KR101558193B1 - 인간 ｔ2ｒ 쓴맛 수용체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, T2R 미각 수용체 패밀리 중 특정 인간 미각 수용체가 예를 들어 커피에 존재하는 특정 쓴맛 화합물에 반응한다는 발견에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 쓴맛 차단제로서 기능을 하는 특정 화합물 및 조성물, 및 예를 들어 커피와 커피맛 식품, 음료 및 의약에서 쓴맛 차단제 또는 풍미 조절제로서의 이의 용도의 발견에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 수많은 상이한 인간 T2R에 길항작용을 하는 화합물, 및 분석에서 및 인간 및 동물이 섭취하는 조성물 중 쓴맛 차단제로서의 이의 용도의 발견에 관한 것이다.

Description

인간 Ｔ2Ｒ 쓴맛 수용체 및 이의 용도{Human T2R bitterness receptors and uses thereof}
관련 출원
본 출원은 2007년 8월 21일에 출원된 미국 가출원 제60/957,129호 및 2008년 4월 23일에 출원된 미국 가출원 제61/047,187호를 우선권으로 주장하고, 차례로 2002년 7월 10일에 출원된 미국 출원 제10/191,058호의 일부 계속 출원이며 또한 2001년 4월 5일에 출원되어 현재 미국 특허번호 제7,105,650호인 미국 출원 제09/825,882호의 분할출원인 2003년 12월 1일에 출원된 미국 출원 제10/742,209호의 일부 계속 출원인 2006년 11월 1일에 출원된 미국 출원 제11/555,617호의 일부 계속 출원인 미국 출원 제11/766,974호와 관련되며, 이들 모든 출원은 전체가 본 명세서에 참조로 통합된다.
기술 분야
본 출원은 인간 2형 미각 수용체(hT2R)의 확인 및 특정 T2R들을 활성화시키는 리간드를 확인하기 위한 분석법에서의 이의 용도에 관한 것이다. 이러한 리간드는 미각 인지, 특히 쓴맛을 조절하는데 유용하다. 이전 특허 출원에서, 본 발명자들은 hT2R8 및 hT2R14를 포함하는 인간 쓴맛 수용체의 기능적 발현을 설명하였다. 본 특허 출원에서, 본 발명자들은 hT2R8 및 hT2R14가 커피의 쓴맛이 풍부한 분획에 의해 활성화된다고 보고하고, 또한 고속 탐색분석법을 이용한 hT2R8 및 hT2R14에 대한 길항물질의 확인을 보고하고, 상기 길항물질들의 조합으로 커피와 커피 분획들의 쓴맛을 줄일 수 있다는 것을 보고한다. 본 발명은 커피 음료의 맛을 조정하고 개선하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 커피 및 그 외 식음료의 쓴맛을 억제(차단)하는 화합물을 확인하는 스크리닝 분석 및 미각 시험에서의 hT2R8 및/또는 hT2T14의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 광범위한 쓴맛 길항 특성들, 즉 다양한 세트의 쓴맛 리간드에 의해 13개의 많은 다른 쓴맛 수용체의 활성화를 주목할 만하게 차단하거나 억제하고, 그들이 상호작용하는 쓴맛 수용체(들)이 아직 설명되지 않은 몇 가지 쓴맛 화합물에 의해 생기는 쓴맛을 억제할뿐만 아니라 6개의 다른 쓴맛 수용체의 활성화를 차단 또는 억제하는, 리간드를 발견하는 것에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 광범위한 쓴맛 길항 특성, 즉 다양한 세트의 쓴맛 리간드에 의해 hT2R3, 7, 10, 14, 16, 44, 51, 55, 61, 63, 64, 65 및 71 쓴맛 수용체의 활성화를 주목할만하게도 차단하거나 억제하고, 그들이 상호작용하는 쓴맛 수용체(들)이 아직 설명되지 않은 몇 가지 쓴맛 화합물에 의해 생기는 쓴맛을 억제할뿐만 아니라 6개의 다른 쓴맛 수용체, 예를 들면 hT2R5, 9, 13, 54, 67 및 75의 활성화를 차단 또는 억제하는, 화합물 C로 본 명세서에 지칭된 리간드의 발견에 관한 것이다.
또한 보다 구체적으로, 본 발명은 이러한 길항물질 화합물이 살리신의 쓴맛, hT2R16 길항물질(antagonist) 및 페닐티오우레아 hT2R51 작용제(agonist)를 감소시킨다는 발견을 제공한다.
또한 보다 구체적으로, 본 발명은 이러한 동일한 길항물질 화합물이 hT2R10, 14 및 75를 활성화시키는 오메프라졸(omeprazole); 및 적어도 7개의 쓴맛 수용체를 활성화시키는 천연 감미제인 레바우디오사이드 A(Rebaudiodise A)를 포함하는 다수의 쓴맛 수용체를 활성화시키는 쓴맛 화합물에 의해 생기는 쓴맛을 차단한다는 것과 이러한 동일한 길항물질이 나아가 또한 덱스트로메토르판(dextromethorphan) 및 디펜하이드라민(diphenhydramine)을 포함하여 이들이 상호작용하는 수용체(들)가 알려지지 않은 쓴맛 화합물에 의해 생기는 쓴맛을 억제한다는 발견을 제공한다.
이에 기초하여, 본 발명은 쓴맛이 다수의 쓴맛 수용체의 활성화와 관련된 확인되지 않은 쓴맛 리간드나 화합물, 또는 이의 수용체 특이성이 결정되지 않은 쓴맛 화합물에 의해 발생하는 쓴맛을 포함하는 이의 쓴맛을 약화시키기 위해 식품, 음료, 약 및 기타 섭취물(injestibles)에서의 본 화합물의 용도에 관한 것이다.
또한 이에 기초하여, 본 발명은 리간드 결합 및 T2R 활성화와 관련된 상이한 인간 T2R들에 존재하는 보존 모티프(conserved motif)를 설명하기 위하여, 본 길항물질의 용도 및 이러한 모티프를 함유하도록 조작된 키메라 및 돌연변이된 G-단백질-결합 수용체(GPCR)의 설계에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 이러한 스크리닝 분석을 이용하여 확인된 임의의 화합물 및 이의 커피와 커피 향 식품 및 음료 및 약을 포함하는 식음료 및 약에서의 용도에 관한 것이다.
인간이 감지할 수 있는 기초적인 미각 양상 중 하나는 쓴맛이다. 상당히 최근까지 쓴맛의 생리학은 거의 이해되지 않았다. 최근 연구들이 미각 생물학에 실마리를 제공하기 시작하였다(Lindemann, Nature(2001)). 많은 쓴맛 화합물이 세포 표면 수용체와 상호작용하여 쓴맛을 생성한다고 현재 알려져 있다. 이러한 수용체는 세포내 G 단백질들과 상호작용하는 7개의 막관통 도메인 수용체의 패밀리(family)에 속한다. T2R로 불리는 신규 GPCR 패밀리는 인간 및 설치류에서 확인되었다(Adler et al., Cell 100(6):693-702 (2000); Chandrashekar et al., Cell 100(6): 703-711 (2000); Matsunami H, Montmayeur J P, Buck L B. Nature 404(6778): 601-4 (2000)). 본 발명 이전의 수많은 증거들은 T2R이 쓴맛 화합물에 대한 반응을 조정한다고 제시하였다. 첫째, T2R 유전자들은 혀와 구개부 상피의 미각 수용체 세포들의 부분집합(subset)에서 특이적으로 발현된다. 둘째, 인간 T2R(hT2R1) 중 하나에 대한 유전자는 인간에서 쓴맛 화합물인 6-n-프로필-2-티오우라실에 대한 민감도와 연관된 염색체 좌위(locus)에 위치한다(Adler et al., (Id.)(2000)). 셋째, 마우스 T2R(mT2R5) 중 하나는 마우스에서 쓴맛 화합물인 사이클로헥시미드(cycloheximide)에 대한 민감도와 연관된 염색체 좌위에 위치한다. 또한, mT2R5는 미각 세포에서 특이적으로 발현되는 G 단백질인 거스트두신(gustducin)을 활성화시킬 수 있고, 쓴맛 자극 전도에 연관되어 있는 것으로 나타났다(Wong et al., Nature 381:796-800(1996)). mT2R5에 의한 거스트두신 활성화는 사이클로헥시미드에 대한 반응시에만 일어난다(Chandrashekar et al., (Id.)(2000)). 따라서, mT2R 패밀리가 마우스에서 쓴맛 반응을 조정하는 반면, hT2R 패밀리는 인간에서 쓴맛 반응을 조정한다고 제안되어 왔다. 단지 하나의 인간 T2R이 쓴맛 리간드를 확인한 것으로 제시되었는데, hT2R4는 데나토늄(denatonium)에 의해 활성화되는 것으로 나타났다(Chandrashekar et al., (Id.)(2000)). 하지만, 본 연구에 사용된 효과적인 데나토늄 농도(1.5 mM)는 특이하게 높았는데, 즉 인간에 대한 데나토늄의 쓴맛 역치로 보고된 것보다 105배 높았다(Saroli, Naturwissenschaften 71:428-429 (1984)). 따라서, 어떠한 특정 쓴맛 리간드도 어떤 hT2R과 확실하게 일치하지 않았다. 또한, 각각의 hT2R이 다수의 쓴맛 리간드를 결합시킬 수 있다고 제시되어 왔다. 이러한 가설은 hT2R 패밀리가 단지 확인된 25개의 구성원으로 이루어져 있는 반면 인간은 수백 개의 상이한 화합물을 쓴맛으로 인식할 수 있다는 사실에 기초한다. hT2R들의 서열은 이전에 보고되어 왔고, Zuker 등 및 Adler 등에 의해 공개된 PCT 출원(WO 01/18050 A2, (2001); WO 01/77676 A1, (2001))에 개시되어 있으며, 이들 모두는 전체가 참조로 본 발명에 통합되어 있다.
T2R 기능 연구의 어려움 중 하나는 이러한 수용체가 배양된 포유동물 세포주들에서 즉시 발현되지 않는다는 점이다. T2R 발현을 개선하기 위하여, 잘-발현된 GPCR인 로돕신으로부터의 N-말단 서열을 T2R 서열에 붙였다(Chandrashekar et al., (Id.)(2000)). 이 N-말단 태그는 또한 이용가능한 항체로 인하여 단백질 발현을 쉽게 관찰할 수 있게 해 주었다. 또한, 다른 N-말단 태그인 SSTR3 태그(Bufe et al., Nat. Genet. 32:397-400 (2002)가 T2R 발현을 개선하기 위해 사용되어 왔다. 로돕신 태그의 통합이 포유동물 세포주에서 몇몇 T2R들의 발현을 개선시킨 반면, 많은 T2R들은 여전히 기능을 연구하기에 충분할 만큼 발현되지 않았다. 다른 접근법에서, mT2R5는 곤충 Sf9 세포에서 성공적으로 발현되었고 생화학적 GTPγS 결합 분석을 이용한 기능 연구를 위해 사용되었다(Chandrashekar et al., (Id.)(2000)).
출원인들의 초기 특허출원으로 현재 미국특허 제7,105,650호인 미국출원 제09/825,882호에서, 출원인들은 hT2R51, hT2R54, hT2R55, hT2R61, hT2R63, hT2R64, hT2R65, hT2R67, hT2R71 및 hT2R75를 포함하는 수많은 신규 인간 미각 수용체의 핵산 서열 및 폴리펩타이드 서열을 확인하고 제공하였다. 또한 전체가 참조로써 본 명세서에 통합된 미국 출원 제 11/182,942 및 10/628,464호에서 출원인들은 또 다른 확인된 hT2R76으로 명명된 신규 인간 미각 수용체의 폴리펩타이드 및 DNA 서열을 제공하였다.
또한, 전체가 참조로써 본 명세서에 통합된 미국 출원 제10/191,058호에서, 출원인들은 세 개의 상이한 인간 T2R들을 특이적으로 활성화시키는 리간드를 발견하였다. 더욱이, 출원인들은 전체가 참조로써 본 명세서에 통합된 미국출원 11/455,693호를 최근에 출원하였고, 여기서는 추가로 다른 인간 T2R들에 특이적으로 결합하는 쓴맛 리간드를 추가로 확인하였고 관련된 분석법을 제공하였다.
또한, 발명의 실용성과 관련하여, T2R 및 T1R 미각 수용체 모두가 위장관계(gastrointestinal system)에서 발현된다고 보고되어 왔다. 예를 들어, Wu 등(Wu et al., Proc, Natl. Acad. Sci, USA 99(4):2392-7(2002))은 T2R들이 거스트두신 및 트랜스두신(transducin) 소단위들뿐만 아니라 장내분비세포들(STC1 세포들)에서 발현되며 이러한 세포들은 위장관 내에서 쓴맛 리간드에 반응할 것으로 예상된다고 보고한다. 또한, Chen 등(Chen et al., AM J. Physiol. Cell Phyisol. 291(4):C726-39 (2006))에 의해 쓴맛 자극이 장내분비 STC-1 세포들에서 Ca++ 신호 및 콜레시스토키닌(cholecystokinin; CCK) 방출을 유도한다고 보고되었다. 또한, Rozengurt(Rozengurt, A J Physiol Gastrointes Liver Physiol 291(2):G171-7 (2006))는 소화관 내 미각 수용체는 소화 기능, 및 호르몬 및/또는 신경 경로의 조절을 분자적으로 인식하는 역할을 할 것 같다는 것과 이들이 유해한 약물들의 검출 및 생존 반응의 역할을 할 수 있을 것으로 보고하였다. 또한, Sternini 등(Sternini Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292(2):G457-61 (2007))은 소화관 내 미각 수용체가 분자 인식(molecular sensing), 영양분 흡수, 해로운 물질로부터의 보호와 같은 위장관 기능과 연관될 수 있다고 보고하고, 또한 이러한 메커니즘들을 이해하는 것이 섭식 장애(feeding disorder) 및 염증과 같은 질병 상태 및 조건과 연관될 수 있다고 제시한다. 또한, 최근에 Mace 등(Mace et al., J Physiol. 2007 (Epub))에 의해 T2R 및 T1R들이 포스포리파아제 C 베타 2, PLC 베타2를 활성화시킨다는 것과, 혀 세포에 존재하는 것과 유사한 소화관 내 분자 장관 인지 시스템이 있을 것 같다는 것과, 미각 수용체를 발현하는 브러시 세포들(brush cells)이나 고립 화학민감성 세포들(solitary chemosensory cells)과 같은 장관내 세포들이 GLUT2 증가를 야기할 수 있으며, 영양분 인지 역할을 할 수 있으며, 비만 및 당뇨병의 치료에서 영양 역할을 할 수 있다. 또한, Cui 등(Cui et al, Curr Pharm Des. 12(35):4591-600 (2006))은 소화관 내에서 발현된 T1R들이 인공 감미제뿐만 아니라 비만 및 당뇨병을 치료하는데 있어 화합물에 대한 분석법에 사용될 수 있다는 것을 제시한다.
하지만, 보고되어 온 것과 T2R 구성원들이 쓴맛을 조절한다는 것을 이해하는 것, 및 이들의 위장 기능에서의 가능한 역할에도 불구하고, 인간 T2R 쓴맛 수용체를 활성화시키는 특정 리간드를 확인할 필요가 있다. 상이한 T2R들, 특히 인간 T2R들의 결합 특성을 보다 더 이해하는 것이 매우 유익한데, 이는 바람직한 미각 조절 특성, 즉 특정 쓴맛 성분의 맛을 차단 또는 억제하는 화합물을 선별하는데 있어서 이의 용도를 훨씬 더 용이하게 할 것이기 때문이다. 또한, 이는 위장 기능 및 비만, 당뇨병, 식품 섭취, 식품 감지, 섭식 장애와 같은 관련 질병의 치료 및 조절용 화합물의 확인과 GLUT2, 콜레시스토킨 등과 같은 관련 호르몬 및 펩타이드의 조절을 제공할 것이다.
발명의 요약
그 목적을 위해, 본 발명은, hT2R8 및 hT2R14 가 커피의 쓴맛 풍부 분획에 의해 활성화되는 발견에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 커피와 커피 관련 식품, 음료 및 의약의 쓴맛을 억제 또는 차단하는 hT2R8 및 hT2R14에 대한 길항물질의 확인을 위한 이의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 커피 및 다른 커피맛 식품, 음료 및 의약의 쓴맛을 억제하는 특이적 길항물질 (쓴맛 차단제) 화합물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 넓은 쓴맛 길항물질 특성을 갖는 리간드의 발견에 관한 것이다, 즉, 그것은 쓴맛 리간드의 다양한 세트에 의해 많은(13개) 상이한 쓴맛 수용체의 활성을 감지할 수 있을 정도로 차단 또는 억제하고, 상호작용하는 쓴맛 수용체(들)가 아직까지 명료하지 않은 일부 쓴맛 화합물에 의해 유도된 쓴맛을 억제할뿐만 아니라 6개의 다른 쓴맛 수용체의 활성을 차단 또는 억제한다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 넓은 쓴맛 길항물질 특성을 갖는 화합물 C 로 불리는 리간드의 발견에 관한 것이다, 즉, 그것은 쓴맛 리간드의 다양한 세트에 의해 hT2R3, 7, 10, 14, 16, 44, 51, 55, 61, 63, 64, 65 및 71 쓴맛 수용체의 활성을 감지할 수 있을 정도로 차단 또는 억제하고, 상호작용하는 쓴맛 수용체(들)가 아직까지 명료하지 않은 일부 쓴맛 화합물에 의해 유도된 쓴맛을 억제할뿐만 아니라 6개의 다른 쓴맛 수용체, 즉 hT2R5, 9, 13, 54, 67 및 75의 활성을 차단 또는 억제한다.
또한, 더욱 구체적으로, 본 발명은, 이러한 길항물질 화합물이 hT2R16 길항물질인 살리신 및 hT2R51 작용물질인 페닐티오우레아의 쓴맛을 감소시킨다는 발견을 제공한다.
또한, 더욱 구체적으로, 본 발명은, 이러한 동일한 길항물질 화합물이 hT2R10, 14 및 75 을 활성화시키는 화합물인 오메프라졸 및 적어도 7개의 쓴맛 수용체를 활성화시키는 천연 감미제인 레바우디오사이트 A 를 포함하는 다수의 쓴맛 수용체를 활성화시키는 쓴맛 화합물에 의해 유도된 쓴맛을 차단하고; 이러한 동일한 길항물질 화합물은 덱스트로메트로판 및 디펜히드라민을 포함하는, 상호작용하는 쓴맛 수용체(들)이 공지되어 있지 않은 쓴맛 화합물에 의해 유도된 쓴맛을 억제한다는 발견을 제공한다.
이를 근거로 하여, 본 발명은 미확인 쓴맛 리간드 또는 화합물에 의해 유도된 쓴맛을 포함하는 쓴맛을 완화하기 위한, 식품, 음료, 의약 및 다른 섭취될 수 있는 것에서 본 발명의 화합물 및 이와 관련된 화합물의 용도에 관한 것이고, 여기서, 쓴맛은 다수의 쓴맛 수용체 또는 쓴맛 화합물의 활성을 수반하고, 상기 수용체 특이성은 미확인되어 있다.
또한, 본 발명은 쓴맛을 억제 또는 차단하는데 충분한, 적어도 하나의 확인된 쓴맛 길항물질 화합물을 함유하는 식품, 음료 및 의약에 관한 것이다.
본 발견은 특이적 쓴맛 리간드의 의 존재 및 부재에서 특정 T2R 를 발현시키는 세포를 사용하여 T2R 의 활성을 측정한 세포 기반 분석을 사용하여 행해졌다. 특히, 아래에 아주 상세히 기재된 바와 같이, 표면 상에 상기 특이적 T2R 를 발현시키고 상기 T2R 를 기능적으로 연결하는 키메라 G 단백질을 추가 발현시킨 HEK 세포주는 세포내 칼슘 농도의 변화를 검출한 세포 기반 분석에 사용되었고, 특이적 쓴맛 화합물에 의해 특이적으로 활성화된 것이 발견되고, 반면에, 다른 hT2R 은 유사한 조건 하에서 활성화되지 않았다.
