sloučenina C a který má široké antagonistické vlastnosti vůči hořkosti, tj. významné blokuje nebo inhibuje aktivaci receptorů hořké chuti hT2R3, 7, 10, 14, 16, 44, 51, 55, 61, 63, 64, 65 a 71 nižnými skupinami hořkých ligandů a blokuje nebo inhibuje aktivaci šesti dalších receptorů hořké chuti, tj. hT2R5, 9, 13, 54, 67 a 75, jakož i hořkost vyvolanou některými hořkými sloučeninami, jejichž receptový) hořkosti, s nímž(nimiž) interagují, zatím nebyl(y) objasněn(y).
|0022] Konkrétněji vynález rovněž poskytuje zjištění, že tato antagonistická sloučenina snižuje hořkou chuť salicinu, antagonisty hT2R16, a fenylthiomočoviny, hT2R51.
(0023] Dále se tento vynález týká zjištění, že tato antagonistická sloučenina blokuje hořkou chuť vyvolanou hořkými sloučeninami, které aktivují násobné receptory hořké chuti, včetně omeprazolu, sloučeniny, která aktivuje hT2R10, 14 a 75; rebaudiosidu A, přirozeného sladidla, které aktivuje alespoň 7 receptorů hořké chuti; a že tato stejná antagonistická sloučenina dále také inhibuje horkou chuť vyvolanou hořkými sloučeninami, jejichž receptoity) hořkosti, s nímž(nimiž) interagují, není(nejsou) znám(y), včetně dextromethorfanu a difenhydraminu.
|0024| Na základě toho se vynález týká použití této sloučeniny a příbuzných sloučenin, podle vynálezu, v potravinách, nápojích, léčivech a dalších poživatinách za účelem zeslabení jejich hořké chuti, včetně hořké chuti vyvolané neidentifikovanými hořkými ligandy nebo sloučeninami, přičemž hořkost zahrnuje aktivaci násobných receptorů hořkosti nebo hořkých sloučenin, kde specifitajejich receptorů není stanovena.
10025] Vynález se také týká potravin, nápojů a léčiv, které obsahují množství alespoň jedné z identifikovaných antagonistických sloučenin hořkosti dostatečné k inhibici nebo blokaci jejich hořké chuti.
|0026] Vynález byl vynalezen za použití buněčných testů, které měřily aktivitu T2R za použití buněk, které exprimují konkrétní T2R v přítomnosti a v nepřítomnosti specifických hořkých ligandů. Zejména, jak je detailněji popsáno níže, se v buněčných testech použily buněčné linie HEK exprimující výše uvedené specifické T2R na svém povrchu a které dále exprimovaly chimérický G protein, který se funkčně váže k těmto T2R, přičemž testy detekovaly změny ve vnitrobuněčné koncentraci vápníku. Zjistilo se, že jsou tyto T2R aktivovány specifickými hořkými sloučeninami, zatímco jiné hT2R nebyly za podobných podmínek aktivovány.
[0027] Proto vynález zahrnuje použití těchto lidských receptorů chuti v testech, s výhodou ve vysokopropustných testech (HT), za účelem identifikace jiných sloučenin, které modulují, s výhodou blokují, aktivaci těchto receptorů těmito nebo jinými hořkými sloučeninami přítomnými v kávě a podobných potravinách nebo nápojích.
[0028| Vynález se také týká použití těchto receptorů pro identifikaci sloučenin, zejména sloučenin přítomných v kávě a potravinách, nápojích a léčivech s příchutí kávy, které vyvolávají hořkou chuť.
|0029| Vynález se rovněž týká použití antagonistické sloučeniny, která disponuje širokým rozmezím antagonistických vlastností, pro in vitro testy a in vivo chuťové testy za účelem identifikace hořké sloučeniny (hořkých sloučenin) nebo hořkých frakcí, jimž tato sloučenina inhibuje horkou chuť jimi vyvolanou a/nebo inhibuje aktivaci jednoho nebo více receptorů hořké chuti hořkou sloučeninou nebo frakcí, která tuto hořkou sloučeninu obsahuje.
[00301 Dále se vynález konkrétně týká použití tohoto antagonisty s širokou působností v potravinách, nápojích, léčivech a dalších jedlých produktech pro požívání lidmi nebo zvířaty, kde je hořká chuť vhodně zeslabena.
|0031] Vynález také zahrnuje testy, které obsahují přídavný krok, který hodnotí účinek identifikovaných modulujících sloučenin v lidských a dalších chuťových testech, a zejména hodnotí účinek identifikovaných sloučenin na hořkou chuť, zejména hořkou chuť vyvolanou kávou a frakcemi odvozenými z kávy obsahujícími jednu nebo více sloučenin, které vyvolávají vjem hořké chuti.
[0032] Dále vynález zahrnuje výrobu kávy a potravin, nápojů a léčiv s příchutí kávy, které byly ošetřeny za účelem odstranění sloučenin, které specificky aktivují tyto receptory hořké chuti, např. potravin a nápojů, které byly zpracovány za účelem odstranění nebo snížení množství v nich obsažených hořkých sloučenin.
[0033] V některých aspektech se vynález také týká strukturních tříd sloučenin, které představují níže uvedené dva scaffoldy. Scaffold 1 znázorňuje představitele urazolového scaffoldu a scaffold 2 znázorňuje představitele hydantoinového scaffoldu.
Scaffold 1
Scaffold 2
[0034] Dalším specifickým předmětem vynálezu je použití sloučenin znázorněných výše a analogů scaffoldu 1 a scaffoldu 2 jako blokátorů hořkosti za účelem snížení hořkosti v potravinářských/farmaceutických aplikacích, které jsou zprostředkovány receptory T2R8, zejména v kávě a potravinách, nápojích a léčivech s příchutí kávy.
[0035] Dalším předmětem vynálezu je potvrdit, že identifikované sloučeniny modulují, s výhodou inhibují nebo blokují, hořkou chuť, např. kterou vyvolává káva a potraviny, nápoje a léčiva s příchutí kávy, v lidských nebo zvířecích chuťových testech, s výhodou v lidských chuťových testech. Příklad 1 znázorňuje příklad smyslových údajů pro jednu z těchto sloučenin. Údaje jasně prokazují významný pokles hořkosti pro specifického antagonistu T2R8 a výrazné zvýšení účinnosti oproti známému blokátorů hořkosti T2R8.
[0036] Dalším předmětem vynálezu je využití sloučenin zde uváděných jako aditiva nebo modulátory příchuti v kompozicích za účelem inhibice nebo blokace hořké chuti vyvolané sloučeninami, které specificky aktivují tyto chuťové receptory. Výhodným předmětem vynálezu je použití sloučeniny, která inhibuje aktivaci receptorů T2R8 za účelem blokace hořké chuti sloučenin přítomných v kávě a potravinách, nápojích a léčivech s příchutí kávy.
|0037] Sloučeniny identifikované podle vynálezu se mohou přidat do potravin, nápojů, kosmetiky nebo léčebných kompozic pro modulování, s výhodou blokování hořké chuti spuštěné aktivací hT2R8 hořkými sloučeninami přítomnými v kávě a příbuzných potravinách, nápojích a léčivech nebo strukturně podobnými sloučeninami nebo jinými hořkými sloučeninami, např. sloučeninami, které se nalézají v potravinách a nápojích nebo léčivech nebo v kosmetice a které vyvolávají vjem hořké chuti.
PŘEDMĚTY VYNÁLEZU
[0038| Předmětem vynálezu je poskytnout testy, které využívají hT2R8 a/nebo hT2R14 a jejich chiméry a varianty, které identifikují sloučeniny a kompozice obsahující tyto sloučeniny, které vyvolávají nebo blokují hořkou chuť spojenou s kávou a potravinami, nápoji a léčivy s příchutí kávy.
[0039] Specifickým předmětem vynálezu je poskytnout testy, které identifikují sloučeniny, které aktivují nebo které blokují nebo modulují aktivaci a/nebo vázání hT2R8 na sloučeniny nebo kompozice, které je obsahují, zodpovědné za hořkou chuť kávy.
[0040] Rovněž je specifickým předmětem vynálezu poskytnout testy, které identifikují sloučeniny, které aktivují nebo které blokují nebo modulují aktivaci a/nebo vázám' hT2R14 na sloučeniny nebo kompozice, které je obsahují, zodpovědné za hořkou chuť kávy.
|0041| Dalším specifickým předmětem vynálezu je poskytnout specifické sloučeniny identifikované za použiti testů podle vynálezu a kompozice, které je obsahují, zejména kávu a potraviny, nápoje a léčiva s příchutí kávy.
[0042] Specifickým předmětem vynálezu je poskytnout sloučeniny znázorněné níže, které jsou antagonisty T2R8 a T2R14 a o nichž bylo prokázáno, že blokují hořkost kávy.
Sloučenina A
ICj0= O,3uM(hT2RO8)
Sloučenina B lC5n = 0,4 uM (hT2R08)
Sloučenina C 1CM - 0,2 uM (hT2R014)
[0043] Dalším předmětem vynálezu je použití sloučenin znázorněných výše a analogů sloučeniny A, sloučeniny B a sloučeniny C jako blokátorů hořkosti za účelem snížení hořkosti v potravinářských/farmaceutických aplikacích, která je zprostředkována receptory T2R8 a/nebo T2R14, zejména v kávě a v potravinách, nápojích a léčivech s příchutí kávy.
[0044] Dalším specifickým předmětem vynálezu je použití sloučeniny C a jejích analogů jakožto blokátorů hořkosti s širokou působností za účelem snížení hořkosti v potravinářských/farmaceutických aplikacích, která je zprostředkována kterýmkoli z lidských T2R3, 7, 10, 14, 16, 44, 51, 55, 61, 63, 64, 65 nebo 71 a/nebo lidským T2R5, 9, 13, 54, 67 nebo 75, v potravinách, nápojích a léčivech obsahujících četné hořké sloučeniny, hořké sloučeniny, které interagují s mnohonásobnými receptory hořké chuti nebo kompozice obsahující neznámé hořké sloučeniny nebo hořké sloučeniny, jejichž specifita receptoru není známa.
[0045] Dalším specifickým předmětem vynálezu je poskytnutí sloučenin, které mohou být znázorněny následujícími vzorci.
|0046] V prvním aspektu je poskytnuta sloučenina dle strukturního vzorce (1):
X / (R''^—Ar1-R1—
B (I) nebo její sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid, kde:
Ar1 je pěti- nebo šestičlenný arylový, heteroarylový nebo cykloalkylový kruh;
mje 0, 1, 2 nebo 3;
R1 je SO?; C=O; C=S; nebo ONOR4;
X je vybráno ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO?, OR6, S(O)sR6, NR6R7, conr6r7, co2r6, NR6CO2R7, NR6CONR7Ra, nr6csnr7r8, NR6C(=NH)NR7R8, so?nr5r6, nr5so?r6, nr5so2nr6r7, bíor^or6), P(O)(ORS)(OR6) a P(O)(R5)(OR6);
každý R1' je nezávisle zvolen ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, he ternary laiky lu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, conr6r7, co2r6, nr6co2r7, nr6conr7r8, nr6csnr7r8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5Rů, NR5SO2Rs, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6) a P(O)(R5)(OR6);
nebo alternativně X a/nebo alespoň jeden R'1 spolu s atomy, k nimž jsou navázány, tvoří arylový, substituovaný arylový, heteroarylový, substituovaný heteroarylový, cykloalkylový, substituovaný cykloalkylový, cykloheteroalkylový nebo substituovaný cykloheteroalkylový kruh, kde kruh je případně kondenzovaný sjiným arylovým, substituovaným arylovým, heteroarylovým, substituovaným heteroarylovým, cykloalkylovýtn, substituovaným cykloalkylovým, cykloheteroalkylovým nebo substituovaným cykloheteroalkylovým kruhem;
R4-R8 jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu a substituovaného heteroarylalkylu nebo alternativně R5 a R6, R6 a R7, R7 a R8, spolu s atomy, na něž jsou vázány, tvoří cykloheteroalkylový nebo substituovaný cykloheteroalkylový kruh;
A a B jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu; a b je 0,1 nebo 2.
100471 V některých provedeních A a B spolu s dusíkem, na který jsou připojeny, tvoří kruh, který může být zkondenzovaný s dalšími substituovanými nebo nesubstituovanými kruhy a může obsahovat alespoň jednu dvojnou vazbu. Neomezující příklad takového kruhu zahrnuje skupinu dle vzorce:
[00481 Ve druhém aspektu poskytuje vynález sloučeniny dle strukturního vzorce (II) znázorněného níže:
X ί^Η2χ-Υ—Ar2—(Rz')n (R1')m—Ar’-R1— N (CH2),-Z- Ar3— (R3')P (H) nebo jejich sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid, kde:
Ar1, Ar2 a A? jsou nezávisle pěti- nebo šestičlenný arylový, heteroaiylový nebo cykloalkylový kruh;
mje 0, 1,2 nebo 3;
n a pjsou nezávisle 0, 1, 2, 3 nebo4;
r a t jsou nezávisle 0,1 nebo 2;
Y a Z jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z CR6R7, C=O, C=S, C=NOR6, O, NR6 a S(O)b;
R1 je vybrán ze skupiny sestávající z SO2, C=O, C=S a C=NOR4;
X je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroaiylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO2, -OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7Rs, NR6CSNR7Rs, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NRsR6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, BiOR’XOR6), P(O)(OR5)(OR6) a P(O)(R5)(OR6);
X je s výhodou vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroaiylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, S(O>,R6, CONR6R7, -CO,R6, SO2NR3R6, NRjSO2R6, NR3SO2NR6R7, B(OR3)(OR6), P(O)(OR5)(OR6) a P(0)(RS)(OR6);
každý R1' je nezávisle zvolen ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, conr6r7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R3, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NRsR6, NR3SO2R6, NR5SO3NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6) a P(O)(R5)(OR6);
každý R2' je nezávisle zvolen ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, conr6r7, co2r6, NR6CO2R7, NR6CONR7Rs, nr6csnr7r8, NR6C(=NH)NR7R8, so2nr5r6, NRsSO2R6, NRsSO2NR6R7, B(OR5)(OR6) a P(O)(OR5)(OR6);
každý R3' je nezávisle zvolen ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO2, OR6, S(O%R6, nr6r7, conr6r7, co2r6, nr6co2rt, nr6conr7r8, nr6csnr7r8, NR6C(=NH)NR7Rs, so2nr5r6, nr5so2r6, nr5so2nr6r7, B(0R5)(0R6), P(O)(OR5)(OR6) aP(O)(R5)(OR6);
nebo altemativné, X a/nebo alespoň jeden R1’ spolu s atomy, na něž jsou vázány, tvoří arylový, substituovaný arylový, heteroarylový, substituovaný heteroarylový, cykloalkylový, substituovaný cykloalkylový, cykloheteroalkylový nebo substituovaný cykloheteroalkylový knih, který je případně zkondenzovaný s dalším arylovým, substituovaným arylovým, heteroarylovým, substituovaným heteroarylovým, cykloalkylovým, substituovaným cykloalkylovým, cykloheteroalkylovým nebo substituovaným cykloheteroalkylovým kruhem;
R4-R8 jsou nezávisle vodík, alkyl, substituovaný alkyl, atyl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heteroalkyl, substituovaný heteroalkyl, heteroaryl, substituovaný heteroaryl, heteroarylalkyl nebo substituovaný heteroarylalkyl nebo alternativně Rj a R6, R6 a R7, R7 a R8, spolu s atomy, na něž jsou vázány, tvoří cykloheteroalkylový nebo substituovaný cykloheteroalkylový kruh;
bje 0, 1 nebol.
10049] V dalším aspektu vynález poskytuje sloučeniny dle strukturního vzorce (III) znázorněného níže:
O
Ηθ4 CH2—AA-(R2')n \ q/0 /
Ar1-S— CH2—Ar3—(R3')p (III) nebo jejich sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid, kde:
Ar', Ar a A? jsou nezávisle pěti- nebo šestičlenný arylový, heteroarylový nebo cykloalkylový kruh a Ar a Ar3 mohou být případně vynechány;
mje O, 1, 2 nebo 3;
n a pjsou nezávisle 0,1,2, 3 nebo 4;
každý R1' je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO?, OR6, SCOjtR6, NR6R7, conr6r7, co2r6, NR6CO2R7, NR6CONR7Rs, nr6csnr7r8, NR6C(=NH)NR7R8, so2nr5r6, nr3so2r6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6) a P(O)(RJ)(OR6);
každý R2' je nezávisle zvolen ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroaiylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroaiylalkylu, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7Rs, NR6C(=NH)NR7Rs, SO2NRsR6, NR5SO2R6, NRjSO2NR6R7, BÍOR^ÍOR6), P(O)(ORs)(OR6) aP(0)(R5)(0R6);
každý R3' je nezávisle zvolen ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO>, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, C02R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, so2nr3r6, NR5SO2R6, NR3SO2NR6R7, B(OR3)(OR6), P(O)(OR3)(OR6) a P(O)(R3)(OR6);
R R jsou nezávisle vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný aiylalkyl, heteroalkyl, substituovaný heteroalkyl, heteroaryl, substituovaný heteroaryl, heteroarylalkyl nebo substituovaný heteroarylalkyl nebo alternativně R3 a R6, R6 a R7, R7 a Rs, spolu s atomy, na něž jsou vázány, tvoří cykloheteroalkylový nebo substituovaný cykloheteroalkylový kruh;
b je 0, 1 nebo 2.
[0050| V ještě dalším aspektu vynález poskytuje sloučeninu dle níže uvedeného vzorce:
[0051] V ještě dalším- aspektu vynález poskytuje sloučeniny dle níže uvedených vzorců:
nebo jejich sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid.
[0052J V ještě dalších provedeních vynález poskytuje sloučeniny mající níže uvedené struktury:
nebo jejich sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid.
10053] Podobně je poskytnuta sloučenina dle strukturního vzorce (IV):
G R21
Ar4—W-Ar5—N ^20 (IV) nebo její sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid, kde:
Ar4 a Ar5 jsou nezávisle pěti- nebo šestičlenný arylový nebo heteroarylový kruh;
W je vybrán ze skupiny sestávající z CR6R7, C=O, C=S; C=N0R6; O, NR6, S, SO, SO2a(CH2)n;
njeO, 1, 2 nebo 3;
G je vybrán ze skupiny sestávající z CR6R7, C=O, C=S, C=NOR6 a 3(0^;
R20 je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, arylalkenylu, heteroarylalkenylu, arylalkylu, heteroarylalkylu, arylu, beteroarylu, alkylu, alkoxy-alkylu, alkenylu, cykloalkylu, cykloalkenylu a substituovaných derivátů;
R21 je vybrán ze skupiny sestávající z arylalkenylu, heteroarylalkenylu, arylalkylu, heteroarylalkylu, arylu, heteroaiylu, alkylu, alkoxy-alkylu, alkenylu, cykloalkylu, cykloalkenylu a substituovaných derivátů;
R a R jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu nebo substituovaného heteroarylalkylu nebo alternativně R6 a R7, R7 a R8, spolu s atomy, na něž jsou navázány, tvoří cykloheteroalkylový nebo substituovaný cykloheteroalkylový knih; a bje 0,1 nebo 2.
[0054] V dalším podobném aspektu je poskytnuta sloučenina dle strukturního vzorce (V);
O . Z ^21
Ar4—(CH2)n—Ar5—N
R35 (V) nebo její sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid, kde:
Ar4 a Ar5 jsou nezávisle pěti- nebo šestičlenný arylový nebo heteroarylový kruh;
nje 0, 1, 2 nebo 3;
R je vybrán ze skupiny sestávající z arylalkenylu, heteroarylalkenylu, arylalkylu, hereoary laiky lu, arylu, heteroarylu, alkylu, alkoxy-alkylu, alkenylu, cykloalkylu, cykloalkenylu a substituovaných derivátů;
R je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu a substituovaného alkylu. [0055] V ještě dalších provedeních vynálezu je poskytnuta sloučenina dle strukturního vzorce (VI):
(VI) nebo její sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid, kde:
R30 je vybrán ze skupiny sestávající z arylalkenylu, heteroarylalkenylu, arylalkylu, hereoarylalkylu, arylu, heteroarylu, alkylu, alkoxy-alkylu, alkenylu, cykloalkylu, cykloalkenylu a substituovaných derivátů;
R35 je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu a substituovaného alkylu. |0056| Vještě dalších provedeních vynález poskytuje sloučeniny mající následující struktury:
O
nebo jejich sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid, kde každý R je nezávisle Cl, MeO, CN, EtO, OH, Me, -SO3Me, F nebo H a nje 0,1,2,3 nebo 4
10057] Vještě dalších provedeních vynález poskytuje sloučeniny mající strukturu uvedenou níže:
nebo jejich sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid, kde každý R je nezávisle MeO nebo OH, a n je 0,1,2,3 nebo 4.
10058] V ještě dalších provedeních vynález poskytuje sloučeniny mající níže uvedenou strukturu:
kde R je H, Me, Et, OCOMe, CHjOH, OMe nebo Ph.
[0059] V ještě dalších provedeních vynález poskytuje sloučeniny mající níže uvedenou strukturu:
MeOjS
nebo jejich sůl, hydrát, sol vát nebo N-oxid.
|0060| V ještě dalších provedeních vynález poskytuje sloučeniny mající níže uvedenou strukturu:
nebo jejich sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid.
|00611 V ještě dalších provedeních vynález poskytuje sloučeniny mající níže uvedenou strukturu:
nebo její sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid.
[0062| V ještě dalších provedeních vynález poskytuje sloučeniny mající níže uvedenou strukturu:
nebo jejich sůl, hydrát, sol vát nebo N-oxid.
[0063| V jednom aspektu se vynález týká sloučeniny vzorce:
θ. ^38 / Nt A^-Alk- Ar7—N R37 R38 nebo její sůl, hydrát, solvát, N-oxid nebo proléčivo, kde Ar6 a Ar7 jsou stejná nebo odlišná, nezávisle na sobě, pěti- nebo Šestičlenná arylová skupina nebo pěti- nebo šestičlenná heteroarylová skupina;
Alk je alkylová skupina, případně přerušená heteroatomem;
R36 a R37 jsou stejné nebo odlišné, nezávisle na sobě, H, alkyl, nebo R36 a R37 spolu s atomy, knimž jsou připojeny, tvoří případně substituovaný pěti- nebo šestičlenný heterocyklus; a
R38 je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl nebo haloalkyl.
[0064] V jednom aspektu sloučeniny podle vynálezu obsahují pěti-členný heterocyklus. V jednom provedení je pěti-členným cyklem hydantoin nebo substituovaná nebo nesubstituovaná cyklická močovina.
[0065] V jednom provedení je hydantoinem hydantoin dle vzorce:
Ar4—Aik—Ar7—hi
-^40 RM nebo jeho sůl, hydrát, solvát, N-oxid nebo proléčivo, kde Ar6 a Ar7 jsou stejná nebo odlišná, nezávisle na sobě, pěti- nebo šestičlenná arylová skupina nebo pěti- nebo šestičlenná heteroaiylová skupina;
Alk je alkylová skupina, případně přerušená heteroatomem;
R38 je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aiylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl nebo haloalkyl; a R” a R40 jsou stejné nebo odlišné, nezávisle na sobě, H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, haloalkyl, nebo Rw a R40, spolu s uhlíkovým atomem, k němuž jsou připojeny, tvoří skupinu C=O nebo substituovanou nebo nesubstituovanou alkenylovou skupinu.
1006«] V dalším aspektu sloučeniny podle vynálezu obsahují pěti-Členný heterocyklus, kterým je urazol. V jednom provedení je urazolem urazol dle vzorce:
O
Ar4—Alk—Ar7---N I o
nebo jeho sůl, hydrát, solvát, N-oxid nebo proléčivo, kde Ar6 a Ar7 jsou stejná nebo odlišná, nezávisle na sobě, pěti- nebo šestičlenná arylová skupina nebo pěti- nebo šestičlenná heteroaiylová skupina;
Alk je alkylová skupina, případně přerušená heteroatomem;
R38 je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, nebo haloalkyl; a
Rn je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, nebo haloalkyl.
(0067] V dalším aspektu sloučeniny podle vynálezu obsahují šestičlenný heterocyklus. V jednom provedení má šestičlenný heterocyklus vzorec:
V
Ar*—Alk—Ar7—N R<3 R« R«R« nebo jeho sůl, hydrát, sol vát, N-oxid nebo proiéčivo, kde R3S je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aiyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aiylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, nebo haloalkyl; a
Rr, R44, R45, a jsou stejné nebo odlišné, nezávisle na sobě, H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný oebo msubstiluovmý hacroMjL 5ubs,itovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, nebo R,, a nebo R,, a R», spolu s uhlikovjro moment, k němuž jsou připojeny, tvoří skupinu C=0.
10068] V dalším aspektu se vynález týká sloučeniny dle vzorce:
R47 oV^AIk N 0 \ > JL R R« 1 1
Rje R37 nebo její soli, hydrátu, solvátu, N-oxidu nebo proléčiva, kde Alk je alkylová skupina, případně přerušená heteroatomem;
je N nebo CR49, kde IU je H nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
M je N nebo CR50, kde R50 je H nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
Rsé a R37 jsou stejné nebo odlišné, nezávisle na sobě, H, alkyl, nebo, R3e a R„ spoiu s atomy, knimž jsou připojeny, tvoří případně substituovaný pěti- nebo šestičlenný heterocyklus; a R“ je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný oykloalkyMky!, substituovaný nebo nesubstituovaný herewcykloalkylalkyl substituovaný nebo nesubstituovaný aryl. substituovaný nebo nesubstitnovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný beteromylamidoitlkyl. substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný a^lalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný Iteteroatyl, substituovaný nebo „esubstttuovaný heteromyhtlkyl, nebo haloalkyl;
Kat je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo „esubsrintovaný myl, subsb^aný „eb„ váný arylalkyl, nebo halo; a
Ras je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo „substituovaný myl, substituovaný nebo „esubstituováný arylalkyl, nebo halo.
[0069] V ještě dalším aspektu se vynález týká sloučeniny dle vzorce:
Rw
nebo její soli, hydrátu, solvátu, N-oxidu nebo proléčiva, kde Alk je alkylová skupina, případně přerušená heteroatomem;
T. je OO a Q je CR51R32 nebo NRS1, kde R51 a R52 jSŮU stejné nebo nczávisie na sobě, H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aiyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamídoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaiylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylaikyl, haloalkyl, nebo R5I a R52, spolu s uhlíkovým atomem k němuž jsou připojeny, tvoří skupinu C=O nebo substituovanou nebo nesubstituovanou alkenylovou skupinu;
MJe N nebo CR49, kde R49je H nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
M2 je N nebo CR30, kde R30 je H nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
Rj8 je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl subsutuovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamtdoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, subst.tuovaný nebo nesubstituovaný heteroarylaikyl, nebo haloalkyl;
R47 je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstttuovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, nebo halo; a je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný atyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, nebo halo,
[0070] V ještě dalším provedení se vynález týká sloučeniny dle vzorce:
r r Π
nebo její soli, hydrátu, solvátu, N-oxidu nebo proléčiva, [0071] V ještě dalším aspektu se vynález týká sloučeniny dle vzorce:
nebo její soli, hydrátu, solvátu, N-oxidu nebo proléčiva.
ÍO072] V ještě dalším aspektu se vynález týká způsobu přípravy sloučeniny dle vzorce:
nebo její soli, hydrátu, solvátu, N-oxidu nebo proléčiva, kde Alk je alkylová skupina, případně přerušená heteroatomem;
Ti je C=S, C=O nebo S(O)3.
RS3 je substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl nebo substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl;
M je N nebo CR54, kde R54 je H nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
M- je N nebo CR55, kde R5Í je H nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
Rjs je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arytalkyl, nebo halo; a R” je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo «substituovaný atyl, substituovaný „ebo nesubstituovaný arylalkyl, nebo halo;
přičemž způsob zahrnuje reakci sloučeniny dle vzorce:
Rs·
R57 kde R56, RiT, a Alkjsou definovány výše a J je odstupující skupina;
se sloučeninou dle vzorce:
kde M1 a M2 jsou definovány výše, za vzniku sloučeniny dle vzorce
obsahující skupinu NO?;
redukci NO2 skupiny za vzniku sloučeniny obsahující skupinu NH?; a reakci sloučeniny obsahující NH2 skupinu se sloučeninou dle vzorce
J2 xTí'Ra kde J2 je odstupující skupina a T, a R53 jsou definovány výše.
100731 V jeStí dalším aspektu se vynález týk* způsobu přípravy s|ouťeni„y Λ vzorce: R47
nebo její soli, hydrátu, solvátu, Ν-oxidu nebo proléčiva, kde Alk je alkylová skupina, případné přerušená heteroatomem;
Rsi a Rn jsou stejné nebo odlišné, nezávisle na sobě, H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný atylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, haloalkyl, nebo R5I a RSJ, spolu s uhlíkovým atomem, kněmž jsou připojeny, tvoří substituovanou nebo nesubstituovanou alkenylovou skupinu;
M1 je N nebo CR49, kde je H nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
M je N nebo CRS0, kde R50 je H nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
R38 je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyi, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylanudoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaiylalkyl, nebo haloalkyl;
R47 je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, nebo halo; a
R48 je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, nebo halo;
přičemž způsob zahrnuje zahřátí sloučeniny dle vzorce:
R47
kde R47, R^Alk, M1, a M2 jsou definovány výše;
pro konverzi -CON, sk„p,n, m skupinu. a pak reakci se sloučeninou dle vzorce:
kde J, je odstupující skupina a R38, Rjb a R52 jsou definovány výše.
10074] V ještě dalším aspektu se vynález týká způsobu přípravy sloučeniny dle vzorce:
^47
nebo její soli, hydrátu, sol vátu, N-oxidu nebo proléčiva, kde Alk je alkylová skupina, případně přerušená heteroatomem;
R52 je H, substrtuovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalky 1, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkylanudoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, haloalkyl;
M je N nebo CR^, kde R49 je H nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
M je N nebo CR50, kde RJ0 je H nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
Rrs je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, nebo haloalkyl;
R47 je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo _ nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, nebo halo; a je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, nebo halo;
přičemž způsob zahrnuje zahřátí sloučeniny dle vzorce:
«47
O kde R47, R4g,Alk, M!, a M2 jsou definovány výše;
pro konverzi -CON, skupiny na -N=C=O skupinu, a pak reakci shydrazinem dle vzorce:
HN'*
I h2n kde R38 je definován výše.
[0075J V ještě dalším aspektu se vynález týká způsobu přípravy sloučeniny dle vzorce:
O
HO^I CH2—Ar2—(R2% \ O o / (R’^Ar’-S— CH2—Ap_ (R3.)p (ΠΙ) nebo její soli, hydrátu, solvátu nebo N-oxidu, kde:
Ar1, Ar2 a Ar3 jsou nezávisle pěti- nebo šestičlenný arylový, heteroarylový nebo cykloalkylový kruh, a Ar2 a A? mohou být případně vypuštěny;
mje 0, 1, 2 nebo 3;
n a p jsou nezávisle 0,1, 2, 3 nebo 4;
každý R1' je nezáviste vybrán κ 5tupiny z vod.tu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu' substituovaného arylu, heteroalkyln, substituovaného heteroalkylu, heterostyly substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heleroaryblkylu, CN NO, OR6, S(OWI‘, NRV, conr‘r', coa6, nr‘co,r; nr‘conr’r·, nr‘csnr’r· NR‘C(=NH)NR’R>, SOrNR’R·. NR!SO,R‘, NR^NrW, B(0RW> Í|«rá|ň a P(O)(R5)(OR6);
každý R-' je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO,,' OR6, S(O)bR6, NR6R7, conr6r7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8 NR6CNNH)NRX so2nr5r6, nr5so3r6, nr5so2nr6r7, bíorW6), P(O)(OR5)(OR6)’ a P(O)(R5)(OR6);
každý R3' je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu,' acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroaryl^ substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NOZ, OR6, S(O)bR6, NR6R7, conr6r7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6C0NR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SOjNR^6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6) a P(O)(R5)(OR6);
R -R jsou nezávisle vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heteroalkyl, substituovaný heteroalkyl, heteroaryl,’ substituovaný heteroaryl, heteroarylalkyl nebo substituovaný heteroarylalkyl nebo alternativně, R6 a R7, R7 a R8, spoiu s atomy, něž jsou navázányj cykioheteroalkylový nebo substituovaný cykloheteroalkylový knih;
bje 0, 1, nebo 2;
přičemž způsob zahrnuje reakci sloučeniny dle vzorce:
j kde J je odstupující skupina; se sloučeninou dle vzorce:
^CH2-AH—(R2% h2n za vzniku produktu; a reakci produktu se sloučeninou dle vzorce:
jx
CHz__,Af3_(R3,^ kde J je odstupující skupina.
[00761 Dalším předmětem vynálezu je využití sloučenin identifikovaných ve zde popsaných testech jako aditiv nebo modulátorů chuti v kompozicích za účelem inhibice nebo blokace hořké chuti vyvolané sloučeninami, které specificky aktivují tyto chuťové receptory. Výhodným předmětem vynálezu je použití sloučeniny, která inhibuje aktivaci alespoň jednoho z výše uvedených lidských T2R receptorů za účelem blokování hořké chuti sloučenin přítomných v kávě a v potravinách, nápojích a léčivech s příchutí kávy.
[0077| Dalším předmětem vynálezu je využití sloučenin podle vynálezu jakožto blokátorů hořkosti s širokou působností za účelem inhibice nebo blokace hořké chuti vyvolané sloučeninami, které specificky aktivují chuťové receptory hT2R8, ligandy, které aktivují násobné receptory hořké chuti, hořkými sloučeninami, které mají neznámou specifitu k receptorům, nebo kompozicemi obsahujícími neznámé nebo četné hořké sloučeniny. V jednom provedení se sloučeniny podle vynálezu využijí k inhibici aktivace alespoň jednoho z výše uvedených lidských receptorů T2R, čímž blokují hořkou chuť sloučenin přítomných v kávě nebo v potravinách, nápojích a léčivech s příchuti kávy. Dalším předmětem vynálezu je potvrdit, že identifikované sloučeniny modulují, s výhodou inhibují nebo blokují, hořkou chuť, např. vyvolanou kávou a potravinami, nápoji a léčivy s příchutí kávy, v chuťových testech na lidech nebo zvířatech, s výhodou v chuťových testech na lidech.
[0078] Dalším předmětem vynálezu je využití sloučenin identifikovaných ve zde popsaných testech jakožto aditiv nebo modulátorů příchuti v kompozicích za účelem inhibice nebo blokace hořké chuti vyvolané sloučeninami, které specificky aktivují tyto chuťové receptory. Výhodným předmětem vynálezu je použít sloučeninu, která inhibuje aktivaci alespoň jednoho z výše uvedených lidských receptorů T2R za účelem blokace hořké chuti sloučenin přítomných v kávě a v potravinách, nápojích a léčivech s příchutí kávy.
[00791 V obzvlášť výhodném provedení se použije sloučenina C a její analogy jako blokátory hořkosti s širokou působností za účelem inhibice nebo blokace hořké chuti vyvolané sloučeninami, které specificky aktivují chuťové receptory hT2R3, 7, 10, 14, 16, 44, 51, 55, 61, 63, 64, 65, 71 a/nebo hT2R5, 9, 13, 54, 67 a 75, ligandy, které aktivují násobné receptory hořké chuti, hořkými sloučeninami, které mají neznámou specifitu k receptorům, nebo kompozicemi obsahujícími neznámé nebo četné hořké sloučeniny. Vzhledem k rozsáhlým antagonistickým vlastnostem sloučeniny C by měla být výrazně zeslabena hořká chuť většiny hořkých sloučenin a kompozic obsahujících hořké sloučeniny. Výhodným předmětem vynálezu je použít sloučeninu, která inhibuje alespoň jeden z výše uvedených lidských chuťových receptorů T2R, např. sloučeninu C nebo její analog, pro blokád hořké chuti sloučenin přítomných v kávě a v potravinách, nápojích a léčivech s příchutí kávy.
PODROBNÝ POPIS OBRÁZKŮ
Obr. I se týká experimentů, kde se použila éástóní přemrštěná hořká frakce z kávy za účelem screening. 25 lidských T2R v přechodné mmsfektoeaných HEK bučkách jak je popsáno v předchozích přihláškách eyn.lez. pfihlatovatete, któ jsou zdc xom. luk je znázorněno na obr. I. kávová ftakce aktivovala budky HEK293, které byly dočasné transfektovány hT2R8 a ET2R14, ve vápníkovém zobrazovacím testu k.tóum imaging assay). Použilo se modré bmvivo FD&C pru snížení hladiny fluorescence kávové frakce, která by rušila při testu,
I0W1I Obr. 2 je graf závislosti OF.F na log kávové frakce, který ukazuje dávkově zavanu odezvu HT2RS a hT2R14 na hořce chutnající frakci pocházející z kávy. Test byl proveden za použiti stabilních buněčných linií hT2R8 a hT2R14 a automatického fluorescenčního detektoru FLIPR.
Í0082J Obr. 3 je graf závislosti procentuální inhibice aktivity hT2R8 na log koncentrace sloučeniny a ukazuje dávkově závislou inhibici pro sloučeniny A a B na stabilní buněčné linii exprimující hT2R8.
[0083] Obr. 4 je gmf procentuální inhibice aktivity hT2R14 v závislosti na log koncentrace sloučeniny C a znázorňuje dávkovou inhibici pro sloučeninu C na stabilní buněčné linii exprimující hT2R8.
|M84| Obr. 5 znázoriluje inhibičm aktivit. sloučenhly c receptorům hořké chuti.
100851 Obr. 6 je graf aktivity recepturu jako funkce log koncentrace sacharinu. Obr 6 znazortuje dávkové závislé vztahy a účinky sacharinu na Závity ν(ΚΜΜ,0.
váných bučkách exprimujíclch varianty ŮT2R43, hT2R44 a hT2R8. HT2R8 má menši odezvu »a sacterin v in vitm testu než alely hT2R43-W3S a hT2R44-W35 „uchutnávače“ ale má lepši odezvu než alely HT2R43-S35 a hT2R44-R35 „necehumávače-.
PODROBNÝ POPIS VYNÁLEZU
100801 Podle tohoto vynálezu molmu být sloučeniny pod|e vy k zeslabení nebo sniž™' hořké chůd kompozic, «př. poživatelné kompozice Vyraz ..pozivatelná kompozice, jak je zde užíván, zahrnuje jakoukuli látku mče„„ p» orilni pozm, a to buď samotnou nebo spolu , další látkou. Poživatel», kompozice zahrnuje jak trnové nebo nápojové produkty, tak .mejedlé produkty. Výraz™ „petrákové nebo nápojové produkty- je míněn jakýkoli jedlý produkt tóný pr0 včetně pevných látek, pouhých lítek „ebo kaolin (napf. n4poje) nebo „nejedlá kompozice zahrnuje doplňky. WŽ,MVC doplňky> fmkín(
produkty (např. jakákoli čerstvá nebo zpracovaná potravina, „ „Iž „ prohlaSuje> vlastnosti podponijfci zdraví anebo vlastnosti prevence nemoci tamí základní výživné funkce doplňkových živin), léky a volné prodejná léčiva, produkty pro péči o ústní dutinu, např. zubní pasty a ústní vody, kosmetické produkty, např. pomády na dy a dalSI produkty osobní péče.
100871 Poživatelná kompozice mali zahrnuje farmaceutickou, lékařskou nebo jedlou kompozici, nebo alternativně fonnulaci, např. farmaceutickou formulaci nebo potravinový nebo nápojový produkt nebo fonnulaci.
10088] Sloučeniny podle vynálezu mohou být také poskytnuty, a to jak samostatné, tak v kombinaci, s jakoukoli poživatelnou známou nebo později objevenou kompozicí. Například může být poživatelnou kompozicí jedlá kompozice nebo nejedlá kompozice. Výraz Jedlá kompozice“ označuje jakoukoli kompozici, kterou lidé nebo zvířata mohou konzumovat jako potravinu, včetně pevných látek, gelů, pasty, pěnového materiálu, polotuhých látek, kapalin nebo jejich směsí. Výraz „nejedlá kompozice“ označuje jakoukoli kompozici, která je určena pro konzumaci nebo použití lidmi nebo zvířaty nikoli jako potravina, včetně pevných látek, gelu, pasty, pěnového materiálu, polotuhých látek, kapalin nebo jejich směsí. Nejedlá kompozice zahrnuje, ale není omezena na, lékařskou kompozici, která se vztahuje na nejedlou kompozici určenou pro použití lidmi nebo zvířaty pro terapeutické účely. „Zvířetem“ je míněn jakýkoli živočich mimo člověka, např. hospodářská zvířata nebo domácí mazlíčci.
[0089] V jednom provedení mohou být sloučeniny podle vynálezu přidány k nejedlé kompozici nebo nejedlému produktu, např. k doplňkům, doplňkům výživy funkčním potravinovým produktům (např. jakékoli čerstvé nebo zpracované jídlo, které má vlastnosti podpory zdraví a/nebo prevence nemocí, vedle základní výživné funkce doplňkových živin), farmaceutickým přípravkům a volně prodejným lékům, výrobkům pro péči o ústní dutinu’ jako jsou zubru' pasty a ústní vody, ke kosmetickým produktům, např. pomádám na rty a dalším produktům pro osobní péči.
[0090] Obecně se volně prodejné produkty (over the counter - OTC) a produkty ústní hygieny vztahují na produkty pro domácí a/nebo osobní použití, které mohou být prodávány bez předpisu a/nebo bez návštěvy u lékaře. Příklady OTC zahrnují, ale nejsou omezeny na, vitamíny a doplňky stravy; lokální analgetika a/nebo anesteúka; prostředky proti kašli, rýmě a alergii; antihistaminika a/nebo prostředky proti alergii; a jejich kombinace. Vitamíny a doplňky stravy zahrnují, ale nejsou omezeny na vitamíny, doplňky stravy> toníka/vý2ivné nápoje v láhvích, vitamíny pro děti, doplňky stravy a jakékoli další produkty vztahující se k výživě, nebo jejich kombinace. Lokální analgetika a/nebo anestetika zahrnují jakékoli
lokální krémy/masti/gely používané pro zeslabení povrchových nebo hloubkových bolestí, např. bolest svalu; gel proti bolesti zubů; náplasti s analgetickou složkou a jejich kombinace. Prostředky proti kašli, rýmě a alergii zahrnují, ale nejsou omezeny na, látky snižující překrvení, prostředky proti kašli, přípravky do hltanu, léčivé cukrovinky, antihistaminika a přípravky proti kašli, rýmě a alergii pro děti; a kombinace těchto produktů. Antihistaminika a/nebo prostředky proti alergii zahrnují, ale nejsou omezeny na, jakoukoli systémovou léčbu senné týmy, nosních alergií, bodnutí hmyzem a žihadla. Příklady produktů pro ústní hygienu zahrnují, ale nejsou omezeny na proužky pro čištění úst, zubní pastu, zubní kartáčky, ústní vody / zubní vody, prostředky pro péči o zubní protézu, osvěžovače dechu, domácí bělidla zubů a dentální niť.
[0091] V dalším provedení mohou být sloučeniny podle vynálezu přidány do potravinových nebo nápojových produktů nebo formulací. Příklady potravinových nebo nápojových produktů nebo formulací zahrnují, ale nejsou omezeny na, polevy pro jedlé produkty nebo jakýkoli předmět zahrnutý do kategorie polévek, kategorie sušených zpracovaných potravin, kategorie nápojů, kategorie hotových jídel, kategorie konzervovaných potravin, kategorie zmražených zpracovaných potravin, kategorie chlazených zpracovaných potravin, kategorie přesnídávkových potravin, kategorie pečeného zboží, kategorie cukrovinek, kategorie mléčných výrobků, kategorie zmrzlin, kategorie náhražek jídla, kategorie těstovin a nudlí, a kategorie omáček, dresinků, kořenících směsí, kategorie dětských potravin a/nebo kategorie pomazánek.
10092] Kategorie polévek se obecně týká konzervované, dehydratované, instantní, chlazené, UHT a zmražené polévky. Pro účely této definice znamená polévka (polévky) jídlo připravené z masa, drůbeže, ryby, zeleniny, obilí, ovoce a dalších ingrediencí, vařené v kapalině, které může obsahovat viditelné kousky některých nebo všech těchto ingrediencí. Může být čirá (např. vývar) nebo hustá (např. rybí polévka), hladká, kašovitá nebo s kousky ingrediencí, hotová, poiozahuštěná nebo zahuštěná a může být servírovaná horká nebo studená, jako první chod nebo jako hlavní chod nebo mezi jídlem jako snack (upíjená jako napoj). Polévku lze použít jako ingredienci pro přípravu dalších složek jídla a může být v rozmezí od vývarů (silné polévky) po omáčky (krémové nebo sýrové polévky).
[0093] .Kategorie dehydratovaných nebo kulinářských potravin“ obvykle znamená: (i) Pomocné produkty pro vaření, např. prášky, granule, pasty, koncentrované kapalné produkty, včetně koncentrovaného bujónu, bujónu a produktů podobných bujónu ve stlačených tubách, tabletách nebo v práškové nebo granulované formě, které se prodávají odděleně od konečného produktu nebo jakožto ingredience v produktu, omáčky a recepturové směsi {nezávisle na technologii); (ii) Produkty jídlových roztoků, např, dehydratované nebo lyofdizované polévky, včetně dehydratovaných polévkových směsí, dehydratované instantní polévky, dehydratované polévkové polotovary, dehydratované nebo vnější přípravky hotových jídel, Jídla a teplé předkrmy včetně těstovinových, bramborových a rýžových jídel; a (iii) Produkty pro zkrášleni jídla, např.: chuťové přísady, marinády, salátové dresinky, salátové zálivky, dipy, strouhanka, šlehané směsi, pomazánky s dlouhou trvanlivostí, omáčky pro barbecue^ kapalné recepturové směsi, koncentráty, omáčky nebo omáčkové směsi, včetně receptářových směsí na salát, prodávané jako hotový produkt nebo jako ingredience produktu, ať už dehydratovaného, kapalného nebo zmraženého.
(0094J Kategorie nápojů obvykle označuje nápoje, nápojové směsi a koncentráty, zahrnující nejen sycené a nesycené nápoje, alkoholické a nealkoholické nápoje, hotové nápoje, kapalné koncentrované formulace pro přípravu nápojů jako jsou sodovky, a suché práškové nápojové výchozí směsi. Kategorie nápojů rovněž zahrnuje alkoholické nápoje, nealkoholické nápoje, nápoje pro sport, isotonické nápoje a teplé nápoje. Alkoholické nápoje zahrnují, ale nejsou omezeny na, pivo, cider/mošt, ochucené alkoholické nápoje, víno a destiláty. Nealkoholické nápoje zahrnují, ale nejsou omezeny na, sycené nápoje, např. Colu a další sycené nápoje, ovocné džusy, nektary, džusové nápoje a nápoje s příchutí ovoce; balenou vodu, která zahrnuje sycenou vodu, pramenitou vodu a čištěnou/stolní vodu; funkční nápoje, které mohou být sycené nebo nesycené a zahrnují nápoje pro sport, energetické nápoje nebo léčebné nápoje; koncentráty, např. kapalné a práškové koncentráty v dávkách připravených pro pití. Teplé nápoje zahrnují, ale nejsou omezeny na, kávu, např. čerstvou (např. vařenou), instantní, kombinovanou kávu, kapalné, hotové, rozpustné a suché kávové nápoje, kávové nápojové směsi a koncentráty (sirupy, pyré, formulované, nebo v práškové formě; příkladem „práškové fonny“ je produkt obsahující kávu, sladidlo a bělidlo, všechny v práškové formě); čaj, např. černý, zelený, bílý, oolong a ochucené čaje; a další teplé nápoje včetně prášků, granulí, kostek nebo tablet na bázi příchuti, sladu nebo rostlin, smíchané s mlékem nebo vodou.
[0095] Kategorie přesnídávkových potravin (snack food) se obecně vztahuje najakoukoli potravinu, která může být lehkým neformálním jídlem včetně, ale nejen, sladkých a slaných snacků a tyčinek. Příklady takových potravin zahrnují, ale nejsou omezeny na, ovocné přesnídávky, chipsy/lupínky, extrudované přesnídávky, tortilly/kukuřičné lupínky, popcorn, preclíky, oříšky a další sladké a slané přesnídávky. Příklady přesnídávkových tyčinek zahrnuj!, ale nejsou omezeny na, granolové/miisli tyčinky, snídaňové tyčinky, energetické tyčinky, ovocné tyčinky a další přesnídávkové tyčinky.
[00961 Kategorie pečeného zboží se obecné vztahuje na jakýkoli jedlý produkt, jehož proces přípravy zahrnuje expozici teplu nebo nadměrnému slunečnímu záření. Příklady pečeného zboží zahrnují, ale nejsou omezeny na, chléb, rohlíky, sušenky, muffmy, obilniny, toastovací pečivo, pečivo, wafle, tortilly, keksy, koláče, bagely, dorty, kiše, buchty, jakékoli pečené potraviny a jakoukoli jejich kombinaci.
[0097] Kategorie zmrzliny se obecně vztahuje na zmražený dezert obsahující smetanu a cukr a aromatické látky. Příklady zmrzliny zahrnují, ale nejsou omezeny na, impulzivně nakupovanou zmrzlinu (impulse ice cream), zmrzlinu pro domácí využití (take-home ice cream), zmražený jogurt a nebalenou zmrzlinu; zmrzliny na bázi sóji, ovsa, fazolí (např. červených fazolí a zelených fazoli) a rýže.
[0098] Kategorie cukrovinek se obecně vztahuje na jedlý produkt, který je chuťově sladký. Příklady cukrovinek zahrnují, ale nejsou omezeny na, bonbóny, želatinové čokoládové cukrovinky, cukrové cukrovinky, žvýkačky apod. a jakékoli kombinované produkty.
100991 Kategorie náhražek jídla se obecné vztahuje na potravinu uríenou k náhradí nonnálních jídel, zejméra pro lidi, kteří dbají o zdraví a tělesnou kondici. Příklady náhražek jídel zahrnuji, ale nejsou omezeny na, produkty na hubnutí a produkty pro zotaveni.
I0O10OJ Kategorie hotových jídel se obecné vztahuje „a jakékoli potraviny, které lze servírovat jako jídlo bez rozsáhlé přípravy nebo zpracováni. Hotová jídla zahrnují produkty kterým dodal receptové „uménf výrobce, což má za následek jejich vysoký stupej hotovosti’ kompletnosti a výhodnosti. Příklady hotových jídel zahrnuji, ale nejsou omezeny na,’ konzervovaná, mražená, sušená, chlazená hotová jídla; obědové smési; zmraženou pizzu; chlazenou pizzu a připravené saláty,
10010(1 Kategorie téstovin a nudlí zahrnuje jakékoli těstoviny a/nebo nudle véetné, ale nejen, konzervovaných, sušených a chlazcnýchcerslvých těstovin; a neochucené. instantní, chlazené, mražené a přesnídávkové nudle.
1001021 Kategorie konzervovaných potravin zahrnuje, ale není omezena na konzervované maso a masné výrobky, ryby a mořské plody, zeleninu, rajeata, fe*. hotová jídla, polévku, těstoviny a další konzervovaná jídla.
[00103] Kategorie zmražených zpracovaných potravin zahrnuje, ale není omezena na, zmražené zpracované tmavé maso, zpracovanou dnibež, zpracované tyby/mořské plody’ zpracovanou zeleninu, náhražky masa, zpracovaná rajčata, pekařské výrobky, dezerty, hotová jídla, pizzu, polévku, nudle a další zmražené potraviny.
1001041 Kategorie sušených zpracovaných porn™ zahrnuje, ale není omezena na. rýži dezertové směsi, sušená hotová jídla, dehydratovanou polévku, instantní polévku, sušené těstoviny, neochucené nudle a instantní nudle.
1001051 Kategorie chlazených zpracovaných potravin zahrnuje, ale není omezena na, chlazená zpracovaná masa, zpracované rybí produkty a mořské plody, obědové baličky čerstvé nakrájené ovoce, hotová jídla, pizzu, připraveně saláty, polévku, čerstvé těstoviny i nudle.
1001061 Kategorie omáček, dresinku . chuťových přísad zahrnuje, ale není omezena na, rajské protlaky a pyré, bujónovéteoxové kostky, bylinky a kořeni, glutamát sodný (MSG), stolní omáčky, sójové omáčky, těstovinové omáčky, Kkulé/kuchyhské omáčky suché omačky/práSkové směsi, kečup, majonézu, hořčici, salátové drasinky, octové omáčky, dipy nakladane výrobky a další omáčky, dresinky a chuťové přísady.
1001071 Kategorie dětských potmvin zahrnuje, ale není omezena na. dětské výživy na bázi mléka nebo sóji; a připravené, sušené a jiné dětské potraviny.
I00I0Í1 Kategorie pomazánek zahrnuje, ale není omeze,» na, džemy a rnamrelády, med, čokoládové pomazánky, oříškové pomazánky a kvasnicové pomazánky.
100109! Kategorie mléčných výrobků sc obecné vztahuje u. jedlé produkty vyrobené ze savčího mléka. Pffldady mléčného výrobku zahrnují, ale nejsou „mezeny na, pitné vyrobky, syr, jogurt a kyselé mléčné nápoje a další mléčné výrobky.
1001101 DMH příklady poživatehré kompozice, zejména potravinových a nápojových produktu «ho formulaci jsou následovně. Příklady poživmelných kompozic zahrnují jeden nebo více produktů ze skupiny: cukrovinky, čokoládové cukrovinky, tablety, čokoládové a jme tyčinky, kolekce v krabicích, standardní kolekce v babicích, miniatury omotané provázkem, sezómu čokolády éokoiáda s hračkou, alftjor (arabské cukroví), jiné éokoíádové cukrovinky, mátové bonbóny, standardní mátové bonbóny, silné mátové bonbóny, vážené sladkostu pastilky, žvýkačky, želé a žvýkaci bonbóny, karamelové bonbóny, karamely a nugát, Wrvé cukrovinky, lízátka, lékořice. jiné cuknrvé cuknrvinky, guma, žvýkačka, žvýkačka s obsahem cukru, žvýkačka bez eukm, funkční žvýkačka, žvýkačka, chléb, aleny/prumyslovy chléb, nebalený/femeslnický chléb, pec™, dorty, balené/prtmyslové dorty, chalenč.fcmeslmcké dorty, sušenky, čokoládou polévané keksy, sendvičové keksy plněné keksy, slané keksy a suchary, náhražky chleba, snkMové «reálie, hotové cereálie' radmne s„,daňově «reálie, v|„cky, jiné zmrzlina, individuální halena znuzlina. |e(ÍKT„rtovi jednoporcova vodová zmrzlina, mléčná znuzlina multipack, vodová zmrzlina mu|,ipack na na „dn^. mlěěná zmrv!™ „ . vodová zmrzlina na odneseni, mražený jogurt,
Z^· Z ^pmUnzovnnd mao mléko, poiomone trvmrlivé/UHT mlao kondertzovane/odpařované mlíko, .ochucené koudenzovahé/odpahrvané mléko η^’ ZVZk“ —-*—-X pouze z mléka, «hue™ nápoje so»™
W f~„é mléčné nápoje, bělidla do ká^ (,^.
M* pro kávové nápoje), priové miéko, ochucené ρ,βονό 5me,ma w Bvený sýr> · , —y sy. sýr, bděný s. Kteleny s.
8«, od^jn^^j^ pmbiorieký jogurt, Jogmo^.
^bpro lonekv jodový nápoj, ch^ .
s« P Y·Z
Z ’ZZZÍ>'' °™”éC «Wkuk^ ^.jiněs^é asianéplesnJky ryěmky potové tyěmky, smdadové ryěmky,’
7“ výrobky na zjvael ώί“ «0»)^ konzervovaná borová Jídla, mrazená totovajídla, s^e„á jWa oovaiidia, obědové 5mčsi, 0 ytorowm polévka, losumní polévka, chlazená polevy resmemy, roviny v konzervě, suSené ch^ersrvé rěsroviuy „udk οΖΧ“”Ζ '^ —k vsáěku,’ výmtZ k ' ’'B”“'’I“>V' V konzervované maso a masné vyrobky, konzervované ^by/moíské piody, konzervovaná zdonma konzervovaná mjěara o~e Ihzde. konzervované ovoce, konzervovaná hmová jídb. konzervovaná polévka, konzervované «oviny, ji„é konzervovanč pracované ,mave ma„, mra2ená
Plody mrvená zpracovaná zelenin. mmZené zpracované masové mihmzky, mmZené ry. barové ehipsy pečené . 1[οι,Μ, ™ bmmbo^ nepcěené v muM. mmZené peteke mrlžené ’ ajrdlzu mražená pizza, mmzená poíéeka, mmZcné nudle, jiné mražené pMravi„y solené mvmy, dezertové směs·, solená hotová jídla, dehydmiovaná polévka, hanami poiévka sušené těstoviny, neochucené nudle, instantní nudle, instantní nudle do šálku/misky, instantní nudle v sáčku, chlazené potraviny, chlazená zpracovaná masa, chlazené rybí produkty a mořské plody, chlazená zpracovaná ryba, chlazená obalovaná ryba, chlazená uzená ryba, chlazené obědové balíčky, chlazená hotová jídla, chlazená pizza, chlazená polévka, chlazene/čerstve těstoviny, chlazené nudle, oleje a niky, olivový olej, rostlinný olej a olej ze semen, tuky na vařeni, máslo, margarín, roztíratelné oleje a tuky, funkční roztíratelné oleje a tuky, omáčky, dresinky a chuťové přísady, rajské protlaky a pyré, bujónové a masoxové kostky, masoxy, omáčkové granule, kapalné masoxy a fondy, bylinky a koření, fcmientované omáčky, sojové omáčky, těstovinové omáčky, mokré omáčky, suché omáčky/práškové směsi, kečup, majonéza, běžná majonéza, hořčice, salátové dresinky, běžné salátové dresinky, salatove dresinky s nízkým obsahem tuku, octové omáčky, dipy, nakládané výrobky, jiné omáčky, dresinky a chuťové přísady, dětské potraviny, mléčné dětské výživy, standardní mléčné výživy, pokračovací mléčné výživy, mléčné výživy pro batolata, hypoalergenní mléčné výživy, připravené dětské potraviny, sušené dětské potraviny, jiné dětské potraviny, pomazánky, džemy a marmelády, med, čokoládové pomazánky, oříškové pomazánky a kvasnicové pomazánky. Příklady poživatelných kompozic rovněž zahrnují cukrovinky, pekařské výrobky, zmrzliny, mléčné výrobky, sladké a slané přesnídávky, tyčinky, produkty pro náhradu jídla, hotová jídla, polévky, těstoviny, nudle, konzervované potraviny, mražené potraviny, sušené potraviny, chlazené potraviny, oleje a tuky, dětské potraviny, nebo pomazánky nebo jejich směs. Příklady poživatelných potravin také zahrnují snídaňové cereahe, sladké nápoje nebo tuhé či kapalné koncentrované směsi pro přípravu nápojů. Příklady poživatelných kompozic rovněž zahrnují potraviny s příchutí kávy (např. kávová zmrzlina).
100111) Obvykle se za účelem zeslabení nebo snížení horké chuti spojené s kompozici do kompozice přidá množství dostatečné pro zeslabení nebo snížení hořké chuti spojené s kompozicí, např. poživatelnou kompozicí, oproti kompozicím, které jsou připraveny bez sloučenin podle vynálezu, jak to posuzují lidé nebo zvířata. Nebo v případě testování formulací, jak to posuzuje většina poroty např. osmi lidských ochutnávačů postupy běžně v oboru známými.
)00112] Koncentrace sloučenin podle vynálezu účinná pro zeslabení nebo snížení hořké chuti spojené s kompozicí bude samozřejmě záviset na mnoha proměnných, včetně konkrétního typu poživatelné kompozice a jejích různých dalších složek, přirozeně genetické rozmanitosti a individuálních preferencích a zdravotním stavu různých lidí testujících kompozice, a na subjektivním účinku konkrétní sloučeniny na chuť takových chemosenzoric44 kyeh sloučenu,. V některých provedeních je ko„ee„te sloučeniny podle vynálezu Mtaá pro zeslabeni nebo sníženi hořké chuti spojené s kompozici od přibližné 0.001 ppm do přibližně 100 ppm, např. od přibližní 0,1 ppm do přibližní 100 ppm, od pHbliiné I ppm do přibližní 25 ppm, od přibližné I ppm do přibližně 10 ppm, od přibližně 0,1 ppm do přibližní 10 ppm. od přibližní 0,01 ppm do přibližné 30 ppm, od přibližní 0,03 ppm do přibližní 10 ppm, od přibližní 0,01 ppm do pWižné 3 ppm, od „,02 ppm * 2 nebo od přibližně 0,01 ppm do přibližně 1 ppm.
IM113I Uvažuje se, že v některých provedeních vytólezu se použije směs jedné „ebo více ’ podte vynálezu pr0 zeslabení hof|[é
Koocemrtme jedne nebo více sloučenin muže být stejná nebo může být koncentrace každé sloučeniny odlišná.
(Ml 14| Před dalším vysvětlováním vynálezu Jsou níže uvedeny následující definice I0.11S] Výraz skupina „T2R- zahnutje pdymorfd variamy, děly, mulanty a homology tore (I) utají přibližné 30-40% identitu sekvence aminokyselin, konkrétněji as. 40, 30, « 70, 73, SO, S3, 90, 93, 96, 97, 98 nebo 99% identitu sekvence aminokyselin vzhledem k níže popsaným T2R, a v přihláškách Zucker (ω) (200|) , Ad|„ (u) (2M|) odkazem, ™ než 25 aminokyselin, nejlépe 50-100 aminokyselin; (2) specificky „ vážou „„ PMI,laiky vyvolané pmti „„„„genu obsahujícímu sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny sestávající za sekvenci T2R popsaných níže , jejich konzon-a.^ (3) specificky hybndizuji (s velikostí přibližní 100. případně alespoh přibližní 3001000 nukleotidů) z. sdingenmich hybridized, podmínek na sekvenci vybranou ze skup,„y s^id ZDNA sekvencí T2R pepraných mže a jejtch konzervativně modifikovaných vanam; (4) obsahují sekvenci alespoh přibližně ze 40 % identickou se sekvencí aminokyselin vybranou ze skupiny sestávající z níže popsaných aminokyselinových sekvencí T2R, nebo (5) JSOU amplifikovany pomoci primed), které specificky hybridizuji za stringenmich hybridizednich podmínek na popsané sekvence T2R.
I«OU6| Zejména tyto „T2R- zahrnuji GPCR chuřového mecptmu, k.«é jsou ,de označovány jako hT2R8 a hT2RÍ4 mající sekvence nukieových kyselin a sekvence ammokysdín uvedené v této pt.hl^, ajejich varianty, ably, mniady. „nhoiogy a dummy klete se specificky vážou „a hořké ligandy, kleté jsou Λ uvetay, „ příbuzné sloučeniny a hořké sloučeniny.
1001171 Zalfmeo geny T2R vykazuji sekvenční odehyiku jak m pmtenut, tak na urovm DNA, bylo zjištěno, že všechny dodnes izolované T2R obsahuj, určíte konvenčni sekvence v líních obl„«h. kleni jsou idenheké nebo které mají alespoň ,045
75% sekvenční identitu s konvenčními sekvencemi T2R identifikovanými dříve ve spisech Adler a kol. (WO 01/77676 Al(2001)) a Zucker a kol. WO 01/18050 A2, které jsou zde tímto odkazem celé zahrnuty.
I0M18I Topologicky mají určité chemosenzorické GPCR „N-koncovou doménu“, „mimobuněčné domény“, „transmembránovou doménu“ obsahující sedm transmembránových oblastí, a odpovídající cytoplazmatické a mimobunéčné smyčky, „cytoplazmatické oblasti“ a „C-koncovou oblast“ (viz např. Hoon a kol.. Cell, 96:541-51 (1999); Buck & Axel, Cell, 65:175-87 (1991)). Tyto oblasti mohou být strukturně identifikovány za použití způsobů známých v oboru, např. sekvenční analytické programy, které identifikují hydrofobní a hydrofilní domény (viz např. Stryer, Biochemistry, (3. vydání 1988); viz rovněž kterýkoli z řady internetových sekvenčních analytických programů, např. programu nacházejících se na dot.imgen.bcm.tmc.edu). Tyto oblasti jsou užitečné pro tvorbu chimérických proteinů a pro in vitro testy podle vynálezu, např. vazebné testy ligandů. Například chimérické T2R lze vyrobit sloučením mimobunéčné oblasti jednoho T2R a transmembránové oblasti jiného T2R stejného nebo odlišného druhu.
100119] „Mimobunéčné domény“ se tedy vztahují na domény polypeptidŮ T2R, které vyčnívají z buněčné membrány a jsou vystaveny mimobunéčné straně buňky. Takové oblasti by zahrnovaly „N-koncovou doménu“, která je vystavena mimobunéčné straně buňky, jakož i mimobuněčné smyčky transmembránové domény, které jsou vystaveny mimobunéčné straně buňky, tj. mimobunéčné smyčky mezi transmembránovými oblastmi 2 a 3, transmembránovými oblastmi 4 a 5 a transmembránovými oblastmi 6 a 7. „N-koncová doména“ začíná na N-konci a vede k oblasti poblíž počátku transmembránové oblasti. Tyto mimobuněčné oblasti jsou užitečné pro in vitro ligandové vazebné testy, jak rozpustné, tak v pevné fázi. Navíc se transmembránové oblasti popsané níže mohou účastnit vázání ligandů, buď ve spojení s mimobuněčnou oblastí nebo samotné, a jsou tedy užitečné pro in vitro vazebné testy ligandů.
100120] „Buňka exprimující T2R“ zde zahrnuje rekombinantní buňky, které exprimují sekvenci lidského T2R podle vynálezu, jakož i buňky exprimující endogenní T2R. Takové buňky jsou obsaženy v jazykovém a gastrointestinal ním systému a zahrnuji buňky v ústní dutině, např. chuťové pohárky exprimované na jazyku, jakož i buňky v gastrointestinálním systému a přidružené orgány, např. kartáčové buňky v gastrointestinálním traktu, enteroendokiynní buňky, např. buňky STC-1. Tyto buňky mohou rovnéž exprimovat G protein, např. gustducin, transducin, Gals nebo Gol6, Buňky, které exprimují specifické T2R, mohou být identifikovány a izolovány známými způsoby, např. buněčnou separací FACS a/nebo postupy izolace buněk pomocí magnetických kuliček.
[001211 „Transmembránová doména“, která zahrnuje sedm transmembránových „oblastí“, se vztahuje na doménu polypeptidů T2R, která leží v plazmatické membráně, a může rovněž zahrnovat odpovídající cytoplazmatické (vnitrobuněčné) a mimobuněčné smyčky, kterým se take říká transmembránové „oblasti“. Sedm transmembránových oblastí a mimobuněčných a cytoplazmatických smyček lze identifikovat standardními způsoby, jak jsou popsány ve spisech Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol., 157:105-32 (1982)) nebo Stryer, viz výše.
[00122] „Cytoplazmatické domény“ se vztahují na domény proteinů T2R, které jsou obráceny směrem dovnitř buňky, např. „C-koncová doména“ a vnitrobuněčné smyčky transmembránové domény, např. vnitrobuněčné smyčky mezi transmembránovými oblastmi 1 a 2, transmembránovými oblastmi 3 a 4, transmembránovými oblastmi 5 a 6. „C-koncová doména“ se vztahuje na oblast, která sahá od konce poslední transmembránové oblasti kCkonci proteinu a která se normálně nachází v cytoplazmě.
[001231 Výraz „7-transmembránový receptor“ označuje polypeptid, který patří k nadskupině transmembránových proteinu, které mají sedm oblastí, které zasahují do plazmatické membrány sedmkrát (proto se těchto sedm oblastí nazývá „transmembránové“ nebo „TM“ domény TM I až TM VII). Skupiny čichových a určitých chuťových receptorů všechny spadají do této nadskupiny. Polypeptidy 7-transmembranového receptont mají podobné a charakteris-tické primární, sekundární a terciární struktury, jak bude podrobněji rozebráno níže.
[00124] Výraz „oblast vázající ligand“ se vztahuje na sekvence odvozené od chemosenzorického nebo chuťového receptorů, který významně začleňuje transmembránové domény II až Vil (TM Π až VII). Oblast může být schopna vázat ligand a, konkrétněji, sloučeninu navozující chuť.
100125] Výraz „translokační doména plazmatické membrány“ nebo prostě „translokační doména“ znamená polypeptidovou doménu, která při začlenění do amino-konce polypeptidové kódující sekvence může s velkou účinností „vést“ (chaperon) nebo „translokovat“ hybridní („fúzní“) protein do buněčné plazmatické membrány. Například konkrétní „translokačm doména“ původně odvozená od amino-konce polypeptidů lidského rhodopsinového receptorů, může být použita pro 7-transmembránový receptor. Další translokační doména byla odvozena ze sekvence hovězího rhodopsinu a je rovněž užitečná pro usnadnění translokace. Sekvence odvozené od rhodopsinu jsou obzvlášť účinné při translokaci 7-transmembranových fúzních proteinů do plazmatické membrány,
100126] „Funkční ekvivalence“ znamená schopnost a působnost domény při translokaci nové translatovaných proteinů do plazmatické membrány stejně účinnou, jako má příkladná translokačni doména, např, doména odvozená od rhodopsinu, za podobných podmínek; relativní působnosti lze měřit (kvantitativně) a srovnávat, jak je zde popsáno. Domény spadající do rozsahu vynálezu mohou být stanoveny rutinním screeningem jejich působnosti při translokaci nově syntetizovaných polypeptidů do plazmatické membrány v buňce (savec, žába apod.) se stejnou působností jako translokačni doména SEKV. ID Č. I, dlouhá aminokyselin.
[00127] Výraz „funkční účinky“ v kontextu testů pro testováni sloučenin, které modulují transdukci chuti zprostředkovanou členem skupiny T2R, zahrnuje stanovém jakéhokoli parametru, který je nepřímo nebo přímo pod vlivem receptoru, např. funkční, fyzikální a chemické účinky. Zahrnuje vázání ligandů, změny iontového toku, membránového potenciálu, průchodu proudu, transkripce, vázání G proteinu, fosforylace nebo defosforylace GPCR, transdukce signálu, interakcí receptor-Iigand, koncentrace druhého posla (např. cAMP, cGMP, IP3 nebo vnitrobuněčný Ca2+), in vitro, in vivo a ex vivo a rovněž zahrnuje dalši fyziologické účinky, např, nárůsty nebo poklesy uvolňování nervových mediátorů nebo hormonů.
(001281 „Stanovení funkčního účinku“ označuje testy na sloučeninu, která zvyšuje nebo snižuje parametr, který je nepřímo nebo přímo pod vlivem člena skupiny T2R, např. funkční, fyzikální a chemické účinky. Takové funkční účinky lze měřit jakýmikoli prostředky známými v oboru, jako jsou např. změny spektroskopických vlastností (např. fluorescence, absorbance, index lomu), hydrodynamické (např. tvar), chromatografické nebo rozpustnostní vlastnosti, technika Patch Clamp, barviva citlivá na elektrické napětí, proudy celých buněk, odtok radioizotopu, redukovatelné markéry, exprese genu oocytového T2R; exprese T2R buněk tkáňové kultury; transkripční aktivace genů T2R; ligandové vazebné testy; změny elektrického napětí, membránového potenciálu a konduktance; testy toku iontů; změny vnitrobuněčných druhých poslů, např. cAMP, cGMP a inositoltrifosfátu (1P3); změny hladin vnitrobuněčného vápníku; uvolňování nervových mediátorů apod.
[001291 „Inhibitory“, „aktivátory“ a „modulátory“ receptoru T2R proteinů se používají zaměmtelně a znamenají „inhtbující, „aktivující“ nebo „modulující“ molekuly identifikovame za použití in vitro a in vivo testů pro transdukci chuti, např. ligandy, agonisty, antagonist/ a jejich homology a mimetika. Inhibitory jsou sloučeniny, které se například vážou, částečně nebo úplně blokují stimulaci, snižují, zabraňují, zpomalují aktivaci, inaktivují, desenzitizují nebo zmenšují trandsukci chuti, např. antagonisté. Aktivátory jsou sloučeniny, které se např. vážou, stimulují, zvyšují, zahajují, aktivují, usnadňují, zesilují aktivaci, senzrtizují nebo zvyšují transdukci chuti, např. agonisté. Modulátory zahrnují sloučeniny, které např. mění interakci receptoru s mimobuněčnými proteiny, které vážou aktivátory nebo inhibitor (např. ebnerin a další členové ze třídy hydrofobních nosičů); G proteiny; kinázy (např. homology rhodopsinkinázy a kinázy beta adrenergrckého receptoru, které mají podíl na dezaktivaci a desenzitizaci receptoru); a arresting které rovněž dezaktivují a desenzitizují receptoty. Modulátory zahrnují geneticky modifikované verze Členů skupiny T2R, např. se změněnou aktivitou, jakož i přirozeně se vyskytující a syntetické ligandy, antagomsty, agonisty, malé chemické molekuly apod.
100130] Takové testy na inhibitory a aktivátory zahrnují např. expresi členů skupiny T2R v buňkách nebo buněčných membránách, použití domnělých modulátorových sloučenin v přítomnosti nebo nepřítomnosti sloučenin, které modulují, např. hořkých sloučenin, a následně stanovení funkčních účinků na transdukci chuti, jak bylo popsáno výše. Vzorky a testy obsahující členy skupiny T2R, na které se působilo potenciálním aktivátorem, inhibitorem nebo modulátorem, se porovnají s kontrolními vzorky bez inhibitoru, aktivátoru nebo modulátoru, aby se zkoumal rozsah modulace. Kontrolním vzorkům (na které nebylo působeno modulátory) se přiřadí relativní hodnota aktivity T2R 100 %. Inhibice T2R je dosaženo, je-li hodnota aktivity T2R vzhledem ke kontrolnímu vzorku přibližné 80 % případně 50 % nebo 25-0 %. Aktivace T2R je dosaženo, je-li hodnota aktivity T2R vzhledem ke kontrolnímu vzorku 110 %, případně 150 %, případně 200-500 % nebo o 1000-3000% vyšší.
100131] Výrazy „přečištěný“ (purifikovaný), „významně přečištěný“ (punfikovaný) a „izolovaný“, jak jsou zde používány, označují stav, kdy je sloučenina podle vynálezu bez dalších, nepodobných sloučenin, s nimiž je normálně spojena ve svém přirozeném stavu. S výhodou „přečištěný“, „významně přečištěný“ a „izolovaný“ znamená, že kompozice obsahuje alespoň 0,5 %, 1 %, 5 %, 10 % nebo 20 %, nejvýhodněji alespoň 50 % nebo 75 % hmotn. daného vzorku. V jednom výhodném provedení tyto výrazy označují sloučeninu podle vynálezu obsahující alespoň 95 % hmotn. daného vzorku. Výrazy „přečištěný“, „významně přečištěný“ a „izolovaný“, jak jsou zde používány, jedná-li se o nukleovou kyselinu nebo protein, o nukleové kyseliny nebo proteiny, se rovněž vztahuji ke stavu přečištění nebo zkoncentrování odlišnému než jak se přirozeně vyskytuje v savčím, zejména lidském těle. Výraz „izolovaný“ zahrnuje jakýkoli stupeň čištění nebo koncentrování vyšší než jaký se přirozeně vyskytuje v savčím, zejména lidském těle, včetně (1) přečištění od jiných spojených struktur nebo sloučenin nebo (2) spojení se strukturami nebo sloučeninami, s nimiž sloučenina normálně není spojena v savčím, zejména lidském těle. Zde popsaná nukleová kyselina nebo protein nebo třídy nukleových kyselin nebo proteinů mohou být izolovány nebo jinak spojeny se strukturami nebo sloučeninami, s nimiž normálně nejsou v přírodě spojeny, podle mnoha různých způsobů a postupů, které jsou odborníkům známy.