따라서, 본 발명은 커피 및 관련 식품 및 음료에 존재하는 이들 및 다른 쓴맛 화합물에 의해 이들 수용체의 활성을 조절, 바람직하게는 차단하는 다른 화합물을 확인하기 위한, 분석, 바람직하게는 고효율 분석에서의 이들 인간 미각 수용체의 용도를 포함한다.
또한, 본 발명은 화합물, 특히 쓴맛을 유도하는 커피와 커피맛 식품, 음료 및 의약에 존재하는 화합물을 확인하기 위한 이들 수용체의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 시험관내 분석 및 생체내 미각 테스트에 사용하기 위한, 넓은 범위의 길항물질 특성을 갖는 길항물질 화합물의 용도에 관한 것으로서, 이 화합물이 유도된 쓴맛을 억제하고/하거나 쓴맛 화합물을 함유하는 쓴맛 화합물 또는 분획에 의한 하나 이상의 쓴맛 수용체의 활성을 억제하는 쓴맛 화합물(들) 또는 쓴맛 분획을 확인한다.
또한, 본 발명은 인간 또는 동물이 섭취하는 식품, 음료, 의약 및 다른 소비 제품에서의 널리 작용하는 길항 물질의 용도에 관한 것으로서, 여기서, 쓴맛은 바람직하게는 완화된다.
본 발명은 또한 인간 또는 다른 미각 테스트에서 확인된 조절 화합물의 효과를 평가하고 특히, 쓴맛, 특히 커피, 및 쓴맛 감지를 유도하는 하나 이상의 화합물을 함유하는, 커피로부터 유래된 분획에 의해 유도된 쓴맛에 대한 확인된 화합물의 효과를 평가하는 추가적인 단계를 포함하는 분석방법을 포함한다.
또한, 본 발명은 쓴맛 수용체, 예를 들어 쓴맛 화합물의 양을 제거 또는 감소시키기 위해 가공된 식품 및 음료를 특이적으로 활성화시키는 화합물을 제거하기 위해 처리된 커피와 커피맛 식품, 음료 및 의약의 제조방법을 포함한다.
어떤 측면에서, 본 발명은 또한 하기에 주어진 2개의 골격으로 표시되는 화합물의 구조적 클래스에 관한 것이다. 골격 1 은 대표적인 우라졸 골격을 나타내고 골격 2 은 대표적인 히단토인 골격을 나타낸다.
Figure 112010017594708-pct00001
본 발명의 다른 특정 목적은 T2R8 수용체에 의해 매개되는 식품/약학적 적용, 특히 커피와 커피맛 식품, 음료 및 의약에서 쓴맛을 감소시키기 위해 쓴맛 차단제로서 상기에 나타낸 화합물, 및 골격 1 및 골격 2 의 유사체를 사용하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 확인된 화합물이 인간 또는 동물 미각 테스트, 바람직하게는 인간 미각 테스트에서 커피와 커피맛 식품, 음료 및 의약에 의해 유도된 쓴맛을 조절, 바람직하게는 억제 또는 차단한다는 것을 확인하는 것이다. 실시예 1 은 이들 화합물 중의 하나에 대한 대표적인 감각 데이터를 보여준다. 상기 데이터는 특이적 T2R8 작용물질에 대한 쓴맛의 상당한 감소 및 공지된 T2R8 쓴맛 차단제에 대한 효능의 상당한 증가를 명확히 증명하고 있다.
본 발명의 다른 목적은 미각 수용체를 특이적으로 활성화시키는 화합물에 의해 유도된 쓴맛을 억제 또는 차단하기 위해 조성물 중 첨가제 또는 풍미 조절제로서 기재된 화합물을 이용하는 것이다. 본 발명의 바람직한 목적은 커피와 커피맛 식품, 음료 및 의약에 존재하는 화합물의 쓴맛을 차단하기 위해 T2R8 수용체의 활성을 억제하는 화합물을 사용하는 것이다.
본 발명에 따라 확인된 화합물은 커피에 존재하는 쓴맛 화합물 및 관련 식품, 음료 및 의약 또는 구조적으로 관련된 화합물 또는 다른 쓴맛 화합물, 예를 들어 쓴맛 감지를 유도하는 식품 및 음료 또는 의약 또는 화장품에 발견된 화합물에 의한 hT2R8 의 활성에 의해 유발된 쓴맛을 조절, 바람직하게는 차단하기 위해 식품, 음료, 화장품 또는 의약 조성물에 첨가될 수 있다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 커피와 커피맛 식품, 음료 및 의약과 관련된 쓴맛을 유도 또는 차단하는 화합물 및 이를 함유하는 조성물을 확인하는 hT2R8 및/또는 hT2R14 및 키메라 및 이의 변이체를 사용하는 분석방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 특정 목적은 커피 쓴맛에 대해 책임 있는 화합물 또는 이를 함유 화합물에의 hT2R8 의 결합 및/또는 활성화를 차단 또는 조절하는 화합물을 확인하는 분석방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 특정 목적은 커피 쓴맛에 대해 책임 있는 화합물 또는 이를 함유 화합물에의 hT2R14 의 결합 및/또는 활성화를 차단 또는 조절하는 화합물을 확인하는 분석방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 특정 목적은 창의적인 분석을 사용하여 확인된 특정 조성물 및 특히 커피와 커피맛 식품, 음료 및 의약을 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 특정 목적은 커피의 쓴맛을 차단하기 위해 제시되었던 T2R8 및 T2R14 길항물질인 하기의 화합물을 제공하는 것이다.
Figure 112010017594708-pct00002
본 발명의 다른 특정 목적은 T2R8 및/또는 T2R14 수용체, 특히 커피와 커피맛 식품, 음료 및 의약에 의해 전달되는 음식/약제학적 응용에서 쓴맛을 감소시키기 위해 쓴맛 차단제로서 상기의 화합물 및 화합물 A, 화합물 B 및 화합물 C의 유사체를 사용하는 것이다.
본 발명의 다른 특정 목적은 인간 T2R3, 7, 10, 14, 16, 44, 51, 55, 61, 63, 64, 65, 또는 71 및/또는 인간 T2R5, 9, 13, 54, 67 또는 75 중 어떤 것에 의해 전달되는 음식/약제학적 응용에서, 특히 다수의 쓴맛 화합물, 다수의 쓴맛 수용체와 상호작용하는 쓴맛 화합물, 또는 미공지 쓴맛 화합물 또는 수용체 특이성이 공지되지 않은 쓴 화합물을 함유하는 조성물을 함유하는 식품, 음료 및 의약에서 쓴맛을 감소시키기 위해 널리 작용하는 쓴맛 차단제로서 화합물 C 및 이의 유사체를 사용하는 것이다.
본 발명의 다른 특정 목적은 하기 화학식에 의해 표시될 수 있는 화합물을 제공하는 것이다.
첫 번째 측면에서, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
[화학식 I]
Figure 112010017594708-pct00003
상기 화학식에서,
Ar1 은 5원 또는 6원 아릴, 헤테로아릴 또는 사이클로알킬 환이고;
m 은 0, 1, 2 또는 3 이고;
R1 는 SO2; C=O; C=S 또는 C=NOR4 이고;
X 는 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각 R1'은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나; 또는
X 및/또는 적어도 하나의 R1'은 이들이 결합하고 있는 원자와 함께 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로헤테로알킬 또는 치환된 사이클로헤테로알킬 환을 형성하고, 여기서, 환은 다른 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로헤테로알킬 또는 치환된 사이클로헤테로알킬 환으로 임의로 융합되고;
R4 내지 R8은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬 및 치환된 헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R5 및 R6, R6 및 R7, R7 및 R8 은 이들이 결합하고 있는 원자와 함께 사이클로헤테로알킬 또는 치환된 사이클로헤테로알킬 환을 형성하고;
A 및 B 는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
b 는 0, 1, 또는 2 이다.
어떤 구현예에서, A 및 B 는 이들이 부합하는 질소원자와 함께 추가 치환 또는 비치환된 환과 융합될 수 있고 적어도 하나의 이중결합을 포함할 수 있는 환을 형성한다. 그와 같은 환의 비제한적인 예는 하기 화학식을 갖는 기를 포함한다:
Figure 112010017594708-pct00004
두 번째 측면에서, 본 발명은 하기에 표시된 화학식 (II)의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
[화학식 II]
Figure 112010017594708-pct00005
상기 화학식에서,
Ar1, Ar2 및 Ar3 은 독립적으로 5원 또는 6원 아릴, 헤테로아릴, 또는 사이클로알킬 환이고;
m 은 0, 1, 2 또는 3 이고;
n 및 p 는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4 이고;
r 및 t 는 독립적으로 0,1 또는 2 이고;
Y 및 Z 는 CR6R7, C=O, C=S, C=NOR6, O, NR6, 및 S(O)b 로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R1 은 SO2, C=O, C=S, 및 C=NOR4 로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
X 는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, -OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
X 는 수소, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, S(O)bR6, CONR6R7, -CO2R6, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
각 R1'은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각 R2'은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), 및 P(O)(OR5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각 R3'은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나; 또는
X 및/또는 적어도 하나의 R1'은 이들이 결합하고 있는 원자와 함께 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로헤테로알킬 또는 치환된 사이클로헤테로알킬 환을 형성하고, 여기서 환은 다른 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로헤테로알킬 또는 치환된 사이클로헤테로알킬 환에 임의로 융합되고;
R4 내지 R8 은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬 또는 치환된 헤테로아릴알킬이거나, 또는 R5 및 R6, R6 및 R7, R7 및 R8 은 이들이 결합하고 있는 원자와 함께 사이클로헤테로알킬 또는 치환된 사이클로헤테로알킬 환을 형성하고;
b 는 0, 1, 또는 2 이다.
다른 측면에서, 본 발명은 하기에 표시된 화학식 (III)의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
[화학식 III]
Figure 112010017594708-pct00006
상기 화학식에서,
Ar1, Ar2 및 Ar3 은 독립적으로 5원 또는 6원 아릴, 헤테로아릴, 또는 사이클로알킬 환이고, Ar2 및 Ar3 는 임의로 제외될 수 있고;
m 은 0, 1, 2 또는 3 이고;
n 및 p 는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4 이고;
각 R1'은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각 R2'은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각 R3'은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R5 내지 R8 은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬 또는 치환된 헤테로아릴알킬이거나, 또는 R5 및 R6, R6 및 R7, R7 및 R8 은 이들이 결합하고 있는 원자와 함께 사이클로헤테로알킬 또는 치환된 사이클로헤테로알킬 환을 형성하고;
b 는 0, 1, 또는 2 이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 구조의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
Figure 112010017594708-pct00007
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 구조의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
Figure 112010017594708-pct00008
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명은 하기 구조의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
Figure 112010017594708-pct00009
관련 측면에서, 화학식 (IV)의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
[화학식 IV]
Figure 112010017594708-pct00010
상기 화학식에서,
Ar4 및 Ar5 는 독립적으로 5원 또는 6원 아릴 또는 헤테로아릴 환이고;
W 는 CR6R7, C=O, C=S, C=NOR6, O, NR6, S, SO, SO2, 및 (CH2)n 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
n 은 0, 1, 2, 또는 3 이고;
G 는 CR6R7, C=O, C=S, C=NOR6, 및 S(O)b 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R20 은 수소, 아릴알케닐, 헤테로아릴알케닐, 아릴알킬, 헤테로아릴알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬, 알콕시-알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 치환된 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R21 은 아릴알케닐, 헤테로아릴알케닐, 아릴알킬, 헤테로아릴알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬, 알콕시-알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 치환된 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R6 및 R7 은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬 또는 치환된 헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R6 및 R7 은 이들이 결합하고 있는 원자와 함께 사이클로헤테로알킬 또는 치환된 사이클로헤테로알킬 환을 형성하고,
b 는 0, 1, 또는 2 이다.
다른 관련 측면에서, 화학식 (V)의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
[화학식 V]
Figure 112010017594708-pct00011
상기 화학식에서,
Ar4 및 Ar5 는 독립적으로 5원 또는 6원 아릴 또는 헤테로아릴 환이고;
n 은 0, 1, 2, 또는 3 이고;
R21 은 아릴알케닐, 헤테로아릴알케닐, 아릴알킬, 헤테로아릴알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬, 알콕시-알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 치환된 유도체로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R35 는 수소, 알킬, 및 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
한층 추가적인 구현예에서, 본 발명은 화학식 (VI)의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
[화학식 VI]
Figure 112015024725280-pct00509
상기 화학식에서,
R30 은 아릴알케닐, 헤테로아릴알케닐, 아릴알킬, 헤테로아릴알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬, 알콕시-알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 치환된 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R35 는 수소, 알킬, 및 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한층 추가적인 구현예에서, 본 발명은 하기 구조의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
Figure 112015024725280-pct00510
상기 화학식에서,
각 R 은 독립적으로 Cl, MeO, CN, EtO, OH, Me, -SO2Me, F, 또는 H 이고,
n 은 0, 1, 2, 3 또는 4 이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 구조의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
Figure 112015024725280-pct00511
상기 화학식에서,
각 R 은 독립적으로 MeO 또는 OH 이고, n 은 0, 1, 2, 3 또는 4 이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 구조의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
Figure 112015024725280-pct00512

Figure 112015024725280-pct00513
상기 화학식에서, R 은 H, Me, Et, OCOMe, CH2OH, OMe, 또는 Ph 이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 구조의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
Figure 112015024725280-pct00514
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 구조의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
Figure 112015024725280-pct00515
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 구조의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
Figure 112015024725280-pct00516
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명은 하기 구조의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
Figure 112015024725280-pct00517
하나의 측면에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드 또는 프로드러그(prodrug)에 관한 것이다:
Figure 112010017594708-pct00020
상기 화학식에서,
Ar6 및 Ar7은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 5원 또는 6원 아릴 기 또는 5원 또는 6원 헤테로아릴 기이고;
Alk는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
R36 및 R37은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 H, 또는 알킬이거나, 또는 R36 및 R37은 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 임의 치환된 5원 또는 6원 헤테로사이클을 형성하고;
R38 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이다.
하나의 측면에서, 본 발명의 화합물은 5원 헤테로사이클을 함유한다. 하나의 구현예에서, 5원 헤테로사이클은 히단토인 또는 치환 또는 비치환 사이클릭 우레아이다.
하나의 구현예에서, 히단토인은 하기 화학식의 히단토인 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드 또는 프로드러그이다:
Figure 112010017594708-pct00021
상기 화학식에서,
Ar6 및 Ar7 은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 5원 또는 6원 아릴 기 또는 5원 또는 6원 헤테로아릴 기이고;
Alk 는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
R38 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이고;
R39 및 R40 은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 할로알킬이거나, 또는 R39 및 R40 은 이들이 부착되어 있는 탄소원자와 함께 C=O 기 또는 치환 또는 비치환된 알케닐 기를 형성한다.
다른 측면에서, 본 발명의 화합물은 우라졸인 5원 헤테로사이클을 함유한다. 하나의 구현예에서, 우라졸은 하기 화학식의 우라졸 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드 또는 프로드러그이다:
Figure 112010017594708-pct00022
상기 화학식에서,
Ar6 및 Ar7 은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 5원 또는 6원 아릴 기 또는 5원 또는 6원 헤테로아릴 기이고;
Alk 는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
R38 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이고;
R41 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이다.
다른 측면에서, 본 발명의 화합물은 6원 헤테로사이클을 함유한다. 하나의 구현예에서, 6원 헤테로사이클은 하기 화학식의 6원 헤테로사이클 또는 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드 또는 프로드러그이다:
Figure 112010017594708-pct00023
상기 화학식에서,
R38 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이고;
R42, R43, R44, R45, 및 R46 는 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬이거나, 또는 R42 및 R43, 또는 R45 및 R46 는 이들이 부착되어 있는 탄소원자와 함께 C=O 기를 형성한다.
다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드 또는 프로드러그에 관한 것이다:
Figure 112010017594708-pct00024
상기 화학식에서,
Alk 는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
M1 은 N 또는 CR49 이고, 여기서, R49 는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
M2 은 N 또는 CR50 이고, 여기서, R50 는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
R36 및 R37 은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 H, 알킬이거나, 또는, R36 및 R37 는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 임의 치환된 5원 또는 6원 헤테로사이클을 형성하고;
R38 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이고;
R47 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이고;
R48 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드 또는 프로드러그에 관한 것이다:
Figure 112010017594708-pct00025
상기 화학식에서,
Alk 는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
T1 는 C=O 이고, Q 는 CR51R52 또는 NR51 이고, 여기서, R51 및 R52 은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 할로알킬이거나, 또는 R51 및 R52 은 이들이 부착되어 있는 탄소원자와 함께 C=O 기 또는 치환 또는 비치환된 알케닐 기를 형성하고;
M1 은 N 또는 CR49 이고, 여기서, R49 는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
M2 은 N 또는 CR50 이고, 여기서, R50 는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
R38 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이고;
R47 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이고;
R48 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드 또는 프로드러그에 관한 것이다:
Figure 112010017594708-pct00026
Figure 112010017594708-pct00027
Figure 112010017594708-pct00028
Figure 112010017594708-pct00029
다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드 또는 프로드러그에 관한 것이다:
Figure 112010017594708-pct00030
Figure 112010017594708-pct00031
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드 또는 프로드러그에 관한 것이다:
Figure 112010017594708-pct00032
상기 화학식에서,
Alk 는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
T2 는 C=S, C=O, 또는 S(O)2 이고;
R53 은 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 아릴알킬이고;
M1 은 N 또는 CR54 이고, 여기서, R54 는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
M2 은 N 또는 CR55 이고, 여기서, R55 는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
R56 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이고;
R57 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이고;
상기 방법은 화학식
Figure 112010017594708-pct00033
(여기서, R56, R57, 및 Alk 는 상기에서 정의한 바와 같고, J 는 이탈기이다)의 화합물을 화학식
Figure 112010017594708-pct00034
(여기서, M1 및 M2 는 상기에서 정의한 바와 같다)의 화합물과 반응시켜 NO2 기를 갖는 화학식
Figure 112010017594708-pct00035
의 화합물을 얻고;
NO2 기를 환원시켜서 NH2 기를 갖는 화합물을 얻고;
NH2 기를 갖는 화합물을 화학식
Figure 112010017594708-pct00036
(여기서, J2 는 이탈기이고, T2 및 R53 는 상기에서 정의한 바와 같다)의 화합물과 반응시키는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드 또는 프로드러그에 관한 것이다:
Figure 112010017594708-pct00037
상기 화학식에서,
Alk 는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
R51 및 R52 은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 할로알킬이거나, 또는 R51 및 R52 는 이들이 부착되어 있는 탄소원자와 함께 치환 또는 비치환된 알케닐 기를 형성하고;
M1 은 N 또는 CR49 이고, 여기서, R49 는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
M2 은 N 또는 CR50 이고, 여기서, R50 는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
R38 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이고;
R47 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이고;
R48 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이고;
상기 방법은 화학식
Figure 112010017594708-pct00038
(여기서, R47, R48, Alk, M1, 및 M2 는 상기에서 정의한 바와 같다)의 화합물을 가열하여 -CON3 기를 -N=C=O 기로 전환시킨 다음, 화학식
Figure 112010017594708-pct00039
(여기서, J3 는 이탈기이고, R38, R51, 및 R52 는 상기에서 정의한 바와 같다)의 화합물과 반응시킴을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드 또는 프로드러그의 제조 방법에 관한 것이다:
Figure 112010017594708-pct00040
상기 화학식에서,
Alk 는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
R52 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 할로알킬이고;
M1 은 N 또는 CR49 이고, 여기서, R49 는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
M2 은 N 또는 CR50 이고, 여기서, R50 는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
R38 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이고;
R47 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이고;
R48 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이고;
상기 방법은 화학식
Figure 112010017594708-pct00041
(R47, R48, Alk, M1, 및 M2 는 상기에서 정의한 바와 같다)의 화합물을 가열하여 -CON3 기를 -N=C=O 기로 전환시킨 다음, 화학식
Figure 112010017594708-pct00042
(R38 는 상기에서 정의한 바와 같다)의 히드라진과 반응시킴을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, 또는 N-옥사이드의 제조 방법에 관한 것이다:
[화학식 III]
Figure 112010017594708-pct00043
상기 화학식에서,
Ar1, Ar2 및 Ar3 은 독립적으로 5원 또는 6원 아릴, 헤테로아릴, 또는 사이클로알킬 환이고, Ar2 및 Ar3 는 임의로 제외될 수 있고;
m 은 0, 1, 2 또는 3 이고;
n 및 p 는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4 이고;
각 R1'은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각 R2'은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각 R3'은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R5 내지 R8 은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬 또는 치환된 헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R6 및 R7, R7 및 R8 은 이들이 결합하고 있는 원자와 함께 사이클로헤테로알킬 또는 치환된 사이클로헤테로알킬 환을 형성하고;
b 는 0, 1, 또는 2 이고;
상기 방법은 화학식
Figure 112010017594708-pct00044
(여기서, J 는 이탈기이다)의 화합물을 화학식
Figure 112010017594708-pct00045
의 화합물과 반응시켜서 생성물을 얻고;
상기 생성물을 화학식
Figure 112010017594708-pct00046
(여기서, J 는 이탈기이다)의 화합물과 반응시킴을 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은 이러한 미각 수용체를 특이적으로 활성화시키는 화합물에 의해 생기는 쓴맛을 억제 또는 차단하기 위하여, 본 명세서에 기재된 분석에서 확인된 화합물을 첨가제 또는 향미 조절제로 조성물에 이용하는 것이다. 본 발명의 바람직한 목적은 커피와 커피맛 식품, 음료 및 의약에 존재하는 화합물의 쓴맛을 차단하기 위하여, 상기 확인된 인간 T2R 수용체 중 적어도 하나의 활성화를 억제하는 화합물을 사용하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 hT2R8 미각 수용체를 특이적으로 활성화시키는 성분, 다수의 쓴맛 수용체를 활성화시키는 리간드, 알려지지 않은 수용체 특이성을 갖는 쓴맛 화합물 또는 알려지지 않은 또는 다수의 쓴맛 화합물을 함유하는 조성물에 의해 생기는 쓴맛을 억제 또는 차단하기 위하여, 본 발명의 화합물을 광범위하게 작용하는 쓴맛 차단제로서 이용하는 것이다. 일 실시예에 있어서, 본 발명의 화합물은 적어도 하나의 상기 확인된 인간 T2R 수용체의 활성화를 억제함으로써 커피와 커피맛 식품, 음료 및 의약에 존재하는 화합물의 쓴맛을 차단하기 위해 이용된다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 확인된 화합물이 예를 들어 인간 또는 동물 미각 시험, 바람직하게는 인간 미각 시험에서 커피와 커피맛 식품, 음료 및 의약에 의해 생긴 쓴맛을 조절, 바람직하게는 억제 또는 차단한다는 것을 확인하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이러한 미각 수용체를 특이적으로 활성화시키는 화합물에 의해 생긴 쓴맛을 억제 또는 차단하기 위하여, 본 명세서에 기재된 분석에서 확인된 화합물을 첨가제 또는 향미 조절제로 조성물에 이용하는 것이다. 본 발명의 바람직한 목적은 커피와 커피맛 식품, 음료 및 의약에 존재하는 화합물의 쓴맛을 차단하기 위하여, 상기 확인된 인간 T2R 수용체 중 적어도 하나의 활성화를 억제하는 화합물을 사용하는 것이다.