[00132J Výraz „izolovaný“, jak je zde použit, pokud jde o nukleovou kyselinu nebo polypeptid, označuje stav přečištění nebo zkoncentrování odlišný od stavu, který se přirozeně vyskytuje v savčím, zejména lidském těle. Do významu výrazu „izolovaný“, jak je zde použit, spadá jakýkoli stupeň čištění nebo koncentrování vyšší než jaký se přirozeně vyskytuje v těle, včetně (1) přečištění od jiných přirozeně se vyskytujících spojených struktur nebo sloučenin nebo (2) spojení se strukturami nebo sloučeninami, s nimiž sloučenina normálně není spojena v těle. Zde popsané nukleové kyseliny nebo polypeptidy mohou být izolovány nebo jinak spojeny se strukturami nebo sloučeninami, s nimiž normálně nejsou v přírodě spojeny, podle mnoha různých způsobů a postupů, které jsou odborníkům známy.
100133] Výrazy „amplifíkující“ a „amplifikace“ se vztahují na použití jakékoli amphfikační metodologie pro generování nebo detekování rekombinantaí nebo přirozeně exprimované nukleové kyseliny, jak je podrobněji popsáno níže. Vynález například poskytuje způsoby a reagencie (např. specifické oligonukleotidové primerové páry) pro amplifikaci (např. polymerázovou řetězovou reakcí, PCR) přirozeně exprimovaných (např. genomové nebo mRNA) nebo rekombinantních (např. cDNA) nukleových kyselin podle vynálezu (např sekvence podle vynálezu, vázající sloučeninu, která navozuje chuť) in vivo nebo in vitro.
[00134] Výraz „expresní vektor“ se vztahuje na jakýkoli rekombinantní expresní systém pro expresi sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu in vitro nebo in vivo, konstitutivně nebo indukovatelně, v jakékoli buňce, včetně prokaryotické, kvasinkové, houbové, rostlinné, hmyzí nebo savčí buňky. Výraz zahrnuje lineární a kruhové expresní systémy. Výraz zahrnuje expresní systémy, které zůstávají epizomální nebo se integrují do genomu hostitelské buňky. Expresní systémy mohou nebo nemusí mít schopnost auto-replikace, tj řídit pouze přechodnou expresi v buňce. Výraz zahrnuje rekombinantní expresní „kazety“, které obsahují pouze minimum prvků, které jsou nezbytné pro transkripci rekombinantní nukleové kyseliny. [00135] Výraz „knihovna“ znamená přípravek, kterým je smés molekul nukleových kyseliny nebo polypeptidů, např. knihovna rekombinantních generovaných senzonckých oblastí, zejména oblastí chuťového receptoru vázajících ligandy, generovaných amplifikaci nukleové kyseliny s degenerovanými příměrovými páry, nebo izolovaná sbírka vektorů, které obsahují amplifikované oblasti vázající ligandy, nebo směs buněk, které jsou každá náhodně transfektována alespoň jedním vektorem, který kóduje chuťový receptor.
[001361 Výraz „nukleova kyselina“ nebo „sekvence nukleové kyseliny“ se vztahuje na deoxyribonukleový nebo ribonukleový oligonukleotid buď ve formě jednořetězcové nebo dvouretězcové. Výraz zahrnuje nukleové kyseliny, tj. oligonukleotidy, obsahující známé analogy přírodních nukleotidů. Výraz rovněž zahrnuje struktury podobné nukleové kyselině se syntetickým hlavním řetězcem.
100137] Není-li uvedeno jinak, pak konkrétní sekvence nukleové kyseliny také implicitně zahrnuje její konzervativně modifikované varianty (např. degenerované kodónové substituce) a komplementární sekvence, jakož i sekvence explicitně uvedené. Konkrétně lze degenerovaných kodónových substitucí dosáhnout generováním, např. sekvencí, kde je třetí poloha jednoho nebo více vybraných kodónů substituována zbytky směsných bází a/nebo deoxyinosinu. (Barter a kol., Nucleic Acid Res., 19:5081 (1991); Ohtsuka a kol., J. Biol. Chern., 2610:2605-08 (1985); Rossolini a koi., Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994)). Výraz nukleová kyselina je používán vzájemně zaměnitelně sgenem, cDNA, mRNA, oligonukleotidem a polynukleotidem.
[00138] Výrazy „polypeptid“, „peptid“ a „protein“ jsou zde používány vzájemně zaměnitelně a vztahují se na polymer aminokyselinových zbytků. Výrazy se týkají aminokyselinových polymerů, kde je jedním nebo více aminokyselinovými zbytky umělá chemická mimetická forma odpovídající přirozeně se vyskytující aminokyselině, a týkají se i přirozeně se vyskytujících aminokyselinových polymerů a aminokyselinových polymerů, které se nevyskytují přirozeně.
(00139] Výraz „alkyl”, jak je zde používán, jakož i další skupiny mající předponu „alk”, jako např. alkoxy, alkanoyl, alkenyl, alkinyl apod. znamenají uhlíkaté řetězce, které mohou být lineární nebo rozvětvené nebo jejich kombinace. Příklady alkylových skupin zahrnují methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, sek- a terc-butyl, pentyl, hexyl, heptyl apod. Výhodné alkylové skupiny mají M uhlíky. “Alkenyl” a další podobné výrazy zahrnují uhlíkaté řetězce obsahující alespoň jednu nenasycenou vazbu uhlík-uhlík. “Alkinyl” a další podobné výrazy zahrnují uhlíkaté řetězce obsahující alespoň jednu trojnou vazbu uhlík-uhlík.
(001401 Výraz „cykloalkyl” znamená uhlíkaté cykly bez obsahu heteroatomů a zahrnuje mono-, bi- a tricyklické nasycené uhlíkaté cykly, jakož i kondenzované cyklické systémy. Příklady cykloalkylu zahrnují cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl, cyklohexyl, dekahydronaftalen, adamantan, indanyl, indenyl, fluorenyl, 1,2,3,4-tetrahydronaftalen apod. Í00141I Výraz „aryl” znamená aromatický substituent, který má jediný kruh nebo několik zkondenzovaných kruhů. Příklady arylových skupin zahrnují, bez omezení, skupiny: fenyl, naftyl, antracenyl, pyridinyl, pyrazinyl, pyrimidinyl, triazinyi, thiofenyl, furanyl, pyrrolyl,
oxazolyl, imidazolyl, triazyolyl a tetrazolyl. Arylové skupiny, které obsahují jeden nebo vice heteroatomů (např. pyridiny!) jsou často nazývány „heteroarylové skupiny.” Je-li arylová skupina tvořena několika kruhy, je alespoň jeden z kruhů aromatický. V některých provedeních alespoň jeden z několika kruhů obsahuje heteroatom, čímž se vytvoří arylová skupina obsahující heteroatom. Arylové skupiny obsahující heteroatom zahrnují, bez omezeni, benzoxazolylovou, benzimidazolylovou, chinoxalinylovou, benzofuranylovou a 1H-benzo[d][l,2,3]triazolylovou skupinu. Arylové skupiny obsahující heteroatom také zahrnují, bez omezeni, 2,3-dihydrobenzo[b][l,4]dioxinylovou a benzo[d][l,3]dioxolylovou skupinu. Arylové skupiny obsahující heteroatom rovněž zahrnují aromatické kruhy zkondenzované na heterocyclický kruh obsahující alespoň jeden heteroatom a alespoň jednu karbonylovou skupinu. Takové skupiny zahrnují, bez omezení, dioxotetrahydrochinoxalinylovou a dioxotetrahydrochinazolinylovou skupinu.
[00142] Výraz „arylalkoxy“ znamená arylovou skupinu navázanou na alkoxy skupinu. [00143] Výraz „arylamidoalkyl” znamená aryl-C(O)NR-alkyl nebo aryl-NRC(O)-alkyl. [00144] Výraz „arylalkylamidoalkyl” znamená aryl-alkyl-C(O)NR-alkyl nebo aryl-aikylNRC(O)-alkyl, kde R je jakákoli vhodná skupina ze seznamu níže.
100145] Výraz „arylalkyl” se vztahuje na arylovou skupinu navázanou na alkylovou skupinu,
100146] Výraz „halogen” nebo „halo” se vztahuje na chlor, brom, fluor nebo jód.
[00147] Výraz „odstupující skupina” se vztahuje na fůnkční skupinu nebo atom, které mohou být nahrazeny jinou funkční skupinou nebo atomem v substituční reakci, např. v nukleofilní substituční reakci. Příklady odstupujících skupin zahrnují chlor, brom a jód; estery kyseliny sulfonové, např. mesylát, tosylát, brosylát, nosylát apod.; a skupiny acyloxy, např. acetoxy, trifluoracetoxy apod.
[00148] Výraz „haloalkyl” znamená alkylovou skupinu mající jeden nebo vice atomů halogenu (např. CFj).
[001491 Výraz „heteroalkyl” se vztahuje na alkylovou skupinu, která obsahuje heteroatom, např. N, O, P, B, S nebo Si. Heteroatom může být napojen na zbytek heteroalkylové skupiny nasycenou nebo nenasycenou vazbou. Alkyl substituovaný skupinou jako je heterocykloalkyl, substituovaný heterocykloalkyl, heteroaryl, substrtuovaný heteroaryl, alkoxy, aryloxy, boryl’ fosfin, ammo, silyl, thio nebo selen spadá do rozsahu výrazu heteroalkyl. Příklady heteroalkylů zahrnují, ale nejsou omezeny na, kyano, benzoyl, 2-pyridyl a 2-furyi.
[001501 Výraz „heteroarylalkyl” znamená heteroarylovou skupinu, k níž je připojena alkylová skupina.
1001511 Výraz „heteroeyklus” znamená monocyklický nebo polycyklický knih obsahující uhlíkové a vodíkové atomy, případně mající 1 nebo 2 násobné vazby, a atomy kruhu obsahují alespoň jeden heteroatom, konkrétně 1 až 4 heteroatomy, nezávisle vybrané z dusíku, kyslíku a siry. Heterocyklické kruhové strukury zahrnují, ale nejsou omezeny na, mono-, bi- a tricyklieké sloučeniny. Specifické heterocykly jsou monocyklické nebo bicyklické Představitelé heterocyklů zahrnují cyklické močoviny, morfolinyl, pyrrolidinonyl, pyrrolidinyl, piperidinyl, piperazinyl, hydantoinyl, valerolaktamyl, oxiranyl, oxetanyl, tetrahydrofuranyl, tetrahydropyranyl, tetrahydropyridinyl, tetrahydroprimidinyl, tetrahydrothiofenyl, tetrahydrothiopyranyl, tetrazolyl a urazolyl. Heterocyklický kruh může být nesubstituovaný nebo substituovaný. Výhodnými heterocykly jsou 5- a 6-členné heterocykly, zejména hydantoinyl a urazolyl.
[001521 Výraz „heterocykloalkyl” se vztahuje na eykloalkylovou skupinu, v níž je alespoň jeden uhlíkový atom v kruhu nahrazen heteroatomem (např. O, S nebo N).
100153] Výrazem „heterocykloalkylalkyl” je míněna heterocykloalkylová skupina, na niž je připojena alkylová skupina.
100154} Výraz „substituovaný” konkrétně zamýšlí a počítá s jednou nebo vlce substitucemi, které jsou v oboru běžné. Obecně však odborníci v oboru pochopí, že substituenty by měly být voleny tak, aby neovlivňovaly nepříznivě užitečné vlastnosti sloučeniny nebo aby nezasahovaly nepříznivě do její funkce. Vhodné substituenty mohou zahrnovat například halo skupiny, perfluoroalkylové skupiny, perfluoroalkoxy skupiny alkylové skupiny, alkenylové skupiny, alkinylové skupiny, hydroxy skupiny, oxo skupiny,’ merkapto skupiny, alkylthio skupiny, alkoxy skupiny, arylové nebo heteroarylové skupiny aryloxy nebo heteroaryloxy skupiny, aralkylové nebo heteroaralkylové skupiny, aralkoxy nebo heteroaralkoxy skupiny, ammo skupiny, alkyl- a dialkylamino skupiny, karbamoylové skuptny, alkylkarbonylové skupiny, karboxylové skupiny, alkoxykarbonylové skupiny, alkylaminokarbonylové skupiny, dialkylaminokarbonylové skupiny, arylkarbonylové skupiny, a^loxykarbonylové skupiny, alkylsulfonylové skupiny, arylsulfonylové skupiny, cykloalkylové skupiny, kyano skupiny, C,<6 alkylthio skupiny, arylthio skupiny, mtro skupiny, keto skupiny, acylové skupiny, boronátové nebo boronylové skupiny, fosfátové nebo fosfonylové skupiny, sulfamylové skupiny, sulfonylové skupiny, sulfínylové skupiny, a jejich kombinace. V případě substituovaných kombinací, např. „substituovaného arylalkylu ” může být substituována buď azylová nebo alkylová skupina nebo může být substituována jak arylova, tak alkylová skupina jedním nebo více substituenty. Navíc se v některých případech mohou vhodné substituenty sloučit za vzniku jednoho nebo více kruhů, jak je odborníkům v oboru známo.
[00155] Zde popsané sloučeniny obsahují jednu nebo více dvojných vazeb a mohou tedy poskytovat cis/trans izomery, jakož i jiné konfonnační izomety. Tento vynález zahrnuje všechny takové možné izomery i směsi takových izomerů.
100156] Zde popsané sloučeniny, a zejména výše popsané substituenty, mohou obsahovat jedno nebo více asymetrických center, a proto mohou tvořit diastereomery a optické izomery. Tento vynález zahrnuje všechny takové možné diastereomery i jejich racemické směsi, jejich v podstatě čisté rozlišené enanciomery, všechny možné geometrické izomeiy a jejich přijatelné soli. Dále jsou zahrnuty také smési stereoizomerů i izolované specifické stereoizomery. Během postupů syntézy používaných pro přípravu takových sloučenin nebo při používání racemizačních nebo epimerizačních postupů známých v oboru mohou být produkty takových postupů směsi stereoizomerů.
[00157] Výrazy „soli“ a „farmaceuticky přijatelné soli“ tak, jak jsou zde používány, se vztahují na deriváty popsaných sloučenin, kde je mateřská sloučenina modifikována tak, že se zní vytvoří kyselá nebo zásaditá sůl. Příklady farmaceuticky přijatelných solí zahrnují, ale nejsou omezeny na, soli anorganických nebo organických kyselin bazických skupin, např. aminů, a alkalické nebo organické soli kyselých skupin, např. karbonových kyselin. Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují běžné netoxické soli nebo kvartemí amonné soli mateřské sloučeniny vytvořené například znetoxických anorganických nebo organických kyselin. Takové běžné netoxické soli zahrnují například solí odvozené od anorganických kyselin jako je kyselina chlorovodíková, bromovodíková, sírová, sulfamová, fosforečná a dusičná; a soli připravené z organických kyselin jako je kyselina octová, propionová, jantarová, glykolová, stearová, mléčná, jablečná, vinná, citrónová, askorbová, pamoová, maleinová, hydroxymaleinová, fenyloctová, glutamová, benzoová, salicylová, sulfanilová, 2-acetoxybenzoová, fumarová, toluensulfonová, methansulfonová, ethandisulfonová, šťavelová a isetionová apod.
[00158] Farmaceuticky přijatelné soli podle vynálezu se mohou syntetizovat z mateřské sloučeniny, která obsahuje zásaditý nebo kyselý zbytek, běžnými chemickými způsoby. Obecně lze takové soli připravit reakcí volných kyselých nebo zásaditých forem těchto sloučenin se stechiometrickým množstvím vhodné zásady nebo kyseliny ve vodě nebo v organickém rozpouštědle nebo ve směsi vody a organického rozpouštědla; obecně jsou výhodná nevodná média jako je éter, ethylacetát, ethanol, isopropanol nebo acetonitril.
Seznamy vhodných solí lze nalézt v Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. vydání, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, str. 1418, jehož obsah je zde začleněn odkazem.
[00159] Výraz „solvat“ znamená sloučeninu nebo její sůl, která dále zahrnuje stechiometrické nebo nestechiometrické množství rozpouštědla navázaného nekovalentními mezimolekulámimi silami. Je-li rozpouštědlem voda, je solvátem hydrát.
[00160] Výraz „proléčivo“ znamená derivát sloučeniny, který může hydrolyzovat, oxidovat nebo jinak reagovat za biologických podmínek (in vitro nebo in vivo) za vzniku aktivni sloučeniny, konkrétné sloučeniny podle vynálezu. Příklady proléčiv zahrnují, ale nejsou omezeny na, deriváty a metabolity sloučeniny podle vynálezu, které zahrnují biohydrolyzovatelné zbytky, např. biohydrolyzovatelné amidy, biohydrolyzovatelné estery, biohydrolyzovatelné karbamáty, biohydrolyzovatelné karbonáty, biohydrolyzovatelné ureidy a biohydrolyzovatelné fosfátové analogy. Specifickými proléčivy sloučenin s karboxylovými funkčními skupinami jsou estery nižších alkylů a karboxylových kyselin. Karboxylátové estery se výhodně tvoří extenfikací jakéhokoli zbytku karboxylové kyseliny přítomného v molekule Prolédva lze typicky připravit za použití známých způsobů, např. způsobů popsaných v Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery 6. vydání (Donald J. Abraham ed„ 2001, Wiley) a Design and Application of Prodrugs (H. Bundgaard ed., 1985, Harwood Academic Publishers Gmfh).
[00161] Není-li uvedeno jinak, výrazy „biohydrolyzovatelný amid, „biohydrolyzovatetoý ester”, „biohydrolyzovatelný karbamát”, „biohydrolyzovatelný karbonát”, „biohydrolyzovatelný ureid, „biohydrolyzovatelný fosfát”, jak jsou zde používány’ znamenají amid, ester, karbamát, karbonát, ureid nebo fosfát, v tomto pořadí, sloučeniny, která buď: 1) nezasahuje do biologické aktivity sloučeniny, ale může dodat této sloučenině výhodné vlastnosti in vivo, např. příjem sloučeniny, trvání akce nebo nástup akce; nebo η je biologicky neaktivní, ale je převedena in vivo na biologicky aktivní sloučeninu. Příklady biohydrolyzovatelných esterů zahrnují, ale nejsou omezeny na, estery nižších alkylů, alkoxyacyloxyestery, alkylacylaminoalkylestery a cholinestery. Příklady biohydrolyzovatelných amidů zahrnují, ale nejsou omezeny na, amidy nižších alkylů, amidy alfa-aminokyselin, alkoxyacylamidy a alkylaminoalkylkarbonylamidy. Příklady biohydrolyzovatelných karbamatů zahrnují, ale nejsou omezeny na, nižší alkylaminy, substituované ethylendiaminy aminokyseliny, hydroxyalkylaminy, heterocyklické a heteroaromatické aminy a polyéteraminy.
1001621 Výraz J*, apaleg'·, jak je zde v kontextu zahrnuje dtasteraomery, hydráty, solváty. soli, proWiva a N-uxidy s|„u&nin.
1001631 Zde popsaná „translokační doména“, „oblast vázající ligand“ a kompozice chimérických receptorů rovněž zahrnují „analogy“ nebo „konzervativní varianty“ a „mimetika“ (peptidomimetika) se strukturami a aktivitou, které značně odpovídají ukázkovým sekvencím. Výrazy „konzervativní varianta“ nebo „analog“ nebo „mimetikum“ se tedy vztahují na polypeptid, který má sekvenci aminokysefin modifikovanou tak, že tato změna(y) nemění podstatně strukturu a/nebo aktivitu polypeptidu (konzervativní varianty), jak jsou zde popsány. Změny zahrnuji konzervativně modifikované variace aminoky se línové sekvence, tj. aminokyselinové substituce, adice nebo odstranění těch zbytků, které nejsou pro aktivitu proteinu důležité, nebo substituce aminokyselin zbytky, které mají podobné vlastnosti (např. kyselé, bazické, pozitivně nebo negativně nabité, polární nebo nepolární atd.), tak aby substituce i důležitých aminokyselin neměnila podstatně strukturu a/nebo aktivitu.
100164] Konkrétněji se výraz „konzervativně modifikované varianty“ týká jak sekvencí aminokyselin, tak sekvencí nukleových kyselin. Pokud jde o konkrétní sekvence nukleových kyselin, pak se konzervativně modifikované varianty vztahují na ty nukleové kyseliny, které kódují identické nebo v zásadě identické aminokyselinové sekvence, nebo kde nukleová kyselina nekóduje aminokyselinovou sekvenci, na v zásadě identické sekvence Díky degeneraci genetického kódu mnoho funkčně identických nukleových kyselin kóduje jakýkoli daný protein.
I0O16SI Např. Radony GCA, CCC. GCG a GCU všeclmy kódují aminokyselinu alanin. Proto v každé poloze, kde je kodonem specifikován alanin, může být kodon tménén M kterýkoli z popsaných odpovídajících kodoní, aniž by se zmínil kódovaný polypeplid ÍI01MJ Takové variace nukleových kyselin jsou „liché variace“, kTeré jsou jedním druhem konzerv..,vmí modifikovaných variací. Každá sekvence nukleových kyselin, ktetá kóduje polypeplid, zde rovněž popisuje každou možnou tichou vnrinci nukleové kyseliny. Odborník v oboru pozná, že každý kodon v nukleové kyselině (kromě AUG, který je běžně jediným kodonem pro merhionin, a TGO, který je běžní jediným kodonem pro tryprofan) být mod,Ukován za vzniku funkíné Identické molekuly. Proto každá tichá variace nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid, je zahrnuta v každé popsané sekvenci.
[00167] Tabulky konzervativních substitucí poskytujících funkčně podobné aminokyseliny JSOU v oboru dobře známy. Například jeden ukázkový návod pro výběr konzervativních substituci zahrnuje (za původním zbytkem je uvedena ukázková substituce): ala/gly nebo ser; arg/lys; asn/gln nebo his; asp/glu; cys/ser; gin/asn; gly/asp; gly/ala nebo pro; his/asn nebo gin; ile/leu nebo val; leu/ile nebo val; lys/arg nebo gin nebo glu; met/leu nebo tyr nebo ile’ phe/met nebo leu nebo tyr; ser/thr; thr/ser; trp/tyr; tyr/trp nebo phe; val/ile nebo leu
Alleniativiii ukázko^ navod
T “ které jsousi vzájemně kTOtivllW substem,: j, A|a„,„ (A)>
TZ “ ' gram (R), Lysin (I); 5) Isnlenein (I), Leucia (LX Mednonin (M), VaMn W , 6) _ (F). Tyrasin (Y), Tiypmftn (W). Wzh
Freeman and Company |1984); Schute Schimer. rf'
Spnnger-Vedag < 1,7% Odborník , obora «eoi, & výše idenliflkovaněj •™' moznyra, konzervativními substitucemi. Například po „ěktoré «y může někdo povazovat veškeré nabité aminokyseliny z. vzájemné kon™„vní substituce, nf „z jsou na te pozitivně nebo kladné. Navíc mohou být za „konzervativně makované ™ace 5UteíMe. Kb0 tKre jedinou ammokysclmu nebo malé procento aminokyselin v kódované sekvenci
TT Výraz „tnimctikum“ nebo .pepidomirackran·. s. M synKlicto chemickou slouřenmu, kt„á má výrazné stojné strukturní a/ncbo funkční vlastnos„ Mypeptidu např. .ramtokaém domény,
XZT Z“můfc být buď zce,a s,oža”* “>
aminokysehn „ho může w chimé,ic|M ^phdovych ammokyseiin a Částek z nepřirodtoch aminokyschm Mimcik™ může ow« obsahovat jakékoli mnofstvl konzervativních substitucí přirazených aminokyselin, pokud tylo substituce výrazné nemění shntaru a/nebo aklivin, mimaika
Stejné jako u préypeptidá
Z' rT““ jC mm“k™v rozsah «·
ZIT n “
J oukoh kombinaci „epř,radních snutaieh komponent, které jsou typicky ze tři —b skupin: a) skupiny vázající ζόΛ, j.né „a je pfirozeni (..p pndicka vazba ). b) „epříradni zbytky místo pHrazeně sc nových zbytku; «W o, zbytky, k,eré „kundámJ ebo stabilizuji sekundární snokluru, „apř. konfirmace beranka, gama-oméka. baa sutany haf .l& helia ap„d. My„.ld lze
ZT; t Iiet“ *ků spw
Pép d.c ym, vazbmli.
pep.id.ekym, v^ami, jinými chemickými vazbami nebo Spojoractal X aapr, gluiarajdehyd, N-hydravysukcinimidové «.y, ^hodnnud IOCC) nebo N.N-dí.sopropy.kadmdíímid (DIQ. ^j
I mohou být alternativou k tradičm „ldové („peptj(lické vazM-K kaomuthyteu („apř. -CC-O^H, pro aminometbylen (Ch2nH), clh>len> oleím (CH.dbd.CH), éter (CH2O), thioéter (CH2-S), tetrazol (CN.), Udazol, Mroamid, Ihioamid nebo eater (viz Mpř. Spatula, Chemisuy and Biochemistry of Ammo Acids Peedes and Proteins, Sv. 7.267.357, Marceli Dekker, Peptide Backbone Mod,fictions NY (1983)). Polypeptid může být rovněž charakterizován jako mimetikum llm, & všechny nebo «které nepil,0<hi zbytky namísto přírodě se ,yskyt„jIcidl nových zbytků; nepHnxM zbytky Λ» v odbomé , patentové litemtufe
1001701 „značka- nebo „detekovatelný zbytek je kompozice detekovatetaá spektroskoptcky, fotochemicky, biochemicky, imunochetnicky nebo chemicky. Užitečné značky zahrnuji například «Ρ, Huoresoenčni baniiva, elektrondenzm reakčni činidla, enzymy (nap, jaké se běžné používají v testech ELISA), biotin, digoxigenin «ho hapten, a proteiny, které mohou byt učiněny detekovatelnými, např. začleněním radioznačky do peptidu, nebo používané pro detekci protilátek specificky reagujících s peptidem.
1001711 „Označená nukleottdové sonda nebo oligonukleotid“ je sonda, která je vázána bud· kovalentně, proatfcdnictvim lurtan nebo chemickou vazbou, nebo nekoval iontovými, van der Walsovými, elektrostaliokými nebo vodíkovými vazbami, ke značce tak. aby pntomnost sondy mohla být detekována detekcí přitomnosti značky navázané nu somfo.
|00172| Výraz .mukleotidová sonda nebo oligonukleotid“, jak je zde používán je definován jako nuklcová kyselina schopná vázat se „a cílovou „ukleovou kw|inu komplementární sekvence jedním nebo více typy cbenuckýcb vazeb, obvykle prostřednici™, párováni komplementárních bázi, obvykle prostřednictvím tvorby vodíkové vazby. Sonda jak je zde používána, zahrnuje přirozené (tj. A O, c nebo T> „ebo modifikované báze (7-de’aza. gmmosm, mosm atd.). Navíc mohou být báze v sondě spojeny vazbou jinou než je fosfodtesterová vazba, pokud to ne™ bybrídízaci. Sondy tedy mohou být „apřfidad popudové nukleově kyseliny, kdejsou konstituujte! báze spojen, peptidíckými vazbami spíše než fosfodiesterovými vazbami. Odborník pochopí, že sondy mohou váza, elfové sekvence které postrádají komplemr komplementaritu k sekvenci sondy, v závislosti na stringentnosti hybndizačnich podmínek. Sondy jsou případné přímo označeny např, izotopy, chrarn„lo„ iuminoíory, cbromogeny, „ebo nepřímo označeny, mipf. biminem. na «jž ss muže později’ V“' streplavidinový komplex Testováním přítomnosti „ebo nepřítomnosti sondy detekovat pntomnost nebo nepřítomnost vybrané sekvence nebo subsekvence
1001731 Výraz „heterologni“. užije-ii se „ k cásttn] & tklivá kyselina obsahuje dvě „ebo více subvenci se vpřír(xii stejném vzájemném vztahu. Například nukleová kyselina je typicky vytvářena rekombinantní a má dvě nebo více sekvencí z nepřibuzných genů uspořádané tak, aby vytvořily novou funkční nukleovou kyselinu, např, promotor zjednoho zdroje a kódující oblast zjiného zdroje. Podobně i heterologní protein značí, že protein obsahuje dvě nebo více subsekvencí, které se v přírodě nenacházejí ve stejném vzájemném vztahu (např. fuzní protein).
(00174| „Promotor“ je definován jako sada sekvencí nukleových kyselin, která řídí transkripci nukleové kyseliny. Výraz promotor, jak je zde používán, zahrnuje nezbytné sekvence nukleových kyselin poblíž počátečního místa transkripce, např. v případě promotoru typu polymerázy II poblíž prvku TATA. Promotor rovněž případně zahrnuje vzdálené zesilovací nebo potlačující prvky, které mohou být umístěny až několik tisíc párů bází od počátečního místa transkripce. „Konstitutivním“ promotorem je promotor, který je aktivní za většiny okolních a vývojových podmínek. „Indukovatelným“ promotorem je promotor, který je aktivní za okolní nebo vývojové regulace. Výraz „funkčně spojen“ se vztahuje na funkční vazbu mezi sekvencí nukleové kyseliny řídící expresi (např. promotor nebo sada vazebných míst transkripčních faktorii) a druhou sekvencí nukleové kyseliny, přičemž sekvence řídící expresi řídi transkripci nukleové kyseliny podle druhé sekvence.
I0017SI Výraz upkombmtmW, jak je p0UÍIvfe M νζ,Λ,ικ syntetizovaný nebo jinak zpracovaný in vitro (např. „rekombimntni polynukleolid“), na způsoby použití rekombinamuich polybukleotidů pra tvorbu genových produktů v buňkách nebojiných biologických systémech, nebo na polypeptid (,Rekombinantní protein) kódovaný rekombinantní polynukleotidem. „Rekombinantní prostředky“ rovnžž zahrnuji llgaci nukleových kyselin majících různé kódujíc! oblasti nebo domény nebo promotorové sekvence z různých zdrojů do expresní kazety „ebo vektoru pro expresi, napí. indukovatelnou nebo konst,mtivm- expresi ffizniho proteinu obsahujícího tramlokaím doménu podle vynálezu a sekvenci nukleové kyseliny amplifikovnnon za použiti primeru podle vynálezu.
10017*1 Výraz „sdekíivné („ho specificky) hybridizuje na se vztahuje na ..cam zdvojováni „ebo hybridized molekuly penze „ konkrétní „ukleotidov™ sekvenci za slnngentních hybridizaídch podmínek, když je sekvence přítomna v komplexní smési (např. celá buněčná DNA nebo RNA nebo knihovny DNA nebo RNA).
Ι00Π7] Výraz „stnngentní hybridizační podmínky“ se vztahuje na podmínky, za nichž sonda hybndizuje na svou cílovou subsekvencí, typicky v komplexní směsi nukleové kyseliny, ale na žádné jiné sekvence. Stnngentní podmínky jsou závislé na sekvenci a budou za různých okolnosti různé. Delší sekvence hybridizují specificky za vyšších teplot. Rozsáhlý návod na hybridizaci nukleových kyselin lze nalézt v Tijssen, Techniques in Biochemistry soli je and Molecular Biology-Hybridizaiion with Nucleic Probes, Overview of principles of hybrufa,™ and the strategy of nucWc acid assays (1993). Obecné sc sbingenmi podmínky VO . lak, aby byly přibliž 0 5-10 C „J8J „ež je tepe|„ý hod tinl (Tm) prp specif|ckou sekvenci za definovaného pH iontové sily. Tm je teplom (za definované iontové sily pH a nukleové koncentrace), při nik 30 % sond komplementárních kcilové hybridizují „a cílovou sekvenci za rovnováhy (jel i kok jsou cílové sekvence pHromny v nadbytku, pH Tm je 50 % sond obsazeno za rovnováhy). Smngenmj podmhdry budou takové, kde ko^enírace nizSi než pfibllžné 1,OM koncemrace sodného iontu, obvykle přibližné 0,01 až I 0M oncenirace sodného iontu (nebo jiných solí) při pH 7,0 až SJ a teplotu je alespoň přibližné pro krátké sondy (Mtí. 10 ů 50 nukleoudú) . a|Kpoň prQ sondy (napr. dělá! „ež 50 nukleotidu), suji^h desubilizujicich «del, „př. formamide. Pm selekfivm nebo specifickou hybridní je POZO,™, signal alespoh dvakrát pozadí, pHpadué lo-Wr hybndlza„ stnngentm hybnd12aini podmínky mohou být následující; 50% fo[mn]id, 5lSSC a I% SOS, I^otacc při 42 T, nebo 5 x SSC, ,% SDS, lnk„ba„ pfi 65 s piM]yt|m y „ , χ SSC a 0.1% SDS při 65 C. Takové hybridizaee a promývaci hrnky lze provádí, po dobu například 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60; nebo více minut.
' Nukleové kyseliny, „ájemné „ehyhridizují ·>« příbuzné, pokud pojypepridy, kKré ,sou vý2MMí ro * stane přiklad když * kopie degenerace umožníné genciokým kódem. v ,akovýcb y ndizup z. slabé sínngenmích hyhridizaénid, hyWrrM podmínky ztaujl hyWzac. v 4o% |m
Pt. 37 T, a p^., v í y SSC při 45 .c Takov. hyba promývad provadény po dobu ™pf. ,. J, 5, 10, !5, M 60 alespoň dvahrár poradí. Odborník v obou, snadno parna, a to atoativ„, y ndizace a promyvam, aby se zajisíily podmínky o podobné síringenmosíi.
100179) „Protilátka“ se vztahuje na polypeptíd obsahující úsek základní smkliiry z imunoglobulinového gen. nebo jeho Ragmen^, kte^ * spccificky yfe , «gen. Rozpoznané imunoglobuíí^é geny zahrnují geny totanmirb „bW kappa, l-^a. alfa, gama, deka. ypsilo„ a mí, jakož i ímun^ohuhnové geny prvých oblastí, hebké řetta5 jsou tankovány buď jakp kappa z e etézce jsou tankovaný jako gama, mí, alia, delta nebo epsilon, které na oplátku delinuj, imunoglohulmové Sidy IgC, IgM, IgA, IgD a IgE, v mmto pořadí.
W180I Ukázková imunoglobuliuová (proiilátová) zmitaoi jednotka obsahuje taňme». Každý η,™» je složen ze dvou identických part polýpeptido^h refcu, pfcž každý par najeden „lehký“ (asi 25 kDa) ajeden „těžký“ (asi 50-70 kDa) řetězec. N-konec každého řetězce definuje proměnlivou oblast o přibližní 100 až 110 nebo více aminokyselinách, která jo primární zodpovědná za rozpoznání antigenu. Výrazy prománl.vý lehký řetězec ŘL) a proměnlivý těžký řetězec (V„) se vztahují na tyto lehké, tesp. tížké řetězce.
1001811 „Chimérická protilátka“ Je molekula protilátky, kde (a) konstantní oblast nebo její íast je změněna, „altrazata nebo vyměněna t* aby bylo vazební místo antigenu (proměnlivá oblast) spojeno s konstantní oblasti jiní nebo zmíněné třídy, ejektorové takce atebo druhu, nebo kc zcela odlišné molekule, která dodá chimérické protilátce nové vlastnosti, např k enzymu, toumu, hormon» rtstovéntu faktoru, léčivu atd., nebo (b) promínlivá obte nebo její Cast je změněna, nahrazena nebo vyměněna proměnlivou oblastí mající odlišnou nebo změněnou antigenovou specifitu.
I0O1KI Protilátka ,tali-T2R“ je protilátku nebo fragment protiíátky, ktort specificky váže polypeptid kódovaný genem T2R, cDNA nebo jejich subsekvencí.
IWlni Výraz „imunologický test“ je test, který používá protilátku pm specifické vázáni antigenu. Imunologický les. se vnucuje použitím specifických vazebných vábností konkrétní protilátky pro izolaci, cílení a/nebo kvantifikaci antigenu.
I“1Vi™ « Váže na protilátku nebo „specificky (nebo seleklivné) ummitní reaguje s- pokud jde „ reakci, která urCuje přítomnost proteinu «heterogenní populaci prosta , dalších o ogiekych látek. Za daných podmínek imunologického testu se tedy protilátky vá&u M kontem, protem alespoň dvakrát pozadí a nevážou se výraané ve „a — proteiny přítomné ve vzorku. Specifické vázám „a ptotiiátku z. t^ p(Ktoliaek muže vyžadovat protilátku, která je vybrána pra svou specifitu ke konkrétnímu I00IS5I Například polyklonálai protilátky vypěstované na člena skupiny T2R ze specifických «.jako je taysa. myj „ebo ílovík. moho„ * yybWaJ, takových polyklonáluich protilátek, které specificky imuuotogicky rougují spdypepddem T2R nebo jeho imunogemu části a ne sjtnýmí proteiny, kromě otalognid, nebo polyraortach vartant a akt polypeptidu T2R. Tohoto výběru lze dosáhnout odčtením protilátek, klere křížově roaguji s molekulami T2R z jiných druhů nebo s jinými molekulami
R. Protilátky mohou být rovněž vybily tak. r07pM|y
GPCR. ale mkoh GPCR z jiných skupin. Pro výběr protilátek, klete specificky IIIlurologlcky reaguj, s konkrétním proteinem, lze použit mnoho rázných formátů imunologických teta
Běžné se používají pro výběr protilátek specificky imunologicky reagujících s proteinem například imunologické testy ELISA na pevné fázi (viz např. Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, (1988) pro popis formátů a podmínek imunologických testů, které lze použit pro určení specifické imunologické reaktivity). Typicky bude specifická nebo selektivní reakce alespoň dvakrát signál nebo hluk pozadí a ještě typičtěji více než 10 až 100krát pozadí.
1001861 Výr82 „selektivně se spojuje s se vztahuje na schopnost „ukjeové kyseliny „wlekuvne hybndizovaT s jinou, jak je popsáno výše, nebo schopnost protilátky selektivní (nebo specificky) se vázat na protein, jak bylo definováno výše.
100187] Výraz „expresní vektor“ se vztahuje na jakýkoli rekombinantní expresní systém pro účely exprese sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu in vitro nebo in vivo, konstitutivně nebo indukovatelně, vjakékoli buňce, včetně prokaiyotických, kvasinek, hub,’ rostlin, hmyzu nebo savčích buněk. Výraz zahrnuje lineární nebo knihové expresní systémy. Výraz zahrnuje expresní systémy, které zůstávají epizomálni nebo se začlení do genomu hostitelské buňky. Expresní systémy mohou nebo nemusí mít schopnost auto-replikace, tj. řídit pouze přechodnou expresi v buňce. Výraz zahrnuje rekombinantní expresní kazety, které obsahují pouze minimum prvků nezbytných pro transkripci rekombinantní nukleové kyseliny.
100188] „Hostitelskou buňkou“ je míněna buňka, která obsahuje expresní vektor a podporuje replikací nebo expresi expresního vektoru. Hostitelské buňky mohou být prokaiyotické buňky, např. E. eoli, nebo eukaiyotické buňky, např. buňky kvasinek, hmyzu obojživelníků nebo savců, např. CHO, HeLa, HEK-293 apod., např. kultivované buňky,’ explantát a buňky in vivo.
1001891 Na základě výše uvedeného poskytuje vynález testy pro identifikaci sloučenin, ktere modulují, s výhodou blokují, specifickou aktivaci předem identifikovaného lidského receptoru hořké chuti hořkými sloučeninami, např. hořkými sloučeninami přítomnými v kávě a extraktech z kávy a strukturně příbuznými a dalšími hořkými sloučeninami. Konkrétně vynález poskytuje buněčné testy pro identifikaci sloučenin, které modulují (např. blokují) aktivaci hT2R8 a hT2R14, Tyto sloučeniny modulují hořkou chuť spojenou s těmito chuťovými receptory u lidských subjektů. To se pak potvrdí v chuťových testech.
(001901 ° Vynález také identifikuje a poskytuje antagonism s antagomsúckýnu vlastnostmi o široké působnosti, které lze použít v potravinách, nápojích, léčivech a dalších materiálech pro požiti člověkem nebo zvířetem, obsahujících známé nebo neznámé hořké sloučeniny, přičemž hořká chut je vhodně minimalizována nebo eliminována.
(00191) To, že výše uvedené chuťové receptory specificky odpovídají na hořkou sloučeninu(y) přítomnou v kávě a na specifické hořké sloučeniny, které interagují s jedním, násobným nebo neznámým receptorem hořké chuti, se stanovilo v zásadě pomocí expresního systému HEK293 a vápníkových zobrazovacích metod, o nichž se píše v jiných publikacích, jakož i v přihláškách vynálezů podaných současným majitelem této přihlášky, např. US č. 10/191,058 a 09/825,882, které jsou zde obě celé zahrnuty odkazem. Konkrétněji vynálezci transfektovali buňky HEK293 konkrétním hT2R označeným rhodopsinovou 35aminokyselinovou značkou (SEKV. ID. Č. 1) spolu s chimérickým G proteinem (G16gust44), který obsahuje sekvenci G(1I6 G proteinu modifikovanou nahrazením karboxy-44-aminokyselínových zbytků zbytky gustducinu a zaznamenali odpovědi těchto buněk na specifické hořké ligandy vápníkovými zobrazovacími metodami.
[00192| Konkrétně vynálezci použili savčí buněčný test pro monitorování aktivit hT2R. Pro vápníkové zobrazovací testy se buňky naočkovaly do 48-jamkových tkáňových kultivačních destiček. O 24 hodin později se buňky přechodně transfektovaly expresním plazmidem (pEAKlO) obsahujícím sekvenci nukleové kyseliny hT2R a plazmidem (pEAKlO) obsahujícím chimérický G protein (G16gust44). O dalších 24 hodin později se buňky inkubovaly s fluorescenčním barvivém specifickým pro vápník (Fluo-4; Molekulární sondy). Naplněné buňky se vystaví různým hořkým sloučeninám a aktivace hT2R vede k aktivaci G16gust44, která na oplátku vede k mobilizaci vápníku uvnitř buněk. Tento nárůst koncentrace vápníku mění fluorescenční vlastnosti vápenatého barviva uvnitř buněk. Tyto změny se monitorují za použití fluorescenční mikroskopie.
[001931 Vynálezci rovněž použili automatický fluorimetrický zaměřovači systém FLIPR za použití mírně odlišného protokolu. Buněčná linie HEK293 stabilně exprimující G16gust44 se transferovala expresním plazmidem hT2R, o 24 hodin později se buňky naložily a analyzovaly na FLIPRu.
[00194| Poté, co je pro konkrétní hT2R identifikován ligand, vytvoří se buněčná linie stabilně exprimující jak hT2R, tak G16gust44, což usnadní budoucí screemngové testy pro identifikaci dalších ligandů, které aktivuji konkrétní hT2R nebo které modulují (blokují nebo zesiluji) aktivaci tohoto hT2R jiným hořkým ligandem, jako je např. horká sloučenina obsažená v kávě. Tím se zabrání nutnosti přechodné transfekce.
[00195] Jak je znázorněno na obrázcích, takové experimenty ukázaly, že hT2R8 a hT2R14 reagují na hořké sloučeniny přítomné v kávě, a identifikovaly sloučeniny, které inhibují nebo blokují hořkou chuť kávy. Experimenty také na obr. 5 a v příkladu 3 mže ukazují široké antagonistické vlastnosti konkrétně sloučeniny C.
[001961 Tyto výsledky ukazují, že buňky, které identifikovaly chuťové receptory hT2R, mohou být použity v testech pro identifikaci ligandů, které modulují hořkou chuť spojenou s alespoň jedním ze zmíněných konkrétních hT2R, jakož i v testech pro detekci sloučenin zodpovědných za hořkou chuť.
1001971 Tyto testy s výhodou využiji testovací buňku, kteří expnmuje DNA kódující 0I2R mající jednu z aminokyselinových sekvenci definovaných níže. Očekává se vlak že i fragmenty, oriology, varianty a chiméry ttehtn nrceptorových polypepaidů, kleté si „chovají funkční vlastnosti .Sehto receptor! hořké chuti, tj. budou reagovat na ačkteré hořké slotiíemny, budou »téchto testech užitečné. Přiklad, útkových variant zahrnuj, spojené v«W. polymorfismy jednoho nukleotidu, aktové varianty a mmace vytvořené rekombmantné nebo chemicky, nebo přirozené se vyskytující. Prostředky izolace a exprese T2R. které se použil, testech podle , v v tomto vynálezu pm identifikaci sloučenin, tané inhibuj, aktivaci téchto receptor!, jsou objasněny níže.
Izolace a exprese T2R
IM198I Izolace a exprese T2R nebo jeho fragment! nebo variant podle vynálezu mohou byt proveden, zavedenými konstruovaných na základ! sekvencí aukleových kyselin T2R popsaných v této přihlášce. Příbuzné sekvence T2R mohou být také Identifikovány z lidských nebo jiných genomovýeh databázi z. použiti zde popsaných sekvencí a známých počítačových vyhledávacích technologií, na,», vyhledávání sekvencí BLAST. V jednom konkrétním provedení mohou být pro identifikaci funkčních alel nebo příbuzných genů použity zde popsané pseudogeny.
1001991 Expresní vektory pak mohou být použity k infekci nebo Iransfckcí hostitelských “ pro funkční expresi téchto sekvenci. Tyto geny a veklmy mohou bý, dvořeny a expnmovány in vitro nebo in vivo. Odborník v oboro pozná, že požadované ftnotypy pro ménéní a řízeni exprese nukleových kyselin lze získat modulací exprese nebo aktivity geml . nukleových kyselin (např. promotora, zesilovačů apod.) ve vektorech podle vynálezu Lze použit jakýkoli popsaný známý způsob pro zvýSeni „ebo sníženi exprese nebo aktivity.
Vynalez může být praktikován ve spojení s jakýmkoli způsobem nebo protokolem známým v oborou, ktere jsou dobře popsány v odborné a patentové literatuře,
[00200] Alternativně mohou být tyto nukleové kyseliny syntetizovány in vitro dobře známými technikami chemické syntézy, jak je popsá„o např. v Carruthers, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411^18 (1982); Adams, Am. Chem. Soc., 105.661 (1983)· Belousov, Nucleic Acids Res. 25:3440-3444 (1997); Frenkel, Free Radic. Biol. Med. 19:37364
380 (1995); Blommers. Biochemistry 33:7886-7896 (1994); Narang, Meth. Enzymol. 68:90 (1979); Brown, Meth. Enzymol. 68:109 (1979); Beaucage, Tetra. Lett 22:1859 (1981); U.S patem Í. 4,458,066. Fragmenty dvuuSraubmcoyé DNA pak lze získat buď komplementárního řetězec a spojením řetězců podáním komplementárního řetězce za použití DNA polymery s vhodnou primem™ sekvencí.
100201] Techniky manipulace snukleovými kyselinám, např. pro generováni mutací v sekvencích, sub-klonování, značkovací sondy, sekvencování, hybndizace apod. jsou dobře popsány v odborné a patentové literatuře. Viz např. Sambrook, ed„ Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd cd.), Svazky 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989); Ausubel, ed, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1997),· Tijssen, ed„ Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization Acid ^es, Pan t fheoty and Nucleic Acid PKprat^
IMÍ02I Nukleové kyseliny, vektory, kapaidy, pdypeptitiy apod. se mohou analyzovat a kvantifikovat jakýmkoli znrnoha obecných prostředků, Here odborníci voboro dobře znají Tyto prostředky zahrnují nnpř. analytické biochemické metody jako je NMR spektrofotometre, radiografc, elektroforéza, kapilární elektroforéza, vyaokoúéinná kapalinová chromatograde (HPLC), tenkovrstvá dmimatogmíle (TLC) a hyperdiftai chromatografie razné imunologické metody, např. fluidré nebo gdové přec,pumové reakce, imunodita imunoelektrotoreza, radioimunotogické testy (R1A), enzymová imunosoBrém analýza (EL1SA), ummofhmmacanM testy, SMhen, blot, gelová elektroforéza (např. SDS-PAGE), RT-PCR. tvMiaii,n, metody pro omplifikaci nukleové kyseliny nebo clle nebo signálu, mdioznaéková^. scintilační počítání a afínitní chromatografie.
1002031 Oligonukleolidové přiměj, mohou být použity pro amplnikoc, nukleovýcll k |ln oblas. T2R vábící 1]ga„d zde nukleové klonovaný „H, métay kvantitativné za použiti amplion technik. Amplifikaěm metody jsou rovněž dobře známy v obora a zahrnují např. polymctózov™ řetězovou „akci IPCR) (hans ed„ PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, Academie Press, N.Y. (1990); Innis ed„ PCR Strategies, Academic Press. Inc., N.Y. (1995)); ligázovou relézovou „akci (LCR) (Wu, Genomics, 4:560 (1989); Landegreu, Science, 241 1077 (1988)· Bamnget, Gene, 89;I17 (1990)); mmsknpém amplifikaei (Kwoh, PNAS, 86:1173 (1989))sekveníni auloreplikaee (Ouatelli, PNAS, 87:1874 (!990)); Q-bea „plikázová amplitíkaee (Smith, J. Clin. Microbiol., 35:1477-91 (1997)); automatizovaný Q-beta replikázový amplifíkační test (Burg, Mol. Cell. Probes, 10:257-71 (1996)); a další techniky zprostředkované RNA polymerázou (např. NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario). Viz také Berger, Methods Enzymol., 152:307-16 (1987); Sambrook; Ausubel; U.S. patenty č. 4,683,195 a 4,683,202; Sooknanan, Biotechnology, 13:563-64 (1995),
[00204} Jakmile jsou nukleové kyseliny amplifikovány, buď individuálně nebo jako knihovny, mohou být klonovány způsoby známými v oboru, je-li to Žádoucí, na jakýkoli z mnoha vektorů za použití rutinních molekulárních biologických metod; metody klonování nukleových kyselin amplifíkovaných in vitro jsou popsány např. v U.S. patentu Č. 5,426,039. Pro usnadnění klonování amplifíkovaných sekvencí mohou být do PCR příměrového páru „zabudována“ restrikční enzymová místa. Například místa Pst I a Bsp El byla konstruována do ukázkových příměrových párů podle vynálezu. Tato konkrétní restnkční místa mají sekvenci, která když je ligována, tak jsou „in-frame“ vzhledem k „donorové“ kódující sekvenci 7-membránového receptoru, do níž jsou napojena (sekvence kódující oblast vázající ligand je vnitřní k 7-membránovému polypeptidu, a proto je-li žádoucí, aby byl konstrukt translatován po směru zapojovacího místa restrikčního enzymu, mělo by se zabránit výsledkům out of frame; to nemusí být nutné, pokud vložená oblast vázající ligand obsahuje podstatnou většinu transmembránové oblasti VII). Primery mohou být konstruovány tak, aby uchovaly původní sekvenci „donorového“ 7-membmnového receptoru. Alternativně mohou primery kódovat aminokyselinové zbytky, které jsou konzervativními substitucemi (např. hydrofobní pro hydrofobni zbytky, viz diskuze výše) nebo funkčně benigní substituce (např. nezabraňují inzerci plazmatické membrány, nezpůsobuji Štěpení peptidázou, nezpůsobují abnormální skládání receptoru apod.).
100205) Příměrové páry mohou být konstruovány tak, aby selektivně amplifíkovaly oblasti proteinu T2R vázající ligand. Tyto vazební oblasti se mohou pro různé ligandy lišit; proto co může být minimální vazebná oblast projeden ligand, to může být příliš omezující pro druhý potenciální ligand. Proto mohou být amplifikovány vazebné oblasti o různých velikostech obsahující různé doménové struktury; například transmembránové domény II až VII, III až VII, III až VI nebo 11 až VI nebo jejich variace (např. pouze subsekvence konkrétní domény, pomícháni pořadí domén apod.) 7-transmembránového T2R.
(002061 Jelikož doménové struktury a sekvence mnoha 7-membránových T2R proteinů jsou známy, odborník v oboru snadno zvolí sekvence sousedící s doménou a vnitřní doménové sekvence jako modelové sekvence pro konstrukci degenerovaných amplifikačních příměrových párů. Například sekvence nukleové kyseliny kódující doménové oblasti II až VII mohou býi generovány PCR amplifikaci za použiti příměrového páru. Pro amplifikaci nukleové kyseliny obsahujíc! sekvenci transmembránové domény I (TM 1) muže být zkonstruován degenerovaný primer z nukleové kyseliny, klem kóduje aminokyselinovou sekvenci výSc popsané konvenčni sekvence I skupiny T2R. Takový degenerovaný primer se muže použil pro generováni vazebné oblasti začleňující TM I až TM III. TM 1 až TM IV, TM I až TM V, TM I až TM VI nebo TM I až TM VII, DaBÍ degenerované primery mohou být zkonstruovány „ základí zde poskytnutých ostatních konvenčních sekvenci skupiny T2R Tskový degenerovaný primer se muže použit pro generováni vazebné oblasti začleňující TM 111 až TM IV, TM III až TM V, TM III až TM VI nebo TM III až TM VII.
100207] Vzory konstrukce degenerovaných příměrových párů jsou v oboru dobře známy. Například počítačový program strategie COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Printer (CODEHOP) (konvenční degenerovaný hybridní oligonukleotidový primer) je dostupný na a Je pfímo napojen zm,sta mnohonásobného sekvenčního alignment BlockMaker pro předpověď hybridních primerů počínaje sadou příbuzných proteinových sekvencí, jako známých oblastí chuťového receptoru vázajících lígand (viz např. Rose, Nucleic Acids Res., 26:1628-35 (1998); Singh, Biotechniques, 24:318-19 (1998)).
[00208] Prostředky pro syntézu oligonukleotidových příměrových párů jsou v oboru dobře známy. Lze použít páry „přírodních“ bázi nebo pátý syntetrckých bází. Například použití umělých nukleobází nabízí všestranný přístup kmanipulaci sprinterovou sekvencí a ke generování komplexnější směsi amplifikačních produktů. Různé skupiny umělých nukleobází jsou schopny pojmout mnoho orientací s vodíkovou vazbou prostřednictvím rotací vnitřních vazeb, aby se poskytly prostředky pro identifikaci degenerovaných molekul. Začlenění těchto analogů do jediné polohy PCR prímeru umožňuje generování komplexní knihovny amplifikačních produktů. Viz např. Hoops, Nuclete Acid Res„ 25:4866-71 (1997). Nepolární molekuly mohou být rovněž použity, aby napodobovaly tvar přirozených DNA bází. Napodobenina tvaru adeninu, bez vodíkových vazeb, se může účinně a selektivně replikovat proti nepolární napodobenině tvaru thyminu (viz např. Morales, Nat. Struct. B10|„ 5:950.54 (1998)). Například dvěma degenerovanými bázemi mohou být pynmidinová báze 6H 8H -3,4-dihydroPyrimido[4,5-c][l,2]oxazin-7-on nebo purinová báze N6-methox^ 6-draminopurin (v.z např. Hill, PNAS, 95:4258-63 (1998)). Ukázkové degenerované primery podle vynálezu začleňují analog nukleobáze 5^imethoxytrityl-N-benzoyl-2'-deoxy-cytidm,3H(2-kyanoethyl)- (N,N-diiSoPropyl)]-foSforamidit („P“ v sekvencích - viz výše).
Tento analog pynmidinu tvoří vodíkové vazby s puriny, včetně A a G zbytků.
#5 r
Ο ne ft <1 ί
[00209] Polymorfní varianty, alely a mezidruhové homology, které jsou značně identické se zde popsaným chuťovým receptorem, mohou být izolovány pomocí výše popsaných sond nukleových kyselin. Alternativně mohou být použity expresní knihovny pro klonováni T2R polypeptidů a jejich polymorfních variant, alel a mezidruhových homologů, detekcí expnmovaných homologů imunologicky s antiséry nebo puntíkovanými protilátkami proti T2R polypeptidů, které také rozpoznávají a selektivně se vážou na homolog T2R.
100210] Nukleové kyseliny, které kódují oblasti chuťových receptorů vázající ligand, mohou být generovány amplifikací (např. PCR) vhodných sekvencí nukleových kyselin za použití vhodných (dokonalých nebo degenerovaných) příměrových párů. Amplifikovanou nukleovou kyselinou může být genomová DNA zjakékoli buňky nebo tkáně nebo mRNA nebo cDNA odvozená 2 buněk exprimujících chuťový receptor.
[00211] V jednom provedení mohou být konstruovány hybridní sekvence kódující protein, obsahující nukleové kyseliny kódující T2R spojené s translokačními sekvencemi. Poskytnuty jsou i hybridní T2R obsahující translokační motivy a oblasti vázající sloučeninu vyvolávající chuť zjiných skupin chemosenzorických receptorů, zejména chuťových receptoiů. Tyto sekvence nukleových kyselin mohou být funkčně spojeny s transknpčnínu nebo translačními řídicími prvky, např. transkripčními nebo translačními iniciačními sekvencemi, promotory a zesilovači, transknpčními a translačními terminátory, polyadenylačními sekvencemi a dalšími sekvencemi užitečnými pro transkripci DNA do RNA. Při konstrukci rekombinantních expresních kazet, vektorů a transgenických forem se může použít fragment promotoru pro řízení exprese požadované nukleové kyseliny ve všech požadovaných buňkách nebo tkáních.
[002121 V dalším provedení mohou fuzní proteiny zahrnovat C-koncové nebo N-koncové translokační sekvence. Dále mohou fůzní proteiny obsahovat další prvky, např. pro detekci proteinu, purifikaci nebo další aplikace. Domény usnadňující detekci a purifikaci zahrnují např. peptidy tvořící cheláty skovy, např. polyhistidinové oblasti, histidin-tryptofanové moduly nebo další domény, které umožňují purifikaci na .mobilizovaných kovech; protein vázající maltózu, domény proteinu A umožňující purifikaci na imobilizovaném imunoglobulinu; nebo doménu používanou v extenzním/afinitním purifikačním systému FLAGS (Immunex Corp, Seattle Wash.).
[002131 Inkluze sekvencí odštěpíteIného linkeru, např. Factor Xa (viz např Ottavi Biochimie, 80:289-93 (1998)), subtilisin proteázového rozpoznávacího motivu (viz např’ Polyak, Protein Eng., 10:615-19 (1997)); enterokinázy (Invitrogen, San Diego, Calif,) apod. mezi translokační doménu (pro účinnou expresi plazmatické membrány) a zbytek nově translatovaného polypeptidů může být užitečná pro usnadnění purifikace. Jeden konstrukt například může obsahovat polypeptid kódující sekvenci nukleové kyseliny napojený na Šest histidinových zbytků, následovaný thioredoxinem, enterokinázovým štěpícím místem (viz např. Williams, Biochemistry, 34:1787-97 (1995)) a C-koncovou translokační doménou. Histidinové zbytky usnadňují detekci a purifikaci, zatímco enterokinázové štěpící místo poskytuje prostředky pro purifikaci požadovaného proteinu(Ů) od zbytku fozního proteinu. Technologie týkající se vektorů kódujících fuzní proteiny a aplikace fuzních proteinů jsou dobře popsány v odborné a patentové literatuře (viz např. Kroll, DNA Cell. Biol, 12-441-53 (1993)).
[00214] Expresní vektory, buď jako individuální expresní vektory nebo jako knihovny expresních vektorů, obsahující sekvence kódující oblast vázající ligand mohou být zavedeny do genomu nebo do cytoplazmy nebo do jádra buňky a exprimovány mnoha různými běžnými postupy, ktere jsou dobře popsány v odborné a patentové literatuře. Viz např. Roberts, Nature, 328:731 (1987); Berger viz výše; Schneider, Protein Exper. Purif., 6435:10 (1995); Sambrook; Tijssen; Ausubel. Informace o produktu od výrobců biologických reakčních činidel a experimentální vybavení rovněž poskytují informace týkající se známých biologických metod. Vektory mohou být izolovány z přírodních zdrojů, získány z takových zdrojů jako jsou ATCC nebo knihovny genových bank nebo připraveny metodami syntézy nebo rekombinace.
[00215| Nukleové kyseliny mohou být exprimovány v expresních kazetách, vektorech nebo virech, které jsou stabilně nebo přechodně exprimovány v buňkách (např. epizomální expresní systémy). Selekční markéry mohou být začleněny do expresních kazet a vektorů, aby transformovaným buňkám a sekvencím dodaly volitelný genotyp. Selekční markéry mohou například kódovat epizomální udržení a replikaci tak, aby integrace do hostitelského genomu nebyla nutná. Marker může například kódovat odolnost vůči antibiotikům (např. chloramfentkol, kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin) nebo odolnost vůči herbicidům (např. chlorsulfuron nebo Basta), aby se umožnil výběr těch buněk, které jsou transformovány s požadovanými DNA sekvencemi (viz např. Blondelet-Rouault, Gene, 190:315-17 (1997); Aubrecht, J. Pharmacol. Exp. Ther., 281:992-97 (1997)). Protože mohou být geny volitelných markérů dodávajících odolnost substrátům jako je neomycin nebo hygromycin používány pouze ve tkáňové kultuře, mohou být chemorezistentní geny rovněž použity jako volitelné markéry in vitro a in vivo.
[002161 Sekvence chimérické nukleové kyseliny může kódovat oblast T2R vázající ligand v jakémkoli 7-transmembránovém poiypeptidu. Protože polypeptidy 7-transmembránového receptorů mají podobné primární sekvence a sekundární a terciární struktury, mohou být strukturní domény (např. mimobuněčná doména, TM domény, cytoplazmatická doména atd.) snadno identifikovány sekvenční analýzou. Například modelování homologie, Fourierova analýza a detekce periodicity helixu mohou identifikovat a charakterizovat sedm domén se sekvencí 7-transmembránového receptorů. Algoritmy rychlé Fourierovy transformace (FFT) se mohou použít pro vyhodnocení dominantních period, které charakterizují profily hydrofobicity a variability analyzovaných sekvencí. Zesílení detekce periodicity a index periodicity alfa-helixu lze provést např. pomocí Donnelly, Protein Sci., 2:55-70 (1993). Další algoritmy pro alignment a modelování jsou v oboru dobře známy (viz např. Peitsch, Receptors Channels, 4:161-64 (1996); Kyte & Doolittle, J. Md. Biol., 157:105-32 (1982); a Cronet, Protein Eng., 6:59-64 (1993).
[00217] Vynález rovněž zahrnuje nejen molekuly nukleových kyselin a polypeptidů mající specifikované sekvence nukleových kyselin a aminokyselin, ale také jejich fragmenty, zejména fragmenty o např. 40, 60, 80, 100, 150, 200 nebo 250 nukleotidech, nebo více, jakož i polypeptidové fragmenty o např. 10, 20, 30, 50, 70, 100 150 aminokyselinách, nebo více. Případně mohou fragmenty nukleových kyselin kódovat antigenni polypeptid, který je schopen navázat se na protilátku vypěstovanou proti členu skupiny T2R. Dále může být fragment proteinu podle vynálezu případně antigenním fragmentem, který je schopen vázat se na protilátku vypěstovanou proti členu skupiny T2R.
[002181 Zamýšleny jsou i chimérické proteiny obsahující alespoň 10, 20, 30, 50, 70, 100 nebo 150 aminokyselin, nebo více, z alespoň jednoho ze zde popsaných polypeptidů T2R, navázané na další aminokyseliny představující celý nebo část dalšího GPCR, s výhodou člena 7-transmembránové nadskupiny. Tyto chiméry mohou být vytvořeny z okamžitých receptorů a dalšího GPCR nebo mohou být vytvořeny kombinací dvou nebo více přítomných receptorů. V jednom provedení jedna část chiméry odpovídá nebo je odvozena z transmembránové domény T2R polypeptidů podle vynálezu. V dalším provedení jedna část chiméry odpovídá nebo je odvozena z jedné nebo více tmnsmembránových oblastí zde popsaného T2R polypeptidů a zbývající část nebo části mohou pocházet zjiného GPCR. Chimérické receptory jsou v oboru dobře známy a postupy jejich přípravy a výběr a hranice domén nebo fragmentů receptorů spojených s G-proteiny pro začlenění jsou rovněž dobře známy. Tato znalost odborníků může být tedy snadno využita pro tvorbu takových chimérických receptorů. Použití takových chimérických receptorů může poskytnout například chuťovou selektivitu charakteristickou pro jeden ze zde popsaných receptorů, spojenou s vlastnostmi signální transdukce jiného receptorů, jako je dobře známý receptor používaný v testovacích systémech dosavadního stavu techniky.
[00219] Například oblast jako je oblast vázající ligand, mimobuněčná doména, transmembránová doménám cytoplazmatická doména, N-koncová doména, C-koncová doména nebo jakákoli jejich kombinace může být kovalentně vázána na heterologní protein. Například transmembránová oblast T2R může být spojena s transmembránovou doménou heterologního GPCR nebo mimobuněčná doména heterologního GPCR může být spojena s transmembránovou oblastí T2R. Další vybrané heterologní proteiny mohou zahrnovat např. zelený fluorescenční protein, beta-galaktosidázové polypeptidy, glutamátový receptor a rhodopsinové polypeptidy, např. N-koncové fragmenty rhodopsinu, např. hovězího rhodopsinu.
|00220| V rozsahu vynálezu je i použiti různých hostitelských buněk pro expresi T2R, fragmentů nebo variant podle vynálezu. Pro získání vysokých úrovní exprese klonovaného genu nebo nukleové kyseliny, např. cDNA kódující T2R, fragmenty nebo varianty podle vynálezu, se typicky sub-klonuje sekvence nukleové kyseliny, která nás zajímá, do expresního vektoru, který obsahuje silný promotor přímé transkripce, terminátor transkripce/translace, a pokud jde o nukleovou kyselinu kódující protein, vazební místo pro ribozom pro iniciaci translace. Vhodné bakteriální promototy jsou v oboru dobře známé a popsané, např. vSambrook a kol. S výhodou se pro expresi předmětného receptorů hT2R použijí eukaryotické expresní systémy,
100221] Lze použít jakýkoli z dobře známých postupů zavedení cizích nukleotidových sekvencí do hostitelských buněk. Ty zahrnují použití kalcium-fosfátové transfekce, polybren, fúze protoplastů, elektroporace, lipozomy, mikroinjekce, plazmatické vektory, virové vektory a jakýkoli z dalších dobře známých způsobů pro zavedení klonované genomové DNA, cDNA, syntetické DNA nebo dalšího cizího genetického materiálu do hostitelské buňky (viz např. Sambrook a kol.). Je pouze nutné, aby byl konkrétní postup genového inženýrství schopen úspěšně zavést alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny do hostitelské buňky schopné exprimovat T2R, fragment nebo variantu, které nás zajímají.
[00222] Poté, co je expresní vektor zaveden do buněk, jsou transferované buňky kultivovány za podmínek podporujících expresi receptorů, fragmentu nebo varianty, které nás zajímají a který je pak izolován z kultury za použití standardních technik. Příklady takových technik jsou v oboru dobře známy. Viz např. WO 00/06593, který je zde začleněn odkazem konzistentně s tímto popisem.
Testy detekce sloučenin, které modulují aktivitu hT2R podle vynálezu
[002231 Způsoby a kompozice pro určení, zda se testovaná sloučenina specificky váže na polypeptid T2R podle vynálezu, jak in vitro, tak in vivo, jsou popsány níže. Pro vyhodnocení ucinku vázání ligandu na přirozeně se vyskytující nebo chimérické T2R lze monitorovat mnoho aspektů buněčné fyziologie. Tyto testy mohou být prováděny na intaktních buňkách expnmujicich polypeptid T2R, na permeabilizovaných buňkách nebo na membránových frakcích vytvořených standardními způsoby.
[00224J Chuťové receptory vážou sloučeniny vyvolávající chuť a iniciují transdukci chemického podnětu do elektrických signálů. Aktivovaný nebo inhibovaný G protein na oplátku zrněni vlastnosti cílových enzymu, kanálků a dalších efektorových proteinů. Některé příklady jsou aktivace cGMP fosfodiesterázy transdukci ve zrakovém systému, adenylátcyklázy stimulačním G proteinem, fosfolipázy C pomocí Gq a dalších příbuzných G proteinů a modulace různých kanálků pomoci Gi a dalších G proteinů. Mohou být zkoumány i důsledky po směru exprese, např. generování diacylglycerolu a IP3 fosfolipázou C a na oplátku mobilizace vápníku pomocí IP3.
1002251 Předmětné hT2R proteiny nebo polypeptidy z testu se typicky zvolí z polypeptidu majícího sekvenci obsaženou v seznamu sekvencí, který je uveden před nároky, nebo jeho fragmenty nebo konzervativně modifikované varianty.
[002261 Alternativně mohou být T2R proteiny nebo polypeptidy z testu odvozeny z eukaryotické hostitelské buňky a mohou obsahovat aminokyselinovou sekvenci mající určíte procento aminokyselinové sekvenční identity s těmito T2R polypeptidy nebo jejich konzervativně modifikovanými variantami. Obecně je aminokyselinová sekvenční identita alespoň 30%, s výhodou 30-40%, konkrétněji 50-60, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% nebo 99%. Případně mohou T2R proteiny nebo polypeptidy z testů obsahovat oblast T2R polypeptidu, např. tnimobuněčnou doménu, transmembránovou oblast, cytoplazmatickou doménu, doménu vázající ligand apod. Případně, jak je to doloženo příklady, může být T2R polypeptid nebo jeho část kovalentně vázána na heterologní protein pro tvorbu chimérického proteinu používaného ve zde popsaných testech.
(00227| Modulátory aktivity T2R mohou být testovány za použití T2R proteinů nebo polypeptidů, jak bylo popsáno výše, buď rekombinantních nebo přirozeně se vyskytujících. T2R proteiny nebo polypeptidy mohou být izolovány, expnmovány v buňce, exprimovány v membráně odvozené z buňky, exprimovány ve tkáni nebo ve zvířeti, buď rekombinantní nebo přirozeně se vyskytující. Mohou se použít např. plátky jazyka, disociované buňky zjazyka, transformované buňky nebo membrány. Modulace se může testovat za použití zde popsaných in vitro nebo in vivo testů.
Detekce modulátorů r *» r n i rr
Ί ι (00228] Kompozice a způsoby určení, zda se testovaná sloučenina specificky váže na T2R receptor podle vynálezu, jak in vitro, tak in vivo, jsou popsány níže. Pro vyhodnocení účinku vázání ligandu na T2R polypeptid podle vynálezu může být monitorováno mnoho aspektů buněčné fyziologie. Tyto testy mohou být prováděny na intaktních buňkách exprimujících chemosenzorický receptor, na permeabilizovaných buňkách nebo na membránových frakcích vytvořených standardními způsoby nebo in vitro za použití znovu syntetizovaných proteinů.
[002291 In vivo se chuťové receptory vážou na sloučeniny modulující chuť a iniciují transdukci chemických podnětů na elektrické signály. Aktivovaný nebo inhibovaný G protein na oplátku zni ní vlastnosti cílových enzymů, kanálků a dalších efektorových proteinů. Některé příklady jsou aktivace cGMP fosfodiesterazy transdukci ve zrakovém systému, adenylátcyklázy stimulačním G proteinem, fosfolipázy C pomocí Gq a dalších příbuzných G proteinů a modulace různých kanálků pomocí Gi a dalších G proteinů. Mohou být zkoumány i důsledky po směru exprese, např. generování diacylglycerolu a ÍP3 fosfolipázou C a naoplátku mobilizace vápníku pomocí 1P3.
[002301 Alternativně mohou být T2R proteiny nebo polypeptidy z testu odvozeny z eukaryotické hostitelské buňky a mohou obsahovat aminokyselinovou sekvenci mající aminokyselinovou sekvenční identitu se zde popsanými T2R polypeptidy nebo jejich fragmenty nebo jejich konzervativně modifikovanými variantami. Obecně je aminokyselinová sekvenční identita alespoň 35 až 50%, nebo případně 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% nebo 99%. Případně mohou T2R proteiny nebo polypeptidy z testů obsahovat oblast T2R proteinu, např. tnimobuněčnou doménu, transmembránovou oblast, transmembránovou doménu, cytoplazmatickou doménu, doménu vázající ligand apod. Dále, jak je zde popsáno, může být T2R polypeptid nebo jeho doména kovalentně vázána na heterologní protein pro tvorbu chimérického proteinu používaného ve zde popsaných testech.
[002311 Modulátory aktivity T2R se testují za použití T2R proteinů nebo polypeptidŮ, jak bylo popsáno výše, buď rekombinantních nebo přirozeně se vyskytujících. T2R proteiny nebo polypeptidy mohou být izolovány, exprimovány v buňce, exprimovány v membráně odvozené z buňky, exprimovány ve tkáni nebo ve zvířeti, buď rekombinantní nebo přirozeně se vyskytující. Mohou se použít např. plátky jazyka, disociované buňky zjazyka, transformované buňky nebo membrány. Modulace se může testovat za použití zde popsaných in vitro nebo in vivo testů.
In vitro vazebné testy
[00232] Transdukce chuti může být také zkoumána in vitro reakcemi v rozpustném nebo pevném stavu, za použití T2R polypeptidŮ podle vynálezu. V jednom konkrétním provedení mohou být domény T2R vázající ligand použity in vitro v reakcích v rozpustném nebo pevném stavu za účelem testování vázání ligandu.
[00233| Je možné, aby byla doména vázající ligand tvořena N-koncovou doménou spolu s dalšími částmi mimobuněčné domény, např. mimobunččnými smyčkami transmembránové domény.
[002341 In vitro vazebné testy se použily s dalšími GPCR, např. s metabotropickými glutamátovými receptory (viz např. Han and Hampson, J, Biol. Chem. 274:10008-10013 (1999)). Tyto testy by mohly zahrnovat odstranění radioaktivně nebo fluorescenčně označeného ligandu, měření změn vlastní fluorescence nebo změn proteolytické susceptibility atd. [00235J Vázání ligandu na T2R polypeptid podle vynálezu se může testovat v roztoku, ve dvouvrstvé membráně, případně připojené k pevné fázi, v lipidické monovrstvé nebo ve vezikulách. Vázání modulátoru se může testovat pomocí např. změn spektroskopických vlastností (např. fluorescence, absorbance, index lomu), hydrodynamických vlastností (např. tvar), chromatografických vlastností nebo změn rozpustnosti.
[00236| Ve výhodném provedení podle vynálezu se použije vazební test [35S]GTPyS. Jak bylo popsáno výše, po aktivaci GPCR je podjednotka Ga komplexu G proteinu stimulována ktomu, aby vyměnila navázaný GDP za GTP. Stimulace výměnné aktivity G proteinu zprostředkovaná ligandem se může měřit biochemickým testem, kde se měří vázání přidaného radioaktivně značeného [35S,GTPyS ke G proteinu v přítomnosti domnělého ligandu. Typicky se membrány obsahující chemosenzorický receptor, který nás zajímá, smíchají s G proteinem. K testu se přidají potenciální inhibitory a/nebo aktivátory [3ÍS)GTPyS a měří se vázání ’GTPýS na G protein. Vázání lze měřit kapalinovým scintilačním počítáním nebo jakýmikoli jinými prostředky známými v oboru, včetně scintilačnich proximitních testů (SPA). V jiných testech lze použít fluorescenčně označený ^'GTRyS.
Fluorescenční polarizační testy
[002371 V dalším provedení lze použít testy na bázi fluorescenční polarizace („FP“) pro detekci a monitorování vázání ligandu. Fluorescenční polarizace je všestranná laboratorní technika pro měřeni rovnovážného vázání, hybridizace nukleových kyselin a enzymatické aktivity. Fluorescenční polarizační testy jsou homogenní v tom. že nevyžadují krok separace, jako je např. centrifugace, filtrace, chromatografie, srážení nebo elektroforéza. Tyto testy se provádějí v opravdovém čase, přímo v roztoku a nevyžaduji mobilizovanou fázi. Hodnoty polarizace lze měřit opakovaně a po přidání reakčních činidel, protože měření polarizace je rychlé a neničí vzorek. Obecně může být tato technika použita pro měření hodnot polarizace fluoroforů od nízkých pikomolámích hodnot až na mikromolámí hodnoty. Tato část popisuje, jak lze fluorescenční polarizaci využít jednoduchým a kvantitativním způsobem pro měření vázání ligandů na T2R polypeptidy podle vynálezu.
[00238] Když se fluorescenčně označená molekula excituje lineárně polarizovaným zářením, emituje záření, které má stupeň polarizace, který je nepřímo úměrný kjejí molekulami rotaci. Velké fluorescenčně označené molekuly během excitovaného stavu zůstávají poměrně stacionární (4 nanosekundy v případě fluoresceinu) a polarizace záření zůstává mezi excitací a emisí poměrně konstantní. Malé fluorescenčně označené molekuly se během excitovaného stavu rychle otáčejí a polarizace se významně mění mezi excitací a emisí. Proto mají malé molekuly nízké hodnoty polarizace a velké molekuly mají vysoké hodnoty polarizace. Například jednořetězcový fluoresceinem značený oligonukleotid má poměrně nízkou hodnotu polarizace, ale když se hybridizuje ke komplementárnímu řetězci, má vyšší hodnotu polarizace. Když se použije FP pro detekci a monitorování vázání sloučeniny vyvolávající chuť, která může aktivovat nebo inhibovat chemosenzorické receptory podle vynálezu, mohou se použít fluorescenčně značené sloučeniny vyvolávající chuť nebo autofluorescenční sloučeniny vyvolávající chuť.
[00239| Fluorescenční polarizace (P) je definována jako:
P=
[00240] kde íntpar je intenzita emisního záření rovnoběžného s rovinou excitačního záření a Intw je intenzita emisního záření kolmého k rovině excitačního záření. Polarizace P je poměr intenzit záření, a proto je bezrozměrná. Například Beacon™ a Beacon 2000™. Systém lze použít ve spojení s těmito testy, takové systémy typicky vyjadřují polarizaci vmilipolarizačních jednotkách (1 polarizační jednotka = 1000 mPjednotek).
[00241J Vztah mezi molekulovou rotací a velikostí je popsán Perrinovou rovnicí a čtenář je odkázán na Jolley, Μ. E. (1991) v Journal of Analytical Toxicology, strany 236-240, který je zde začleněn odkazem a který podává důkladné vysvětlení této rovnice. Ve stručnosti, Pemnova rovníce udává, že polarizace je přímo úměrná času rotačního odpočinku, času, který molekule zabere rotace o úhel přibližně 68,5 °C. Čas rotačního odpočinku se vztahuje k viskozitě (éta), absolutní teplotě (T), molekulovému objemu (V) a plynové konstantě (R) dle následující rovnice: 2(čas rotačního odpočinku) = J V RT
[002421 Čas rotačního odpočinku je malý (~ nanosekunda) pro malé molekuly (např. fluorescein) a velký (- 100 nanosekund) pro velké molekuly (např. imunoglobuliny).
Udržuje-Ιι se viskozita a teplota konstantní, pak čas rotačního odpočinku, a tím i polarizace, přímo souvisí s objemem molekuly. Změny molekulového objemu mohou být způsobeny interakcemi s dalšími molekulami, disociaci, polymerací, degradací, hybridizací nebo konformačními změnami fluorescenčně značené molekuly. Například fluorescenční polarizace byla používána pro měření enzymatického štěpení velkých fluoresceinem značených polymerů proteázami, DNázami a RNázami. Byla také používána pro měření rovnovážného vázání pro interakce protein/protein, vázání protilátka/antigen a vázání protein/DNA.
Vysokopropustné testy v pevném stavu a rozpustné
100243] V ještě dalším provedení vynález poskytuje rozpustné testy za použití T2R polypeptidu, nebo buňky nebo tkáně cxpnmující T2R polypeptid. V dalším provedení vynález poskytuje in vitro testy na bázi pevné fáze ve vysokopropustném formátu, kde T2R polypeptid, nebo buňka nebo tkáň exprimující T2R polypeptid, je připojen k substrátu nebo sloučenině stimulující chuť, která jsou v pevné fázi, a je uveden do styku s T2R receptorem a vázání se detekuje pomocí vhodné značky nebo protilátky vypěstované proti T2R receptorů.
100244] Ve vysokopropustných testech podle vynálezu lze provést screening až několika tisíců různých modulátorů nebo ligandů za jediný den. Konkrétně může být každá jamka mikrotitrační destičky použita pro provádění jiného testu na vybraný potenciální modulátor nebo, pokud se mají pozorovat účinky na koncentraci nebo inkubační dobu, může se v každých 5-10 jamkách testovat jeden modulátor. Na jediné standardní mikrotitrační destičce se tedy může snadno testovat přibližně 100 (např. 96) modulátorů. Použije-li se 1536 jamek, pak se na jediné destičce může snadno testovat od přibližně 1000 do přibližně 1500 různých sloučenin. Také lze testovat více sloučenin v každé jamce destičky. Lze testovat několik různých destiček denně; při použití integrovaných systémů podle vynálezu je možné testování az přibližně 6.000-20.000 tůzných sloučenin. Nedávno byly vyvinuty mikrofluidní metody manipulace s reakčním činidlem.
100245] Molekula, která nás zajímá, může být navázána na složku v pevné fázi, přímo nebo nepřímo, prostřednictvím kovalentní nebo nekovalentní vazby, např. pomocí značky (tag). Značkou může být jakákoli z mnoha různých komponent. Obecně je molekula, která váže značku (tag binder), fixována na pevném nosiči a označkovaná molekula, která nás zajímá (např. molekula pro transdukci chuti), je připojena k pevnému nosiči interakcí značky (tag) a molekuly, která váže značku (tag binder).
Í0O246] Lze použít mnoho značek a molekul, které vážou značku, na základě známých molekulárních interakcí, které jsou dobře popsány v literatuře. Například když má značka f Π přirozený spojovací prvek, například biotin, protein A nebo protein G, může být použita ve spojení s vhodnými molekulami, které vážou značku (avidin, streptavidin, neutravidin Fe oblast imunoglobulinu atd.). Protilátky k mdekulám s přirozenými spojovat™ prvky jako je biotm jsou rovněž Strace dostupné a vhodné jako tag bindets (viz SIGMA Immunochemicals 1998 catalogue SIGMA, St, Louis Mo.).
[002471 Podobně může být jakákoli haptenová nebo antigenní sloučenina použita v kombinaci s vhodnou protilátkou pro tvorbu páru tag/tag binder. Tisíce specifických protilátek jsou komerčně dostupné a v literatuře je popsáno mnoho dalších protilátek Například vjedné běžné konfiguraci je značka první protilátkou a tag binder je druhou protilátkou, která rozpoznává první protilátku. Kromě interakcí protilátka-antigen jsou jako páry tag a tag binder vhodné i interakce receptor-ligand. Například agonisté a antagonists receptorů buněčné membrány (např. buněčné interakce receptor-ligand, např. transferrin, c-kit, virové receptorové ligandy, cytokinové receptory, chemokinové receptory, interleuknové receptory, imunoglobulinové receptory a protilátky, rod kadherinů, rod integrinů, rod selektinů apod.; viz např. Pigott & Power, The Adhesion Molecule Facts Book I (1993)). Podobně mohou s nižnými buněčnými receptory interagovat toxiny a venomy, virové epitopy hormony (např. opiáty, steroidy atd.), vnitrobuněčné receptory (např. ty, které zprostředkovávají účinky různých malých ligandů, včetně steroidů, hormonů štítné žlázy, retinoidů a vitamínu D; peptidů), léčiva, lektiny, cukry, nukleové kyseliny (jak lineární, tak cyklické polymerní konfigurace), oligosacharidy, proteiny, fosfolipidy a protilátky.
[002481 Vhodnou značku (tag) nebo tag binder mohou tvořit i syntetické polymery, např. polyuretany, polyestery, polykarbonáty, polymočoviny, polyamidy, polyethyleniminy, polyarylensulfidy, polysiloxany, polyamidy a polyacetáty. Mnoho párů tag/tag binder je rovněž užitečných ve zde popsaných testovacích systémech, jak bude pro odborníka po přečtení popisu zjevné.
100249] Jako značky mohou sloužit i běžné linkery, např. peptidy, polyétery apod., které zahrnují polypeptidové sekvence, např. poly-gly-sekvence o přibližně 5 až 200 aminokyselinách. Takové flexibilní linkery jsou odborníkům v oboru známy. Například póly(ethylenglykolové) linkery jsou dostupné u firmy Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Ala Tyto linkery mají případně amidové vazby, sulfhydrylové vazby nebo heterofunkční vazby. [002501 Tag bindery jsou fixovány na pevné substráty pomocí jakéhokoli z mnoha různých v současnosti dostupných způsobů. Pevné substráty jsou běžně derivatizovány nebo na ně je zaváděna funkční skupina vystavením celého nebo části substrátu chemickému činidlu, které k povrchu fixuje chemickou skupinu, která reaguje s částí tag binderu. Například skupiny, které jsou vhodné pro napojení na dlouhou řetězcovou část, zahrnují aminy, hydroxylové, thiolové a karboxylové skupiny. Pro zavádění funkčních skupin na mnoho různých povrchů,’ např. na skleněné povrchy, lze použít aminoalkylsilany a hydroxyalkylsilany. Konstrukce takových testů biopolymerů v pevné fázi je v literatuře dobře popsána. Viz např. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963) (popisující syntézu např. peptidů v pevné fázi); Geysen a kol., J. Inunun. Meth., 102:259-274 (1987) (pop.sující syntézu komponent v pevné fázi na čepech); Frank & Doring, Tetrahedron, 44:60316040 (1988) (popisující syntézu různých peptidových sekvencí na celulózových kruhových destičkách); Fodor a kol., Science, 251:767-777 (1991); Sheldon a kol., Clinical Chemistry, 39(4):718-719 (1993); a Kozai a kol., Nature Medicine, 2(7):753759 (1996) (všechny popisují testy biopolymerů fixovaných na pevných substrátech). Nechemické metody fixování tag binderů k substrátům zahrnují další běžné metody, např. teplo, síťování UV zářením apod.
Buněčné testy
[00251] V jednom výhodném provedení je T2R protein exprimován v eukaryotické buňce buď v nemodifikovaných formách nebo jako chimérické, variantní nebo zkrácené receptory s nebo s výhodou bez heterologní chaperonové sekvence, která usnadňuje jeho maturaci a cílení sekreční cestou. Takové T2R polypeptidy mohou být exprimovány v jakékoli eukaryotické buňce, např. v HEK-293 buňkách. S výhodou buňky obsahují funkční G protein, např. Gul5, nebo chimérický Gal6, gustducin nebo transducin nebo chimérický G protein, např. G16gust44, který je schopen vázat chimérický receptor na vnitrobuněčnou signalizační cestu nebo na signalizační protein jako je fosfolipáza C. Aktivace receptoru T2R v takových buňkách se může detekovat pomocí jakéhokoli standardního způsobu, např. detekcí změn vnitrobuněčného vápníku prostřednictvím detekce FURA-2-dependentní fluorescence v buňce. Takový test je základem experimentálních zjištění prezentovaných v této přihlášce. [00252] Aktivované GPCR receptory jsou často substráty pro kinázy, které fosforylují C-koncový konec receptotu (a eventuálně i další místa). Aktivátory tedy podpoří přenos 32P z radioznačeného ATP na receptor, který může být testován scíntilačním počítačem. Fosforylace C-koncového konce podpoří vázání proteinů podobných arrestinu a bude rušit vazam G proteinů. Pro obecný přehled transdukce signálu GPCR a způsobů testování transdukce signálu viz např. Methods in Enzymology, svazky 237 a 238 (1994) a svazek 96 (1983); Bourne a kol., Nature, 10:349:117-27 (1991); Bourne a koi., Nature, 348:125-32 (1990); Pitcher a koi., Annu. Rev. Biochem., 67:653-92 (1998)
[00253] Modulace T2R může být testována porovnáním odezvy T2R polypeptidů ošetřených domnělým modulátorem T2R s odezvou neošetřeného kontrolního vzorku nebo vzorku obsahujícího známý „pozitivní“ kontrolní vzorek. Takové domnělé modulátory T2R mohou zahrnovat molekuly, které buď inhibují nebo aktivují aktivitu polypeptidu T2R. V jednom provedení je kontrolním vzorkům ošetřeným sloučeninou, která aktivuje T2R, přiřazena relativní aktivita T2R o velikosti 100. Inhibice polypeptidu T2R se dosáhne, je-li hodnota aktivity T2R vzhledem ke kontrolnímu vzorku přibližně 90 %, případně 50 %, případně 25-0 %. Aktivace polypeptidu T2R se dosáhne, je-li hodnota aktivity T2R vzhledem ke kontrolnímu vzorku přibližně 110 %, případně 150 %, 200-500 % nebo 1000-2000 %.
100254] Změny iontového toku mohou být hodnoceny stanovením změn iontové polarizace (např. elektrického potenciálu) buňky nebo membrány exprimující polypeptid T2R. Jedním prostředkem stanovení změn buněčné polarizace je měření změn proudu (čímž se měří změny polarizace) pomoci technik napěťového zámku nebo terčíkového zámku (viz např. technika „přilnuti k buňce“ („cell-attached“), technika „inside-out“ a technika snímání celé buňky („whole cell“), např. Ackerman a kol., New Engi. J Med., 336:1575-1595 (1997)). Proudy celých buněk jsou obyčejně stanoveny za použití standardu. Další známé testy zahrnují: testy radioznačeneho iontového toku a fluorescenční testy za použití barviv citlivých na napětí (viz např. Vestergand-Bogind a kol., J. Membrane Biol., 88:67-75 (1988); Gonzales & Tsien, Chem. Biol., 4:269-277 (1997); Daniel a kol., J. Pharmacol. Meth., 25:185-193 (1991); Holevinsky a kol., J. Membrane Biology, 137:59-70 (1994)).
100255] Účinky testovaných sloučenin na funkci polypeptidŮ se mohou měřit zkoumáním kteréhokoli zvýše uvedených parametrů. Jakákoli vhodná fyziologická změna, která ovlivňuje aktivitu GPCT, může být použita pro stanovení vlivu testované sloučeniny na polypeptidy podle vynálezu. Když se určí funkční následky za použití intaktních buněk nebo zvířat, lze rovněž změřit mnoho různých účinků, např. uvolňování přenašeče, uvolňování hormonů, transkripční změny jak známých, tak neidentifikovaných genetických markérů (např. hybridizace „northern blot“), změny buněčného metabolismu, např. růst buněk nebo změny pH, a změny vnitrobuněčných druhých poslů, např. Ca^, IP3, cGMP nebo cAMP [002561 Výhodné testy GPCR zahrnují buňky, naplněné barvivý citlivými na ionty nebo napětí pro záznam aktivity receptoru. Testy stanovení aktivity takových receptorů mohou rovněž využívat známé agonisty a antagonisty pro další receptory vázané na G-proteiny jako kontrolní vzorky pro stanovení aktivity testovaných sloučenin. V testech identifikace modulačních sloučenin (např. agonistů, antagonist) se monitorují změny hladiny iontů v cytoplazmě nebo membránové napětí pomocí fluorescenčního indikátoru citlivého na ionty, respektive na membránové napětí. Mezi iontové citlivé indikátory a napěťové sondy, které lze použit, patří ty, co jsou popsány v katalogu Molecular Probes 1997 Catalog. Pro receptory vázané na G-proteiny lze ve vybraném testu použít promiskuitní G proteiny, např. Gal5 a Galó (Wilkie a kol., Proc. Nat‘l Acad. Sci., 88:10049-10053 (1991)). Alternativně lze použít jiné G proteiny, např. gustducin, tiansducin a chimérické G proteiny, např. Gal6gust44 nebo Gal6t25.
100257] Aktivace receptoru iniciuje následné vnitrobuněčné děje, např. nárůst druhých poslů. Aktivace některých receptoríi vázaných na G-protein stimuluje tvorbu inositoltrifosfátu (IP3) prostřednictvím hydrolýzy fosfatidylinositolu zprostředkované fosfoltpázou C (Berridge & Irvine, Nature, 312:315-21 (1984)). IP3 pak na oplátku stimuluje uvolňování zásob vmtrobuněčných vápenatých iontů. Změna hladin cytoplazmatických vápenatých iontů nebo změna hladin druhých poslů, např. IP3, tedy může být použita pro stanovení funkce receptoru vázaného na G protein. Buňky exprimující takové receptory vázané na G protein mohou vykazovat zvýšené hladiny cytoplazmatického vápníku v důsledku příspěvku jak uvolněného vápníku z vnitrobuněčných zásob, tak vstupu mimobuněčného vápníku iontovými kanálky plazmatické membrány.
[00258| Ve výhodném provedení se aktivita T2R polypeptidu měří expresí genu T2R vheterologní buňce spromiskuitním G proteinem, který váže receptor na cestu transdukce signálu fosfolipázy C (viz Offermanns & Simon, J. BioL Chem., 270:15175-15180 (1995)) S výhodou je buněčnou linií HEK-293 (která nonnálně neexprimuje geny T2R) a promiskuitním proteinem je Gal5 (Offermanns & Simon, viz výše) nebo chimérický G protein, např. Gal6gust44. Modulace transdukce chuti se testuje měřením změn hladin vmtrobuněčného Ca2+, které se mění v odpověď na modulaci cesty transdukce signálu T2R prostřednictvím podání molekuly, která se spojuje s polypeptidem T2R. Změny hladin Ca2+ se případně měří pomocí fluorescenčních Ca2+ indikátorových barviv a fluorimetrického zobrazování.
[002591 V dalším provedení lze hydrolýzu fosfatidylinositolu (PI) analyzovat podle US patentu č. 5,436,128, který je zde začleněn odkazem. Ve stručnosti, test zahrnuje «značkování buněk 3H-myoinositolem po dobu 48 hodin nebo déle. Na označené buňky se působí testovanou sloučeninou po dobu 1 hodiny. Takto ošetřené buňky se lý^jí a extrahují do chlorofonnu-methanolu-vody a poté se inositolfosfáty oddělí iontoměničovou chromatografií a kvantifikují se scintilačním počítáním. Násobná stimulace se určí výpočtem poměru cpm v přítomnosti agonisty kcpm v přítomnosti pufrového kontrolního vzorku. Podobně se násobná inhibice určí výpočtem poměru v přítomnosti agonisty kcpm v přítomnosti putroveho kontrolního vzorku (který může, ale nemusí obsahovat agonistu).
1002601 Další tosý receptorů mohou vnitrotaě£ných cykl.ckých nukleotidů, např. cAMP nebo cGMP. V případech, kdy má aktivace receptorů za následek snížení hladin cykUckých nukleotidů, může být výhodné před přidáním sloučeniny aktivující receptor k buňkám testu vystavil buňky činidlům, které zvyšuji hladiny vnitrobuuéčnýcb cyklických nukleotidů, např. Terakota. v jednom provedení lze zrniny vnitrobuněčného cAMP „bo cGMP m» pomocí imunologických testů. Pro stanovém hladiny CAMP lze použil způsob popsaný v Offermanns & Simon, J. Bio. Chc.n„ 270-1517515180 (1995). Pro stanoveni hladiny cGMP lze použít způsob popsaný v Felley-Bosco a kol.. Am. I. Resp. Cell and Mol. Biol, 11:159-164 (1994). Navíc je v US patentu č. 4,115,538, kletý je zde začleněn odkazem, popsána testovací souprava pro měření cAMP a/nebo cGMP. 100261) V dalším provedení lze měřil Iransknpéní hladiny za účelem stanoveni účinků testované sloučeniny na Mnsdukci signálu. Hostitelská buňku obsahující polypeptid T2R, který nás zajímá, se uvede do styku se sloučeninou po dostatečně dlouhou dobu, aby se' pravemy jakékoli interakce, a pak se měří hladina exprese genu. Množství času pro provedeni takových interakci lze empiricky stanovit, např. měřením hladiny transkripce v závislosti na čase. Množství transkripce lze měřit za použiti jakéhokoli vhodného způsobu známého odborníkům v obore. Např. expresi mRNA protemu. kletý nás zajímá, ize detekovat za použiti analýzy ..north™ bluf nebo jejich polypeptidové produkt, m„ho„ hýl identifikovány za použiti Imunologických testu. AU™,™ lze použit testy m použiti reportéravého genu, jak je popsáno v US patentu č. 5,436.128. který je zde začten Odkazem. Reportérovými geny mohou být např. chloramfenikolacetyhransfete, lucifete, beto-galaktosidte, beta-lakamáza a alkalická fosfáte. Navíc protein, který nás zajímá, muže být použit jako nepřímý reportér prostřednictvím připojení k druhému reportéru, např. zelenému lluorastemmu proteinu (viz např. Místili * Spector. Nature Bioíechnology 15:961-964(1997)).
IMI262I Množství transkripce se pak porovná s množstvím trarekripce butf v téže buňce v nepřítomnosti testované sloučeniny, „ebo se může porovnat s množstvím transkripce ve v podstatě identické buňce, v níž chybí polypeptidfy) T2R, které nás zajímají. Tato v podstatě idenneká buňka může být odvozena z týchž buněk, z nichž se připravíš rekrenbinantni buňka, ale která nebyla modifikována zavedením hetelogní DNA. Jakýkoli rozdíl v množství .ranskripee značí, že testovaná sloučenina nějakým způsobem teml, aklivlu polypeptidů T2R, který nás zajímá.
Transgenní živočichové, nikoli lidé, kteří exprimuií chemosenzorické reeentorv 1002631 pra receptorové testy lze rovněž využít živočichy, vyjma lidí, exprimující jednu nebo více sekvencí chuťového receptoru podle vynálezu. Taková exprese se může použít ke stanovení, zda se testovaná sloučenina specificky váže na savčí chuťový transmembránový receptorový komplex in vivo, a to tak, že se živočich, ne člověk, stabilně nebo přechodně transfektovaný nukleovými kyselinám, kódujícími chemosenzorické receptory nebo jejich oblasti vázající ligandy uvede do styku s testovanou sloučeninou a určí se, zda živočich reaguje na testovanou sloučeninu specifickým vázáním na receptorový polypeptidový komplex.
1002641 živočichové transfektovaní nebo infikovaní vektory podle vynálezu jsou obzvlášť užiteční pro testy k identifikaci a charakterizaci chuťových podnětů, které se mohou vázat na specifický receptor nebo na sady receptorů. Takoví vektorem infikovaní živočichové expnmující sekvence lidského chuťového receptoru se mohou použít pro in vivo screening chuťových podnětů a jejich účinku na např. buněčnou fyziologii (např. na chuťové neurony), na CNS nebo na chování.
[002651 Prostředky infekce/exprese nukleových kyselin a vektorii jsou v oboru známy buď individuálně nebo jako knihovny. Mnoha různými prostředky lze měřit mnoho různých individuálních parametrů buňky, orgánu nebo celého živočicha. Sekvence T2R podle vynálezu mohou být například exprimovány ve zvířecích chuťových tkáních dodáním infikujícího činidla, např. adenovirového expresního vektoru.
|002M| Endogenní geny chuťového receptoru mohou zOstat takém o uklivíu divokého typu (naUvni) být nadále přítomna. V jiných situacích kde je žádoucí, aby byla „skorá akhvna chuťového receptům diky zavedenému exogenmmu hybridnímu recepturu je výhodné použit knock-outovou linii. Způsoby k„„slnlkce zejména transgenních myší, a výběr a pHprava rekombioanínich konstruktů pro generováni transformovaných buněk jsou v oboru dobře známy.
11102671 Konstrukce „knock-outové“ buňky a zlvoéicha jo založena „a předpokladu, že hladina exprese konkrétního genu v savci buňce může býl snížena nebo zcela zrušena tím že “ do genomu zavede nová sekvence DNA, která slouží k přerušení nijaké Části DNA sekvence genu, který má být potlatar. Pn> přemšem hostitelského genu lze rovněž pcoaj tzv. „vloženi genové pasti („gene trap insertion“) a myší embryonální kmenové (ES) buňky se mohou použil pro produkci knock-ou!„váných mmsgcmrich živočichu (viz např Holzschu Transgenic Ros 6:97-106 (1997». Vloženi exogeml sekvence se typicky provede bomologni rekombinacr mez. komplementárními sekvencemi nukleových kyselin. Exogennr sekvencí je nějaká část cílového genu, který má být modifikován, např. exonové, intronové nebo transkripční regulační sekvence, nebo jakákoli genomová sekvence, která je schopna ovlivnit hladinu exprese cílového genu; nebo jejich kombinace. Genové cílení prostřednictvím homologní rekombinace v pluripotentních embryonálních kmenových buňkách umožňuje přesně modifikovat genomové sekvence, které nás zajímají. Pro tvorbu, vyhledávání, propagaci knock-outového živočicha lze použít jakoukoli techniku, viz např. Bijvoet, Hum.’ Mol. Genet. 7:53-62 (1998); Moreadith, J. Mol. Med. 75:208-216 (1997); Tojo, Cytotechnology 19:161-165 (1995); Mudgett, Methods Mol. Biol. 48; 167-184 (1995); Longo Transgenic Res. 6:321-328 (1997); U.S. patenty č. 5,616,491; 5,464,764; 5,631,153; 5,487,992; 5,627,059; 5,272,071; WO 91/09955; WO 93/09222; WO 96/29411- WO 95/31560; WO 91/12650.
100268] Nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být rovněž použity jako reakční činidla pro produkci „knock-outových lidských buněk a jejich potomstvo. Obdobně mohou být nukleové kyseliny podle vynálezu také použity jako reakční činidla pro produkci „knock-inů“ u myší. Lidské nebo krysí sekvence genu T2R mohou nahradit ortologni T2R v myším genomu. Takto se vytvoří myš exprimující lidský nebo krysí T2R. Tato myš pak může být použita k analýze funkce lidských nebo krysích T2R a k identifikaci ligandu pro takové T2R.
Modulátory
[00269] Sloučeninami testovanými jako modulátoiy ze členů skupiny T2R mohou být jakékoli malé chemické sloučeniny nebo biologické entity, např. protein, cukr, nukleová kyselina nebo lipid. Alternativně mohou být modulátory geneticky změněné verze člena skupiny T2R. Typicky mohou být testovanými sloučeninami malé chemické molekuly a peptidy. V testech podle vynálezu může být použita v zásadě jakákoli chemická sloučenina jako potenciální modulátor nebo ligand, ačkoli nejčastěji používanými sloučeninami jsou ty, které lze rozpustit ve vodném nebo organickém (zejména na bázi DMSO) rozpouštědle. Testy mohou být navrženy ke screeningu mnoha chemických knihoven automatizací kroků testu a poskytnutím sloučenin zjakéhokoli vhodného zdroje do testů, které jsou typicky prováděny paralelně (např. mikrotitrační formáty na mikrotitračních destičkách v robotických testech) Ocení se. že existuje mnoho dodavatelů chemických sloučenin, včetně společností Sigma (St. Louis, Mo.), Aldrich (St. Louis, Mo.), Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo.), Fluka ChemikaBiochemica Analytika (Buchs, Švýcarsko) apod.
[00270] V jednom provedení zahrnují vysokopropustné screeningové metody poskytnutí kombinatorické chemické nebo peptidové knihovny obsahující velké množství potenciálních terapeutických sloučenin (potenciálních modulátorových nebo ligandových sloučenin).
Takové „kombinatorické chemické knihovny“ nebo „ligandové knihovny se pak prohledávají vjednom nebo více zde popsaných testech, aby se identifikovali ti členové knihovny (zejména chemické druhy nebo podtřídy), které vykazují požadovanou charakteristickou aktivitu. Takto identifikované sloučeniny mohou sloužit jako konvenční „vedoucí sloučeniny“ nebo mohou být samy použity jako potenciální nebo aktuální spotřebitelské produkty.
100271] Kombinatorická chemická knihovna je sbírka rozmanitých chemických sloučenin generovaných buď chemickou syntézou nebo biologickou syntézou, spojením mnoha chemických „stavebních bloků“, například reakčních činidel. Například lineární kombinatorická chemická knihovna, jako je polypeptidová knihovna, se vytvoří spojením sady chemických stavebních bloků (aminokyselin) jakýmkoli možným způsobem pro danou délku sloučeniny (tj. počet aminokyselin v polypeptidové sloučenině). Takovým kombinatoriálním mícháním chemických stavebních bloků lze syntetizovat miliony chemických sloučenin,
[00272] Příprava a screening kombinatorických chemických knihoven je odborníkům v oboru dobře známa. Takové kombinatorické chemické knihovny zahrnuji, ale nejsou omezeny na, peptidové knihovny (viz např. U.S. patent č. 5,010,175, Furka, Int. J. Pept. Prot. Res„ 37:487-93 (1991) a Houghton a kol., Nature, 354:84-88 (1991)). Lze použít i jiné chemická procesy pro generování chemických výběrových knihoven. Takové chemické procesy zahrnují, ale nejsou omezeny na: peptoidy (např. WO 91/19735), kódované peptidy (např. WO 93/20242), náhodné bio-olígomery (např. WO 92/00091), benzodiazepiny (např. U.S. patent č. 5,288,514), diverzomery, např. hydantoiny, benzodiazepiny a dipeptidy (Hobbs a kol., PNAS., 90:6909-13 (1993)), vinylogní polypeptidy (Hagihara a kol., J. Amer. Chem. Soc„ 114:6568 (1992)), ncpeptidické peptidomimetiky s glukózovým scaflbldem (Hirschmann a kol., J. Amer. Chem. Soc., 114:9217-18 (1992)), analogické organické syntézy knihoven malých sloučenin (Chen a kol., J. Amer. Chem. Soc., 116:2661 (1994)), oligokarbamáty (Cho a kol., Science, 261:1303 (1993)), peptidické fosfonáty (Campbell a kol., J. Org. Chem., 59:658 (1994)), knihovny nukleových kyselin (Ausubel, Berger a Sambrook, vše viz výše), knihovny peptidů a nukleových kyselin (U.S. patent č. 5,539,083), knihovny protilátek (Vaughn a kol., Nature Biotechnology, 14(3):309-14 (1996) a PCT/US96/10287), sacharidové knihovny (Liang a kol., Science, 274:1520-22 (1996) a U.S. patent č. 5,593,853), knihovny malých organických molekul (benzodiazepiny, Baum, C&EN, Jan 18, str. 33 (1993); thiazolidinony a metathiazanony, U.S. patent č. 5,549,974; pyridiny, <» n Γ η fl n a 4» * Γ * · rs-zs * fl Λ · <• · * · η β λ c <· β
U.S, patent δ. 5,525,735 a 5,519,134; morfolinové sloučeniny, U.S. patent δ. 5,506,337; benzodiazepiny, 5,288,514 apod.).
1002731 Zařízení pro přípravu kombinatorických knihoven jsou komerčně dostupná (viz např. 357 MPS, 390 MPS (Advanced Chem Tech, Louisville Ky.), Symphony (Rainin Woburn, Mass.), 433A (Applied Biosystems, Foster City, Calif.), 9050 Plus (Millipore, Bedford, Mass.)). Navíc je mnoho samotných kombinatorických knihoven komerčně dostupných (viz např. ComGenex, Princeton, NJ.; Tripos, Inc., St. Louis, Mo.; 3D Pharmaceuticals, Exton, Pa.; Martek Biosciences; Columbia, Md.; atd.).
[002741 V jednom aspektu vynálezu mohou být modulátory T2R použity v jakémkoli potravinovém produktu, cukrovinkách, farmaceutické kompozici nebo jejich ingredienci, Čímž se požadovaným způsobem moduluje chuť produktu, kompozice nebo ingredience. Například modulátory T2R, které zesilují pocit hořké chuti, mohou být přidány za účelem poskytnutí horké chuti produktu nebo kompozice, zatímco modulátory T2R, které blokují pocity hořké chuti, se mohou přidat za účelem blokace horké chuti produktu nebo kompozice. Vynález také poskytuje prostředky pro identifikaci hořkých sloučenin, které se nacházejí v potravinách, nápojích, kosmetice a léčivech, a prostředky pro tvorbu chuťově vylepšených potravin, nápojů a léčiv, které tyto hořké sloučeniny nemají nebo je mají ve sníženém množství.
Použití sloučenin identifikovaných podle vynálezu
[00275] Sloučeniny identifikované podle vynálezu se mohou přidat do potravin, nápojů, kosmetiky nebo léčebných kompozic pro modulaci, s výhodou blokování hořké chuti spouštěné aktivací alespoň jednoho zhT2R8 a/nebo hT2R14 hořkými sloučeninami přítomnými v kávě a příbuzných potravinách, nápojích a léčivech nebo strukturně příbuznými sloučeninami nebo dalšími hořkými sloučeninami, např. sloučeninami nacházejícími se v potravinách a nápojích nebo léčivech nebo kosmetice, které vyvolávají vjem hořké chuti. [00276] Konkrétné sloučenina C, a její analogy, může být na základě svých široce působících antagonistických vlastností použita jako aditivum do potravin, nápojů, léčiv nebo materiálu pro požití lidmi nebo zvířaty, přičemž je vhodně zeslabena hořká chuť. Vzhledem k vlastnostem sloučeniny C mohou tyto materiály obsahovat hořké ligandy, o nichž je známo, že interagují se specifickými receptory hořkosti jako jsou hT2R3, 7, 10, 14, 16, 44, 51 55 61 63, 64, 65 nebo 71 a/nebo s hT2R5, 9, 13, 54, 67 a 75, nebo jejich kombinací, nebo obsahují horké sloučeniny, pro něž není určena selektivita jejich receptoru hořkosti. Obzvlášť výhodnými aplikacemi jsou kompozice obsahující sloučeniny, které aktivují násobné receptory hořkosti.
[00277] Navíc mohou být předmětné sloučeniny včetně sloučeniny C použity v kompetitivních vazebných a funkčních testech, jakož i v chuťových testech za účelem identifikace hořkých sloučenin, jimž sloučenina C blokuje nebo inhibuje horkou chuť.
[002781 Jak bylo uvedeno dříve, vlastnosti modulující chuť, s výhodou vlastnosti blokující hořkou chuť sloučenin identifikovaných v předmětných buněčných testech T2R se potvrdí v lidských nebo zvířecích chuťových testech, s výhodou v lidských chuťových testech.
Soupravy
[00279| Geny T2R a jejich homology jsou užitečnými nástroji pro identifikaci buněk chuťových receptorů, pro soudní analýzu a určování otcovství a pro zkoumání transdukce chuti. Reakční činidla specifická pro členy skupiny T2R, která specificky hybridizují na nukleove kyseliny T2R, např. T2R sondy a primery, a reakční činidla specifická pro T2R, která se specificky vážou na protein T2R, např, protilátky T2R, se používají pro zkoumání buněčné exprese chuti a řízení transdukce chuti.
[00280] Testy nukleových kyselin na přítomnost DNA a RNA u člena skupiny T2R ve vzorku zahrnují mnoho technik, které jsou odborníkovi v oboru známy, např. analýza southern blot, northern blot, analýza dot blot, RNázová ochrana, analýza Sl, amplifikační techniky jako je PCR, a in situ hybridizace. Například při in situ hýbridizaci je cílová nukleová kyselina uvolněna ze svého buněčného okolí tak, aby byla dostupná pro hýbridizaci v buňce, zatímco se uchová buněčná morfologie pro následnou interpretaci a analýzu. Následující Články poskytují přehled oboru in sítu hybridizace: Singer a kol., Biotechniques, 4:230250 (1986); Haase a kol., Methods in Virology, sv. VII, 189-226 (1984); a Names a koi eds.. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (1987). Navíc může být protein T2R detekován různými imunologickými testy popsanými výše. Testovací vzorek se obvykle porovná jak s pozitivním kontrolním vzorkem (např. vzorkem exprimující rekombinantní T2R protein), tak s negativním vzorkem.
[00281] Vynález rovněž poskytuje soupravy pro screening modulátorů Členů skupiny T2R. Takové soupravy lze připravit ze snadno dostupných materiálů a reakčních činidel. Takové soupravy mohou například obsahovat kterýkoli nebo více z následujících materiálů: T2R nukleové kyseliny nebo proteiny, reakční zkumavky a návod pro testování aktivity T2R. Souprava případně obsahuje funkční T2R polypeptid. Lze připravit velké množství různých souprav a komponent podle vynálezu, v závislosti na zamýšleném uživateli soupravy a konkrétních potřebách uživatele.
[002821 Když byl nyní obecně popsán vynález, bude snáze pochopen s odkazem na následující příklady, které slouží pro ilustraci a nejsou určeny pro omezení rozsahu vynálezu.
Rozumí se, ze lze vytvořit různé modifikace a změny zde popsaných ukázkových provedeni, aniž bychom se odchýlili od ducha a rozsahu vynálezu.
PŘÍKLADY
Příklad 1
I1T2R8 a hT2R14 jsou aktivovány hořkou kávovou frakcí
100283] K provedení screeningu 25 lidských T2R v přechodně transfektovaných HEK buňkách se použila částečně přečištěná hořká kávová frakce, jak bylo popsáno v předchozích patentových přihláškách. Stručně (jak již bylo podrobněji probráno ve zveřejněném US patentu č. 2003/0170608, který je zde zahrnut tímto odkazem), lidské embryonální buňky ledvin, které stabilní exprimují velký antigen T-buněk a G15 protein (HEK-G15), se přechodně transfektovaly s hT2R expresním plazmidem (např. použitím Ca2* fosfátu nebo použitím systémů na bázi lipidu). Dále, jiné HEK-G15 buněčné linie se přechodně transferovaly jinými lidskými T2R. Pro detekci změn koncentrace vápníku v přechodně transfektovaných buňkách se poté provedl fluorescenční test. Interakce testované sloučemny(nin) s transfektovanými buňkami vyvolávají signalizační kaskádu, která vede k aktivaci PLC a následnému zvýšení vnitrobuněčné koncentrace vápníku, což vede ke zvýšení fluorescence, která se detekuje použitím fluorescenčního barviva citlivého na vápník. Tyto změny se monituruji např. použitím fluorescenčního mikroskopického a vhodně navrženého softwaru (jako je Imaging Workstation, Axon).
Ϊ00284Ι Kávová frakce vykazuje vysokou míru fluorescence, což interferuje s testem. Aby se zabránilo interferenci, u řady modrých barviv se testovala schopnost blokovat fluorescenci Z kávové frakce. Jak je ukázáno na Obr. 1, kávová frakce aktivovala hT2R8 a hT2R14 v zobrazovacím testu vápníku použitím přechodně transfektovaných buněk. Modré barvivo použité v pokusu z Obr. 1 je FD&C 1 při 1,9 mM. Také se jeví, že několik jiných hT2R se aktivuje touto kávovou frakcí. Různé kombinace hT2R se aktivují (Tabulka 1) s různými morými barvivý. Nicméně, hT2R8 a hT2R14 jsou konzistentně vybrány jako citlivé na kávovou frakci a aktivity těchto dvou receptoru jsou závislé na dávce kávové frakce (Obr. 2). Modrým barvivém, které se použije v pokusu z Obr. 2, je tryptanová modř.
Tabulka I hT2R aktivované kávovou frakci s rit^ými modrými barvivý
Modré barvivo identifikované hT2R receptury
aktivace týdenní aktivace
FD&C 1 8. 14
Trypan 1,8,14 10, 75
Coomassie 14 —
[002851 Použitím tohoto testu bylo zjištěno, že přídavek hořké kávové frakce k buňkám, které expnmují hT2R8 a hT2R14, aktivuje vnitrobuněčné G proteiny. Naproti tomu při použití stejného testu hořká kávová frakce specificky neaktivovala HEK-G15 buňky, které byly přechodně transferovány jinými hT2R. Tento pokus podporuje závěr, že chuťové receptory hT2R8 a hT2R14 jsou specificky citlivé na hořkou sloučeninu(ny) přítomnou v kávě.
Příklad 2
Identifikace antagonism hT2R8 a hT2R14
[00286| K identifikaci antagonist se vygenerovaly buněčné linie, které stabilně exprimovaly hT2R8 a hT2R14, podle pořadí, spolu s promiskuitním chimémím G16g44 proteinem, jak je popsáno v předešlých přihláškách vynálezu. Vysokopropustný test (HT) byl ustanoven použitím stabilních buněčných linii a FLIPR (čtečky destiček zobrazující fluorescenci). K aktivaci receptorů až do výše 70-80 % jejich příslušné maximální aktivity se použil agonista hT2R8 nebo hT2R14. Pro hT2R8 je použitým agonistou andrografolid (200 pM); pro HT2R14 je to kyselina aristolochová (3 μΜ). K identifikaci antagonist se přidaly sloučeniny s různorodými chemickými strukturami společně s agonistou. Sloučeniny, které zapříčinily statisticky významné snížení aktivity receptorů, se spojily a znovu se ověřily inhibičními křivkami v závislosti na dávce. Sloučenina A a sloučenina B se identifikovaly jako hT2R8 antagonists (Obr. 3). Sloučenina C je identifikována jako hT2R14 antagonista (Obr. 4),
Přiklad 2a
Kombinace hT2R8 a hT2R14 antagonist snižujících hořkou chuť kávy
1002871 Provedly se chuťové testy s kombinacemi hT2R8 a hT2R14 antagonist v kávové frakci a ve dvou typech instantní kávy (středně pražené a středně-tmavé pražené) za použití metody 2-altematívní rychlé volby s 4 - 5 odborníky na chutě. Vzorky kávy s antagonisty se daly odborníkům na chutě spolu se vzorky bez antagonist, odborníci byli požádáni, aby identifikovali hořčejší vzorek v páru. Jak je ukázáno v Tabulce 2, odborníci konzistentně identifikovali vzorky kávových frakcí bez antagonist jako více hořké, než ty s antagonisty, coz naznačuje, že antagonisté snižuji hořkou chuť kávové frakce. Stejně tak, jak je ukázáno v Tabulce 3, antagonisté snižují hořkou chuť u obou typů instantní kávy.
[00288] Jak ukázaly chuťové testy tohoto příkladu, vnímání hořkosti v kompozicích (např. potravinách, nápojích a/nebo lécích), jež vykazují hořkou chuť, může být snížena nebo eliminována včleněním antagonist hT2R8 a/nebo hT2R14 do takovýchto kompozic.
|00289| Ke stanovení podílu jednotlivého antagonisty se provedly chuťové testy se středně praženou kávou se sloučeninou C. Jak je ukázáno v Tabulce 4, hT2R14 antagonists (sloučenina C) dostatečně sám o sobě snižuje hořkou chuť kávy z tohoto Příkladu.
Tabuika 2 Výsledky chuťových testů s kávovou frakci a 2 různé kombinace antagonist
Test Antagonists Koncentrace (μΜ) vybrán jako hořčejší P hodnota
HT2R8 hT2R14 bez antagonisty s antagonistou
1 slouč. A slouč. C 30 32 0 <0,001
2 slouč. B slouč. C 30 15 1 0,001
3 slouč. A slouč. C 10 16 --- 0 <0,001
Tabulka 3 Výsledky chutovách testů se dvěma typy instantní kávy
Instantní káva Antagonists Koncentrace (μΜ) vybrán jako hořčejší P hodnota
hT2R8 hT2R14 bez antagonists s antagonistou
střední slou£. A slouč. C 30 16 0 <0,001
střednčtmavá slouč. A slouč. C 30 13 3 0,021
Tabulka 4 Výsledky chuťovách testů se středně praženou kávou a jednotlivým antagonistou
Chnfnvý tM»5, * * - ’ , ÁnfagtiBijtiii, ; ' a Koncentrace 4* · /¼ ./ S * , . vybrán jako bo«ejí^> F hodnot*
s... be^' antagotiHry * - * a afttflgíiiiBtoii
1 sloučenina C 50 18 2 <0,001
2 sloučenina C 25 19 1 <0,001
Přiklad 3
Sloučenina C je všestranně aktivujícím antagonistou receptorů hořkosti
[00290] Příklad 2 výše ukazuje, že sloučenina C je lidským T2R antagonistou identifikovaný pomocí vysokopropustných screeningových testů za použití hT2R14. Další pokusy odhalují, že sloučenina C je všestranné laděným antagonistou pro 13 lidských T2R a v menším rozsahu antagonize šest jiných lidských T2R. Navíc, v chuťových testech tato sloučenina blokuje intenzitu hořké chuti vyvolanou řadou různorodých hořkých látek.
[00291| Specificky, aby se vyhodnotila inhibiční selektivita sloučeniny C, testovala se tato sloučenina proti 22 lidským T2R, které pomocí Senomyxu přestaly být tzv. “orphan” proteiny. Tyto receptory a hořké ligandy, které aktivují tyto lidské T2R, jsou uvedeny v dřívějších přihláškách vynálezu, které jsou zde zahrnuty tímto odkazem. Těmito 22 lidskými T2R jsou hT2Rl, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 16, 44, 51, 54, 55, 61, 63, 64, 65, 67, 71 a 75. Sekvence aminokyselin a nukleových kyselin všech těchto T2R mohou být nalezeny v těchto dřívějších přihláškách vynálezu. Tyto lidské T2R se každý jednotlivě přechodně transfektovaly do HEK293 buněk, které stabilně exprimovaly promiskuitní G protein G16g44 a provedly se funkční testy za použití těchto receptorů, jak se uvádí v těch stejných přihláškách vynálezu. V těchto pokusech se každý receptor aktivuje jedním z jeho ligandů vybraných z hořkých molekul, u kterých se dříve ukázalo, že aktivují určitý T2R. Tyto ligandy se použily v EC80 stupních koncentrace. Seznam použitých hořkých ligandů a koncentrace testovaných ligandů jsou obsaženy v Tabulce 5 tohoto příkladu.
|00292] Dále, aby se potvrdila in vitro aktivita této sloučeniny v testu receptorů, vynálezci provedli párové srovnání chuťového testu, aby se stanovil účinnek sloučeniny in vivo. Odborníci na chuť byli požádáni, aby ochutnali hořké látky s a bez sloučeniny C a aby identifikovali, který ze vzorků chutná hořčeji. Testovala se řada párů každým odborníkem, aby se zvýšil počet vzorků a tyto výsledky se analyzovaly za použití příslušných statistických metod. Pořadí vzorků s nebo bez sloučeniny C se randomizovalo a vzájemně vyvážilo.
(00293| Aby se stanovily široké antagonistické vlastnosti této sloučeniny, testovala se její schopnost blokovat hořkou chuť vyvolanou rozmanitými hořkými ligandy, jakož i hořkou chuť vyvolanou hořkými ligandy, u kterých je známo, že aktivují rozmanité receptory hořké chuti, a hořkými ligandy, u kterých ještě nebylo dokázáno, že aktivují specifický hT2R. Několik hořkých molekul, o nichž je známo, že aktivují recetory hořkosti, se testovalo, která aktivace je inhibována sloučeninou C. Konkrétně, salicin je hořkou molekulou, která aktivuje hT2R16, a výsledky chuťových testů ukázaly, že sloučenina C při 40 μΜ může snižovat její hořkou chuť. Fenylthiomočovina je hořkou molekulou, jež aktivuje hT2R51, a sloučenina C snižuje její hořkou chuť při 25 μΜ.
[00294] Několik hořkých molekul, které mohou aktivovat rozmanité T2R, se testovaly se sloučeninou C. Aktivace receptorů hořkosti pro některé z těchto molekul byly částečně inhibovány sloučeninou C. Omeprazol je hořkou molekulou, která aktivuje hT2R10, 14 a 75 Třebaže jeho hořká chuť může zapojit násobné receptory hořkosti, jeho hořká chuť je také znatelně snížena sloučeninou C. Rebaudiosid A je přírodním sladidlem se silnou hořkou chutí, jež aktivuje alespoň 7 lidských T2R. Jeho hořká chuť je také snížena sloučenina C.
[O0295| Dále sloučenina C inhibuje hořkou chuť pro některé sloučeniny, kde receptorfy), se kterým interagují, je neznámý, například dextromethorfan a difenhydramin. Testoval se účinek sloučeniny C na tyto sloučeniny a zjistilo se, že se také snížila hořká chuť.
[00296] Ve vztahu k výše uvedenému, Obr. 5 obsahuje výsledky pokusů, kde se sloučenina C testovala s různými sloučeninami agonistů. InhibiČní aktivita je prezentována redukcí aktivity receptorů v přítomnosti sloučeniny C. Obr. 5 ukazuje, že 13 různých hT2R bylo významně (více než 30 %) inhibováno sloučeninou C. Těchto 13 hT2R je hT2R3, 7, 10, 14, 16, 44, 51, 55, 61, 63, 64, 65 a 71. Šest jiných receptorů, včetně hT2R5, 9, 13, 54, 67 a 75, se také inhibovalo, třebaže v menším rozsahu.
Tabulka 5 Seznam ligandů a koncentraci použitých pro každý testovaný T2R.
hT2R agonista koncentrace
1 kyselina pikrová 0,05 mM
_ 3 chlorchinin pH 6,5 50 μΜ
4 chlorchinin pH 6,5 5 mM
5 pikolin 10 mM
________7 chlorchinin pH6,5 10 mM
8 andrografolid 0,5 mM
_____ 9 ofloxacin ImM
10 strychnin 50 μΜ
13 oxyfenonium l mM
14 kyselina aristolocholová 2μΜ
16 salicin 1 mM
44 denatonipM 0,5 μΜ
51 __________EÍ5E__________ 2,5 μΜ
_____ 54 ranitidin 5 mM
55 cinchonin 150 μΜ
61 kyselina aristolocholová 25 nM
63 kofein 1 mM
63 andrografolid 100 μΜ
64 kyselina aristolochiolová 1 μΜ
_____65 oleuropein 1 mM
67 andrografolid 5 μΜ
71 kyselina pikrová 10 μΜ
. 75 __________strychnin________ 1 μΜ
Příklad 4 hT2R8 antagonists: Příprava sloučenin podle vynálezu
Příklady sloučenin podle vynálezu jsou syntetizovány následovně.
Příklad 4-1: N-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)- lH-pyrazol-4-yl)pikolinamid.
[00297] Hydrochlorid 1-((3,5-dimethylizoxazoM-yl)methyl)-lH-pyrazol4-aminu (Příklad 4-1 a) (400 mg, 2,1 mmol), kyselina pikolinová (256 mg, 2,1 mmol) a HOBt (388 mg, 2,50 mmol) se smíchaly v DCM (7 ml). Reakční směs se nachala reagovat s triethylaminem (670 ml, 4,8 mmol) a míchala se po dobu 15 minut při teplotě místnosti v dusíkové atmosféře. Přidal se EDC (598 mg, 3,1 mmol) a reakční směs se míchala po dobu dalších 4 hodin. Reakční směs se pak zředila dichlormethanem (5 ml) a promyla se vodným nasyceným roztokem NaHCOj (5 ml, 2x), a pak vodným nasyceným roztokem NaCl (5 ml). Organická vrstva se sebrala, vysušila a zfiltrovala. Rozpouštědla se za vakua odstranila. Surový produkt se znovu suspendoval v EtOH (5 ml) a přečistil se pomocí reverzní fázové HPLC (5%-95% ACN v H2O: 25 minutový gradient). Čisté frakce se spojily a koncentrovaly, což dalo N-( 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4~yl)pikolinamid (372 mg, 60%) jako bílou pevnou látku. lH NMR (CDClj, 400 MHz): δ 2,21 (s, 3H), 2,44 (s, 3H), 5,05 (s, 2H), 7,497,47 (m, 1H), 7,59 (s, 1H), 7,93-7,88 (dt, J= 14, 2 Hz, 1H), 8,07 (s, 1H), 8,24-8,21 (d, > 8 Hz, 1H), 8,61-8,56 (m, 1H), 9,83 (bs, !H). LC/MS; [M+H] vypočteno pro C15H15N5O2; očekáváno 297,1; nalezeno 298,3. : Teplota tání: 135 -137 °C.
[00298] Sloučenina měla lC5o 0,57 μΜ na hT2R8 receptorů hořkosti.
Příklad 4-la: hydrochlorid l-((3,5-díntethvlizoxazol-4-vl)methvl)-lH-Dvrazol-4-aminu
[00299] Terc.butyl-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)- lH-pyrazol-4-yl-karbamát) (Příklad 4-Ib) (592 mg, 2 mmol) se míchal v roztoku 4N HC1 v dioxanu (20 ml) při teplotě okoh po dobu 2 hodin. Rozpouštědlo se odstranilo za sníženého tlaku a zbytek se spojil se směsi 1/1 ethylacetat/hexany {30 ml) a koncentroval se (dvakrát). Pevná látka se třela s hexany a sebrala se filtrací, což dalo hydrochlorid l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-ammu { 500 mg, 99%) jako bílou pevnou látku. 'H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 2,11 (s, 3H), 2,38 (s, 3H), 5,16 (s, 2H), 7,51 (s, 1H), 8,03 (s, 1H), 10,27 (bs, 3H).
Příklad 4-lb: Terc.butvlu-(l-((3.5-dimcthvlizoxazol-4-yl)methvl>-IH-Dvra7oL
-4-vlkarbamát)
100300] 3,5-Dimethyl-4-((4-nitro-l H-pyrazol-l-yl)methyl)izoxazol (Příklad 4-1 c) (14,6 g, 66 mmol), Boc anhydrid a 10% Pd/C (3,8 g) se míchal v MeOH (400 ml) pod 101,3 kPa (1 atmosférou) H2 po dobu 16 hodin při teplotě okolí. Směs se zfiltrovala a roztok se odstranil za sníženého tlaku. Zbytek se přečistil chromatografií na silikagelu (20% ethylacetát v hexanech), což dalo terc.butyl-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-ylkarbamat) (12,7 g, 66%) jako světle růžovou pevnou látku, 'H NMR (CDC13,400 MHz): δ 1,41 (s, 9H), 2,10 (s, 3H), 2,32 (s, 3H), 4,90 (s, 2H), 6,19 (bs, 1H), 7,19 (s, IH), 7,50 (s, 1H). MS 293 (MH+).
^^^cdimethyl^^
[00301] Do 4-nitro-lH-pyrazolu (Příklad 4-ld) (3,8 g, 34 mmol) v DMF (80 ml) ochlazeného na 0 “C pomocí ledové lázně se přidal í-BuOK (4,2 g, 38 mmol). Po přídavku této báze se ledová lázeň odstranila a směs se míchala po dobu 30 minut, načež následoval přídavek 4-(chlormethyi)-3,5-dimethylizoxazolu (5 g, 34 mmol). Reakční směs se refluxovala po dobu 16 hodin, poté se ochladila na teplotu okolí. Do reakční směsi se přidala H2O a vznikla sraženina se sebrala pomocí filtrace. Sraženina se promyla další H2O, pak se vysušila za vysokého vakua, což dalo 3,5-dimethyl-4-((4-nitro-lH--pyra^ (5,8 g, 78%) jako světle žlutou pevnou látku. 'H NMR (CDC13, 400 MHz): δ 2,23 (s, 3H) 2,46 (s, 3H), 5,08 (s, 2H), 8,02 (s, 1H), 8,08 (s, 1H).
Příklad 4-ld: 4-nitro-lH-pvrazol
[00302] Pyrazol (10 g, 147 mmol) se po částech přidal do koncentrované kyseliny sírové (100 ml), zatímco se vnitřní rekční teplota udržovala pod 50 C pomocí ledové lázně. Poté se po kapkách přidala koncentrovaná kyselina dusičná (10 ml), přičemž se udržovala vnitřní reakční teplota pod 50 “C pomocí ledové lázně. Ledová lázeň se odstranila a reakční směs se zahřála na 60 ’C a míchala se po dobu 4 hodin. Reakční směs se ochladila pomoci ledové lázně a přidala se báze 18 N vodný NaOH roztok (150 ml ) na - pH 8. Produkt, který se vysrážel jako bílá pevná látka, se sebral filtrací, promyl se H2O a vysušil se za vysokého vakua, což dalo 4-nitro-1 H-pyrazol (7g, 42%) jako bílou pevnou látku. 13C NMR (100 MHz, CDC13): Ó 126,4, 137,0.
Příklad 4-2: 3-chlor-N-(l-((3,5-diinethylizoxazol-4-yl)inetliyl)-lH-pyrazol-4-yl)-4-(methylsulfonyl)thiofen-2-karboxamid |00303f Do míchané směsi hydrochlondu ((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)mcthyl)-lH-pyrazol-4-aminu (Příklad 4-la) (500 mg, 2 mmol) v DCM (20 ml), ochlazeného na 0 °C pomocí ledové lázně, se přidal triethylamin (600 mg, 6 mmol). Směs se míchala, dokud nebyla všechna pevná látka v roztoku (-10 minut). 3-Chlor-4-(methylsulfonyl)thiofen-2. karbony 1-chlorid (543 mg, 2,1 mmol) v 2 ml CH3CN se přidal pomocí stříkačky do volného aminu při 0 °C. Ledová lázeň se odstranila a směs se míchala po dobu 2 hodin. Reakční směs se zředila dichlormethanem (100 ml) a organická fáze se promyla H2O (200 ml). Organická vrstva se vysušila nad síranem sodným, zfiltrovala se a koncentrovala se za sníženého tlaku. Pevná látka se třela s ethylacetát/hexany (1/5), což dalo 3-chlor-N-(l-((3,5-dimethylizoxazol4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)4 (methylsulfonyi)thiofen-2-karboxamid (375 mg, 45%) jako bílou pevnou látku. Ή NMR ÍCDCb, 400 MHz): δ 2,20 (s, 3H), 2,43 (s, 4H), 3,22 (s, 3H), 5,05 (s, 2H), 7,57 (s, 1H), 7,94 (s, 1H), 8,41 (s, 1H), 8,59 (bs, 1H), LC/MS ; [M+H] 415,5. Teplota tání: 202-204°C.
[00304] Sloučenina měla IC50 2,09 μΜ na hT2R8 receptoru hořkosti.
Přiklad 4-3: CSfV(14(3,5-dimethylizoxazuM-yl)methylMH-pyrazol-4-yl)-2-fenylpropanamid.
[00305] Hydrochlorid l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-aminu (Příklad 4-1 a) (200 mg, 1 mmol), kyselina (S)-2-fenylpropionová (156 mg, 1 mmol) a PyBop (650 mg, 1,3 mmol) se přidaly do DMF (4 ml), načež následoval triethylamin (0,3 ml, 2,1 mmol). Reakční směs se míchala po dobu 4 hodin při teplotě místnosti v dusíkové atmosféře, pak se zředila ethylacetátem (20 ml), promyla se vodným nasyceným roztokem NaHCO3 (2x15 ml), následován vodným nasyceným roztokem NaCl (15 ml). Organická fáze se vysušila, zfiltrovala a koncentrovala na rotační odparce. Surový produkt se znovu suspendoval v methanolu (3 ml) a přečistil sc pomoci reverzní fázové HPLC (5% - 95% ACN ve H2O· 25 minutový gradient). Frakce obsahující čistý produkt se koncentrovala, což dalo (S)-N-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-2-fenylpropanamid (200 mg, 60%) jako bílou pevnou látku. Ή NMR (400 MHz, DMSO-ds) δ 1,36 (d, J= 7,2, Hz, 3H), 2,09 (s, 3H), 2,36 (s, 3H), 3,71- 3,66 (m, 1H), 5,05 (s, 2H), 7,33-7,17 (m, 5H), 7,37 (s, 1H), 7,90 (s, IH), 10,05 (s, 1H), MS 325 (M+H). Teplota tání 108°C - 110“C.
100306] Sloučenina měla ICM 0,41 μΜ na hT2R8 receptoru hořkosti.
Příklad 4-4 : N-(l-((3,5-dimethyIizoxazol-4-yl)metliyl)-lH-pyrazol-4-yl)-2-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyfenyl)acetamid.
[00307] Hydrochlorid H(3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-aminu (Příklad 4-1 a) (376 mg, 1,7 mmol), kyselina 2-(4-hydroxy-3.5-dimethoxyfenyl) octová (350 mg,
1,7 mmol), PyBop (1 g, 2 mmol) a triethylamin (605 mg, 6 mmol) se společně míchaly v DMF (10 ml) při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Reakční směs zředila se vodnou IN HC1 (100 ml) a extrahovala se DCM (3x, 75 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným, zfiltrovaly se a koncentrovaly se na rotační odparce. Zbytek se přečistil chromatografií na silikagelu (30% ethylacetát v hexanech), což dalo N-(l-((3,5-dimethylizoxazoM-yljmethylMH-pyrazoM-yl)^ acetamid (189 mg, 29%) jako bílou pevnou látku, 'h NMR (CDCh, 400 MHz) 52,10 (s, 3H), 2,36 (s, 3H), 3,40 (s, 2H), 3,70 (s, 6H), 5,07 (s, 2H), 6,53 (s, 2H), 7,39 (s, 1H), 7,92 (s, 1H), 8,18 (s, 1H), 10,03 (s, 1H). LC/MS; [M+H] vypočteno pro C19H22N4O5; očekáváno 387,16; nalezeno 387,6. Teplota tání: 187-188C.
100308] Sloučenina měla IC50 0,46 μΜ na hT2R8 receptotu hořkosti.
Příklad 4-5 : N-(l-((3,5-dimethylÍzoxazo|-4-yl)niethyl)-lH-pyrazol-4-yl)-2-fenyIpropanamid.
[00309] Hydrochlorid l-((3,5-dimethylízox^^^^^ (Přík]ad
4-la) (300 mg, 1,3 mmol), kyselina 2-fenylpropanová (225 mg, 1,5 mmol), triethylamin (300 mg, 3 mmol), DMAP (61 mg, 0,5 mmol) a EDC (386 mg, 2 mmol) se společně míchaly v DCM (10 ml) při teplotě místnosti po dobu 4 hodin. Reakční směs zředila se vodnou 1N HC1 (100 ml) a extrahovala se DCM (3x, 75 ml). Spojené orgamcké extrakty vysušily sc nad síranem sodným, zfiltrovaly se a koncentrovaly se na rotační odparce. Zbytek se přečistil chromatografií na silikagelu (30% ethylacetát v hexanech), což dalá N-(l-((35-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-2-fenylpropanamid (272 mg, 81%) Jako bílou pevnou látku.'H NMR (CDC13, 400 MHz) á 1,36 (d, 3H, J=7,2 Hz), 2,10 (s, 3H) 2 37 (% 3H), 3,70 (m, 1H, J=6,8 Hz), 5,06 (s, 2H), 7,20 (t, 1H, J=8,4 Hz), 7,31-7,28 4H)’ 7,38 (s, 1H), 7,91 (s, 1H), 10,10 (s, 1H). LC/MS; [M+H] vypočteno pro C18H20N4O2; očekáváno 325,16; nalezeno 325.5. Teplota tání: 129-130X2.
[00310| Sloučenina měla 1C5O 0,32 μΜ na hT2R8 receptoru hořkosti.
Příklad 4-6: Ν4Η(3,S-diinethylfaM^
4-6
1003111 Hydrochloridová sůl H(3,5-dimethyl^^^ (Příklad 4-la) (230 mg, 1 mmol) a triethylamin (300 mg, 3 mmol) se smíchaly v DCM (10 ml) ochlazeného na 0 C pomocí ledové lázně. 2-Fenylacetylchlorid (184 mg, 1,3 mmol) se přidal po kapkách do míchané reakční směsí. Když se přídavek dokončil, odstranila se ledová lázeň a reakční směs se míchala po dobu 1 hodiny. Směs se zředila DCM (50 ml), promyla se IN vodnou HC1 (100 ml), následována 1N vodným NaOH (100 ml) a pak H2O (10O ml) Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným, zfiltrovaly se a rozpouštědlo se odstranilo na rotační odparce. Výsledný zbytek se přečistil chromatografií na silikagelu (50% ethylacetát v hexanech), což dalo 210 mg pevného produktu, který se třel v ethylacetát/hexanech (1/9), což dalo N-( 1-((3,5-dímethylizoxazol^^
-yl)-2-fenylacetamid (188 mg, 68%) jako bílou pevnou látku. Ή NMR (CDC1}, 400 MHz): δ 2,15 (s, 3H), 2,38 (s, 3H), 3,69 (s, 2H), 4,97 (s, 2H), 7,15 b(s, 1H), 7,40-7,27 (m, 6H), 7,84 (s, 1H). LC/MS ; [M+H] vypočteno pro C17H18N4O2; očekáváno 311,14; nalezeno'3H,4o’ Teplota tání: 106-108 ’C,
[00312] Sloučenina měla IC5O 0,53 μΜ na hT2R8 recepturu hořkosti.
Příklad ^-(1-((3,5-dimethyIizoxazol-4-y|)niethyi)-lH-pyrazol-4-yl)-3-methoxy-benzamid.
4-7
1003131 Hydrochlorid 1-((3,5-dimcrhylizoxazol-d-yOme^ ,wikla(i
4-1.) (300 mg, 1,3 mmol), kyselina y-meihoxjtenzoová (172 mg, 1,3 mmol), EDC (386 mg, 2 mmol) a triethylamio (303 mg, 3 mmol) se míchaly v DCM (5 ml) pH teplo» okolí po dobo 6 hodm. Reakční smis se zředila DCM (50 ml) a organická fáze se promyla vodnou 0,1 N
HC1 (150 ml), následována vodným IN NaOH (150 ml). Organická vrstva se vysušila nad síranem sodným, zfiltrovala se a koncentrovala se na rotační odparce. Surový produkt se přečistil chromatografií na silikagelu (40% ethylacetátem v hexanech), což dalo 225 mg ne zcela bílé pevné látkyy. Pevná látka se třela ethylacetátemyhexany (1/9) a bílá pevná látka se sebrala filtrací. Čistý produkt se rozpustil v absolutním ethanolu a koncentroval se na rotační odparce (4x, 25 ml), což dalo N-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-3-methoxybenzamid (185 mg, 43%) jako bílou pevnou látku. 'H NMR (CDC13, 400 MHz): δ 2,20 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 3,85 (s, 3H), 5,03 (s, 2H), 7,09-7,06 (m, 1H), 7,37-7,35 (m, 2H), 7,41 (m, 1H), 7,51 (s, 1H), 7,93 (bs, 1H), 8,03 (s, 1H). LC/MS; [M+H] vypočteno pro C17H18N4O3; očekáváno 327,14; nalezeno 327,30. Teplota tání: 127-129 C.
100314] Sloučenina měla IC50 0,39 μΜ na hT2R8 receptorů hořkosti.
Příklad 4-8: N-(l-((3,5-dimethylj20xazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)benzo[d||l,3j-díoxoi-5-karboxa mid
4-8
[00315] Hydrochlorid 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-aminu (Příklad la) (8 mg, 35 pmol) a kyselina benzo[d][l,3]dioxol-5-karboxylová (7 mg, 42 pmol) se každý zvlášť rozpustily v 200 μΐ dimethylformamidu. Si-karbodiimidová pryskyřice (70 mg, 70 pmol) se dala do 1,2 ml Greinerovy destičky s 96-ti jamkami, načež následoval přídavek aminu a kyseliny. Hydroxybenzotriazol (6 mg, 42 pmol) se rozpustil ve 100 μΐ dimethylformamidu a přidal se do reakční jamky. Reakční směs se přes noc protřepávala při teplotě místnosti. Aby se odstamil přebytek karboxylové kyseliny a hydroxybenzotriazolu, přidala se do reakční směsi PS-trisaminová pryskyřice (35 mg, 70 pmol) za stálého protřepávání přes noc při teplotě místnosti. 200 pl acetonitnlu se přidalo do reakční jamky a protřepávalo se po dobu 1 minuty. Horní čirý roztok se převedl do nové desky. Proces extrakce se ještě dvakrát opakoval. Roztok se odpařil za vakua a dal požadovaný produkt. Výtěžek 6%. MS M+H vypočteno 341,1, nalezeno 341,2.
100316] Sloučenina měla IC50 0,2 pM na hT2R8 receptorů hořkosti.
ΡΗ^Μ:ιΝ-(1-((3,5η^^ benzamid
|·βΐη fflpn,.mý jak v Přikládá 4-8 z kysehny j.S^oxybenzoavé a hydrochloride WMi™.hylizoxaz^^ (pf4|ad
Výtěžek 13%. MS M+H vypočteno 357,5, nalezeno 357,3.
100318] Sloučenina měla IC50 0,17 μΜ na hT2R8 receptorů hořkosti.
PHkl.d 4-10: ^MH(3,Mim«byllz«^^
4-10
10*3191 Připravený jak v Přndadu 4-8 z kyseliny 3-ky^benz^ a hy^hlondu h 4,|a) výKfck |5% ms M+H vypočteno 322,6, nalezeno 322,3.
1003201 Sloučenina mSla 1C® 0,2 μΜ na hT2R8 receproru horkosti.
Příklad 4-11:
propankarboxamid
4-11
100 (00321] Připravený jak v Příkladu 4-8 z kyseliny 1 -fenylcyklopropankarboxylové a hydrochlondu 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-aminu (Příklad 4-la). Výtěžek 6% MS M+H vypočteno 337,6, nalezeno 337,5, |00322| Sloučenina měla IC5o 0,25 μΜ na hT2R8 receptoru hořkosti.
Příklad 4-12: N-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-3-fenylbutanamid
4-12
[00323] Připravený jak v Přikladu 4-8 2 kyseliny 3-fenylbutanové a hydrochlondu 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-aminu (Příklad 4-la). Výtěžek 6%. MS M+H vypočteno 339,6, nalezeno 339,5.
[00324] Sloučenina měla ICjo 0,28 μΜ na hT2R8 receptoru hořkosti.
Příklad 4-13: N-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-lH-pyrol-2-karboxamid
4-13
[00325] Připravený jak v Příkladu 4-8 z kyseliny 1 H-pyrol-2-karboxylové a hydrochloridu l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-aminu (Příklad 4-la). Výtěžek 18%, MS M+H vypočteno 286,6, nalezeno 286,3.
[00326| Sloučenina měla 1CSO 0,57 μΜ na hT2R8 receptoru hořkosti.
101
Příklad 4-14: 2-cyklohexyl-N-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)metliyl)-lH-pyrazol-4-yl)acetamid
1003271 Připravený jak v Příkladu 4-8 z kyseliny 2-cyklohexyloctové a hydrochlondu 1((3,5-drniethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-amiiiu (Příklad 4-1 a). Výtěžek 17%, MS M+H vypočteno 317,6, nalezeno 317,4.
[00328] Sloučenina měla IC50 0,73 μΜ na hT2R8 receptoru hořkosti.
Příklad 4-15:N-(l-((3,5-dimethylizoxazoM-yl)methylMH-pyrazoM^^^
4-15
1003291 Připravený jak v Příkladu 4-8 z kyseliny skořicové a hydrochloridu 1-((3,5. -dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-aminu (Příklad 4-1 a). Výtěžek 4%. MS M+H vypočteno 322,6, nalezeno 322,4.
[00330] Sloučenina měla IC50 0,7 μΜ na hT2R8 receptoru hořkosti.
Příklad 4-16: N-(l-((3,5-dimethyIizoXazoI-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl) adamantan.
4-16
[00331] Hydrochlorid 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-IH-pyrazol-4-aminu (300 mg, 1,56 mmol), kyselina adamantan- 1-karboxylová (281 tng, 1,56 mmol), PyBop (972 mg, 1,87 mmol) a tnethylamin (0,438 ml, 3,12 mmol) se míchaly v DMF (5 ml). Reakční směs se míchala př. teplotě místnosti po dobu 4 hodin v dusíkové atmosféře, Reakční směs se zředila
102 cthylacetátem (4 ml) a promyla se nasyceným roztokem NaHCOi (2x, 3 ml) a pak nasyceným NaCl roztokem {3 ml). Organická vrstva se extrahovala, vysušila a zfiltrovala. Rozpouštědla se za vakua odstranila. Surový produkt se znovu suspendoval v methanolu (4 ml) a přečistil se pomocí HPLC. Čistý produkt se znovu rozpustil v ethanolu a koncentroval se za vakua (3x3 ml), což dalo N-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)niethyl)-lH-pyrazoM-yl)adamantan jako bílou pevnou látku v 60% výtěžku. lH NMR (400 MHz, CDC13): δ 1,79-1,70 (m, 6H), 1,93 1,92 (m, 6H), 2,08 (bs, 3H), 2,18 (s, 3H), 2,41 (s, 3H), 4,98 (s, 2H), 7,37 (s, 1H), 7,38 (s, 1H), 7,92 (s, 1H), MS 355 (M+H). Teplota tání 167-169 °C.
[003321 Sloučenina měla IC50 0,88 μΜ na hT2R8 receptorů hořkosti.
[00333| Další sloučeniny se syntetizovaly následujícími podobnými postupy, jak je popsáno v Příkladech 4-1 až 4-16 a pokusně se testovaly a zjistilo se, že mají relativně vysokou míru účinnosti jako inhibitory hT2R8 receptorů hořkosti. Výsledky těchto testů jsou ukázány v Tabulce A.