특히 바람직한 실시예에 있어서, hT2R3, 7, 10, 14, 16, 44, 51, 55, 61, 63, 64, 65, 71 및/또는 hT2R5, 9, 13, 54, 67 및 75 미각 수용체를 특이적으로 활성화시키는 화합물, 다수의 쓴맛 수용체를 활성화시키는 리간드, 알려지지 않은 수용체 특이성을 갖는 쓴맛 성분들 또는 알려지지 않은 또는 다수의 쓴맛 화합물을 함유하는 조성물에 의해 생긴 쓴맛을 억제 또는 차단하기 위하여, 화합물 C 및 이의 유사체가 광범위하게 작용하는 쓴맛 차단제로서 사용된다. 화합물 C의 광범위한 길항 특성을 고려해 볼 때, 이는 가장 쓴 화합물 및 이를 함유하는 조성물의 쓴맛을 실질적으로 약화시켜야 한다. 본 발명의 바람직한 목적은 커피와 커피맛 식품, 음료 및 의약에 존재하는 화합물의 쓴맛을 차단하기 위하여, 화합물 C 및 이의 유사체와 같이 상기 확인된 인간 T2R 수용체 중 적어도 하나의 활성화를 억제하는 화합물을 사용하는 것이다.
도 1은 본 명세서에 참조로 통합된 출원인의 이전 특허 출원들에 기재된 바와 같이 일시적으로 형질감염된 HEK 세포들에서 25개의 인간 T2R들을 탐색하기 위하여, 커피로부터의 부분적으로 정제된 쓴맛 분획을 사용한 실험에 관한 것이다. 도 1에 나타난 바와 같이, 상기 커피 분획은 칼슘 이미지 분석에서 hT2R8 및 hT2R14로 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포들을 활성화시켰다. 상기 커피 분획의 형광 수준을 감소시키기 위하여 청색 염료 FD&C가 사용되었고, 이들은 분석을 간섭하였다.
도 2는 커피 유래의 쓴맛 분획에 대한 hT2R8 및 hT2R14의 용량-의존적 반응을 보여주는 △F/F 대 로그(log) 커피 분획의 그래프이다. 상기 분석은 hT2R8 및 hT2R14 안정 세포주 및 자동화된 형광 검출기 FLIPR을 이용하여 수행하였다.
도 3은 hT2R8 활성의 백분율 억제 대 화합물의 농도의 로그의 그래프로서, 안정적인 hT2R8 발현 세포주에서 화합물 A 및 B에 대한 용량-의존적 억제를 보여준다.
도 4는 hT2R8 활성의 백분율 억제 대 화합물 C의 농도의 로그의 그래프로서, 안정적인 hT2R8 발현 세포주에서 화합물 C에 대한 용량-의존적 억제를 보여준다.
도 5는 상이한 (2) 인간 쓴맛 수용체에 대한 화합물 C의 억제 활성을 나타낸다.
도 6은 사카린 농도의 로그의 기능으로서의 수용체 활성의 그래프이다. 도 6은 용량-반응 관계와 hT2R43, hT2R44 및 hT2R8의 변이체(variant)들을 발현하는 형질감염 세포에서의 수용체 활성에 대한 사카린의 영향을 보여준다. hT2R8은 "미각감별사(taster)"인 hT2R43-W35 및 hT2R44-W34 대립유전자(allele)보다 시험관내(in vitro) 분석에서 사카린에 대한 반응성이 낮았지만, "비-미각감별사(non-taster)"인 hT2R43-S35 및 hT2R44-R35 대립유전자보다 더 반응한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 화합물은 조성물, 예를 들어 섭취가능한 조성물의 쓴맛을 약화시키거나 감소시키는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "섭취가능한 조성물(ingestible composition)"은 단독으로 또는 다른 물질과 함께 경구 소비되고자 하는 임의의 물질을 포함한다. 상기 섭취가능한 조성물은 "식품 또는 음료 제품" 및 "비-식용 제품" 모두를 포함한다. "식품 또는 음료 제품"은 고체, 반고체 또는 액체(예를 들어, 음료)를 포함하는, 인간이나 동물에 소비되고자 하는 식용 제품을 의미한다. 용어 "비-식용(non-edible) 제품" 또는 "비-식용(noncomestible) 조성물"은 보충물(supplement), 기능식품(nutraceutical), 기능성 식품(예를 들어 영양소를 공급하는 기본적인 영양학적 기능을 넘어 건강-증진 및/또는 질병-예방 특성을 갖는다고 주장하는 임의의 신선 또는 가공 식품), 조제약 및 일반 의약품(over the counter), 치약(dentifice) 및 구강청결제와 같은 구강 케어 제품, 립밤과 같은 화장품 및 기타 개인 관리 제품들을 포함한다.
상기 섭취가능한 조성물은 또한 약제학적, 의학적 또는 식용 조성물을 포함하며, 또는 대안적으로 제형, 예를 들어 약제학적 또는 의학적 제형 또는 식품 또는 음료 제품 또는 제형을 포함한다.
본 발명의 화합물은 또한 단독으로 또는 알려져 있거나 후에 발견될 임의의 섭취가능한 조성물과 함께 조합되어 제공될 수 있다. 예를 들어, 상기 섭취가능한 조성물은 식용 조성물 또는 비-식용 조성물일 수 있다. "식용 조성물"은 인간이나 동물에 의해 식품으로 소비될 수 있는 임의의 조성물을 의미하며, 고체, 젤, 페이스트, 포말성(foamy) 물질, 반-고체, 액체 또는 이의 혼합물을 포함한다. "비-식용 조성물(noncomestible composition)"은 식품이 아닌 것으로 인간 도는 동물에 의해 소비되거나 사용되고자 하는 임의의 조성물을 의미하며, 고체, 젤, 페이스트, 포말성 물질, 반-고체, 액체 또는 이의 혼합물을 포함한다. 상기 비-식용 조성물은 의학 조성물을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니며, 치료 목적을 위해 인간이나 동물에 의해 사용되고자 하는 비-식용 조성물을 의미한다. "동물"은 예를 들면 가축 및 애완동물과 같은 임의의 인간이 아닌 동물을 포함한다.
일 실시예에 있어서, 본 발명의 화합물은 보충물(supplement), 기능식품(nutraceutical), 기능성 식품(예를 들어 영양소를 공급하는 기본적인 영양학적 기능을 넘어 건강-증진 및/또는 질병-예방 특성을 갖는다고 주장하는 임의의 신선 또는 가공 식품), 조제약 및 일반 의약품(over the counter), 치약(dentifice) 및 구강청결제와 같은 구강 케어 제품, 립밤과 같은 화장품 및 기타 개인 관리 제품과 같은, 비-식용 조성물 또는 비-식용 제품에 첨가될 수 있다.
일반적으로, 처방전 없이 구입이 가능한(OTC) 제품 및 구강 위생 용품은 처방전 없이 및/또는 의학 교수에게 방문하지 않고 판매될 수 있는 가정용 및/또는 개인용 제품을 의미한다. OTC 제품의 예에는 비타민 및 영양제; 국소 진통제 및 마취제; 기침, 감기 및 알레르기 치료약; 항히스타민제 및/또는 알레르기 치료약제; 및 이의 조합을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비타민 및 영양제에는 비타민, 영양제, 토닉/병 영양 음료, 어린이 대상 비타민, 영양 보충제, 임의의 기타 영양 제품 또는 영양관련 제품 또는 영양 제공 제품, 및 이의 조합을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 국소 진통제 및/또는 마취제는 표재성(superficial) 또는 심재성(deep-seated) 아픔 및 통증, 예를 들어 근육통을 약화시키기 위해 사용되는 임의의 국소 크림/연고/젤; 티딩젤(teething gel); 진통 성분을 갖는 패취; 및 이의 조합을 포함한다. 기침, 감기 및 알레르기 치료약은 충혈제거제(decongestant), 기침 치료약, 인두(pharyngeal) 제제, 약용 과자(medicated confectionery), 항히스타민제 및 어린이 대상 기침, 감기 및 알레르기 치료약; 및 이의 조합을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 항히스타민제 및/또는 알레르기 치료약은 건초열(hay fever), 비알레르기(nasal allergy), 곤충 물림 및 쏘임에 대한 임의의 체계적 치료를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 구강 위생 용품의 예에는 구강 세정 스트립(strip), 치약, 치솔, 구강세정제(mouthwash)/치아 린스, 의치(denture) 관리, 구강 청정제(mouth freshener), 가정용 치아 미백제(at-home teeth whitener) 및 치실을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 실시예에 있어서, 본 발명의 화합물은 식품이나 음료 제품 또는 제제에 첨가될 수 있다. 식품 및 음료 제품 또는 제형의 예에는 식용 제품을 위한 코팅, 설탕입힘(frosting) 또는 윤내기(glaze), 또는 스프류, 건조 가공 식품류, 음료류, 즉석 식품(ready meal)류, 캔 또는 보존 식품류, 냉동 가공 식품류, 냉장 가공 식품류, 스낵 식품류, 구운 제품류, 과자류, 낙농품류, 아이스크림류, 대체식량류, 파스타 및 국수류 및 소스, 드레싱, 조미료류, 아기 식품류, 및/또는 스프레드류에 포함된 임의의 개체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일반적으로, 상기 스프류는 캔/보존, 건조, 인스턴트, 냉장, UHT 및 냉동 스프를 가리킨다. 본 정의를 위하여, 스프는 고기, 가금류, 생선, 야채, 곡물, 과일 및 기타 재료로부터 제조되어, 상기 재료들의 조각의 일부 또는 전부가 포함될 수 있는 액상으로 조리되는 식품을 의미한다. 스프는 맑거나(브로스(broth)로서) 진하고(차우더(chowder)로서), 부드럽고, 퓨레 또는 덩어리가 든(chunky), 즉시 제공되는, 반 농축 또는 농축일 수 있으며, 식사 중 처음 코스로 또는 메인 코스로 또는 간식(음료와 같이 조금씩 마시는)으로 뜨겁게 또는 차갑게 제공될 수 있다. 스프는 다른 음식을 준비하기 위한 재료로 사용될 수 있고 브로스(콘소메)로부터 소스(크림 또는 치즈 기반 스프)의 범위일 수 있다.
"건조 및 요리(culinary) 식품류"는 일반적으로 (i) 제품, 소스 및 레시피 믹스(기술에 관계없이) 내 완제품 또는 성분으로 개별적으로 판매되는, 분말, 과립, 페이스트, 농축 부용, 압축된 큐브, 정제 또는 분말 또는 과립 형태의 부용 및 부용 유사 제품과 같은 조리 보조 제품들; (ii) 건조 스프 믹스를 포함하는 건조 및 냉동 건조 스프, 건조 인스턴스 스프, 건조 즉석 조리 스프, 파스타, 감자 및 쌀 음식을 포함하는 즉석 제조된 음식, 식사 및 단일 제공 앙트레(antree)의 건조 또는 앰비언트(ambient) 조제물과 같은 식사 해결 제품들(meal solution products); 및 (iii) 건조, 액상 또는 냉동이든 간에 완제품으로 또는 제품 내 성분으로 판매되는, 조미료, 양념장(marinade), 샐러드 드레싱, 샐러스 토핑, 딥(dip), 반죽(breading), 배터 믹스(batter mix, 튀김용 믹스), 상온 보관 가능한(shelf stable) 스프레드, 바베큐 소스, 액상 레시피 믹스, 농축액, 샐러드용 레시피 믹스를 포함하는 소스 또는 소스 믹스와 같은 식사 장식 제품들을 의미한다.
음료류는, 탄산 및 비탄산 음료, 알콜 및 비알콜 음료, 휴대용(ready to drink) 음료, 소다수와 같은 음료 제조를 위한 액상 농축 조제물, 및 건조 분말 음료 프리커서(precursor) 믹스를 포함하나 이에 제한되지 않는 일반적으로 음료, 음료 믹스 및 농축물을 의미한다. 상기 음료류는 또한 알콜 음료, 청량음료, 스포츠 음료, 이온음료 및 핫 드링크를 포함한다. 상기 알콜 음료는 맥주, 사이다/페리(배로 빚은 술), 향알코올음료(FAB), 포도주, 및 스피릿(spirits)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 청량음료는 콜라 및 비콜라 탄산음료와 같은 탄산음료; 쥬스, 넥타, 쥬스 음료, 과일향 음료와 같은 과일쥬스; 청량수(sparkling water), 샘물(spring water) 및 정제수/광천수(table water)를 포함하는 생수(bottled water); 스포츠, 에너지 또는 엘릭서제(elixir)를 포함하고, 탄산이거나 그대로일 수 있는 기능성 음료; 액상 및 분말 농축물과 같은 농축물을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 핫 드링크는 신선(예를 들어, 우려낸), 인스턴트, 혼합(combined), 액상, 휴대용, 용해도가 높은 건조 커피 음료, 커피 음료 믹스 및 농축물(시럽, 퓨어, 제형화 또는 분말 형태; "분말 형태"의 예는 모든 파우더 형태의 커피, 감미제 및 분말크림(whitener)을 포함하는 제품임); 홍차, 녹차, 백차(white tea), 우롱차 및 향차(flavored tea)와 같은 차; 및 향-, 맥아- 또는 식물-기반의 분말, 과립, 또는 우유 또는 물과 혼합된 블록 또는 정제를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
스낵식품류는 단맛과 짤짤한 맛의 스낵 및 스낵바(snack bar)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌, 일반적으로 가벼운 일상적인 식사가 될 수 있는 임의의 식품을 의미한다. 스낵 식품의 예에는 과일 스낵, 칩/크리습(crisp), 압출 스낵, 토틸라/옥수수칩, 팝콘, 프레첼(pretzel), 넛트 및 기타 단맛과 짭짤한 맛의 스낵을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 스낵바의 예에는 그라놀라(granola)/뮤즐리(muesli) 바, 아침식사용 바, 에너지바, 과일바 및 기타 스낵바가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
구운 제품류는 일반적으로 이의 제조과정이 열이나 과다한 햇빛에 노출되는 것을 포함하는 임의의 식용 제품을 의미한다. 구운 제품의 예에는 빵, 번(bun), 쿠키, 머핀, 시리얼, 토스터 페이스트리, 페이스트리, 와플, 토틸라, 비스켓, 파이, 베이글, 타르트(tart), 퀴치(quich), 케익, 임의의 구운 식품 및 이의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
아이스크림류는 일반적으로 크림과 설탕 및 향료를 함유하는 냉동 디저트를 의미한다. 아이스크림의 예에는 임펄스(impulse) 아이스크림; 테이크-홈 아이스크림; 프로즌 요구르트 및 아티서널(artisanal) 아이스크림; 대두, 오트, 콩(예를 들어, 적두 및 녹두), 및 쌀-기반의 아이스크림을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
과자류는 일반적으로 맛이 단 식용 제품을 의미한다. 과자류의 예에는 캔디, 젤라틴, 초콜릿 과자, 설탕 과자, 검 등과 이의 조합 제품이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
식사 대체류는 특히 건강이나 체형에 관심을 갖는 사람들을 위한 정상적인 식사를 대체하고자 하는 임의의 식품을 지칭한다. 식사 대체류의 예에는 슬리밍(slimming) 제품 및 요양(convalescence) 제품을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
즉석 식사류는 일반적으로 대대적인 준비나 가공없이 식사로 제공될 수 있는 임의의 식품을 지칭한다. 상기 즉석 식사류는 제조업체에 의해 첨부된 조리 "기술"을 갖는 제품을 포함하며, 이는 즉석도, 완성도 및 편의성이 높다. 즉석 식사의 예에는 캔/보존, 냉동, 건조, 냉장 즉석 식사; 디너 믹스(dinner mix); 냉동 피자; 냉장 피자; 및 가공된 샐러드를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
파스타 및 국수류는 캔, 건조 및 냉장/신선 파스타; 및 일반, 즉석, 냉장, 냉동 및 스낵 국수를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 파스타 및/또는 국수를 포함한다.