103
Tabulka A
t Sloučenina č. Sloučenina hT2R8IC„ (μΜ)
4-17 i O /= NZ ΓΑ. Γ~λ\ Z~OMe □a nJ~NH N-( 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4—yl)methyl)-1Hpyrazol-4-yi)-4—methoxybenzamid 0.26
4-18 i OMe oA ^nh M, X OMe N-( 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1H__ pyrazol-4-y])-3,5-dimethoxybenzamid 0,28
4-19 AaAt ' MeO N-( l-((3,5-dimethylizoxazol-4—yl)methyl)-1Hpyrnzol-4-yl)-2-methoxybenzamid 0,39
4-20 । OMe 1 0 θΑ N-( 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methy 1)-1Hpyrazol-4-yl)-4-hydroxy-3-methoxybenzaniid 0,48
4-21 , OMe 1 0 /=/ 0 \ Níí/ NH — N-( l-((3.5-dimethylizoxazol-4—yl)methyl)- 1Hpyrazol-4-yl)-3.4—dimethoxybenzamid 0,56
4-23 A °\ N lT^'A AF θΑ ^Anh N-( 1 -((3,5-di methylizoxazol-4~yl)methyl)-1H- pyrazoi-4-yl)-4-tluorbenzamid 1,56
4-24 Η N-( 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1Hpyrazoi-4-yt)benzamid 2,62
4-25 । MeO OMe i 0 22 θΑ nA~nh N-(14(3,5-dimethylizoxazol-4—yl)methyl)-lHpyrazol-4-y 1 )-2,3-dimei hůxybenzamid 0,61
104
Sioufcnína c, Sloučenina hT2R8 ÍC^ (uM)
4-26 i SO2Me 0 \ N<Z NH N-( 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4--y 1 (methyl)-1H- 0,72
4-27
i HO i. o, )=\ °A N^/ NH M OMe N-( I -((3.5-dimethylizoxazol-4—yljmethyl)-1H- 0,98
4-28
1 0 °A n^/ NH N-( I -((3,5-dimethylizoxazol-4~yl)niethyl)-1H---------pyrazol-4-yl)-3--methylbenzamid 0,57
4-29 °\ N^/ NH N-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4— yl)methyl)-lH- --Eg^l~4-yl)-2nietboxyt>enzamid 0,30
4-30
1 OMe #~°h 0 \ NH v/, 0Μθ N-(t-((3,5-dunethylizoxazol-4- yl)methy|)-iH- 0,39
4-31
1 o v==/'OMe y Π ν3Me 2 (2,3-ditnethoxyfenyl )-N-( 1 -((3,5*dimethyiizoxazol-4-yl)methy})-1 H-p^oJ-4__ yl)acetamid 0,80
4-32 MeO 1 °A NH 2-(3,5-dimethoxyfenyl)-N-(l-((3.5- -diniethy[iZOxaZol-4-yl)meíhyl).lH-pjTazol.4yl)acetamid____| 0.96
105
Sloučenina č. Sloučenina hT2R8 (uMI
4-33 4-34 4-35 4-36 \ O 1 O L 0 \=/ A7 °A NH N-(l-((3,5-dimethyIizoxazol-4--yl)methyl)-lH--9^^01-4^1)-2-(4--methoxyfeny])acetamid — ---- 0,99
OMe j \ V-OMe 'FA A7 °A n</~NH N-( 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4—yl)methyl)-1H------ pyrazol-4-yl)-2-methoxybenzamid 1.11
, ZA o. )=/ p—' OMe °A nAnh N-( 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1H---pyraol-4-yl>2-(2-methoxyfenvhaťeiamid 1. 1,16
1 0 V—/ 0Me °A N^/ NH N-( 1 -((3.5-dimetbylizoxazol-4—yí)methyl)-1H- ------Pyrazol-4-yl)-2-methoxybenzamid 1,85
4-37 i Q r—\ °A ŇV~NH / N-( 1-((3,5dimethylizoxazol-4-y|)merhy|)-lH- __Pyrazol-+-yl)-2-fenylbutanamid 0,50
4-38 1 O i 0 \=/ N/ r~\~ °A nh x N-( 1 -((3,5-dime(hylizoxazol-4— yl)methyl). 1H______pyrazol-4-yl)-2--niethoxybenzamid_______ 0,53
4-39
N
Q
NH OCOCH3
0.83 (2-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4--y|)methyl)-lH' ---------yi/meuiyi3-iMJ_ pyrazol-4-ylamino)-2-oxo I - fenyiethyl)-acetát
106
Sloučenina č. Sloučenina hT2R8 IC5, ίμΜ)
4-40 ΖΛ °\ N-i r-\ °A ΆΝΗ V°H N-( 1 -((3,5-dimethy[izoxazol-4—yl)methyl)-l Hpyrazol-4-yl)-3-hydroxv—2-fenvlnrnnanamid 0,96
4-41
/A o \=/ Nz ΥΑλ 7—R 0 \ N^/ NH °M® N-( 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1Hpyrazol-4-y|)-2—methoxvbenzamid 2,10
4-42
, fA 1 o \=/ °A nA-nh ' (R)-N-(l-((3,5-dimethyIizoxazol-4-yl)methyl)- 3,72
4-43
1 O 1 o \=/ °A W NH OMe N-( 1 -((3,5-dimethyiizoxazol-4-yl)methyl)-1Hpyrazol-4-yl)-2-methoxy-2-fenvlacetamid 3,43
4-44
1 /A 1 o v=/ N/Z~\ °A nAnh W N-( l -((3,5-dimethylizoxazol-4-y|)methyl)-1Hpyrazol-4-yl)-2,2--difenylacetamid 5,19
4-45
1 Λ H °A nv nh N-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yljmethyl) IH_pyrazol-4-yl)-4-methyl-1 H-pyrol-2-karboxamiri 0.72
4-46 1 Q, /=N Άν>ν^ N-( 1 -((3,5-dimethy lizoxazol-4-yl )melhyl)-1H- ___pyrazol-4-y|)nikotinamid 1.05
107
Sloučenina í. Sloučenina hT2R8 IC!t (pM)
4-47 4-48 4-49 N^/ NH N-( 1 <(3,5-dimethylizoxa2ol-4-yl)methyl)-l H__Pyrazol-4-yl)-2-methoxybenzamid 1,35
°A nJ~nh N-( i -((3.5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1H___pyrazol-^yO-ó-methyipikolinamid 1,95
j. θ N N-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4--yl)tnethyl)-lHpyrazot-4-y|)-l.methyt- lH-pyroi-2-karboxamid 3,40
4-50 N-( 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1H___ pyrazol-4-yl)izonikotinamid 4,59
4-51 ÚQOXC? N-( l-((3,5-dimethylizoxazol-4--yl)methyl)-1H_ pyrazol-4-y|).2-methylfuran-3-karboxamid 7,87
4-52 X .. Q N' jXA- °A NH N-( 1 -((3,5-dimethyltzoxazol-4-yl)methyl)-1Hpyrazol-4-y|)-1,3-dimethyl-1 H-pyrazol-5- ______ karboxamid 18,05
4-53 4-54 1 0 V °Λ NV~NH N-( 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4--yl)tnethyl)-1H- pyrazol-4-yl)-2,5-diniethylfuran-3-karhox.imid 3,03
Q οΛ nX nh N-( 1 -í (3,5-dimethylizoxazol-4—yl)methyi)-1Hpyrazol-4-yl)-5-inethylfiiran-2-karboxamid 3,19 —-----_
108
Sloučenina č. Sloučenina hT2R8IC„ íuM)
4-55 N< /7 W 0 \ n^/ NH N-( l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)- 1H- 0.49
4-56
O o fa nz'fa °\ ν^νη ‘Z I -((3,5-dimethylizoxazol-4-y])methyl)-1H- 0,83
4-57
V z fa °A ň^/ NH N-( 1 -((3,5-dimethylizoxazot-4-.yl)methyl)-1H- 4,16
4-58
fa °A N^/ NH N-( 1-((3.5-dimethylizoxazol-4-yl)methyi)-1H- --2>Tazol-4-yl)-2-(fjran-3—yljacetamid 8,66
4-59 1 0 r—/0Et Η N-( 1 -((3,5-dimethylizoxazoi-4--y|)methyl}- IH- 0,22
4-60
z7 °Λ -Uhl N-(!-((3>5-dimethy!izoxazol-4-y| Imethylj- IH------Eyrazol-^yQ-j-methylpentananiid 1.94
4-61
°A n^Aií w N-( 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1HpyrazoM-yljcyiclohexankarboxaniid 2,20
109
Sloučenina č. Sloučenina __ hT2R8 ICM (uM)
4-62 1 o >5/ Z 7 o A \ W H N-(l-((3,5-dimethy]izoxazol-4-yj)methyl)-lH.____£yrazol-4-yl)-2--(adamanth- l-yl)acetaniid 3,77
4-63 NZ f 'n-A / OA uJa \ NA H 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)niethy|)-N- ___ methyl-1 H-pyrazol-4-amin 8,76
4-64 Φ ,__X S f¥° \ S O AA Z-Z 12,60
OMe N.N-bÍ3(23-dimethojLybenzyl)-1 -((3,5- -dimethyiizoxazol-4-yl)methyl)-1H—pyrazol-4__ amin
λ ?\ o
4-65 N-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-!H---ĚÍA°l-4-yl)-N-methyl-24enylpropanami<l 2,81
1 0 fy
4-66 N-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4--y|)ni ethyl)- 1Hpyrazol-4-yl)-N-methyl--l_____fenylcyklopropankarboxamid 8,23
4-67 taA N-' 0 1 (S)-N-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-y|)methyl)1 H-pyrazol-4-yÍ)-2—methoxy-2-fenylacetamid | 8.6
110
Sloučenina ¢. Sloučenina hT2R« ÍCH íuM)
4-68 N'V 0 H I í ° 1Ά 0 (R)-N-(l -((3,5 -dime thylizoxazol-4--yi)[nethyl)- --1 H-pyrazol-4-y l)-2—rnethoxy-2- fenylacetamid 5,0
4-69 'αύυ 0 N-( 1-((3,5-dimethyltzoxazol-4-yl)methyi)-lHpyrazol-4-yl)-2-(4— hydtoxy-3- ___ methoxyfenyl)acetamid 4,7
4-70 Jx/OH o- „y 'SYr hH 0 N-( 1 -((3,5-di methy iizoxazot-4--yl)niethyl)-1Hpyrazol-4-yl)-2-(3-hydroxy-4- __methoxytenyi)acetamid 3,1
4-71 hC O OH N-( i -((3,5-dimethyiizoxazol-4—yl )methyl)-1H__Eyrazol-4-yl)-2.hydroxy-3-niethoxYbenzamid 2,9
4-72 Y-roSv-Oň VN,Y Y^N 0 N-( 1 -({3,5-dimethyiizoxazoi-4~yl (methyl)-1H—pyrazol-4-yl)benzo[d]oxazol-5-karboxamid 3,6
4-73 Ύ π °H 0 N-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4—y|)methyl)-lHpyrazol-4-yl)-3,4*-dihydroxy-5- ____methoxybenzamid 2,2 -_____________
Ill
Sloučenina č.
Sloučenina
pyrazol-4-yl)-3--methoxy-4-methylbenzamid hT2R8 IC,, - ΦΜ)
2,2
4-75
F, ,F
Λ-Y H N' J
N
N-( 1 ·(( 3,5-dimethylizoxazol-4--yi)methy l)-1Hpyrazol-4-yl).2-niethylbenzoíuran-5___kaiboxamid
4-76 h
7 \ z^N
N-( 1 -(OJ-dimethylizoxazol-T-yl Jmethyl)-1H---pyrazoM-ylJchinoxaJin-S-Íarhnxnmid
4-77
H
-J
N
N-( l -((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)tnethyl)-lH---gyrazol-4-yl)benzofuran-5-icarboxaniid
O
H N> J N O
N-( 1 -(f 3.5-dimethyiizoxazol-4—ybmethyl)-1Hpyrazol-4-yl)-2,2-difluorbenzo[d][ 1,3 ]dioxol-5_________Aarboxam id
112
Sloučenina č. Sloučenina hT2R8 ICS0 ___frM)
4-79
N-f 1-((3,5-dimethylizoxazol-4--yl)methyl)-lHpyrazol-4-yl)-2-methyl-1 H-benzo[d]imidazol-5___karboxamid
4-80
4-81
4-82
4-83
1,0
3-chlor-N-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1 H-pyrazol-4-yl)benzam id
H N
N-( 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1Hpyrazol-4-yl)-2-ethyibenzo[d]oxazol-5__________ karboxatntd
Α-/ Η 7 \ /^Ν Ν- / hr Ο
Ν-( 1 -((3.5-di methylizoxazol-4~ yJJmethy i). IH---P^^L^yOchinoxalin-e-karhoitamiH
Nq 1 -{(3,5-dimethylizoxazol-4-yl (methyl)-1Hpyrazol-4-yl)-2-methylbenzo[d]oxazol-6karboxamid
N-l H(3.5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-IHpyrazol-4-yl)-1 H-benzo[d]imidazol-5karboxamid
0,6
113
Sloučenina č. Sloučenina hT2R8 IC5ft ín
4-86 X 0 2-( lH-benzo[d]imidazol-6-yl)-N-(l -((3 5dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1 H-pyrazol-4- _______ yl)acetamid --LHjViJ _ 0,6
4-87 3T , rd SX γ^Ν 0 N-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-IHpyrazol-4-yl> 1 H-benzo[d] [ 1,2,3] triazol-5---karboxamid 0,6
XďO
4-88 / Π 0 X 0 N-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyi)-1Hpyrazol-4-yl)-2,3-dihydrobenzo[b][l,41dioxin-6—_____ -karboxamid 0,4
ťA BrW0^ AT n 11Ί
4-89 N /11 0 X 0 7-brom-N-( 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-2 3-dihydr0bCTzo[b][l,4]di0xin-6-karbw^^ 0,3
Af a T Γ ] —
4-90 ^N T [] 0 0 7-chlor-N-(l -((3,5-dimethylizoxazol-4- -yl)methyl)-lH-pvrazol-4-yi)-2 3- _ -dihydfobenzo[b][ 1 .^ďioxin-ó-kartoxaniid 0,1
4-91 T V X°x h( T ΙΓ o 0 8-chtor-N-( 1 -((J.5-dimethylizoxazo|-4- yllrnethyl)-1 H-pyra2oj-4-yi)-2j- -dihydrobenzoíbir 1 41dioxin-6- 0,1
4-96 ________________________________________________________________________________________________________________________________________| Νχ/ --— 0Z T Ne / H l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-N. __methyl-1 H-pyrazol-4-aniin__ _ 8,764
114
Sloučenina č. 1 Sloučenina hT2R8 ICM (μΜ)
4-97 o' J Ν=ξ N-(l-((3,5-dimethy!izoxazol-4--yl)methyl)-lH__pyrazol-4-yl)-N-methyl—2-fenylpropanamid 2,126
4-98 4-99 ?N<Z o \ > 0 Ύ N=x '1 .W ' \ - (S)-N-( 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4--yl)niethyl)lH-pyrazol-4-yl)-N-methyl—2-fenylprot>anamid 2,811
N οΊ o η n=\ ckz λ- ! H 2-kyano-N-( 1-((3,5-diňiethylizoxazol-4_.-yl)methyl)-1 H-pyiazol4--yl )benzensulfonamid 1,358
4-100 4-101 ,Ν^ 0 \ o T ,N=\ An A Ό N-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1Hpyrazol-4-y])-2--fluorbenzen$ulfonatnid 8,510
0 Q J N=\ O*/' k. \ / h zo N-( 1-((3,5-dimcthylizoxazol-4-y])methyl)-lH- _ pyrazol-4-yl)-2,5-dimethoxybenzensulfonamid r 1,631
4-102 0 \ 0 J N=\ Ό N-( 1-((3,5-dimethylizoχazol·4-y|)methyl)-1H___pyrazol-4-yl)-2—methylbenzensulfonamid 2,153
4-103 O T MÍA*! / h N-( 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4-y Ijmethy 1)-1H_ pyrazol-4-yl)-2-methoxybenzensulfonamid 3,801
4-104 N “V0 Λ/ / Η 3—' methyl-(3-(N-( l-((3,5-dimethylizoxazol—4- yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)sulfamoyl)thiofen2-karboxylát)________ 1,252
115
Sloučenina č. Sloučenina hT2R8 IC,,, (nM)
4-105 s \ 5 0 T ,N=\ k Γ X-Nx^N H F 1,629
1 -(1 -((3,5-dimethylizoxazol-4-y])methyl)-1H__Py!?Ml-4-yl)-3-(2--fluorfenyl;thiom
4-106 ,N^ S \ Λ Q Ύ NéA A W
/X'N'aA'N η .0 I-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-IH_pyrazol-4-y!)-3-(2-methoxyfenyl)thiomočovina 2,607
7^ $ On
4-107 / v h 1 -(1 -((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)inethyl)-1H___PJrazo l-4-yl)-3-(pyridin-3-yl)thiomočovtna 2,999
4-108
/ v Η n 1-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-l H__pyrazol-4-yl)-3-o--toly1thioinočovina 3,013
4-109 S I ,N=\ k / h l-(3-kyanofenyl)-3-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4- . yl)methyl)-1 H-pyrazoM-yl (thiomočovina 0,783
4-110 l-benzyl-3-( 1-((3,5-dimeth ylizoxazol-4- -yl)methyi)-lH-pyrazol-4— yljthiomočovina 1,097
4-111 0 V N=\ t . N l-(2-kyanotenyl)-3-(l-((3,5-dimethy)izoxazol-4yl)methyl)-1H—pyrazoi-4-yl )thiomočovina 2,347
4-112 - . . 0 T N=x ξ Χ/
/ Η Π 1-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4~yl)methyl)-lHpyrazol-4-yl)-3-fenylthiomoéovina 2.492
116
Sloučenina Č. Sloučenina 6T2R8IC„ (uM)
4-113 _ O /'z o EZ xz / 5,240
l-(2,5-dimethoxyfenyl)-3-(l-((3,5- -dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1 H-pyrazol-4_____ yl)thiomočovina
4-114 c/V n=n v / N h N-(2-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)niethyl)-2H- __tetrazol-5-yl)-3-methoxybenzamid 1,866
4-115 N-( 1 ( (3,5-dimethylizoxazol-4--yl)methyl)-3- __!Dethyl-lH-pyrazol-4-yl)—3-Hiethoxybenzamid 9,248
4-116 V H M-As 0 3-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-2-oxo-N(thiofen-2-ylmethyl)-2,3-dihydrothiazol-5________________katboxamid 2,279
Příklady 4-67 až 4-91:
[00334] Připravený jak v Příkladu 4-73 z hydrochloridu l-((3,5-dimethylizoxazoI-4yl)methyl)-lH-pyrazol-4-aminu (Příklad 4-la) a jeho odpovídajících funkčních karboxylových kyselin. Charakterizace se provedla pomocí LCMS, kde se nalezly požadované hmotnosti.
Příklad 4-73: N-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)mcthyl)-lH-pyrazol-4-yl)-3,4-dihydroxy
-5-methoxybenzamid
4-73
117 (00335] Hydrochlorid 1-((3,5-dimethylizoxazoM-yl)methyl)-1H-pyrazol4-aniinu (Příklad 4-la) (228 mg, 1 mmol), kyselina 3,4-dihydroxy-5-methoxybenzoová (184 mg, 1 mmol), HOBt (135mg, 1 mmol) a EDC (191mg, 1 mmol) se rozpustily v 2 ml DMF v mikrovlnné zkumavce, načež následoval přídavek triethylaminu (lOlmg, 1 mmol). Reakční směs se dala do mikrovlnného reaktoru při 165 °C po dobu 5 minut. Surový produkt se přečistil přímo použitím variantní HPLC (10%-95% ACN v H2O: 25 minutový gradient). Čisté frakce se spojily a koncentrovaly, což dalo N-(l-((3,5-dimethyHZoxazoM-yl)m^
-3,4-dihydroxy-5-methoxybenzainid. (280 mg, 70%). LC/MS; [M+H] vypočteno pro C17H18N4O5; očekáváno 359,1; nalezeno 359,1.
100336] Sloučenina měla IC50 2,2 μΜ na hT2R8 receptorů hořkosti.
Příklad 4-92: N-(l-((3,5-dimethylizoxaZol-4-y|)methyl)-lH-pyrazol-4-yl}-7-methoxy-benzo[d]|l,3]dioxol-5-karboxamid
4-92
[003371 N-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol4-yl)-3,4-dihydroxy-5-methoxybenzanud (Příklad 73) (50 mg, 0,14 mmol) a uhličitan česný (113 mg, 2,5 mmol) se rozpustily v 1 ml acetonu, načež následoval přídavek dibrommethanu (239 mg, 1,4 mmol). Reakční směs se umístila do mikrovlnného reaktoru při 120 °C po dobu 20 minut. Z reakční směsi se odstranil čirý roztok a odpařil se za vakua. Surový produkt se rozpustil v 1 ml ethanolu a přečistil se variantní HPLC (10%-95% ACN v H2O: 25 minutový gradient). Čisté frakce se spojily a koncentrovaly, což dalo N-(l-((3,5-dimethylizOXaZoM-yl)methyl)-lH-pyrazoí-4-yl)-2-(7-methoxybenzo[d][l,3]dioxol-5-yi)acetamid. (12 mg, 23%). LC/MS; [M+H] vypočteno pro C18H18N4O5; očekáváno 371,1; nalezeno 371,1.
100338] Sloučenina měla IC50 0,7 μΜ na hT2R8 receptorů hořkosti.
Příklad 4-93: Ml-((3.5-dimethylrioxazol-4-vl)methyl)-lH-pvrazol-4^
-dihydro benzo [b] [ 1,4] dioxi n-6- karboxamid
[003391 Připravený jak v Příkladu 4-92 z N-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-3,4-dihydroxy-5-methoxybenzamid (Příklad 4-73), uhličitan česný a dibromethan. Výtěžek 20%. MS M+H vypočteno 385,1, nalezeno 385,1.
[00340| Sloučenina měla IC5o 0,7 μΜ na hT2R8 receptorů hořkosti.
Příklad 4*94: N-( 1-((3,5-dimetliylizoxazol-4-yl)methyl)-l H-pyrazol-4-yl)-7-methoxy-2-methylbenzo[d][13]dioiol-5-karboxamid
H N
[00341] Připravený jak v Příkladu 4-92 z N-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yI)methyl)-1H-pyrazol-4-yl)-3,4-dihydroxy-5-methoxybenzamid (Příklad 4-73), uhličitan česný a 1,1-dibromethan. Výtěžek 25 %. MS M+H vypočteno 385,1, nalezeno 385,1.
Sloučenina měla IC$o 0,7 μΜ na hT2R8 receptorů hořkosti.
Příklad 4-95: N-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyI)-1 H-pyrazoi-4-yl)-7-methoxy-23-dihydrobenzo [b] 11,4| dioxin-6-karboxamid
O ]00342[Připravenýjak v Příkladu 4-73 z hydrochloridu l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-aminu (Příklad 4-la) a kyseliny 7-methoxy-2,3-dihydrobenzo[b][l,4]-dioxin-6-karboxylové (Příklad 4-95a). Výtěžek 50 %. MS M+H vypočteno 385,1,
119 nalezeno 385,1. 'H NMR (400 MHz, DMSO): 2,136 (s,3H), 2,410 (s, 3H), 3,851 (s, 3H), 4,214 (bs, 2H), 4,296 (bs, 2H), 5,120 (s, 2H), 6,688 (s, 1H), 7,290 (s, 1H), 7,6006 (s, 1H), 8,069 (s, 1H), 9,856 (s, 1H).
Sloučenina měla IC50 0,7 μΜ na hT2R8 receptoru hořkosti.
Příklad 4-95a: kyselina 7-methoxy-23-dihydrobenzo|b](l,4]dioxin-6-karboxyIová °A o
4-95a
[00343] Methyl-(7-brom-2,3-dihydro-benzo[b][l ,4]dioxin-6-karboxylát) (273 mg, 1 mmol) a CuBr (14,3 mg, 0,1 mmol) se rozpustily v suchém DMF ve 2 ml mikrovlnné zkumavce a umístily se do ledové lázně. Methoxid sodný (540 mg, 10 mmol) se přidal po kapkách do reakční směsi za současného míchání při 0 °C. Reakční směs se zahřála na teplotu místnosti a míchala se po dobu 45 minut. Reakční směs se pak umístila do mikrovlnného reaktoru po dobu 5 minut při 135 C. Reakční směs se zředila vodou a promyla se ethylacetátem. Vodná vrstva se sebrala a okyselila na pH 4 pomocí 1M HC1. Produkt se extrahoval použitím ethylacetátu, pak se vysušil nad síranem sodným. Rozpouštědlo se odpařilo za vakua, což dalo požadovaný meziprodukt kyseliny 7-methoxy-2,3-dihydrobenzo[b][l,4]dioxin-6-karboxylové, jež se použila přímo bez dalšího přečištění. Výtěžek 57 %. MS M+H vypočteno 211,1, nalezeno 211,1.
Příklad 5 hT2R14 Antagonisté: Příprava sloučenin podle vynálezu
100344] Následující příklady jsou uvedeny pouze pro ilustraci různých příkladných provedeni podle vynálezu a nejsou zamýšleny, aby jakkoliv omezovaly.
Přiklad 5-1: Kyselina 4-(N-benzyl-N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benzoová
120
5-1
[00345] Benzyl-(4-(N-benzyl-N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benzoát) (Příklad 5-la) (517 mg, 1 mmol) se míchal s 10/1/2 roztokem vodného 6N NaOH/THF/MeOH (27 ml) při teplotě okolí po dobu 6 hodin. Roztok se okyselil vodnou 3N HC1 na pH -3 (přibližně 50 ml) a vodná fáze se extrahovala ethylacetátem (3x, 75 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným a koncentrovaly se na rotační odparce. Zbytek se sebral do MeOH (15 ml) a přečistil se pomocí reverzní fázové HPLC (5-95% acetonitril ve H2O gradientu: 25 minut) ve třech 5 ml podílech. Čisté frakce se spojily a koncentrovaly na bílou pevnou látku. Produkt se rozpustil v 15 ml absolutního ethanolu a odpařil se na rotační odparce (4x), což dalo čistou kyselinu 4-(N-benzyl-N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benzoovou (174 mg, 42%) jako bílou pevnou látku. T.t 161-163 'C. Ή NMR (CDCb, 400 MHz): δ 3,78 (s, 3H), 4,32 (s, 2H), 4,36 (s, 2H), 6,78 (d, 7=8,4 Hz, 2H), 6,99(d, 7=8,8 Hz, 2H), 709-7,07 (m, 2H), 7,27-7,24 (m, 3H), 7,93 (d, 7=8,8 Hz, 2H), 8,24 (d, 7=8 Hz, 2H). MS 412 (ΜΗ*).
[00346| Sloučenina měla IC50 0,22 μΜ na hT2R 14 receptoru hořkosti.
Příklad 5-la: BenzYl-f44N-benzyl-N-(4-methoxvbenzyl)sulfamovl)benzoát)
100347] Kyselina 4-(N-(4-methoxybenzyl)suIfamoyl)benzoová (Přiklad 5-lb) (450, mg, 1,4 mmol), benzylbromid (770 mg, 4.5 mmol) a uhličitan česný (l,5g, 4,5 mmol) v DMF (10 ml) se míchaly při 80 ’C po dobu 2 hodin. Roztok se ochladil na teplotu místnosti, zředil se H,0 (200 ml) a extrahoval se ethylacetátem (3x, 100 ml). Spojené organické vrstvy se vysušily nad síranem sodným, zfiltrovaly se a koncentrovaly se za vakua. Zbytek se přečistil chromatografij na silikagelu (10% ethylacetát v hexanech), což dalo benzyl-( 4-(N-benzyl-N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyi)benzoát) (517 mg, 73 %) jako bílou pevnou látku, 'h NMR (400 MHz, CDCh) S 3,76 (s, 3H), 4,28 (s, 2Η), 4,32 (s, 2H0, 5,40 (s, 2Η), 6,79 (d, 7=8 Hz, 2H), 6,96 (d, 7=8 Hz, 2H), 7,04-7,07 (m, 2H), 7,21-7,23 (m, 3H), 7,35-7,47 (m, 5H), 7,85 (d, 7=8 Hz, 2H), 8,17 (d, 7=8,4 Hz, 2H).
Příklad 5-lb: Kyselina 4-(N-(4-methoxvbenzvl)sulfamovnben7QQvÍi
121
100348] Kyselina 4-(chlorsulfonyl)benzoová (5 g, 22,7 mmol) se přidávala ve třech částech jako pevná latka do míchaného roztoku 4-methoxybenzylaminu (6,1 g, 45 mmol) a triethylaminu (2,3 g, 22,7 mmol) v acetonu (100 ml) ochlazeného na 0 'C pomocí ledové lázně po dobu více než 10 minut. Ledová lázeň se odstranila a reakční směs se míchala po dobu dalších 4 hodin. Reakční směs se zředila roztokem 5% kyseliny octové ve H2O (150 ml) a extrahovala se ethylacetátem (3x, 100 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným, zfiltrovaly se a koncentrovaly se na rotační odparce. Výsledná bílá pevná látka se třela s hexany/ethylacetátem (9/1), což dalo kyselinu 4-(N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benzoovou (5,1 g, 70 %) jako bílou pevnou látku. 'H NMR (400 MHz, DMSO de) δ 3,68 (s, 3H), 3,91 (s, 2H), 6,79 (d, /=8,4 Hz, 2H), 7,10 (d, /=8,8 Hz, 2H), 7,80 (d, /=8,8 Hz, 2H), 8,02 (d, /=8,4 Hz, 2H).
Příklad 5-2 : Kyselina 4-(N-(furan-2-ylmethyl)-N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benzoová XO
5-2
100349] 4-Methoxybenzyl-(4-(N-(furan-2-ylmethyl)-N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benzoat) (Příklad 5-2a) (750 mg, 1,4 mmol) se míchal se směsí 2/2/1 vodného 2N LiOH/THF/MeOH (45 ml) při teplotě okolí po dobu 3 hodin. Roztok se okyselil vodným 1N HCI na pH ~3 (přibližně 100 ml) a extrahoval se ethylacetátem (3x, 100 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným a koncentrovaly se na rotační odparce. Zbytek se sebral do MeOH (9 ml) a přečistil se pomocí reverzní fázové HPLC (5-95% ACN v H2O gradient: 40 minut) ve třech 3 ml podílech. Čisté frakce se spojily a koncentrovaly se na bílou pevnou látku. Produkt se rozpustil v absolutním ethanolu a odpařil se (4x, 20 mi), což dalo čistou kyselinu 4-(N-(furan-2-ylmethyl)-N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benzoovou (205 mg, 36 %) jako bílou pevnou látku. T.t. 151-152 ’C. 'H NMR (DMSO-d<j, 400 MHz): δ 3,71 (s, 3H), 4,24 (s, 2H), 4,27 (s, 2H), 6,14 (d, 1H, J=3,2 Hz), 6,26 (m, 1H), 6,87 (d, 2H,
122
J=9,2 Hz), 7,14 (d, 2H, >8,8 Hz), 7,41 (s, 1H), 7,89 (d, 2H, J=8 Hz), 8,06 (d, 2H, J=8,4 Hz), 13,48 (bs, 1H). MS400(M-H).
[00350] Sloučenina měla IC50 0,59 μΜ na hT2Rl 4 receptorů hořkosti.
Příklad 5-2a: 47methoxybenzvl·(4-(N-(íuran-2-vlmethvl)-N-(4-methoxvbenzyί)sul famoyDbenzoáO:
|00351| Kyselina 4-(N-(furan-2-ylmethyl)sulfamoyl)benzoová (Příklad 5-2b) (500 mg, 1,8 mmol), p-methoxybenzylchlorid (624 mg, 4,0 mmol) a uhličitan česný (1,3 g, 4,0 mmol) se rozpustily v DMF (10 ml) a míchaly se při 80 C po dobu 1 hodiny. Směs se ochladila na teplotu okolí, zředila se H3O (200 ml) a extrahovala se ethylacetátem (3 x 100 ml). Spojené organické vrstvy se vysušily nad síranem sodným a koncentrovaly se na rotační odparce. Produkt se přečistil chromatografií na sílikagelu (15% ethylacetát v hexanech), což dalo 4methoxybenzyl-(4-(N-(furan-2-yImethyl)-N-(4-methoxybenzyl)-sulfamoyl)benzoát) (753 mg, 80%) jako čitý olej. 'H NMR (DMSO-d^, 400 MHz); δ 3,70 (s, 3H), 3,75 (s, 3H), 4,22 (s, 2H), 4,26 (s, 2H), 5,39 (s, 2H), 6,14 (d, 1H, >3,2 Hz), 6,25 (m, 1H), 6,87 (d, 2H, J—8,8 Hz), 6,97 (d, 2H, >8,8 Hz), 7,13 (d, 2H, >8,4 Hz), 7,39 (m, 1H), 7,43 (d, 2H, J=8,4 Hz), 7,91 (d, 2H, >8,4 Hz), 8,07 (d, 2H, >8,4 Hz).
Příklad 5-2b: Kyselina 4-(N-(furan-2-ylmethvl)sulfamo^
[00352] Kyselina 4-(chlorsulfonyl)benzoová (5,0 g, 22,7 mmol) se přidávala ve třech castech po dobu více než 10 minut do míchaného roztoku furfurylaminu (6,6 g, 68 mmol) v acetonu (200 ml) ochlazeného na 0 °C pomocí ledové lázně. Po přídavku sulfonylchloridu se reakce ukončila, ledová lázeň se odstranila a roztok se míchal po dobu 1 hodin při teplotě okolí. Směs se koncentrovala a podrobila se chromatografií na sílikagelu (90% ethylacetát, 8% hexany a 2% kyselina octová), což dalo 4,4 kyselinu 4-(N-(furan-2-ylmethyl)sulfamoyl)benzoovou (4,4 g, 68%) jako bílou pevnou látku. 'H NMR (DMSO-ds, 400 MHz): δ 4,04 (d, 2H, >6 Hz), 6,13 (d, 1H, >3,2 Hz), 6,25 (m, IH), 7,43 (m, 1H), 7,83 (d, 2H, >8,4 Hz), 8,05 (d, 2H, >8,4 Hz), 8,36 (t, 1H, >6 Hz), 13,4 (bs, 1H).
Příklad 5-3: Kyselina 4-(N-(4-ethoxybenzyI)-N-(furan-2-ylmethyl)sulfanioyl)benzoová
123
Mt
[0O353J 4-Kyano-N-(4-ethoxybenzyl)-N-(furan-2-ylmethyl)benzensulfonamid (Příklad 5-3a) (300 mg, 0,8 mmol) se míchal ve směsi 1/1 dioxanu/1,5 N vodného NaOH (100 ml) při 80 C po dobu 16 hodin. Směs se ochladila, okyselila IN vodnou HC1 (100 ml) a extrahovala se ethylacetátem (3x, 75 ml). Spojené organické extrakty se vysušily se nad síranem sodným, zfiltrovaly se a koncentrovaly se na rotační odparce. Pevná látka se třela s ethylacetátem/hexany (-1/9) a sebrala se filtrací, což dalo kyselinu 4-(N-(4-ethoxybenzyl)-N-(furan-2-ylmethyl)sulfamoyl)benzoovou (250 mg, 69 %) jako bílou pevnou látku. NMR (DMSO-d,, 400 MHz): δ 1,29 (t, >6,8 Hz, 3H), 3,97 (q, >6,4 Hz, 2H), 4,23 (s, 2H), 4,27 (s, 2H), 6,15 (d, >3,2 Hz, 1H), 6,27 (m, 1H), 6,84 (d, >8,8 Hz, 2H), 7,11 (d, >8,8 Hz, 2H), 7,39 (m, 1H), 7,87 (d, >8,4 Hz, 2H), 8,00 (d, >8,4 Hz, 2H).
[00354] Sloučenina měla 1C5O 3,0 μΜ na hT2R14 receptorů hořkosti.
Příklad 5-3a: 4-kyano-N-(4-ethoxVbenzyl)-N-(^^
[00355] 4-Kyanobenzen-l-sulfonylchlond (600 mg, 2,9 mmol) se přidal do míchaného roztoku N-(4-ethoxybenzyl)-l-(furan-2-yl)mcthanaminu (Příklad 5-3b) (685 mg, 2,9 mmol) a triethlyaminu (455 mg, 4,5 mmol) v DCM (100 ml) a reakční směs se míchala po dobu 2 hodin. Reakční směs se zředila H2O (200ml) a extrahovala se DCM (3x, 75 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným, zftltrovaly se a koncentrovaly se na rotační odparce. Zbytek se přečistil chromatografií na silikagelu (10% ethylacetát v hexanech), což dalo 4-kyano-N-(4-ethoxybenzyl)-N-(fiiran-2-ylmethyl)benzensulfonamid (665 mg, 68 %) jako ne zcela bílou pevnou látku. NMR (DMSO-de, 400 MHz): δ 1,29 (t, >7,2 Hz, 3H), 3,97 (q, >6,8 Hz, 2H), 4,23 (s, 2H), 4,27 (s, 2H), 6,15 (d, >3,2 Hz, 1H), 6,27 (m, 1H), 6,84(d,>8,8 Hz, 2H), 7,11 (d,>8,8 Hz, 2H), 7,39(m, 1H), 7,92 (d, >8,4 Hz 2H), 8,03(d,>8,4 Hz, 2H).
124
Příklad 5-3b: 4 N-(4-ethoxybenzvl)-l-(furan-2-yl)methanamin:
[00356} 4-Ethoxybenzaldehyd (5 g, 33 mmol) a furfurylamin (4,2 g, 43 mmol) ve směsi methanolu (50 ml), trimethylorthoformiát (10 ml) a AcOH (1 ml) se smíchaly při teplotě místnosti pod atmosférou dusíku po dobu 16 hodin. Borhydrid sodný (1,4 g, 35 mmol) se přidával ve 4 dílech po dobu více než 30 minut (exotermická reakce). Reakční směs se míchala po dobu dalších 2 hodin při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odstranilo za vakua a zbytek se sebral do ethylacetátu (150 ml). Organická fáze se promyla H2O (200 ml) a vodná fáze se zpět extrahovala ethylacetátem (2x, 100 ml). Spojené organické vrstvy se koncentrovaly a zbytek se přečistil na silikagelu (70% ethylacetát v hexanech s -0,5 % triethylaminem), což dalo N-(4-ethoxybenzyl)-l-(furan-2-yl)methanamin (6,1 g, 80 %) jako čirý olej. NMR (CDC13, 400 MHz): δ 1,40 (t, 7=7,2 Hz, 3H), 3,71 (s, 2H), 3,76 (s, 2H), 4,02 (q, 7=7,2 Hz, 2H), 6,17 (d, 7=4 Hz, 1H), 6,31 (m, 1H), 6,84 (d, 7=8,8 Hz, 2H), 7,23 (d, 7=8,8 Hz, 2H), 7,36 (m, 1H).
Příklad 5-4: Kyselina 4-(N-ethyl-N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benzoová
5-4
100357} Kyselina 4-(N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benzoová (Příklad 5-lb) (160 mg, 0,5 mmol) a uhličitan česný (325 mg, 1 mmol) se umístily do mikrovlnné zkumavky a rozpustily se v 2 ml DMF. Do reakční směsi se přidal ethyljodíd (155 mg, 1 mmol). Reakční směs se umístila do mikrovlnného reaktoru a zahřívala se při 165 °C po dobu 5 minut. Reakční směs se rozpustila v ethylacetátu a promyla se vodou. Organická vrstva se vysušila nad síranem sodným a odpařila se za vakua. Surový produkt se rozpustil ve směsi 4/1 vodného roztoku 6N NaOH/tetrahydrofuranu (3 ml) a míchal se při teplotě okolí po dobu 6 hodin. Roztok se okyselil vodnou 3N HC1 na pH -3 a produkt se extrahoval ethylacetátem (3x, 75 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným a koncentrovaly se za vakua. Zbytek se sebral do methanolu (3 ml) a přečistil se pomocí reverzní fázové HPLC (5-95 % acetonitril v H2O gradient: 25 minut). U sloučeniny bylo známo, že inhibuje hT2R14 s IC50 20 μΜ. Výtěžek 35%. MS M+H vypočteno 350,11, nalezeno 350,0.
125
[00358] Sloučenina měla ICjo 10 μΜ na hT2R 14 receptorů hořkosti.
Příklad 5-5: Kyselina ^N-benzyl-N-(furan-2-yImethyl)suIto
100359] Kyselina 4-(N-(fúran-2-ylmethyl)sulfamoyl)benzoová (Příklad 5-2b> (140 mg, 0,5 mmol) a uhličitan česný (325 mg, 1 mmol) se umístily do mikrovlnné zkumavky a rozpustily se v 2 ml DME (Brommethyl)benzen (170 mg, 1 mmol) se přidal do reakční směsi. Reakční směs se umístila do mikrovlnného reaktoru a zahřívala se ph 165 °C po dobu 5 minut. Reakční směs se rozpustila v ethylacetátu a promyla se vodou. Organická vrstva se vysušila nad síranem sodným a odpařila se za vakua. Surový produkt se rozpustil ve směsi 4/1 vodného roztoku 6N NaOH/tetrahydrofuran (3 ml) a míchal se při teplotě okolí po dobu 6 hodin. Roztok se okyselil vodnou 3N HC1 na pH 3 a produkt se extrahoval ethylacetátem (3x, 75 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným a koncentrovaly se za vakua. Zbytek se sebral do methanolu (3 ml) a přečistil se pomocí reverzní fázové HPLC (5-95 % acetonitril v H2O gradient: 25 minut). Výtěžek 35 %. MS M+H vypočteno 372,4, nalezeno 372,0.
[00360] Sloučenina měla IC50 4,6 μΜ na hT2R14 receptorů hořkosti.
Přiklad 5-6: Kyselin, HN-(ta.n-2-ylmdhylW3^^^
5-6
1003611 Připravená jak v Přikladu 5-5 z nbronmeíhylj-S.me.hoxybenzenu a kyseliny 4. -<N-(furan-2-ylmelhyl)sulfamoyl)benzoové (Příklad 5-2b). Výréžek 35 %. MS M+H vypočteno 402,3, nalezeno 402,0.
[00362] Sloučenina měla IC50 10 μΜ na hT2R14 receptorů hořkosti.
Příklad 5-7: Kyselina 4riN-(fiiran-2-ylmethyl)-N-(2-methoxybenzy^^
[00363] Připravená jak v Příkladu 5-5 z l-(brommethyl)-2-methoxybenzenu a kyseliny 4-(N-(furan-2-ylmethyl)sulfamoyl)benzoové (Příklad 5-2b). Výtěžek 35%. MS M+H vypočteno 402,3, nalezeno 402,0.
]00364] Sloučenina měla IC5012 μΜ na hT2R14 receptorů hořkosti.
Příklad 5-8: Kyselina 4-(N-(4.propoxybenzyl)-N-(fUran-2-ylmethyl)su]famoyl)benzoová
1003651 4-Kyano-N-(4-propoxybenzyl)-N-(furan-2-ylmethyl)benzensulfonamid (Příklad 5—8a) (300 mg, 0,8 mmol) se míchal ve 1/1 směsi dioxanu/1,5 N vodného NaOH (100 ml) při 80 C po dobu 16 hodin. Směs se ochladila, okyselila IN vodnou HC1 (100 ml) a extrahovala se ethylacetátem (3x, 75 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným, zfiltrovaly se a koncentrovaly se na rotační odparce. Pevná látka se třela s ethylacetátem/hexany (-1/9) a sebrala se filtrací, což dalo kyselinu 4-(N-(4-propoxybenzyl)-N-(furan-2-ylmethyl)sulfamoyl)benzoovou (165 mg, 63 %) jako bílou pevnou látku. NMR (DMSO-dí, 400 MHz): δ 0,94 (t, Jdfi Hz, 3H), 1,70 (m, >6,8 Hz, 2H), 3,87 (t, >6,4 Hz, 2H), 4,23 (s, 2H), 4,27 (s, 2H), 6,13 (d, >2,8 Hz, 1H), 6,27 (m, 1H), 6,84 (d, >6,8 Hz, 2H), 7,11 (d, >8,8 Hz, 2H), 7,39 (m, 1H), 7,87 (d, >6,8 Hz, 2H), 8,05 (d, >6,8 Hz, 2H) 13 45 (bs, IH).
[00366] Sloučenina měla 1C5O 2,5 μΜ na hT2R14 receptorů hořkosti.
Γ * · r C ť r * ♦ · Λ C <· ® a P p r
127
Přiklad 5-8a: 4-kYano-N-(4-propoxvbenzvl)-N-(furan.2-vlmeth¥l)-benzensiilfonamid;
Í00367J 4-Kyanobenzen-l-sulfonylchlorid (600 mg, 2.9 mmol) se přidal do míchaného roztoku N-(4-propoxybenzyl)-l-(furan-2-yl)methanaminu (Příklad 5-8b) (685 mg, 2,9 mmol) a triethlyaminu (455 mg, 4,5 mmol) v DCM (100 ml) a reakční směs se míchala po dobu 2 hodin. Reakční směs se zředila H2O (200 ml) a extrahovala se DCM (3x, 75 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným, zfiltrovaly se a koncentrovaly se na rotační odparce. Zbytek se přečistil chromatografii na silikagelu (10% ethylacetátem v hexanech), což dalo 4-kyano-N-(4-propoxybenzyl)-N-(furan-2-ylmethyl)-benzensulfonamid (500 mg, 50 %) jako ne zcela bílou pevnou látku. NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 0,95 (t, J-7,2 Hz, 3H), 1,70 (m, >6,4 Hz, 2H), 3,88 (t, >6,4 Hz, 2H), 4,25 (s, 2H), 4,28 (s, 2H), 6,15 (d, >3,2 Hz, 1H), 6,27 (m, 1H), 6,84 (d, >6,8 Hz, 2H), 7,11 (d, >8,8 Hz, 2H), 7,39 (m, 1H), 7,93 (d, >6,4 Hz, 2H), 8,01 (d, >6,4 Hz, 2H).
Příklad 5-8b : 4N-(4-propoxvbenzyl)-l-(furan-2-vbmethanamin:
100368] 4-Propoxybenzaldehyd (5 g, 31 mmol) a furíuiylamin (3,9 g, 40 mmol) ve směsi methanolu (50 ml), trimethylorthoformiátu (10 ml) a AcOH (-1 ml) se míchaly při teplotě místnosti pod atmosférou dusíku po dobu 16 hodin. Borhydrid sodný (1,4 g, 35 mmol) se přidával ve 4 dílech po dobu více než 30 minut (exotermická reakce). Reakční směs se míchala po dobu dalších 2 hodin při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odstranilo na rotační odparce a zbytek se sebral do ethylacetátu (150 ml). Organická fáze se promyla H,0 (200 ml) a vodná fáze se zpětně extrahovala ethylacetátem (2x, 100 ml). Spojené organické vrstvy se koncentrovaly a zbytek se přečistil na silikagelu (70 % ethylacetát v hexanech s ~2% tnethylanunm), což dalo N-(4-propoxybenzyl)-l-(furan-2-yl)methanamin (5,3 g, 75 %) jako žlutý olej. NMR (CDC13, 400 MHz): δ 1,03 (t, J=7,2 Hz, 3H), 1,79 (m, >6,4 Hz, 2H), 3,71 (s, 2H), 3,76 (s, 2H), 3,90 (t, >6,8 Hz, 2H), 6,17 (d, >3,2 Hz, 1H), 6,32 (m, 1H), 6,85 (d, >8,4 Hz, 2H), 7,22 (d, >8,8 Hz, 2H), 7,37 (m, 1H).
|00369| Další sloučeniny se testovaly v pokusech a zjistilo se, že mají relativně velkou mini účinnosti jako inhibitory hT2R14 receptoru hořkosti. Výsledky těchto testů jsou ukázány v Tabulce B.
128
Tabulka Β
Příklad 5-10; Kyselina 4-(N-(4-nuorbenzyl)-N-(4-metlioxybcnzyl)Sulfamoyl)benzoová
[00370] Methyl-(4-(N-(4-fluorbenzyl)-N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benzoát) (Příklad 5-10a) (3,7 g, 8,3 mmol) se rozpustil v MeOH/THF (1:1.5, 30 ml) a nechal reagovat s vodným NaOH (3 N, 15 ml). Směs se míchala při teplotě okolí přes noc, pak se ve vakuu odstranily MeOH a THE Výsledný vodný roztok se okyselil vodnou 6 N HC1 na pH -3 a extrahoval se EtOAc (3 x 40 ml). Spojené organické vrstvy se promyly se vodou a solankou, vysušily se nad Na2SO4 a koncentrovaly se. Surový produkt se přečistil překrystalováním z EtOH, což dalo čistou kyselinu 4-(N-(4-fIuorbenzyl)-N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyljbenzoovou jako bílou krystalickou pevnou látku (2,1 g, 58,6%). MS (M-H, 428,1)· Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3,66 (s, 3H), 4,23 (s, 2H), 4,26 (s, 2H), 6,72 (d, 2H J=8 Hz), 6,95 (m, 6H), 7,92 (d, 2H J=8 Hz), 8,07(d, 2H, J=8 Hz). Sloučenina milá IC50 1,97 μΜ na hT2R14 receptoru horkosti.
129
Příklad 5-IOa: Methvl-(4-(N-(4-fluorbenzvl)-N-(4-methoxvbenzvl>-sulfamovl)benzoát)
[00371| Methyl-(4-(N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benzoát) (Příklad 5-10b) (4,3 g, 12,8 mmol) se rozpustil v acetonu (70 ml). Přidal se uhličitan česný (8,57g, 25,6 mmol) a (4-fluorbenzylbromid (1,76 ml, 14,08 mmol) a směs se míchala při teplotě místnosti přes noc. Anorganické solí se odfiltrovaly a aceton se odstranil ve vakuu. Zbytek se znovu rozpustil v ethylacetátu, promylu se vodou a solankou, pak se organická vrstva vysušila nad síranem hořečnatým a koncentrovala se. Surový produkt se přečistil překrystalováním s ethylacetátem/ hexany, což dalo čistý methyl-(4-(N-(4-fluorbenzyl)-N-(4-methoxybenzyl)-sulfamoyl)benzoát (3,7 g, 65 %) jako bílou pevnou látku. Ή NMR (400MHz, CDC13): 5, ppm: 3,77 (s, 3H), 3,98 (s, 3H), 4,27 (s, 2H), 4,28(s, 2H), 6,74 (d, 2H, J=8 Hz), 6,92 (m, 4H), 7,03(m, 2H), 7,88 (d, 2HJ=8Hz), 8,16(d,2H, J=8 Hz).
Příklad 5-lQb: Methyl-(4-(N-(4-methoxybenzvl)sulfamoyl)benzoát).
[00372) Do roztoku methyl-(4-(chlorsulfonyl)benzoátu) (Příklad 5-10c) (4 g, 17,09 mmol) v dichlormethanu (40 ml) při 0 °C v ledové lázni se přidal (4-methoxyfenyl)methanamin (2,56 ml, 19,65 mmol) a triethylamin (2,38 ml, 17,1 mmol). Ledová lázeň se pak odstranila a směs se ponechala ohřát na teplotu okolí za současného míchání po dobu dalších 2 hodin. Po dokončení (monitorováno pomocí TLC 40 % ethylacetáChexany) se ve vakuu odstranilo rozpouštědlo. Zbytek se znovu rozpustil v ethylacetátu (200 ml), promyl se vodnou IN HC1 (20 ml), vodou (20 ml) a solankou (20 ml), pak se vysušil nad síranem hořečnatým. Roztok se koncentroval a produkt se přečistil pomocí překrystalování s horkým ethylacetátem/hexanech, coz dalo čistý methyl-(4-(N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benzoát) (4,3 g, 74,8 %) jako bílou pevnou látku. Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): 8, ppm: 3,67 (s, 3H), 3,78 (s, 3H), 3,93 (s, 2H), 6,78 (m, 2H), 7,09 (m, 2H), 7,87(m, 2H), 8,08 (m, 2H), 8,25(br, s, 1H).
Příklad 5-10c: Methyl-(4-(chlorsulfonvDbenzoátl
[00373] Kyselina 4-chlorsulfonylbenzoová (5 g, 23 mmol) a thionylchlorid (20 ml) v dichlorethanu (10 ml) se zahřívaly na 80 °C po dobu 2 hodin. Reakční směs se koncentrovala pomoci rotační odparky, což dalo nahnědlou pevnou látku. Tato pevná látka se chladila na ledu po dobu 5 minut a za stálého míchání se přidával ledově studený methanol (40 ml) při 0 °C po dobu 5 minut. Reakční směs se ponechala ohřát na teplotu okolí a míchala se dalších 10 min. Přídavek ledové vody (40 ml) dal vzniku bílé pevné látky, která se odfiltrovala a
130 vysušila se za vakua, což dalo čistý methyl-(4-(chloreulfonyl)benzoát) (4,5 g, 84 %). Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3,84 (s, 3H), 7,70 (d, 2H, J=8,4Hz), 7,93 (d, 2H, J=8,4Hz).
Přiklad 5-11: Kyselina 4-((N-benzyl-4-methylfenylsulfonamido)methyl)cykiohexankarboxylová
[00374] Do suspenze kyseliny 4-(ammomethyl)cyklohexankarboxylové (1,57 g, 10 mmol) v 100 ml 2,2-dimethoxypropanu se přidala HC1 (10 ml, 36% vodný roztok). Směs se míchala při teplotě okolí po dobu 18 hod. a pak se koncentrovala. Zbytek se rozpustil v minimálním objemu MeOH a přidal se diethylether, aby se vysrážela HC1 sůl methyl-(4-(aminomethyl)cyklohexankarboxylátu) jako ne zcela bílá pevná látka. Tento material se použil bez dalšího přečištění nebo charakterizace, |00375] Do směsi HC1 soli methyl-(4-(aminomethyl)cyklohexankarboxylátu) (208 mg, 1 mmol) v 5 ml dichlormethanu při 0 °C v ledové lázni se přidal triethylamin (360 μΐ, 2,58 mmol) a 4-methylbenzen-l-sulfonylchlorid (190 mg, 1 mmol). Ledová lázeň se ponechala pomalu ohřívat přes noc na teplotu okolí za stálého míchání. Rozpouštědlo se odstranilo ve vakuu. Zbytek se znovu rozpustil v ethylacetátu (20 ml), promyl se IN HC1 (5 ml), vodou (5 ml) a solankou (5 ml), pak se vysušil nad síranem horečnatým a koncentroval se. Tento surový produkt (I62mg, 0,5mmol) ze znovu rozpustil v acetonu (5ml) a ponechal se reagovat s uhličitanem draselným (110 mg, 0,79 mmol) a (4-fluorfenyl)methanaminem (1,76 ml, 14,08 mmol). Směs se míchala v tlakové nádobě při 80 °C přes noc, pak se ochladila a anorganická sůl se odfiltrovala. Aceton se odstranil ve vakuu a zbytek se znovu rozpustil v ethylacetátu a promylu se vodou a následně solankou. Organická vrstva se vysušila nad síranem hořečnatým a koncentrovala se. Surový produkt (162 mg, 0,4 mmol) se rozpustil v MeOH/THF (1:1,5, 10 ml) a ponechal se reagovat s vodným NaOH (ION, 400 μΐ). Směs se míchala při 100 °C po dobu 20 min. v mikrovlnné
131 troubě a pak se ve vakuu odstranily MeOH a THE Zbytek se okyselil 6 N vodnou HC1 na pH ~3 a extrahoval se EtOAc; spojené organické vrstvy se promyly vodou a solankou, vysušily se nad Na^SOí a koncentrovaly se. Surový produkt se přečistil překrystalováním z EtOH, což dalo čistou kyselinu 4-((N-benzyl^methylfenyl-sulfonamido)methyl)cyklohexankarboxylovou jako bílou pevnou látku (120 mg, 74%). MS (M+H, 402); Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 0,68 (m, 2H)), 0,91 (m, 2H), 1,06 (br, s, 1H), 1,50 (d, 2H), l,72(d, 2H), 2,O(1H), 2,41 (s, 3H), 2,86 (m, 2H), 4,21(s, 2H), 7,30(m, 5H), 7,43(m, 2H), 7,73(m, 2H), ll,97(br, s, 1H).
100376] Sloučenina měla IC5o 0,014 μΜ na hT2R 14 receptorů hořkosti.
Příklad 5-12: Kyselina 4-(N-(3-fluorbenzyl)-N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)bcnzoová
O-
[00377] Methyl-(4-(N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benzoát) (Příklad 5-10b) (500 mg, 1,49 mmol), 3-fluorbenzylbromid (280 mg, 2,98 mmol) a uhličitan česný (971 mg, 2,98 mmol) se daly do DMF (12 ml) a míchaly se při 90 °C po dobu 4 hodin. Roztok, ochlazený na teplotu okolí, se zředil HjO (200 ml) a extrahoval se ethylacetátem (3x, 100 ml). Spojené organické vrstvy se vysušily nad MgSOí, zfiltrovaly se a koncentrovaly se za vakua. Zbytek se přečistil chromatografií na silikagelu (10-20 % ethylacetát v hexanu), což dalo methyl-(4-(N-(3-fluorbenzyl)-N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benzoát) (528 mg, 80 %) jako bílou pevnou látku, |00378| Methyl-(4-(N-(3-fluorbenzyl)-N-(4-meihoxybenzyl)sulfamoyl)benzoát) (500 mg, 1,12 mmol) se rozpustil v MeOH/THF (1:1, 40 ml) a nechal se působit vodný roztok NaOH (10 N, 8 ml). Směs se míchala při teplotě okolí přes noc, pak se pomocí rotační odparky odstranily MeOH a THE Výsledný vodný roztok se promylu EtOAc (10 ml) a okyselil se vodnou 6 N HC1 (-15 ml) na pH -4. Vodný roztok se extrahoval EtOAc (3x, 40 ml) a spojené organické vrstvy se promyly, solankou, vysušily se nad MgSO4 a koncentrovaly se. Surový produkt se přečistil překrystalováním z EtOH, což dalo titulní sloučeninu kyselinu 4-(N-(3
132
-fluorbenzyl)-N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benzoovou jako bílou krystalickou pevnou látku (150 mg) v 30% výtěžku.
[00379] MS (M-H, 428.1); Ή NMR (400MHz, DMSO-dó): δ, ppm: 3,65 (S, 3H), 4,27 (S, 2H), 4,29 (s, 2H), 6,75-7,00 (m, 7H), 7.20 (m,!H), 7,95 (d, 2H, J= 8 Hz); 8,10 (d, 2H, J= 8 Hz).
Příklad 5-13: Kyselina 4-(N-benzyl-N-(2,4-dimethoxybenzyl)sulfamoyl)benzo<»vá
[00380] Připravená jak v Příkladu 5-10 z (2,4-dimethoxyfenyl)methanaminu, methyl-(4-(chlorsulfonyl)benzoátu) (Příklad 5-10c) a benzylbromidu. MS (Μ - H, 440,10); Ή NMR (400MHz, DMSO-dó): δ, ppm: 3,5O(s, 63H), 3,66(s, 3H), 4,20(s, 2H), 4,34(s, 2H), 6,29(s, 1H), 6,33(d, J=8,0Hz, 1H), 6,91(d, J=8,8Hz, 1H), 7,12-7,23 (m, 5H), 7,80(d, J = 8,0 Hz, 2H), 8,01 (d, J=8,4Hz, 2H), 13,49(s, 1H).
Příklad 5-14: Kyselina 4-(N-(3-chlorbenzyl)-N-(4-methoxybenzyl)sulfainoyl)benzoová
[00381] Připravená jak v Příkladu 5-10 z methyl-(4-(N-(4-rnethoxy-benzyl)sulfamoyl)benzoátu) (Příklad 5-10b) a 1-(brommethyl)-3-chlorbenzenu. MS (M-H, 444,1); Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3,69 (s, 3H), 4,30 (m, 4H), 6,76-7,24 (m, 8H), 7,99 (m, 2H), 8,13 (m,2H).
133
[00382] Sloučenina měla IC50 1,88 μΜ na hT2R14 receptoru hořkosti.
Příklad 5-15: Kyselina 4-(N-benzyl-N-(2,4,6-triinethoxybenzyl)suIfanioyl)beii2oová
[00383] Připravená jak v Příkladu 5-10 z (2,4,6-trimethoxyfenyl)-methanaminu, methyl*(4-(chlorsulfonyl)benzoátu) (Příklad 5-10c) a benzylbromidu. MS (Μ - H, 470,10); Ή NMR (400MHz, DMS0-d6): δ, ppm: 3,45(s, 6H), 3,69(s, 3H), 4,26(s, 2H), 4,28(s, 2H), 5,98(s, 2H), 7,ll-7,26(m, 5H), 7,82(d, J=8,0Hz, 2H), 8,07(d, J = 8 Hz, 2H), 13,49(s, 1H), Elementární analýza (nalezeno, %): C 61,05; H 5,49; N 2,98; (vypočteno, %); C61.13; H 5,34 a N 2,97
100384] Sloučenina měla IC50 10,76 μΜ na hT2R14 receptoru hořkosti.
Příklad 5-16: Kyselina 4-((N-benzyl-N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)metiiyl)benzoová
[00385] Připravená jak v Příkladu 5-10 z methyl-(4-(N-(4-methoxybenzyl)Sulfamoyl)benzoát) (Příklad 5-10b) a benzylbromid. MS (M-H, 424,1); Ή NMR (400MHz, DMS0-d6): δ, ppm: 3,72 (s, 3H), 4,18 (d, 2H), 4,55 (s, 2H), 6,83 (m, 2H), 7,12 (m, 2H), 7,21 (m, 2H), 7,28 (m, 3H), 7,43 (m, 2H), 7,93 (m, 2H).
134
Příklad 5-17: Kyselina 4-(N-(4-methoxybenzyl)-N-pr(>pylsulfamoyl)benzoová
100386] Připravená jak v Příkladu 5-10 z methyl-(4-(N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benzoátu) (Příklad 5-10b) a n-propylbromidu. MS (M-H, 362,1); Ή NMR (400MHz, CDC13): S, ppm: 0,70 (m, 3H), 1,35 (m, 3H), 3,08 (m, 2H), 3,73 (s, 3H), 4,31 (s, 2H), 6,83 (m, 2H), 7,17 (m, 2H), 7,93 (m, 2H), 8,23 (m, 2H).
[00387| Sloučenina měla IC50 3,75 μΜ na hT2R 14 receptorů hořkosti.
Příklad 5-18: Kyselina 4-(N-(4-methoxybenzyl)-N-fenylsulfamoyl)beiizoová
(00388| Připravena jak v Příkladu 5-10 z anilinu, methyl-(4-(chlorsulfonyl)benzoátu) (Příklad 5-10c) a l-(chlormethyl)-4-methoxybenzenu. MS (Μ - H, 396,1); Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3,66(s, 3H), 4,73(s, 2H), 6,78(d, J=8,4Hz, 2H), 7,00(d, J-7,6Hz, 2H), 7,12(d, J=8,0Hz, 2H), 7,24(d, J=8,0Hz, 2H), 8,1 l(d, J=8,4Hz, 2H), 13,49(s, 1H).
Příklad 5-19: Kyselina 4-(N-(4-methoxybenzyl)-N-fenethyIsulfamoy|)benzoová
135
[00389] Připravená jak v Příkladu 5-10 z 2-fenylethanaminu, methyl-(4-(chlorsulfonyl)benzoátu) (Příklad 5-10c) a l-(chlormethyl)-4-methoxybenzenu. MS (M-H, 424,1); Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 2,51 (m, 2H), 3,23 (m, 2H), 3,74 (s, 3H), 4,31 (s, 2H), 4,31 (s, 2H), 6,92 (m, 2H), 6,98 (m, 2H), 7,20-7,27 (m, 5H), 7,85 (m, 2H), 8,06 (m, 2H).
]00390] Sloučenina měla IC50 4,58 μΜ na hT2R14 receptorů hořkosti.
Příklad 5-20: Kyselina 4-((N-(4-fluorbenzyl)-4-methylfenylsulfonamido)methyl)cyklohexan kar boxy lová
100391] Připravená jak v Příkladu 5-11 z l-(brommethyl)-4-íluorbenzenu, kyseliny 4-(arninomethyl)cyklohexankarboxylové a 4-methylbenzen-l-sulfonylchloridu. MS (M+H, 420); Ή NMR (400MHz, DMSO-dó): δ, ppm: 0,71 (m, 2H)), 0,95 (m, 2H), 1,15 (br, s, 1H), 1,51 (d, 2H), l,76(d, 2H), 2,0(lH), 2,40 (s, 3H), 2,85 (m, 2H), 4,22(s, 2H), 7,14(m, 2H), 7,32(m, 2H), 7,40(m, 2H), 7,69(m, 2H), 1 l,93(br, s, 1H).
[00392] Sloučenina měla IC50 0,083 μΜ na hT2R14 receptorů hořkosti.
136
Příklad 5-21: Kyselina 4-((4-acetamido-N-benzylfenyIsulfonainido)methyl)-cyklohexankarboxylová
[00393] Připravená jak v Příkladu 5-11 z acetamidobenzen-l-sulfonylchloridu, kyseliny 4-(ammomethyl)cyklohexankarboxylové a benzylbromidu. MS (M+H, 445,2); Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): 5, ppm: 0,65 (m, 2H), 0,68 (m, 2H), 1,05 (m, 1H), 1,48 (m, 2H), 1,70 (m, 2H), 1,92 (m, 1H), 2,00 (s, 3H), 2,82 (s, 2H), 4,21 (s, 2H), 7,27 (m, 5H), 7,76(m, 4H), 7,62(m, 2H), 10,l(s, 1H), 1 l,93(br, s, 1H).
[00394] Sloučenina měla IC5q 1,619 μΜ na hT2R14 receptorů hořkosti.
Příklad 5-22: Kyselina 4-((N-(4-fluorbenzyl)fenylsulfonamido)methyl)cyklohexankarboxylová
|00395| Připravená jak v Příkladu 5-11 z benzensulfonylchloridu, kyseliny 4-(aminomethyl)cyklohexankarboxylové a l-(brommethyl)-4-fluorbenzenu. MS (M+H, 406); Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): 5, ppm: 0,77 (m, 2H), 0,94 (m, 2H), 0,98 (m, 2H), 1,50 (m, 2H0, 1,75 (m, 2H), 1,77 (m, 1H), 2,80 (d, 2H), 4,28 (s, 2H), 7,20 (m, 2H), 7,38(m, 2H), 7,62(m, 2H), 7,70(m, 1H), 7,88(m, 2H), 1 l,93(br, s, 1H).
137
[0O396J Sloučenina měla IC50 0,240 μΜ na hT2R14 receptoru hořkosti.
Příklad 5-23: Kyselina 4-(N-(cykIohexylniethyl)-N-(4-niethoxybenzyl)sulfamoyl)benzoová
[00397] Připravená jak v Příkladu 5-10 z methyl-(4-(N-(4-methoxybenzyl)Sulfamoyl)benzoátu) (Příklad 5-10b) a cyklohexylmethanaminu. MS (M-H, 416,1); Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 0,63 (m, 2H), 0,87 (m, 3H), 0,94 (m, 1H), 1,25-1,52 (m, 5H), 1,70 (m, 2H), 2,86 (m, 2H), 3,70 (s, 3H), 4,22 (s, 2H), 6,84 (m, 2H), 7,16 (m, 2H), 7,9I(m, 2H), 7,62(m, 2H), 8,09(m, 2H).
[00398] Sloučenina měla IC50 3,47 μΜ na hT2R14 receptoru hořkosti.
Příklad 5-24: Kyselina 4-((N-(4-nuorbenzyl)-l-fenylmethylsulfonamido)methyl)cyklohexankarboxylová
[003991 Připravená jak v Příkladu 5-10 z fenylmethanesulfonylchloridu a methyl-(4-(aminomethyl)cyklohexankarboxylátu) a l-(brommethyl)-4-fluor-benzenu. MS(M-H, 418); 'H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 0,639 (m, 2H), 0,897 (m, 2H), 1,034 (m, 1H), 1,467 (d, široký, 2H, J= 11,2Hz), 1,709 (d, Široký, 2H, J=ll,2Hz), 1,961 (m, 1H), 2,828 (d, 2H, J=7,6Hz), 4,207(s, 2H), 4,449 (s, 2H), 7,155 (t, 2H, J=9,2Hz), 7,377 (m, 7H), 12 (s, široký, 1H)
[00400} Sloučenina měla IC50 9,57 μΜ na hT2R14 receptorů hořkosti.
Přiklad 5-25: Kyselina 4-(N-(2-kyanobeiizyl)-N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl) benzoová (00401} Připravená jak v Příkladu 5-10 z methyl-(4-(N-(4-methoxybenzyl)-sulfamoyl)benzoátu) (Příklad 5-10b) a alpha-brom-o-tolunitrilu. MS(M-H, 435,1); ‘H NMR (400MHz, DMSO-d6): S, ppm: 3,664 (s, 2H), 4,348 (s, 2H), 4,498 (s, 2H), 6,728 (d, 2H, J= 8,4 Hz), 7,036 (d, 2H, j= 8,4 Hz), 7,352 (t, 2H, J=9,2Hz), 7,548 (t, 1H, J=7,6Hz), 7,640 (d, 1H, J= 7,6 Hz), 8,003 (d, 2H, J=8 Hz), 8,139 (d, 2H, J= 8,4Hz), 13,559 (s, široký, 1H).
(00402) Sloučenina měla 1C5O 4,61 μΜ na hT2R 14 receptorů hořkosti.
Přiklad 5-26; Kyselina 4-(N-(4-acetamidobenzyl)-N-(4-metlioxybenzyl)sulfanioyl) benzoová
[00403] Připravená jak v Příkladu 5-10 z methyl-(4-(N-(4-methoxy-benzyl)sulfamoyi)benzoátu) (Příklad 5-10b) a N-(4-(chlormethyl)fenyl-)acetamidu. MS (M-H, 467,1); ’h NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 2,0(s, 3H), 3,69s, 3H), 4,23(s, 4H), 6,78(d, 2H, J=7,6Hz), 6,98(m, 4H), 7,4l(d, 2H, J=8Hz), 7,94(d, 2H, J=8Hz), 8,09(d, 2H, J=8Hz), 9,90(s, 1H).
139
Příklad 5-27: Kyselina 4-(N-(furan-3-ylmethyl)-N-(4-methoxybenzyl)sulfainoyl> benzoová
[00404| 110 mg l-(furan-3-yl)-N-(4-methoxybenzyl)methanaminu (Příklad 5-27a) se smíchalo s methyl-(4-(chlorsulfonyl)benzoátem) (Příklad 5-10c) (117 mg, 0,5 mmol) a triethylaminem (100 μΐ) v DCM (5 ml). Směs se míchala přes noc při teplotě okolí a koncentrovala se. Zbytek se znovu rozpustil v ethylacetátu (20 ml), promyl se IN HC1 (vodnou, 2 ml), následována vodou (5 ml) a solankou (5 ml), pak se vysušila nad síranem hořečnatým. Surový produkt se přečistil preparativní TLC (40 % ethylacetát/hexany), což dalo methyl-(4-(N-(fiiran-3-ylmethyl)-N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benzoát) jako bílou pevnou látku. Saponifikace jako v Příkladu 5-10 dala kyselinu 4-(N-(furan-3-ylmethyl)-N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benzoovou jako bílou krystalickou pevnou látku (68 mg, 64% výtěžek). MS (M-H, 400,1); 'H NMR (400MHz, DMSO-d6): 8, ppm; 3,72(s, 3H), 4,13(s, 2H), 4,26(s, 2H), 5,99 (s, 1H), 6,87 (m, 4H), 6,87 (d, 2H, J=8,8Hz), 7,13 (d, 2H, J=8,8Hz), 7,39 (s, 1H), 7,49 (s, 1H), 7,95 (d, 2H, J=8,4Hz), 8,09 (d, 2H, J=8,8Hz).
Příklad 5-27a: l-(furan-3-yl)-N-(4-methoxybenzyl)methanamin
[00405| Směs 3-furaldehydu (5 mmol, 437 μΐ) a (4-methoxyfenyl)methan-aminu v MeOH (20 ml) se míchala při teplotě okolí přes noc, pak se pomalu přidával borhydrid sodný (300 mg, 7,89 mmol). Výsledná směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 15 minut a ukončila pomocí NaOH (1 N, vodný). Methanol se odstranil ve vakuu a výsledná suspenze se znovu rozpustila v ethylacetátu, pak se promyla se vodou, solankou, vysušila se nad síranem sodným a koncentrovala se. Přečištění chromatografii na silikagelu (ethylacetát: hexany 7:3) dalo l-(furan-3-yl)-N-(4-methoxybenzyl)methanamin jako olej. MS (M+H, 218,10); 'H NMR (400MHz, CDC13): δ, ppm: 3,64(s, 2H), 3,74(s, 2H), 3,80(s, 3H), 6,39(m, 1H), 6,86(m, 1H), 6,88(m, 1H), 7,23(m, 1H), 7,25(m, 1H), 7,35(m, 1H), 7,38(m, 1H).
140
Příklad 5-28: Kyselina 4-(N,N-dibenzylsulfamoyl)benzoová
100406] Připravená jak v Příkladu 5-27 z dibenzylaminu a methyl-(4-(chlorsulfonyl)bcnzoátu) (Příklad 5-10c). MS (M-H, 380,1); Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 4,52 (s, 4H), 7,10 (m, 4H), 7,25 (m, 6H), 8,00 (d, 2H, >8,4 Hz), 8,15 (d, 2H >8,4 Hz), 13,5 (s, široký, 1H).
[00407] Sloučenina měla IC50 7,74 μΜ na hT2R14 receptoru hořkosti.
Příklad 5-29: Kyselina 4-(N-(4-methoxybenzyl)-N-methylsulfamoyi)benzoová
100408] Připravená jak v Příkladu 5-27 z l-(4-methoxyfenyl)-N-methyl-methanaminu a methyl-(4-(chlorsulfonyl)benzoátu) (Příklad 5-10c). MS (M-H, 335.1); Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 2,51 (s, 3H), 3,71 (s, 3H), 4,05 (s, 2H), 6,88 (d, 2H), 7,18 (d, 2H), 7,91 (d, 2H); 8,13 (d, 2H). Elementární analýza: (nalezeno): C 57,47%, H 4,77% a N 4,31%; (theoretical): C 57,30%, H 5,11% a N 4,18%
Přiklad 5-30; Kyselina 4-(N,N-bis(4-inethoxybenzyl)sulfamoyl)benzoová
[00409] Připravená jak v Příkladu 5-27 z bis(4-methoxybenZyl)aminu a methyl-(4-(chlorsulfonyl)benzoátu) (Příklad 5-10c). MS (M-H, 440,1); Ή NMR (400MHz, DMSOd6): δ, ppm: 3,68 (s, 6H), 4,20 (s, 4H), 6,77 (d, 4H, J=10 Hz), 6,98 (d, 4H, >10 Hz), 7,92 (dd, 2H >8 Hz), 8,06(dd, 2H, >8 Hz), Elementární analýza: (nalezeno): C 62,45%, H 5,19% a N 3,06%; (teoreticky): C 62,57%, H 5,25% a N 3,17% (00410] Sloučenina měla IC50 4,14 μΜ na hT2R 14 receptorů hořkosti.
Příklad 5-31: Kyselina 4-(N-(2-fluorbenzyI)-N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benZoová
1004111 Připravená jak v Příkladu 5-10 z methyl-(4-(N-(4-methoxybenzyl)Sulfamoyl)benzoátu (Příklad 5-10b) a 1 -(brommethyl)-2-fluorbenzenu. Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3,66 (s, 3H), 4,29 (s, 2H), 4,37(s, 2H), 6,72 (d, 2H, >8 Hz), 7,01-7,03 (m, 6H), 7,93 (d, 2H, >8 Hz), 8,08 (d, 2H, J=8Hz).
142
Příklad 5-32: Kyselina 4-(N-(2,5-difluorbenzyl)-N-(4-metiioxybenzyl)sulfanioyl) benzoová
[00412| Připravená jak v Příkladu 5-10 z methyl-(4-(N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benzoátu) (Příklad 5-10b) a 2-(brommethyl)-l,4-difluorbenzenu. Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3,66 (s, 3H), 4,31 (s, 2H), 4,33 (s, 2H), 6,74-7,06 (m, 7H), 7,95 (d, 2H, J=8 Hz), 8,09 (d, 2H, J=8Hz).
Příklad 5-33: Kyselina 4-(N-(23-difluorbenzyl)-N-(4-niethoxybenzyl)sulfamoyl)benzoová
[00413) Připravená jak v Příkladu 5-10 z methyl-(4-(N-(4-methoxybenzyl)-sulfamoyl)benzoátu) (Příklad 5-10b) a l-(brommethyl)-2,3-difluorbenzenu. Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3,30 (s, 3H), 4,29 (s, 2H), 4,32(s, 2H),, 6,87 (d, 2H, J=8Hz), 7,02-7,20 (m, 5H), 7,95 (d, 2H, J=8Hz), 8,05 (d, 2H, J=8Hz).
143
Přiklad 5-34: Kyselina MN-(3-methoxyben2yl)-N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benzoová
100414] Připravená jak v Příkladu 5-10 z methyl-(4-(N-(4-methoxybenzy^^ benzoatu (Příklad 5-1 Ob) a 3-methoxybenzylbromidu. MS (M - H, 440,50); Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3,58(s, 3H), 3,68(s, 3H), 4,24(s, 2H), 4,25(s, 2H), 6,50(s, 1H), 6,64(d, J = 4 Hz, 1H), 6,73(m, 1H), 6,77(d, J = 8 Hz, 2H), 7,00(d, J = 8 Hz, 2H), 7,12(1, J=8 Hz, 1H), 7,94(d, J=8 Hz, 2H), 8,09(d, >8 Hz, 2H), 13,49(s, 1H).
[00415] Sloučenina měla IC5o 2,46 μΜ na hT2R14 receptoru hořkosti.
Příklad 5-35: Kyselina 4-(N-benzyl-N-(4-methoxyfenyl)sulfamoyl)beiizoová
100416] Připravený jak v Příkladu 5-10 z methyl-(4-(N-(4-methoxyfenyl)-sulfamOyl)benzoátu) (Příklad 5-35a) a benzylbromidu MS (Μ - H, 396); Ή NMR (400MHz, DMSOd6): δ, ppm: 3,66(s, 3H), 4,75(s, 2H), 6,76(d, J = 8 Hz, 2H), 6,90(d, J = 8 Hz, 2H), 7,23(m, 5H), 7,74(d, J = 8 Hz, 2H), 8,11 (d, J = 8 Hz, 2H), 13,51 (s, 1H).
Příklad 5-35a: methyl-(4-(N-(4-methoxyfenyl)sulfamoyl)benzoát)
100417] Do 4-methoxybenzenaminu (580 mg, 4,71 mmol) a triethylaminu (1,48 ml, 10,7 mmol) v dichlormethanu (10 ml) se přidal methyl-^chlor-sulfonyljbenzoát (1,00 g, 4,28 mmol). Tato směs se míchala po dobu 16 hodin při teplotě místnosti. Reakční směs se
144
zředila dichlormethanem (50 ml) a promývala se vodou, 10% kyselinou citrónovou a solankou, v tomto pořadí. Organické vrstvy se vysušily nad síranem sodným a koncentrovaly se pomocí rotační odparky, Výsledný surový materiál se podrobil chromatografii na silikagelu za použití 100% dichlormethanu jako elučního činidla, což dalo methyl-(4-(N-(4-methoxyfenyl)sulfamoyl)benzoát) jako bílou krystalickou pevnou látku (400 mg, 30% výtěžek)
Příklad 5-36: Kyselina 4-(N-(3,4-difluorbenzyl)-N-(4-niethoxybenzyI)sulfamoyl)benzoová
[00418] Připravená jak v Příkladu 5-10 z N-(3,4-difluorbenzyl)(4-methoxyfenyl)methanaminu (Příklad 5-36a) a methyl-(4-(chlorsulfonyl)benzoátu) (Příklad 5-10c). MS (M - H, 446); Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ ppm: 3,69 (s, 3H), 4,20 (s, 4H), 6,73 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,93 (m, 2H), 6,98 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,22 (m, 1H), 7,74(d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,99 (d, J = 8,4 Hz, 2H).
Příklad 5-36a: N-(3,4-difluorbenzyl)(4-methoxyfenyl)methananiin
100419) Do (4-methoxyfenyl)methanaminu (1,77 ml, 13,6 mmol) a kyseliny octové (2,7 ml, 45 mmol) v dichlormethanu (15 ml) se přidal 3,4-difluorbenzaldehyd (1,0 m, 9,08 mmol). Tato směs se zahřívala v mikrovlnné troubě při 100 °C po dobu 15 min. Reakční směs se ochladila na teplotu místnosti a přidala se po částech mikroporézní kyanoborhydridová pryskyřice (9,8 g, 22,7 mmol). Tato směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 16 hodin. Pryskyřice se odfiltrovala a promyla dichlormethanem a organické vrstvy se promyly nasyceným hydrogenuhličitanem sodným, dokud neskončilo bubláni. Organivké vrstvy se vysušily nad síranem sodným a koncentrovaly se pomocí rotační odparky. Výsledný surový materiál se přečistil chromatografii na silikagelu použitím gradientu methanol dichlormethanu jako elučního činidla, což dalo N-(3,4-difluorbenzyl)(4-methoxyfenyl)methanamin jako nažloutlý olej (1,9 g, 80 % Výtěžek), MS (M + H, 264); Ή
145
NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 2,63 (br s, 1H), 3,56 (s, 2H), 3,61 (s, 2H), 3,71 (s, 3H), 6,84 (d, J = 8,8 Hz, 2 H), 7,14 (m, 1H), 7,21 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,34 (m, 2H).
Přiklad 5-37: Kyselina 4-((N-(4-fluorbenzyl)-4-methylfenyIsulfonaniido)methyl>
benzoová
{00420] Připravená jak v Příkladu 5-11 z 4-(aminomethyl)fenylkarboXylové, 4-methylbenzen-l-sulfonylchloridu a 4-fluorbenzylbromidu. Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.11 (s, 3H), 4,21 (s, 2H), 4,24(s, 2H), 6,94-7,08 (m, 6H), 7,40-7,42 (d, 2H, J= 8Hz), 7,63 (d, 2H, J=8Hz), 7,73 (d, 2H, J=8Hz)
100421] Sloučenina měla 1C5O 0,054 μΜ na hT2R14 receptoru hořkosti.
Příklad 5-38: Kyselina 4-((4-karboxy-N-(4-metlioxybenzyl)fenylsuIfonainido)inethyl)benzoová
100422] Připravená jak v Příkladu 5-10 z methyl-(4-(brommethyi)benzoátu) a methyl-(4-(N-(4-methoXybenzyl)sulfamoyl)benzoátu) (Příklad 5-10b). Ή NMR (400MHz, DMSO
146 d6): δ, ppm: 3,65 (s, 3H), 4,24 (s, 2H), 4,33(s, 2H), 6,71 (d, 2H, J= 8Hz), 6,95 (d, 2H, J= 8Hz), 7,14 (d, 2H, J=8Hz), 7,73 (d, 2H, J=8Hz), 7,89(d, 2H, J=8Hz), 8,O6(d, 2H, J=8Hz).
Příklad 5-39: Kyselina 4-(N-benzyl-N-(3,4-dimethoxybenzyl)sulfamoyl)benzoová
[004231 Připravená jak v Příkladu 5-10 z (3,4-dimethoxyfenyl)niethanaminu, methyl-(4-(chlorsulfonyl)benzoátu) (Příklad 5-10c) a benzylchloridu. MS (Μ - H, 440,10); Ή NMR (400MHz, CD30D): δ, ppm: 3,59 (s, 3H), 3,76 (s, 3H), 4,30 (s, 2H), 4,36 (s, 2H), 6,51 (d, 1H, J= 1,7 Hz), 6,60 (m, 1H), 6,76 (d, 1H, J= 8,2 Hz), 7,12 (m, 2H), 7,21 (m, 3H), 7,95 (d, 2H, J 8,6 Hz), 8,18 (d, 2H, J = 8,6 Hz).
[00424] Sloučenina měla IC50 0,678 μΜ na hT2R14 receptorů hořkosti.
Příklad 5-40: Kyselina 4-(N-(3,4-dimethoxybenzyl)-N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benzoová
[00425] Připravená jak v Příkladu 5-10 z (3,4-dimethoxyfenyl)methanaminu, methyl-(4-(chlorsulfonyl)benzoátu) (Příklad 5-10c) a 4-methoxybenzylbromidu. MS (Μ - H, 470,10); Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3,49 (s, 3H), 3,67 (s, 3H), 3,68 (s, 3H), 4,20 (s, 2H), 4,22 (s, 2H), 6,41 (d, 1H, J= 1,4 Hz), 6,58 (dd, 1H, JI = 8,2 Hz, J2 = 1,4 Hz), 6,78 (m, 3H), 7,02 (d, 2H, J= 8,6 Hz), 7,94 (d, 2H, J= 8,4 Hz), 8,09 (d, 2H, J= 8,4 Hz).
[00426] Sloučenina měla IC30 1,47 μΜ na hT2R14 receptorů hořkosti.
147
Příklad 5-41: Kyselina 4-(N-(3-nuor-4-methoxybenzyl>N-(4.met^ benzoová
1004271 FHprawtí jak v Přikladu 5-10 z , methyl-(4-(N-(4-mstboxybenzyl)sultaoyl)beiizoálu) (Příklad 5-10b). MS (M - H, 458,10)· Ή NMR (400MHz, CD,OD): », ppm: 3,73 (s. 3Hh 38O (s 3H), 4 24 4 2J (j
6,75 (ra, 4H), 6.88 (m, IH). 6,97 (d, 2H. J. 8,6 Hz), 7,88 (d, 2H, J- 8,3 Hz), 8 14 (d 2H J8,3 Hz). ’ ’
[004281 Sloučenina měla IC50 1,11 μΜ na hT2R14 receptorů hořkosti.
Příklad 5-42: Kyselina 44(4-hydroxy-N-(2-methoxybenzyl)fen^ benzoová
100429] 4-(N-(2-methoxybenzyl)sulfamoyl)fenylacetát (Příklad 5^2a) (50 mg 0 15 mmol) se rozpustil v acetonu (1,0 ml) následován přídavkem uhličitanu česného (97 mg, 0,30 mmol) a methyl-(4-(brommethyl)benzoátu (38 mg, 0,17 mmol). Směs se míchala při teplotě místnosti přes noc a pak se anorganické soli odfiltrovaly. Aceton se odstranil ve vakuu a zbytek se znovu rozpustil v ethylacetátu a promylu se vodou a pak solankou. Organická vrstva se vysušila nad síranem hořečnatým a koncentrovala se. Surový produkt se přečistil
148 kolonovou chromatografií ethylacetátem/hexany jako elučního Činidla, což dalo methyl-(4-((4-acetoxy-N-(2-methoxybenzyl)fenylsulfonamido)methyl)benzoát).
[00430| Methyl-(4-((4-acetoxy-N-(2-methoxybenzyl)fenylsulfonamido)melhyl)benzoát) (surový) se rozpustil v THF (1,0 ml) a nechal se na něj působit vodný NaOH (1N, 2,0 ml, 2,0 mmol). Směs se refluxovala po dobu jedné hodiny. Po ukončení se odstranil THF ve vakuu a výsledný vodný roztok se okyselil 6N vodnou HC1 na pH -3. Vodná fáze se extrahovala EtOAc (2 x 15 ml) a spojené organické vrstvy se promyly vodou, solankou, vysušily se nad Na2SO4 a koncentrovaly se. Surový produkt se přečistil reverzní fázovou HPLC, což dalo 10,8 mg titulní sloučeniny (15% výtěžek po dvou krocích). MS (M-H, 426,1); Ή NMR (400MHz, aceton-d6): δ, ppm: 3,65 (s, 3H), 4,37 (s, 2H), 4,43 (s, 2H), 6,79 (m, 2H), 7,01 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,17 (m, 2H), 7,28 (d, 2H, J = 7,9 Hz), 7,73 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,87 (d, 2H, J = 7,9 Hz).
[004311 Sloučenina měla !C$o 2,56 μΜ na hT2R14 receptoru hořkosti.
Příklad 5-42a: 4-(N-(2-methoxybenzyl)sulfamoyl)fenylacetát
[00432] Roztok 4-(chlorsulfonyl)fenylacetátu (Příklad 5-42b) (531 mg, 2,265 mmol) v 5,0 ml dichlormethanu se ochladil na 0 °C v ledové lázni. Přidal se (2-methoxy fenyl)methanamin (325 μΐ, 2,492 mmol) a triethylamin (347 μΐ, 2,492 mmol). Ledová lázeň se pak odstranila a směs se ohřála na teplotu okolí a míchala se po dobu 2 hodin. Reakční směs se koncentrovala a surový produkt se přečistil kolonovou chromatografií (hexany/ethylacetát = 90/10 až 30/70), což dalo čistý 4-(N-(2-methoxybenzyl)sulfamoyl)fenylacetát (743 mg, 89 %) jako bílou pevnou látku. MS (M+H, 336,1) Ή NMR (400MHz, CDC13): δ, ppm; 2,32 (s, 3H), 3,71 (s, 3H), 4,18 (d, 2H, J = 5,8 Hz), 5,15 (t, 1H, J = 5,8 Hz), 6,71 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 6,82 (br t, IH, J = 7,4 Hz), 7,07(br d, 1H, J = 7,4 Hz), 7,10 (d, 2H, J= 8,7 Hz), 7,19 (br t, 1H, J = 7,8 Hz), 7,74 (d, 2H, > 8,7 Hz).
Příklad 5-42b: 4-(chlorsulfonyl)fenylacetát
[00433] 6,285 g (36,08 mmol) kyseliny 4-hydroxybenzensulfonové se rozpustilo ve směsi 30 ml anhydridu kyseliny octové a 15 ml kyseliny octové a refluxovaly se po dobu 6 hodin. Těkavé látky se odpařily a umístily se pod vysoké vakuum přes noc. Výsledný surový produkt se rozpustil v 100 ml DCM a nechal se na něj působit 4,72 ml oxalylchloridu (54,12 mmol) a 139 μΐ DMF (1,804 mmol) při 0 °C. Míchání pokračovalo, dokud se nezastavil vývoj plynu, pak se reakční směs koncentrovala a znovu se rozpustila v EtOAc. Organická vrstva se
149
dvakrát promyla 2 N H2SO4 a vysušila se solankou a MgSO4. Zakoncentrování dalo 7,067 g 4-(chlorsulfonyl)fenylacetátu jako tmavého hustého oleje, který se případně nechal ztuhnout (83 % výtěžek po dvou krocích).
[00434] 'H-NMR (400MHz, CDCI3): δ, ppm: 2,35 (s, 3H), 7,37 (d, 2H, J = 8,9 Hz), 8,06 (d, 2 H, J = 8,9 Hz), BC-NMR (100 MHz, CDC13): δ, ppm: 21,13, 123,05, 128,91, 141,15, 155,80, 168,29.
Příklad 5-43: Kyselina 4-((4-hydroxy-N-(3-methoxybenzyl)fenylsuifonamido)methyl)benzoová
[00435] Připravená jak v Příkladu 5-42 z (3-methoxyfenyl)methanaminu a methyl-(4-(brommethyl)benzoátu). MS (Μ - H, 426.10); Ή NMR (400MHz, aceton-d6): δ, ppm: 3,66 (s, 3H), 4,32 (s, 2H), 4,40 (s, 2H), 6,65 (br s, 1H), 6,73 (m, 2H), 7,05 (d, 2H, J= 8,5 Hz), 7,12 (t, 1H, J = 8,0 Hz), 7,27 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,82 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 7,88 (d, 2H, J = 8,0 Hz).
(00436] Sloučenina měla IC50 0,188 μΜ na hT2R14 receptorů hořkosti.
150
Příklad 5-44: Kyselina 4-((4-hydroxy-N-)4-methoxybenzyl)fenylsulfonamido)methyl)benzoová
|00437] Připravená jak v Příkladu 5-42 z (4-methoxyfenyl)methanaminu a methyl-(4-(brommethyl)benzoátu). MS (M - H, 426,10); Ή NMR (400MHz, aceton-d6): δ, ppm; 3,73 (s, 3H), 4,27 (s, 2H), 4,35 (s, 2H), 6,76 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,04 (d, 4H), 7,24 (d, 2H, J = 7,8 Hz), 7,79 (d, 2H, J = 8,2 Hz), 7,88 (d, 2H, J = 7,8 Hz).
[00438] Sloučenina měla IC50 3,43 μΜ na hT2R14 receptorů hořkosti.
Příklad 5-45: Kyselina 4-((N-(3-fluorbenzyl)-4-hydroxyfenylsulfonamido)methyl)* benzoová
[00439| Připravená jak v Příkladu 5-42 z (3-fluorfenyl)methanaminu a methyl-(4-(brommethyl)benzoátu). MS (Μ - H, 414.1), Ή NMR (400MHz, aceton-d6): δ, ppm: 4,37 (s, 2H), 4,42 (s, 2H), 6,94 (m, 3H), 7,06 (d, 2H, J - 8,3 Hz), 7,21 (m, 1H), 7,28 (d, 2H, J = 7,6 Hz), 7,81 (d, 2H, J = 8,3 Hz), 7,87 (d, 2H, J = 7,6 Hz).
[00440] Sloučenina měla IC50 0,459 μΜ na hT2R14 receptorů hořkosti.
151
Příklad 5-46: N-benzyl-N-(4-methoxybenzyl)-4-(ltf-tetrazol-5-yl)benzensulfonamid
[004411 N-benzyl-4-kyano-N-(4-methoxybenzyl)benzensulfonamid (Příklad 5-46a, 400 mg, 1 mmol) a trimethylcínazid (400 mg, 2 mmol) se rozpustily v toluenu (10 ml) a vystavily se působeni mikrovln při 150 °C po dobu 3 hodin. Přidaly se další 2 ekvivalenty trimethylcínazidu a reakční směs se vystavila působení mikrovln při 150 °C po dobu dalších 3 hodin. Směs se ochladila a zfiltrovala, což dalo surový tetrazol cíničitý, který se hydrolyzuje v MEOH/konc. HCI (50 ml : 20 ml). Přidala se voda a výsledná sraženina se odfiltrovala. Produkt se překrystaloval absolutním ethanolem a vodou za vzniku N-benzyl-N-(4-methoxybenzyl)-4-(l/7-tetrazol-5-yl)benzen-sulfonamidu jako bílé pevné látky. MS (M + H, 436,10); Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3,65(8, 3H), 4,27(s, 2H), 4,30(s, 2H), 6,75(d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,98(d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,08(m, 2H), 7,20(m, 3H), 8,05(d, J = 8,4 Hz, 2H), 8,22(d, J = 9,2 Hz, 2H).
[00442] Sloučenina měla IC50 3,67 μΜ na hT2R 14 receptorů hořkosti.
Příklad 5-46a: N-benzyl-4-kyano-N-(4-methoxybenzyl)benzensulfonamid.
[004431 4-Kyanobenzen-l-sulfonylchlorid (600 mg, 3 mmol) se přidal do roztoku Nbenzyl’*l-(4-methoxyfenyl)mcthanaminu (Příklad 5-46b, 750 mg, 3,3 mmol) a triethylaminu (500 mg, 3,6 mmol) v dichlormethanu (15 ml). Reakční směs se míchala při teplotě okolí po dobu 4 hodin, pak se koncentrovala na rotační odparce. Surový produkt se přečistil na sílikagelu, což dalo N-benzyl-4-kyano-N-(4-methoxybenzyl)benzensulfbnamid jako bílou pevnou látku. Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3,68(s, 3H), 4,26(s, 2H), 4,3l(s, 2H), 6,75 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,97(d, J = 9,2 Hz, 2H), 7,07(m, 2H), 7,21(m, 3H), 7,98(d, J = 8,4 Hz, 2H), 8,04 (d, J = 8,8 Hz, 2H).
152
Příklad 5-46b: N-benzyM-(4-methoxyfenyl)methanamin.
100444] 4-Methoxybenzaldehyd (5 g, 35 mmol) a benzylamin (3,8 g, 35 mmol) se přidaly do triacetoxyborohydridu sodného (10,4 g, 49 mmol) v dichlorethanu (125 ml). Reakční směs se míchala ph teplotě okolí 2 hodiny, pak se koncentrovala. Směs se se zředila dichlormethanem (200 ml), promyla se nasyceným vodným hydrogenuhličitanem sodným (200 ml), solankou (200 ml) a vysuSila se nad síranem horečnatým. Surový amin se koncentroval a přečistil chromatografií na silikagelu (70% ethylacetát v hexanech), což dalo N-benzyl-l-(4-mcthoxyfenyl)methanamin jako olej. Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm; 3,59(s, 2H), 3,64(s, 2H), 3,71 (s, 3H), 6,86(d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,28(m, 7H).
Příklad 5-47: Kyselina 2-(4-(N-benzyl-N-(4-inetliOxybenzyl)Sulfamoyl)fenyl) octová.
100445] Připravená jak v Příkladu 5-27 z methyl<2-(4-(chlo^^ (Příklad 5-47a), 4-methoxybenzaldehydu a benzylaminu. MS (M - H, 424.10); Ή NMR (400MHz. DMSO-dó): δ, ppm: 3,66(s, 3H), 3,72(s, 2H), 4,18(s, 2H), 4,22(s, 2H), 6,73(d, J = 8,4 Hz, 2H), 6,9l(d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,02(m, 2H), 7,19(m, 3H), 7,49(d, J - 8,4 Hz, 2H) 7,80(d, J = 8 Hz, 2H).
Příklad 5-47a: Methyl-(2-(4-(chlorsulfonyl)fenyl)acetát).
[00446] Kyselina 2-(4-(chlorsulfOnyl)fenyl)octová (600 mg, 2,6 mmol) se přidala do thionylchloridu (3 ml) a zahřívala se při 80 °C po dobu I hodiny. Reakční směs se koncentrovala, ochladila na 0 °C v ledové lázni a se přidal ledový methanol. Směs se míchala po dobu 30 minut a koncentrovala se, což dalo methyl-(2-(4-(chlorSulfonyl)fenyl)aCetát) jak olej. Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3,57(s, 3H), 3,65(s, 2H), 7,21 (d, J = 8 Hz, 2H) 7,55(d, J = 8 Hz, 2H).
Příklad 5-48: Kyselina 4-((N-benZyl-4-karboxyfenylsulfonamido)methyl)benzoová.
[00447] Připravená jako v Příkladu 5-10 z methyl-(4-(chlorsulfonyl)benzoátu) (Příklad 5-10c), benzy laminu a rnethyl-(4-(brommethyl)benzoátu). MS (M + H, 426,10); Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 4,29(s, 2H), 4,34(s, 2H), 7,03(m, 2H), 7,12(m, 2H), 7,68(d, J = 8 Hz, 2H), 7,94(d, J = 8,8 Hz, 2H), 8,06(d, J = 8,8 Hz, 2H), 13,03(s, 2H).
Příklad 5-49: Kyselina 4-(benzyl(4-methoxybeiizyl)karbamoyl)benzoová
[00448] Připravená jako v Příkladu 5-27 z 4-(chlorkarbonyl)benzoátu a N-benzyl-l-(4-methoxyfenyl)methanaminu. Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3,72(d, J = 7,6 Hz, 3H), 4,26(s, 1H), 4,30(s, 1H), 4,50(s, 1H), 4,55(s, 1H), 6,89(m, 2H), 7,02(m, 1H), 7,10(m, 1H), 7,10(m, 1H), 7,20(m, 1H), 7,28(m, 4H), 7,55(m, 2H), 7,96(m, 2H), 13,13(s, 1H).
Příklad 5-50: Kyselina 4-(N-(4-fluor-3-methoxybenzyl)-N-(4-metlioxybenzyl) sulfamoyl)benzoová
155
156
157
Sloučenina ί. Sloučenina hT2R14 ICM (μΜ)
5-59 J? fjf° Ησ^γ% kyselina 3-(4-(N-benzyi-N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)fenyl)propanová
5-60 Q PC°t 0 kyselina 2-(N-benzyi-N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)benzoová
5-61 Λ XT Ησγ^ kyselina 4-(N-(4-methoxybenzyl)-N-(tliiofen-2ylmethyl)sulfamoyl)benzoová
5-62 0 r^Y0- TiY iói kyselina 4-(N-(4-methoxybenzyl)-N--(thiofen-3ylmethyl)sulfamoyl)benzoová
158
Sloučenina Č. Sloučenina hT2R14 ICM (μΜ)
5-63 kyselina 4-(N-(4-methoxybenzyl)-N-(( 5- -methylfuran-2-y[)tnethyl)-sulfamoyi)benzoová
5-64 ^°rY kyselina 4-(N-(4-methoxyb enzyl)-N-(2-metbylbenzyl)sulfamoyl)benzoová
5-65 •a kyselina 4-(N-(4-methoxybenzyl)-N-(3-methylbenzyl)sulfamůyl)benzoová
5-66 W 0 kyselina 4-(N-(4-methoxybenzyl)-N-(4-methylbenzyl)sulfamoyi)benzoová
Sloučenina č.
5-67
5-68
5-69
5-70
159 hT2R14 iCM (μΜ)
Sloučenina
kyselina 4-(N-(3.5-dimethoxybenzyl)-N-(4_ -methoxybenzyDsulfamoyDhenzonvá
kyselina 4-(N-(2-chlorbenzyl)-N-(4-tnethoxybenzyl) sulfamoyl)benzoová
kyselina 4-(N-(4-fluorbenzyl)-N-(4-methoxybenzyl)sulfanioyl)benzoová
kyselina 4-(N-benzyl-N-(4-methylbenzyl)__________sulfamoy[)benzoová
12,141
7,044
8,283
5.394
160 <0
161
Sloučenina č.
Sloučenina
H
N
O O kyselina 4-(N-benzyl-N-(3-kyanobenzyl)sulfamoyl)benzoová
OH
0¾
hT2R14 Κ%(μΜ)
kyselina 3-((N-benzyl-4-karboxyfenylsulfonamidoimethyljbenzoová
H
O
Λ kyselina 4-(N-benzyl-N-(4-chlorbenzyl)sulfamoyl)benzoová
O
Cl
3,977
H
S.N. d'b
kyselina 4-(N-benzyl-N-( 4(methylthio)benzyl)sulfanioyl)benzoová
2,458
162
163
164
Sloučenina hT2R14 ICM (μΜ)
Sloučenina č.
O O
kyselina 4-(N-(4-methoxybenzyl)-N-(pyridin-4ylmethyl)sulfamoyl)benzoová
kyselina 4-(N-(4-methoxyben zyl)-N-(pyridin-2ylmethyl)sulfamoyi)benzoová
O O
kyselina 4-(N-(4-methoxybenzyl)-N--(pyridin-3________ylmethyl )sulfamoyl)benzoová________
kyselina 4-(N-benzyl-N-(4-methoxy-3-methylbenzyl)sulfamoyl)benzoová
O O
1.995
165
166
Sloučeninu &
Sloučenina hT2R!4 ICM (μΜ)
O
kyselina 4-(3-benzyl-3’(4-methoxy* benzyl)ureido)benzoová
kyselina 4-(N-(4-methoxybenzyl)-N-( 1 -fenyiethyi)snlfamoyl)benzoová
1,397
kyselina 4-(N-(4-methoxybenzyl)-N-( 1,2,3,kyselina 4-tetrahydronaftalen-1 -yl)sulfamoyi)benzoová
2,415
kyselina 4-(N-((4-methoxyfenyl )(fenyl)tnethyl)sulfamoyl}benzoová
167
168
Sloučenina č. Sloučenina hT2RI4 ICW (μΜ)
0 ΰ
o P^
5-101 ÍP p 0,345
kyselina 4-((N-(3-methoxybe nzyl)fenylsulfonarnido)mefhyl)benzoová
0
n P^
5-102 ó'P 2,219
Y ^0 kyselina 4-((N-(4-methoxybenzyl)fenylsulfonamido)methyl)benzoová
0 II
p^“
5-103 ClP 0,429
kyselina 4-((N-(2-fluorbenzyl)fenyl_______ sulfonamido)methyl)benzoová__________
169
170
Sloučenina č. Sloučenina hT2R14 ICM (μΜ)
5-107 0 Ti A F kyselina 4-((N-(4-fluorbenzyl)-4-hydroxyfenylsulfonamido)metliyl)benzoová 4,086
5-108 j? °°0 kyselina 4-(N-benzyl-N-(4- ethoxybenzyl)sulfamoyl)benzoová
5-109 j? Zr0^ U-SA A kyselina 4-(N-benzyl-N-(4-propoxy___________benzyl)sulfamoyl)benzoová__
171
Sloučenina č.
Sloučenina hT2R14
IC® (μΜ)
5-110
kyselina 4-(N-benzyl-N-(4-izopropoxybenzyl)sulfamoyl)benzoová
5-111
°x
O
kyselina 4-((3-(3-chlor-4-methylfenyi)-1-(4-methoxybenzyl)thioureido)methyl)cyklo-hexankarboxylová O
5-112
kyselina 4-(( 1 -(4-methoxybenzyl)-3-(2-methoxyfenyl)thioureido)methyl)cyklo-hexankarboxylová O
kyselina 4-(( l-(4-ethylbenzyl)-3-o-tolylthioureido)methyl)cyklohexankarboxylová
5-113
172
173
Sloučenina č.
Sloučenina
5-118
ethyl-(4-((N-bcnzyl-4-bromfenylsulfonamidQ)_______methyl)cyklůhexankarboxylát)
5-119
ethyl-(4-((N-benzyl-4-chlorfenylsulfonamido)5-120
kyselina4-((N-benzy]-4-chlorfenyisulfon________amido)methyl)benzoová______
5-121
kyselina 4-(N-(2-methoxybenzyl).N-(4-methoxybenzyl)sulfamoyl)bgnzo<ivá
I1T2RI4 IC* (μΜ)
2,344
0,672
0,394
2,943
174
Sloučenina
č.
Sloučenina hT2R14 IC» (μΜ)
5-122
N-benzyl-3-methoxy-N-(4* -methoxybenzyl)benzensulfonamid
2,219
5-123
0,092
O kyselina 4-((N-(4-fluorbenzyl)-4-methoxyfenylsulfonamidojmcthyljcyklohexankarboxylová
Sloučenina Č.
5-124
Sloučenina
kyselina 4-((4-acetamido-N-(4-fluotbenzyl)fenylsnlfonamido)methyl)cyklohexanlcarboxylová hT2R14 1C50 (μΜ)
0,842
5-125
kyselina 4-((4-amino-N-(4-fluorbenzyl)fenylsulfonamido)methyl)cyklohexankarboxylová
1,651
176
Sloučenina č. Sloučenina hT2R14 ICM (μΜ)
5-129 X fY° 0 Qr kyselina 4-(N-(4-methoxybenzyl)-N-(2-methylbenzy 1 )sulfamoyl jbenzoová 5J16
Sloučenina č. Sloučenina hT2R14 ICM (μΜ)
5-130 j? χτ H0 lil ’X kyselina 4-(N-(2-chlorbenzyl)-N-(4- methoxybenzyllsuifamovljbenzoová 7,044
5-131
x^ XX H0 lil o ol kyselina 4-(N-benzyl-N-(4-fluorbenzyl)-sulfamoyt)benzoová 8,283
5-132
X ťY 4X1 ό kyselina 4-(N-benzyl-N-(4-methylbenzyl)sulfamoyl)benzoová 5,394
5-133 j jO ΗΟ'η<^ι X' kyselina 4-(N-benzyl-N-(2- ___________metlioxybenzy])snlfamoyl)beiizoová__ 5,061
177
178
Sloučenina
č.
Sloučenina hT2RI4
ICM (μΜ)
5-138
5-139
5-140
5-141
Sloučenina f.
5-142
HO
N.
O' 'O kyselina 4-(N-benzyl-N-(4-(methylthio)______benzyl)sulfamoyl)benzoová______ O
HO
,N, Ó' kyselina 4-(N-benzyl-N-(3-fluorbenzyl)-sulfamoyl)benzoová
HO
O O
HO kyselina 4-(N-benzyl-N-(2-methylbenzyl)__________sulfamoyi)benzoová_______
,N. Cl λ!
kyselina 4-(N-benzyl-N-(2-chlorbenzy|)-sulfamoy|)benz nová Sloučenina
HO
Cl kyselina 4-(N-benzyl-N-(3-chlorbenzyl)-sulfamoyl)benzoová |
2,458
2310
2,926
4,486 hT2R14
ICi(l (μΜ)
4,286
179
Sloučenina č. Sloučenina
5-143 5-144 5-145 H0 lil ó - kyselina4-(N.benzyl-N-(4-ethylbenzyl}-sulfamoyl)benzoová ?Y0 ho ηη kyselina 4-(N-benzyl-N-(4-methoxy-3-methyl_________benzyl)sulfamoyl)benzoová_______ o fNY°x HO ó kyselina 4-(N-benzyl-N-((6-methoxypyridin-3- _ -yl)methyt)sulfamoyÍ)benzoová
Sloučenina č. Sloučenina -------------------- I
5-146 i. rr H0 lil r5^ ° γΊ kyselina 4-(N-benzyl-N-(4-kyanobenzyl)- ___sulfamoyl)benzoová
180
181 ·♦*
Sloučenina i. Sloučenina hT2R14 ICw(gM)
5-151 Z fa H0 lil kyselina 4-(N-benzyl-N-(4____-hydroxybenzyl)sulfamoyl)benzoová 5,207
5-152 0 °' & kyselina 4-((N-(2-metlioxybenzyl)fenyl___ sulfonamido)methyl)benzMvá 1,294
Sloučenina č. Sloučenina hT2RI4
5-153 0 /A™ '%. 1 kyselina 4-((N-(3-methoxybenzyl)fenyl__ sulfonamido (methyl (benzoová 0,345
5-154 0 o kyselina 4-{(N-(4-methoxybenzyl)fenyl______________sulfonatnido)nielhyl (benzoová________________ 2,219
182
Sloučenina č. Sloučenina hT2R14 Κ+ο(μΜ)
5-155 0 a <°A“ X kyselina 4-((N-(2-fluorbenzyl)fenylsulfon__ amido)methyl)benzoová 0,429
Sloučenina č. Sloučenina hT2R14 IC« (uMl
5-156 0 oo 1 o, kyselina 4-((N-(3-fluorbenzyl)fenylsulfon___ atnido)methyl)benzoová 0,406
5-157 0 Φ F kyselina 4-((N-(4-fluoibenzyl)fenylsulfon___ amido)methyi)benzoová 0,935
5-158 \ ,0 0 d/ οΛο^—' kyselina 4-(2-methoxy-5H-dibenzo[c,e]a2epin-6(7H)- ______ ylsutfonyl)benzoová 3,571
Sloučenina č. Sloučenina hT2R14 ICM (μΜ)
• •c
183
Sloučenina č.
Sloučenina hT2R14 ΆμΜ)
5-159
kyselina 4-((N-(4-fluorbenzyl)-4-hydroxyfenylsulfonamidolmethvlÍhgnynňvá
4,086
5-160
kyselina 4-(N-(2,kyselina 4-difluorbenzyl)-N-(4-methoxybenzyl)sulfanioyl )benzoová
5-161
kyselina 4-(3-(4-methoxyfenyl)-3,4--dihydroizochinolin__2( 1 H)-ylsulfonyl)benzoová
6,267
Sloučenina č.
5-162
Sloučenina
kyselina 4-(6-methoxy-l-fenyl-3, 4-dihydroizochinolin_________ 2( 1 H)-ylsulfonyl)benzoová hT2R14
IC^M)
9,616
184
Sloučenina č. Sloučenina hT2R14 ICM (μΜ)
5-163 0 ΗοΛη on ° o JL kyselina 4-(7-methoxy-l-fenyl-3,4-dihydroizochínolin- _________________2( 1 H)-ylsulfonyl)benzoová____________ 2,879
185
Přiklad 6-1: Kyselina (2>3-(5-(2,5-dimethoxyben2yliden)-4-ox(>-2-thioxothiaz()lidin-3yl)prupanová
[00452] Kyselina 3-(4-oxo-2-thioxothiazolidin-3-yl)propanová (200 mg, 1 mmol), 2,5-dimethoxybenzaldehyd (168 mg, 1 mmol) a pipendin (0,3 ml) se spojily v ethanolu (3 m» a ozařovaly se v mikrovlnné troubě při 100 °C po dobu 10 minut. Reakční směs se ochladila, pevná latka se sebrala filtrací, promyla se ethylacetátem/hexany (1/1) a překrystalizovala se z ethanolu, což dalo 85% výtěžek titulní sloučeniny (309 mg, hnědo-oranžová pevná látka). MS (M+H, 284); Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 2,57 (t, 2H)), 3,74 (s, J=6,8Hz, 3H), 3,84 (s, 3H), 4,19 (t, 2H), 6,90 (s, 1H), 7,10 (s, 2H), 7,86 (s, 1H).
[00453) Sloučenina měla ICÍO 2,75 μΜ na hT2R14 receptorů hořkosti.
Příklad ^2: (E)-2-kyano-3-(furan-2-yl)-N-(5-fenyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)akrylamid
[004541 S-Fenyl-UAthiadiazol-Z-amin (600 mg, 3,3 mmol), kyselina kyanooctová (300 mg, 3,6 mmol) a EDC-HC1 (861 mg, 4,5 mmol) se míchaly v acetonitrilu (15 ml) při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Směs se zředila vodnou IN HC1 a vodná fáze se extrahovala ethylacetátem. Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným, zfiltrovaly sc koncentrovaly se ve vakuu. Zbytek se třel s ethylacetátem/hexany (1/9), což dalo 2-kyano-N-(5-fenyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)acetamid jako bílou pevnou látku, která se dále použije bez dalšího přečištění.
1004551 312 mg 2-kyano-N-(5-fenyl-l,3,4-thiadiazol.2-yl)acetamidu a 150 μΐ furan-2-karbaldehydu se mixovalo v 2,5 ml DMF a zahřívalo se v mikrovlnné troubě při 150 °C po dobu 15 min.. Přidalo se 5 ml H;O a sebrala se výsledná sraženina a promyla se vodou (4 x), což dalo surový produkt. Překrystalováním z ethanolu se získalo 180 mg čistého produktu
186 jako hnědé pevné látky. MS (M+H, 323); Ή NMR (400MHz, DMS0-d6): 8, ppm: 6,82 (m. 1H)), 7,43 (d, 1H), 7,49 (m, 4H), 7,87 (m, 2H), 8,15 (s, 1H), 8,22 (br, s, 1H).
100456] Sloučenina měla 1C5O 0,499μΜ na hT2R 14 receptorů hořkosti.
Příklad 6-3: N-(23-dihydrobenzo|b][l,4]dioxin-6-yi>l,4-dimethyl-2,3-dio^
-tetrahydrochinoxalin-6-su)fonamid
[00457] 1,4-Dimethyl-2,3-dioxo-1,2,3,4-tetrahydrochinoxalin-6-sulfonylchlorid (Přiklad 6-3a, 450 mg, 1,6 mmol) se přidal do míchaného roztoku 2,3-dihydrobcnzo[b][l,4]dioxin-6-amm (215 mg, 1,4 mmol) a triethylaminu (170 mg, 1,7 mmol) v dichlormethanu (10 ml) . Reakční směs se míchala při teplotě okolí přes noc, pak se koncentrovala. Surový produkt se přečistil chromatografíí na silikagelu (0-30 % ethyiacetát v hexanech), což dalo N-(2,3-dihydrobenzo[b][l,4]dioxin-6-yl)-l,4-dimethyl-2,3-dioxo-l,2,3,4-tetrahydrochinoxalin-6-sulfonamidu jako bílé pevné látky. MS (M + H, 404,10); Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3,47(s, 3H), 3,49(s, 3H), 4,12(m, 4H), 6,55(m, 1H), 6,61(d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,69(d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,53(m, 1H), 7,59(d, J = 2 Hz, 1H), 10,00(s, 1H).
[00458] Sloučenina měla IC50 7,71 μΜ na hT2Rl 4 receptorů hořkosti.
Příklad 6-3a: M-dimethyl-2,3-diex(>-l,23,4-tetrahydrochinoxaiin[00459J Kyselina chlorsulfonová (3 ml) se zahřála na 65 UC a po částech se přidával 1,4-dimethylchinoxalin-2,3(lH,4H)-dion (Příklad 6-3b, 1 g, 5,5 mmol) více než 0,5 hodiny. Reakční směs se míchala po dobu 4 hodin, pak se ochladila na teplotu okolí a pomalu se vlila na led. Výsledná sraženina se zfiltrovala a promyla se vodou, což dalo l,4-dimethyl-2,3-dtoxo-l,2,3,4-tetrahydrochinoxalin-6-sulfonylchlorid jako bílou pevnou látku. Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): Ó, ppm: 3,5O(s, 6H), 7,25(m, 2H), 7,38(m, 4H).
Příklad 6-3b: l,4-dimethykhinoxalin-2,3(lH,4H)-dion
[004601 Do roztoku NaH (2,5 g) v DMF (200 ml) se přidal po částech chinoxalin-2,3(1 H,4H)-dton (5 g), následován pomalým přídavkem methyljodidu (3,8 ml). Reakční směs se míchala při teplotě okolí po dobu 4 hodin, pak se přidala voda (200 ml). Výsledná
187 sraženina se odfiltrovala a promyla se vodou, což dalo l,4-dimethylchinoxalin-2,3(lH,4H)-dion jako bílou pevnou látku ve 95% výtěžku. Ή NMR (400MHz, DMSO-dó): δ, ppm: 3,5O(s, 6H), 7,25(m, 2H), 7,38(m, 4H).
Příklad 6-4: l,4-dimethyI-2,3-dioxo-N-(4-(pyridin-2-ylmethyl)fenyl>l,23í4-tetraliydro-
[004611 Sloučenina je komerčně dostupná a byla nakoupena přímo od Ryan Scientific.
[00462] Sloučenina měla 1C5O 6,14 μΜ na hT2R 14 receptorů hořkosti.
[00463] Další sloučeniny se testovaly v pokusech a zjistilo se, že mají relativně vysokou účinnost jako inhibitory hT2R14 receptorů hořkosti. Výsledky takovéhoto testování jsou ukázány v Tabulce D.
Tabulka D
Sloučenina č. Sloučenina hT2R14 IC5O ίμΜ)
6-5 Ck_N. Λ, ΡΆ T Y ί zA/° yU/ AY o ό'Ή N-(benzo[d] [ 1,3]dioxol-5-yl)-1,3-di methyl-- 2,4_dioxo4,2,3,4-tetrahydrochinazolin-6-suifonamid 0,264
6-6 0 0 H N-(2,3-dihydrobenzo[bl[l,4]dioxin-6-yl)-1,3dimethyi-2,4-dioxo-l,2,3,4-t-etrahydrochinazoljn-6__ sulfonamid 0,706
6-7 1 F O.yN, x. J XXa/yS 0 0 H NO-lluor-2-methylfenyl}-|,3-dimethyl-2,4--dioxol,2,3,4-tetrahydrochinazolin-6-sulfnnamid 0,935
188
Sloučenina č. Sloučenina hT2R14 IC51) (μΜ)
6-8 1 ΧΙΛ/Τ) II 0 0 H J N-(2,6-dimethyl fenyl)-1,3-dimethyl-2,4-dioxo- 1,2,3,4-tetrahydrochinazolin-6—sulfonamid
6-9 1 o á ň 1,3-dimethyl-2,4-dioxo-N-o-tolyl-1,2,3,4-tetrahydrochinazolin-6-sulfonamÍd 1,726
6-10 XXXjQ' 0 H N-(4-fluorfenyl)-l,4,7-trimethyl-2,3-dioxo--l,2,3,4tetrahydrochinoxalin-6-sulfonamid 12,623
6-11 1 o- rn 1 0 1 N-ethyl-N-m-tolyl-2-(N, 1,4-trimethyl-2,3-dioxo- l,2,3,4-tetrahydrochinoxalin-6- __ -suJfonamido)acetamid 14,926
6-12 0 A A λνΎΥΊ A-7 Vs „xAJk 0 sr ? 0 Kyselina (Z)-3-(4-oxo-2-thioxo-5-(2,4,6_jntnethoxybenzyliden)thiazolidin-3-yl)DroDanová 9,371
6-13 0 H9 r/τΎΥ0' V Kyselina (Z)-3-(5-(3t5-dimethoxybenzyliden)-4- ______^P~2thioxothiazolidin-3-vhpropnnrmg 5,378
6-14 N ο>ΑόΊ \-N 0 (E)-3-(benzo[d][l,3]dioxol-5-y|)-2-kyano-N-(5________fenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)akrylatnid 2.906
190
Sloučenina č. Sloučenina hT2Rl4IC<0 (μΜ)
6-20 1 l,3-dimethyl-2,4-dioxo-N-o4olyl-1,2,3,4___ -tetahydrochinazolín-6-sulfbnamid 1,726
6-22 ΟγΝγΝγχ· aJLn ° S> -^N^O N-ethyl-N-methyl-2-(2,6,8-trimethyl-5,7-dioxo- 5,6,7,8-tetrahydropyrimido[4,5--d]pyrimidin-4- ___ ylthio)acetamid 0,861
6-23 Y Y Π ^χΧ’ΥΧτ 0 0 H N-(4-chlor-2-f]uorfenyl)-l,3-dimethyl-2,4-dioxo__1 .2,3,4-tetrahydrochinazoiin-6--sulfonamid 9,703
6-24 exp γ γ p zN^Un 0 S> CZ^1^0 1.3,7 trimethy!’5-(2-oxo-2-(piperidin- i - -yl)ethylthio)pyrimido[4,5*d]pyrimidin—2,4( IH.3H)dion 0,292
6-25 ΟγΝγΝ^ 0 L l,3.7-írimethyl-5-(2-morpholino-2-oxoethylthio)pyrimido[4,5-d]pyrímidin_________________-2,4(lH,3H)-dion__ 1,006
Í ft
191
Sloučenina č. Sloučenina hT2R14 iC5n (μΜ)
6-26 O^N 0 s> 7-ethy]-l,3-dimethyl-5-(2-(4- methylpiperidin-l-yl)- 2-oxoethylthio)pyrímido[4,5-dlpyriniidin__-2,4(1 H,3H)-dion 0,721
6-27 Oylil ° S> 0 Ethy^-(4-(2-(2-ethy^6,8-dimethyl-5,7-dioxo-5,6,7,8tetrahydropyrimido[4,5-d]pyriniidin-4- ____ylihio)acetyl)piperazin- 1-karboxyiát) 0,763
6-28 w 0 s> 5-( 2-(azepan-1 -yl)-2-oxoethylthio)-1,3- 2,377
N-benzyl-2-( 1,3-dimethyl-2,4-dioxo-1.2,3,4tetrahydropyTÍdo[2,3-d]pyrimidin—5-y|thio)acetaniid
192
Sloučenina c. Sloučenina hT2R14IC,0 (μΜ)
6-30 H H $ NH N-methyl-2,3-díoxo-l .2,3,4— tetrahydrochinoxalin-6____________________šulfonamid _____________ 6,234
Tabulka 7: Reprezentativní výsledky sereeningu proti 23 receptorům hořkosti.
[00464] U sloučenin z Příkladů 5 a 6 výše se provedl screening proti sadě 23 receptorů hořkosti. Receptory hořkosti se aktivovaly na ECso odpovídajícím agonistou, pak se na ně nechaly působit sloučeniny výše o koncentraci 25 μΜ. Výsledky jsou shrnuty v tabulce níže.
80% nebo vyšší inhibice = ++++
60% až 80% inhibice = +++
40% až 60% inhibice = ++
20% až 40% inhibice = +
193
194
195
Příklad 7. Senzorická data Příkladu 10-10, |00465] Aby se stanovila účinnost jednotlivého agonisty, provedly se chuťové testy se specifickým agonistou T2R8, sloučeninou, která nás zajímá, a referenčním blokátorem hořkosti. Již dříve jsme popsali dobrého antagonism hT2R8, u kterého se potvrdilo, že působí na chuť, Přiklad 4-8 z U.S. přechodné přihlášky ser. č. 60/957129, podané 21. srpna 2007: N-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)benzo[d][l,3]dioxol-5-karboxamid. Ukázalo se, že snižuje hořkost kávy sám o sobě a ve spojem se širokým spektrem blokátorů hořkosti. Jak je ukázáno v Tabulce 6, když se srovná s našim kontrolním antagonistou (Příklad 10-8), antagonista hT2R8 z Příkladu 10-10 vykazuje vyšší schopnost blokovat vnímanou hořkost.
příklad číslo HTS lest ICS, vybraný jako více __ hořký p hodnota konc. antaeonistv
μΜ _ 10-8 + jiné ΠΜ
10-10 0,02 0,04 14 2 0,004
Tabulka 6. Výsledky chuťového testu porovnávající kontrolní blokátor hořkosti a silnější blokátor hořkosti 10-10.
[00466] Jak ukázaly chuťové testy tohoto příkladu, vnímání hořkosti může být sníženo nebo eliminováno včleněním antagonisty hT2R8, přičemž antagonista z Příkladu 10-10 se zdá být silnějším analogem ve srovnání se známými antagonisty hořkosti jako je N-( 1-((3,5-dimethylizoxazol4.yl)methyl)-lH-pyrazoM-yl)benzo[d][l,3]dioxol-5-karboxamid (7767). To vede k tomu, že vnímání hořkosti může být sníženo nebo eliminováno včleněním antagonist hT2R8 do kompozic, jako jsou potraviny, nápoje a/nebo léky, kde je hořká chuť vyvolaná agonisty T2R8.
Příklad 8. Identifikace antagonist hT2R8
100467] K identifikaci antagonist se vytvořily buněčné linie stabilně exprimující hT2R8 spolu s promiskuitním chiménum G16g44 proteinem, jak bylo popsáno v dřívějších přihláškách vynálezu. Byl proveden vysokopropustný test (HT) za použití stabilních buněčných linií a FLIPR (čtečky desky zobrazující fluorescenci). Použil se agonista hT2R8 k
196 aktivaci receptorů nejvýše 70-80 % jejich příslušné maximální aktivity. Pro hT2R8 se použil agonista andrografolid (200 μΜ). K identifikaci antagonist se přidaly sloučeniny s rozličnou chemickou strukturou spolu s antagonistou. Sloučeniny, které způsobily statisticky nejvýznamnější snížení aktivity receptoru, se spojily a znovu ověřily inhibičnimi křivkami v závislosti na dávce. Scaffold A a scaffold B jsou identifikovány jako hT2R8 antagonisté (Obr, 1). Specifické příklady jsou uvedeny v Tabulce 1.
Příklad 9. Antagonisté hT2R8
Přiklad 9-1: 2-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)izoindolin-13
-dion.
[00468] 2-(lH-pyrazol-4-yl)izoindolin-l,3-dion (Příklad 9-1 a) (1,5 g, 7 mmol), 4-(chlormethyl)-3,5-dimethylizoxazol (1,5 g, 10 mmol) a uhličitan česný (3,3g, 10 mmol) se míchaly v DMF (20 ml) při 80 °C po dobu 3 hodin. Reakční směs se ochladila, zředila se H2O (150 ml) a extrahovala se ethylacetátem (3x, 75 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným, zfiltrovaly se a koncentrovaly se na rotační odparce. Pevný produkt se třel s ethylacetátem/hexany (1/9) a překrystalizoval se z refluxujícího absolutního ethanolu (30 ml), což dalo 2-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-y|)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)izoindolin-1,3-dion (900 mg, 38%) jako jasnou, světle žlutou pevnou latku.'H NMR {DMSO-ťU, 400 MHz) 1,36 (d, 3H,δ 72,16 (s, 3H), 2,41 (s, 3H),=7,2 Hz), 5,22 (s, 2H). 7,81 (s, 1H), 7,91-7,83 (m, 4H), 8,21(s, 1H). MS M+H vypočteno 323,11; nalezeno 323,1, teplota tání: 170-171 °C, ukázalo se, že titulní sloučenina inhibuje hT2R08 receptor hořkosti a měla ICjo 0,18 μΜ
Příklad 9-la: l-tosyl-lH-pyrazol-4-amin.
[004691 l-Tosyi-lH-pyrazol-4-amin (Příklad 9-lb) (3 g, 12,7 mmol) a tzobenzofuran-1,3-dion (1,9 g, 13 mmol) se míchaly v DMF/acetonitrilu (1/1) (20 ml) při 100 °C po dobu 1
197 hodiny. Směs se ochladila a zředila se H2O. Sraženina se sebrala filtrací, promyla se další vodou, následována ethylacetátem a hexany. Pevný produkt se vysušil za vysokého vakua, což dalo 2-(lH-pyrazol-4-yl)izoindolin-l,3-dion (2,5 g, 92%) jako žlutou pevnou látku. MS M+H vypočteno 214,1; nalezeno 214,1. 'h NMR (CDCfi, 400 MHz), δ 7,93-8,10 (m, 6H), 13,03 (bs, 1H).
Příklad 9-lb: l-tosyl-lH-pyrazol-4-amin.
[00470] 4-Nitro-l-tosyl-IH-pyrazol (Příklad 9-lc) (3 g, 11,2 mmol) a 10 % paladium na uhlíku (800 mg) v MeOH (150 ml) se míchaly pod 202,65 kPa (2 atmosférami) vodíku v Parrově hydrogenátoru po dobu 3 hodin. Směs se zfiltrovala přes celit, koncentrovala se a přečistila se pomocí chromatografie na silikagetu (80% ethylacetát v hexanech), což dalo l-tosyl-lH-pyrazol-4-amin (1,9 g, 71%) jako růžovou pevnou látku. 'H NMR (CDCfi, 400 MHz).δ. 2,40 (s, 3H), 3,01 (bs, 2H), 7,29 (d, 2H, >8 Hz), 7,41 (d, 1H, >1,2 Hz) 7 53 (d IH, >1,2 Hz), 7,81 (d, 2H, >8 Hz).
Příklad 9-lc: 4-nitro-l-tosyl-lH-pyrazoL
[00471] 4-Nitro-lH-pyrazoi (500 mg, 4,4 mmol), 4-methylbenzen-l-sulfonylchlorid (840 mg, 4,4 mmol) a triethylamin (510 mg, 5 mmol) se míchaly v DMF (25 ml) při 80 °C po dobu 1 hodiny. Reakční směs se ochladila, zředila se H2O (200 ml) a extrahovala se ethylacetátem (3x, 100 ml). Organická fáze se promyla vodným IN HC1 (200 ml) a H,0 (200 ml), vysušila se nad síranem sodným, zfiltrovala se a koncentrovala se na rotační odparce. Pevná látka se třela s hexany, což dalo 4-nitro-l-tosyl-IH-pyrazol (600 mg, 50%) jako ne zcela bílou pevnou látku. H NMR (DMSO-d*, 400 MHz), δ 2,40 (s, 3H), 7,52 (d, 2H, >8,4 Hz), 7,98 (d, 2H, >8,8 Hz), 8,57 (s, 1H), 9,58 (s, 1H).
198 • or
Příklad 9-2: 2-((1-((3,5-dimethylboxazol-4-yl)methyl>lH-pyrazol-4-ylamm benzonitril
[00472] H&S-DimethylizoxazoM-yOme^ (100
0,44 mmol), 2-(brommethyl)benzonitril (115 mg, 0,6 mmol) a triethylamin (0,5 ml,’ 3,5 mmmol) v DMF (3 ml) se ozařovaly a míchaly v mikrovlnném reaktoru při 80 *C po dobu 10 minut. Reakční směs se ochladila, zředila se H2O (50 ml) a extrahovala se ethylacetátem (3x, 30 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným a koncentrovaly se na rotační odparce. Zbytek se rozpustil v ethanolu (70 ml), H2O (3 ml) a kyselině octové (1 ml) a směs se refluxovala po dobu 2 hodin. Roztok se koncentroval na rotační odparce, sebral se do methanolu (3 ml) a přečistil pomocí reverzní fázové HPLC ve třech 1 ml podílech (5 až 95% acetonitril v H2O: 16 minutový gradient). Čisté frakce se spojily a koncentrovaly na rotační odparce. Zbytek se třel s ethylacetátem/hexany (1/9), což dalo 2-(l -((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-!H-pyrazol-4-yl)izoindolin-l-on (85 mg, 61%) jako čistou bílou pevnou látkou, 'h NMR(DMSO-d<„ 400 MHz); 62,18 (s, 3H), 2,43 (s, 3H), 4,97 (s, 2H), 5,18 (s, 2H), 7,58-7,68 (m, 3H), 7,77 (s, IH), 8,10 (d, J= 8 Hz, 1H),8,27 (s, ΙΗ), 9,19 (bsj 1H). Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla hodnotu IC50’vyšší 30 μΜ.
Příklad 9-3: 2-(1-((3,5-din)ethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)izoindolin-l-on
100473] 2-((1-((3,5-Dimethyiizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-ylamino)methyl)benzomtnl (Příklad 9-2) (30 mg, 0,14 mmol) se míchal ve směsi MeOH/ 2N vodného NaOH (5 ml) při 100 C po dobu 30 minut v mikrovlnném reaktoru. Reakční směs se okyselila 1N vodnou HC1 (100 ml) a extrahovala se ethylacetátem (3x, 70 mi). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným a koncentrovaly. Zbytek se rozpustil v MeOH (3 ml) a přečistil pomocí reverzní fázové HPLC ve dvou 1,5 ml podílech (5 až 95% acetonitril v H,O: 16
199
minutový gradient). Čisté frakce se spojily a koncentrovaly se, což dalo 2-(1-((3,5-dimethyhzoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol4-yl)izoindolin-l-on (21 mg, 50%) jako čistou bílou pevnou látku. lH NMR (DMSO-d«, 400 MHz): δ 2,15 (s, 3H), 2,41 (s, 3H), 4,81 (s, 2H), 5,17 (s, 2H), 7,48-7,50 (m, 1H), 7,51-7,52 (m, 2H), 7,72 (d, > 7,2 Hz, 1H), 7,75 (s, 1H), 8,20 (s, 1H). Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla ICi0 11 μΜ.
Příklad 9~3; 3-(l-((3.5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)chiriazo]in-2,4(1 HJHj-dion
[00474] Hydrochlorid l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-aminu (75 mg, 0,33 mmol), methyl-(2-izocyanatobenzoát) a triethylamin (200 mg, 2 mmol) v acetonitrilu (3 ml) se ozařovaly v mikrovlnném reaktoru při 100 ‘C po dobu 30 minut. Reakční směs se ochladila, zředila se H2O (75 ml) a extrahovala se ethylacetátem (3x, 50 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným, zfiltrovaly se a koncentrovaly se na rotační odparce. Zbytek se přečistil chromatografií na sílikagelu (75% ethylacetát v hexanech), což dalo 3-( 1-((3,5-dimethylízoxazol-4-y!)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)chinazolin-2,4(lH,3H)-dton (20 mg, 18%) jako světle růžovou pevnou látku. 'H NMR (DMSOA, 400 MHz): 82,16 (s, 3H), 2,40 (s, 3H), 5,17 (s, 2H), 7,17-7,22 (m, 2H), 7,50 (s, 1H), 7,66 (dt, > 8, 1,2 Hz, 1H), 7,92 (d, J= 6,8 Hz, 1H), 7,95 (s, 1H), 11,52 (bs, 1H). Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla 1C5O 1,5 μΜ.
Přiklad 9-5: l-benzyl-3-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lř/-pyrazol-4-yl)tetrahydropyrimidin-2(l#)-on
[00475] 1-(1-((3,5-Dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lř/-pyrazol-4-yl)tetrahydropyrimidin-2(lZ0-on (Příklad 9-5a) (50 mg, 0,18 mmol) a 60% hydrid sodný (8 mg, 0,20 mmol) v
DMF (3 ml) se míchaly při teplotě místnosti po dobu 15 minut, pak se ochladily na 0 qC. Do
200
směsi se přidal benzylbromid (31 mg, 0,18 mmol) a nechal se ohřát, pak se míchal po dobu 2 hodin. Reakce se ukončila methanolem a koncentrovala se. Reakční směs se zředila solankou (50 ml) a extrahovala se dichlormethanem (2x, 50 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem hořečnatým, zfiltrovaly se a koncentrovaly se na rotační odparce. Zbytek se sebral do dichlomiethanu (5 ml) a přečistil se pomocí chromotografíe na silikagelové koloně (100% až 90% dichlormethan v methanolu: 30 minutový gradient), což dalo l-benzyl-3-( 1-((3,5-dimethylÍ2oxazol-4-yl)methyl)-l//-py^ (20 mg, 30%) jako bílou pevnou látku. *H NMR (DMSO^6,400 MHz): δ 1,85-1,91 (m, 2H), 2,10 (s, 3H), 2,37 (s, 3H), 3,12 (m, 2H), 3,55 (t, 5,8 Hz, 2H), 4,48 (s, 2H), 5,05 (s, 2H),
7,22-7,31 (m, 5H), 7,49 (s, 1H), 7,84 (s, 1H). LC/MS; [M+H] vypočteno pro C70H23NsO2· očekáváno 366,19; nalezeno 366,15. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla IC50 1,65 μΜ.
Příklad 9-5a: 1-(1-((3,5-dimethyl izoxazol-4-vDmethyl)-1tf-Dvrazol-4-vntetrahvdropyrimidin-2(l#)-on
1004761 H3-Chloipropyl)-3-(l-((3,5-dimeihylizoxazol-4-yl)methyl)lW-pyrazol-4yttnMov™. (Ifiklad 9-5b) (200 mg, 0,64 mmol) „60% hydnd SCK1„ý (2Í mg_ 0JI „ DMF 12 ml) se míchaly při 0 °C po dobu 15 minut, pak „ ponechaly „hřát „a leplom nosmosu a míchaly se po dobu 2 hodin. Reakční smis se methanolem a koncentrovala se. Reakční směs se zředila solankou (50 ml) a extrahovala se dichlormethanem (2x, 50 ml). Spojené otganieké extrakty se vysušily nad stanem hořečnatým, zlillrovaly se a koncentrovaly se. Zbytek se sebral do dmhtaahanu (5 ml) a přečistil pomoci chromatografie na silikagelové koloně (100% až 90% dichlormeihan v methanol: 30 minutový gradient), což dalo 1-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)m«hyl)-lH1Jyrazo|ut.yl). tetrahydrnpyrimidm-2(l/ř)-on (84 mg, 48%) jako bílou pevnou látku. Ή NMR (DMSOmU 400 MHz): 61,85-1,91 (m, 2H), 2,10 (s, 3H), 2J7 (s. 3H). 3,12 (m, 2H), 3,48 (t. J = 6.0 Hz' 2H), 5,05 (s, 2H), 6,57 (s. 1H), 7,46 (s. 1H), 7,80 (s, 1H). LC/MS; [MeH] vypočteno pro Ci3H|7N5O2; očekáváno 276,14; nalezeno 276,10.
201
-Dvrazol-4-yl)močovina
(00477] 1 -((3,5-Dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-l/Apyrazol-4-amin (342mg, 1,78 mmol) a 2-chlorpropyLdzokyanát) (213 mg, 1,78 mmol) v acetonitrilu (5 ml) se zahřívaly při 65 °C po dobu 16 hodin. Reakční směs se ochladila na teplotu místnosti, koncentrovala a zbytek se rozpustil v dichlormethanu (5 ml) a přečistil pomocí chromatografie na silikagelové koloně (100% až 90% dichlormethan v methanolu: 30 minutový gradient), čisté frakce se spojily a koncentrovaly, pak se třely s ethylacetátem/hexany (1/9), což dalo (l-(3-chlorpropyl)-3-(l-«3,5-dimethylizoxazoM-yl)methyl)l^ (2i8 mg> 391%) jako biJou pevnou látku. LC/MS; [M+H] vypočteno pro C,2HlbClN5O2; očekáváno 298 10· nalezeno 298,10.
Přiklad 9-6: l-«»enzyl-HH0,5-diniethylizo^
-triazinan-2-on
100478] i-Benzyl-5-(2,4-dimethoxybenzyi).3-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)melhyl)-l//-pyrazol-4-yl)-l,3,5-triazinan-2-on (Příklad 9-6a) (44 mg, 0,09 mmol), anizol (9 mg, 0,09 mmol) a 50% roztok kyseliny frifluoroctové/dichlonnethanu (1 ml) v dichlormethanu (1 ml) se smíchaly při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Reakční směs se koncentrovala, ukončila se nasyceným hydrogenuhličitanem sodným (50 ml), extrahovala se ethyíacetátem (2x, 50 ml) a promyla se solankou (50 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem horečnatým, zfdtrovaly a koncentrovaly se. Přečištění chromatografií na silikagelové koloně (100% až 90% dichlormethan v methanol: 30 minutový gradient) dalo 1 -benzyl-3-( 1-((3,5-dimethyhzoxazol-4-yl)methyl)-W-Pyrazol-4-yl)-l,3,5-triazinan-2-on (19 mg, 62%) jako bílou pevnou látku. LC/MS; [M+H] vypočteno pro C„H22N6O2; očekáváno 367,18;
202 nalezeno 367,20. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla IC 5,84 μΜ.
Přiklad 9-6a: i-benzyl-Stl^dimethoxybenzyl^-iHfXSmethyl)-1 H-pyrazol-4-y I)- 13,5-triazinan-2-on
I0M79I |.BetlZý|.3-(l.((3,5-dimahylizoxazoM-yl)m^^^ (Ph'klad Mb) (50 mg, 0,(5 mmol), 2,4-mertoxybenzylamm (26 mg, 0,15 mmol) a formaldchyd (37 hmom.% v radou) CJ mg, 0J| mmol) se zahřívaly M 100 .c po ,6 hodin. Reakční směs se ochladila na teplotu mlsnosti, zředila K solankou (50 ml) a extrahovala « dichlotmcilianem (2x, 50 ml). Spojené organické extrakty se vysuái|y nad síranem hořečnatým, zfillrovaly se a koncentrovaly se. Zbytek se přečistil chromatograftí na silikagelové koloně (100% ař 90% dichlormerhan v methanol: 30 minutový gnrdient), což dalo 1 -benzy|.5.(2,<Wimethoxybenzyl).341 -((3,S-dimethyláoxazoM-yl)methyl)- Iřř-pyrazoM.yl).l,3,5.ttiazma11.2™ <44 mg, 56%) jako olej. LC/MS; (M+HJ vypočteno pro CrsHjiNňO^; očekáváno 517,25; nalezeno 517,20.
Příklad 9-6b: l-benzy 1-3-( 1-((3,5-dimethylizoxazo^
-yDmočovína
100480] 1-((3,5-Dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-I//-pyrazol-4-amin (287 mg, 1,49 mmol) a benzylizokyanát (199 mg, 1,49 mmol) v acetomtrilu (5 ml) se zahřívaly při 65 °C po dobu 16 hodin. Reakční směs se ochladila na teplotu místnosti a koncentrovala se. Zbytek se přečistil chromatografií na silikagelové koloně (100% až 90% dichlonnethan v methanolu; 30
203 minutový gradient) a se třel s ethylacetátem/hexany (1/9), což dalo l-benzyl-3-(l-((3,5-dimethylIZoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazOl-4-yl)moČovinu (246 mg, 51%) jako bílou pevnou látku. LC/MS; [M+H] vypočteno pro C17H19N5O2; očekáváno 326,15; nalezeno 326,10.
Přiklad 9-7: 5-benzyl-l-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-_vl)methylýl//-pyrazol-4-yl)-3-fenethyl-1,3,5-triazinan-2-on
[004811 Připravený jak v Příkladu 9-6a z 1-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-l/f-pyrazol-4-yl)-3-fenethylmočoviny (Příklad 9-7a), formaldehydu a benzylaminu. Výtěžek: 15%. ‘H NMR (DMSO-t/Ě, 400 MHz): 52, 11 (s, 3H), 2,37 (s, 3H), 2, 69 (t, J= 7, 6 Hz, 2H) 3, 39 (t, 7, 8 Hz, 2H), 3, 81 (s, 2H), 4, 16 (s, 2H), 4, 42 (s, 2H), 5, 05 (s, 2H), 7, 17-7, 32
10H), 7,42 (S, 1H), 7, 78 (s, 1H). LC/MS; [M+H] vypočteno pro C27H30N6O2; očekáváno 471,24; nalezeno 471,15. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla 1C5O 2,64 μΜ.
Příklad 9-7a: 1-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl}-3-fenethyl. močovina
[00482] Připravený jak v Přikladu 9-6b z 1-((3,5-dimethyIizoxazol-4-yl)methyl)-l//-pyrazol-4-aminu a fenethylizokyanátu. Výtěžek: 29%. 'H NMR (DMSO-í/6, 400 MHz): 52, 10 (s, 3H), 2, 36 (s, 3H), 2, 69 (t, y = 7, 2 Hz, 2H), 3, 25 (q, J= 7, 4 Hz, 2H), 5,02 (s, 2H), 6,’ 00 (t, J= 5, 8 Hz, 1H), 7, 16-7, 30 (m, 6H), 7, 68 (s, 1H), 8, 13 (s, 1H). LC/MS; [M+H] vypočteno pro GULNíCH; očekáváno 340,17; nalezeno 340,20.
204
Příklad 9-8: HH(3,54MmethylizoMzol-triazinan-2,4,6-trion
[00483] 1-(1-((3,5-Dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-l^Pyrazol-4-yl)-3-fenethylmočovina (Příklad 9-7a) (100 mg, 0,29 mmol) v THF (2 ml) se ochladila na 0 °C a pomalu se přidával n-chlorkarbonylizokyanát (93 mg, 0,88 mmol). Po přídavku se ponechala reakční směs ohřát na teplotu místnosti a míchala se po dobu 1 hodiny. Reakční směs se koncentrovala a zbytek se přečistil chromatografií na silikagelové koloně (100% až 90% dichlormethan v methanolu: 30 minutový gradient), což dalo (H 1-((3,5-dimethyl^^ yl)3-fenethyl-l,3,5-triazinan-2,4,6-trion (100 mg, 83%) jako bílou pevnou látku. 'H NMR (DMSO-rí6, 400 MHz); 52, 13 (s, 3H), 2, 39(s, 3H), 2, 82 (t, J = 5,8 Hz, 2H), 3, 88 (t, J= 8, 0 Hz, 2H), 5, 17 (s, 2H), 7, 19-7, 31 (m, 5H), 7, 44 (s, 1H), 7, 89 (s, 1H), 11, 84 (s, 1H), LC/MS; [M+H] vypočteno pro C20HaN6O4; očekáváno 409,15; nalezeno 409,20. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla ICJ0 3,03 μΜ.
Příklad 9-9: 1-benzyl“3-(l-((3^-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-l,3,5-triazinan-2,4,6-trion
100484) l-Benzyl-3-( I 4(3,5-dim«hylizoxazol4-yl)m«hyl). I H-pymzoU yl)močovtaa (PHktad 95bl( 100 mg,0J1 mmol) vTHF(2 ml)se «hladila „a o t a pomalu se přidával -chlorkatbonylizokyanát (97 mg. 0,92 mmol). Po přídavku se reakční smis ponechala ohřit M teplou místnosti a míchala se po dobu 1 hodiny. Reakční smis se koncentrovala a zbytek se přečíslil chromatogmlii na silikagelové koloné (100% až 90% dichlormahanu v methanolu: 30 minutový gradient), což dalo |.benzy|.3-|l-((3.5.dim«hylizoxireol.4.
205 y0methyl)-t/f-pyrazol-4-y|)-l,3,5-triazinan-2,4,6-trion (112 mg, 93%) jako bílou pevnou UíL·,, .....
látku. H NMR (DMSO-J6, 400 MHz); 52,12 (s, 3H), 2,38(s, 3H), 4,87 (s, 2H), 5,16 (s, 2H), 7,23-7,34 (m, 5H), 7,45 (s, 1H), 7,90 (s, 1H), 11,93 (s, 1H). LC/MS; [M+H] vypočteno pro Cl9H[8N6O4; očekáváno 395,14; nalezeno 395,15. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla IC5fl 1,14 μΜ.
Přiklad 10. hT2R8 antagonists: Příprava sloučenin podle vynálezu
Příklad 3-(1-((3,5-dimethyHzoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-y|)imidazolidin
-2,4-dion |00485| 1-((3,5-Dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-karbonylazid (Příklad 10la) (6 g, 25,5 mmol) v toluenu (100 ml) se refluxoval po dobu 1 hodiny a ochladil se na teplotu okolí pod atmosférou dusíku. Přidal se hydrochlorid methylesterglycinu (3,1 g 26 mmol) a triethylamin (3,2 g, 32 mmol), směs se refluxovala po dobu 16 hodin. Reakční směs se ochladila a rozpouštědlo se odstranilo na rotační odparce. Pevná látka se znovu rozpustila v ethylacetátu (100 ml) a organická fáze se promyla IN HC1 roztokem (2x, 150 ml). Vodná fáze se opět extrahovala ethylacetátem (2x, 75 ml) a spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným a koncentrovaly se. Výsledná pevná látka se třela ethylacetátem/hexany (1/9) a vysušila se za vysokého vakua, což dalo 3-( 1-((3,5-dimethylizoxazoM-yl)methyl)-1H-pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dion (5.2 g, 74%) jako bílou pevnou látku. 'H NMR (DMSO-de, 400 MHz); δ 2,19 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 4,09 (s, 2H), 5,06 (s, 2H), 5,68 (bs, 1H), 7,90 (s, 1H), 8,05 (1H). Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla [Cn 1,7 μΜ.
Příklad 10-la: l-((3^-diraethylizoxazol-4-yl)methyi)-lH-pyrazol-4-kart>onylazid
[00486] Více než 10 minut se přidával po kapkách dusičnan sodný (450 mg, 6,5 mmol, v H2O) (10 ml) do suspenze l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-karbohydrazidu (Příklad 10-lb) (1 g, 4,3 mmol) v 10% vodné kyselině octové (50 ml) a ochladila se na 0 C pomocí ledové lázně. Reakční směs se míchala po dobu dalších 15 minut, pak se extrahovala cthylacetátem (3x, 75 ml). Spojené organické extrakty se promyly vodným nasyceným uhličitanem sodným (100 ml), následovaným H2O (100 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným, zfiltrovaly a koncentrovaly se. Pevný produkt se třel ethylacetátem/hexany (1/9) a vysušil se ve vakuu, což dalo l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-karbonylazid (lg, 93%) jako bílou pevnou látku, 'h NMR (CDC13, 400 MHz): 82,20 (s, 3H), 2,44 (s, 3H), 5,07 (s, 2H), 7,81 (s, 1H), 7,93 (s, 1H).
Příklad 10-lb: 1-((3,S-dimethylizoxazoH-yDniethylJ.lH-pyrazoM-karbohydrazid
100487] Ethyl-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-karboxylát) (Příklad 10-lc) (6 g, 24 mmol) a hydrazin (7,5 g, 240 mmol) se míchaly v EtOH (100 ml) při refluxu po dobu 12 hodin. Roztok se koncentroval na rotační odparce a pevný produkt se třel ethylacetátem/hexany (1/9) a vysušil se za vysokého vakua, což dalo 1-((3,5dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-karbohydrazid (5.5 g, 97%) jako čistý bílou pevná látka. !H NMR (DMSO-de, 400 MHz); 82,11 (s, 3H), 2,39 (s, 3H), 5,15 (s, 2H), 7,81 (s IH), 8,17 (s, 1H), 9,31 (bs, 1H).
Příklad 10-lc: 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)iiiCthyI)-lH-pyrazol-4-karboxyIát
[004881 EthyKlH-pyrazol-4-karboxylát) (4,2g, 30 mmol), 4-(chlormethyl)-3,5-dimethyhzoxazol (5.1 g, 35 mmol) a uhličitan česný (9,8 g, 30 mmol), v DMF (50 ml) se míchaly při 80 C po dobu 12 hodin. Reakční směs se ochladila na teplotu okolí, zředila se 0,1 N HC1 (150 ml) a extrahovala se cthylacetátem (3x, 75 ml). Spojené organické extrakty se
207 vysušily nad síranem sodným a koncentrovaly se na rotační odparce. Pevný produkt se třel ethylacetátem/hexany(l/9) a sebral se filtrací, což dalo ethyl-(l-((3,5-dÍmethylizoxazoM-yl)mcthyl)-lH-pyrazol-4-karboxylát) (6 g, 80%) jako bílou pevnou látku. 'H NMR (CDClj, 400 MHz): 61,34 (t, J= 7,2 Hz, 3H), 2,19 (s, 3H), 2,43 (s, 3H), 4,29 (q, J= 7,2 Hz, 2H), 5,06 (s, 2H), 7,77 (s, 1H), 7,91 (s, 1H).
Příklad 3-(1-((3,5-dimethylizoXa2ol-4-yl)methyl)-lH-py™^^^
-2,4-dion
[00489] Připravený jak v Příkladu 10-1 z hydrochloridu methylester (+/-)-fenylalaninu a 1-((3,5-dimethyhzoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-karbonylazidu. Výtěžek: 58%. 'h NMR (Aceton^, 400 MHz); 52,17 (s, 3H), 2,43 (s, 3H), 3,07 (dd, J= 14,4, 6,4 Hz, 1H), 3,20 (dd, J = 14, 4,4 Hz, 1H), 4,53 (t, 7=4,8 Hz, 1H), 5,18 (s, 2H), 7,27-7,19 (m, 5H), 7,46 (bs, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,99 (s, 1H). MS M+H vypočteno 366,15; nalezeno 366,1. Teplota tání: 169 až 171 °C. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla ICS0 0,18 μΜ.