캔/보존 식품류는 캔/보존 고기 및 고기제품들, 생선/해산물, 야채, 토마토, 콩, 과일, 즉석 식사, 스프, 파스타, 및 기타 캔/보존 식품을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
냉동가공식품류는 냉동가공된 적색육(red meat), 가공 가금류, 가공 생선/해산물, 가공 야채, 육류 대체물, 가공 토마토, 베이커리 제품들, 디저트, 즉석 식사, 피자, 스프 국수 및 기타 냉동 식품을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
건조가공식품류는 쌀, 디저트 믹스, 건조 즉석 식사, 건조 스프, 즉석 스프, 건조 파스타, 일반 국수 및 즉석 국수를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
냉장가공식품류는 냉장가공육, 가공 생선/해산물 제품, 런치 키트(lunch kit), 신선 컷(cut) 과일, 즉석 식사, 피자, 가공 샐러드, 스프, 신선 파스타 및 국수를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
소스, 드레싱, 조미료(condiment)류는 토마토 페이스트와 퓨레, 부용(bouillon)/고형 육수(stock cube), 허브와 향신료(spice), 글루탐산나트륨(MSG), 테이블 소스, 콩 기반 소스, 파스타 소스, 웨트(wet)/쿠킹(cooking) 소스, 건조 소스/분말 믹스, 케찹, 마요네즈, 겨자, 샐러드 드레싱, 비네그레트(vinaigrette), 딥(dip), 피클 제품, 및 기타 소스, 드레싱 및 조미료를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
유아식품류는 우유- 또는 대두-기반의 유동식(formula); 및 가공, 건조 및 기타 유아식품을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
스프레드류는 잼과 설탕절임(preserve), 꿀, 초콜릿 스프레드, 넛트 기반의 스프레드, 및 효모 기반의 스프레드를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
낙농제품류는 일반적으로 포유동물의 젖으로부터 생산되는 식품을 지칭한다. 낙농제품류의 예에는 마시는 우유 제품, 치즈, 요구르트와 사우어 우유 음료(sour milk drink), 및 기타 낙농제품을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
식용 조성물(comestible composition), 특히 식음료 제품 또는 제형들의 또다른 예들이 다음과 같이 제공된다. 예시적인 식용 조성물은 하나 이상의 과자류, 초콜릿 과자, 정제류, 카운트라인(countline)류, 배그드(bagged) 셀프라인(selfline)/소프트라인(softline)류, 박스 포장류(boxed assortments), 일반 박스 포장류(standard boxed assortments), 꼬아서 감싼 미니어처(twist wrapped miniatures), 양념 초콜릿, 초콜릿 장난감, 알파요레(alfajores), 다른 초콜릿, 과자, 박하사탕, 보통 박하사탕, 파워 박하사탕, 눈깔 사탕, 향정, 껌, 젤리 및 껌, 토핑, 카라멜 및 너겟, 약성분 함유 과자, 롤리팝, 감초, 다른 설탕 과자, 껌, 츄잉껌, 설탕껌, 무설탕껌, 기능성껌, 풍선껌, 빵, 포장된/대량 생산 빵, 비포장된/장인제조 빵, 페스트리, 케익, 포장된/대량 생산 케익, 비포장된/장인제조 케익, 쿠키, 초콜릿 코팅 비스켓, 샌드위치 비스켓, 충진된 비스켓, 짭짤한 비스켓 및 크래커, 빵 대체식품, 조식용 시리얼, RTE (ready-to-eat) 시리얼, 가족 조식용 시리얼, 플레이크, 뮤즐리, 다른 RTE 시리얼, 어린이용 조식 시리얼, 핫 시리얼, 달고 짭짤한 스낵, 과일 스낵, 칩/크리스피, 압출 스낵, 토띨라/옥수수칩, 팝콘, 프레즐, 넛트, 다른 달콤 짭짤한 스낵, 스낵바, 그라놀라바, 조식용바, 에너지바, 과일바, 다른스낵바, 고기 대체 제품, 슬리밍 제품, 회복기 드링크, 즉석식품(ready meals), 캔 조리식품, 냉동 조리식품, 건조 조리식품, 냉장 조리식품, 디너 믹스, 디저트 믹스, 냉동 피자, 냉장 피자, 수프, 캔 수프, 건조스프, 인스턴트 스프, 냉장 스프, 냉동 스프, 파스타, 캔 파스타, 건조 파스타, 냉장/신선 파스타, 누들, 보통 누들, 인스턴트 누들, 냉동 누들, 컵/용기 인스턴트 누들, 파우치 인스턴트 누들, 냉장 누들, 스낵 누들, 푸드캔, 고기캔 및 고기 식품, 어류/해물캔, 야채캔, 토마토캔, 콩캔, 과일캔, 조미식품캔, 파스타캔, 다른 캔 식품, 냉동식품, 냉가공 붉은색 고기, 냉가공 가금류, 냉가공 어류/해물, 냉가공 야채, 냉동 고기 대체물, 냉동 포테이토, 오븐 베이트 포테이토칩, 다른 오븐 베이크 포테이토 식품, 비오븐 가공 포테이토, 냉동 베이커리 식품, 냉동 디저트, 다른 냉동 식품, 건조 식품, 냉장 가공 고기, 냉장 어류/해물 식품, 냉장 가공 어류, 냉장 코팅 어류, 냉장 훈제 어류, 냉장 런치 킷트, 냉장/신선 파스타, 냉장 누들, 오일 및 지방, 올리브 오일, 야채 및 씨 오일, 쿠킹 지방, 버터, 마아가린, 스프레드 오일 및 지방, 기능성 스프레드 오일 및 지방, 소스, 드레싱 및 조미료, 토마토 페이스트 및 퓨레, 부용/스톡 큐브, 스톡 큐브, 그레이비 그래뉼, 액상 스톡 및 폰드, 허브 및 스파이스, 발효 소스, 콩류 소스, 파스타 소스, 젖은 소스, 건조 소스/분말 믹스, 케첩, 마요네즈, 보통 마요네즈, 머스타드, 샐러드 드레싱, 보통 샐러드 드레싱, 저지방 샐러드 드레싱, 비니그레트(vinaigrettes), 딥(dip), 피클 식품(pickled products), 다른 소스류(other sauces), 드레싱류 및 조미료류, 스프레드류, 쨈류, 및 방부제, 꿀, 초콜릿 스프레드, 넛류 스프레드, 및 효모류 스프레드를 포함한다.
인간이나 동물에 의해 판명된 바와 같이, 또는, 제형 시험의 경우 당해 분야에서 일반적으로 알려진 과정을 통해 대다수의 패널, 예를 들어 8명의 인간 미각감별사(taster)에 의해 판명된 바와 같이, 본 발명의 화합물 없이 제조된 조성물과 비교시, 조성물과 관련된 쓴맛을 약화시키거나 줄이기 위하여, 전형적으로 조성물, 예를 들어 섭취가능한 조성물과 관련된 쓴맛을 약화시키거나 줄이기에 충분한 양이 상기 조성물에 첨가된다.
조성물 관련 쓴맛을 약화시키거나 감소시키기에 효과적인 본 발명의 성분의 농도는 식용 조성물의 특정 형태와 이의 다양한 기타 성분, 자연의 유전적 다양성과 개개의 선호도와 상기 조성물을 맛보는 다양한 인간의 건강 상태, 및 이러한 화학감각 화합물의 미각에 대한 특정 화합물의 주관적 효과를 포함하는 다양한 변수에 따라 물론 달라질 것이다. 몇몇 실시예에 있어서, 조성물과 관련된 쓴맛을 약화시키거나 감소시키는데 효과적인 본 발명의 화합물의 농도는 약 0.001 ppm 내지 약 100 ppm, 예를 들어, 약 0.1 ppm 내지 100 ppm, 약 1 ppm 내지 약 25 ppm, 약 1 ppm 내지 약 10 ppm, 약 0.1 ppm 내지 약 10 ppm, 약 0.01 ppm 내지 약 30 ppm, 약 0.05 ppm 내지 약 10 ppm, 약 0.01 ppm 내지 약 5 ppm, 약 0.02 ppm 내지 약 2 ppm, 또는 약 0.01 ppm 내지 약 1 ppm이다.
본 발명의 몇몇 실시예에 있어서, 조성물과 관련된 쓴맛을 약화시키거나 줄이기 위하여 본 발명의 하나 이상의 화합물의 혼합물이 사용될 것으로 고려된다. 상기 하나 이상의 화합물의 농도는 같거나 각 화합물의 농도는 다를 수 있다.
본 발명을 더 설명하기에 앞서, 하기 정의가 제공된다.
용어 "T2R" 패밀리는, (1) 약 30-40% 아미노산 서열 동일성(identity), 보다 상세하게는 약 25개의 아미노산, 최적으로 50-100개의 아미노산들의 윈도우 이상으로, 아래 및 본 명세서에 참고로 통합된 Zuker (Id) (2001) 및 Adler (Id.) (2001) 출원에 개시된 T2R과 약 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 가지며; (2) 아래에 개시된 T2R 서열 및 이의 보존적으로 변형된 변이체들로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 면역원(immunogen)에 의해 생성된 항체에 특이적으로 결합하고; (3) 엄격한 하이브리드화 조건하에서 아래에 개시된 T2R DNA 서열 및 이의 보존적으로 변형된 변이체들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열에 특이적으로 하이브리드화(적어도 약 100, 선택적으로 약 500-1000 뉴클레오타이드의 크기를 가짐)하며; (4) 아래에 개시된 T2R 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 약 40% 동일한 서열을 포함하고; (5) 기재된 T2R 서열들에 엄격한 하이브리드화 조건하에서 특이적으로 하이브리드화하는 프라이머들에 의해 증폭되는, 다형성 변이체, 대립유전자(allele), 돌연변이, 및 동족체(homolog)를 포함한다.
특히, 이러한 "T2R"은 본 출원에서 제공된 핵산 서열 및 아미노산 서열을 갖는 hT2R8 및 hT2R14로 본 명세서에서 지칭된 미각 수용체 GPCR, 및 본 명세서에서 확인된 쓴맛 리간드에 특이적으로 결합하는 이의 변이체, 대립유전자, 돌연변이, 오르토로그(ortholog)와 키메라, 및 기타 구조적으로 관련성이 있는 화합물 및 쓴맛 화합물을 포함한다.
T2R 유전자들은 단백질 및 DNA 수준 모두에서 실질적인 서열 차이를 나타내는 반면, 현재까지 분리된 모든 T2R들은 동일한 특정 영역에서 어떤 보존 서열(consensus sequence)을 함유한다고 확인되었거나 본 명세서에 전체가 참조로 통합되어 있는 애들러(Adler) 등(WO 01/77676 A1 (2001) 및 주커(Zuker) 등(WO 01/18050 A2)에서 이전에 확인된 T2R 보존 서열을 함유하거나 적어도 70-75% 서열 동일성을 갖는 것으로 확인되었다.
위상학적으로, 어떤 화학감각 GPCR들은 "N-말단 도메인", "세포외 영역", 7개의 막관통 영역을 포함하는 "막관통 도메인" 및 상응하는 세포질 및 세포외 루프, "세포질 영역" 및 "C-말단 영역"을 가지고 있다(Hoon et al, Cell, 96:541-51 (1999); Buck & Axel, Cell, 65:175-87 (1991) 참조). 이러한 영역들은 소수성 및 친수성 도메인을 확인하는 서열 분석 프로그램(Stryer, Biochemistry, (3rd ed. 1988) 참조; dot.imgen.bcm.tmc.edu 에서 얻을 수 있는 프로그램과 같이 수많은 인터넷 기반 서열 분석 프로그램 참조)과 같이 당해 기술분야의 숙련자에 의해 알려진 방법을 이용하여 구조적으로 확인될 수 있다. 이러한 영역들은 키메라 단백질들을 만드는 데 유용하고, 본 발명의 시험관내 분석, 예를 들어 리간드 결합 분석에 유용하다. 예를 들어, 키메라 T2R은 하나의 T2R의 세포외 영역과 동일하거나 다른 종의 또 다른 T2R의 막관통 영역과 결합하여 제조될 수 있다.
그러므로, "세포외 영역"은 세포막으로부터 돌출되어 세포의 세포외 표면에 노출된 T2R 폴리펩타이드의 도메인을 지칭한다. 상기 영역들은 세포의 세포외 면에 노출된 막관통 도메인의 세포외 루프들, 즉 막관통 영역 2와 3, 막관통 영역 4와 5 및 막관통 영역 6 및 7 사이의 세포외 루프들뿐만 아니라 세포의 세포외 면에 노출된 "N-말단 도메인"을 포함한다. 상기 "N-말단 도메인"은 N-말단에서 시작해서 상기 막관통 영역의 시작점 근처 영역까지 확장한다. 이러한 세포외 영역들은 수용상 및 고체상 모두 시험관내 리간드 결합 분석에 유용하다. 또한, 아래에 기재된 막관통 영역들은 세포외 영역과 조합되거나 단독으로 리간드 결합에 관여할 수 있고, 따라서 시험관내 리간드 결합 분석에 유용하다.
본 명세서에서 "T2R 발현 세포"는 내생(endogenous) T2R 발현 세포뿐만 아니라 본 발명에 따른 인간 T2R 서열을 발현하는 재조합 세포를 포함한다. 이러한 세포들은 혀 및 위장 시스템에 포함되어 있으며, 위장내 브러시 세포, STC-1 세포와 같은 장내분비(enteroendocrine) 세포와 같은 위장 시스템 및 관련 기관 내 세포뿐만 아니라 혀 위에 발현된 미뢰(taste bud)와 같은 구강 내 세포를 포함한다. 이러한 세포들은 또한 구스트두신(gustducin), 트랜스두신(transducin), Gα15 또는 Gα16과 같은 G 단백질을 발현할 수 있다. 특정 T2R들을 발현하는 세포들은 FACS 세포 분리 및/또는 마그네틱 비드 세포 분리 과정과 같이 알려진 방법에 의해 확인 및 분리될 수 있다.
7개의 막관통 "영역들(regions)"을 포함하는 "막관통 도메인"은 원형질막 내에 있는 T2R 폴리펩타이드의 도메인을 지칭하며, 또한 막관통 "영역들"로 지칭되는, 대응하는 세포질(세포내) 및 세포외 루프들을 또한 포함할 수 있다. 상기 7개의 막관통 영역과 세포외 및 세포질 루프들은 Kyte & Doolittle(J. Mol. Biol., 157:105-32 (1982)) 또는 Stryer에서 언급된 바와 같은 표준 방법을 이용하여 확인될 수 있다.
"세포질 도메인들"은 세포 내에 맞대고 있는 T2R 단백질들의 도메인들, 예를 들면, "C-말단 도메인" 및 막관통 도메인의 세포내 루프들, 예를 들면, 막관통 영역 1과 2, 막관통 영역 3과 4 및 막관통 영역 5와 6 사이의 세포내 루프들을 지칭한다. "C-말단 도메인"은 마지막 막관통 영역의 끝에서부터 단백질의 C-말단까지 걸쳐있는 영역을 지칭하며, 정상적으로 세포질 내에 위치한다.
용어 "7-막관통 수용체"는 원형질막에 7번 걸쳐있는 7개의 영역을 갖는 막관통 단백질들의 슈퍼패밀리에 속하는 폴리펩타이드를 의미한다(따라서, 상기 7개의 영역은 "막관통" 또는 "TM" 도메인들 TM I 내지 TM VII로 불림). 후각 및 어떤 미각 수용체의 패밀리들은 각각 이 슈퍼패밀리에 속한다. 하기에 보다 상세히 설명되는 바와 같이, 7-막관통 수용체 폴리펩타이드들은 비슷하고 특징적인 제1, 제2 및 제3 구조를 가지고 있다.
용어 "리간드 결합 영역"은 막관통 도메인 II 내지 VII(TM II 내지 VII)을 실질적으로 통합하는 화학감각 또는 미각 수용체로부터 유래한 서열을 지칭한다. 상기 영역은 리간드, 보다 상세하게는 미각 생성 화합물과 결합할 수 있다.
용어 "원형질막 전위(translocation) 도메인" 또는 간략하게 "전위 도메인"은 폴리펩타이드 암호화 서열의 아미노 말단으로 통합시, 하이브리드화("융합") 단백질을 높은 효율로 세포 원형질막으로 "인솔(chaperone)"하거나 "전위(translocate)"할 수 있는 폴리펩타이드 도메인을 의미한다. 예를 들어, 인간 로돕신 수용체 폴리펩타이드인 7-막관통 수용체의 아미노 말단에서 최초로 유래한 특정 " 전위 도메인"을 사용할 수 있다. 또 다른 전위 도메인은 소의 로돕신 서열에서 유래되었고 또한 전위를 용이하게 하는데 유용하다. 로돕신 유래 서열들은 7-막관통 융합 단백질을 원형질막으로 전위시키는데 특히 효율적이다.
"기능적 동등성(functional equivalency)"은 비슷한 조건하에서 로돕신에서 유래한 것과 같은 예시적인 전위 도메인만큼 효과적으로 새롭게 번역된 단백질을 원형질막으로 전위시키는 도메인의 능력 및 효율을 의미하며, 상대적 효율은 본 명세서에 기재된 바와 같이 (정량적으로) 측정되고 비교될 수 있다. 본 발명의 범주 내에 속하는 도메인들은, 20개의 아미노산 길이의 전위 도메인인 서열번호 1과 동일한 효율로 새롭게 합성된 폴리펩타이들을 세포 내(포유동물, 제노푸스(Xenopus) 등) 원형질막으로 전위시키는 효율을 일상적으로 스크리닝하여 결정될 수 있다.
미각 신호전달을 중재하는 T2R 패밀리 구성원을 조절하는 화합물을 시험하기 위한 분석법의 문맥에서 구 "기능적 효과(functional effect)"는 비직접적 또는 직접적으로 수용체의 영향하에 있는 임의의 변수, 예를 들어 기능적, 물리적 및 화학적 효과를 결정하는 것을 포함한다. 이는 리간드 결합, 이온 유속(ion flux)의 변화, 막 전위, 전류 흐름(current flow), 전사, G 단백질 결합, GPCR 인산화 또는 탈인산화, 신호 전달, 수용체-리간드 상호작용, 이차 전달자(messenger) 농도(예를 들어, cAMP, cGMP, IP3, 또는 세포내 Ca2 +), 시험관내, 생체내 및 생체외(ex vivo)를 포함하고, 또한 신경전달물질 또는 호르몬 방출의 증가 또는 감소와 같은 기타 생리학적 효과를 포함한다.
"기능적 효과를 결정한다는 것"은 비직접적 또는 직접적으로 T2R 패밀리 구성원의 영향 하에 있는 변수, 예를 들어 기능적, 물리적 및 화학적 효과를 증가시키거나 감소시키는 화합물에 대한 분석을 의미한다. 이러한 기능적 효과들은 예를 들어 분광학적 특성(예를 들어, 형광성, 흡광도, 굴절률), 유체역학적(예를 들어, 형태), 크로마토그래피, 또는 용해도 특성의 변화, 패치 클램프, 전압-민감성 염료, 전체 세포 전류, 방사성 동위원소 유출, 유도성 마커, 난모세포 T2R 유전자 발현; 조직 배양 세포 T2R 발현; T2R 유전자의 전사 활성화; 리간드 결합 분석; 전압, 막 전위 및 컨덕턴스(conductance) 변화; 이온 유속 분석; cAMP, cGMP 및 이노시톨 삼인산(IP3)와 같은 세포 내 2차 전달자의 변화; 세포 내 칼슘 수준의 변화; 신경전달물질 방출 등과 같은 당해 기술분야의 숙련자들에게 알려진 임의의 수단에 의해 측정될 수 있다.
T2R 단백질 수용체의 "억제제", "활성제" 및 "조절제"는 예를 들어 리간드, 작용제, 길항물질, 및 이들의 동족체(homolog) 및 모방체(mimetic)와 같은 미각 신호전달을 위한 시험관내 및 생체내 분석을 이용하여 확인된 억제성, 활성화 또는 조절하는 분자들을 의미하는 것으로 상호교환적으로 사용된다. 억제제는 미각 신호전달에, 예를 들어 결합하거나, 부분적으로 또는 전체적으로 자극을 차단하거나, 감소시키거나, 예방하거나 활성화를 지연시키거나, 불활성화시키거나, 둔감화시키거나 예를 들어 길항물질와 같이 하향조절하는 화합물이다. 활성제는 미각 신호전달에 결합하고, 자극하고, 증가시키고, 열고, 활성화시키고, 촉진하고, 활성화를 증가시키고, 민감하게 하고 또는 작용제와 같이 상향 조절하는 화합물이다. 조절제는 예를 들어 활성제나 억제제(예를 들어 에브네린 및 소수성 담체 패밀리의 기타 구성원); G 단백질; 키나아제(예를 들어, 수용체의 불활성화 및 둔감화와 관련된 로돕신 키나아제 및 베타 아드레날린성 수용체 키나아제의 동족체); 및 또한 수용체를 불활성화시키고 둔감화시키는 아레스틴(arrestin)에 결합하는 세포외 단백질과 수용체의 상호작용을 바꾸는 화합물을 포함한다. 조절제는 자연적 발생 및 합성 리간드, 길항물질, 작용제, 작은 화학분자 등뿐만 아니라 예를 들어 바뀐 활성을 갖는 유전적으로 변화된 형태의 T2R 패밀리 구성원을 포함한다.
억제제 및 활성제를 위한 상기 분석들은, 예를 들어 세포 또는 세포막에서 T2R 패밀리 구성원들을 발현하는 것, 예를 들어 쓴맛 화합물을 조절하는 화합물의 존재 또는 부재하에 추정되는 조절제 화합물을 적용하는 것, 및 그리고 나서 상기 기재한 바와 같이 미각 신호전달에 미치는 기능적 효과를 결정하는 것을 포함한다. 잠재적 활성제, 억제제 또는 조절제로 처리된 T2R 패밀리 구성원들을 포함하는 시료들 또는 분석을 상기 억제제, 활성제 또는 조절제가 없는 대조군 시료와 비교하여 조절 정도를 조사한다. 대조군 시료들(조절제로 처리되지 않음)은 100%의 상대적 T2R 활성값을 부여받는다. T2R의 억제는 대조구 대비 T2R 활성값이 약 80%, 선택적으로 50% 또는 25-0%인 때에 달성된다. T2R의 활성화는 대조구 대비 T2R 활성값이 110%, 선택적으로 150%, 선택적으로 200-500%, 또는 1000-3000% 이상인 때 달성된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "정제된", "실질적으로 정제된" 및 "분리된"은 본 발명의 화합물이 자연상태에서 정상적으로 회합하는 기타 다른 화합물이 없는 상태를 가리킨다. 바람직하게는, "정제된", "실질적으로 정제된" 및 "분리된"은 상기 조성물이 주어진 시료의 중량의 적어도 0.5%, 1%, 5%, 10% 또는 20%, 가장 바람직하게는 적어도 50% 또는 75%의 중량비를 포함하는 것을 가리킨다. 바람직한 일 실시예에 있어서, 이들 용어들은 주어진 시료의 중량의 적어도 95%의 중량비를 포함하는 본 발명의 화합물을 가리킨다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 핵산이나 단백질의 용어 "정제된", "실질적으로 정제된" 및 "분리된"은 핵산이나 단백질을 지칭시, 포유동물, 특히 인간 체내에서 자연적으로 발생하는 것보다는 다른 정제 또는 농도의 상태를 또한 가리킨다. 포유동물, 특히 인간 체내에서 자연적으로 발생하는 것보다 큰 임의의 정제 정도 또는 농도 정도는 (1) 다른 회합된 구조들이나 화합물로부터의 분리 또는 (2) 포유동물, 특히 인간 체내에서 정상적으로 회합되지 않는 구조들이나 화합물과의 회합을 포함하여, "분리된"의 의미에 속한다. 당해 기술분야에서 숙련자에게 알려진 다양한 방법들과 공정에 따라, 본 명세서에 기재된 핵산이나 단백질 또는 핵산이나 단백질의 클래스(class)는 분리되거나, 그렇지 않으면 자연 상태에서 정상적으로 회합되지 않는 구조들이나 화합물과 회합될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "분리된"은 핵산 또는 폴리펩타이드와 관련하여, 포유동물, 특히 인간 신체에서 자연적으로 존재하는 것과 상이한 정제 또는 농도의 상태를 가리킨다. 체내에서 자연적으로 발생하는 것보다 큰 임의의 정제 정도 또는 농도 정도는 (1) 다른 자연적으로 발생하는 회합된 구조들이나 화합물로부터의 정제 또는 (2) 체내에서 정상적으로 회합되지 않는 구조들이나 화합물과의 회합을 포함하여, "분리된"의 의미에 속한다. 당해 기술분야에서 숙련자에게 알려진 다양한 방법들과 공정에 따라, 본 명세서에 기재된 핵산이나 폴리펩타이드는 분리되거나, 그렇지 않으면 자연 상태에서 정상적으로 회합되지 않는 구조들이나 화합물과 회합될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "증폭하는" 및 "증폭"은 하기에 상세히 설명되는 바와 같이, 재조합 또는 자연적으로 발현되는 핵산을 생성하거나 검출하기 위한 임의의 적절한 증폭 방법의 사용을 가리킨다. 예를 들어, 본 발명은 생체내 또는 시험관내로 자연적으로 발현된(예를 들어, 게놈 또는 mRNA) 또는 재조합(예를 들어, cDNA)의 본 발명의 핵산들(예를 들어, 본 발명의 미각을 생성하는 화합물이 결합한 서열들)을 증폭(예를 들어, PCR)하기 위한 방법들 및 시약들(예를 들어, 특정 올리고뉴클레오타이드 프라이머쌍)을 제공한다.
용어 "발현 벡터"는 원핵, 효모, 곰팡이, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포를 포함하는 임의의 세포에서 시험관내 또는 생체내로, 구성적으로 또는 유도적으로, 본 발명의 핵산 서열을 발현하는 목적을 위한 임의의 재조합 발현 시스템을 가리킨다. 상기 용어는 선형 또는 원형 발현 시스템을 포함한다. 상기 용어는 에피좀(episome)으로 있거나 숙주세포의 게놈으로 삽입되는 발현 시스템을 포함한다. 상기 발현 시스템은 자가-복제하거나 그렇지 않은 능력, 즉 세포 내에서 일시적 발현만을 유도하는 능력을 가질 수 있다. 상기 용어는 재조합 핵산의 전사를 위해 필요한 최소한의 구성요소만을 함유한 재조합 발현 "카세트"를 포함한다.
용어 "라이브러리"는 축퇴성 프라이머쌍과 핵산의 증폭으로 재조합 생성 감각, 특히 미각 수용체 리간드 결합 영역, 또는 상기 증폭된 리간드 결합 영역들에 삽입되는 분리된 벡터들의 집합, 또는 미각 수용체를 암호화하는 적어도 하나의 벡터로 각각 무작위로 형질감염된 세포들의 혼합물과 같은 상이한 핵산 또는 폴리펩타이드 분자들의 혼합물의 조제물을 의미한다.
용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 일본쇄 또는 이본쇄 형태의 데옥시-리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 올리고뉴클레오타이드를 가리킨다. 상기 용어는 천연 뉴클레오타이드의 알려진 유사체를 함유하는 핵산들, 즉 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 용어는 또한 합성 골격을 갖는 핵산-유사 구조들을 포함한다.
다르게 표시하지 않는 한, 특정 핵산 서열은 직접적으로 표시한 서열뿐만 아니라 이의 보존적으로 변화된 변이체들(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보적인 서열들을 또한 암시적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 예를 들어 선별된 하나 이상의 코돈 중 세 번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기들과 치환된 서열들을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260:2605-08 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994)). 상기 용어 핵산은 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드, 및 폴리뉴클레오타이드와 상호교환적으로 사용된다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기들의 중합체를 가리키는 것으로 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 자연적으로 발생하는 아미노산 중합체 및 비-자연적으로 발생하는 아미노산 중합체뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연적으로 발생하는 아미노산의 합성 화학적 모방체(mimetic)인 아미노산 중합체에 적용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 예를 들어 알콕시, 알카노일, 알케닐, 알키닐 등과 같은 접두사 "알크(alk)"를 갖는 다른 기뿐만 아니라 "알킬"이란 선형 또는 분지형 또는 이의 조합일 수 있는 탄소 사슬을 의미한다. 알킬 기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 2급- 및 3급-부틸, 펜틸, 헥실, 헵팁 등을 포함한다. 바람직한 알킬 기는 1개 내지 4개의 탄소를 갖는다. "알케닐" 및 기타는 적어도 하나의 불포화 탄소-탄소 결합을 갖는 탄소 사슬을 포함한다. "알키닐" 및 기타는 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 탄소 사슬을 포함한다.
용어 "사이클로알킬"이란 헤테로원자를 갖는 않는 카보사이클을 의미하고, 모노-, 비- 및 트리사이클릭 포화 카보사이클, 및 융합 환계를 포함한다. 사이클로알킬의 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 데카하이드로나프탈렌, 아다만테인, 인다닐, 인데닐, 플루오레닐, 1,2,3,4-테트라하이드로나프탈렌 등을 포함한다.
용어 "아릴"이란 단일 환 또는 함께 융합된 다중 환인 방향족 치환기를 의미한다. 예시적인 아릴 기는 비제한적으로 페닐, 나프틸, 안트라세닐, 피리디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 트리아지닐, 티오페닐, 푸라닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 이미다졸릴, 트리아지올릴, 및 테트라졸릴 기를 포함한다. 하나 이상의 헤테로원자 (예를 들어, 피리디닐)를 갖는 아릴 기는 종종 "헤테로아릴 기"라 부른다. 다중 환으로 형성될 때, 구성 환의 적어도 하나는 방향족이다. 어떤 구현예에서, 다중 환의 적어도 하나는 헤테로원자를 포함하고, 이에 따라 헤테로원자 함유 아릴 기를 형성한다. 헤테로원자 함유 아릴 기는 비제한적으로 벤족사졸릴, 벤즈이미다졸릴, 퀴녹살리닐, 벤조푸라닐, 및 1H-벤조[d][1,2,3]트라아졸릴 기를 포함한다. 헤테로원자 함유 아릴 기는 또한 비제한적으로 2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥시닐 및 벤조[d][1,3]디옥솔릴 기를 포함한다. 헤테로원자 함유 아릴 기는 또한 적어도 하나의 헤테로원자 및 적어도 하나의 카보닐 기를 포함하는 헤테로사이클릭 환에 융합된 방향족 환을 포함한다. 그와 같은 기는 비제한적으로 디옥소 테트라하이드로퀴녹살리닐 및 디옥소 테트라하이드로퀴나졸리닐 기를 포함한다.
용어 "아릴알콕시"란 알콕시 기에 결합된 아릴 기를 의미한다.
용어 "아릴아미도알킬"이란 아릴-C(O)NR-알킬 또는 아릴-NRC(O)-알킬을 의미한다.
용어 "아릴알킬아미도알킬"이란 아릴-알킬-C(O)NR-알킬 또는 아릴-알킬-NRC(O)-알킬을 의미하고, 여기서, R 은 하기에 열거된 어떤 적합한 기이다.
용어 "아릴알킬"이란 알킬 기에 결합된 아릴 기을 의미한다.
용어 "할로겐" 또는 "할로"란 염소, 브롬, 불소 또는 요오드를 의미한다.
용어 "이탈기"란 치환 반응, 예컨대 친핵성 치환 반응에서 다른 관능기 또는 원자에 의해 대체될 수 있는 원자 또는 관능기를 의미한다. 예로써, 대표적인 이탈기는 하기를 포함한다: 클로로, 브로모 및 요오도 기; 설폰산 에스테르 기, 예컨대 메실레이트, 토실레이트, 브로실레이트, 노실레이트 등; 및 아실옥시 기, 예컨대 아세톡시, 트리플루오로아세톡시 등.
용어 "할로알킬"이란 하나 이상의 할로겐 원자를 갖는 알킬기(예를 들어, CF3)를 의미한다.
용어 "헤테로알킬"이란 N, O, P, B, S, 또는 Si 와 같은 헤테로원자를 포함하는 알킬 부분을 의미한다. 헤테로원자는 포화 또는 불포화 결합에 의해 헤테로알킬 부분의 나머지에 연결될 수 있다. 따라서, 기로 치환된 알킬, 예컨대 헤테로사이클로알킬, 치환된 헤테로사이클로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알콕시, 아릴옥시, 보릴, 포스피노, 아미노, 실릴, 티오, 또는 셀레노는 용어 헤테로알킬의 범위 내에 있다. 헤테로알킬의 예는 시아노, 벤조일, 2-피리딜 및 2-푸릴을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.
용어 "헤테로아릴알킬"이란 알킬 기가 부착된 헤테로아릴 기를 의미한다.
용어 "헤테로사이클"이란 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 적어도 하나의 헤테로원자, 특히 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 1개 또는 2개 다수의 결합, 및 환 원자를 이의로 갖는 탄소 및 수소 원자를 포함하는 모노시클릭 또는 폴리시클릭 환을 의미한다. 헤테로사이클 환 구조는 모노-, 바이-, 및 트리-사이클릭 화합물을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다. 구체적인 헤테로사이클은 모노시클릭 또는 바이시클릭이다. 대표적인 헤테로사이클은 사이클릭 우레아, 모르폴리닐, 피롤리디노닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 히단토이닐, 발레로락타밀, 옥시라닐, 옥세타닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로피리디닐, 테트라하이드로피리미디닐, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피라닐, 테트라졸릴, 및 우라졸릴을 포함한다. 헤테로사이클릭 환은 비치환 또는 치환일 수 있다. 바람직한 헤테로사이클은 5원 및 6원 헤테로사이클, 특히 히단토이닐 및 우라졸릴이다.
용어 "헤테로사이클로알킬"이란 환 중 탄소원자 중의 적어도 하나가 헤테로원자 (예를 들어, O, S 또는 N)에 의해 대체되는 사이클로알킬 기를 의미한다.
용어 "헤테로사이클로알킬알킬"이란 알킬 기가 부착된 헤테로사이클로알킬 기를 의미한다.
용어 "치환된"이란 선행기술에 공통적인 하나 이상의 치환을 특히 구상하고 참작한다. 그러나, 당업자는, 치환기는 화합물의 유용한 특성에 부정적 영향을 미치지 않거나 기능을 부정적으로 방해하지 않도록 선택되어야 한다는 것을 일반적으로 이해한다. 적합한 치환기는 예를 들어 하기를 포함할 수 있다: 할로 기, 퍼플루오로알킬 기, 퍼플루오로알콕시 기, 알킬 기, 알케닐 기, 알키닐 기, 하이드록시 기, 옥소 기, 머캅토 기, 알킬티오 기, 알콕시 기, 아릴 또는 헤테로아릴 기, 아릴옥시 또는 헤테로아릴옥시 기, 아르알킬 또는 헤테로아르알킬 기, 아르알콕시 또는 헤테로아르알콕시 기, 아미노 기, 알킬- 및 디알킬아미노 기, 카르바모일 기, 알킬카보닐 기, 카르복실 기, 알콕시카보닐 기, 알킬아미노카보닐 기, 디알킬아미노 카보닐 기, 아릴카보닐 기, 아릴옥시카보닐 기, 알킬설포닐 기, 아릴설포닐 기, 사이클로알킬 기, 시아노 기, C1-C6 알킬티오 기, 아릴티오 기, 니트로 기, 케토 기, 아실 기, 보로네이트 또는 보로닐 기, 포스페이트 또는 포스포닐 기, 설파밀 기, 설포닐 기, 설피닐 기, 및 이의 조합. 치환된 조합, 예컨대 "치환된 아릴알킬"의 경우에, 아릴 또는 알킬 기, 또는 아릴 및 알킬 기 모두가 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다. 추가로, 어떤 경우에, 적합한 치환기는 당업자에 공지된 하나 이상의 환을 형성하기 위해 조합할 수 있다.
본 명세서에 기재된 화합물은 하나 이상의 이중결합을 함유하고, 따라서, 다른 형태 이성체뿐만 아니라 시스/트랜스 이성체를 생기게 할 수 있다. 본 발명은 모드 그와 같은 가능한 이성체, 및 그와 같은 이성체의 혼합물을 포함한다.
본 명세서에 기재된 화합물, 특히 상기에 기재된 치환기는 하나 이상의 비대칭 중심을 함유할 수 있고, 따라서 부분입체이성체 및 광학 이성체를 생기게 할 수 있다. 본 발명은 모두 그와 같은 가능한 부분입체이성체, 및 이의 라세미 혼합물, 실질적으로 순수한 분할 거울상이성체, 모든 가능한 기하 이성체, 및 이의 허용되는 염을 포함한다. 또한, 분리된 특정 입체이성체뿐만 아니라 입체이성체의 혼합물이 또한 포함된다. 그와 같은 화합물을 제조하기 위한 합성 절차의 과정 동안에, 또는 당업자에게 공지된 라세미화 또는 에피머화 과정의 사용시에, 그와 같은 절차의 생성물은 입체이성체의 혼합물일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "염" 및 "약제학적으로 허용되는 염"이란 개시된 화합물의 유도체를 의미하고, 여기서, 모 화합물은 이의 산 또는 염기 염을 만들기 위해 변성된다. 약제학적으로 허용되는 염의 예는 아민과 같은 염기성 기의 무기산 또는 유기산 염; 및 카르복실산과 같은 산성 기의 알칼리 또는 유기 염을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 약제학적으로 허용되는 염은 예를 들어, 비독성 무기 또는 유기 산으로부터 형성된 모 화합물의 종래의 4차 암모늄 염 또는 종래의 비독성 염을 포함한다. 예를 들어, 그와 같은 종래의 비독성 염은 하기를 포함한다: 염산, 브롬화수소산, 황산, 설파민산, 인산, 및 질산과 같은 무기산으로부터 유래된 것; 및 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 파모산, 말레산, 하이드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 설프아닐산, 2-아세트옥시벤조산, 푸마르산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 에탄 디설폰산, 옥살산, 및 이세티온산 등과 같은 유기산으로부터 유래된 염.
본 발명의 약제학적으로 허용되는 염은 종래의 화학 방법에 의해 염기 또는 산 부분을 함유하는 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 그와 같은 염은 이들 화합물의 유리 산 또는 유리 염기 형태를 물 또는 유기 용매, 또는 이들의 혼합물 중 적합한 염기 또는 산의 화학양론적 양과 반응시킴으로써 제조될 수 있고; 일반적으로, 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올, 또는 아세토니트릴과 같은 비수성 매질이 바람직하다. 적합한 염의 목록은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418 에 기재되어 있고, 이의 내용은 참고로 본 명세서에 통합되어 있다.
용어 "용매화물"이란 비공유 분자간력에 의해 결합된 용매의 화학양론적 또는 비화학양론적 양을 포함하는 화합물 또는 이의 염을 의미한다. 용매가 물인 경우, 용매화물은 수화물이다.
용어 "프로드러그(prodrug)"란 활성 화합물, 특히 본 발명의 화합물을 제공하기 위해 생물학적 조건(시험관내 또는 생체내) 하에서 가수분해, 산화 또는 반응할 수 있는 화합물의 유도체를 의미한다. 프로드러그의 예는 생가수분해성 아미드, 생가수분해성 에스테르, 생가수분해성 카바메이트, 생가수분해성 카보네이트, 생가수분해성 우레이드, 및 생가수분해성 포스페이트 유사체와 같은 생가수분해성 부분을 포함하는 본 발명의 화합물의 유도체 및 대사산물을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 카르복실 관능기를 갖는 화합물의 특정 프로드러그는 카르복실산의 저급 알킬에스테르이다. 카르복실레이트 에스테르는 분자 상에 존재하는 어떤 카르복실산 부분을 에스테르화하여 편리하게 형성된다. 프로드러그는 공지된 방법, 하기에 기재된 것을 사용하여 전형적으로 제조될 수 있다: Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery 6th ed. (Donald J. Abraham ed., 2001, Wiley) and Design and Application of Prodrugs (H. Bundgaard ed., 1985, Harwood Academic Publishers Gmfh).