208
Příklad 10-3: (S)-5-benzyl-3-(l-((3,5-dimetliylizoxazol-4-yl)inethyl)-lII-pvi azoM-yl)imidazolidin-2,4-dion
[00490] Připravený jak v Příkladu 10-1 z hydrochloridu methylester (S)-fenylalaninu a 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-karbonylazidu (Příklad 6a). Výtěžek: 13% izolovaný chirální chromotografii 'H NMR (CDC13, 400 MHz):. 52,19 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 2,88 (dd, J= 13,6, 9,2 Hz, 1H), 3,35 (dd, J = 13,6, 3,6 Hz, 1H), 4,31-4,35 (m, 1H) 5,06 (s, 2H), 5,53 (bs, 1H), 7,21-7,36 (m, 5H), 7,85 (s, 1H), 8,01 (s, 1H). LC/MS; [M+H] vypočteno pro Ci9H|9NsO3; očekáváno 366,15; nalezeno 366,1. [a]D= (-)-136, c=0,l ethanoi. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla IC50 0,12 μΜ.
Příklad 10-4; (R)-5-benzyl-3-(l-((3,5-dinjethylizoxazol-4-yl)niethyl)-lH-pyrazol-4-yl)iniidazolidin-2,4-dion
[00491] Připravený jak v Příkladu 10-1 z hydrochloridu methylester (R)-fenylalaninu a 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-karbonylazidu. Výtěžek: 9% se izoloval chirální chromotografii 'H NMR (CDC13, 400 MHz): 52,19 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 2,88 (dd J = 13,6, 9,2 Hz, 1H), 3,35 (dd, 13,6, 3,6 Hz, 1H), 4,31-4,35 (m, 1H) 5,06 (s, 2H), 5,53 (bs, 1H), 7,21-7,36 (m, 5H), 7,85 (s, 1H), 8,01 (s, 1H). MS M+H vypočteno 366,15; nalezeno 366,1. [a]D= (+)-124, c=0,2, ethanol. Titulní sloučenina vykázala inhibici HT2R08 receptorů hořkosti a měla 1C5O 0,11 μΜ.
209
Příklad 10-5: 3-( 1-((3,5-dimethylÍ2Oxazol-4-yl)inethyl)-l H-pyrazol-4-yl)-l-(2-fenoxyethyl)imidazolidin-2,4-dion
[00492] 3-( 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1 H-pyrazol-4-yl)imidazoIidin-2,4-dton (Příklad 10-1) (200 mg, 0,7 mmol), (2-bromethoxy)benzen (200 mg, 1 mmol) a uhličitan česný (325 mg, 1 mmol) se ozařovaly v mikrovlnném reaktoru při 85 ‘C po dobu 20 minut. Reakční směs se ochladila na teplotu místnosti, zředila se vodným IN HC1 (100 ml) a extrahovala se ethylacetátem (3x, 75 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným, zfiltrovaly a koncentrovaly se. Zbytek se sebral do methanolu (10 ml) a přečistil se pomocí reverzní fázovou HPLC (5 az 95% acetonitril v H2O: 25 minutový gradient). Čisté frakce se spojily, koncentrovaly, pak se znovu rozpustily v absolutním ethanolu a koncentrovaly se na rotační odparce (4x), což dalo 3-(I-((3,5-dimethylizoxa2ol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-l-(2-fenoxyethyl)imidazolidin-2,4-dion (150 mg, 54%) jako bílou pevnou látku.'H NMR (CDCb 2,1?, 400 MHz): δ (s, 3H), 2,41 (s, 3H), 3,86 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 4,19 (t, J =4,4 Hz, 2H), 4,25 (s, 2H), 5,05 (s, 2H), 6,88 (dd, J = 9,2, 1,2 Hz, 2H), 7,00 (dt, J= 7,6, 1,2 Hz, 1H), 7,27-7,32 (m, 2H), 7,89 (s, 1H), 8,05 (s, 1H). MS M+H vypočteno 396,17; nalezeno 396,1. Teplota tání: 117-118 “C. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a méla IC5o 0,06 μΜ.
Přiklad 10-6: 3-(1-((3,5-dímethylkoxazol-4-yl)methyl)-l H-pyrazol-4-ylH-(3-methoxybenzyl)imidazolidin-2,4-dion
[00493] Připravený jak v Příkladu 10-5 z 3-(l-((3(5-dimethylizoxazol-4-yl)methyi)-lH-pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dionu (Příklad 6) a 3-methoxy-benzylbromidu. Výtěžek: 55%. 'H NMR (CDCb, 400 MHz): 82,19 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 3,81 (s, 3H), 3,85 (s, 2H),
210
4,58 (s, 2H), 5,06 (s, 2H), 6,81-6,88 (m, 3H). 7,26-7,31 (m, 1H), 7,92 (s, 1H), 8,08 (s, 1H). Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla IC50 0,07 μΜ.
Příklad 10-7: Methyl-(3-((3-( 1-((3,5-dímethylizoxazol-4-yl)methyl)-l H-pyrazol-4-y|)-2,4-dioxoimidazolidin-l-yl)methyl)benzoát)
[00494] Připravený jak v Příkladu 10-5 z 3-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dionu a 3-methoxy-benzylbromidu. Výtěžek: 83%. 'h NMR (CDClj, 400 MHz): 52,20 (s, 3H), 2,43 (s, 3H), 3,86 (s, 2H), 3,93 (s, 3H), 4,67 (s, 2H), 5,07 (s, 2H), 7,45-7,52 (m, 2H), 7,93 (s, 1H), 7,95 (s, 1H), 8,03 (dd, J= 7,2, 1,6 Hz, 1H), 8,08 (s, 1H). Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla ICÍO 0,09 μΜ.
Příklad 10-8: Kyselina 3-((3-( l-((33-dimethylizoxazol-4-vl)iuethyl)-l H-pyrazol-4-y!)-2,4-dioxoimldazolidin-l-yl)methyl)benzoová
100495] 3-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dion (500 mg, 1,8 mmol) (Příklad 10-5), methyl-(3-(brommethyl)benzoát) (456 mg, 2 mmol) a uhličitan česný (650 mg, 2 mmol) se smíchaly v DMF (4 ml) v mikrovlnném reaktoru při 85 °C po dobu 20 minut. Reakční směs se ochladila, zředila se IN vodnou HCl (100 ml) a extrahovala se ethylacetátem (3x, 75 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným, zfilmovaly se a koncentrovaly se. Surový ester se rozpustil v methanolu (5 ml) a přidal se vodný NaOH (50 ml, !0 hmotn.%) a směs se míchala při teplotě okolí po dobu 2 hodin. Reakční směs se okyselila IN HCl (150 mi) a extrahovala se ethylacetátem (3x, 75 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným, ztiltrovaly se a koncentrovaly se na rotační odparce. Volná kyselina se třela ethylacetátem/hexany (1/9) a
211 vysušila se za vakua, což dalo kyselinu 3-((3-(b((3,5-dimethylizoxazoM-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-2,4-dioxounidazoiidin-l-yl)methyl)benzoovou (61O.mg, 83%) jako bílou pevnou latku.'H NMR (DMSO^, 400 2,13 (s, 3H), 2,29 (s, 3H), 4,00 (s, 2H), 4,59 (s, 2H), 5,18 (s, 2H),MHz): δ 7,46-7,59 (m, 2H), 7,78 (s, 1H), 7,85-7,88 (m, 2H), 8,18 (s, 1H). Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a mčla IC50 1,8 μΜ,
Příklad 10-9: 3-((3-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-2,4-dioxo-itnidazolidin-l-yl)methyl)-N-nietliylbenzamid
[00496] Kyselina 3-((3-(l-((3,5-dimethylizoxazoM-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-2,4dioxo-imidazolidin-l-yl)methyl)benzoová (100 mg, 0,24 mmol) (Přiklad 10-8), hydrochlorid methylaminu (67 mg, 1 mmol), triethylamin (155 mg, 1.5 mmol) a EDC (57 mg, 0,3 mmol) v acetomtnlu (3 ml) se ozařovaly v mikrovlnném reaktoru při 80 ’C po dobu 10 minut. Reakční směs se ochladila, zředila se vodnou IN HC1 (100 ml) a extrahovala se ethylacetátem (3x, 75 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným, zfiltrovaly se a koncentrovaly se. Surový produkt se rozpustil v MeOH (3 ml) a přečistil se pomocí reverzní fázové HPLC (5 až 95% acetonitril v H2O: 25 minutový gradient), což dalo 3-((3-(1-((3,5’dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-2,4-dioxoimidazolidin-l-yl)methyl)-N-methylbenzamid (25 mg, 25%) jako bílou pevnou látku. MS M+H vypočteno 423,17; nalezeno 423,2. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla IC50 0,14 μΜ.
Přiklad 10-10: 3-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-l-(3-hydroxybenzyl)imidazolidin-2,4-dion:
HO
[004971 Připravený jak v Příkladu 10-1 z 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-IH-pyrazol-4-karbonylazidu (Příklad 10-la) a methyl-(2-(3-hydroxybenzylamino)acetátu) (Příklad 10-10a). Výtěžek: 24%. *H NMR (DMSO, 400 MHz): 52,15 (s, 3H), 2,41 (s, 3H), 3,99 (s, 2H), 4,45 (s, 2H), 5,21 (s, 2H), 6,70 (m, 3H), 7,15 (m, H), 7,80 (s, 1H), 8,19 (s, H), 9,44 (s, H). LC/MS; [M+H] očekáváno 382,1; nalezeno 382,1. Teplota tání: 135-136 “C. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla ICJ0 0,035 μΜ.
Příklad 10-10a: methy|-(2-(3-hydroxybenzylamino)acetát):
100498] Methylester glycinu (500 mg, 4 mmol) a 3-hydroxybenzaldehyd (480mg, 4nunol) se rozpustily v 5 ml THF/Methanol (1:1). Kyselina octová (240mg, 4mmol) a 1M kyanoborhydrid sodný v THF (4,8ml, 4,8 mmol) se pomalu přidaly do reakční směsi. Reakční směs se ozařovala v mikrovlnném reaktora při 85 ’C po dobu 15 minut, ochladila se na teplotu místnosti a soli se odstranily filtrací. Čirý roztok se koncentroval a zbytek se přečistil pomocí reverzní fázové HPLC (10 až 95% acetonitril v H,O:25 minutový gradient), což dalo titulní sloučeninu jako čirý gel. Výtěžek 45%. MS M+H vypočteno 196,1; nalezeno 196,1.
Příklad 10-11: 3-(1-((3,5-dÍmethylizoiazol-4-yl)methyl)-l H-pyrazol-4-yl)-l-(2-liydroxybenzyl)in]idazolidin-2,4-dion:
|00499| Připravený jak v Příkladu 10-1 z 1-((3,5-dimethylizoxazoM-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-karbonylazidu (Příklad 10-la) a methyl-^-^-hydroxybenzylaminoJacetátu) (Příklad 10-lla). Výtěžek: 28%. 'H NMR (DMSO, 400 MHz): 52,12 (s, 3H), 2,38 (s, 3H), 4,00 (s, 2H), 4,45 (s, 2H), 5,17 (s, 2H), 6,83 (m, 2H), 7,10 (m, 2H), 7,78 (s, 1H), 8,16 (s, H), 9.66 (s, H). LC/MS; [M+H] očekáváno 382,1; nalezeno 382,2. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla ICM 0,07 μΜ.
Příklad 10-lla: methy!-(2-(2-hydroxybenzylamino)acetát):
213
100500] Připravený jak v Příkladu 10-10a z methylesterů glycinu a 2-hydroxybenzaldehydu. Výtěžek 40%. MS M+H vypočteno 196,1; nalezeno 196,1
Přiklad 10-12: 3-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyIMH-pyrazoI-4-vl)-l-(4-hydroxybenzyl)imidazolidin-2,4-dion:
1005011 Připravený jak v Příkladu 10-1 z i-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-karbonylazidu a methyl-(2-(4-hydroxybenzylamino)acetátu) (Příklad 10-12a). Výtěžek 9%. 'H NMR (DMSO, 400 MHz):. 62,117 (s, 3H), 2,383 (s, 3H), 3,918 (s, 2H\ 4,387 (s, 2H), 5,174 (s, 2H), 6,719 (J=8,8, d, 2H), 7,108 (J=8,8, m, 2H), 7,761 (s, 1H), 8,154 (s, H), 9,399 (s, H). LC/MS; [M+H] očekáváno 382,1; nalezeno 382,2. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla IC50 0,06 μΜ.
214
Příklad 10-12a: methyl-(2-(4-hydroxybenzylamino)acetát):
[00502] Připravený j ak v Příkladu 10-10a z methylester glycinu a 4-hydroxybenzaldehydu.
Výtěžek 40%. MS M+H vypočteno 196,1; nalezeno 196,1
Příklad 10-13: 3-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-l-(3-hydroxy-4-methoxybenzyl)imidazolidin-2,4-dion:
[005031 Připravený jak v Příkladu 10-1 z 1-((3,5-dimethyliZOxa2oM-yl)methyl)4H-pyrazol-4-karbonj/lazídu (Příklad 10-la) a methyl-(2-(3-hydroxy-4-methoxybenzylaminojacetátu) (Příklad 10-13a ). Výtěžek 22%. 'h NMR (DMSO, 400 MHz): 82,119 (s, 3H), 2,383 (s, 3H), 3,716 (s, 3H), 3,923 (s, 2H), 4,361 (s, 2H), 5,117 (s, 2H), 6,667 (m, 2H), 6,863 (J=8,4, d, 1H), 7,766 (s, H), 8,159 (s, H). MS M+H vypočteno 412,1; nalezeno 412,1, Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla IC50 0,1 μΜ.
Příklad 10-13a: methyl-(2-(3-hydroxy-4-methoxybenzylamino)acetát):
100504] Připravený jak v Příkladu 10-10a z methylester glycinu a 3-hydroxy-4-methoxybenzaldehydu. Výtěžek 47%. MS M+H vypočteno 226,1; nalezeno 226,1
215
Příklad 10-14: 3-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-l-(3-(2
-methoxyethoxy)benzyl)imidazolidin-2,4-dion:
100505] Připravený jak v Příkladu 10-1 z l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH•pyrazol-4-karbonylazidu (Příklad 10-la) a methyl-(2-(3-(2-methoxyethoxy)-benzylamino)acetátu) (Příklad 10-14a). Výtěžek 27%. H NMR (DMSO, 400 MHz); 32,12 (s, 3H), 2,38 (s, 3H), 3,26 (s, 3H), 3,62 (t, J=4,4, 2H), 3,98 (s, 2H), 4,06 (t, J=4,4, 2H), 4,48 (s, 2H), 5,18 (s, 2H), 6,86 (m, 3H), 7,24 (t, >8, 1H), 7,78 (s, 1H), 8,17 (s, 1H). MS M+H vypočteno 440,2; nalezeno 440,2. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla ICjo 0,07 μΜ.
Přiklad 10-14a: methyl-(2-(3-(2-inethoxyethoxy)benzylaniino)acetát):
[005061 Připravený jak v Příkladu 10-10a z methylesteni glycinu a 3-(2-methoxyethoxy)benzaldehydu. Výtěžek 55%. MS M+H vypočteno 254,1; nalezeno 254,1.
216
Příklad 10-15:3-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1 H-pyrazol-4-yl). 1-(2
-(methylthio)bcnzyl)imidazolidin-2,4-dion:
[00507] Připravený jak v Příkladu 10-1 z l-((3,5-dimethylizoXazol-4-yl)methyl)-lH. -pyrazol-4-karbonylazidu (Přiklad 10-la) a methyl-(2-(2-(methylthio)benzylamino)acetátu) (Příklad l0-15a). Výtěžek 67%. 'h NMR (DMSO, 400 MHz): 62,12 (s, 3H), 2,39 (s, 3H), 2,48 (S, 3H), 3,98 (s, 2H), 4,54 (s, 2H), 5,19 (s, 2H), 7,18 (m, IH), 7,30 (m, 3H), 7,79 (s, 1H), 8,18 (s, 1H). LC/MS; [M+H] očekáváno 412,1; nalezeno 412,1. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla 1C5O 0,03 μΜ.
Příklad 10-15a: methyl-(2-(2-(methylthio)benzy!anuno)acetát):
[005081 Připravený jak v Příkladu 10-10a z methylesteru glycinu a 2-(methylthio)benzaldehydu. Výtěžek 50%. MS M+H vypočteno 226,1, nalezeno 226,1.
Příklad 10-16:3-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazoI-4-yl)-l-(2-(2
-methoxyethoXy)benzyl)imidazolidiii-2,4-dion:
100509] Připravený jak v Příkladu 10-5 z 3-(l-((3,5-dimethylizoXazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yi)-l-(2-hydroXybenzyl)imidazolidin-2,4-dionu (Příklad 10-11) a 2-bromethylmethyletheru. Výtěžek 19%. Ή NMR (DMSO, 400 MHz): 62,11 (s, 3H), 2,08 (s, 3H), 3,25 (s, fl ·
217
3H), 3,64 (t, >3,6, 2H), 4,00 (s, 2H), 4,11 (t, >3,2, 2H), 4,27 (s, 2H), 5,17 (S, 2H), 6,90 (m, 1H), 7,00 (m, 1H), 7,26 (m, 2H), 7,76 (s, 1H), 8,15 (s, 1H). Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla 1C5O 0,1 μΜ.
Příklad 10-17:33-(1-((3,5-dímethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyra2oI
-$ulflnyl)benzyl)iniidazolidin-2,4-dion:
[00510( Ve 20 ml mikrovlnné zkumavce se rozpustily 3-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-y|)-l-(2-(methylthio)benzyl)imidazolidin-2,4-dion (Příklad 10-15) (70 mg, 0,17 mmol) a m-CPBA (58 mg, 0,34 mmol) v dichlormethanu při 0 “C. Reakční směs se míchala při 0 °C a ponechala se ohřívat na teplotu místnosti po dobu 4 hodin. Rozpouštědlo se z reakční směsi odstranilo za vakua a surový produkt se rozpustil v 1 ml ethanolu a přečistil se variantní HPLC (10 až 95% acetonitril/voda; 25 minut). Přečištěná frakce se odpařila za vakua, což dalo titulní sloučeninu. MS M+H vypočteno 428,1; nalezeno 428,1. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla 1CÍO 0,4 μΜ. Výtěžek12 mg, 17%.
Přiklad 10-18: 3-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-l-(2-methoxybenzyl)imidazolidin-2,4-dion:
1005111 Připravený jak v Příkladu 10-5 z STHIS.SxImrethylizoxazol.d-yDmetbyD-IH-pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4.dion (Příklad 10-1) a HbrommcthylW-methoxybenzenu (199 mg, 1 mmol). Výlííek: 33%. MS M+H vypršeno 396,1; nálezem, 396. l.Třtulní sloučenina vykázala in hrbrci hT2R0S receptoru hořkosti a míla IC„ 0,06 μΜ.
218
Příklad 10-19: 2-((3-( 1-((3,5-dimethylizoxazoi-4-yl)methyl)-IH-pyrazol-4-yl)-2,4-dioxoimidazolidin-l-yl)methyl)beiizoiiitril:
[00512] Připravený jak v Přikladu 10-5 z 3-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH_pyrazol-4-yl)iniidazolidin-2,4-dionu (Příklad 10-1) a 2-(brommethyl)benzonitrilu. Výtěžek: 27%. MS M+H vypočteno 391,1; nalezeno 391,l.Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla IC50 0,5 μΜ.
Přiklad 10-20: 3-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)inethyl)-lH-pyrazol-4-yl)-l-(2-methyl benzyl)imídazolidin-2,4-dion:
[005131 Připravený jak v Příkladu 10-5 z 3-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-iHpyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dionu (Příklad 10-1) a l-(brommethyl)-2-methylbenzenu. Výtěžek: 21%. MS M+H vypočteno 380,1; nalezeno 380,1. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla 1CJO Ο,ΙμΜ.
219
Přiklad 10-21: 3-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)niethy 1)-1 H-pyrazol-4-yIF 1-(2-fluorbenzyl)imidazolidin-2,4-dion:
[00514) Připravený jak v Příkladu 10-5 z 3-( 1-((3 .S-dimcthylizoxazoM-ylJme^ 1Hpyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dionu (Příklad 10-1) a l-tbřommethyO-Z-fluorbenzenu. Výtěžek 42%. MS M+H vypočteno 384,1; nalezeno 384,1. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla 1C5O 0,08 μΜ.
Příklad 10-22: 3-(1-((3,5-dímethylizoxazol-4-yl)niethyl)-lH-pyra2ol-4-ylM-(2-(trinuormethyl)benzyl)imidazolidin-2,4-dion:
(0OS15I Připravený jak v Přikladu 10-5 z SHHCM-dhtetylm^^^ pyrazol4-yl)imidazolidin-2,4-dionu (Přiklad 10-1) a l-lbromtnahyD-l-Hrifluonnethyl). benzenu. Výtížek: 37%. MS M+H vypočteno 434,1; nalezeno 434,1. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2RO8 receptorů hořkosti a měla 1C5O 0,2 μΜ.
220
Přiklad 10-23 - 3-(1-((3,5-dimethylhoxazol-4-yl)methyl)-l H-pyrazol-4-yl)-l-(2-nitrobenzyljimidazolidin-l^-dion:
I0M16I Připravený jak v Přikladu )0-5 z 3-(1-((3,SJÚwhyliwxnzoM.ylJmuthylHH-pyrazot-4-yl)iniidazolidin-2,4-dionu (Příklad 10-1) a Hbřomntetl^M-oint+Ixuzenu. Výtéžek 22%. MS M+H vypočteno 411,1; nalezeno 411,1. Titulní sloučenina »4,^1. inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla IC50 0,07 μΜ.
Přiklad l°-24: 3-((3-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methylHH-pyrazo^
ÍiDÍdazolidin-l-yl)methy!)bcnzaldehyd:
|MS17| Připravený jak v PřiTdadu 10.5 z 3-(l-((WdúWhyUz»zaz0l+y|)meIh,|).1H. pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dionu (Přiklad 10-1) a 3-íbrnmmeihyDbenzaldehydu Vy.Wek 35%. Ή NMR (DMSO, 400 MHz): 52,123 (s, 3H), 2.388 (s, 3H). 4,035 (s, 2H), 4,631 (s, 2H). 5,186 (s, 2H), 7,581 (m, IH), 7,643 (m, 1H), 7,787 (m. 3H), 8,178 (s, H), 9,997 (s, H). Tďulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a míla ICj, 0,2 gM.
221
Přiklad 10-25: 3-((3-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-y|)-2,.
-dioxoimidazolidin-l-yl)methyl)benz«nitril:
[005181 Připravený jak v Příkladu 10-5 z 3-(1-((3,5-dimethylÍ2oxazoM-yl)methyl)-lH-pyrazoI-4-yl)imidazolidin-2,4-dionu (Příklad 10-1) a 3-(brommethyl)benzonitrilu. Výtěžek 21%. MS M+H vypočteno 411,1; nalezeno 411,1. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla IC50 1 μΜ.
Příklad 1®'26: 3-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-l-(3-niethylbenzyl)imidazolidin-2,4-dion:
10051»! Připravený jak v Přikladu 10-5 a 3-(,.((3.5-0^,^^^ -pyrazoM-ylltaidaz^^ (PHkbd 1(M) , Hbromra..hyl)-3-™!a>yU>enzenu.
Výtěžek 25%. MS M+H vypMteno 380,1; naleženo 380,1. Titulní složenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla IC30 0,02 μΜ.
222
Příklad 10-27: 3-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)niethyl)-lH-pyrazol-4-yl)-l.(3-fluor benzyl)imidazolidin-2,4-dion:
100520] Připravený jak v Příkladu 10-5 z 3-( 1-((3,5-dimethylizOxazol-4-yl)methyl)-1H-pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dionu (Přiklad 10-1) a 1 (brommethyl)-3-fluor-benzenu. Výtěžek 27%. MS M+H vypočteno 384,1; nalezeno 384,1. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru horkosti a měla 1CÍO 0,06 μΜ.
Příklad l°-28: HU,5-dimethyl-lH-pyrazol-3-yl)methyl>3-(l-((3,5-d^
-yl)methyi)-lH-pyrazol-4-yI)imidazolidin-2,4-dion:
100521] Připravený jak v Příkladu 10-5 z 3-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH*pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dionu (Příklad 10-1) a 3-(brommethyl)-l,5-dimethyl-lH-pyrazolu. Výtěžek: 22%. MS M+H vypočteno 384,1; nalezeno 384,1. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla IC50 0,3 μΜ
223
Přiklad 10-29: 3-(1-((3,5-dimethylůoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-y|)-l-(4-methoxy benzy l)imidazolidin-2,4-dion:
|00S22| pfjpravený jak , Přikladu 10_5 z 3U-<(W-drm«hyUzox^^
-pynzoM-yDtaidazolidm^ionu („η^ 1(M) , 1
Výtěžek 19%. MS M+H vypočteno 396,1; nalezeno 396,1. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla IC50 0,07 μΜ.
Příklad 10-30: 3-(1-((3,5-dimethylizoxazol4-yl)niethyl)-lH-pyrazol-4-yl).l-(4-methy!benzyl)imidazolidin-2,4-dion ·
IW523I Připravený jak v Přikladu 10-S z HHUS+Sro^lizt^^ -pyrazol-4-yl)intidazolidin-2,4.dionu (Příklad 10-1) a Hbrontmolhyn+rnetbytaz^ Výtěžek 25%. MS M+H vypočteno 380,!; nalezeno 380,1. Titulní sloníonina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla 1C5O 0,06 μΜ.
224
Přiklad 10'31: 3-(1-((3,5-dimethyJizoxazol-4-y|)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-l-(4-fluorbenzyl)imidazolidin-2,4-dion:
[00524] Připravený jak v Příkladu 10-5 z 3-(l-((3,5-dimethylizoXaz01-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dionu (Příklad 10-1) a HbronimethylH-fluorbenzenu. Výtěžek 33%. MS M+H vypočteno 384,1; nalezeno 384,1. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla IC50 0,05 μΜ.
Přiklad 10-32: 4-((3-(l-((3,Sdiinethylizoxazol-4-yl)niethyl>lH-pyrazoM-yl>2,4
-dioxoimidazolidin-l-yl)methyl)benzonitril:
[00525] Připravený jak v Příkladu 10-5 z 3-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dionu (Příklad 10-1) a 4-(brommethyl)benzonitrilu. Výtěžek 21%. MS M+H vypočteno 391,1; nalezeno 391,2. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla IC5O 0,05 μΜ.
225
Příklad ^θ'^: ^(H(3,5-dimethylizoxazol-4-yl)metliyl)-lH-pyrazol-4-yl)-1.(3.
-(hydroxymethyl)benzyl)imidazoIÍdín-2,4-dion:
11
I’*in-l-yl)raethyl)ben2aldehyd (Přiklad 10-24) (13! 0,3 sc rozpuslil , 2 m| ethanolu. Roztok se nestal projít přístrojem H<ube |(* katalyzátoru při proudové rychlosti 1 „tatam., Seblané „ koKcnMva|x * rozpustily ve 2 ml ethanolu a přec,suly „ pm^ HPLC (10-95% acetomtril/voda, 23 minut). Prečdt™ frakce se spojily a koncentrovaly, což dalo titulní sloučeninu, 'h NMR (DMSO 400 MHz); 52,123 (s. 3H), 2,388 h 3H), 3,978 (s, 2H>, 4,516 (s. 2Ηλ 5,182 (s 2H) 7^ (m. 4H), 7,779 (s, 1H). 8.172 (a, ÍH). 8,505 (s, !H). MS M+H vypočteno 396,1; nakzeno 396,1. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 recepturo hořkosti a měla IC» 03 UM Výtěžek: 24 mg, 18%.
Pftklad 10-34:
-4-yl)imidazolidin-2,4-dion:
IOOS27| 3H 1-((3,5-dimethylizoaazOM-yl)melhyl). I H-pyrozol+yl). |.(2-nitrobenzvl).mid^lidta-24-dta (Přiklad !0-23) (l26 η» 0.3 mmol) se rozpustil v 2 m! ethanem Roztok » nechal projit přístrojem H-Ct.be při teplo® místnosti za použiti 10% Pd/C katalyzátoru při proluk™ rychlosti I ml/minutu. Sebraná frakce se koncentrovala, znovu se rozpustila ve 2 ml elhanolu a přečistila se pomoci HPLC (10-95% acctonitril/voda. 25 minul). PreciStíné frakce se spojily a koncentrovaly, což dalo titulní sloučenou Výtěžek 26% MS M+H „ρ«Μο 38l.1; nato0 38IJ Iilu|n| in|.wc] receptorů hořkosti a měla IC50 0,02 μΜ.
226
Příklad 10-35: H3,4-dimethoXybenzyl>3-(l-((3^^
-pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dion:
[00528] 3-( 1-((3,5-DimcthylizoxazoM-yl)methyl)-l H-pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4^ (Příklad 10-1) (275 mg, 1 mmol), (3,4-dimethoxyfenyl)methanol (201 mg, 1,2 mmol), Ν,Ν,Ν,Ν-tetramethylazodikarboxamid (344 mg, 2 mmol) se rozpustily v 2 ml bezvodém THE Přidal se nbutylfosfin (404 mg, 2 mmol) a reakční směs se ponechala v mikrovlnném reaktoru po dobu 5 minut při 90 °C. Reakční směs se zfílttovala, koncentrovala a přečistila pomocí HPLC (10-95% acetonitril/voda, 25 minut), což dalo titulní sloučeninu. Výtěžek: 25mg, 6% Ή NMR (DMSO, 400 MHz): 32,119 (s, 3H), 2,385 (s, 3H), 3,724 (J=6,4 d, 6H), 3,946 (s, 2H), 4,435 (s, 2H), 5,178 (s, 2H), 6,885 (m, 3H), 7,776 (s, IH), 8,166 (s, 1H). MS M+H vypočteno 426,1; nalezeno 426,1. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla ÍC50 0,06 μΜ.
Přiklad 10-36: Hbenzo(d|[l,3]dioxol-5-ylmethyl>3-(b((3,5-dimethylfroxazol^ methyl)-lH-pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dion:
10052»! Připravený jak v Přikladu 10-35 z 3-(1-((3,S-dimelhylizoxazol-d-yDmeihyD-IH-pyrazol-4-yl)lmidazolidin-2,4-tlíon (Příklad 10-1) a beuz»[dJ[l,31diox»l-5-ylmet^ VýiSM: 19%. Ή NMR (DMSO, 400 MHz): 82,143 (,. 3H), 2,408 (s. 3H). 3,977 (s. 2H) 4,440(3, 2H), S.202 (s. 2H), 6,003 (s. 2HK 6,897 (m, 3H), 7,788 (s, IH), 8,181 (s, IH) MS M+H vypočteno 410,1: nalezeno 410,1. Titulní sloučenina vykázal. ,nh.bici ET2RO8 receptoru hořkosti a měla IC50 0,07 μΜ.
Přiklad 10-37: H3-í(dimethylamino)methyl)beflzyl)-3-(l-((3,5-dim^ methyl)-lH-pyrazol-4-yI)imidazolidin-2t4-dion:
(00530] 3-(1-((3, ^imethylizoxazoM-yDmeth^^ (Přiklad 10-1) (275 mg, i mmol), l,3-bis(brommethyl)benzen (263 mg, 1 mmol) a uhličitan česný (325mg, 1 mmol) se rozpustily ve 2 ml DMF a ozařovaly se v mikrovlnném reaktoru pn 165 °C po dobu 5 minut. Reakční směs se ochladila na teplotu místnosti a sraženina soli se odstranila filtrací. Čirý roztok obsahující surový produkt se koncentroval a znovu se rozpustil v ethylacetátu. Organický roztok se promyl vodou dvakrát a poté solankou. Organická vrstva se vysušila nad síranem sodným a odpařila se, což dalo surový produkt, který se přenesl do dalšího kroku bez dalšího přečištění nebo characterizace. l-(3-(Brommethyl)benzyl)-3-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyraZol-4-yl)Ímidazolidin-2,4-dion (Příklad 42a) (152 mg, 0,3 mmol), dimethylamin (2 M roztok v THF) (1,5 ml, 3 mmol) a hydrid sodný (9 mg, 0,36 mmol) se rozpustily v 1 ml bezvodého THF. Reakční směs se umístila do mikrovlnného reaktoru po dobu 5 minut při 120 °C. Surový produkt se znovu rozpustil ve 2 ml ethanolu a přečistil se HPLC (10-95% acetonitril/voda, 25 minut), což dalo |-(3-((dimethylamino)methyl)ben^
-yl)imidazolidin-2,4-dion (16 mg, 13%). MS M+H vypočteno 423,1; nalezeno 423,1. Titulní sloučenina vykazala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla 1C5O 1,2 μΜ.
228
Příklad 10-38:3-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazo^
-lH-pyrazol-3-yl)methyl)imidazolidin-2,4-dinn:
i00531j Připravený jak v Příkladu 10-5 z z 3-(l-((3,5-dimethy[izoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dionu (Příklad 10-1) a 3-(brommethyl)-l -methyl- 1H-pyrazolu. Výtěžek 19%. MS M+H vypočteno 370,1; nalezeno 370. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla IC5o 0,4 μΜ.
Příklad 10-39: N-(2-((3,5-dimethylkoxazol-4-yl)methyl)-2H-tetrazo^^ benzamid
[00532| 2-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-2H-tetrazol-5-amin (Příklad 10-39a) (102 mg, 0,528 mmol), 3-methoxybenzoylchlorid (0,065 ml, 0,528 mmol) a pyridin (0,043 ml, 0,528 mmol) v acetonitrilu (3 ml) se míchaly při 100 °C po dobu jedné hodiny. Reakční směs se zředila dichlormethanem (30 ml) a promyla se solankou (30 ml). Organické vrstvy se vysušily nad síranem sodným, koncentrovaly se a přečistily pomocí reverzní fázové HPLC (systém rozpouštědel: acetonitril/voda 10% až 100% gradient). 25 minutový běh), což dalo ^-(2-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-2H-tetrazol-5-yl)-3-methoxybenzamid jako bílou krystalickou pevnou látku (60 mg, 35 % výtěžek) MS M+H vypočteno 329,1, nalezeno 329, Ή NMR (400MHz, DMSO-dó): δ 2,02 (s, 3H), 2,46 (s. 3H), 3,81 (s, 3H), 5,78 (s, 2H), 7,16(m, IH), 7,42 (t, J - 8 Hz, 2H), 7,54 (m, 1H), 11,3 (s, lH).Sloučenina měla IC50 1,87 μΜ na hT2R8 receptorů hořkosti.
Příklad 10^9a:2-((3,5-dimethylizoxazol-4-.vl)methyl)-2H-t^
100533] 2H-Tetrazol-5-amin (1,29 g, 12,5 mmol), 4-(chlonnethyl)-3,5-dimethylizoxazol (1,56 ml, 12,5 mmol) a uhličitan draselný (1,73 g, 15,5 mmol) v DMF (20 ml) se zahřívaly na 80 °C za stálého míchání po dobu 16 hodin. Reakční směs se ochladila na teplotu místnosti Zředila se dichlonnethanem (100 ml), a pak následné se promývala solankou a vodou’ Organické vrstvy se vysušily nad síranem sodným a koncentrovaly se na rotační odparce. Surový produkt se přečistil chromatografií na silikagelu (0 - 10 % gradient ethylacetát/ dichlormethan), což dalo 2-((3,5-dimethylÍzoxazol-4-yl)methyl)-2H-tetrazol-5-amin jako bílou krystalickou pevnou látku (970 mg, 40 % výtěžek) MS M+H vypočteno 195,1, nalezeno
Přiklad 10-40: N-(l-((33-dimethylÍMmu^
-[l,3]dioxol-5-karboiamid
[00534] 1-((3,5-DimethylizoxazoM-yl)methyl)-IH-imidazol-4-amin (Příklad 10-40a) (HOmg, 0,57 mmol), benzo[d][l,3]dioxol-5-karbonylchlorid (105 mg, 0,57 mmol) a tnethylamm (90 μΐ, 0,69 mmol) v dichlormethanu se míchal po dobu 16 hodin. Reakční směs se zředila dichlonnethanem (30 ml) a následně promývala solankou a vodou. Organické vrstvy se vysušily nad síranem sodným a koncentrovaly se na rotační odparce. Surový produkt se přečistil reverzní fázové HPLC (systém rozpouštědel: acetonitril/voda, 10% až 100% gradient, 25 minutový běh), což dalo N-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)- 1H-imidazol-4-yl)benzo[d][l,3]dioxol-5-karboxam jako bílou krystalickou pevnou látku (32 mg, 15 % výtěžek). MS M+H vypočteno 341,3, nalezeno 341,3. Ή NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 2,08 (s, 3H), 2,41 (s, 3H), 5,02 (s, 2H), 6,07 (s, 2H), 6,95 (d, J = 8,4 Hz, 1 Hf
230 ,27 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 7,54 (m, 3H), 10,6 (s, 1H). Sloučenina měla IC50 12,1 μΜ na hT2R8 receptorů hořkosti.
Příklad IMv H0,5-dim«hylkoxazol-4.yl)„Kth^^
I0053SI 3.5-Dta«h,M4(4.nito.W^ (PfikM 1(MW)) (| 0 & 4,5 mmol) a 10% palladium na aktivním uhlí (200 mg) v metanolu (40 ml) se .lepaly na Panově třepačce pod .lakem 250 kPa (2,5 ter) vodíku po dobu 2 hodím Fitace fees zátku nelitu následována odpařen™ v mínění odparce dala vzmku l-((3,5-dimethylizoMzol-4.yl). methyl>lH-imidazoM-aminu jako žlutoěervené pevné látce (800 mg, 43 % Výtěžek). MS M+H vypočteno 193, nalezeno 193.
Příklad 1040b: 3,5-dimethyM-^^^
[005361 3,5-Dimethyl4-((4-mtro-^^ se připravil postupem jako v Příkladu 10-41 c alkylací 4-nitro-l H-imidazolu, což dalo 3,5-dimethyl-4-((4-mtro-lH-imidazol-l-yljmethyljizoxazol jako bílou krystalickou pevnou látku (5,0 g, 80% výtěžek). MS M+H vypočteno 223, nalezeno 223. Ή NMR (400MHz, DMSO-dó): δ, ppm' 2,09 (s, 3H), 2,43 (s, 3H), 5,15 (s, 2H), 7,90 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 8,35 (d, J = 1,9 Hz, 1H).
Příklad 1041: 3-(1-((3,S-dÍmethylĚoXazol-4-yl)methylH^ dazolidin-2,4-dion
[00537] Hydrochlorid l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1 H-pyrazol-4-aminu (Příklad 1041a) (] ,0 g, 5,20 mmol), ethyl-(2-izokynatepropionát) ( 0,745 g, 5,20 mmol) a triethylamin (1,5 ml, 10,4 mmol) se smíchaly v EtOH (20 ml). Reakční směs se refluxovala po dobu 12 hodin a pak se ponechala ochladit na teplotu místnosti. Rozpouštědlo se odstranilo za vakua a krystaly se vytvořily v průběhu stání. Krystaly se sebraly a promyly hexany, což dalo 3-( 1 -((3,5-dimethyli2oxazol4-yl)methyl)-lH-pyrazol4-yl)-5-methylimidazolidin-2,4-dionv80% výtěžku jako bílou pevnou látku, 'h NMR (DMSO-do, 400 MHz): δ 1,53-1,51 (d 3H) 2 19 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 4,214,19 (m, 1H), 5,06 (s, 2H), 6,00 (bs, 1H), 7.90 (s, IH), 8,05 (s’ 1H) Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoro hořkosti a měla IC50 1,3 μΜ.
231
Přiklad 1041a: hydrochlorid 1-((3,5-dirnethylizoxazol4-yl)methyl)-lH-pyrazol4-aminu
[00538] Terc.butyl-(l-((3,5-dimethylizoxazol4-yl)methyl)-lH-pyrazo^ (Příklad 1041b) (592 mg, 2 mmol) se míchal v roztoku 4N HC1 v dioxanu (20 ml) při teplotě okolí po dobu 2 hodin. Rozpouštědlo se odstranilo a zbytek se rozpustil ve směsi 1/1 ethylacetát/hexany (30 ml) a koncentroval se dvakrát. Pevná látka se třela s hexany a sebrala se filtrací, což dalo hydrochlorid 1-((3,5-dimethylizoxazol4-yl)methyl)-lH-Pyrazol4-aminu ( 500 mg, 99%) jako bílou Pevnou látku. 'H NMR (DMSO-d6, 400 MHz); δ 2,11 (s, 3H), 2,38 (s, 3H), 5,16 (s, 2H), 7,51 (s, 1H), 8,03 (s, 1H), 10,27 (bs, 3H).
Přiklad 1041b: terc.butyl-(l-((3,5-dÍniethyli2Oxazol4-y))inethyl)-lH-pyrazol. 4-ylkarbamát)
[00539] 3,5-Dimethyl4-((4-nitro-lH-pyrazol-l-yl)methyl)izoxazol (Příklad 1041c) (12 g, 53,8 mmol) a BOC anhydrid (12,8 g, 64 mmol) se rozpustily ve směsi 3/1/1 MeOH/EtOH/THF (300 ml) v Parrově reakční nádobě, načež následoval přídavek 10% Pd/C (1,5 g). Směs se třepala Parrově hydrogenátoru při 202,65 kPa (2 atmosférách) vodíku po dobu 3 hodin. Směs se zfiltrovala přes 7,62cm (3 palcovou) zátku celitu a koncentrovala se na rotační odparce. Růžový olej se přečistil chromatografií na silikagelu (25% ethylacetát v hexanech), což dalo terc.butyl-( 1-((3,5-dimethylizoXazol4-yl)methyl)- 1H-Pyrazol4-ylkarbamát) (12,6 g, 80%) jako růžový/červený olej, který během stání ztuhne za vzniku světle růžové pevné látky. Ή NMR (CDC13, 400 MHz): δ 1,41 (s, 9H), 2,10 (s, 3H), 2,32 (s, 3H), 4,90(s, 2H), 6,19 (bs, 1H), 7,19(s, 1H), 7,50(s, 1H).
Přiklad 1041c: 3,S-dimethyl-4-((4-nitro-lH-pyrazoi-l-yl)metliyl)izoxazoI
232
100540] IH-Pyrazol (10 g, 147 mmol) se přidal v malých dávkách do koncentrované H2S04(100 ml), ochlazené na 0 C pomoci ledové lázně, přičemž se udržovala vnitřní reakční teplota pod 40 C. Po kapkách se opatrně do reakční směsi přidala koncentrovaná HNO3 (10 ml) « současného udržení vnitřní reakční teploty pod 55 X. Reakční směs se pak zahřála na 35 C a míchala se po dobu 5 hodin. Směs se ochladila na 0 X a opatrně se přidal (pH~8) vodný NaOH roztok (110 g NaOH v 150 ml H2O), dokud se nevytvořila bílá sraženina, přičemž se pečlivě udržovala vnitřní reakční teplota roztoku pod 40 X. Bílá pevná látka se odfiltrovala a promyla se ethylacctátem/hexany (1/3), pak se vysušila ve vakuu, Cai dalo 4mtro-lH-pyrazol (7g, 42% izolovaný výtěžek). 13C NMR (DMSO-de, 137,0, 126,4. Do 4nitro-lH—pyrazolu (9 g, 80 mmol) v DMF (1OO m()100 MHz) δ se přidal uhličitan česný (26 g, 80 mmol), načež následoval přídavek 4-(Chlormethyl)-3,5-dimethy^ (i2,3 g, 85 mmol). Reakční směs se míchala v DMF (100 ml) při 80 X po dobu 30 minut, pak se ochladila, zředila se H2O (150 ml) a extrahovala se ethylacetátem (3x, 75 ml). Spojené organické vrstvy se vysušily nad síranem sodným, zfiltrovaly se a koncentrovaly se. Zbytek se sebral do ethylacetátu (200 ml) a promyl se H2O (2x, 100 ml). Organická vrstva se vysušila nad síranem sodným, zfiltrovala se a koncentrovala se. Pevný produkt se třel ethylacetátem/ hexany(l/9) a sebral se filtrací. Produkt se vysušil za vysokého vakua, což dalo 3,5-dimethyh 4-((4-nitrOlH-PyTazol-l-yl)methyl)izoxazol (12g, 67%) jako světle žlutou pevnou látku. 'H NMR (CDCh, 400 MHz): δ 2,23 (s, 3H), 2.46 (s, 3H), 5,08 (s, 2H), 8,02 (s, 1H), 8,08 (s, 1H).
233
Přiklad 10-42: 5-benzyl-3-(l-((3,5-dimethyIizoxazol-4-yl)metliyl)-lH-pyrazol-4-yl)-l
-methyliniidazolidin-2,4-dion
1005411 Připravený jak v Přikladu 10-5 a 5.^|.3.(|.((3,5.^^ ýlJnretliylj-IH-pytazol-d-yllimidazolidin-ž.d-dion (Přiklad 10-2) a jodmelhan. Výtěžek: 95%. ‘H NMR (CDCI,, 400 MHz): S 2,04 (s, 3H), 2.15 (a, 3H), 2,96 (s, 3Ηξ 3,24-3,23 (m, 2 H, /= 4,0 Ha), 4,23-4.21 (m, 1H). 5,00 (s, 2H), 7.24-723 (m, 5H. J = 4,0 Hz), 7 70 (a IH) 7,87 (s, IH).
[00542] Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla ICÍO 0,15 μΜ.
Přiklad 10-43:
-methylimidazolidin-2,4-dion
O
100543) Připravený jak v Přikladu 10-5 z 341-((3,S-diraethyta^^^ pyrazoM.yD-S.methylimidazolidin.žAdtau (Příklad 1041) a benzylbromidn. Výtěžek: 50%. H NMR (CDCI,.400 MHz): 6 1,44 (a, 3H), 2,19 (a, 3H). 3,88 (a, 3H). 4,18 (d, 2= 8 Hz, 2H), 4,22 <t. 1H. J - 4 Hz)). 5,06 (a, 2H), 7,39-729 (w. 5H), 7,94 (a, IH), 1,10 (ύ 1H) Titulní sloučenina vykázala inhibici HT2R08 receptoru hořkosti a měla IC„ 0,02 μΜ
234
Přiklad 10-44:
-2,5-dioxoimidazo!idin-4-yl)octová
IOO544I Přlp™á jak v Přikladu 10-1 z 1-((3.5-^^,1^^^^ -pyrazol-4-karbonylazidu (Přiklad 10-la) a H-Asp-OMe. Výtéžek; 85%. MS M+H vypočteno 334,1; nalezeno 334,1
Příklad 10-45: 3<l-((3,5-dimethylÍ2oxazol-4^ imidazolidin-2,4-dion
|0054S| Připravený juk v Přikladu 10-1 z 1.((3,5.4^^0,.^^ pyrazoM-karbonylazidu (Příklad 10-la) a methyW-amnM-^^
15%. H NMR (CDCI,, 400 MHz): δ 2,09-2,03 (m, 2H), 2,19 3H), 2,41 (a, 3H), 2,83-2,78 (m, 2H), 4,13-4,09 (t, IH, J= 8 Hz), 5.05 (s, 2H), 5,95 (ba, IH), 7,30-7,19 (m, 5H). 7,95 (a. 1H), 8,03 (s, IH). Titulní sloučeninu vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a míla IC,Ů 0,22 μΜ.
235
Příklad 10-46: 3-(1-((3,5-dimeth}lizoxazol-4-y^ H-pyrazol-4-y|)-5-(3.
-fenylpropy|)imidazolidín-2,4-dion
1005461 Připravený jak v Přikladu 10-1 z l-«3.5.dimethylÍ2OIaz0|.4.y^ -pyrazol-4-katbonýlazidu (Příklad 10-1.) a mothyl^-amino-S-fenylpentanoáta). Vý,Hek: 20%,'h NMR (CDCIj, 400 MHz): 5 1,72-1,68 (m, 1H). 1.85-1,78 (m, 2H), 1,99-1 9| (m 1H). 2,19 O, 3H), 2,41 (a 3H), 2,69-2,63 (t, J - 8 Hz, 2H), 4,13 (ba, 1H). 5,05 h 2H), 5.95 (bs, 1H), 7,30-7,19 (m, 5H), 7,95 (a, 1H). 8,03 (s, IH). Tilulaí sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla IC50 0,17 μΜ.
Příklad 10-47: Mbenzylosymethy])-3-(l-((3,5-dimeíhylizoxaz(>l^
-pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dion
10054η Připravený jak v Přikladu 10-1 z IW-dtamhyliz^^ -pyrazol-4-karbonylazidu (Přiklad 10-la) a nKdlyl.(2-ani„0-3-(benzyl„xy)pr„pan0ÍI„) Výtčiek: 32%.‘H NMR (CDCI,,400 MHz): S 2,19 (a, 3H), 2.43 (a. 3H), 3,70-3 67 (ra.1 H) 3.89-3.86 (m,lH), 4,31-4,30 (wIH), 4.56-4.32 (d, J - W Hz, 2H), 5,05 (a, 2H) 5 62 (ba' IH). 7,35-7,29 (m, 5H), 7.88 (a, IH), 8,M (a, IH). Titulní sloučením vykázala inhibid hT2R08 receptoru hořkosti a měla ÍC50 0,76 μΜ.
236
Příklad 10-48:
imidazoIidin-4-yl)-N-fenylacetainid
[005481 ^selína 3-(1-(1-((3,5-dimethylizoxazoM-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-2,5-dioxoimidazolidin-4-yl)octová (Příklad 10-44) (100 mg, 0,3 mmol), anilin ( 33 mg, 0,36 mmol), Pybop (187 mg, 0,36 mmol) a tnethylamin (0,05 ml, 0,36 mmol) se míchaly v DMF (1 nd)’ Reakční směs se míchala při 65 X po dobu 4 hodin. Reakční směs se nechala ochladit na teplotu místnosti a pak se zředila ethylacctátem (2 ml). Organická fáze se promyla roztokem nasyceného hydrogenuhličitanu sodného (2x, 2 ml) a pak nasyceným roztokem NaCl (I ml). Organická fáze se extrahovala, vysušila se nad bezvodým Na2SO4 a zfiltrovala se Surový produkt se znovu suspendoval v MeOH (Iml) a přečistil se pomocí reverzní fázové HPLC (595% acetonitril v H2O; 16 minutový gradient). Čisté frakce se spojily a rozpouštědlo se odstranilo na rotační odparce, což dalo 2-(l-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol4-yl)-2,5-dioxoimi«^^ bílou
H NMR (CDCh, 400 MHz): δ 2,18 (s, 3H), 2,40 (s, 3H), 2,72 (m, I H), 3 14-3 13 (d, 1H J = 4 Hz), 4,54-4,51 (d, 7= 8 Hz 1H), 5,04 (s, 2H), 6,53 (bs, 1H), 7,15-7,13 (m 1H) 7 33-7 22 (πι, 2H), 7,47-7,45 (d, 7 = 8 Hz, 2H), 7,78 (bs, 1H), 7,09 (s, 1H), 8,05 (s, 1H). Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla IC50 0,75 μΜ.
237
Přiklad 10-49: N-benzyl-2-(l-(14(3,5-dimethylizoxazol^yl)methy|)-lH-pyraz(»l-4-yl)-2,5-dioxoimidazolidin-4-yl)acetamid
100549] Připravený jak v Příkladu 10-48 z kyseliny 3-( 1-(1-((3,5^imethyiizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-2,5-dioxoimidazolidin-4-yl)octové (Příklad 10-44) a benzylaminu. Výtěžek: 30%. [H NMR (CDC13, 400 MHz): δ 2,18 (s, 3 H), 2,41 (s, 3 H), 2,56-2,52 (m, 1H, 16 Hz), 2,56 -2,52 (m, 1H), 3,00-2,96 (m, 1H), 4,45-4,44 (d, J = 5 6 Hz
2H), 5,04 (s, 2H), 5,96 (bs, 1H), 6,36 (bs, 1H), 7,36 - 7,25 (m, 5H), 7,90 (s, 1H, 8,05 (s, 1H)’ Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla IC50 1,3 μΜ.
Příklad 10-50: 2-(1-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)me^^ imidazolidin-4-yl)-N-(3-niethoxybenzy!)acetamid
100550] Připravený jak v Příkladu 10-48 z kyseliny 3-( 1-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-2,5-dioxoimidazolidin^ (Příklad 10-44) a (3. -methoxy fenyl )methanaminu. Výtěžek: 50%. LC/MS; očekáváno 453; nalezeno 453,1 Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla IC50 1,7 μΜ.
Pnklad 10-51: 3-(l-((3,5-dimethyluoxazol-4-y|)methyl)-l^^ imidazolidin-2,4-dion
238
Ν=
Ο
Λ, ο
[00551] 3-(1-((3,5-Dimethylizoxa^^ (Přiklad 10-1) (50 mg, 0,182 mmol) a uhličitan česný (60 mg, 0,185 mmol) se míchaly v DMF (1 mi) po dobu 15 minut v dusíkové atmosféře při teplotě místnosti. Pak se přidal jodmethan (14 mg, 0,185 mmol) a reakční směs se dále míchala po dobu dalších 2 hodin H->0 (2 ml) se přidala a produkt se extrahoval ethylacetátem (1 ml, 2x). Organická fáze se sebrala a promyla se roztokem nasyceného hydrogenuhličitanu sodného (2ml, 2x), vysušila se a zfiltrovala se. Rozpouštědlo se odstranilo pod proudem dusíku a pak se dále vysušilo za vysokého vakua, což dalo 3-( 1-((3,5-dimethyiiZoxazol-4-yl)methyl).lH-pyrazol-4-yl)-1-ntethylimidazolidin-2,4-dion jako bílou pevnou látku (42 mg, 80%). Výtěžek: 80% Ή NMR (CDClj, 400 MHz): S 2,18 (s, 3H), 2,41 (s, 3H), 3,06 (s, 3H), 3,95 (s, 2H), 5,05 (s> 2H), 7,89 (s, 1H), 8,05 (s, 1H). Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla IC50 0,58 μΜ.
Příklad 10-52: 3-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yi)methyl)-lH-pyrazol-4-yI).l,5,5.
-trimethylimidazolidin-2,4-dion
100S511 3'(H(3,S-Dimelhylizoxazol-4-yl)melhyl)-lH-pyrazol-4-yl).5-melhylimidazolidin-2,4-dion (PHklad 10-41) (50 mg, 0,173 mmd) a 60% NaH (8 mg, 0,190 mmol) se míchaly v DMF (1 ml) po dobu 30 minut Mel (0,04 ml, 0,190 mmol) se přidal a ,eakc„, smis se míchala dalří 4 hodiny, Rcakím smés se okyselila IN HC1 a zředila se elhylacetíiem (2 ml) Oigamcká fSze se vysušila, zíiltmvala a mzpoušiédto se «farami» pod proudem dusíku Surový pmduk. se znovu suspendoval v MeOH (1 ml) a přeřistil pomoci reverzní ffemé HPLC (S až 95% acetoníiríl v Η,Ο 16 minutový gradiem). Cisré frakce se spojily a rozpousičdlo odstranilo za vakua, eož dalo H IW-dtaeftylizmaz»^^ *Pyraz°l-4-yl)-l,5,5-trimethylimidazolidin.2,4-dion jako bta pevnou laiku (25 mm 50%). H NMR (CDC1,, (CDC1,, 400 MHz): ó 1,45 (a, 6H), 2,19 (s, 3H). 2,42 (s, 3H), 2,94 (s, 3 HI,
239 ( , 2 Η), 7,92 (s, 1 Η), 8,08 (s, 1Η). Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla IC5o 0,80 μΜ.
Příklad 10-53: l-benzyl-^l-f^diniethylizoxa^
-yl)imidazolidin-2,4-dion
I00SS3I Připravený jak v Přikladu 10-5 z SIW-dtaahyliaMaa^ pyrazoM-yl)imidazolidin-2,4-dionu (Přiklad 10-1) a bettzylbromidu. Výtěžek: 40%. ’H NMR (CDCI,, 400 MHz): 8 2,18 (a, 3H), 2,42 (a, 3H), 3,84 (a, 2H), 4,61 (a, 2 H), 5,06 (a 2H), 7,40 - 7,27 (m. 5H), 7,62 (a, 1 H), 8,08 (a. IH). Titulní aloueeaiua vykázala’ inhibic,' hT2R08 receptorů hořkosti a měla IC50 0,09 μΜ.
Příklad 10-54: HW^methytaox^^
-ylmethyl)imidazolidin-2,4-dion
1005541 Připravený jak v Příkladu !0-5 z 3-( l .((WteíiraethylizcxaznM^^ 'Pyrazol4-yl)imidazolidin-2,4^ionu a 2-(brommethyl)pyridira.. Výtěžek: 50% Ή NMR (CDClt. 400 MHz): S 2.19 (a, 3H), 2,41 (a. 3H), 4,12 (a. 2H), 4,71 (a. 2H), 5.05 (a, 2H). 7,727.23 (m, 4H). 7,92 (a. 1H) 8,08 (a, 1H). Titulní slouřenina vykázala iahibiei hT2RO8 receptorů hořkosti a měla IC;o 0,68 μΜ.
Příklad 10-55: H(3,5-dimethylúoXazol-4-yl)methyl^
-yl)methyl)-lH-pyrazoI-4-yl)imidazolidin-2,4-dion
240
1005551 Připmveuý Jak „ I0.5 z
-pym«.yl),m,dazolidin-2,4.dionu a d^hlomUhylW^^^ Vým· 50%. 'H NMR (CDCh. 400 MHz): 2,.9 3H), 2,27 (s_ JH), 2,43-2,42 (d. J-5 2 6^'
3,82 (s, 2H), 4,40 (s, 2H), 5,05 (s, 2H). 7,92 (a, IH), 8,05 (a, 1H). Ttaloí staonim, inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla IC50 0,04 μΜ.
FKklad 10-56: 3-(1-((3,Sdlme,hyllz0«^^^ benzyl)imidazolidin-2,4-dion
1005561 Hydrachlorid W+dimeM^^ „„„ mi 2,08 mmol), dipyndm-2.y|.(karboná0 (450 mg, 2,08 mmol) a «!««„ (0,290 ml ,08 mmd) se míchaly , díchlometao (7 m!) p„ dobo (2 hodin pH ,epl„tí
R«m smis se koncentrovala za vata, což dalo Híd-IWamm-lH^. 1 -yl)n,ethyll. 3,5-dimclhylizoxazol jako ne zcela bílou pevnou Útku v kvamiooivmm výréžko. Elha„ol ml) se pndal spolu s meW-ammeJ-Q-me^^ (6g m& ’ ’ . meOryltunmem (0,064 ml, 0,461 mmol). ReaMm smis se míchala při reltau po dobu 12 hod,o, pak se nechala ochladí, na mplon, mia„K„ RoípollSlčd|l) * pod proudem dusdru. Surový pmduk, se znovu 5uspendova| , Me<,H (| g pomocí reverail fázové HPLC (5 až ,5% acetonitni v h2O: ,6 minutový Clsté ra^e se spojdy o mzpooMdb se odsmmlb za vakua, což dab 3^(5,5^1^ 4.yl)methylMH--pyraz01-4.ylW látku Vytéžek: 50% Ή NMR(CDCI„ W MHz): ó 2,19 (s. 3 H), 2,41 U 3H) 334-333(1 ^-3,2 H. 1H). «kl-g Hz, ,HX 3,76 (s, 3H), 4.334,30 (m, .H), 5.05 (s' 2H) . 'Η)· «· 6·82·6·78 <· ™>· ™ (i 1H). 7.99 (s, 1HX Ttolnl' sloučenou, vykázala «ίά hT2Rog a θ
Přiklad 10-57:
-pyrazol-4-y|)imidazolidin-2,4-dion
241
1005571 Připravený jak v Přikladu 10-56 z hydrochloridu l-«3.5-dintethylizoxázol-4— yl)methyl)-m-pyrazol-4-aminu (Přiklad HMI.) a methyl-(2-amino-3^klohexyl— pnopanoáluh Výtěžek: 30%. Ή NMR (CDC1„ 400 MHz): δ 1,06-0,95 (m. 2H), 1 29-1 15= WH) 1.60-1,50 (1H) 1,77-1,67 (7 H). 1,914,85 (m, 1H), 2,19 (η, 3H), 2,41 (χ,Μ) 4 19— 4.15 fe 1H), 5,05 (s. 2H), 6.01 (bs, IH), 74>l (j> 1HK 8,03 1H). slou£^na_.
vykázala inhibici hT2RO8 receptorů hořkosti a mčla 1CSO 0,96 μΜ.
Příklad 10-58: 5Hcyklopenty|methyl)-3-(l-((3,Sd^
-pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dion
1005581 Připravený jak v Přikladu 80-56 z hydrochloridu i-Md.S-dtaethyiizoxazoU-yl)methyl)-IH-pyrazol-4-aminu (Přiklad 1Mla) . ,^.(2.^3..^^ propanoarn). Výtěžek: 50%. Ή NMR (CDCI,. 400 MHz): δ 1.20-1,14 (m 3H) I 68-l 55 <m. 6H), 2.04-1,92 (tn, 2H), 2,19 (s. 3H), 2,42 (s, 3H), 4.14-4,11 („, IH). 5,05 2Ηχ „2 (bs, IH), 7,90 (s, 1H), 8,06 (s, 1H). Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla IC50 0,31 μΜ.
242
Příklad 10-59: 3-(1-( (3,5*dimethylizoxazol-4-yl)inetliyl)-lH-pyrazol-4-yl)-5-(4-hydroxybenzyl)imidazolidin-2,4-dion
[005591 Připravený jak v Příkladu 10-56 z hydrochloridu l-((3,5-dimethylizoxazoM-yl)methyl)-lH-pyrazoM-aminu (Příklad 10-41a) a methyl-(2-amino-3-(4-hydroxyfenyl)propanoátu). Výtěžek: 50%. 'H NMR (CDC13, 400 MHz): δ 2,41 (s, 3H), 2,85 (s, 3H), 3,263,25 (d,lH, J = 4 Hz), 3,23-3,22 (d,J=4 Hz, 1H) 4,31-4,28 (m, 1H), 5,04 (s, 2H), 5,77-5,74 (bs, 1H), 7,07-7,04 (d, J = 12 Hz, 2H), 6,75-6,73 (d, J = 8 Hz, 2H), 7,06 (s, 1H), 7,97 (s, 1H), 9,43 (bs, 1H). Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla ÍC50 0,33 μΜ.
Příklad 10-60: 5-(3,4-dihydroxybenzyl)-3-(l-((3,5-dinietiiylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)imídazolidin-2,4-dion
[00560] Připravený jak v Příkladu 10-56 z hydrochloridu l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-aminu (Příklad 10-41 a) a methyl-(2-amino-3-(3,4-dihydroxyfenyljpropanoátu). Výtěžek: 50%. MS M+H vypočteno 398,1; nalezeno 398,1. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla IC30 0,51 μΜ.
243
Příklad 10-61: 3 (l-((3,5-dÍmethyIÍ2oiazol^ imidazoIidin-2,4-dion
1005611 Připravený jak , 1(M| z hydrochloridu
-yDmethyD.IH-pyrazoU.aminn (ΡΒΙω l(M|a) , eihyl^izokynnara^methylpentanoátu). Výtěžek: 50%. Ή NMR (CDCI,, 400 MHz): S 1,01-0.98 (m, 8H), 1,87-1,82 (m. IH), 2,19 (s, 3H), 2,41 (s, 3H), 4,134,12 (u IH), (5,05 (s, 2H), 5,70 (ta, 1H). 7,90^ IH),8,05(s, IH). Titulní sloučenina vykázala inhibici bT2RO8 receptem hořkosti a mela ICw 1,0 μΜ.
Příklad 10-62: 3-<H<3.5-dimethylÍ2oxa,ol.4-yl)m^ imidazolidin-2,4-dion
1005021 Připravený jak v Příkladu 10-41 z hydrechimidu 1-((3,S-dimethylizoxazoMyl)methyl)-IH-pyrazol4-amínu (Příklad 1041a) a «hyl-(2-rakyanato.3-methylbutanoátu) Výlčžek: 30«. Ή NMR (CDC1„ 400 MHz): 6 0,96-0,94 (d. 3H, J - 7,2 Hz), 1,09-1,07 (d, 3H, J - 8 Hz). 2,19 (s, 3H), 2,26-2,22 (m, IH), 2,40 (s. 3H), 4.02 (s. IH). 5,05 (s, 2H), 5,53' (bs, IH), 7,90 (s, IH). 8,05 (s, IH). Tilutní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla 1C5O 1,1 μΜ.
244
Příklad (Z)-5-benzyliden-3-(l-((3,5-dimethyli2oxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazoI-4·
-yl)imidazolidin-2,4-dion
[005631 3-( 1 -((í.í-DimethylizoxazoM-yOmethyl)-1 H-pyrazoM-ylJimidazofidin-Z^ion (Příklad 10-1) (275 mg, 1 mmol), benzaldehyd (140 mg, 1,3 mmol) a octan sodný (205 mg, 2,5 mmol) v kyselině octové (3 ml) se ozařovaly v mikrovlnném reaktoru po dobu 7 hodin při 185 °C. Po ochlazení se směs zředila H2O (100 ml) a extrahovala se ethylacetátem (3x, 50 ml). Spojené organické extrakty se promyly roztokem nasyceného vodného uhličitanu sodného, vysušily se nad síranem sodným, zfiltrovaly se a koncentrovaly se. Pevný produkt se třel ethylacetátem/hexany (1/1) a vysušil se za vysokého vakua, což dalo (Z)-S-benzy íiden-3-(1-((3,5-dimethyliz0xazol-4-yl)methyl)-lH-Pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dion (173 mg, 48%) jako světle žlutou pevnou látku. *H NMR (DMSO-ds, 400 MHz): δ 2,14 (s, 3H), 2,40 (s’ 3H), 6,59 (s, 1H), 5,20 (s, 2H), 7,33-7,40 (m, 3H), 7,66 (s, 2H), 7,81 (s, 1H), 8,21 (s’ 1H), 11,01 (bs, 1H). Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla IC50 0,34 μΜ.
Přiklad 10-64: 4-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-fH-pyrazol-4-yl)-l-nietliyl-
-1,2,4-tr iazolidin-3,5-dion
[005641 Elhyl-(4-(I-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-2-methyl-3,5-dmxo-U^-triazolidin-l-karboxylát) (3,2 g, 8,8 mmol) se míchal ve směsi (1/1) MeOH/lN vodný NaOH (100 ml) při teplotě okolí po dobu 30 minut. Směs se okyselila vodnou 1N HC1 (150 ml), extrahovala se ethylacetátem (3x, 100 ml), vysušila se nad síranem sodným, zfiltrovala se a koncentrovala se, což dalo 4-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH245 pyrazol-4-y 1)-1-methyl-1,2,4-triazolidin-3,5-dion (2,3 g, 89%) jako žlutou pevnou látku, 'h NMR (DMSO-dí, 400 MHz): 52,18 (s, 3H), 2,44 (s, 3H), 3,05 (s, 3H), 5,17 (s, 2H), 7,94 (s, 1H), 8,13(s, 1H).
Přiklad 10-64a: ethyl-(4-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methv^ 1 H-pyrazol-4-yl)-2-methyl-3,5-dioxo-l,2,4-triazolidin-l-karboxylát)
[00565] Ethyl(chlorformiát) (1,3 g, 12 mmol) se přidal do směsi N-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-l H-pyrazol-4-yl)-l-methylhydrazinkarboxamidu (Příklad 10-64b) (2,5 g, 9 mmol) a triethylaminu (1,2 g, 12 mmol) v acetonitrilu (100 mi). Směs se refluxovala po dobu 1 hodiny, ochladila se, pak se zředila IN vodnou HC1 (150 ml) a extrahovala se ethylacetátem (3x, 75 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným, zfiltrovaly se a koncentrovaly se na rotační odparce. Pevná látka se třela s ethylacetátem/hexany (1/3) a vysušila se za vysokého vakua, což dalo ethyl-(4-( 1-((3,5-dimethylizoxazol4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-2-methyl-3,5-dioxo-l,2,4-triazolidin-1-karboxylát) (3,2 g, 94%) jako bílou pevnou látku. 'H NMR (DMSO-dí, 400 MHz): 51,28 (t, J=7,2 Hz, 3H), 2,13(s, 3H), 2,40 (s, 3H), 3,24 (s, 3H), 4,30 (t, J=7,2 Hz, 2H), 5,21 (s, 2H), 7,73 (m, 1H), 8,16 (s, 1H).
Přiklad 10-646: MHO,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyra2o^ hydrazinkarboxamid
[005661 H(3,5-Dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-karbonylazid (Příklad 10-la) (1.25 g, 5,3 mmol) se míchal v toluenu (30 ml) při teplotě refluxu po dobu 40 minut. Směs se ochladila na teplotu okolí a přidal se methylhydrazin (0,3 ml, 260 mg, 5,6 mmol) a směs se refluxovala po dobu 30 minut. Po ochlazení reakční směsi na teplotu místnosti se na rotační
246 odparce odstranilo rozpouštědlo a pevný produkt se třel s ethylacetátem/hexany (2/5) a vysušil se za vysokého vakua, což dalo N-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-l-methylhydrazinkarboxamid (1,1 g, 79%) jako bílou pevnou látku. ’H NMR (DMSO-dí, 400 MHz): 62,09 (s, 3H), 2,36 (s, 3H), 2,98 (s, 3H), 4,61 (s, 2H), 5,02 (s, 2H), 7,42 (s, 1H), 7,72 (m, 1H), 8,78 (s, 1H).
Příklad 10-65: l-BenzyM-fl-^S-dimethylizoxazoM-ylJmetliylj-lH-pyrazoM-yl)^-methyl-l,2,4-triazolidin-3,5-dion
|00567] 4-(1-((3,5-Dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-l-methyl-l,2,4triazoli-din-3,5-dion (Příklad 10-64) (785 mg, 2,7 mmol) se rozpustil v acetonitrilu (50 ml). Přidaly se triethylamin (1 g, 10 mmol) a benzylbromid (510 mg, 3 mmol) a reakční směs se míchala při teplotě okolí po dobu 12 hodin. Směs se pak koncentrovala na rotační odparce, rozpustila se v methanolu (5 ml) a přečistila pomocí reverzní fázové HPLC (5-95% acetonitril v H2O: 25 minutový gradient). Čisté frakce se spojily a koncentrovaly se a produkt se znovu překrystalizoval z ethanolu, což dalo 1-benzyl-4-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-l H-pyrazol-4-yl)-2-methyl-l,2,4-triazolidin-3,5-dion(210 mg, 20%) jako bílou pevnou látku. 'H NMR (DMSO-dí, 400 MHz): 62,13 (s, 3H), 2,39 (s, 3H), 3,09 (s, 3H), 4,81 (s, 2H), 5,18 (s, 2H), 7,30-7,35 (m, 5H), 7,76 (s, IH), 8,18 (s, 1H). MS M+H vypočteno 381,1; nalezeno 381,1. Teplota tání: 124-126 ’C. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla IC50 0,02 μΜ.
247
Přiklad 10-66: l-benzyl-4-(l-((3,5-dimethyiizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yJ)-2-methyl-l,2,4-triazolidin-3,5-dion
1005681 Opravený jak „ PřikJadu 1M5 2 4-(1-((3,3-dtaethylizoxazol-).yl)mahy|).|H.
*yr»z»M-yW-«^ (rendad |0.M) , 1.(24)romeU,yiM.
-fluotbenzcnu .Výtěžek: 14%. Ή NMR (CDCI,, 400 MHz): 82,18 (s, 3H), 2,40 (s 3H) 2 87 (t, >6.8 Hz, 2H), 3,14 ft 3H), 3,83 ft >7,2 Hz; 2H). 5,03 2H), 6,95 ft >8,4 Ηζ,’ίΗ), ,14 ft 2 8 Hz, 2H), 7,77 (s, IH), 7,95 (s, 1H). Titulní sloučenina vykázala inhibici bT2R08 receptoru hořkosti a měla ICS0 0,01 μΜ,
Příklad 10-67:4«Η(3^ΐΜβΛΥΜζσχί^^
-fenoxyethyl)-l,24-triazolldin-3,5-dion
1005691 Připravený jak v Přikladu 10-65 z ^W.S-tlta^yli^ Pyrazol-4-yl)-l-meíhyl-l,2,4-triazolitlin-3,5-dionu (Přiklad 10-64) a (2-bromethuxy)benzenu. Výtěžek: 20%. Ή NMR (DMSOdk, 400 MHz): 62,13 (s, 3H), 2,40 (s 3H) 3 15 (S, 3H), 3,99 (t. >4,4 Hz, 2H), 4,13 (t, >4.8 Hz. 2H), S.20 (s, 2H). 6,80 (d, >8 Hz, M) 6,90 ft >7 1 Hz, 1H). 7,22 (t, >8 Hz. 2H). 7.75 ft 1H), 8,17 ft IH). Titulní slouíeni™ vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla IC50 0,031 μΜ
248
Přiklad 10-68: 4-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-l H-pyrazol-4-yl)-l,2,4-triazolidin-3,5-dion
I00570J 1-((3,5-Dimediylizoxazol-4-yl)rnethyl)-lH-pyrazol-4-karbonyIazid (Přík]ad JQ U) (lg, 4,1 mmol) se refluxoval v toluenu (100 ml) po dobu jedné hodiny. Reakční směs se ochladila na teplotu místnosti a přidal se ethyl-(hydrazinkarboxylát) (0,45g, 43 mmol). Reakční směs se zahřála na reflux a míchala se po dobu 1 hodiny, pak se ochladila a koncentrovala se na rotační odparce. Zbytek se sebral do ethanolu (100 ml) a přidal se uhličitan draselný (100 mg). Směs se refluxovala po dobu 12 hodin, pak se zfiltrovala, ochladila se na teplotu okolí a neutralizovala se kyselinou octovou (přibližně 7 kapkami) Rozpouštědlo se odstranilo na rotační odparce a výsledná pevná látka se třela s ethylacetátem/hexany (1/9), což dalo 4-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-y^^^ -yl)-l,2,4-triazolidin-3,5-dion (0,98 g, 85%) jako ne zcela bílou pevnou látku, lH NMR (CDClj, 400 MHz); 52,18 (s, 3H), 2,41 (s, 3H), 4,98 (s, 2H) 7,16 (s, 1H), 7,38 (s, IH).
Přiklad 1^9: 4-(1-((3,5-dimethylizoxaZol-4-yl)methyl>^
-1,2,4-triazolidin-3,5-dion
100S71] 4*(l-((3,5-Dimethylizoxazol-4-yl)melhyl)-IH-pyrazoM-yi)-l,2,4-(riazolidin-3 5.0-68) (100 mg, 0,36 mmol), me.hyljod.dd41 mg, I mmo»,«taCHný (325 mg, 1 mmol) se míchaly ve smísí 2/1 acettni.nl/DMF (5 ml) při teplo» „fen po dobu 2 hod». Směs se zředila vodnou IN HC1 (100 ml) , extrahovala sc «hylacetatem (3x, SO ml) Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem sodným, koncentrovaly se a sum™ zbytek se sebral do MeOH a přejistíI se pomoci mveraní fázové HPLC (5 až 95% ace,oni.nl v H,O: 25 minutový gradient). Čisté frakce se spojily a koncentrovaly se, což dalo 4-(1-((3,5249
-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyTazol-4-yl)-l,2-dimethyl-l,2,4-triazolidin-3,5-dion (89 mg, 80%) jako čirou polotuhou látku. 'H NMR (CDC13,400 MHz); 52,18 (s, 3H), 2,41 (s, 3H), 3,22 (s, 6H), 5,04 (s, 2H), 7,88 (s, IH), 8,03 (s, IH). Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla IC5(10,6 μΜ.
Přiklad 10-70:l,2-Dibenzyl-4-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-y|)methyl)-lH-pyrazol-4-y|)-
- l,2,4-triazolidin-3,5-dion
Λ N
Tx— An n d O \ U'N /
1005721 Připravený jak v Příkladu 10-65 z 44l.((3,5Jimelhyliz<,xazol-4-yl)mahyl>IH.
pynz*W.2-di^ (PHUad |0.M) a
Výtéžek: 69%. Ή NMR (CDC1,. 400 MHz); 62,14 (s, 3H), 2.36 (a, 3H), 4,65 (s, 4H) 4 99 (s 2H). 7,06-7,08 (m, 4H). 7,19-725 (m, 6H), 7,86 (s, IH), 8.02 (a, IH). Titulní stamina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla IC50 0,8 μΜ.