본 명세서에 사용된 바와 같이, 그리고 달리 지적되지 않으면, 용어 "생가수분해성 아미드," "생가수분해성 에스테르," "생가수분해성 카바메이트," "생가수분해성 카보네이트," "생가수분해성 우레이도," "생가수분해성 포스페이트"란 하기인 화합물 각각의 아미드, 에스테르, 카바메이트, 카보네이트, 우레이도, 또는 포스페이트를 의미한다: 1) 화합물의 생물학적 활성을 방해하지 않지만 그 화합물에 작용의 활용, 기간 또는 시작과 같은 생체내 유익한 특성을 제공할 수 있거나; 2) 생물학적으로 비활성이지만 생물학적 활성 화합물로 생체내에서 전환된다. 생가수분해성 에스테르의 예는 하기를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다: 저급 알킬 에스테르, 알콕시아실옥시 에스테르, 알킬 아실아미노 알킬 에스테르, 및 콜린 에스테르. 생가수분해성 아미드의 예는 하기를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다: 저급 알킬 아미드, 알파-아미노산 아미드, 알콕시아실 아미드, 및 알킬아미노알킬카보닐 아미드. 생가수분해성 카바메이트의 예는 하기를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다: 저급 알킬아민, 치환된 에틸렌디아민, 아미노산, 하이드록시알킬아민, 헤테로사이클릭 및 헤테로방향족 아민, 및 폴리에테르 아민.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 본 명세서에 개시된 화합물의 맥락에서의 용어 "이의 유사체"는 화합물의 부분입체이성체, 수화물, 용매화물, 염, 프로드러그, 및 N-옥사이드를 포함한다.
본 명세서에 기재된 "전좌(translocation) 영역" "리간드 결합 부위", 및 키메라 수용체 조성물은 예시적인 서열에 대체로 상응하는 구조 및 활성을 "유사체" 또는 "보존적 변이체" 및 "모방체" ("펩타이도모방체")이다. 따라서, 용어 "보존적 변이체" 또는 "유사체" 또는 "모방체"란 변형 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미하고, 이에 따라 변화(들)은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 폴리펩타이드 (보존적 변이체) 구조 및/또는 활성을 실질적으로 바꾸지 않는다. 이들은 아미노산 선열의 보존적으로 변형된 변화, 즉, 단백질 활성에 필요하지 않은 잔기의 아미노산 치환, 부가 또는 삭제, 또는 유사한 특성(예를 들어, 산성, 염기성, 양성 또는 네가티브 충전, 또는 극성 또는 비극성 등)을 갖는 잔기에 의한 이미노산의 치환을 포함하고, 이에 따라 훨씬 필요한 아미노산의 치환은 구조 및/또는 활성을 실질적으로 바꾸지 않는다.
더욱 특히, "보존적으로 변형된 변이체"은 아미노산 및 핵산 서열 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열에 대해, 보존적으로 변형된 변이체는 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하거나 핵산이 아미노산 서열을 본질적 동일한 서열로 암호화하지 않는 핵산을 의미한다. 유전 암호의 축퇴 때문에, 수많은 기능적으로 동일한 핵산은 어떤 소정의 단백질을 암호화한다.
예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU 모두는 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 지정된 모든 위치에서, 코돈은 암호화된 폴리펩타이드를 바꾸지 않고 기재된 어떤 상응하는 코돈으로 바꿀 수 있다.
그와 같은 핵산 변화는 보존적으로 변형된 변화의 한 종류인 "잠재성 변화"이다. 폴리펩타이드를 암호화하는 모든 핵산 서열은 핵산의 모든 가능한 잠재성 변화를 기재하고 있다. 당업자는, 핵산 중의 각 코돈(대개 메티노닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 대개 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 산출하기 위해 변형될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 각 잠재성 변화는 기재된 각 서열에 포함된다.
기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 선행기술에 공지되어 있다. 예를 들어, 보존적 치환을 선택하기 위한 하나의 예시적인 지침은 하기를 포함한다 (최초 잔여물, 그 다음, 예시적인 치환): ala/gly 또는 ser; arg/lys; asn/gln 또는 his; asp/glu; cys/ser; gin/asn; gly/asp; gly/ala 또는 pro; his/asn 또는 gln; ile/leu 또는 val; leu/ile 또는 val; lys/arg 또는 gln 또는 glu; met/leu 또는 tyr 또는 ile; phe/met 또는 leu 또는 tyr; ser/thr; thr/ser; trp/tyr; tyr/trp 또는 phe; val/ile 또는 leu. 대안적인 예시적인 지침은 하기의 6개의 군을 포함하고, 각각은 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌 (R), 리신 (I); 5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 및 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W); (참조, 예를 들어, Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Company (1984); Schultz and Schimer, Principles of Protein Structure, Springer-Verlag (1979)). 당업자는, 상기의 치환이 유일한 가능한 보존적 치환은 아니라는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 어떤 목적을 위해, 당업자는, 모든 충전된 아미노산을, 양성 또는 네가티브인지를 서로에 대해 보존적 치환으로서 간주할 것이다. 또한, 암호화된 서열 중 소량의 아미노산 또는 단일 아미노산을 변경, 부가 또는 삭제하는 개별 치환, 삭제 또는 부가는 "보존적으로 변형된 변화"로서 고려될 수 있다.
용어 "모방체" 및 "펩타이도모방체"란 폴리펩타이드의 동일한 구조적 및/또는 기능적 특성, 예를 들어, 본 발명의 전좌 영역, 리간드 결합 부위, 또는 키메라 수용체를 상당히 갖는 합성 화합물을 의미한다. 모방체는 전적으로 아미노산의 합성의 비천연 유사체로 구성될 수 있거나, 부분적으로 천연인 펩타이드 아미노산 및 아미노산의 부분적으로 비천연인 유사체의 키메라 분자일 수 있다. 모방체는 또한 어떤 양의 천연 아미노산 보존적 치환을 포함할 수 있는데, 단, 그와 같은 치환이 모방체의 구조 및/또는 활성을 실질적으로 변경하지 않아야 한다.
보존적 변이체인 본 발명의 폴리펩타이드와 마찬가지로, 일상적인 실험은 모방체가 본 발명의 범위 내인지, 즉, 이의 구조 및/또는 기능이 실질적으로 변경되지 않는 지를 결정할 것이다. 폴리펩타이드 모방체 조성물은 전형적인 3개의 구조 군으로부터의 비천연 구조 성분의 어떤 조합을 함유할 수 있다: a) 천연 아미드 결합("펩타이드 결합") 연결 이외의 잔기 연결 기; b) 자연 발생 아미노산 잔기 대신의 비천연 잔기; 또는 c) 2차 구조 모방을 유도하는, 즉 2차 구조, 예를 들어, 베타 턴(beta turn), 감마 턴(gamma turn), 베타 시트(beta sheet), 알파 나선 형태 등을 유도하거나 안정화시키기 위한 잔기. 폴리펩타이드는, 잔기의 모두 또는 일부가 천연 펩타이드 결합 이외의 화학 수단에 의해 결합될 때 모방체를 특징으로 할 수 있다. 개별 펩타이도모방체 잔기는 펩타이드 결합, 다른 화학 결합 또는 커플링 수단, 예컨대, 예를 들어, 글루타르알데히드, N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 2관능성 말레이미드, N,N'-디사이클로헥실카보디이미드 (DCC) 또는 N,N'-디이소프로필카보디이미드 (DIC)에 의해 연결될 수 있다. 종래의 아미드 결합 ("펩타이드 결합") 연결에 대해 대안적일 수 있는 연결 기는 예를 들어, 케토메틸렌 (예를 들어, --C(.=O)--NH--)에 대해 --C(.=O)--CH2, 아미노메틸렌 (CH2NH), 에틸렌, 올레핀 (CH.dbd.CH), 에테르 (CH2O), 티오에테르 (CH2--S), 테트라졸 (CN4), 티아졸, 레트로아미드, 티오아미드, 또는 에스테르를 포함한다 (참조, 예를 들어, Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, 267-357, Marcell Dekker, Peptide Backbone Modifications, NY (1983)). 폴리펩타이드는 또한 자연 발생 아미노산 잔기 대신에 모든 또는 일부 비천연 잔기를 함유함으로써 모방체를 특징으로 할 수 있고; 비천연 잔기는 과학 및 특허 문헌에 잘 기재되어 있다.
"표지(label)" 또는 "검출가능 부분"은 분광, 광화학, 생화학, 면역화학, 또는 화학 수단에 의해 검출가능한 조성물이다. 예를 들어, 유용한 표지는 32P, 형광염료, 전자 치밀 시약, 효소 (예를 들어, ELISA에서 통상 사용됨), 바이오틴, 디곡시게닌, 또는 합텐(hapten) 및 단백질을 포함하고, 이는 방사성표지(radiolabel)를 펩타이드에 혼입하여 만들어질 수 있거나 펩타이드와 특이적 반응성이 있는 항체를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
"표지된 핵산 프로브(probe) 또는 올리고뉴클레오타이드"는 링커 또는 화학 결합을 통해 공유적으로 또는 이온, 반데르발스, 정전 또는 수소 결합을 통해 비공유적으로 표지에 결합된 것이고, 이에 따라 프로브의 존재는 프로브에 결합된 표지의 존재를 검출함으로써 검출될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "핵산 프로브 또는 올리고뉴클레오타이드"는 화학 결합의 하나 이상의 유형, 통상 상보적 염기 페어링(pairing), 통상 수소 결합 형성을 통해 상보적 서열의 표적 핵산에 결합할 수 있는 핵산으로서 정의된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 프로브는 천연 (즉, A, G, C, 또는 T) 또는 변형 염기 (7-데아자구나노신, 이노신 등)를 포함할 수 있다. 또한, 프로브 중 염기는 포스포(포스포)디에스테르 결합 이외의 연결에 의해 연결될 수 있고, 단, 하이브리드화를 방해하지 않아야 한다. 따라서, 예를 들어, 프로브는, 구성 염기가 포스포디에스테르 연결보다는 펩타이드 결합에 의해 연결된 펩타이드 핵산일 수 있다. 당업자는, 프로브가 하이브리드화 조건의 엄격함에 따라 프로브 서열과의 완전한 상보성이 부족한 표적 서열을 결합할 수 있다. 프로브는 스트렙타비딘 복합체가 나중에 결합할 수 있는 바이오틴으로 간접적으로 표지되거나 동위원소, 발색단, 루미포어(lumiphore), 색원체로 임의로 직접 표지된다. 프로브의 존재 또는 부재에 대하여 분석함으로써, 선택된 서열 또는 서브(sub)서열의 존재 또는 부재를 검출할 수 있다.
핵산의 부분을 참조로 사용될 때의 용어 "이종"이란, 핵산이 사실상 서로 동일한 관계에서 발견되지 않는 둘 이상의 서브서열을 포함한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 핵산은 통상 재조합적으로 생산되고, 새로운 기능적 핵산, 예를 들어 하나의 공급원으로부터의 프로모터 및 다른 공급원으로부터의 암호화 부위를 만들기 위해 배열된 무관련 유전자로부터 2이상의 서열을 갖는다. 마찬가지로, 이종 단백질이란, 단백질이 사실상 서로 동일한 관계에서 발견되지 않는 둘 이상의 서브서열을 포함한다 (예를 들어, 융합 단백질)는 것을 나타낸다.
"프로모터"란 핵산의 전사를 겨냥하는 핵산 서열의 어레이(array)로서 정의된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 프로모터는 폴리머라제 II 타입 프로모터의 경우에 TATA 요소와 같은 전사의 개시 부위에 인접한 필요한 핵산 서열을 포함한다. 프로모터는 또한 임의로 디스털 인핸서(distal enhancer) 또는 억제인자 요소를 포함하고, 이는 전사의 개시 부위로부터 수천 쌍의 염기만큼 위치할 수 있다. "지속적" 프로모터는 대부분의 환경적 및 발달적 조건 하에서 활성인 프로모터이다. "유도가능" 프로모터는 환경적 및 발달적 조절 하에서 활성인 프로모터이다. 용어 "작동가능하게 연결된"이란 핵산 발현 조절 서열 (예컨대, 전사 인자 결합 부위의 어레이 또는 프로모터)과 제2 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 의미하고, 여기서, 발현 조절 서열은 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 겨냥한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "재조합"이란 세포 또는 다른 생물계에서 유전자 산물을 생산하기 위해 재조합 폴리뉴클레오타이드를 사용하는 방법에 대하여 시험관내에서 합성 또는 조작된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, "재조합 폴리뉴클레오타이드"), 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드 ("재조합 단백질")을 의미한다. "재조합 수단"은 또한 다양한 암호화 부위 또는 영역을 갖는 핵산 또는 상이한 공급원으로부터의 프로모터 서열의, 발현 카세트(cassette) 또는 발현, 예를 들어 본 발명의 전좌 영역을 포함하는 융합 단백질 및 본 발명의 프라이머를 사용하여 증폭된 핵산 서열의 유도가능 또는 지속적 발현을 위한 벡터로의 결찰을 포함한다.
구절 "~로 선택적으로 (또는 특이적으로) 하이브리드화하다"란, 복합 혼합물 (예를 들어, 총 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA)에 존재할 때 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 분자의 특정 뉴클레오타이드 서열에만 결합, 듀플렉싱(duplexing) 또는 하이브리드화하는 것을 의미한다.
구절 "엄격한 하이브리드화 조건"이란, 프로브가 통상 핵산의 복합 혼합물에서 다른 서열은 아닌 표적 서브서열로 하이브리드화하는 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 서열 의존성이고, 상이한 환경에서는 상이할 것이다. 긴 서열은 고온에서 특이적으로 하이브리드화한다. 핵산의 하이브리드화에 대한 광범위한 안내는 하기에서 발견된다: Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 세기, pH 에서 특정 서열에 대한 열융점(Tm)보다 약 5 내지 10℃ 낮게 선택된다. Tm 은, 표적에 대해 상보적인 프로브의 50% 가 평형상태(표적 서열은 Tm 에서 과잉으로 존재하기 때문에, 프로브의 50%는 평형상태에 있다)에서 표적 서열로 하이브리드화하는 (정의된 이온 세기, pH, 및 핵산 농도 하에서의) 온도이다. 엄격한 조건은, 염 농도가 7.0 내지 8.3 의 pH 에서 약 1.0 M 미만, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M 나트륨 이온 농도 (또는 다른 염)이고, 온도는 짧은 프로브(예를 들어, 10 내지 50개의 뉴클레오타이드)에 대해서 적어도 30℃ 및 긴 프로브(50개 초과의 뉴클레오타이드)에 대해서 적어도 약 60℃인 것이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가로 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 하이브리드화에 대해서, 양성(positive) 신호는 적어도 2배, 임의로 10개의 백그라운드(background) 하이브리드화이다. 예시적인 엄격한 하이브리드화 조건은 하기와 같을 수 있다: 50% 포름아미드, 5xSSC, 및 1% SDS, 42℃에서 배양, 또는, 5xSSC, 1% SDS, 65℃에서 배양, 및 65℃에서 0.2xSSC, 및 0.1% SDS 에서 세정. 그와 같은 하이브리드화 및 세정 단계는 예를 들어, 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60분; 또는 그 이상 동안 수행될 수 있다.
엄격한 조건 하에서 서로 하이브리드화하지 않는 핵산은, 암호화하는 폴리펩타이드가 실질적으로 관련되어 있다면 여전히 실질적으로 관련되어 있다. 이는, 예를 들어 핵산의 복사물이 유전 부호에 의해 허용되는 최대 코돈 축퇴를 사용하여 만들어질 때 일어난다. 그와 같은 경우에, 핵산은 전형적으로 중간 정도로 엄격한 조건 하에서 하이브리드화한다. 예시적인 "중간정도로 엄격한 하이브리드화 조건"은 37℃ 에서 40% 포름아미드의 버퍼, 1 M NaCl, 1% SDS 에서 하이브리드화 및 및 45℃ 에서 1xSSC 에서 세정을 포함한다. 그와 같은 하이브리드화 및 세정 단계는 예를 들어, 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60분; 또는 그 이상 동안 수행될 수 있다. 양성(positive) 하이브리드화는 적어도 2회의 백그라운드(background)이다. 당업자는, 대안적인 하이브리드화 및 세정 조건이 유사한 엄격한 조건을 제공하기 위해 이용될 수 있다는 것을 쉽게 인식할 것이다.
"항체"란 항원을 특이적으로 결합하고 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 이의 절편으로부터 골격 부위를 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 부위 유전자 및 미리어드(myriad) 면역글로불린 가변 부위 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로서 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되는데, 이는 차례차례 면역글로불린 부류, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 을 각각 정의한다.
예시적인 면역글로불린 (항체) 구조 단위는 테트라머를 포함한다. 각 테트라머는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩타이드 사슬로 구성되고, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄" (약 50-70 kDa)를 갖는다. 각 사슬의 N-말단은 항원 인식에 우선 책임 있는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 부위를 한정한다. 용어 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH)는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 의미한다.
"키메라 항체"란 하기인 항체 분자이다: (a) 불변 부위, 또는 이의 부분은 변경, 대체 또는 교환되고, 이에 따라 항원 결합 부위(가변 부위)가 상이하거나 변경된 부류, 작동체 기능 및/또는 종류의 불변 부위, 또는 새로운 특성을 키메라 항체, 예를 들어, 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등에 수여하는 전적으로 상이한 분자에 연결되거나; 또는 (b) 가변 부위, 또는 이의 부분은 상이하거나 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 부위로 변경, 대체 또는 교환된다.
"항-T2R" 항체는 T2R 유전자, cDNA, 또는 이의 서브서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 절편이다.
용어 "면역분석"은 항원을 특이적으로 결합하기 위해 항체를 사용하는 분석이다. 면역분석은 항원을 분리, 표적으로 삼고/삼거나 정량하기 위해 특정 항체의 특이적 결합 특성을 사용을 특징으로 한다.
단백질 또는 펩타이드를 언급할 때, 구절 "~와 특이적으로 (또는 선택적으로) 면역반응하는" 또는 "항체에 특이적으로 (또는 선택적으로) 결합하는"이란 단백질 및 다른 생물의약품의 이종 집단에서 단백질의 존재를 확정하는 결합 반응을 의미한다. 따라서, 지정된 면역분석 조건 하에서, 명기된 항체는 적어도 2회의 백그라운드(background)로 특정 단백질에 결합하고, 샘플에 존재하는 다른 단백질에 상당한 양으로 실질적으로 결합한다. 그와 같은 조건 하에서 항체에 대한 특이적 결합은 특정 단백질에 대한 특이성을 위해 선택된 항체를 필요로 할 수 있다.
예를 들어, 래트, 마우스 또는 인간과 같은 특정 종으로부터 T2R 패밀리 구성원로 향상된 다클론성 항체는 T2R 폴리펩타이드 또는 이의 면역 부분과 특이적으로 면역반응하고 T2R 폴리펩타이드의 상동체 또는 다형적 변이체 및 대립유전자를 제외하고 다른 단백질과는 반응하지 않는 다클론성 항체만을 얻기 위해 선택될 수 있다. 이러한 선택은 다른 종 또는 다른 T2R 분자로부터 T2R 분자와 교차반응하는 항체를 공제함으로써 달성될 수 있다. 다른 패밀리로부터 GPCR 은 아닌 T2R GPCR 패밀리 구성원만을 인식하는 항체가 또한 선택될 수 있다. 다양한 면역분석 형식은 특정 단백질과 특이적으로 면역반응하는 항체를 선택하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 고상 ELISA 면역분석은 단백질과 특이적으로 면역반응하는 항체를 선택하기 위해 일상적으로 사용된다. (참조, 예를 들어, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, (1988), 특이적 면역활성을 측정하기 위해 사용될 수 있는 면역분석 형싱 및 조건의 기재). 전형적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 적어도 2회, 더욱 전형적으로 10 내지 100회의 백그라운드 신호 또는 노이즈일 것이다.