Přiklad 10—71:3-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lZ/-pyrazol-4-yl)-l-((6-(hydroxymethyl)pyridin-2-yl)methyl)imidazoUdin-2,4-dion
[00573] Připravený jak v Příkladu 10-5 z 3-(l-((3,5-dimethylizox^^^^ -pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dionu a 6-brommethyl-2-pyridinmethanolu, Výtěžek: 35%. MS M+H vypočteno 397,2; nalezeno 397,2. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla 1C5O 0,72 μΜ.
250
Příklad 10-72: 1-((3,4-dimethoXypyridin-2-yl)methyl>3-(l-((3t5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-l/f-pyra2ol-4-yl)imidazolidin-2,4-dion
100574] Připravený jak v Příkladu 10-5 z 3-( 1-((3,5-dimethy!izoxazoi-4-yl)methyl)-l//-pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dionu a hydrochloridu 3,4-dimethoxy-2-chlormethylpyridinu. Výtěžek: 26%. MS M+H vypočteno 360,2; nalezeno 360,2. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla IC50 1,0 μΜ.
Příklad 10-73: 3-(H(3>dimethylizoxazol-4-yl)methy[)-l//-pyrazoi-4-yl)-l-((6-(tetrahydrofuran-2-yl)methyl)iniidazolidin-2,4-dion
[00575] Připravený jak v Příkladu 10-52 z 3-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-y^ -pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dionu a tetrahydrofurfutylbromidu. Výtěžek: 28%. MS M+H vypočteno 427,2; nalezeno 427,2. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla IC50 1,4 μΜ.
251
Příklad ^74: l-(cykIohexylmethyl>3-(l-((3^
-pyrazol-4-yl)iniidazolidm-2,4-dion
1005761 Připravený jak v Přikladu 10-52 z l-O-lftS-diraethylizoxuzo^^ pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dionu (PHldnd 10-1) a bromnetltylcyklohexanu. Výtfek 20%. Ή NMR (DMSOnfc 400 MHz); δ 0.88 (q, J - 10,4 Hz, 2H), 1,09-1 19 (tn, 3H) l 58 1,65 (m, 6H), 2,12 (s, 3H), 2,38 (a, 3H), 3,13 (d, /= 7,2 Hz, 2H), 4,06 (,. 2H), 5,17 al), 7,75 (k IH), 8,14 (a, IH). MS M+H vypojte,» 372,2; nalezeno 372,!. Titulní alouíenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla IC30 0,28 μΜ.
Přiklad 10-75:3-(1-((3,5-dimethylizoxazo!-4-yl)methyl)-|tf-pyrazol4-yl)-l-((6-methoxypyridin-2-yl)methyl)ÍmÍdazotidín-2,4-dion
[005771 3-(l-((3,5-DimethylizOxazol-4-yl)methyl)-lřf-pyraZol4-yl)imidazoIidin-2,4-dion (100 mg, o,4 mmol), (ó-methoxy-pyridin-ž-yl^methanol (Příklad 10-75a) (101 mg 0,7 mmol), tributylfosfin (147 mg, 0,7 mmol) a l,l”»-azobis(N,N-dimethyiformamid)’ (125 mg, 0,7 mmol) se rozpustily v THF (5 ml) a míchaly se při teplotě místnosti po dobu 15 hodm. Reakční směs se zředila solankou (100 ml) a extrahovala se ethylacetátem (2x, 100 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem hořečnatým, zfiltrovaly se a koncentrovaly se na rotační odparce. Zbytek se sebral do methanolu (5 ml) a přečistil se pomocí reverzní fázové HPLC (5 až 95% acetonilrii v H2O: 25 minutový gradient), Clsté frakce se spojily, koncentrovaly se, pak se znovu rozpustily ve směsi ethylacetát/hexan (1:9). Roztok se chladil při 5 °C po dobu 15 hodin, přičemž vznikla bílá pevná látka. Sraženina se sebrala, což dalo 3-(H(3,5-dimethylÍzoxazol-4-yl)methyl)-l/^^
252
Pyridin.2-yl)mefcyl)M^ (5 4%) ja|a) b.lou ,h nmr (OMSOV,, 400 MHz): S2.ll (s, 3H), 2.37 (s, 3H), 3,74 (s, 3H), 4,17 (s, 211). 4,54 (s, 2H), 5,17 (s,2H), 6,69 (d, 3-7,6 Hz. IH). 6,96 (d, J-6,8 Hz, ΙΗλ 7,67 (d, 3 = 6,ShÍ1H). 7,76 (s, 1H), 8,17 1H). MS M+H vypočteno 397,2; nalezeno 397,2, Titulní sloučenta vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla IC50 0,23 μΜ.
Příklad 10-75a: (6-methoxypyridin-2-yl)methanol
|M578| Methyl-ló-niethoxypyridm-l-karboxylát) (2g, 11.96 mmol) v bezvodém netaolu (20 ml) se «hladil na 0 C pod dusíkem a do roztoku se pomalu přidával borhydnd sodný (1,36 g, 35.89 mmol). Reakřni smis míchala 0 p„ M pak se ohřívala na teplotu mismosti 1 hodinu. Reakční smis se „končila vodou j koncentrovala se na rotační odparce, Renkdní směs se so|mkm (10„ g se roztokem dichlormeíhmv2-propanolu (2:1) (3x. 150 ml). Spojené organ,cké extrakty se vysuáily nad stanem hořečnatým, ziiltmvaly se a koncentrovaly se » rotační odparce, což dalo (6-tnethoxypyridin-2-yl)methanol (500 mg, 30%) jako olej. MS M+H vypočteno 140 I· nalezeno 140,1.
Příklad l0-76:-Hl-(n,5-dimcthy|izoxazol4-yl)nw^ fenethy|)imidazolidin-2,4-dion
O
1005791 Připravený jak v Přikladu 10-52 z J-MlJ-dime^^ -pyrazol+yl),m.dazoltdin-2,4.dionu (Přiklad 6) a 2-methoxyfemthytanmidu. Výlčžek- 52% H NMR (DMSO-4,400 MHz); S2.ll (s. 3Ηλ 2,38 (s, 3H). 2,80 (W- 7,2 Hz, 2H), 3,51 (,. J >7,2 Hz, 2H), 3,75 (s. 3H), 4,03 (s, 2H), 5,17 (s, 2HX 6,85 (t, J. 7,2 Hz, 1H), 6,95 (d J. 8,4 Hz. IH), 7,16-7,21 (m, 2H). 7.73 (s, 1H), 8.13 (s, IH). MS M+H vypočteno 410,2;
253 nalezeno 410,1. Teplot. táni: 97 až 9S 'C. Timlní sloučenin. vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla 1C5O 0,14 μΜ.
Příklad 10-77:3-(l-((3,5-dirnethylÍ2oxazol-4-yl)methylH^ fenethy])imidazolidin-2,4-dion
O
IOOS80I Připravený jak „ „Madu 2 3-(l-((„.dimeIhytoxl^^^ -pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dionu (Mad 10-1) a S-duorfenethylbramidu Výtížek- +2% HNMR(DMSO-d1,400MHzM2,ll(s,3H),2,38(s,3H).2.80(U-72Hz 2H) 357(1 J -7,2 Hz, 2H), 4,06 (s, 2H), 5,17 (s. 2H), 6,85 (dt, J. 8,4, 2,0 Hz, IH), 7,11 (, j. s 4 Hz 2H). 7.32 «U- 7,8 Hz, 1H), 7,73 (a, IH). 8J2 (a, IH), MSM+H vypočteno 398.2;nalezeno 398.1. Teplota táni; 1,0.11, -c. Mí vykázala inhibici H2RO8 receptoru hořkosti a měla IC50 0,06 μΜ.
Příklad 1M8: 3-(1-((3,5-^^^0^ imidazolidin-2,4-dion
O (00581, Připravený jak v Přikladu 10-52 z 3-(1-((3, 5+tatbylta^^^ -pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dionu (Příklad 10-1) a feneihylbramidu. Výičžek 37% Ή NMR (DMSO+4. 400 MHz); 62.11 (a, 3H), 2,38 (a, 3H), 2,83 (t, J - 6,4 Hz. 2H), 3,55 (, J ‘V Hz. 2H), 4,03 (a, 2H), 5,17 (a, 2HK 7,18-7,30 (m. 5H), 7,73 (a, 1H>. 8,13 (s' IH) MS M+H vypočteno 380,2; naleze,» 380,1. Teplot, táni; 95-96 ’C. Titulní sl„učcnina vykíala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla 1C5O 0,14 μΜ.
254
Přiklad 1<H79:3-<t.((W.dim.thytaoMz»^^ fenethy|)imidazolidin-2,4-dion
I0O5S2I Připravený jak v Přikladu 10-52 z 3^(3.5^,^^ (Příklad 10-t) a 4.methox,linetllylbromidu /». H NMR (DMSO-dk 400 MHz): S2,H (a, 3H). 2,38 (χ JH), 2,78 «, 7 = 7 4 Hz 2H)' ’A”’4 2H>. 5.® (S. 3H), 4.02 (a, 2H), 3,16(S, 2HX 6,84 (d, J. S,4 Hz 2H), 7,15 . 8,4 Hz 2H), 7,73(5, IH), 8,12(χ IH), MS M+H vypočteno 410,18; nalezeno 410 2
Titulní doočemna vykázala W2R08 θ
Příklad 1M0: HH(3.5+ltathyllz^^
- l-yl)ethyl)imidazolidin-2,4-dion
100583) Připravený jak v Přikiadu 10-52 z ORHftSvlíraethyiízox.^^ -pyrazoM-yl),™^^ 10‘^ · H^thyOnaWenu. Vy«&k:
-0/. MS .M+H vypočteno 430,18; „niezeno 4302. Titntrd a^ inh|bic.
Π i ZKUS receptorů hořkostí a měla 1C5() 1,27 μΜ.
255
Přiklad IMi:
1005841 Připravený jak v Přikladu 10-52 a 3^1 -((W-dimelbylizuaazol^^ -pyraa»l-4-yl)imidazulidin.2,4-dionu (Přiklad 10-1) a 2-chlorfeneihylbramida Výlířek- 25% MS M+H vypočteno 414,13; nalezeno 414.2. Titubai *** vykázda mR0, receptorů hořkosti a měla IC5fl 0,25 μΜ.
Přiklad »»: l-0-«lllOr6..llVl^
I0O58S] Připravený jak v PříkMu 1M2 z 3-(1-((3.5.^,1^
-pyrazoM ρΙ),·η«4ίη.2.Μ·οηυ (Přiklad 10-1) a 3-ehlurfeneihylbmmidu Výtaek· 27% MS M+H vypuč,»» 414.13; batat» 4,4.2. Iřtutal sluubeuta vykázala ,kibici W2R08 reccptoni hořkosti a měla IC50 0,20 μΜ.
256
Příklad 10-83: 3-(l-((3}5-dimethylizoxazol-4-yl)inethyl)-líf-pyrazol-4-yl)-l-(2-nuorfenethyl)imidazolidin-2,4-dion
100586] Připravený jak v Příkladu 10-52 z 3-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl^ pyrazoM-yl)imidazolidin-2,4-dionu (Příklad 10-1) a 2-fluorfenethylbromidu. Výtěžek: 24%. MS M+H vypočteno 398,16; nalezeno 398,1. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla ICÍO 0,13 μΜ.
Příklad 10-84: 3-(1-((3,5-dimethylizoxazoI-4-yl)methylM/^pyMzol-4-ylH-(4-nuorfenethyl)imidazolidin-2,4-dion
100587] Připravený jak v Příkladu 10-52 z 3-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)m^ -pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dionu (Příklad 10-1) a 4-fluorfenethylbromidu. Výtěžek: 34%. MS M+H vypočteno 398,16; nalezeno 398,1. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla ICJ0 0,01 μΜ.
Příklad 10-85: 3-(1-((3,5-dimethylÍzoxazol-4-yl)methyl)-lžř-pyrazol-4-yl)-l-(3-nietlioxyfenethyl)inúdazolidin-2,4-dion
[00588] Připravený jak v Příkladu 10-52 z 3-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-Uf-pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dionu (Příklad 10-1) a 3-methoxyfenethylbromidu. Výtěžek:
257
A “ M+H 4IW,. mlKeno <|U n 12X08 receptorů hořkostí a měla IC50 0,16 μΜ.
FHM.d fenethyl)imidazoljdin-2,4-dion
l«K«9| Připravený jal , PHklaál 1M2 z 3-(1-((3,5.dtaihylia^ 1)^11^-24^ (Ρ,ί1ω lw) , vy,ČM:
31%. MS M+H vypočteno 396,16; nalezeno 396 1 Tih,ir>i is· K ’ natezeno Tltul™ sloučenina vykázala inhibici
Π12Κ08 receptorů hořkosti a měla 1CSO 0,41 μΜ.
PHkM IW, HM-dl«»<«tf4^).3^^ -pyrazol-4-yl)imidazolidln-2,4-dion
I00S9OJ Prip™.ý jek v ffitadu 1O.S2 z 3-0.((3.5-^,(,^^ νΡ,-4^^ (mkM , M+H al“Cn° inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla IC50 0,26 μΜ.
258
Přiklad 10-88: l-benzyl-3-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lZf.pyrazol-4-y l)imidazolidin-2-o n
[00591 ] 1 -(1 -((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1 H-pyrazol-4-yI)imidazolidin-2-on (Příklad 10-88a) (50 mg, 0,19 mmol) a 60% hydrid sodný (8 mg, 0,21 mmol) v DMF (3 ml) se míchaly při teplotě místnosti po dobu 15 minut, pak se ochladily na 0 °C. Do směsi se přidal benzylbromid (33 mg, 0,19 mmol) a nechal se ohřívat při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Reakce se ukončila methanolem a koncentrovala se na rotační odparce. Reakční směs se zředila solankou (50 ml) a extrahovala se dichlormethanem (2x, 50 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem hořečnatým, zfiltrovaly se a koncentrovaly se na rotační odparce. Zbytek se přečistil chromatografií na silikagelové koloně (100% až 90% dichlormethan v methanolu: 30 minutový gradient), což dalo 1 -benzyl-3-( 1-((3,5-dimethyhzoxazol4-yl)methylHfApyrazol-4-yl)imidazolidin-2-on (21 mg, 31%) jako bílou pevnou látku. MS M+H vypočteno 352,17; nalezeno 352,2. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2RO8 receptorů hořkosti a měla ICJ0 0,71 μΜ.
Příklad 10-88a: 1-(1-((3,5-dimethyiizoxazoI-4-yi)methy l)-lH-pyrazol-4-yl)Ímidazolidin-2-on
I00592J l-(2-chlorethyl)-3-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)lH'-pyrazol-4.yl)močovina (Příklad 10-88b) (115 mg, 0,39 mmol) a 60% hydrid sodný (17mg, 0,42 mmol) v DMF (2 ml) se míchaly při 0 °C po dobu 15 minut, pak se ponechaly ohřát na teplotu místnosti za současného míchání po dobu 2 hodin. Reakční směs se ukončila methanolem a koncentrovala se na rotační odparce. Reakční směs se zředila solankou (50 ml) a extrahovala se dichlormethanem (2x, 50 ml). Spojené organické extrakty se vysušily nad síranem horečnatým, zfiltrovaly se a koncentrovaly se na rotační odparce. Zbytek se přečistil * - <·«»« Γ <;
• . .· r <« rt «· r · · · ? <» · r , p Λ n e
259 chromatografrí na silikagelové koloně (100% až 90% dichlormethanu v methanolu: 30 minutový gradient), což dalo 1-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)m^ imidazoiidin-2-on (98 mg, 97%) jako bílou pevnou látku. !H NMR (DMSO-4 400 MHz):
62,10 (s, 3H), 2,37 (s, 3H), 3,35-3,39 (m, 2H), 3,61 (d, J= 8,8 Hz, IH), 3,63 (d, 7= 10,4 Hz, IH), 5,07 (s, 2H), 6,71 (s, IH), 7,42 (s, IH), 7,74 (S, IH). MS M+H vypočteno 262,12; nalezeno 262,1.
Příklad 10-88b: l-(2-chIorethyl)-3-(l-((3,5-dÍmethylho^^
-yl)moíovina
[00593] 1 -((3,5-Dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-l/Z-pyrazoU-amín (419 mg, 2,18 mmol) a 2-chlorethylizokyanát (230mg, 2,18 mmol) v acetonitrilu (5 ml) se zahřívaly při 65 °C po dobu 16 hodin. Reakční směs se ochladila na teplotu místnosti a koncentrovala se na rotační odparce. Zbytek se přečistil chromatografií na silikagelové koloně (100% až 90% dichlormethanu v methanolu: 30 minutový gradient), vysušil se a třel se s ethylacetátem/ hexany (1/¾ c°ždalo (l-(2-chlorethyl)-3-(l-((3,5-dimethylÍ2oxazol-4-yl)methyl)lžf-pyrazol-4-yl)močovina (258 mg, 40%) jako Žlutá pevná látka. MS M+H vypočteno 298 10· nalezeno 298,1
Přiklad 10-89: I-benzyl-4-U-((3,5-dinKthyiizoxazol-4-yl)methyl)-f//-pyrazol-4-yl)-2-(methoiymethyl)-l,2,4-triazoUdln-3,5-dion
[005941 Připravený jak v Příkladu 10-91 z l-benzyl-4-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl). ntethyl)-lH-pyrazol’4-yl)-l,2,4-triazolÍdin-3,5-dionu (Příklad 10-91a) a brommethylmethyl260 etheru. Výtížek: 1«. Ms M+H 41, „. 4|] 2 vykázala inhibici hT2RO8 receptoru hořkosti a měla IC50 0,02 μΜ.
Příklad 1(^90: 1-((1,3-dimethyl-lH-pyrazol-4-y^^
-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)iinidazolidin-2,4-dion
100595] 3-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dion (10a) (200 mg, 0,7 mmol), 4-(chlormethyl)-l,3-dimethyl-lH-Pyrazol (144 mg, 1 mmol) a uhličitan česný (325 mg, 1 mmol) se rozpustily v 2 ml DMF a ozařovaly se v mikrovlnném reaktora při 165 'C po dobu 5 minut. Reakční směs se ochladila na teplotu místnosti a sraženma soli se odstranila filtrací. Získal se čirý roztok obsahující surový produkt a přečistil se HPLC (10 až 95% acetonitril/voda; 25 minut), což dalo l-((l,3-dimethyl-lH-pvrazol-5-^^1)-341-((3,5^^ (150 mg, 53%) jako světle hnědou pevnou látku.’2,09H NMR (DMSO, 400 MHz): δ (s 3H) 2.14 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 3,70 (s, 3H), 3,99 (s, 2H), 4,55 (s, 2H), 5,19 (s, 2H), 6,06 (s, H),’ 7,77 (s, H), 8,17 (s, H)„ MS M+H vypočteno pro 384,2; nalezeno 384,2. Teplota tání· 145 až 146 °C.
Přiklad 19-91:14»ozyM^l-((3,5HÍtnwft^
-ethyl-1,2,4-triazoIidin-3,5-dion
(00596] 1 -benzyl-441 4(3,5-dimethylizoxazol-4-y l)methyl)-1 H-pyrazol-4-yl)-1,2,4-tnazolidin-3,5-dion (100 mg, 0,27 mmol), bromethan (149 mg, 1,36 mmol) a uhličitan česný (355 mg, 1,1 mmol) v DMF (5 ml) se zahřívaly se při 80 °C po dobu 15 hodin. Reakční směs se ochladila na teplotu místnosti, zředila se solankou (50 ml) 3 extrahovala se ethylacetátem
261 (2x, 50 ml). Spojené organické extrakty se vysušily „ad a,raném hořečnatým, zfilmovaly se a koncentrovaly se na rotační odparce. Zbytek se přečisUl pomocí HPLC (5 až 95% nceto„itrt| v H2O: 25 minutový gradient), což dalo l-benzyl^H^·^,^ lH-pynmo|.4.yl)-2.ethyl-lA^^^ (40 mg, 37%) jako olej. '« NMR (DMSO J., 400 MHz): S0.97 (t, J + 7,2 Hž, 3H), 2,13 (s, 3H), 2,39 (s, 3Ηλ 3,58 (q, J - 6 8 Hz. 2H), 4.80 (s, 2H), 5,18 (s, 2H), 7,28-7,36 (m, 5H), 7,77 (a, 1H), 8,19 (s, 1H). MS M+H vypočteno 395.18; nalezeno 395,2. Titulní sloučenina vykázala inbibiei hT2R08 receptorů hořkosti a měla ICjo 0,04 μΜ.
Příklad l-benzyI-441^^
-1,2,4-triazolídin-3,5-dion
1005971 l-B“tyl-N-(l-((3,5-dim«hylizoxazoU.yl)metliyl)-IH.p)TazoM-yl)hydrazinkarboxamid (2.00g, 5,88 mmtd), eíhyHchlOrform.át) (6.38g, 58,77 mnml) a tnethytanin (1.78g. 17,63 mmol) v acetonitrilu (50 ml) se zahHvaly při 100 C po dobo 48 hodin. Smés se ochladila „a 80 °C, přidal se »d„y I Μ N.OH (5 ml) a reakční smés se míchala po dobu I hodiny. Reakční smčs se ochladil, „a íeplotu mismosíi . koncentrovala na rotační odparee Zbytek se tozpusttl v dichlormethanu a zfitaval se, aby se odsály soli „ Je konceníroval, což dalo 1-^1-4-(1-((3,5-4^^ l,2,4-maz»li4in-3,5slion (1,28 g. 60%) jako žlutý olej. MS M+H vypočteno 367.14· nalezeno 367,2. ’ ’
Příklad 10.91b:
-yl)hydrazmkarboxamid
262
[00598) 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl- lH-pyrazol-4-karbonylazid (2,79g,
11,33 mmol) v toluenu (70 ml) se zahříval při refluxu po dobu 4 hodin, což dalo 4-((4-izokyanato-lH-pyrazol-l-yl)methyl)-3,5-dimethylizoxazol in siiu. Dihydrochlorid benzyl· hydrazinu (2,44 g, 12,45 mmol) a triethylamin (2,29 g, 22,64 mmol) se přidaly do směsi. Směs se zahřívala při 100 °C po dobu dalších 4 hodin. Reakční směs se ochladila na teplotu místnosti, zředila se ethylacetátem (150 ml) a zfiltrovala se přes celit. Mateřský louh se pak promyl solankou (150 ml) a organická vrstva se vysušila nad síranem hořečnatým, zfiltrovala se a koncentrovala se. Zbytek se přečistil chromatografií na silikagelové koloně (100% až 90% dichlormethanu v methanolu: 30 minutový gradient), což dalo 1-benzyl-N-( 1-((3,5-dimethylizoxazoM-yl)methyl)-H/-pyrazol-4-yl)hydrazinkarboxamid (2,00g, 52%) jako olej. MS M+H vypočteno 341,16; nalezeno 341,2.
Příklad 10-92: 1 -benzyl-4-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-l^-pyrazol-4-y 1)-2-(2-mcthoxyethyl)-l,2,4-triazolidín’3,5-dion
[00599| Připravený jak v Příkladu 10-91 z 1 -benzyl-4-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lž/-pyrazol-4-yl)-|,2,4-triazolidin-3,5-dionu (Příklad 10-91a) a 2-bromethy|methyletheru. Výtěžek: 20%. MS M+H vypočteno 425,19; nalezeno 425,2. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla IC50 0,06 μΜ.
Příklad 10-93: l-benzyl-4-( 1 -((3,5-dimcthylizoxazol-4-y Ijmethy 1)- IH-py razol-4-y l)-2-pr opy 1-1,2,4-triazolidin-3,5-dion
263
[00600] Připravený jak v Příkladu 10-91 z l-benzyl-4-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-l//-pyrazol-4-yl)-l,2,4-triazolidin-3,5-dionu (Přiklad 10-91 a) a 1-brompropanu. Výtěžek: 38%. MS M+H vypočteno 409,19; nalezeno 409,2. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla IC30 0,06 μΜ.
Příklad 10-94: 3-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-l-(3-fenyl· propyl)imidazolidin-2,4-dion.
|00601| Připravený jak v Příkladu 10-52 z 3-(l-((3,5-dimethylizoxazol4-yl)methyl)-l/A -pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dionu (Příklad 10-1) a (3-brompropyl)benzenu. Výtčžek: 36%. MS M+H vypočteno 394,2; nalezeno 394,2, Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru horkosti a měla IC50 0,26 μΜ.
Příklad 10-95: l-benzyl-2-butyl-4-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)inethyl)-U/-pyrazol-4-yl-l,2,4-triazolidin-3,5-dion
264
[06602] Připravený jak v Příkladu 10-91 z 14^1-4-(1-((3,5^^ -yl)methyl)-l//-pyrazOl-4-yl)-l!2,4-triazolidin-3>5-dionu (Příklad 10-91a) a 1-brombutanu.
Výtěžek: 22%. MS M+H vypočteno 423,21; nalezeno 423,15. Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla IC50 0,41 μΜ.
Příklad 10-96; terc.buřylu 3-((3-(1-((3,5-dimethylizoxazol^
-yl)-2,4-dioxoimidazolidin-l-yl)niethyl)benzylkarbainát
[00603] 3-(1-((3,5'Dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dion (Příklad 10-1) (070 mg, 0,254 mmol), terc.butyl-O-ťhydroxymethyDbenzylkarbamát) (0,254 mmol, 60 mg), diethyl-(azodikarboxylát) (0,50 mmol, 86 mg) a P-tBu3 (125 ml, 0,50 mmol) se míchaly v THF (1 ml) po dobu 4 hodin. Reakční směs se zředila ethylacetátem (1,5 ml) a promyla se roztokem nasyceného hydrogenuhličitanu sodného (2x, 1,5 ml). Organická fáze se sebrala a směs se koncentrovala pod proudem dusíku. Surový produkt se přečistil kolonovou chromatografii na silikagelu použitím ethylacetátu, jako elučního činidla. Čisté frakce se spojily a rozpouštědla se odstranila na rotační odparce, což dalo terc.butyl-(3-((3-( 1-((3 5-dí™thylizoXazol-4-yl)methyl)-lH^^ benzylkarbamát) jako bílou pevnou látku (112 mg, 90%). Ή NMR (CDC13, 400 MHz)· § 1,44 (s, 9H), 2,19 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 3,48 (bs, IH), 3,84 (s, 2H), 4,31-4,30 (d,J = 6 Hz IH), 4,60 (s, 2H), 4,87 (bs, IH), 5,06 (s, 2H), 7,36 - 7,16 (m, 4H), 7,92 (s, 1 H), 8,08 (s, IH)’ Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptoru hořkosti a měla 1C5O 0,90 μΜ.
265
Příklad 10-97: 3-( 1 -((3,5-dimetbylizoxazol-4-y l)methyl)-1 H-pyrazol-4-yl)-5-(hydroxymethyl)imidazolídin-2,4-dion
HO
[00604| 4-((4-lzokyanato-lH-pyrazol-l-yl)methyl)-3,5-dimethylizoxazol (Příklad 10-1) (784 mg, 3,6 mmol), hydrochorid methylester šeřinu (672 mg, 432 mmol) a triethylamin (1 ml, 7,2 mmol) se refluxovaly v toluenu (16 ml) po dobu 8 hodin. Reakční směs se nechala ochladit na teplotu místnosti a pak se roztok koncentroval na rotační odparce. Produkt se přečistil reverzní fázovou HPLC (5 až 95% acetonitril v H2O: 16 minutový gradient), což dalo 3-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)-5-(hydroxymethyl)-imidazolidin-2,4-dion jako bílou pevnou látku (60 mg, 25%). 'h NMR (CDClj, 400 MHz):. S(s, 3H), 2,40 (s, 3H), 3,13-3,07 (m, 1H), 3,94-3,93 (d, A 4 Hz, 2H), 4,214,19 (t, J = 4 Hz, 1H), 5,03 (s, 2H), 6,68 (bs, 1H), 7,87 (s, 1H), 7,99 (s, 1H). Titulní sloučenina vykázala inhibici hT2R08 receptorů hořkosti a měla ÍC50 3 μΜ.
Sloučenina Č. Sloučenina hT2R8 l€,0 (μΜ)
10-66 O. / c( I NJ £ 4-( l - (f 3,5-d i met hy lizoxazol-4-yi)methyl)-1 H-pyrazol- 4-ylJ-1 -(4-fluorfenethyi )-2-methyl— 1,2,4-triazolidin-3,5diun 0,012
10-15 1 - 0 3-{ l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-l H-pyrazol4-yl)-1 -(2-(methylthio)benzyl)-imidazolidin-2.4-dinii 0,016
10-42 A nA 0 5-bertzyl-3-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-y|)-methyl)-lHpyrazol-d-yli-l-meihyl-itnidazolidin-Ž^-dion 0,017
266
Sloučenina č. ________________ Sloučenina hT2R8 ÍC« (μΜ)
10-26 ° Vx 0 H 1 -((3,5Uimet hyl izoxazol-4-yl)methyl)-1 H-pyrazol_____%vl)-l-(3-rnethylbenzyl)3midazolidin-2,4-dion 0,019
10-43 i 0 0-yCO 0 l-benzyl-3-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)-methyl)-1H___pyrazol-4-yl)-5-methyl-iniidazol!din-2,4-dion 0,020
10-89 0 / 1 -benzyl-4-( 1-((3,5-dimethylizoxazoÍ-4-yl)-methyl)-lHpyrazol-4-yl)-2-(methoxymethyl)— 1,2,4-triazolidin-3.5- ___ dion 0,024
10-10 cA-x 0 M=/ k n^z^n f O OH 3-( 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1 H--pyrazol____‘l~y|)~1-(3-hydroxybenzy|)-iniidazol idin-2,4-dion 0,026
10-84 °Ή /VY o. A N o N 3-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yi)methyl)-lH-pyrazol- -Fyl)· 1 -(4-fluorfenethyl)imidazolidin-2,4-dion 0.027
10-91 Q r řů 1 -benzyl-4-( l-((3,5-dimethylizoxazol-4--yl)methyl)-IHpyTazol-4-yl)-2-ethyl-l,2,4-triazolidin-3,J-dion 0,041
267
Sloučenina č. _______________ Sloučenina hT2R8 IC,o (μ.Μ)
10-12 οΆ\ O Η A \ I'U/'-N 7 o 3(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methy])-lH-pyrazol- --tílhL·í4-hydΓOXybenzy])-iπlidazolidin-2,4-dion 0,043
10-79 WA* 3-ť l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyi). 1 H-pyrazol4-yl)-1 -(4-methoxvfenelhyh-imida7nlidin 2 4 dinn 0,044
10-31
0 0 W) _ XA r 3-( H(3,5-dimethylizoxazol-4-y|)methyl)-1 H-pyrazol______4~yl )-1-(4- fluofbenzvhimidaznlidin-? d.dinn 0,045
10-32 O \ nAn. 7 r-A 4-((3-( I -((3,5-dímethylizoxazol-4-yI)methyl)— 1Hpyrazol-4-y|)-2,4-dioxoiniidazolidin-1 - ____________________- yl |niethyl)benzonitril 0,048
10-35 0 l(3,4-dimethoxybenzyi)-3-( 1-((3,5-dimethylizoxazol4-yi)methyl)J H-pyrazol-4-yl)imidazolidin-2 4-dion 0,051
10-36 __ 0 7^ n NXó /-v 1 (benzo[d|[IJ]dioxol-5-ylmethyl )-3-( 1-((3,5- dimethylizoxazol-4-y|)methyl)-1 H-pyrazol-4____ yl)imidazolidin-2.4-dion 0,053
268
Sloučenina č.
10-92
Sloučenina o~
5. (μΜ) ]
0,057 l-benzyl-4-( 1-((3,S-dimethylizoxazol-a-yD-methyl)-1Hpyrazol-4-yl)-2-(2-methoxyethyl)-l12T4-triazolidin-3,5dion
10-27
058
3-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1 H-pyrnzol----Ly||-l-(3-fluorbenzyljimidazoli1jin-2,4-di,ln
10-18
Ύν N=\ lil.
O O'
10-93
10-5
10-77 o
o 3“(T((3,5-dimethylizoxazol-4-y])methyl)-lH-pyrazol4-yl)-l-(2-methoxybenzyl)-imidazolidin-2,^
0,06
0,064
-benzyl-4-( 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methy|J-1H. σ-\--χ Q 0 O'\j/
3-( 1 -í(3-5-dimethyliz0xazol-+y|)methyJ)-1 H-pyrazol----±jO-H2-fenoxyethyl)imidazolidin-2,4-dion
3-(l-((3,5-dim«hylizoxazo|.4-yJ)nie«iyl).lH-pyrazol.
----4-y|)-l(3-nuorfenethyl)imidazolidin-2,4-dion
269
Sloučenina č. Sloučenina hT2R8 ICM (μΜ)
10-30 oA-x o N \ N^An / A A J 0 3-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1H—pyrazol- 4-yl)-l-(4-methylbenzyl)-imido2olidin-2.4-dion 0,065
10-94 oA^ o ' Y Ν-λ 1 \ N^AN ' Ax A 0 3-(1-((3,5-dimethylizoxazoi-4-yl)niethyl)-1 H-pyrazol4-yl)-l-(3-fenylpropyl)imidazo[idin-2,4-dion 0,068
10-11 nA--x 0 n \ í^\ o p HO 3-( 1-((3,5-dimethy lizoxazol-4-y l)methyl)-1 H-pyrazol- ____4-yl)-1 -(2-hydroxybenzyl)- imidazolidin-2,4-dion 0,069
10-6 A _ o 9 AAA N \ NA ζ J 0 3-( l-((3,5-dimethylizoxazol-+yl)methylM H-pyrazol4-yl)-l-(3-methoxybenzyl)-imidazolidin-2,4-dion 0,073
10-23 D o, A N o N 3-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-y])methyl)-lH-pyrazol__jFyl)-l-(2-nitrobenzyl)ímidazolidin-2,4-dion 0,081
10-76 . 1 A . o π \ N^-^J 0 3 ( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-IH-pyrazol4-yl)-142-methoxyfenethyi)-iniidazolidin-2,4-dion 0,097
270
Sloučenina č. Sloučenina hT2R8 IC« (μΜ)
10-13 W»;nx 0 3-( 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methy))- IH-pyrazol4-yl)-1 -(3-hydroxy-4-inethoxy-benzyl)imidazo lidin-2,4- _ dion 0,087
10-21 S O ΑτΟύΆ o, Λ 0 3-( 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)niethyl)- lH-pyrazol__ 4-yl)-1-(2-fluorbenzyl)imidazolidin--2,4-dion 0,090
10-7 X _ O O NA n3-n /ΆΑι 0 A U rnethyl-(3-((3-(l-((3,5-dimethyIizoxazol-4—yl)methyl)1 H-pyrazol-4-yl)-2,4—dioxoiniidazolidin-1 yl)methyl)benzoát) 0,102
10-4 O->-^ O n={ n Vo (R)-5-benzyl-3-( 1 -((3,5-dimethyiizoxazol-4-y|)methyl)- lH-pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dion 0,112
10-3 oA-x O (S)-5benzyl-J-(l-('(3,5-dimethylizoxa2ol·4~y^)methyl)lH-pyrazol-4-yl)imidazolidiíi-2,4-dion 0,113
10-2 5-benzyl-3-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)niethyl)-IHP yrazo 1-4-y 1) imidazolidin-2,4-dion 0,117
271
Sloučenina t. Sloučenina hT2R8 IC,, (μΜ)
10-16 1 ,0 ° A íQ 0 3-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)mcthylHH-pyrazol4-yl)-1 -(2-(2-methoxyethoxy)-benzyl)imidazolidin-2,4dion 0,131
10-56 0 nA nAn i a a x anh A 0 3-(l·((3,5-dimethylizoxazo^-4-yl)πlethyj)-lH—pyrazol4-yi)-5-(3-methoxybenzyl)-imidazoíidin-2.4-dion 0,131
10-20 °> o MW'2' o, Λ N o N^ 3-(1-((3,5-dimelhylizoxazol-4-yl)melhyl)-IH-pyrazoi4yl)-l-(?.-methylb<.'nzyí)-imidazulidin-2.4-<lion 0,133
10-87 Ν ' l-(3,4-dimethoxyťenethyl)-3-( 1-((3,5-dímcthylizoxazol4-yl)methyl)-1 H-pyrazol-4-yl)iniidazolidín-2,4-dion 0,137
10-78 0, A 3 νΆ v \\ Av / o, A o N^· 3-(l-((3,5-diniethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol- _______ -4-yl)-l-ťenethylimidazolidin-2,4-dion 1 1 0.139
10-9 A -s 0 ° A n-λ A nA nA-n ? AA 0 3-( (3-( 1 -l (J.5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1Hpyrazol-4-yl)-2,4-dioxoimidazolidin-l--yl}methyl)-N- ___tnethylbenzamid______ 0,141 i 1 --i
272
Sloučenina č. Sloučenina hT2R8 ΙΟ,(μίνΐ)
10-85 1 0 9k N=\ ν^/'Ν / 0 PA 0^ 3 1 l-((3.5-dimethylizoxazol-4-yl(methyl)-IH-pyrazol4-yl)-1 -(3-methoxyfenethyl)- imÍdazoiidin-2.4-dion 0,158
10-34 °> o Q. Λ N 0 Ν^ 1-( 2-aminobenzyl )-3-( 1-((3,5-dimethyl-ízoxazol-4yl)methylHH-pyrazol-4-yl)-imidazolidin-2,4-dion 0,163
10-24 0 ? \ γΥ 7 h\) u VO 3-((3-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl (methyl)-lHpyrazol-4-yl)-2,4-dioxoimidazolidin-1 -y 1)______ methyl)benzaldehyd 0,201
10-90 A Ρλ ίχ l-(( 1,3-dimethyl-l H-pyrazol-5-yl)methyl)-3-( 1-((3,5dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-IH-pyrazol-4- ___ yl)imidazolidin-2,4-dion 0,215
10-22 Vt 0 0, Λ N O F Ν^ 3-( 1-1(3,5-dimethylizoxazol-4-yl)niethyl (-1 H-pyrazol4-yl)-1 -(2-1 tritluormethyl)benzyl)-imidazaiidin-2.4-dion 0,221
10-75 X _ O 9 / k x v pa] j-( 1-113, >dimethylizoxazoi-4-yl (methyl)- IH-pyrazol4-yl)- l-í(6-methoxypyridin-2-yl)-methyhimidazolidm- __2,4-dion____________ 0,229 i __________________________________________________________________________________________1
273
Sloučenina č. ______ Sloučenina I hT2R8 ÍC^ (μΜ)
10-53 (TVa 0 A nAA 1 -benzyl-3-( 1 -((J.S-dimethylizoxazol^-yil-methyl)-1H- ___ pyrazol-4-yl)imidazoli<lin-2.4-dion 1 1 0,257
10-81 Va .γΥ N ''A’N Y N O. A N=/ O Cl^ N'^· l-(2-chlorfenethyl)-3-( l-((3,5-dimethyl-izoxazoi-4yDmethyl)-1 H-pyrazol-4--yi)imidazoiidin-2.4-dion 0,248
10-74 Η ΑΆ k \ nA^m i --χ kkk / o Ύ l -í cyklohexyl methyl )-3 -(1 -« 3,5-dimethylizoxazol-4- ____vijrnethyl)-1 H-pyrazol-4-yl)imidazoiidin-2,4-dion 0,276
10-58 “Jk ΎνΑυυ 0 5-(cyklopentyimethyl )-3-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4_ yl)methyl)-1 H-pyrazol-4-yl )imidazolidin-2.4-dion 0,316
10-28 Vr-NVN x/NA-N 1-(( 1.5-dimethyí- IH-pyrazol-3-yl)methyl)-3-( 1 -((3,5dimethyiiztJxazol-4-yl)methyi)-lH-pyrazol^ ______yl)imidazolidin-2,4-dion 0J22
10-33 Ν=Γ N-Λ k \ n^An 7 0 ^X-OH 3-(l-((3,5-dimethylÍzoxazol-4-yl)methyl)-l H-pyrazol- Ή)-1 3-<hydroxytmhyl)ben2yl)-imidazolidin-2,4- _____________________ dion_____________ 0,322 -------------------------------------------------------------------i
274
Sloučenina č. Sloučenina hT2R8 iCí0 (μΜ)
10-59 \ Νς^Ζ-Ν 1 Γ ll Vnh L JI 0 ^OH 3-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol4-yl)-5-(4-hydroxybenzvh-imidazolidin-214-dinn 0,327
10-38 □Y ? N=(\ iXl /=> Hx-XV 0 N 3-(1-((3,5-dimethylízoxazoí-4-yl )methyi)-1 H-pyrazol- +yl)-1 -((1 -methyl-1 H-pyrazol-3- ___________:;llmethyllimidazolidin-2,4-dion 0,363
10-46 O \ n^z-n γ γΗ M 0 3-(i-((3.5-dimethyiizoxazol-4-yi)methyl)-lH-pyrazol4-yl)-5 (3-ťenvlpronvl)imÍdazolidin—2 4-,lif>n 0,484
10-95 \ V N-/ y η 0 l-benzyl-2-butyi-4-( l-((3,5-dimethylizoxazol—4j/l)methyl)-1 H-pyrazol-4-yl)-l .2.4--triazolidin-J,5-dion 0,409
10-17 Y 0 '' S-X) 0 0-\ 3-(I ((3.5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1 H-pyrazol- _hy!.tl-ť2-(methylsuitinyl)benzyl)-imidazoiidin-i 4-<tinn 0,412
10-86 \ z- m'V n. > \\ Xu y 0, Λ N 0 N' · 3-(l-((J,5-diniethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol4-ylM-l4-hydroxyťenethyi)-imidazolidin-2,4-dion 0,412
275
Sloučenina č. Sloučenina hT2R8 IC,9 (μΜ)
10-83 0 Λ N 0 F 3-( 1 -(( 3,5-dimethylizoxazol-4-yl )methyl+1 H-pyrazot_____+yl)’l-(2-fluorfeneihy])imidazolidin--2,4-dion 0,442
10-55 oX__. A X v ° yN l-((3.5-dimethylizoxazol~4-yl)methyl)-3-( 1-((3,5dimethyl izoxazol-4-y|)methyl)-lH-pyrazol-4- _____ y()imidazolidm-2,4-dion 0,479
10-60 oX--\ o λΝΗ X NH AO: OH P-(3,4-dihydroxybenzyi)-3-(l-((3,5-dimethylizoxazol4-yl)methyl)-lH-pyrazol-4-yl)ÍTnidazolidin-2,4-dion 0,513 í
10-19
0<H O °XC 0 N N 2-((3-( 14(3,5-dimethylizoxazol-4-yl (methyl)-IHpyrazol-4-y!)-2,4-dioxoimidazolidin-1 __ -yl)methyl)benzonitril 0,550
10-54 Q \ n^A-n 7 o 3+l-«3.5-dimethyHzoxazol-4-yi)methyl)-lH-pyrazol_£vh-1 (pyridi n-2-ylmethyl )-i midazolidin- 2,-ldiún i f 0,609
10-71 oA-. O n=< rv X, ΡΆ) ,,, ° N OH 3-( l-((3.5dimethylizoxazul-4-ynmethyi)-lH-pyrazoI4-yl)-1 -((6-( hydroxymethyl lpyridin-2_________ yi}methyl)ímidazolidin-2,4-dion 0,721
276
Sloučenina c. Sloučenina j hT2R8 1C\„ (μΜ)
10-48 1 n-\ A ΓΑ Ó '0 2-(1-( l-((3,5-dimethylizoxazol-4-y!)methyl)—lH- pyrazol-4-yl)-2,5-dioxoimidazoHdin-4-yl)—N- _____ ťenylacetamid -1------------------------------------- 1 0,747
10-47 0 Aj 5-(benzyloxymethyl)-3-(l-((3,5-dimethyl-izoxazol-4yl)methyt)-lH-pyrazol-4-yl)-imidazolidin-2 4 dion 0,766
10-96
°ή ox Λ n o terc.butyl-(3-{(3-( l-((3.5-dimethyltzoxazol-4- -yl)methyi)-lH-pyrazol-4-yi)-2,4—dioxoimidazolidin-1- __yl(methyl)-benzylkarbatnát) 0,891 1
10-61 A - O nAmY 0 3-( 1-((3.5 dimethykzoxazol-4-yl)methyl)-l H-pyrazol__4-yl)-5-izobutylimidazokdin-2,4-dion 0,912 1
10-80 . ^ΝγΝ-^0 o. Λ N o < Λ N' 341 -((3.5-dimethylizoxazoi-4-yl (methyl)-1 (l-pyrazol4-yl)-1 ( 2 (naťtalen-1 -vDethyll- imidažnliditi-? 4.<iinq 0,927
10-57 O~N NH Γ > // X—A / O v--- ><cyklohexylmethyi)-3-< 1-((3,5-dimethyi-izoxazol-4yl (methyl)-1 H-pyrazol-4-vl limidazol idin- 5 4.d i.>n j 0,962
. ----------------------------!
277
Sloučenina č. Sloučenina hT2R8 ICS, (μΜ)
10-Sl yN z otX Ϊ N 3-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol_____ +yh- l-methylimidazolidin-2,4-dion 0,966
10-82 YY 0 a 1-(3-chlorfenethyi )-3-( 1-((3,5-dimethy!-izoxazol-4_ yl(methyl)-1 H-pyrazot-4-yl)-imidazoiidin-2,4-dion 0.982
10-45 0. / NH zíY Q, X o N^· 3-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yi)methyl)-IH-pyrazol- ____4-yl)-5-fenethylimidazolidin-2,4-dion 0,793
10-72 λ 0 C< 9 _7 'NY\ 0 14(3,4-dimethoxypyridin-2- yl)methyl)-3 41 -((3.5dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1 H-pyrazol-4- __yl)imidazolidin-2,4-dion 0,999
10-25 °H 0^ 0, X o Ν ' 3-((341 1(3,5-dintethylizoxazol-4-yl)melhyl)-lH- pyrazol-4-yJ)-2.4-dioxoimidazolidin-1 yiimethybbenzDnitnl 1,003
10-37 y νΛΟΎ r । /Γ 0 1 13 ((dimethylamino(methyl)benzyl)-3-( 1-((3.5. dimethylizoxazol-4-yl)niethyi)-lH-pyrazol-4yl)imidazolidin-2.4-dion 1,220
278
Sloučenina č. Sloučenina hT2R8 IC, (μΜ)
10-41 “Η VA'n'V-n μη Ον I A N 3-11 -((3,5-dimethylizoxazol-4-yl (methyl)-1 H-pyrazol+yl)-5-methylimidazolidin-2,4-dion 1,285
10-49 0 ^33 \JI N-benzyl-2-( 1-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4— yl)methyl)__n+£yrazol-4-yl)-2,5-dioxoimidazolidin-4-yl)acetamíd IJ29
10-73 V Λ NÁ «JY ry )r UJ 0 0 3-( 1 (13,5-dimethylizoxazoM-yl)methyl)-1 H-pyrazol4-yl)-l-i(tetrahydroftiran-2-yl)-methyl)imidazoiidin-2,4- ___ dion 1,362
10-62 n'xy-A, Q í ' / 1 1 ΝΛ y-NH 0 3-1 l-113.5-dimethylizoxazoi-4-yl)methyl)-lH-pyrazol- 4-yl)-5-izopropylimidazolidin-2,4—dion 1,440
10-1 NH °' X 'N=/ 0 3( l( < 3,5-dimetiiylizoxazoi-4-yl (methyl)-1 H-pyrazol_____ i-yl)iinidazolidin-2.4-dion 1,696 1
10-50 H A N=\ ΝχΛΝ TY ^-NH 0 ó 2-11 -(!-((3,5-diniethylizoxazol-4-ybinethyl)-1H- pyrazoJ-4-yl)-2,5-dioxoimidazoiidin-4-yl)-N.(3__methpxybenzyl lacetamid 1,773
279
Sloučenina č. Sloučenina hT2R8 ICÍO (μΜ)
10-8 °> Ať° oh ofX 0 3-((3-(l-((3,5-diniethylízoxazol-4-yl)methyl)-lHpyrazol-4-yi)-2.4-dioxoimidazoiidin-l-yl)__ -methyl)benzoová 1,798
9-5 Φγ o υ l-benzyl-3-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4—yi)methyl)-IH.___pyrazol-4-yi)imidazolidin--2,4.5-tnon 2,493
10-29 _/=\ / o. /—\ .Η ífX N 0 N 3-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)tnethyl)-lH—pyrazol- 4-yl)-1 -(4-methoxybenzyl)-imidazolidin-2.4-dion 3,117
10-63 Ó. y-NH Q 1 n=/ J k
(E)-5-benzyliden-3-( 1 -((3,5-dimethylizoxazol-4vl)methyi)-1 H-pyrazol-4-yl)imidazolidin-2,4-dion
10-67 οΎ. O n=/ tn K\ N 0 ο-γ 4-(1-((3.5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl >-1 H--pyrazol4-yl)- l-methyl-2-(2-fenoxyethyl)- l.2.4-triazoiidin-3,5- ____________ Ji on
10-97 0 y-NH °· 1 N=y O N 3-( 1 -((3,5 dimethylizoxazol-4-yl(methyl)-1 H-pyTazol4-yl (-5 -(hydroxymethyl)! midazolidin- 2,4-dion
280
Sloučenina č. Sloučenina
9-8 H O^N^O \<-n τ i f B HY ° u N 1 -(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1 H-pyrazol4-yl)-3-tenethyl-l,3,5-triazinan-2,4,6— tri on
9-7 U υζλ > \ )-N 0 '—\ O 5-benzyl-1 -< l - ((3.5-dime thy 1 izoxazol-4-y Ijmethy 1)-1Hpyrazol-4-yl)-3-fenethyl-1,3,5—tri azinan-2-on
9-9 H YAY Y\ Y 0 A l-benzyl-3-( 1-((3.5di tnethy!izoxazol-4-yi)methyl)-1Hpyrazol-4-yl)-1,3,5-triazinan-2,4,6-tnon
10-88 l-benzyl-3-(l-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-IHpyrazol-4-yl) j midazo ltdín-2-on
9-5 o >Y o 7 i ŮY) l-benzyl-3-( 1-((3.5-di tnethylizoxazol-4-y!)-ntethyl)-lHpyrazol-4-yl)tetrahydropyrimidin-2( 1 Ht-on
9-6 0 z N Y A i. j U H 1 -benzyl-3-( 1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yl (methyl 1-1H___________pyrazol-4-ylM,3,5-triazinan-2-on___________[
281
Sloučenina č. __________ Sloučenina YiTIRS IG. (μ.Μ)
10-68 θχ NH V/^NVNyNH Q 0 N - 4-(l-((3.5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-lH-pyrazol- ______ 4-yl)-1,2.4-triazolidin-3,5-dion
10-45 y—nh 0, 3 0 N 3-( 1-((3,5-dimethyl izoxazol-4- yljmethyl)-1H—pyrazol4-yl)-5-fenethvlimidazolidin-2 4-diAn 0,793 i
10-44 0, Xnh ? Aa nA n AI n=/ J N - kyselina 2-(1-(1 -((3.5-dimethylizoxazol-4- -yl)methyl)-iH-pyrazol-4-yl)-2,5—dioxoimidazolidín-4- ______ yl) octová i
10-65 oA-x o X ΝΛ A- O l-benzyl-4-(l-((3,5-dimetliylizoxazol-4-yl)methyh-lH_ pyrazol-4-yl )-2-methyl-1,2,4-tnazolidin-3,5-dion 0,019
10-70 Avx hAxJ 0 1.2-dibenzyl-4-(1-((3,5-dimethylizoxazol-4-yi)methyl)____ |H-pyrazol-4-yl)-l,2,4-triazolidin-3,5-dion 1,799 i
10-69 nA nJwy FN\ 0 4-(1-1(3,5 dimethylizoxazoi-4-yl)methyl)-IR—pyrazol- ______±ii)-l ^-dimeihyl-1,2,4-triazolidin-3,5-diún 0,707 1
10-52 z θ x-x-b 0 1 3-( l-«J.5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-IH-pyrnzol- ________4-yl)-l,5.5-triiTiethylimidazolidin-2.4-fiinn ; 0,810 i i
282
Sloučenina č. Sloučenina hT2R8 Ι(%(μΜ)
10-14 ° 0 3-( 1 -((3.5-dimethylizoxazol-4-yl)methyl)-1 H-pynzol- 4-yi)-1-(3-(2-methoxyethoxy)-benzyi)imidazolidin-2,4__________________di on 0,071
Příklad 11. hT2R8 přispívá k hořkosti sacharinu u lidí $ “netasterovými” (neochutnávacími) verzemi 11T2R43 a hT2R44 genů
Obr. 6 ukazuje vzájemné vztahy dávkových odpovědí a účinků sacharinu na aktivity receptoru v transfektované buňce exprimující varianty hT2R43, hT2R44 a hT2R8. hT2R8 je méně citlivý na sacharin v in vitro zkoušce, než tasterové hT2R43-W35 a hT2R44-W35 alely, ale je citlivější, než netasterové hT2R43-S35 a hT2R44-R35 alely. Pronin a kol., Curr. Biol. 17: 1403-8 (2007). Na základě genotypové analýzy se vybralo pět jednotlivců s “tasterovými” atelami (hT2R43-W35 a/nebo hT2R44-W35) a pět s “netasterovými” alelami (hT2R43-S35 a hT2R44-R35). Každému subjektu bylo představeno 6 párů roztoků a měli určit, který ze vzorků v páruje více hořký. Výsledek je ukázán v Tabulce 8 níže, přičemž ukazuje, že hT2R8 blokátor Cpd-D snižuje hořkou chuť sacharinu u lidí s “netasterovými” alelami hT2R43 a hT2R44, ale nemá vliv na lidi s “tasterovými” alelami těchto genu.
Tabulka 8: Výsledky chuťového testu
chuťový test agonist* hořkosti- genotypová skopin* vybraný jako více horký P hodnoto
bea >Cpd-I>
1 sacharin bT2Ř43-W35 a/nebo HT2R44- W35 13 17 0,82
2 sochařin hT2R43-S35 a iT2R44-R3S______________ 27 3 0.001
100605] Jiné příklady sloučenin, které jsou poskytnuty podle vynálezu a/nebo vhodné k použití ve způsobech podle stávajícího vynálezu, zahrnují sloučeniny dle následujícího vzorce.
100606] Podle prvního aspektu je poskytnuta sloučenina dle strukturního vzorce (I):
283 \ y (RX—Ar'-R1- N
B (I) nebo její sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid, kde:
Ar1 pěti- nebo šestičlenný arylový, heteroarylový nebo cykloalkylový kruh;
m je 0, 1, 2 nebo 3;
R' je SO2; C=O; C=S; nebo C=NOR4;
X je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkvlu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR^7, CONR6R7, CO2Ró, NR6CO2R7, NR6CONR7R3, NRbCSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO;NR5R6. NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(ORě) a P(O)(R3)(OR6);
každý R1' je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO·» OR6, S(O)bR6, nr6r7, conr°r7, co2r6, nr6co2r7, nr6conr7r3, nr6csnr7r8, NR^NHjNRTČ, SO2NR3R6, NR^R6, NR5SO2NRůR7, B(OR3)(ORó), P(O)(OR3)(ORď) a P(O)(R3)(ORt’);
nebo případné X a/nebo alespoň jeden R1' spolu s atomy, ke kterým jsou připojeny, tvoří aryl, substituovaný aryl, heteroaryl, substituovaný heteroaryl, cykloalkyl, substituovaný cykloalkyl, cykloheteroalkylu nebo substituovaný cykloheteroalkylový kruh, kde kruh je případně kondenzovaný s jiným arylem, substituovaným arylem, heteroarylem, substituovaným heteroarylem, cykloalkylem, substituovaným cykloalkylem, cykloheteroalkylem nebo substituovaným cykloheteroalkyiovým kruhem;
284
R. -Rs jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, hetcroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, hcteroarylalkylu a substituovaného heteroarylalkylu nebo případně R3 a R6, R6 a R7, R7 a Rx, spolu s atomy, ke kterým jsou připojeny, tvoří cykloheteroalkylový nebo substituovaný cykloheteroalkylový knih;
A a B jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu; a b je 0, 1, nebo 2;
1006071 Podle druhého aspektu je poskytnuta sloučenina dle strukturního vzorce (II) znázorněného níže:
x ^CH^-Y-Ar2-!^^ (R1')mAAri_Ri_N (CH2X-Z—Ar3—(R3% (II) nebo její sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid, kde:
Ar1, Ar a A? jsou nezávisle pěti- nebo šestičlenné arylové, heteroarylové nebo cykJoalkylové kruhy;
m je 0, 1, 2 nebo 3;
n a p jsou nezávisle 0, 1, 2, 3 nebo 4;
ra tjsou nezávisle 0,1 nebo 2;
Y a Z jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z CR^R7, CO, C =S, ONOR6, O, NR6 a S(O)b;
R1 je vybrán ze skupiny sestávající z SOi, C=O, OS a ONOR1;
285
X může být vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO,, -OR6, S(O)bR6, NR^R7, CONR6R7, CO2R6, NR6COjR7, NR6CONR7R3, NR6CSNR7Rs, NR6C(=NH)NR7R3, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO,NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6) a P(O)(R5)(OR6);
X je s výhodou vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, S(O)bR6, CONR6R7, -CO2R6, SO2NR3R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR°R7, H(OR5)(OR\ P(O)(OR5)(OR6) a P(O)(R5)(OR6).
každý R'1 je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R3, NR6CSNR7Rs, NR6C(=NH)NR7R3, SO2NRjR6, NR5SO2Rs, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6) a P(O)(R5)(OR6);
každý R” je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NRbR7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6C0NR7Rs, NR6CSNR7Rs, NR6C(=NH)NR7Rs, SO2NR5R6, NR’SOiR6, NRsSO2NR6R7, B(OR3)(OR6) a P(O)(OR5)(OR6);
každý RJ| je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO2, OR6, SIO^R6, NR6R7, CONR°R7, CO,Rb, NR6CO2R7, NR6CONR7R3, NR6CSNR7R3, XICONHiNRY, S02NRjR6, NR5SO2Rs, NR5SO2NR6R7, BIOR^OR6), P(O)(OR5XORŮ) a P(OMRS)(OR”);
286 nebo případné X a/nebo alespoň jeden R1 ’ spolu s atomy, ke kterým jsou připojeny, tvoří aryl, substituovaný aryl, heteroaryí, substituovaný heteroaryí, cykloalkyl, substituovaný cykloalkyl, cykloheteroalkylu nebo substituovaný cykloheteroalkylový kruh, kde kruh je případně kondenzovaný s jiným ary lem, substituovaným arylem, heteroarylem, substituovaným heteroarylem, cykloalkylem, substituovaným cykloalkylem, cykloheteroalkylem nebo substituovaným cykloheteroalkylovým kruhem;
R -R jsou nezávisle vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heteroalkyl, substituovaný heteroalkyl, heteroaryí, substituovaný heteroaryí, heteroarylalkylu nebo substituovaný heteroarylalkylu nebo případně R5 a R6, R6 a R7, R7 a Rs, spolu s atomy, ke kterým jsou připojeny, tvoří cykloheteroalkylový nebo substituovaný cykloheteroalkylový kruh;
bje 0, 1, nebo 2.
[006081 Podle jiného aspektu vynález poskytuje sloučeniny mající strukturní vzorec (III) znázorněný níže:
O
HO-4 9Η2—Af2—(R2’)n , \ A? /
IRL—Ar'-S--N
CH2---Ar3_fR3.jp (III) nebojejí sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid, kde:
Ar', Ar a Ar3 jsou nezávisle pěti- nebo šestičlenný aryl, heteroarylu nebo cykloalkylový kruh a Ar a Ar3 mohou být případně vynechány;
<n je 0, 1, 2 nebo 3;
n a pjsou nezávisle 0, 1,2, 3 nebo 4;
každý R1, je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu. substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu,
287 substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO?, ORŮ, S(O)bR6, NR<;R?, CONR6R7, CO2Rď, NR6CO2R7, NRňCONR7R3, NR6CSNR7R3, NRA-NHjNR^3, SO;NR3R6, NR5SO2Rb, NR5SO2NR'’R7, B(OR5)(ORó), P(O)(OR5)(ORň) a P(O)(RS)(OR6);
každý R·' je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NRfeR7, CONR6R7, CO2R6, NRóCO2R7, NR6CONR7R8 NR6CSNR7Rb, NR6C(AH)NR7Rs, so2nr3r6, nr5so2r6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR3)(OR6) a P(O)(R3)(OR6);
každý R3' je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NRŮR7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7Rs, NR6CSNR7Rs, NR6C>NH)NR7R3, SO2NR3Ró, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(ORó), P(O)(OR3)(OR6) a P(O)(R3)(OR6);
R R jsou nezávisle vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl. heteroalkyl, substituovaný heteroalkyl, heteroaryl, substituovaný heteroaryl, heteroarylalkyl nebo substituovaný heteroarylalkyl nebo případné R3 a R6, R6 a R7, R7 a R3, spolu s atomy, ke kterým jsou připojeny, tvoří cykioheteroalkylový nebo substituovaný cykioheteroalkylový knih;
b je 0, 1, nebo 2.
[00609| Podle ještě dalšího aspektu vynález poskytuje sloučeninu mající strukturu:
288
nebo její sul, hydrát, solvát nebo N-oxid.
|00610| Podle ještě dalšího aspektu vynález poskytuje sloučeninu mající strukturu:
nebo její sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid, |00611| Podle ještě jiných provedení vynález poskytuje sloučeniny mající strukturu:
nebo jejich sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid.
[00612| Podle souvisejícího aspektu je poskytnuta sloučenina dle vzorce (IV):
289
G----R21
Ar4—W-Ar5—N \
R20 (IV) nebo její sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid, kde:
Ar4 a Ar5 jsou nezávisle pěti- nebo šestičlenný arylu nebo heteroarylový kruh;
W je vybrán ze skupiny sestávající z CR6R7, C=O, OS; C=NOR6; O, NR6, S, SO, SO2 a (CH2)n;
n je 0, 1,2, nebo 3;
G je vybrán ze skupiny sestávající z CR6R7, C=O, C=S, ONOR” a S(O)bi
R° je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, arylalkenylu, heteroarylalkenylu, arylalkylu, heteroarylalkylu, arylu, heteroarylu, alkylu, alkoxy-alkylu, alkenylu, cykloalkylu, cykloalkenylu a substituovaných derivátů;
R_i je vybrán ze skupiny sestávající z arylalkenylu, heteroarylalkenylu, arylalkylu, heteroarylalkylu, arylu, heteroarylu, alkylu, alkoxy-alkylu, alkenylu, cykloalkylu, cykloalkenylu a substituovaných derivátů;
R6 a R7 jsou nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu nebo substituovaného heteroarylalkylu nebo alternativně R6 a R7, spolu s atomy, ke kterým jsou připojeny, tvoří cykloheteroalkylový nebo substituovaný cykloheteroalkylový kruh; a b je 0, 1, nebo 2.
|00613| Podle jiného aspektu je poskytnuta sloučenina dle strukturního vzorce (V):
290 / ^21
Ar4-(CH2)n-Ars—-N^
R35 (V) nebo její sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid, kde:
Ar' a Ar5 jsou nezávisle pěti- nebo šestičlenný arylu nebo heteroarylový kruh; n je 0, 1,2, nebo 3;
R21 je vybrán ze skupiny sestávající z arylalkenylu, heteroarylalkenylu, arylalkylu, hereoarylalkylu, arylu, heteroarylu, alkylu, alkoxy-alkylu, alkenylu, cykloalkylu, cykloalkenylu a substituovaných derivátů;
je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu a substituovaného alkylu.
100614] Podle ještě dalších provedení vynález poskytuje sloučeninu dle strukturního vzorce (VI)
(VI} nebo jejich sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid, kde
Rj0 Je vybrán ze skupiny sestávající z arylalkenylu, heteroarylalkenylu, arylalkylu, hereoarylalkylu, arylu, heteroarylu, alkylu, alkoxy-alkylu, alkenylu, cykloalkylu, cykloalkenylu a substituovaných derivátů;
R. je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu a substituovaného alkylu.
100615] Podle ještě dalších provedení vynález poskytuje sloučeniny mající strukturu:
291
nebo jejich sůl, solvát nebo N-oxid, kde každý R je nezávisle Cl, MeO, CN, EtO, OH, Me, -SO3Me, F, nebo H a n je 0,1, 2, 3 nebo 4.
[00616] Podle ještě dalších provedení vynález poskytuje sloučeniny mající strukturu:
nebo jejich sůl, solvát nebo N-oxid, kde každý R je nezávisle MeO nebo OH, a n je 0,1, 2, 3 nebo 4.
100617] Podle ještě dalších provedení vynález poskytuje sloučeniny mající strukturu:
292
nebo jejich sůl, solvát nebo N-oxid,
kde R je H, Me, Et, OCOMe, CH:OH, OMe nebo Ph,
[006181 Podle ještě dalších provedení vynález poskytuje sloučeniny mající strukturu:
nebo jejich sul, solvát nebo N-oxid.
|(J0619| Podle ještě dalších provedeni vynález poskytuje sloučeniny mající strukturu:
293
nebo jejich sůl, solvát nebo N-oxid.
[006201 Podle ještě dalších provedeni vynález poskytuje sloučeniny mající strukturu:
nebo jejich sůl, solvát nebo N-oxid.
294
[006211 V ještě dalších provedeních vynález poskytuje sloučeniny mající strukturu:
[00622| Vjednom aspektu vynález poskytuje sloučeninu dle vzorce:
θι z R3«
Ar6—Alk—Ar7—N R37
R« nebo jejich sůl, sol vát, N-oxid nebo proléčivo, kde Ar6 a Ar7 jsou stejné nebo na sobě vzájemně nezávislé a pěti- nebo šestičlenná skupina nebo pěti- nebo šestičlenná heteroarylová skupina;
alk je alkylová skupina, případně přerušená heteroatomem;
a R37 jsou stejné nebo na sobě vzájemně nezávislé, H, alkyl, nebo, R36 a R37, spolu s atomy, ke kterým jsou připojeny, tvoři případně substituovaný pěti- nebo Šestičlenný heterocyklus; a
Rjs je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkyialkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, nebo halogenalkyl.
[006231 Podle jednoho aspektu sloučeniny podle vynálezu obsahují pětičlenný heterocyklus. V jednom provedení je pétičlenným heterocyklem hydantoin nebo substituovaná nebo nesubstituovaná cyklická močovina
100624| Podle jednoho provedení je hydantoinem hydantoin dle vzorce:
295
O
XZ3‘
Ars-Alk-Ar7—N i „
O R39 nebo jeho sůl, hydrát, solvát, N-oxid nebo proléčivo, kde A? a Ar7 jsou stejné nebo různé vzájemně na sobě nezávislé pěti- nebo šestičlenné arylové skupiny nebo pěti- nebo šestičlenná heteroarylová skupina;
Alk je alkylová skupina, případně přerušená heteroatomem;
je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, nebo halogenalkyl; a
Rw a R40 jsou stejné nebo různé vzájemně na sobě nezávislý H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, halogenalkyi, nebo Rií a R^ spolu s uhlíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří C=O skupinu nebo substituovanou nebo nesubstituovanou alkenylovou skupinu.
[00625] Podle jiného aspektu sloučeniny podle vynalezu obsahují pětičlenný heterocyldus, kterým je urazoi. V jednom provedení je urazolem tirazol dle vzorce:
O
ΧΥ33
Ar6—AI k—Ar7—-N I o
nebo jeho súl, hydrát, solvát, N-oxid nebo proléčivo,
296 kde Ar a Ar7 jsou stejné nebo různé vzájemné na sobě nezávislé pěti- nebo šestičlenná arylová skupina nebo pěti- nebo šestičlenná heteroarylová skupina;
Alk je alkylová skupina, případně přerušená heteroatomem;
Rss je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryí, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, nebo halogenalkyl; a je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkylanudoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryí, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl nebo halogenalkyl.
[006261 Podle jiného aspektu sloučeniny podle vynálezu obsahují šestičlenný heterocyklus. V jednom provedení je šestičlenným heterocyklem šestičlenný heterocyklus dle vzorce:
KM
R
Ars—Alk—Arr—N 42 R« R«R« nebo jeho sul, hydrát, solvát. N-oxide nebo proléčivo, kde Ri8 je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryí, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, nebo haiogenaikylu; a
297
Rj?, R43, Ru, R45 a R46 jsou stejné nebo nižné vzájemné na sobě nezávislý H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný eykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, nebo R42 a R43, nebo R45 a R^, spolu s uhlíkovými atomy, ke kterým je každý připojen, tvoři OO skupinu.
100627] Podle ještě jiného aspektu se vynález týká sloučeniny dle vzorce:
R47
R3fl R37 nebo její soli, hydrátu, solvátu, N-oxidu nebo proléčíva, kde Alk je alkylová skupina, případně přerušená heteroatomem;
M1 je N nebo CR40, kde R49 je H nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
M je N nebo CR50, kde R50 je H nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
a R37 jsou stejné nebo různé vzájemně na sobě nezávislý H, alkylu nebo R76 a R,7j spolu s atomy, ke kterým jsou připojeny, tvoří případně substituovaný pěti- nebo šestičlenný heterocyklus; a
Rix je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný eykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, nebo halogenalkyl;
R47 je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, nebo halogen; a je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl nebo halogen.
[00628| Podle ještě jiného aspektu se vynález týká sloučeniny dle vzorce:
298
nebo její soli, hydrátu, solvátu, N-oxidu nebo proléčiva, kde Alk je alkylová skupina případné přerušená heteroatomem;
T, je C=O a Qje CR5iRS2 nebo NRSI, kde R5, a R52 jsou stejné nebo různé vzájemné na sobě nezávislé H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylaíkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylaraidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkylarnidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, halogenalkyl, nebo R51 a Rí2j spolu s uhlíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří C=O skupinu nebo substituovanou nebo ncsubstituovanou alkenylovou skupinu;
M je N nebo CR49, kde R49 je H nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
M je N nebo CR®, kde R50 je H nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
R3S je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylaíkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, nebo halogenalkyl;
R47 je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl nebo halogen; a
299
Ras je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl nebo halogen.
j00629| Podle ještě j iného aspektu se vynález týká sloučeniny dle vzorce:
OH
300
301
302
nebo její soli, hydrátu, solvátu, N-oxidu nebo proiéčiva.
[00630] Podle ještě dalšího aspektu se vynález týká sloučeniny dle vzorce:
303
nebo její soli, hydrátu, solvátu, N-oxidu nebo proiéčiva.
|00631| Podle ještě jiného aspektu se vynález týká způsobu přípravy sloučeniny dle vzorce:
r58
nebo její soli, hydrátu, solvátu, N-oxidu nebo proiéčiva, kde Alk je alkylová skupina, případně přerušená heteroatomem; Γ? je C=S, C=O, nebo S(O)i;
304 Rsj je substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkýl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, nebo substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl;
M je N nebo CR54, kde R54 je H nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
M je N nebo CR55, kde R55 je H nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, nebo halogen; a
R57 je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl nebo halogen;
kde způsob zahrnuje reakci sloučeniny dle vzorce:
^56
Rw kde Rjů, R57 a Alk jsou definovány výše a J je odstupující skupina;
se sloučeninou dle vzorce:
HNNo t M2 kde M1 a xM2 jsou definovány výše, což dá sloučeninu dle vzorce Rs* o\y 2 / m^xNOi rS7 mající NO? skupinu;
redukce NO? skupiny za vzniku sloučeniny mající NH? skupinu; a reakci sloučeniny mající NH? skupinu se sloučeninou dle vzorce
Jj kde J? je odstupující skupina a T? a RSJ jsou definovány výše.
100632 J Podle ještě jiného aspektu se vynález tyká způsobu výroby sloučeniny dle vzorce:
304
R?i je substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, nebo substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl;
M1 je N nebo CR54, kde R54 je H nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
M2 je N nebo CR55, kde R55 je H nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
R56 je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, nebo halogen; a
R57 je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl nebo halogen;
kde způsob zahrnuje reakci sloučeniny dle vzorce:
RS6 oV^-Alk / Λ J
N^/ RS7 kde R56, R57 a Alk jsou definovány výše a J je odstupující skupina;
se sloučeninou dle vzorce:
kde M1 a M2 jsou definovány výše, což dá sloučeninu dle vzorce Rw
mající NO2 skupinu;
redukce NO2 skupiny za vzniku sloučeniny mající NH2 skupinu; a reakci sloučeniny mající NH2 skupinu se sloučeninou dle vzorce
Jj R53 kde Ji je odstupující skupina a T2 a R^j jsou definovány výše.
(006321 Podle ještě j ineho aspektu se vynález týká způsobu výroby sloučeniny dle vzorce:
305
nebo její soli, hydrátu, solvátu, N-oxidu nebo proléčiva, kde Alk je alkylová skupina, případně přerušená heteroatometn;
Rsi a R52 jsou stejné nebo různé navzájem na sobě nezávislé, H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, halogenalkyl, nebo ríi a R53, spolu s uhlíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří substituované nebo nesubstituované aíkenylové skupiny;
M1 je N nebo CR49, kde R49 je H nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
M2 je N nebo CR50, kde R50je H nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
R38 je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl nebo halogenalkyl;
R47 je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl nebo halogen; a
R4« je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl nebo halogen;
306 kde způsob zahrnuje zahřátí sloučeniny dle vzorce:
«47
O kde R47, RigjAlk, M‘ a M2jsou definovány výše;
aby se přeměnila -CON3 skupina na -N=C=O skupinu a pak reagovala se sloučeninou dle vzorce:
kde J3 je odstupující skupina a R38) R5l a Rj2 jsou definovány výše.
[006331 Podle ještě jiného aspektu se vynález týká výroby sloučeniny dle vzorce:
R47
nebo její soli, hydrátu, solvátu, N-oxidu nebo proléčiva, kde Alk je alkylová skupina, případné přerušená heteroatomem;
R52 je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloaikylalkyl. substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl. substituovaný nebo nesubstituovaný arylaikylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaiylalkylamrdoaikyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl. substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, halogenalkyl;
M1 je N nebo CR4o. kde Rj, je H nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
M^je N nebo CR,ň, kde Ríň je H nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
307
R-38 je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl nebo halogenalkyl;
R47 je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl nebo halogen; a
Ras je H, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl nebo halogen;
kde způsob zahrnuje sloučeninu dle vzorce:
*47
O kde R47, R^.Alk, M1 a jsou definovány výše;
aby se přeměnila -CON3 skupina na -N=00 skupinu a pak reagovala s hydrazinem dle vzorce:
z *38
HN
I h2n kde Rj8 je definován výše.
|00634| Podle ještě jiného aspeku se vynález týká způsobu výroby sloučeniny dle vzorce:
O
Ho4 CH2— Ar2— (R2’)n \ 0 O /
I \ / (RY—ArL S—
CH2--Ar3_(R3·^ (III) nebo její soli, hydrátu, solvátu nebo N-oxidu, kde:
308
Ar, Ar a Ar3 jsou nezávisle pěti- nebo šestičlenné aryly, heteroaryly nebo cykloalkylový kruh a Ar a Ar3 mohou být případně vynechány;
mje 0, 1. 2 nebo 3;
n a p jsou nezávisle 0, l, 2, 3 nebo 4;
každý R1' je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO,, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO,R6, NR6CO,R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7Rs, NR6C(=NH)NRX so2nr5r6, nr3so3r6, NR5S02NR6R7, B(OR5)(OR6), PÍOKO^XOR6) a P(0)(R5)(0R6);
každý R je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaných alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaných heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO,, ORS, S(O)bR6, NR6R7, CONRĎR7, CO,R6, NR6CO,R7, NR6CONR7RS, NR6CSNR7R8. NR^NHjNRV, SO2NR5R6, NR5SO< NRsSO,NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(ORi)(ORó)a P(O)(R5)(OR6);
každý R3' je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkyl, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR'R7, CO+R6. NR^CO+R7, NRhCONR7Ra, NR’CSNR^, NR6C(=NH)NR7R*, SO,NR5R6, NR5SO< NR3SO,NR6R7, B(OR’)(OR6), P(O)(OR5)(OR6) a P(O)(R5)(OR6);
R;’R* jsou nezávisle vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heteroalkyl, substituovaný heteroalkyl, heteroaryl, substituovaný heteroaryl, heteroarylalkyl nebo substituovaný heteroarylalkyl nebo případně R a R, R a R. spolu s atomy, ke kterým jsou připojeny, tvoří cykloheteroalkylový nebo substituovaných cykloheteroalkylový kruh;
b je 0, 1, nebo 2;
kde způsob zahrnuje sloučeninu dle vzorce;
309
O ho-4 \ on j
kde J je odstupující skupina;
se sloučeninou dle vzorce:
^-Ar2—(R*)n
H2N za vzniku produktu; a reakce produktu sc sloučeninou dle vzorce:
CH2--Ar3_(R3.)p kde J je odstupující skupina.