구절 "~와 선택적으로 관련된다"란 상기에 기재된 다른 것과 "선택적으로 하이브리드화하는" 핵산의 능력, 또는 상기에 기재된 "단백질과 선택적으로 (또는 특이적으로 결합하는) 항체의 능력을 의미한다.
용어 "발현 벡터"란 원핵생물, 효모, 진균, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포를 포함하는 어떤 세포에서 시험관내 또는 생체내, 지속적으로 또는 유도성으로 본 발명의 핵산 서열을 발현시키기 위해 어떤 재조합 발현 시스템을 의미한다. 상기 용어는 선형 또는 환형 발현 시스템을 포함한다. 상기 용어는 에피좀으로 남아있거나 숙주세포 게놈으로 통합된 발현 시스템을 포함한다. 발현 시스템은 자기복제하거나 그렇지 않을 능력을 가질 수 있고, 즉 세포 내에서 일시적인 발현만을 추진할 수 있다. 상기 용어는 재조합 핵산의 전사에 필요한 최소 요소만을 함유하는 재조합 발현 "카세트"를 포함한다.
"숙주세포"란 발현 벡터를 함유하고 발현 벡터의 복제 또는 발현을 지지하는 세포를 의미한다. 숙주세포는 원핵생물 세포, 예컨대 대장균, 또는 진핵세포, 예컨대 효모, 곤충, 양서류, 또는 포유동물 세포, 예컨대 CHO, HeLa, HEK-293 등, 예를 들어, 생체내 배양 세포, 외식편, 및 세포일 수 있다.
상기를 근거로 하여, 본 발명은 쓴맛 화합물, 예를 들어 커피 및 이로부터 유도되고 구조적으로 관련된 추출물에 존재하는 쓴맛 화합물 및 다른 쓴맛 화합물에 의한, 미리 확인된 인간 쓴맛 수용체의 특이적 활성을 조절하고, 바람직하게는 차단하는 화합물을 확인하는 분석방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 hT2R8 및 hT2R14 의 활성을 조절하는 (예를 들어, 차단하는) 화합물을 분석하기 위한 세포 기반 분석방법을 제공한다. 이들 화합물은 인간 대상체에서 이들 미각 수용체와 관련된 쓴맛을 조절할 것이다. 이는 미각 테스트에서 확인될 것이다.
또한, 본 발명은 공지 및 미공지 쓴맛 화합물을 함유하는, 인간 또는 동물이 섭취하는 식품, 음료, 의약 및 다른 물질에 사용될 수 있는 넓은 범위의 길항물질 특성을 갖는 길항물질을 확인하고 제공하는데, 여기서, 쓴맛은 바람직하게는 최소화되거나 제거된다.
상기 미각 수용체가 커피에 존재하는 쓴맛 화합물(들) 및 하나, 다수의 또는 미공지 쓴 수용체와 상호작용하는 특정 쓴맛 화합물에 반응하는 것은, 현 양수인에 의해 출원된 특허 출원, 예를 들어, U.S. 시리즈 No. 10/191,058 및 09/825,882뿐만 아니라 다른 공보에 보고된 칼슘 이미징법 및 HEK293 발현 시스템을 사용하여 본질적으로 결정되었고, 상기 문헌 모두는 이의 전체가 참고로 본 명세서에 통합되어 있다. 더욱 특히, 본 발명자들은 구스트듀신의 잔기에 의한 카르복시-44 아미노산 잔기의 대체에 의해 변형된 Gα16 G 단백질 서열을 포함하는 키메라 G 단백질 (G16gust44)와 함께 로돕신 35 아미노산 태그 (서열번호 1)로 태그된(tagged) 특정 hT2R 로 HEK293 세포를 형질감염(transfection)했고, 칼슘 이미징법을 사용하여 특정 쓴맛 리간드에 대한 세포의 반응을 기록했다.
구체적으로, 본 발명자들은 hT2R 활성을 모니터하기 위해 포유동물 세포 기반 분석을 사용했다. 칼슘 이미징 분석에 대해, 세포를 48-웰 조직 배양 플레이트에 시딩(seeding)했다. 24시간 후, 세포를, hT2R 핵산 서열을 함유하는 발현 플라스미드 (pEAK10), 및 키메라 G 단백질 (G16gust44)을 함유하는 플라스미드 (pEAK10)로 일시적으로 형질감염했다. 추가 24시간 후, 세포를, 칼슘 (Fluo-4; Molecular Probes)에 대해 특이적인 형광염료와 함께 배양했다. 로딩(loading)된 세포는 상이한 쓴맛 분자에 노출되고, hT2R 의 활성은 G16gust44 의 활성으로 이르게 하고, 이는 세포 내로 칼슘 이동으로 이르게 된다. 칼슘 농도에서의 이러한 증가는 세포 내의 칼슘 염료의 형광 특성을 변화시킨다. 이런 변화는 형광 현미경 관찰을 이용하여 모니터한다.
본 발명자들은 또한 약간 상이한 프로토콜을 사용하는 자동 형광 표적 시스템(automated fluorimetric aiming system) FLIPR 을 사용했다. G16gust44 를 안정하게 발현시키는 HEK293 세포주를 24시간 후 hT2R 발현 플라스미드로 형질감염했고, 세포를 로딩하고, FLIPR 상에서 분석했다.
리간드가 특정 hT2R 에 대해 확인된 후, hT2R 및 G16gust44 모두를 안정하게 발현시키는 HEK293 세포주를 산출하는데, 이는 특정 hT2R 를 활성화시키거나 다른 쓴맛 리간드, 예컨대 커피 내에 함유된 쓴맛 화합물에 의해 hT2R 의 활성을 조절(차단 또는 향상)하는 다른 리간드를 확인하기 위해 미래 스크리닝 분석을 촉진한다.
도면들에 보여진 바와 같이, 그와 같은 실험은, hT2R8 및 hT2R14 가 커피 내에 존재하는 쓴맛 화합물에 반응한다는 것을 보여주었고 커피의 쓴맛을 억제 또는 차단하는 화합물을 확인했다. 또한, 하기의 도 5 및 실시예 3 에서의 실험은 특히 화합물 C 의 넓은 길항물질 특성을 보여주었다.
이들 결과는, hT2R 미각 수용체를 확인한 세포가 상기의 특정 hT2R 중의 적어도 하나와 관련된 쓴맛을 조절하는 리간드를 확인하기 위해 분석, 및 쓴맛에 대해 책임 있는 화합물을 검출하기 위한 분석에 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
바람직하게는, 이들 분석은 아래에서 확인된 아미노산 서열들 중의 하나를 갖는 hT2R 을 암호화하는 DNA 를 발현시키는 테스트 세포를 이용할 것이다. 그러나, 이들 쓴맛 수용체의 기능적 특성을 보유하는, 즉 어떤 쓴맛 화합물에 반응하는 이들 수용체 폴리펩타이드의 절편, 상동체, 변이체 또는 키메라가 이들 분석에서 유용할 것이라는 것이 예상된다. 그와 같은 변이체의 예는 접합(splice) 변이체, 단일 뉴클레오타이드 다형성, 대립유전자 변이체, 및 재조합 또는 화학 수단에 의해 생산되거나 자연 발생 돌연변이를 포함한다. 본 발명의 분석, 및 수용체의 활성을 억제하는 화합물을 확인하기 위해 본 발명에 사용하기 위해 고려된 분석에 사용된 T2R 의 분리 및 발현 수단은 하기에 기재되어 있다.
T2R 의 분리 및 발현
본 발명의 T2R, 또는 이의 절편 또는 변이체의 분리 및 발현은 출원에 개시된 T2R 핵산 서열을 근거로 한 구성된 프로브 또는 프라이머를 사용하여 잘 확립된 클로닝 절차에 의해 달성될 수 있다. 관련 T2R 서열은 또한 본 명세서에 개시된 서열 및 및 공지된 컴퓨터 기반 탐색 기술, 예를 들어, BLAST 서열 탐색을 사용하여 인간 또는 다른 종 게놈 데이타베이스로부터 확인될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 개시된 유사유전자는 기능적 대립유전자 또는 관련 유전자를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
그 다음, 발현 벡터는 이들 서열의 기능적 발현을 위해 숙주세포를 감염시키거나 형질감염하기 위해 사용될 수 있다. 이들 유전자 및 벡터는 시험관내 또는 생체내에서 만들어지고 발현될 수 있다. 당업자는, 핵산 발현을 변경 및 조절하기 위한 목적 표현형이 본 발명의 벡터 내에서 유전자 및 핵산 (예를 들어, 프로모터, 인핸서 등)의 발현 또는 활성을 조절함으로써 얻을 수 있다는 것을 인식할 것이다. 발현 또는 활성을 증가 또는 감소시키기 위해 기재된 어떤 공지된 방법을 사용할 수 있다. 본 발명은 과학 및 특허 문헌에 잘 기재되어 있는, 선행기술에 공지된 어떤 방법 또는 프로토콜과 함께 실시될 수 있다.
대안적으로, 이들 핵산은 예를 들어 하기에 기재된 바와 같이 공지된 화학 합성 기술에 의해 시험관내에서 합성될 수 있다: Carruthers, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-18 (1982); Adams, Am. Chem. Soc., 105:661 (1983); Belousov, Nucleic Acids Res. 25:3440-3444 (1997) Frenkel, Free Radic. Biol. Med. 19:373-380 (1995); Blommers, Biochemistry 33:7886-7896 (1994); Narang, Meth. Enzymol. 68:90 (1979); Brown, Meth. Enzymol. 68:109 (1979); Beaucage, Tetra. Lett. 22:1859 (1981); U.S. 특허 No. 4,458,066. 그 다음, 이본쇄 DNA 절편은 상보적 가닥을 합성하고 적합한 조건 하에서 가닥을 어닐링(annealing)하거나, 적합한 프라이머 서열을 갖는 DNA 폴리머라제를 사용하여 상보적 가닥을 첨가하여 얻을 수 있다.
핵산의 처리, 예를 들어 서열에서 돌연변이를 산출하고, 서브클로닝(subcloning), 프로브 표지화(labeling), 시퀀싱(sequencing), 하이브리드화 등의 기술은 과학 및 특허 문헌에 기재되어 있다. 참조, 예를 들어, Sambrook, ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989); Ausubel, ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); Tijssen, ed., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I, Theory and Nucleic Acid Preparation, Elsevier, N.Y. (1993).
핵산, 벡터, 캡시드(capsid), 폴리펩타이드 등은 당업자에게 공지된 수많은 일반적인 기술 중 어떤 것에 의해 분석 및 정량화될 수 있다. 이들은 예를 들어 하기를 포함한다: 분석 생화학 방법, 예컨대 NMR, 분광광도법, 방사선촬영, 전기영동, 모세관 전기영동, 고속액체 크로마토그래피 (HPLC), 박층 크로마토그래피 (TLC), 및 초고확산 크로마토그래피, 다양한 면역 방법, 예를 들어, 유체 또는 겔 침강소 반응, 면역확산, 면역전기영동, 방사선면역분석 (RIA), 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISA), 면역형광 분석, 써던(Southern) 분석, 노던(Northern) 분석, 닷블롯(dot-blot) 분석, 겔 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE), RT-PCR, 정량 PCR, 다른 핵산 또는 표적 또는 신호 증폭법, 방사성표지화(radiolabeling), 섬광계수기, 및 친화성 크로마토그래피.
올리고뉴클레오타이드 프라이머는 T2R 리간드 결합 부위를 암호화하는 핵산을 증폭하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 핵산은 또한 증폭 기술을 사용하여 정량적으로 클로닝(cloning) 또는 측정될 수 있다. 증폭 방법은 또한 선행기술에 공지되어 있고 예를 들어 하기를 포함한다: 폴리머라제 사슬 반응 (PCR) (Innis ed., PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications, Academic Press, N.Y. (1990); Innis ed., PCR Strategies, Academic Press, Inc., N.Y. (1995)); 리가제 사슬 반응 (LCR) (Wu, Genomics, 4:560 (1989); Landegren, Science, 241:1077 (1988); Barringer, Gene, 89:117 (1990)); 전사 증폭 (Kwoh, PNAS, 86:1173 (1989)); 자기지속 서열 복제 (Guatelli, PNAS, 87:1874 (1990)); Q 베타 레플리카제 증폭 (Smith, J. Clin. Microbiol., 35:1477-91 (1997)); 자동 Q-베타 레플리카제 증폭 분석 (Burg, Mol. Cell. Probes, 10:257-71 (1996)); 및 다른 RNA 폴리머라제 매개 기술 (예를 들어, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario). 참조, 또한, Berger, Methods Enzymol., 152:307-16 (1987); Sambrook; Ausubel; U.S. 특허 Nos. 4,683,195 and 4,683,202; Sooknanan, Biotechnology, 13:563-64 (1995).
일단 증폭되면, 핵산은, 필요에 따라, 개별적으로 또는 라이브러리로서, 선행기술에 공지된 방법에 따라 일상적인 분자생물학적 방법을 사용하여 어떤 다양한 벡터로 클로닝될 수 있고; 시험관내 증폭된 핵산을 클로닝하는 방법은 예를 들어, U.S. 특허 No. 5,426,039 에 기재되어 있다. 증폭된 서열의 클로닝을 촉진하기 위해서, 제한 효소 부위는 PCR 프라이머 쌍"에 만들어"질 수 있다. 예를 들어, Pst I 및 Bsp E1 부위는 본 발명의 예시적인 프라이머 쌍에 설계되었다. 이들 특정 제한 부위는 부위가 접합된 7-막 수용체 "공여체" 암호화 서열에 대해 "인프레임(in-frame)"인 서열을 갖는다 (리간드 결합 부위 암호화 서열은 7-막 폴리펩타이드에 대해 내재하고, 따라서, 구성이 제한 효소 접합 부위의 번역된 하류인 것이 바람직하다면, 골격을 벗어난 결과는 피해야하고; 이는, 삽입된 리간드 결합 부위가 대부분의 막관통 VII 부위를 실질적으로 포함한다면 필요하지 않을 수 있다). 프라이머는 "공여체" 7-막 수용체의 최초 서열을 보유하기 위해 설계될 수 있다. 대안적으로, 프라이머는 보존적 치환 (예를 들어, 소수성 잔기에 대한 소수성, 상기 논의 참조) 또는 기능적으로 양호한 치환 (예를 들어, 이는 원형질막 삽입을 방지하고, 이에 따라 펩티다제에 의한 절단을 야기하고, 또한 수용체의 비정상 폴딩을 야기한다 등)인 아미노산 잔기를 암호화할 수 있다.
프라이머 쌍은 T2R 단백질의 리간드 결합 부위를 선택적으로 증폭하기 위해 설계될 수 있다. 이들 결합 부위는 상이한 리간드에 대해서 변할 수 있고; 따라서, 하나의 리간드에 대해 최소 결합 부위일 수 있는 것은, 제2 잠재적인 리간드에 대해 너무 제한적일 수 있다. 따라서, 상이한 영역 구조를 포함하는 상이한 크기의 결합 부위는 증폭될 수 있고; 예를 들어, 7-막관통 T2R의 막관통 (TM) 영역 II 내지 VII, III 내지 VII, III 내지 VI 또는 II 내지 VI, 또는 이의 변화 (예를 들어, 특정 영역의 서브서열만, 영역의 순서를 혼합함 등).
많은 7-막 T2R 단백질의 영역 구조 및 서열은 공지되어 있기 때문에, 당업자는 축퇴성 증폭 프라이머 쌍을 설계하기 위해 모델 서열로서 영역 플랭킹(flanking) 및 내부 영역 서열을 쉽게 선택할 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열 암호화 영역 부위 II 내지 VII 는 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭에 의해 산출될 수 있다. 막관통 영역 I (TM I) 서열을 포함하는 핵산을 증폭하기 위해, 축퇴성 프라이머는 상기에 기재된 T2R 패밀리 공통 서열 1 의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산으로부터 설계될 수 있다. 그와 같은 축퇴성 프라이머는 결합 부위 혼입 TM I 내지 TM III, TM I 내지 TM IV, TM I 내지 TM V, TM I 내지 TM VI 또는 TM I 내지 TM VII 을 산출하기 위해 사용될 수 있다. 다른 축퇴성 프라이머는 다른 T2R 패밀리 공통 서열을 근거로 설계될 수 있다. 그와 같은 축퇴성 프라이머는 결합 부위 혼입 TM III 내지 TM IV, TM III 내지 TM V, TM III 내지 TM VI 또는 TM III 내지 TM VII 를 산출하기 위해 사용될 수 있다.
축퇴성 프라이머 쌍을 설계하기 위한 패러다임은 선행기술에 공지되어 있다. 예를 들어, COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer (CODEHOP) 전략 컴퓨터 프로그램은 http://blocks.fhcrc.org/codehop.html 로서 접근 가능하고, 공지된 미각 수용체 리간드 결합 부위로서 관련 단백질 서열의 세트로 시작하는 하이브리드 프라이머 예측에 대해 lockMaker 다수의 서열 정렬 부위로부터 직접 연결된다 (참조, 예를 들어, Rose, Nucleic Res., 26:1628-35 (1998); Singh, Biotechniques, 24:318-19 (1998)).
올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 합성하는 수단은 선행기술에 공지되어 있다. "천연" 염기 쌍 또는 합성 염기 쌍이 사용될 수 있다. 예를 들어, 인공적인 뉴클레오베이스의 사용은 프라이머 서열을 처리하고 증폭 생성물의 복합 혼합물을 산출하기 위해 다양한 접근을 제공한다. 인공적인 뉴클레오베이스의 다양한 패밀리는 축퇴성 분자 인식에 대한 수단을 제공하기 위해 내부 결합 회전을 통해 다수의 수소 결합 지향성을 추정할 수 있다. 이들 유사체의, PCR 프라이머의 단일 위치로의 혼입은 증폭 생성물의 복합 라이브러리의 산출을 허용한다. 참조, 예를 들어, Hoops, Nucleic Acids Res., 25:4866-71 (1997). 무극성 분자는 또한 천연 DNA 염기의 형태를 모방하기 위해 사용될 수 있다. 아데닌에 대한 비수소 결합 형태의 모방체는 티민에 대한 무극성 형태의 모방체에 대해 효율적이고 선택적으로 복제할 수 있다 (참조, 예를 들어, Morales, Nat. Struct. Biol., 5:950-54 (1998)). 예를 들어, 2개의 축퇴성 염기는 피리미딘 염기 6H, 8H-3,4-디하이드로피리미도[4,5-c][1,2]옥사진-7-온 또는 퓨린 염기 N6-메톡시-2,6-디아미노퓨린일 수 있다 (참조, 예를 들어, Hill, PNAS, 95:4258-63 (1998)). 본 발명의 예시적인 축퇴성 프라이머는 뉴클레오베이스 유사체 5'-디메톡시트리틸-N-벤조일-2'-데옥시-시티딘,3'-[(2-시아노에틸)--(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트(서열에서 용어 "P", 상기 참조)일 수 있다. 이 피리미딘 유사체는 A 및 G 잔기를 포함하는 퓨린과 수소결합한다.
본 명세서에 개시된 미각 수용체와 실질적으로 동일한 다형적 변이체, 대립유전자, 및 이종간 동족체는 상기에 기재된 핵산 프로브를 사용하여 분리될 수 있다. 대안적으로, 발현 라이브러리는 T2R 동족체를 인식하고 선택적으로 결합하는 T2R 폴리펩타이드에 대해 만들어진 항혈청 또는 정제 항체로 발현된 동족체를 면역적으로 검출하여 T2R 폴리펩타이드 및 다형적 변이체, 이의 대립유전자, 및 이종간 동족체를 클로닝하기 위해 사용될 수 있다.
미각 수용체의 리간드 결합 부위를 암호화하는 핵산은 적합한 (완전한 또는 축퇴성) 프라이머 쌍을 사용하여 접합한 핵산 서열의 증폭 (예를 들어, PCR)에 의해 산출될 수 있다. 증폭된 핵산은 미각 수용체 발현 세포로부터 유도된 어떤 세포 또는 조직 또는 mRNA 또는 cDNA로부터의 게놈 DNA 일 수 있다.