310
SEKVENCE CHIMÉRNÍHO G PROTEINU A hT2R GENŮ A POLYPEPTIDŮ |00635| Sekvence proteinu Rhodopsin tag: (SEQ ID NO: I) mngtegpnfyvpfsnktgvvrspfeapqyylaepw
1006361 Sekvence proteinu G16gust44: (SEQ ID NO:2) marsltwrccpwcltedekaaarvdqeinrilleqkkqdrgelkllllgpgesgkst FIKQMR1IHGAGYSEEERKGFRPLVYQN1FVSMRAMIEAMERLQ1PFSRPESKHHASLV MSQDPYKVTTFEKRYAAAMQWLWRDAGIRACYERRREFHLLDSAVYYLSHLERITE EGYVPTAQDVLRSRMPTTG1NEYCFSVQKTNLR1VDVGGQKSERKKWIHCFENP0MO CÍL1YLASLSEYDQCLEENNQENRMKESLALFGTILELPWFKSTSVILFLNKTDILEEKI PTSHLATYFPSFQGPKQDAEAAKRFILDMYTRMYTGCVDGPEGSNLKKEDKEIYSHM TCATDTQNVKFVFDAVTDIIIKENLKDCGLF
[00637] hT2R8 sekvence:
DNA-(SEQ (O NO3)
ATGTTCAGTCCTGCAGATAACATCTTTATAATCCTAATAACTGGAGAATTCATACT AGGAATATTGGGGAATGGATACAT rGCACTAGTCAACTGGATTGACTGGATTAAGAAGAAAAAGATTTCCACAGTTGAC TACATCCTTACCAATTTAGTTATCG
CCAGAATTTGTTTGATCAGTGTAATGGTTGTAAATGGCATTGTAATAGTACTGAA CCCAGATGTTTATACAAAAAATAAA
CAACAGATAGTCATTTTTACCTTCTGGACATTTGCCAACTACTTAAATATGTGGAT
T ACCACCTGCCTTAATGTCTTCTA
TTTTCTGAAGATAGCCAGTTCCTCTCATCCACTTTTTCTCTGGCTGAAGTGGAAAA TTGATATGGTGGTGCACTGGATCC
FGCTGGG A FGCTTTGCC ATTTCCTTGTTGGTC AGCCTT AT AGCAGC A AT AGTACTG AGTTGTGATTATAGGTTTCATGCA
ATTGCC;\AACATz\AAAGAAACATTACTGAAATGTTCCATGTGAGTAA.AATACCAT ACTTTGAACCCTTaACTCTCTTTAA
CCTGTTTGCAATTGTCCCATTTATTGTGTCACTGATATCATTTTTCCTTTTAGTAAG ATCTTTATGGAGACATACCAAGC
AAA rAAAACTCTATGCTACCGGCAGTAGAGACCCCAGCACAGAAGTTCATGTGA GAGCCATTAAAACTATGACTTCATTT
311
Λ rCTTCTTTTTTTTCCTATACTATATTTCTTCTATTTTGATGACCTTTAGCTATCTTA
TGACAAAATACAAGTTAGCTGT
GGAGTTTGGAGAGATTGCAGCAATTCTCTACCCCTTGGGTCACTCACTTATTTTAA
TTGTTTTAAATAATAAACTGAGGC
AGACATTTGTCAGAATGCTGACATGTAGAAAAATTGCCTGCATGATATGA
Protein-(SEQ ID N0:4)
MfSPADNIFlILITGEFILGILGNGYlALVNWlDWlKKKKISTVDYlLTNLPOMOCÍRlCLI
SVMVVNGIVIVLNPDVYTKNK
QQIVIFTFWTFANYLNMWITTCLNVFYFLKIASSSHPLFLWLKWKIDMWHWILLGCF
A1SLLVSLIAA1VLSCDYRFHA
1AKHKRN1TEMFHVSK1PYFEPLTLFNLFAIVPFIVSL1SFFLLVRSLWRHTKQIKLYATG
SRDPSTEVHVRAIKTMTSF
IFFFFLYYISS1LMTFSYLMTKYKLAVEFGEIAAILYPLGHSLIL1VLNNKLRQTFVRML
TCRK1ACMI |00638| hT2R 14 sekvence:
dna-<seq 1D NO:5)
ATGGGTGGTGTCATAAAGAGCATATTTACATTCGTTTTAATTGTGGAATTTATAAT
TGGAAATTTAGGAAATAGTTTCAT
AGCACTGGTGAACTGTATTGACTGGGTCAAGGGAAGAAAGATCTCTTCGGTTGAT
CGGATCCTCACTGCTTTGGCAATCT
CTCG AATT AGCCT GGTTTGGTT AAT ATT CGGAAGCTGGTGTGTGTCTGTGTTTTTC
CCAGCTTTATTTGCCACTGAAAAA
ATGTTCAGAATGCTTACTAATATCTGGACAGTGATCAATCATTTTAGTGTCTGGTT
AGCTACAGGCCTCGGTACTTTTTA
TTTTCTCAAGATAGCCAATTTTTCTAACTCTATTTTTCTCTACCTAAAGTGGAGaGT
TAAAAAGGTGGTTTTGGTGCTGC
TTCTTGTGACTTCGGTCTTCTTGTTTTTAAATA TTGC ACTGATA AACA TCCATATA
AATGCCAGTATCAATGGATACAGA
AGAAACAAGACTTGCAGTTCTGATTCAAGTAACTTTACACGATTTTCCAGTCTTAT
TGTATTAACCAGCACTGTGTTCAT
TTTCATACCCTTTACTTTGTCCCTGGCAATGTTTCTTCTCCTCA TCTTCTCCATGTG
GAAACATCGCAAGAAGATGCAGC
312
ACACTGTCAAAATATCCGGAGACGCCAGCACCAAAGCCCACAGAGGAGTTAAAA GTGTGATCACTTTCTTCCTACTCTAT
GCCATTTTCTCTCTGTCTTTTTTCATATCAGTTrGGACCTCTGAAAGGTTGGAGGA
AAATCTAATTATTCTTTCCCAGGT
GATGGGAATGGCTTATCCTTCATGTCACTCATGTGTTCTGATTCTTGGAAACAAGA AGCTGAGACAGGCCTCTCTGTCAG rGCTACTGTGGCTGAGGTACATGTFCAAAGATGGGGAGCCCTCAGGTCACAAAGA ATTTAGAGAATCATCTTGA
Protein-(SEQ ID N0:6)
MGGV1KSIFTFVL1VEFIIGNLGNSFIALVNCÍDWVKGRKISSVDRILTALA1SRISLVWL1 FGSWCVSVFFPALFATEK
MFRMLTN1WTVINHFSVWLATGLGTFYFLKIANFSNS1FLYLKWRVKKVVLVLLLVT
SVFLFLNIALIN1HINPŘIBLIŽNÉNGYR
RNKTCSSDSSNFTRFSSL1VLTSTVFIFIPFTLSLAMFLLL1FSMWKHRXKMQHTVKJSG DASTKAHRGV KSVITFFLL Y
AIFSLSFFISVWTSERLEENL11LSQVMGMAYPSCHSCVLILGNKKLRQASLSVLLWLR YMFKDGEPSGHKEFRESS
313 |00639| Zatímco bylo v předchozím popisu podrobně vysvětleno několik provedení vynálezu, má se za to, že popis výše je pouze ilustrativní a neomezuje popsaný vynález. Vynález je vymezen patentovými nároky, které následují.

Claims (171)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Test pro identifikaci sloučeniny, která údajně moduluje hořkou chuť spojenou s kávou a/nebo potravinami, nápoji a/nebo léčivy s příchutí kávy, zahrnující provedení rozboru, který vyhledává sloučeninu, která moduluje lidský T2R receptor hořké chuti vybraný z I1T2R8 a/nebo hT2R14 nebo která moduluje aktivaci lidského hT2R8 a/nebo hT2R14 jinou hořkou sloučeninou nebo kompozici obsahující hořkou sloučeninu,
  2. 2. Test podle nároku 1, kde hořká sloučenina je obsažena v extraktu pocházejícím z kávy,
  3. 3. Test podle nároku 1, kde receptor má polypeptidovou sekvenci, která je alespoň z 90 % identická s hT2R8 polypeptidem v SEKV ID Č.: 4 neboje kódována sekvencí nukleové kyseliny, která hybridizuje se sekvencí nukleové kyseliny SEKV ID Č.:3 za stringentních podmínek.
  4. 4. Test podle nároku 1, kde receptor má polypeptidovou sekvenci, kteráje alespoň z 90 % identická s hT2R14 polypeptidem v SEKV ID Č.: 6 nebo je kódována sekvencí nukleové kyseliny, která hybridizuje za stringentních hybridizačních podmínek se sekvencí nukleové kyseliny SEKV ID Č.:5 za stringentních hybridizačních podmínek.
  5. 5. Test podle nároku 1, 2, nebo 3, kde účinnost blokování hořkosti identifikované sloučeniny je potvrzena chuťovým testem.
  6. 6. Test podle nároku 5, kde chuťový test potvrdí, zda identifikovaná sloučenina blokuje nebo inhibuje hořkou chuť vyvolanou sloučeninou pocházející z kávy nebo kompozicí obsahující tuto sloučeninu.
  7. 7. lest podle nároku 6, kde káva zahrnuje instantní kávu, mletou kávu, vařenou kávu nebo sloučeninu nebo extrakt z nich pocházející.
  8. 8. Test podle nároku 1, kde chuťový receptor je exprimován na buněčné membráně.
  9. 9. Test podle nároku 1. kde chuťový receptor je exprimován na izolované buněčné membráně.
  10. 10. Test podle nároku 1, kde chuťový receptor je exprimován na intaktní buňce.
    II. Test podle nároku 1, kde chuťový receptor je exprimován na eukaryotické buňce.
    315
  11. 12. Test podle nároku 1, kde chuťový receptor je exprimován buňkou obojživelníka, savce nebo hmyzu.
  12. 13. Test podle nároku 1, kde chuťový receptor je exprimován na buňce vybrané z HEK293, BUK, COS, HEK293T, CHO a oocytu z Xenopus.
  13. 14. Test podle nároku 1. kterým je lluorimetncký test.
  14. 15. Test podle nároku 1, kterým je vazební test.
  15. 16. Test podle nároku 1, který detekuje účinek sloučeniny testováním jejího působení na intracelulámí koncentraci iontů.
  16. 17. Test podle nároku 1, který detekuje účinek sloučeniny na intracelulámí sodík nebo vápník.
  17. 18. Test podle nároku 1, který detekuje účinek sloučeniny na membránový potenciál buňky.
    19, Test podle nároku 1, který detekuje účinek sloučeniny na transkripci reportérového genu.
  18. 20. Test podle nároku 1, kde sloučenina je zvolena na základě její schopnosti blokovat interakci chuťového receptoru s jedním z hořkých ligandů.
  19. 21. Test podle nároku 1, který detekuje účinek sloučeniny na intracelulámí cAMP, cGMP nebo IP3.
    z2. Test podle nároku 1, kde chutový receptor obsahuje extraceluiámí doménu nebo transmembránovou oblast chuťového receptem.
  20. 23. Test podle nároku 1, který detekuje změny vápníku za použití kalcium-specifického fluorescenčního barviva.
  21. 24. Test podle nároku 1, který detekuje změny intracelulámiho vápníku za použití barviva vybraného z Fluo-3, Fluo-4 a Fura-2.
  22. 25. Test podle nároku 1, kde chuťový receptor je v roztoku.
    316 .6. Test podle nároku i, kterým je vazební test, který detekuje změny spektroskopických vlastností, hydrodynamických vlastnosti nebo rozpustnosti,
  23. 27. Test podle nároku 1, který detekuje účinek sloučeniny na tvorbu komplexu chuťového receptoru s G proteinem.
  24. 28. Test podle nároku 1, který detekuje účinek sloučeniny na tvorbu komplexu chuťového receptoru s G proteinem vybraným z transducinu, gustducinu, GH|5, G„lh. nebo chiméry z nich.
  25. 29. Test podle nároku 1, kterým je fluorescenční polarizační test.
  26. 30. Test podle nároku 1, kde chuťový receptor je navázán na substrát pevné fáze.
  27. 31. Test podle nároku 1, kterým je vysoce výkonný (HT) test.
  28. 32. Test podle nároku 1, kde chuťový receptor je exprimován buňkou HEK293.
  29. 33. Sloučenina vybraná ze sloučenin majících následující struktury:
    vX i/Y H π Sloučenina A Sloučenina B 1C3I) = 0,3 uM (hT2R08) 1C.„ = 0,4 uM (hT2R08)
  30. 34. Sloučenina strukturního vzorce 1 níže : X (R'X,—Ar1-R1—/ • 0 O.+ .OH 'm u Sloučenina C ICs(1 = 0,2 uM(hT2R14) A / B nebo její sul, hydrát, solvát nebo N-oxid, kde:
    Ar1 je pěti- nebo šestičlenný arylový, heteroarylový nebo cykloalkylový kruh;
    317 mje O, 1, 2 nebo 3;
    R1 je SO?; C=O; C=S; nebo ONOR4;
    X je vybráno ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONRftR7, CO2R6, NR6CO,R7, NR6CONR7R3, NRYlSNR7^, NR6C(=NH)NR7Rs, so2nr5r6, nr5so2r6. nr5so2nr6r7, B(OR5)(OR6), PíOKOR^OR6) a PfOXR’yOR6);
    každý R1' je nezávisle zvolen ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2Rb, NR6CO2R7, NR^CONR7^, NR6CSNR7Ra, NR6C(=NH)NR7R8, so2nr5r6, nr5so2r6, NR^SOjNR^7, BÍOR^OR6), P(O)(OR5)(OR6) a P(O)(RS)(OR6);
    nebo alternativně X a/nebo alespoň jeden R1' spolu s atomy, k nimž jsou navázány, tvoří arylový, substituovaný arylový, heteroarylový, substituovaný heteroarylový, cykloalkylový, substituovaný cykloalkylový, cykloheteroalkylový nebo substituovaný cykloheteroalkylový kruh, kde kruh je případně kondenzovaný s jiným arylovým, substituovaným arylovým, heteroarylovým, substituovaným heteroarylovým, cykloalkylovým, substituovaným cykloalkylovým, cykloheteroalkylovým nebo substituovaným cykloheteroalkylovým kruhem;
    R+-R4 jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu a substituovaného heteroary lalkylu nebo alternativně R5 a R°. Rb a R7, R a R', spolu s atomy, na něž jsou vázány, tvoří cykloheteroalkylový nebo substituovaný cykloheteroalkylový kruh;
    318
    A a B jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, atylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu. heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu; a bjeO, 1 nebo 2.
  31. 35. Sloučenina strukturního vzorce II znázorněného níže:
    X ^CHz)r-Y—Ar2—(Rz')n (R'%—Ar'-R’—ΐϊ (CH2)t“Z—Ar3—(R3')p (II) nebo její sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid, kde:
    Ar1, Ar2 a Ar’ jsou nezávisle pěti- nebo šestičlenný arylový, heteroarylový nebo cykloalkylový kruh;
    m je 0, 1, 2 nebo 3;
    n a p jsou nezávisle 0, 1, 2, 3 nebo 4;
    r a t jsou nezávisle 0,1 nebo 2;
    Y a Z jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z CRÓR7, C=O, OS, ONORft O NR6aS(O)b;
    R1 je vybrán ze skupiny sestávající z SO2, OO. OS a ONOR4;
    X je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO, -OR6, S(O)bR6, NR6r\ CONR6R7, CO2Rft, NR6COR7, NR^CONR7^, nr6csnr7r\ NR^NHJNR^, SO:NR’R6, NRsSO2R6, NR’SOiNR^7, B(OR5)(OR6). PfOXO^XOR6) a PIOXR’XOR6);
    319 každý R1' je nezávisle zvolen ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO?, OR6, S(0)hR6, NR6R7, CONR6R7, CO+R6, NR6CO+R7, NR6CONR7RS, NR^CSN^R8, NR6C(=NH)NR7RS, SO2NR5RÓ, NR3SoA NR’SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6) a P(O)(R5)(OR6);
    každý R-' je nezávisle zvolen ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroatylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO2, OR6, S(OU6, NR6R7, CONRÓR7, CO?R6, NRYOtR7, NR”CONR7R8, NR6CSNR7Rs, NR6ONH)NR’rk, so2nr5r6, nr5so2r6, NR5S02NR6R7, B(OR5)(OR6) a P(O)(OR3)(OR°);
    každý R1' je nezávisle zvolen ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR*R7, CO2RŮ, NR6CO+R7, NR6CONR7RS, NR6CSNR7Rs, NR6C(=NH)NR7RS, SO2NR5R6, nr-Wr, NR5SO2NR6R7, B(OR3)(OR6), P(O)(OR5)(OR6)aP(OHR5)(OR6);
    nebo alternativně, X a/nebo alespoň jeden R1’ spolu s atomy, na něž jsou vázány, tvoří arylový, substituovaný arylový, heteroarylovv, substituovaný heteroarylový, cykloalkylový, substituovaný cykloalkylový, cykloheteroalkylový nebo substituovaný cykloheteroalkylový kruh, který je případné zkondenzovaný s dalším arylovým, substituovaným arylovým, heteroary levým, substituovaným heteroarylovým, cykloalkylovým, substituovaným cykloalkylovým, cykloheteroalkylovým nebo substituovaným cykloheteroalkylovým kruhem;
    RÍR< jsou nezávisle vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heteroalkyl, substituovaný heteroalkyl, heteroaryl, substituovaný heteroaryl, heteroarylalkyl nebo substituovaný heteroarylalkyl nebo
    320 alternativně R a R , R6 a R', R7 a R1, spolu s atomy, na něž jsou vázány, tvoři cykioheteroalkylový nebo substituovaný cykloheteroalkylový kruh;
    b je 0, 1 nebo 2.
  32. 36. Sloučenina podle nároku 35, kde X je vybráno ze skupiny sestávající z vodíku, heteroalkylu. substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, S(O)bR6, CONR6R7 -COiR6 SO2NR5R6, NR’SOY NICSO>NR6R7, BiOR’XOR6), P(O)(OR5)(OR6) a P(O)(R5)(OR6).
  33. 37. Sloučenina strukturního vzorce 111 níže:
    O
    Ho4 CHj— Ar2—(R2')n \ q0 / (R’%-Ar’-'s— CH2---Ar3_(R3-yp (HD nebo její sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid, kde:
    Ar1, Ar2 a ArJ jsou nezávisle pěti- nebo šestičlenný ary lovy, heteroary lový nebo cykloal kýlový kruh a Ar a Ar3 mohou být případně vynechány;
    m je 0, 1,2 nebo 3;
    ti a p jsou nezávisle 0, 1, 2, 3 nebo 4;
    každý R1’ je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu. substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO2, OR6, S(O)hR6, XW, CONR6R7, CO2R6, NR^CO^R7, NRhC0NR?R\ NR6CSNR7R\ \'R6C>NH)NRY SOtNRY nr\soY NR-^NRY B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(ORó) a P(O)(R3)(OR6);
    každý R-' je nezávisle zvolen ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu. substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného
    321 aryialkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, ON, N02, OR6, SfO)^6, NR6R7, CONR6R?, CO2Rň, NR6CO,R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7Rs, SO2NR5R6. nr5so+r6, n^SO2NR6R7, B(OR')(OR6), P(O)(OR5)(OR6) a PiOMR’XOR6);
    každý RJ' je nezávisle zvolen ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO?, OR6, 8(())1. NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO+R7, NRhCONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO+N^R6, ’ NR’SO,R6, NR5SO2NR6R7, B(ORS)(OR6), P(O)(OR5)(ORó) a P(O)(R3)(OR6);
    R5R8 jsou nezávisle vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heteroalkyl, substituovaný heteroalkyl, heteroaryl’ substituovaný heteroaryl, heteroarylalkyl nebo substituovaný heteroarylaiky 1 nebo alternativně R3 a R6, R6 a R7, R7 a spolu saton^ na něž jsf>u cykloheteroalkylový nebo substituovaný cykloheteroalkylový kruh;
    b je 0, 1 nebo 2.
  34. 38. Sloučenina mající následující strukturu:
    322 nebo její sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid.
  35. 39. Sloučenina mající následující strukturu:
    nebo její sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid.
  36. 40. Sloučenina mající následující strukturu:
    nebo její sůl, hydrát, solvát nebo N-o.xid.
  37. 41. Sloučenina strukturního vzorce IV níže:
    323
    G----R21 /
    Ar4—W-Ar5—N R20 (IV) nebo její sůl, hydrát, sol vát nebo N-oxid, kde:
    Ar a Ar5 jsou nezávisle pěti- nebo šestičlenný arylový nebo heteroarylový kruh;
    W je vybrán ze skupiny sestávající z CR6R7, C-O, C=S; ONOR6; O, NR6, S, SO, SO, a(CHa)n;
    n je 0, l, 2 nebo 3;
    O je vybrán ze skupiny sestávající z CRĎR7, C=O, C=S, C=NOR6 a S(O)b;
    R-° je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, arylalkenylu, heteroarylalkenylu, arylalkylu, heteroarylalkylu, arylu, heteroarylu, alkylu, alkoxy-alkylu, alkenylu, cykloalkylu, cykloalkenylu a substituovaných derivátů;
    R-1 je vybrán ze skupiny sestávající z arylalkenylu, heteroarylalkenylu, arylalkylu, heteroarylalkylu, arylu, heteroarylu, alkylu, alkoxy-alkylu, alkenylu, cykloalkylu, cykloalkenylu a substituovaných derivátů;
    R6 a R7 jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu nebo substituovaného heteroarylalkylu nebo alternativně Ró a R7, R7 a R, spolu s atomy, na něž jsou navázány, tvoří cykloheteroalkylový nebo substituovaný cyklohcteroalkylový kruh; a bje 0, 1 nebo 2.
  38. 42. Sloučenina strukturního vzorce V mže:
    324
    A
    AČ-ICHjJn-Ar5—N (V) nebo její sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid, kde:
    Ar4 a Ar5 jsou nezávisle pěti- nebo šestičlenný arylový nebo heteroarylový kruh;
    nje 0, 1, 2 nebo 3;
    R-1 je vybrán ze skupiny sestávající z arylalkenylu, heteroarylalkenylu, arylalkylu, hereoarylalkylu, arylu, heteroarylu, alkylu, alkoxy-alkylu, alkenylu, cykloalkylu, cykloalkenylu a substituovaných derivátů;
    R je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu a substituovaného alkylu.
  39. 43. Sloučenina strukturního vzorce VI níže:
    (VI) nebojejí sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid, kde:
    R30 je vybrán ze skupiny sestávající z arylalkenylu, heteroarylalkenylu, arylalkylu, hereoarylalkylu, arylu, heteroarylu, alkylu, alkoxy-alkylu, alkenylu, cykloalkylu, cykloalkenylu a substituovaných derivátů;
    RJ5 je vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, alkylu a substituovaného alkylu.
  40. 44. Sloučeniny mající následující strukturu:
    325
    nebojejich sul, hydrát, solvát nebo N-oxid, kde každý R je nezávisle Cl, MeO, CN, EtO, OH, Me, -SO, Me, F, H a nje 0,1,2,3 nebo 4.
  41. 45. Sloučenina mající následující strukturu:
    nebo její sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid, kde každý R je nezávisle MeO, OH, a nje 0,1,2,3 nebo 4.
    46, Sloučenina mající následující strukturu:
    326
    nebo její sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid, kde R je vybrán ze skupiny sestávající z H, Me, Et, OCOMe, CH2OH, OMe, a Ph.
  42. 47. Sloučenina mající následující strukturu:
    nebo její sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid.
    327
  43. 48. Sloučenina mající následující strukturu:
    nebojejí sul, hydrát, solvát nebo N-oxid.
  44. 49. Sloučenina mající následující strukturu:
    nebojejí sul, hydrát, solvát nebo N-oxid.
    328
  45. 50. Sloučenina mající následující strukturu :
    nebojejí sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid.
  46. 51. Způsob snížení nebo zeslabení hořké chuti zahrnující přidání sloučeniny podle nároku 34 nebo jejího analogu ke kompozici pro požití lidmi nebo zvířaty, kde má být snížena nebo zeslabena hořká chuť.
  47. 52. Způsob podle nároku 51, kde kompozicí je potravina, nápoj nebo léčivo.
  48. 53. Způsob podle nároku 51, kde kompozice obsahuje hořké sloučeniny, které aktivují jeden nebo více z hT2R3, 7, 10, 14, 16, 44, 51, 55, 61, 63, 65, 71 a/nebo hT2R5, 9, 13, 54, 67 a 75.
  49. 54. Způsob podle nároku 51, kde kompoztcc obsahuje alespoň jednu hořkou sloučeninu, která aktivuje četné receptory hořkosti nebo která má neurčitou specifícitu k receptoru hořkosti.
    55, Způsob podle nároku 51, kde kompozice obsahuje salicin nebo denvát.
  50. 56. Způsob podle nároku 51, kde kompozice obsahuje omeprazol nebo derivát.
    ?7. Způsob podle nároku 51, kde kompozice obsahuje rebaudiosid A nebo derivát.
  51. 58. Způsob podle nároku 51, kde kompozice obsahuje dextromethorťan.
  52. 59. Způsob podle nároku 51, kde kompozice obsahuje difenhydramin.
    329
  53. 60. Způsob podle nároku 51, kde kompozicí je potravina, nápoj nebo léčivo pro lidskou spotřebu.
  54. 61. Způsob zeslabení hořké chuti spojené s kávou nebo s potravinami, nápoji nebo léčivy s příchutí kávy, zahrnující přidám alespoň jedné sloučeniny podle jednoho z nároků 33 až 50.
  55. 62. Způsob podle nároku 61, kde káva nebo potravina, nápoj nebo léčivo s příchutí kávy obsahuje alespoň 2 sloučeniny, z nichž alespoň jedna je antagonistou hT2R8 a alespoň jednaje antagonistou hT2R14.
  56. 63. Způsob podle nároku 61, kde kávou je instantní káva nebo vařená káva.
  57. 64. Kompozice kávy nebo potraviny, nápoje nebo léčiva s příchutí kávy, která obsahuje alespoň jednu sloučeninu vybranou ze sloučenin podle jednoho z nároků 33 až 50.
  58. 65. Kompozice podle nároku 64, která obsahuje alespoň 2 sloučeniny, z nichž alespoň jedna je antagonistou hT2R8 a alespoň jedna je antagonistou hT2R14,
  59. 66. Kompozice podle nároku 65, kde kávou je instantní káva, mletá káva nebo vařená káva.
  60. 67. Kompozice podle nároku 65, kterou je instantní káva.
  61. 68. Kompozice potraviny nebo nápoje nebo léčiva, která obsahuje alespoň jednu sloučeninu vybranou ze sloučenin podle jednoho z nároků 33 až 50.
  62. 69. Kompozice potraviny nebo nápoje nebo léčiva, která obsahuje sloučeninu podle nároku 34.
  63. 70. Potravina, nápoj nebo léčivo podle nároku 68, která obsahuje alespoň 2 sloučeniny, z nichž alespoň jednaje antagonistou hT2R8 a alespoň jedna je antagonistou hT2RI4.
    330
  64. 71. Způsob detekce nebo kvantitativní analýzy hořké sloučeniny v kompozici, zahrnující: kontaktování kompozice obsahující lidský receptor hořké chuti, kterým je hT2R8, hT2R14, nebo oba, a detekci navázáni sloučeniny na receptor, kde toto navázání značí, že sloučenina přispívá k hořké chuti kompozice.
  65. 72. Způsob podle nároku 71, kde rozsah navázáni udává koncentraci sloučeniny v kompozici.
  66. 73. Způsob testu pro detekci nebo kvantitativní analýzu, zda je hořká chuť horké sloučeniny v kompozici blokována antagonistickou sloučeninou podle nároku 34, zahrnující: kontaktováni kompozice obsahující alespoň jednu horkou sloučeninu, která aktivuje alespoň jeden lidský receptor hořké chuti vybraný ze skupiny sestávající z hT23, 7, 10, 14, 16, 44, 51,55, 61, 63, 64, 65 nebo 71 a/nebo hT2R5, 9, 13. 54, 67 a 75 a detekci, zda je aktivace tohoto alespoň jednoho receptorů blokována nebo inhibována sloučeninou podle nároku 38, přičemž blokování nebo inhibice zeslabuje hořkost této alespoň jedné hořké sloučeniny.
  67. 74. Test podle nároku 73, který dále obsahuje test chuti, kde jsou hořká sloučenina a antagonistická sloučenina ochutnávány odděleně a v kombinaci za účelem potvrzení. Že hořká chuť je antagonistou zeslabena.
  68. 75. Test podle nároku 73, kde chuťový receptorje expnmován na buněčné membráně.
  69. 76. Test podle nároku 73, kde chuťový receptor je expnmován na izolované buněčné membráně,
  70. 77. Test podle nároku 73, kde chuťový receptorje expnmován na intaktní buňce.
  71. 78. Test podle nároku 73, kde chuťový receptorje expnmován na eukaryotické buňce.
    331 i 9. Test podle nároku 73, kde chuťový receptor je exprimován buňkou obojživelníka, savce nebo hmyzu.
  72. 80. Test podle nároku 73, kde chuťový receptor je exprimován na buňce vybrané z HEK293, BHK, COS, HEK293T, CHO a oocytu z Xenopus.
  73. 81. Test podle nároku 73, kterým je fluorimetrický test,
  74. 82. Test podle nároku 73, kterým je vazební test.
  75. 83. Test podle nároku 73, který detekuje účinek sloučeniny testováním jejího účinku na intracelulámí koncentraci iontů.
  76. 84. Test podle nároku 73, který detekuje účinek sloučeniny na intracelulámí sodík nebo vápník.
  77. 85. Test podle nároku 73, který detekuje účinek sloučeniny na membránový potenciál buňky.
  78. 86. Test podle nároku 73, který detekuje účinek sloučeniny na transkripci reportérového genu.
  79. 87. Test podle nároku 73, kde sloučenina je vybrána na základě její schopnosti blokovat interakci chuťového receptorů s jedním z hořkých ligandů.
  80. 88. Test podle nároku 73, který detekuje účinek sloučeniny na intracelulámí cAMP, cGMP nebo 1P3.
  81. 89. Test podle nároku 73, kde chuťový receptor obsahuje exracelulámí doménu nebo transmembránovou oblast chuťového receptorů.
  82. 90. Test podle nároku 73, který detekuje změny vápníku za použití kalcium-specifického fluorescenčního barviva.
    332
    91 - Test podle nároku 90, kde barvivém je Flu^3, Fluo-4, Fura-2 nebo jejich směsi.
  83. 92. Test podle nároku 73, kde chuťový receptor je v roztoku.
    Test podle nároku 73, ferý. je vazební lest, kletý detekuje spektroskopických vlastnosti, hydrodynamických vlastností nebo rozpustnosti receptoru.
  84. 94. Test podle nároku 73, ktetý detekuje úcnek sloučen,„y . kompfclů receptoru s G proteinem.
  85. 95. Test podle nároku 94. kde G proto,nemje iransducin, gtmducin. G.„ Ges nebo jejich chiméra.
  86. 96. Test podle nároku 73, kterým je fluorescenční polarizační test.
  87. 97. Test podle nároku 73, kde chuťový receptor je navázán na substrát pevné fáze.
  88. 98. Test podle nároku 73, kterým je vysoce výkonný test,
  89. 99. Test podle nároku 73, kde chuťový receptor je exprimován buňkou HEK293.
  90. 100. Zpísob ideu.ifikace kotlaného wcbnóho mot™ ρΗ«0 , rizných ,idskýc|, T2R. zahrnující výsraveni buněčné membrány buňky sloučemné podle nároku 38.
  91. 101. Chimérický GPCR konstruovaný tak. aby obsahoval uvedený v „
  92. 102. Sloučenina vzorce:
    333
    334
    335
    336
    nebo její sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid.
  93. 103. Sloučenina vzorce:
    337
    338
    339
    340
    YA o o i
    341
    342
    343
    344
    346
    347
    348
    349
    350
    351
    352
    O
    nebo její sůl, hydrát, solvát nebo N-oxid.
  94. 104. Sloučenina vzorce:
    353
    ·«« -** · kompozicí pro poai,, IUmi n8bo rahnrujK! pnrlan, JeJn8 neb„ vfce s|0UC;nin podl8 Jednoho 2 “ 104 nebo jejich ke kompmici zeslabeni hořké chuti spojené s kompozicí.
  95. 106. Wb podle tóofa, ΙΙΆ kde koncen„Kp w s|mieen.n * přibližně 0,1 ppm do přibližně 100 ppm.
    354
  96. 107. Způsob podle nároku 105, kde koncentrace této jedné nebo více sloučenin je od přibližné 1 ppm do přibližně 25 ppm.
  97. 108. Kompozice pro požití lidmi nebo zvířaty, obsahující jednu nebo více sloučenin podle jednoho z nároků 33 až 50 nebo 102 až 104 nebo jejich analog.
  98. 109. Kompozice podle nároku 108, kde kompozicí je potravinový nebo nápojový produkt.
  99. 110. Kompozice podle nároku 109, kde nápojovým produktem je hotový, rozpustný a suchý kávový nápoj, směs kávového nápoje nebo koncentrát kávového nápoje.
  100. 111. Kompozice podle nároku 109, kde nápojovým produktem je sušené mléko nebo smetana na bázi mléka, sušené mléko nebo smetana na nemléčné bázi nebo bělidlo pro kávové nápoje.
  101. 112. Kompozice podle nároku 108, kde kompozicí je nejedlý produkt.
  102. 113. Kompozice podle nároku 112, kde nejedlým produktem je doplněk, nutraceutikum, tunkční potravinový produkt, farmaceutikum, volně prodejné léčivo, produkt pro péči o ústní dutinu nebo kosmetický produkt.
  103. 114. Kompozice podle nároku 113, kde produktem pro péči o ústní dutinu je zubní pasta, ústní voda nebo žvýkačka.
  104. 115. Sloučenina vzorce:
    O R3Í
    Ar8-AIK-Ar7-N R„
    Rae nebo její sůl, hydrát, solvát, N-oxid nebo proléčivo, kde A? a Ar7 jsou stejná nebo odlišná, nezávisle na sobě, pěti- nebo šestičlenná arylová skupina nebo péti- nebo šestičlenná heteroarylova skupina;
    Alk je alkylová skupina, případně přerušená heteroatomem;
    355
    Rj6 a R37JS011 stejné nebo odlišné, nezávisle na sobě, vodík, alkyl, nebo R16 a R,7 spolu s atomy, k nimž jsou připojeny, tvoří případně substituovaný pěti- nebo šestičlenný heterocyklus; a
    Ris je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl nebo haloalkyL
  105. 116. Sloučenina podle nároku 115, kde pétičlenným heterocyklem vytvořeným R36 a Rj+ je hydantoin nebo substituovaná nebo nesubstituovaná cyklická močovina.
  106. 117. Sloučenina podle nároku 116, kde hydantoinem je hydantoin vzorce:
    O
    X^R38
    Ar®-Alk-Ar7—N I o \>-R«
    0*39 nebo jeho sůl, hydrát, solvát, N-oxid nebo proléčivo, kde A? a Ar7 jsou stejná nebo odlišná, nezávisle na sobě, pěti- nebo šestičlenná arylová skupina nebo pěti- nebo šestičlenná hcteroarylová skupina;
    Alk je alkylová skupina, případně přerušená heteroatomem;
    R)S je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl nebo haloalkyl; a
    R39 a R40 jsou stejné nebo odlišné, nezávisle na sobě, vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl. substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl,
    356 substituovaný nebo nesubstituovaný aiylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný hcteroarylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaiy laiky 1, haloalkyl, nebo R39 a R^ spolu s uhlíkovým atomem, k němuž jsou připojeny, tvoří skupinu C=O nebo substituovanou nebo nesubstituovanou alkenylovou skupinu,
  107. 118. Sloučenina podle nároku 115, kde pětičlenným heterocyklem vytvořeným Rw a R37 je urazol.
  108. 119. Sloučenina podle nároku 118, kde urazolem je urazol vzorce:
    O
    Kn'Rm
    Ar®-Alk—Ar7---N I o
    nebo jeho sůl, hydrát, solvát, N-oxid nebo proléčivo, kde Ar6 a Ar7 jsou stejná nebo odlišná, nezávisle na sobě, pěti- nebo šestičlenná arylová skupina nebo pěti- nebo šestičlenná heteroarylová skupina;
    Alk je alkylová skupina, případně přerušená heteroatomem;
    R38 je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloaikylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroatylalkyl, nebo haloalkyl; a K je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloaikylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaiylalkylamidoaikyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy,
    357 substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryí, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, nebo haloalkyl.
  109. 120. Sloučenina podle nároku 115, kde šestičlenným hetcrocyklem vytvořeným Rw a R„ je šestičlenný heterocyklus vzorce:
    nebo jeho sůl, hydrát, solvát, N-oxid nebo proléčivo, kde R38 je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryí, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, nebo haloalkyl; a
    R43, R44, R45, a R^ jsou stejné nebo odlišné, nezávisle na sobě, vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryí, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, nebo R,3 a R^, nebo R^ a spolu s uhlíkovými atomy, k nimž jsou připojeny, tvoří skupinu C=O,
  110. 121. Sloučenina vzorce:
    nebo její sůl, hydrát, solvát, N-oxid nebo proléčivo, kde Alk je alkylová skupina, případní přerušená heteroatomem;
    M1 je dusík nebo kde R4o je vodík nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
    358
    M jc dusík nebo CR50, kde R5Ů je vodík nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
    Rt6 a R37 jsou stejné nebo odlišné, nezávisle na sobě, vodík, alkyl, nebo, R36 a Rp, spolu s atomy, k nimž jsou připojeny, tvoří případně substituovaný pěti- nebo šestičlenný heterocyklus; a
    RW je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubsutuovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, nebo haloalkyl;
    R47 je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, nebo halo; a je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubslituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný «yl. substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, nebo halo.
  111. 122. Sloučenina vzorce:
    G—Q nebojejí sůl, hydrát, solvát, N-oxid nebo proléčivo, kde Alk je alkylová skupina, případně přerušená heteroatomem;
    Oje C=O a Q je CR51R5, nebo NR„, kde R„ a R?2 jsou stejné nebo odlišné, nezávisle na sobě, vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstůuovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo
    359 nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, haloalkyl, nebo R„ a R52, spolu s uhlíkovým atomem, k němuž jsou připojeny, tvoři skupinu C=O nebo substituovanou nebo nesubstituovanou alkenylovou skupinu;
    M je dusík nebo CR^, kde R49 je vodík nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
    xr je dusík nebo CR50, kde R50 je vodík nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
    Ris je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyi, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, nebo haloalkyl;
    R47 je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, nebo halo; a
    Rhx je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, nebo halo.
  112. 123. Sloučenina vzorce:
    360
    361
    362
    363
    nebo její sůl, hydrát, solvát, N-oxid nebo prolécivo.
  113. 124. Sloučenina vzorce:
    364
    nebo její sůl, hydrát, solvát, N-oxid nebo proléčivo.
  114. 125. Způsob snížení nebo zeslabení hořké chuti, zahrnující podání kompozice obsahující účinné množství jedné nebo více sloučenin podle jednoho z nároků 115 až 124 nebo její soli, hydrátu, solvátu, N-oxidu nebo proléčiva.
  115. 126. Způsob podle nároku 125, kde kompozicí je potravina, nápoj nebo léčivo.
  116. 127. Způsob podle nároku 125, kde sloučenina aktivuje alespoň hT2R8.
  117. 128. Způsob podle nároku 125, kde hořká chuť je spojena s kávou nebo potravinou, nápojem nebo léčivem s příchutí kávy.
  118. 129. Způsob podle nároku 128. kde kávou je instantní káva nebo vařená káva.
  119. 130. Způsob podle nároku 125, kde alespoň jednou sloučeninou je antagonista hT2R8.
  120. 131. Kompozice obsahující jednu nebo více sloučenin podle jednoho z nároků 1 15 až 124 nebo její sul, hydrát, solvát, N+oxid nebo proléčivo a jeden nebo více farmaceuticky přijatelných nosičů.
  121. 132. Kompozice podle nároku 131, kterou je potravina, nápoj nebo léčivo pro lidskou spotřebu.
  122. 133. Kompozice kávy nebo potraviny nebo nápoje nebo léčiva s příchutí kávy, která obsahuje alespoň jednu sloučeninu podle jednoho z nároků 115 až [24 nebo její >úi, hydrát, solvát, N-oxid nebo proléčivo.
    365
  123. 134. Kompozice podle nároku 133, kde alespoň jednou sloučeninouje antagonists hT2R8.
  124. 135. Kompozice podle nároku 133, kterou je instantní káva, mletá káva nebo vařená káva.
  125. 136. Kompozice podle nároku 133, kterou je instantní káva.
  126. 137. Kompozice potraviny, nápoje nebo léčiva mající horkou chuť, kde tato hořká chuť je zeslabena nebo eliminována přídavkem účinného množství sloučeniny podle jednoho z nároků 115 až 124, nebo její soli, hydrátu, solvátu, N-oxidu nebo proléčiva.
  127. 138. Kompozice podle nároku 137, kde alespoň jednou sloučeninouje antagonista hT2R8.
  128. 139. Kompozice podle nároku 137, kde nápojem je instantní kávový nápoj, nápoj z mleté kávy nebo vařený kávový nápoj.
  129. 140. Kompozice podle nároku 137, kde nápojemje instantní kávový nápoj.
  130. 141. Způsob testu pro detekci nebo kvantitativní analýzu, zda je hořká chuť hořké sloučeniny v kompozici blokována sloučeninou podle jednoho z nároků 115 až 124, nebo její solí, hydrátem, solvátem, N-oxidem nebo proléčivem, přičemž způsob zahrnuje:
    kontaktování receptorů hT2R8 hořké chuti s kompozicí obsahující alespoň jednu hořkou sloučeninu, která aktivuje alespoň jeden receptor hT2R8 hořké chuti a detekci, zda aktivace receptorů hT2R8 je blokována nebo inhibována sloučeninou podle jednoho z nároků 115 až 124. nebo její soli, hydrátem, solvátem. N-oxidem nebo proléčivem, přičemž toto blokování nebo inhibice značí, že hořká chuť sloučeniny nebo kompozice obsahující tuto sloučeninu může být zeslabena přidáním účinného množství sloučeniny podle jednoho z nároků 115 až 124 nebo její soli, hydrátu, solvátu. N-oxidu nebo proléčiva.
  131. 142. Test podle nároku 141, který dále zahrnuje chuťový test, kde se hořká sloučenina a antagonistická sloučenina ochutnají oddělené a v kombinaci za účelem potvrzení, že je hořká chuť antagonistou zeslabena.
    366
  132. 143. Test podle nároku 141, kde je chuťový receptor exprimován na buněčné membráně.
  133. 144. Test podle nároku 141, kde je chuťový receptor exprimován na izolované buněčné membráně.
  134. 145. Test podle nároku 141, kde je chuťový receptor exprimován na intaktni buňce.
  135. 146. Test podle nároku 141, kde je chuťový receptor exprimován na eukaryotické buňce.
  136. 147. Test podle nároku 141, kde je chuťový receptor exprimován buňkou obojživelníka, savce nebo hmyzu.
  137. 148. Test podle nároku 141, kde je chuťový receptor exprimován na buňce vybrané z HEK293, BHK, COS, HEK293T, CHO a oocytu z Xenopus.
  138. 149. Test podle nároku 141, kterýmje fluorimetrický test.
  139. 150. Test podle nároku 141, kterýmje vazební test.
  140. 151. Test podle nároku 141, který detekuje účinek sloučeniny testováním jejího účinku na intracelulámí koncentraci iontů.
  141. 152. Test podle nároku 141, který detekuje účinek sloučeniny na intracelulámí sodík nebo vápník.
  142. 153. Test podle nároku 141, který detekuje účinek sloučeniny na membránový potenciál buňky.
  143. 154. Test podle nároku 141, který detekuje účinek sloučeniny na transkripci reportérového genu,
  144. 155. Test podle nároku 141, který detekuje účinek sloučeniny na intracelulámí cAMP, cGMP nebo 1P3.
    367
  145. 156. Test podle nároku 141, kde chuťový receptor obsahuje extracelulámí doménu nebo transmembránovou oblast chuťového receptorů.
  146. 157. Fest podle nároku 141, který detekuje změny vápníku za použití kalcium-specitlckého fluorescenčního barviva.
  147. 158. Test podle nároku 141, který detekuje změny intracelulámího vápníku za použití barviva vybraného z Fluo-3, Fluo-4 a Fura-2.
  148. 159. Test podle nároku 141, kde chutový receptor je v roztoku.
  149. 160. Test podle nároku 141, kterým je vazební test, který detekuje změny spektroskopických vlastností, hydrodynamických vlastností nebo rozpustnosti [čeho? sloučeniny?].
  150. 161. Test podle nároku 141, který detekuje účinek sloučeniny na tvorbu komplexu chuťového receptorů s G proteinem.
  151. 162. Test podle nároku 141, který detekuje účinek sloučeniny na tvorbu komplexu chuťového receptorů s G proteinem vybraným z transducinu, gustducinu, Gal5, Gal6 nebo jejich chiméry.
  152. 163. Fest podle nároku 141, kterým je fluorescenční polarizační test.
  153. 164. Test podle nároku 141, kde chuťový receptor je navázán na substrát pevné fáze.
  154. 165. Test podle nároku 141, kterým je vysoce výkonný test.
  155. 166. Test podle nároku 141, kde chuťový receptor je exprimován buňkou HEK293.
  156. 167. Způsob identifikace konzervovaného vazebného motivu přítomného v nižných lidských F2R, zahrnující vystavení buněčné membrány buňky sloučenině podle jednoho z nároků 115 až 124 nebo její soli, hydrátu, solvátu, N-oxidu nebo proléčivu.
    368
  157. 168. Chimérický GPCR konstruovaný tak, aby obsahoval motiv identifikovaný způsobem podle nároku 167.
  158. 169. Způsob snížení nebo zeslabení hořké chuti v kompozicí pro požití lidmi nebo zvířaty, zahrnující přidáni jedné nebo více sloučenin podle jednoho z nároků 115 až 124 nebo její soli, hydrátu, solvátu, N-oxidu nebo proléčiva ke kompozici v koncentraci účinné pro zeslabení nebo snížení hořké chuti spojené s kompozicí.
  159. 170. Způsob podle nároku 169, kde koncentrace této jedné nebo více sloučenin je od přibližné 0,1 ppm do přibližně 100 ppm.
  160. 171. Způsob podle nároku 169, kde koncentrace této jedné nebo více sloučenin je od přibližné 1 ppm do přibližně 25 ppm.
  161. 172. Kompozice pro požití lidmi nebo zvířaty, obsahující jednu nebo více sloučenin podle jednoho z nároků 115 až 124 nebo její sul, hydrát, solvát, N-oxid nebo proléčivo.
  162. 173. Kompozice podle nároku 172, kterou je potravinový nebo nápojový produkt,
  163. 174. Kompozice podle nároku 173, kde potravinovým produktem je hotový, rozpustný a suchý kávový nápoj, směs kávového nápoje nebo koncentrát kávového nápoje.
  164. 175. Kompozice podle nároku 173, kde nápojovým produktem je sušené mléko nebo smetana na bázi mléka, sušené mléko nebo smetana na nemlčené bázi nebo bělidlo pro kávové nápoje.
  165. 176. Kompozice podle nároku 172, kde kompozicí je nejedlý produkt.
  166. 177. Kompozice podle nároku 176, kde nejedlým produktem je doplněk, nutraceutikum, tunkční potravinový produkt, farmaceutikum, volně prodejné léčivo, produkt pro péči o ústní dutinu nebo kosmetický produkt.
  167. 178. Kompozice podle nároku 177, kde produktem pro péči o ústní dutinu je zubní pasta, ústní voda nebo žvýkačka.
    369
  168. 179. Způsob přípravy sloučeniny se vzorcem:
    R5# 0V
    I R57
    Alk nebo její soli, hydrátu, solvátu, N-oxidu nebo proléčiva, kde Alk je alkylová skupina, případně přerušená heteroatomem;
    T2 je C=S, C O nebo S(O)2;
    R53 je substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl nebo substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl;
    M1 je dusík nebo CR54, kde R54 je vodík nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
    M“ je dusík nebo CR55, kde R55 je vodík nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
    r56 je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, nebo halo; a
    R57 je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, nebo halo;
    přičemž způsob zahrnuje reakci sloučeniny se vzorcem:
    oV\^AIk / A\ yz RS7 kde R5fl, R57, a Alk jsou definovány výše a J je odstupující skupina, se sloučeninou vzorce:
    ΗΝ-Λ • ať kde M' a M2 jsou definovány výše, za vzniku sloučeniny se vzorcem
    370
    mající skupinu NO?;
    redukci NO? skupiny za vzniku sloučeniny obsahující skupinu NH?; a reakci sloučeniny obsahující NH? skupinu se sloučeninou vzorce
    J2 R53 kde J2 je odstupující skupina a T? a R53 jsou definovány výše.
  169. 180. Způsob přípravy sloučeniny se vzorcem:
    nebo její soli, hydrátu, solvátu, N-oxidu nebo proléčiva, kde Alk je alkylová skupina, případně přerušená heteroatomem;
    Rsi a R52 jsou stejné nebo odlišné, nezávisle na sobě, vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl. substituovaný nebo nesubstituovaný aiylamidoalkyi, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyi, substituovaný nebo nesubstituovaný iieteroarylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, haloalkyl, nebo RJ( a R;?, spolu s uhlíkovým atomem, k němž jsou připojeny, tvoří substituovanou nebo nesubstituovanou alkenylovou skupinu;
    M je dusík nebo CR49, kde R49 je vodík nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
    371
    M je dusík nebo CR50, kde R50 je vodík nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
    Rvi je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný hcteroarylaikyl, nebo haloalkyl;
    R47 je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, nebo halo; a
    Rie je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, nebo halo;
    přičemž způsob zahrnuje zahřátí sloučeniny se vzorcem:
    R47 oV I
    Rw
    Aik
    O kde R47, R4g,Alk, M1, a M jsou definovány vvše;
    pro konverzi -CON3 skupiny na -N=C=O skupinu, a pak reakci se sloučeninou vzorce:
    J, HN kde J) je odstupující skupina a Rm, R51, a R52 jsou definovány výše.
  170. 181. Způsob přípravy sloučeniny se vzorcem:
    N * 'm2 JI r R« \ /
    O R„
    372 nebo její soli, hydrátu, sol vátu, N-oxidu nebo pro léčiva, kde Alkje alkylová skupina, případně přerušená heteroatomem;
    R52 je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný ary laiky lamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, haloalkyl;
    M je dusík nebo CR«, kde je vodík nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
    M je dusík nebo CR50, kde Rqj je vodík nebo substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl;
    Rix je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný cykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heterocykloalkylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylamidoalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroaryl, substituovaný nebo nesubstituovaný heteroarylalkyl, nebo haloalkyl;
    R47 je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, nebo halo; a
    Rís je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný nebo nesubstituovaný alkoxy, substrtuovaný nebo nesubstituovaný aryl, substituovaný nebo nesubstituovaný arylalkyl, nebo halo;
    přičemž způsob zahrnuje zahřátí sloučeniny vzorce:
    $47
    O
    373 kde R47, R^.Alk, M1, a M'jsou definovány výše;
    pro konverzi -CON? skupiny na -N<=0 skupinu, a pak reakci s hydrazinem se vzorcem:
    HN / H2N kde Ris je definován výše.
  171. 182. Způsob přípravy sloučeniny se vzorcem:
    O
    HoJ CH2—Ar2— (Rz')n \ O O / , \ , IV/ / (R'%—Ar’-S—
    CH?—Ar3_(R3.jo (III) nebo její soli, hydrátu, solvátu nebo N-oxidu, kde:
    Ar1, Ar2 a AP jsou nezávisle pěti- nebo šestičlenný arylový, heteroaiylový nebo cykloalkylový kruh, a Ar a Ap mohou být případně vypuštěny;
    m je 0, 1, 2 nebo 3;
    n a p jsou nezávisle 0, 1, 2, 3 nebo 4;
    každý Rh je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného aiylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO?, OR6, S(O)bR6, NRŮR7, CONR6R7, CO+R6, NR6CO^R7, NR6CONR7RS, NR6CSNR7Rs, NR6C(=NH)NR7Rs, SO3NR5R6, NR5S0iR6, NR^SOzNR^7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(ORó), a P(O)(Rj)(OR6);
    každý R2' je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu. substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO?, OR6, SfOU6, NR6R7, C0NR6R7, CO?RŮ, NRbCO.R7, NR6CONR7Rs, NR6CSNR7Rs, NR6C(=NH)NR7Rs, so?nr5r4, NR5soA NR^O+NR^R7, B(ORj)(OR6), P(O)(OR3)(OR6), a P(0)(R5)(0R6);
    374 každý R3' je nezávisle vybrán ze skupiny sestávající z vodíku, halogenu, alkylu, substituovaného alkylu, arylu, substituovaného arylu, arylalkylu, substituovaného arylalkylu, acylu, substituovaného acylu, heteroalkylu, substituovaného heteroalkylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, heteroarylalkylu, substituovaného heteroarylalkylu, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NRftC(=NH)NR7R3, SO2NRsR6, NR5SO2RŮ, NR3SO2NR6R7, BÍOR^OR6), P(O)(OR5)(OR6), a P(O)(R5)(OR6);
    R5-R3 jsou nezávisle vodík, alkyl, substituovaný alkyl, aryl, substituovaný aryl, arylalkyl, substituovaný arylalkyl, heteroalkyl, substituovaný heteroalkyl, heteroaryl, substituovaný heteroaryl, heteroarylalkyl nebo substituovaný heteroarylalkyl nebo alternativně, R6 a R‘, R7 a R3, spolu s atomy, na něž jsou navázány, tvoří cykioheteroalkylový nebo substituovaný cykioheteroalkylový kruh;
    bje 0, 1, nebo 2;
    přičemž způsob zahrnuje reakci sloučeniny se vzorcem:
CZ20100180A 2007-08-21 2008-08-19 Identifikace lidských T2R receptoru, které reagují na horké slouceniny, které vyvolavají horkou chut v kompozicích, a jejich použití v testech pro identifikaci sloucenin, které inhibují (blokují) horkou chut v kompozicích a jejich použití CZ2010180A3 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US95712907P 2007-08-21 2007-08-21
US4718708P 2008-04-23 2008-04-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2010180A3 true CZ2010180A3 (cs) 2010-10-13

Family

ID=40378871

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20100180A CZ2010180A3 (cs) 2007-08-21 2008-08-19 Identifikace lidských T2R receptoru, které reagují na horké slouceniny, které vyvolavají horkou chut v kompozicích, a jejich použití v testech pro identifikaci sloucenin, které inhibují (blokují) horkou chut v kompozicích a jejich použití

Country Status (18)

Country Link
US (3) US7939671B2 (cs)
EP (2) EP2195656A4 (cs)
KR (2) KR101558193B1 (cs)
CN (2) CN101828111B (cs)
AU (1) AU2008289485B2 (cs)
BR (1) BRPI0815634B1 (cs)
CA (2) CA2696995C (cs)
CL (1) CL2008002473A1 (cs)
CZ (1) CZ2010180A3 (cs)
ES (1) ES2545121T3 (cs)
HK (1) HK1174334A1 (cs)
HU (1) HUE025137T2 (cs)
MX (1) MX2010001995A (cs)
NZ (1) NZ583350A (cs)
RO (1) RO128637A2 (cs)
RU (1) RU2522456C2 (cs)
TW (1) TWI482967B (cs)
WO (1) WO2009025793A2 (cs)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009025793A2 (en) * 2007-08-21 2009-02-26 Senomyx, Inc. Human t2r bitterness receptors and uses thereof
US8076491B2 (en) * 2007-08-21 2011-12-13 Senomyx, Inc. Compounds that inhibit (block) bitter taste in composition and use thereof
AR069650A1 (es) 2007-12-14 2010-02-10 Actelion Pharmaceuticals Ltd Derivados de aminopirazol como agonistas no peptidicos del receptor alx humano
BRPI0821115A8 (pt) 2007-12-18 2017-12-26 Actelion Pharmaceuticals Ltd Composto derivado de aminotriazol, medicamento, composição farmacêutica e uso do composto
EP2300830B1 (en) * 2008-06-13 2015-05-20 Givaudan SA Methods of identifying modulators of the bitter taste receptor tas2r44
US8043645B2 (en) 2008-07-09 2011-10-25 Starbucks Corporation Method of making beverages with enhanced flavors and aromas
EP2329263A1 (en) * 2008-08-07 2011-06-08 Givaudan SA Methods to identify modulators of the interaction between dextromethorphan and the bitter taste receptor tas2r46
KR101444559B1 (ko) 2009-06-09 2014-09-26 액테리온 파마슈티칼 리미티드 불화 아미노트리아졸 유도체
CA2760887A1 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Actelion Pharmaceuticals Ltd Oxazole and thiazole derivatives as alx receptor agonists
JP2013525438A (ja) * 2010-04-29 2013-06-20 アメリカ合衆国 ヒトピルビン酸キナーゼ活性剤
US8829026B2 (en) 2010-10-01 2014-09-09 Raqualia Pharma Inc. Sulfamoyl benzoic acid heterobicyclic derivatives as TRPM8 antagonists
US20130196990A1 (en) 2010-10-06 2013-08-01 Junya Qu Benzimidazole Derivatives As PI3 Kinase Inhibitors
SI2649068T1 (sl) 2010-12-07 2015-01-30 Actelion Pharmaceuticals Ltd. Derivati oksazolil-metiletra kot agonisti alx-receptorja
WO2012077051A1 (en) 2010-12-07 2012-06-14 Actelion Pharmaceuticals Ltd Hydroxylated aminotriazole derivatives as alx receptor agonists
CN103998933B (zh) * 2011-10-20 2016-12-14 卓莫赛尔公司 鉴定调节苦味的化合物的测定
WO2013158928A2 (en) 2012-04-18 2013-10-24 Elcelyx Therapeutics, Inc. Chemosensory receptor ligand-based therapies
US20140147556A1 (en) * 2012-11-27 2014-05-29 Elwha Llc Edible or inhalable compositions having antibodies and methods of use
AU2014262540B2 (en) 2013-05-10 2016-10-27 Pepsico, Inc. Taste receptor internalization assay
JP6367315B2 (ja) 2013-05-10 2018-08-01 ペプシコ, インコーポレイテッドPepsiCo Inc. 潜在的味覚調節物質を特定するためのモデルとしての細胞
EP3054936B1 (en) 2013-10-10 2023-10-18 Eastern Virginia Medical School 4-((2-hydroxy-3-methoxybenzyl)amino) benzenesulfonamide derivatives as 12-lipoxygenase inhibitors
ES2802376T3 (es) 2014-02-12 2021-01-19 Firmenich Incorporated Procedimiento mejorado para la síntesis de 1-bencil-3-(1-(isoxazol-4-ilmetil)-1h-pirazol-4-il)imidazolidin-2,4-dionas sustituidas
WO2016202935A1 (en) 2015-06-19 2016-12-22 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Glucose transport inhibitors
US10835505B2 (en) 2018-06-11 2020-11-17 Aardvark Therapeutics, Inc. Oral pharmaceutical formulation for weight loss, diabetes and related disorders
US11871772B2 (en) * 2018-08-10 2024-01-16 Firmenich Incorporated Antagonists of T2R54 and compositions and uses thereof
MX2021003158A (es) 2018-09-18 2021-07-16 Nikang Therapeutics Inc Derivados de anillo tricíclico condensado como inhibidores de la fosfatasa de homología a src 2.
WO2020061502A1 (en) 2018-09-20 2020-03-26 The Better Meat Company Enhanced aerobic fermentation methods for producing edible fungal mycelium blended meats and meat analogue compositions
US11034669B2 (en) 2018-11-30 2021-06-15 Nuvation Bio Inc. Pyrrole and pyrazole compounds and methods of use thereof
US11292782B2 (en) 2018-11-30 2022-04-05 Nuvation Bio Inc. Diarylhydantoin compounds and methods of use thereof
US20220125086A1 (en) * 2019-02-19 2022-04-28 The Regents Of The University Of California Positive allosteric modulators of sweet taste
US20220338510A2 (en) 2019-03-14 2022-10-27 Neuroenergy Ventures, Inc. Taste-Masking Formulation For Ketone Body Compounds
CN112401144A (zh) * 2019-08-23 2021-02-26 向可军 一种腌制腊肉的腌制工艺及其腌制设备
CN111875544B (zh) * 2020-08-13 2022-04-08 五邑大学 一种n-取代乙内酰脲类化合物的合成方法
CN112521449B (zh) * 2020-11-18 2022-04-22 渤海大学 两种具有苦味抑制作用的活性肽
CN113248567B (zh) * 2021-02-10 2023-02-03 渤海大学 一种苦味受体阻滞肽及其应用
TW202400588A (zh) * 2022-02-28 2024-01-01 香港商維泰瑞隆（香港）生物科技有限公司 Ｒｉｐ１調製劑、其製備及用途

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2805250A (en) * 1954-07-15 1957-09-03 Cassella Farbwerke Mainkur Ag Nu-nu-dibenzylsulfamyl benzoic acid
US3557111A (en) * 1968-03-29 1971-01-19 Bola Vithal Shetty N and n,n-alkyl,acyl and arylsulfamyl-tetrahydroquinazolinones
US3954994A (en) * 1968-10-03 1976-05-04 Pfizer Inc. Intermediates for preparing hipolipemic agents and method of lowering the blood lipid level in mammals with said agents
CA1000736A (en) * 1971-01-20 1976-11-30 Pennwalt Corporation Substituted anthranilamides and preparation thereof
DE2442851A1 (de) * 1974-09-06 1976-03-18 Hoechst Ag Basisch substituierte 3-sulfamoylbenzoesaeurederivate und verfahren zu ihrer herstellung
JPS5825980B2 (ja) 1976-02-12 1983-05-31 ヤマサ醤油株式会社 サイクリックヌクレオチドの定量法
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5010175A (en) 1988-05-02 1991-04-23 The Regents Of The University Of California General method for producing and selecting peptides with specific properties
US5084466A (en) * 1989-01-31 1992-01-28 Hoffmann-La Roche Inc. Novel carboxamide pyridine compounds which have useful pharmaceutical utility
US4994490A (en) * 1989-04-03 1991-02-19 The Nutrasweet Company Novel N-(sulfomethyl)-N'-arylureas
US5464764A (en) 1989-08-22 1995-11-07 University Of Utah Research Foundation Positive-negative selection methods and vectors
DE779362T1 (de) 1989-12-22 2001-04-05 Applied Research Systems DNS-Konstrukten zur Aktivierung und Veränderung der Expression von endogenen Genen
US5272071A (en) 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
JPH04505546A (ja) 1990-02-09 1992-09-24 アスラブ　ソシエテ　アノニム 写真平版マイクロ製造法を用いて製造した放射場静電マイクロモーター及び前記マイクロモーターの製造方法
IE66205B1 (en) 1990-06-14 1995-12-13 Paul A Bartlett Polypeptide analogs
US5650489A (en) 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
US5401629A (en) 1990-08-07 1995-03-28 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Assay methods and compositions useful for measuring the transduction of an intracellular signal
US5208247A (en) * 1991-08-01 1993-05-04 American Cyanamid Company Pyridinium compounds which are useful as antagonists of platelet activating factor
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
PT101031B (pt) 1991-11-05 2002-07-31 Transkaryotic Therapies Inc Processo para o fornecimento de proteinas por terapia genetica
US6270989B1 (en) 1991-11-05 2001-08-07 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and delivery
GB9201755D0 (en) * 1992-01-28 1992-03-11 British Bio Technology Compounds
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
US6664107B1 (en) 1993-05-26 2003-12-16 Ontario Cancer Institute, University Health Network CD45 disrupted nucleic acid
US5426039A (en) 1993-09-08 1995-06-20 Bio-Rad Laboratories, Inc. Direct molecular cloning of primer extended DNA containing an alkane diol
US5783593A (en) * 1993-11-04 1998-07-21 Abbott Laboratories Inhibitors of squalene synthetase and protein farnesyltransferase
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5593853A (en) 1994-02-09 1997-01-14 Martek Corporation Generation and screening of synthetic drug libraries
US5539083A (en) 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
US5525735A (en) 1994-06-22 1996-06-11 Affymax Technologies Nv Methods for synthesizing diverse collections of pyrrolidine compounds
US5549974A (en) 1994-06-23 1996-08-27 Affymax Technologies Nv Methods for the solid phase synthesis of thiazolidinones, metathiazanones, and derivatives thereof
KR19990014855A (ko) * 1995-05-17 1999-02-25 미암리 디, 메코너헤이 살진균성 시클릭 아미드
WO1996036595A1 (en) * 1995-05-19 1996-11-21 Chiroscience Limited 3,4-disubstituted-phenylsulphonamides and their therapeutic use
US6310095B1 (en) * 1995-11-06 2001-10-30 University Of Pittsburgh Inhibitors of protein isoprenyl transferases
ES2387211T3 (es) * 1997-05-07 2012-09-18 University Of Pittsburgh Inhibidores de proteínas isoprenil transferass
UA67754C2 (uk) * 1997-10-10 2004-07-15 Пфайзер, Інк. Агоністи простагландину, фармацевтична композиція на їх основі (варіанти), спосіб нарощення та збереження кісткової маси у хребетних та спосіб лікування (варіанти)
DE69936453T2 (de) 1998-07-28 2008-03-06 The Regents Of The University Of California, Oakland Für einen g-protein gekoppelten rezeptor, der an der empfindungstransduktion beteiligt ist, kodierende nukleinsäuren
ES2252996T3 (es) * 1999-01-13 2006-05-16 Warner-Lambert Company Llc Derivados de bencenosulfonamida y su uso como inhibidores de mek.
US6416861B1 (en) * 1999-02-16 2002-07-09 Northwestern University Organosilicon compounds and uses thereof
US6492406B1 (en) * 1999-05-21 2002-12-10 Astrazeneca Ab Pharmaceutically active compounds
ES2252058T3 (es) * 1999-08-27 2006-05-16 Sugen, Inc. Mimicos de fosfato y metodos de tratamiento empleando inhibidores de fosfatasa.
AU773600B2 (en) 1999-09-10 2004-05-27 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The T2R, taste receptor family
AU2001251258B2 (en) 2000-04-07 2008-06-05 Senomyx, Inc. T2r taste receptors and genes encoding same
WO2002055484A1 (fr) * 2001-01-12 2002-07-18 Takeda Chemical Industries, Ltd. Compose biaryle, procede de production de ce compose, et principe actif
DE60207399T2 (de) * 2001-03-02 2006-08-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Alkoxycarbonylaminobenzoesäure- oder alkoxycarbonylaminotetrazolylphenylderivate als ip-antagonisten
DE10122898A1 (de) 2001-05-11 2002-11-14 Haarmann & Reimer Gmbh Verwendung von Hydroxyflavanonen zur Maskierung des bitteren Geschmacks
CA2452337A1 (en) 2001-07-10 2003-01-23 Senomyx, Inc. Use of specific t2r taste receptors to identify compounds that block bitter taste
US20050228017A1 (en) * 2001-10-31 2005-10-13 Morphochem Aktiengesellschaft Fur Kombinatorische Chemie Novel anticancer compounds
RU2004116318A (ru) * 2001-11-30 2005-03-27 Пфайзер Продактс Инк. (Us) Фармацевтические композиции и споосбы введения селективных агонистов ep2-рецептора
TWI294778B (en) * 2002-03-13 2008-03-21 Smithkline Beecham Corp Peptide deformylase inhibitors
KR100657056B1 (ko) * 2002-06-05 2006-12-13 에프. 호프만-라 로슈 아게 중추 신경계 장애의 치료를 위한 5-ｈｔ6-수용체조절제로서 1-설폰일-4-아미노알콕시 인돌 유도체
TW200408393A (en) * 2002-10-03 2004-06-01 Ono Pharmaceutical Co Antagonist of lysophosphatidine acid receptor
US20040167183A1 (en) * 2003-02-20 2004-08-26 The Procter & Gamble Company Phenethylamino sulfamic acids
PL378748A1 (pl) * 2003-03-04 2006-05-15 Pfizer Products Inc. Zastosowanie selektywnych agonistów receptora EP2 w leczeniu
KR20050119201A (ko) * 2003-04-09 2005-12-20 니뽄 다바코 산교 가부시키가이샤 ５원 헤테로방향족 고리 화합물 및 이의 의약적 용도
MXPA06002500A (es) * 2003-09-18 2006-06-20 Basf Ag Nuevas sulfonamidas como agentes fitosanitarios.
US20050203086A1 (en) * 2004-03-04 2005-09-15 Pfizer Inc. Methods of treatment using an EP2 selective receptor agonist
WO2006009876A2 (en) * 2004-06-17 2006-01-26 Cengent Therapeutics, Inc. Trisubstituted nitrogen modulators of tyrosine phosphatases
US20050288340A1 (en) * 2004-06-29 2005-12-29 Pfizer Inc Substituted heteroaryl- and phenylsulfamoyl compounds
NZ536107A (en) * 2004-10-22 2007-06-29 Auckland Uniservices Ltd Nitrobenzindoles and their use in cancer therapy
WO2006084186A2 (en) * 2005-02-04 2006-08-10 Senomyx, Inc. Compounds comprising linked hetero aryl moieties and their use as novel umami flavor modifiers, tastants and taste enhancers for comestible compositions
CA2599555A1 (en) * 2005-03-16 2006-09-21 Basf Aktiengesellschaft Biphenyl-n-(4-pyridyl) methylsufonamides
WO2006097488A1 (en) * 2005-03-16 2006-09-21 Basf Aktiengesellschaft Use of n- (4-pyridyl) methylsulfonamides for combating arthropodal pests
AU2006262399A1 (en) * 2005-06-22 2007-01-04 Senomyx, Inc. Identification of human T2R recepors that are activated by bitter molecules in coffee (chlorogenic lactones) and related assays for identifying human bitter taste modulators
KR20080086917A (ko) * 2005-12-29 2008-09-26 노파르티스 아게 콜레스테릴 에스테르 전달 단백질 (ｃｅｔｐ) 억제제로서의피리디닐 아민 유도체
WO2009025793A2 (en) * 2007-08-21 2009-02-26 Senomyx, Inc. Human t2r bitterness receptors and uses thereof
US8076491B2 (en) * 2007-08-21 2011-12-13 Senomyx, Inc. Compounds that inhibit (block) bitter taste in composition and use thereof
JO3421B1 (ar) 2011-06-20 2019-10-20 H Lundbeck As طريقة لإعطاء 1-((1ار.3س)-6-كلورو-3-فينيل-اندان-1-ايل)-1.2.2-ترايميثيل- بيبيرازين واملاجها لمعالجة انفصام الشخصية

Also Published As

Publication number Publication date
CA2696995A1 (en) 2009-02-26
EP2195656A2 (en) 2010-06-16
US20090274632A1 (en) 2009-11-05
CL2008002473A1 (es) 2009-03-27
KR101558193B1 (ko) 2015-10-12
TW200912306A (en) 2009-03-16
RU2010110557A (ru) 2011-09-27
EP2195656A4 (en) 2011-10-19
KR20100076949A (ko) 2010-07-06
BRPI0815634B1 (pt) 2024-01-09
KR101599715B1 (ko) 2016-03-08
RU2522456C2 (ru) 2014-07-10
CN104130247A (zh) 2014-11-05
CN101828111B (zh) 2014-07-23
EP2487169B1 (en) 2015-05-20
CN104130247B (zh) 2018-06-01
US8148544B2 (en) 2012-04-03
CA2982520A1 (en) 2009-02-26
US20110207937A1 (en) 2011-08-25
US7939671B2 (en) 2011-05-10
WO2009025793A3 (en) 2009-05-14
HK1174334A1 (en) 2013-06-07
ES2545121T3 (es) 2015-09-08
MX2010001995A (es) 2010-06-09
CN101828111A (zh) 2010-09-08
AU2008289485B2 (en) 2014-08-14
TWI482967B (zh) 2015-05-01
KR20150034819A (ko) 2015-04-03
NZ583350A (en) 2012-03-30
AU2008289485A1 (en) 2009-02-26
EP2487169A1 (en) 2012-08-15
CA2696995C (en) 2017-11-21
WO2009025793A8 (en) 2009-07-30
BRPI0815634A2 (pt) 2015-02-18
RO128637A2 (ro) 2013-07-30
HUE025137T2 (en) 2016-01-28
WO2009025793A2 (en) 2009-02-26
US20130183252A1 (en) 2013-07-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ2010180A3 (cs) Identifikace lidských T2R receptoru, které reagují na horké slouceniny, které vyvolavají horkou chut v kompozicích, a jejich použití v testech pro identifikaci sloucenin, které inhibují (blokují) horkou chut v kompozicích a jejich použití
US8076491B2 (en) Compounds that inhibit (block) bitter taste in composition and use thereof
US7514452B2 (en) 2-furancarboxylic acid hydrazides and pharmaceutical compositions containing the same
HUE025162T2 (en) Use of sGC stimulators, sGC activators alone or in combination with PDE5 inhibitors to treat systemic sclerosis (SSc).
TW200412970A (en) Pharmaceutical composition comprising PDE 5 inhibitor and active ingredients
UA72783C2 (en) Agonist of central canabinoid receptors for preparation of drug disaccustoming smoking, combined pharmaceutical composition and kit
TW200840573A (en) Heterocyclic compounds and their methods of use
AU2007220047A2 (en) Inhibition of JAK2 as a treatment of pulmonary arterial hypertension
JP2010070514A (ja) ピラゾール誘導体及びその医薬用途
JPH01501935A (ja) 駆虫薬アシルヒドラゾン、使用方法および組成物
UA108059C2 (uk) Ідентифікація рецепторів t2r людини, які зв&#39;язуються з гіркими сполуками, що надають гіркий смак композиціям, та їх застосування в засобах аналізу для визначення сполук, інгібуючих (блокуючих) гіркий смак у композиціях, і їх застосування
KR100845770B1 (ko) 피라졸로디아제핀계 화합물 및 그의 제조방법
EP1254120A1 (en) Use of pyrimidine endothelin antagonists in companion animals