하나의 구현예에서, 전좌 서열에 융합된 T2R 을 암호화하는 핵산을 포함하는 하이브리드 단백질 암호화 서열이 구성될 수 있다. 또한, 전좌 모티프, 및 화학적 감각 수용체, 특히 미각 수용체의 다른 패밀리의 맛 도출 화합물 결합 부위를 포함하는 하이브리드 T2R 를 제공한다. 이들 핵산 서열은 전사 또는 번역 조절 요소, 예를 들어, 전사 및 번역 개시 서열, 프로모터 및 인핸서, 전사 및 번역 터미네이터(terminator), 폴리아데닐레이션 서열, 및 DNA 를 RNA 로 전사하는데 유용한 다른 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 재조합 발현 카세트, 벡터 및 형질전환의 구성에서, 프로모터 절편은 모든 목적 세포 또는 조직에서 목적 핵산의 발현을 이끌기 위해 이용될 수 있다.
다른 구현예에서, 융합 단백질은 C-말단 또는 N-말단 전좌 서열을 포함할 수 있다. 또한, 융합 단백질은 예를 들어, 단백질 검출, 정제, 또는 다른 적용에 대한 추가 요소를 포함할 수 있다. 검출 및 정제 촉진 영역은 예를 들어 하기를 포함한다: 금속 킬레이팅(chelating) 펩타이드, 예컨대 폴리히스티딘 트랙(tract), 히스티딘-트립토판 모듈, 또는 고정화 금속에 대한 정제를 허용하는 다른 영역; 말토스 결합 단백질; 고정화 면역글로불린에 대한 정제를 허용하는 단백질 A 영역; 또는 FLAGS 신장/친화성 정제 시스템에 이용된 영역 (Immunex Corp, Seattle Wash).
(유효한 원형질막 발현에 대한) 전좌 영역 및 새로 번역된 폴리펩타이드의 나머지 사이의 절개가능 링커 서열, 예컨대 인자 Xa (참조, 예를 들어, Ottavi, Biochimie, 80:289-93 (1998)), 서브틸리신 프로테아제 인식 모티프 (참조, 예를 들어, Polyak, Protein Eng., 10:615-19 (1997)); 엔테로키나아제 (Invitrogen, San Diego, Calif.) 등의 포함은 정제를 촉진하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 하나의 구성은 6개의 히스티딘 잔기, 그 다음, 티오레독신에 연결된 핵산 서열을 암호화하는 폴리펩타이드, 엔테로키나아제 분절부위 (참조, 예를 들어, Williams, Biochemistry, 34:1787-97 (1995)), 및 C-말단 전좌 영역을 포함할 수 있다. 히스티딘 잔기는 검출 및 정제를 촉진하고, 한편 엔테로키나아제 분절부위는 융합 단백질의 나머지로부터 목적 단백질(들)을 정제하기 위한 수단을 제공한다. 융합 단백질을 암호화하는 벡터 및 융합 단백질의 적용에 관한 기술은 과학 및 특허 문헌에 기재되어 있다 (참조, 예를 들어, Kroll, DN세포. Biol,. 12:441-53 (1993)).
리간드 결합 부위 암호화 서열을 포함하는, 개별 발현 벡터로서 또는 발현 벡터의 라이브러리로서 발현 벡터는 게놈에 또는 세포질 또는 세포의 핵에 도입될 수 있고 과학 및 특허 문헌에 기재된 다양한 종래 기술에 의해 발현될 수 있다. 참조, 예를 들어, Roberts, Nature, 328:731 (1987); Berger supra; Schneider, Protein Exper. Purif., 6435:10 (1995) Sambrook; Tijssen; Ausubel. 생물학적 시약 및 실험 장비의 제조자로부터의 제품 정보는 또한 공지된 생물학적 방법에 관한 정보를 제공한다. 벡터는 천연 공급원으로부터 분리되고, ATCC 또는 GenBank 라이브러리로서 그와 같은 공급원으로부터 얻고, 또는 합성 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다.
핵산은 세포에서 안정적으로 또는 일시적으로 발현되는 발현 카세트, 벡터 또는 바이러스에서 발현될 수 있다 (예를 들어, 에피솜 발현 시스템). 선택 마커(marker)는 형질변환된 세포 및 서열 상에 선택가능 표현형을 부여하기 위해 발현 카세트 및 벡터에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 선택 마커는 에피솜 유지 및 복제를 암호화할 수 있고, 이에 따라 숙주 게놈으로의 통합이 필요하지 않다. 예를 들어, 마커는 목적 DNA 서열로 형질변환된 세포의 선택을 허용하기 위해 항생물질에 대한 내성 (예를 들어, 클로람페니콜, 카나마이신, G418, 블레오마이신, 하이그로마이신) 또는 제초제 내성 (예를 들어, 클로로설푸론 또는 Basta)을 암호화할 수 있다 (참조, 예를 들어, Blondelet-Rouault, Gene, 190:315-17 (1997); Aubrecht, J. Pharmacol. Exp. Ther., 281:992-97 (1997)). 네오마이신 또는 하이그로마이신과 같은 지질에 내성을 부여하는 선택가능 마커 유전자는 단지 조직 배양에 이용될 수 있기 때문에, 화학물질저항성 유전자는 또한 시험관내 및 생체내 선택가능 마커로서 사용된다.
키메라 핵산 서열은 어떤 7-막관통 폴리펩타이드 내의 T2R 리간드 결합 부위를 암호화할 수 있다. 7-막관통 수용체 폴리펩타이드는 유사한 1차 서열 및 2차 및 3차 구조를 갖기 때문에, 구조 영역은 (예를 들어, 세포외 영역, TM 영역, 세포질 영역 등)은 서열 분석에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 예를 들어, 상동성 모델링, 푸리에(Fourier) 분석 및 나선 주기성 검출은 7-막관통 수용체 서열을 갖는 7개의 영역을 확인하고 그 특성을 기술할 수 있다. 고속 푸리에 변환 (FFT) 알고리듬은 분석된 서열의 소수성 및 가변성의 프로파일의 특성을 기술하는 주요 기간을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 주기성 검출 상승 및 알파 나선 주기성 인덱스(index)는 예를 들어, Donnelly, Protein Sci., 2:55-70 (1993)에 의해 행해질 수 있다. 다른 정렬 및 모델링 알고리듬은 선행기술에 공지되어 있다 (참조, 예를 들어, Peitsch, Receptors 채널, 4:161-64 (1996); Kyte & Doolittle, J. Md. Biol., 157:105-32 (1982); 및 Cronet, Protein Eng., 6:59-64 (1993).
본 발명은 또한 지정된 핵산 및 아미노산 서열을 갖는 핵산 분자 및 폴리펩타이드뿐만 아니라 이의 절편, 특히 예를 들어, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 또는 250 뉴클레오타이드, 또는 그 이상의 절편, 및 예를 들어 10, 20, 30, 50, 70, 100, 또는 150 아미노 산, 또는 그 이상의 폴리펩타이드 절편을 포함한다. 임의로, 핵산 절편은 T2R 패밀리 구성원에 대해 상승된 항체에 결합할 수 있는 항원 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질 절편은 임의로 T2R 패밀리 구성원에 대해 상승된 항체에 결합할 수 있는 항원 절편일 수 있다.
또한 다른 GPCR 의 모두 또는 일부, 바람직하게는 7 막관통 슈퍼패밀리의 구성원을 대표하는 추가 아미노산에 커플링(coupling)된 본 명세서에 기재된 T2R 폴리펩타이드의 적어도 하나의 적어도 10, 20, 30, 50, 70, 100, 또는 150개의 아미노 산, 또는 그 이상을 포함하는 키메라 단백질이 고려된다. 이들 키메라는 즉각적인 수용체 및 다른 GPCR 로부터 만들어질 수 있고, 또는 2이상의 본 수용체를 조합하여 만들어 질 수 있다. 하나의 구현예에서, 키메라의 하나의 부분은 본 발명의 T2R 폴리펩타이드의 막관통 영역에 상응하거나 그 영역으로부터 유도된다. 다른 구현예에서, 키메라의 하나의 부분은 본 명세서에 기재된 T2R 폴리펩타이드의 막관통 영역에 상응하거나 그 영역으로부터 유도되고, 나머지 부분(들)은 다른 GPCR 로부터 유래될 수 있다. 키메라 수용체는 선행기술에 공지되어 있고, 그것을 만들기 위한 기술, 및 혼힙하기 위한 G 단백질 커플링된 수용체의 영역 도는 절편의 선택 및 경계는 또한 공지되어 있다. 선행기술에 공지된 이러한 지식은 그와 같은 키메라 수용체를 만들기 위해 쉽게 사용될 수 있다. 그와 같은 키메라 수용체의 사용은 예를 들어 다른 수용체, 예컨대 선행기술인 분석 시스템에 사용된 공지된 수용체의 신호 전달 특성과 커플링된, 본 명세서에 구체적으로 개시된 수용체 중의 하나가 특징인 미각 선택성을 제공할 수 있다.
예를 들어, 부위, 예컨대 리간드 결합 부위, 세포외 영역, 막관통 영역, 막관통 영역, 세포질 영역, N-말단 영역, C-말단 영역, 또는 이의 어떤 조합은 이종 단백질에 공유적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, T2R 막관통 부위는 이종 GPCR 막관통 영역에 연결될 수 있거나, 이종 GPCR 세포외 영역은 T2R 막관통 부위에 연결될 수 있다. 선택된 다른 이종 단백질은 예를 들어, 녹색형광 단백질, 베타-갈락토시다아제 폴리펩타이드, 글루타메이트 수용체, 및 로돕신 폴리펩타이드, 예를 들어, 로돕신 예를 들어, 소(bovine) 로돕신의 N-말단 절편을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 T2R, 절편, 또는 변이체를 발현시킥기 위한 상이한 숙주세포를 사용하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 클로닝된 유전자 또는 핵산, 예컨대 본 발명의 cDNA 암호화 T2R, 절편, 또는 변이체의 고수준 발현을 얻기 위해서, 당업자는 전형적으로 관심을 끄는 핵산 서열을, 전사, 전사/번역 터미네이터, 및 단백질을 암호화하는 핵산에 대해서라면, 번역 개시용 리보솜 결합 부위를 이끌기 위해 강한 프로모터를 함유하는 발현 벡터로 서브클로닝한다. 적당한 박테리아 프로모터는 선행기술에 공지되어 있고, 예를 들어 Sambrook et al 에 기재되어 있다. 바람직하게는, 진핵세포 발현 시스템은 대상체인 hT2R 수용체를 발현시키기 위해 사용된다.
외래의 뉴클레오타이드 서열을 숙주세포에 도입하기 위한 어떤 공지된 절차가 사용될 수 있다. 이들은 인산칼슘 형질감염, 폴리브렌(polybrene), 세포융합, 전기천공법, 리포솜, 미량주사, 혈장 벡터, 바이러스 벡터 및 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 다른 외래의 유전자 물질을 숙주세포에 도입하기 위한 어떤 공지된 방법의 사용을 포함한다 (참조, 예를 들어, Sambrook et al). 특정 유전자 조작 절차가, 관심을 끄는 T2R, 절편, 또는 변이체를 발현시킬 수 있는 숙주세포에 하나 이상의 핵산 분자를 성공적으로 도입할 수 있도록 사용되는 것이 단지 필요하다.
발현 벡터가 세포에 도입된 후, 형질감염된 세포는 조건 하에서 배양된다. 관심을 끄는 수용체, 절편, 또는 변이체의 발현을 돕는 조건 하에서 배양되고, 그 다음, 표준 기술을 사용하여 배양으로부터 회수된다. 그와 같은 기술의 예는 선행기술에 공지되어 있다. 참조, 예를 들어, WO 00/06593, 이는 본 명세서와 일치하는 방식으로 참고로 포함되어 있다.
본 발명에 따른 hT2R 의 활성을 조절하는 화합물의 검출을 위한 분석방법
테스트 화합물이 시험관내 및 생체내에서 본 발명의 T2R 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 지를 측정하기 위한 방법 및 조성물은 하기에 기재되어 있다. 세포 생리의 많은 측면은 자연 발생 또는 키메라 T2R 에의 리간드 결합의 효과를 평가하기 위해 모니터될 수 있다. 이들 분석은 T2R 폴리펩타이드를 발현시키는 완전한 세포, 투과된 세포 또는 표준 방법에 의해 생산된 막 분획에 대해 수행될 수 있다.
미각 수용체는 맛 유발 화합물을 결합하고, 화학 자극의 전기 신호로의 전달을 개시한다. 활성 또는 억제된 G 단백질은 표적 효소, 채널, 및 다른 작동체 단백질의 특성을 차례차례 변경할 것이다. 일부 예는 시각계에서 트랜스듀신에 의한 cGMP 포스포디에스테라제, 자극 G 단백질에 의한 아데닐(산) 시클라아제, Gq 및 다른 동족 G 단백질에 의한 포스포리파제 C 의 활성, 및 Gi 및 다른 G 단백질에 의한 다양한 채널의 조절이다. 하향성 결과는 또한 포스포리파제 C 에 의한 디아실 글리세롤 및 IP3 의 산출로서, 그리고 IP3 에 의한 칼슘 이동에 대해 테스트될 수 있다.
분석의 대상체 hT2R 단백질 또는 폴리펩타이드는 전형적으로 특허청구범위 앞에 기재된 서열 목록에 함유된 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 이의 절편 또는 보존적 변형된 변이체으로부터 선택될 것이다.
대안적으로, 분석의 T2R 단백질 또는 폴리펩타이드는 진핵세포 숙주세포로부터 유도될 수 있고, 이들 hT2R 폴리펩타이드 또는 이의 보존적으로 변형된 변이체에 대한 어떤 % 의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 아미노산 서열 동일성은 적어도 30%, 바람직하게는 30-40%, 더 구체적으로 50-60, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일 것이다. 임의로, 분석의 T2R 단백질 또는 폴리펩타이드는 T2R 폴리펩타이드의 부위, 예컨대 세포외 영역, 막관통 부위, 세포질 영역, 리간드 결합 영역 등을 포함할 수 있다. 임의로, 본 명세서에 예시된 바와 같이, T2R 폴리펩타이드, 또는 이의 부분은 본 명세서에 기재된 분석에 사용된 키메라 단백질을 만들기 위해 이종 단백질에 공유적으로 연결될 수 있다.
T2R 활성의 조절제는 재조합 또는 자연 발생으로 상기에 기재된 T2R 단백질 또는 폴리펩타이드를 사용하여 테스트될 수 있다. T2R 단백질 또는 폴리펩타이드는 재조합으로 또는 자연 발생적으로 분리, 세포에서 발현, 세포로부터 유로된 막에서 발현, 조직 또는 동물에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 혀 절편, 혀로부의 분리 세포, 형질변환된 세포, 또는 막이 사용될 수 있다. 조절은 본 명세서에 기재된 시험관내 또는 생체내 분석 중의 하나를 사용하여 테스트될 수 있다.
조절제의 검출
테스트 화합물이 시험관내 및 생체내에서 본 발명의 T2R 수용체에 특이적으로 결합하는 지를 측정하기 위한 방법 및 조성물은 하기에 기재되어 있다. 세포 생리의 많은 측면은 본 발명의 T2R 폴리펩타이드의 리간드 결합의 효과를 평가하기 위해 모니터될 수 있다. 이들 분석은 화학적 감각 수용체를 발현시키는 완전한 세포, 투과된 세포 또는 표준 방법에 의해 생산된 막 분획 또는 새로 합성된 단백질의 시험관내 사용에 대해 수행될 수 있다.
생체내에서, 미각 수용체는 맛 조절 화합물을 결합하고, 화학 자극의 전기 신호로의 전달을 개시한다. 활성 또는 억제된 G 단백질은 표적 효소, 채널, 및 다른 작동체 단백질의 특성을 차례차례 변경할 것이다. 일부 예는 시각계에서 트랜스듀신에 의한 cGMP 포스포디에스테라제, 자극 G 단백질에 의한 아데닐(산) 시클라아제, Gq 및 다른 동족 G 단백질에 의한 포스포리파제 C 의 활성, 및 Gi 및 다른 G 단백질에 의한 다양한 채널의 조절이다. 하향성 결과는 또한 포스포리파제 C 에 의한 디아실 글리세롤 및 IP3 의 산출로서, 그리고 IP3 에 의한 칼슘 이동에 대해 테스트될 수 있다.
대안적으로, 분석의 T2R 단백질 또는 폴리펩타이드는 진핵세포 숙주세포로부터 유도될 수 있고, 이들 본 명세서에 개시된 hT2R 폴리펩타이드, 또는 이의 절편 보존적으로 변형된 변이체에 대한 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 아미노산 서열 동일성은 적어도 35 내지 50%, 또는 임의로 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일 것이다. 임의로, 분석의 T2R 단백질 또는 폴리펩타이드는 T2R 단백질의 영역, 예컨대 세포외 영역, 막관통 부위, 세포질 영역, 리간드 결합 영역 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기에 기재된 바와 같이, T2R 단백질, 또는 이의 영역은 본 명세서에 기재된 분석에 사용된 키메라 단백질을 만들기 위해 이종 단백질에 공유적으로 연결될 수 있다.
T2R 활성의 조절제는 재조합 또는 자연 발생으로 상기에 기재된 T2R 단백질 또는 폴리펩타이드를 사용하여 테스트될 수 있다. T2R 단백질 또는 폴리펩타이드는 재조합으로 또는 자연 발생적으로 분리, 세포에서 발현, 세포로부터 유로된 막에서 발현, 조직 또는 동물에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 혀 절편, 혀로부의 분리 세포, 형질변환된 세포, 또는 막이 사용될 수 있다. 조절은 본 명세서에 기재된 시험관내 또는 생체내 분석 중의 하나를 사용하여 테스트될 수 있다.
시험관내 결합 분석
맛 전달은 또한 본 발명의 T2R 폴리펩타이드를 사용하여 가용 또는 고형 상태 반응으로 시험관내에서 테스트될 수 있다. 특정 구현예에서, T2R 리간드 결합 영역은 리간드 결합에 대해 분석하기 위해 가용 또는 고형 상태 반응에 시험관내에서 사용될 수 있다.
리간드 결합 영역이 세포외 영역의 추가 부분, 예컨대 막관통 영역의 세포외 루프와 함께 N-말단 영역에 의해 형성될 수 있다.
시험관내에서, 결합 분석은 다른 GPCR, 예컨대 친대사성 글루타메이트 수용체와 함께 사용되었다 (참조, 예를 들어, Han 및 Hampson, J. Biol. Chem. 274:10008-10013 (1999)). 이들 분석은 방사성으로 또는 형광성으로 표지된 리간드를 대체하는 것을 필요로 하고, 이는 고유 형광의 변화 또는 단백질분해 민감성의 변화 등을 측정한다.
본 발명에 따른 T2R 폴리펩타이드에 결합하는 리간드는 용액, 고상에 임의로 부착된 이중층 막, 지질 단일층, 또는 소낭에서 테스트될 수 있다. 조절제의 결합은 예를 들어, 분광 특성 (예를 들어, 형광, 흡광도, 굴절률), 수력학적 (예를 들어, 형태), 색층분석, 또는 용해도 특성의 변화를 사용하여 테스트될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, [35S]GTPγS 결합 분석이 사용된다. 상기에 기재된 바와 같이, GPCR 의 활성화 시에, G 단백질 복합체의 Ga 서브유닛은 자극되어 결합된 GDP 를 GTP 로 교환한다. G 단백질 교환 활성의 리간드 매개 자극은 추정 리간드의 존재에서, 첨가된 방사성으로 표지된 [35S]GTPγS 의 G 단백질로의 결합을 측정하여 생화학 분석에서 측정될 수 있다. 전형적으로, 관심을 끄는 화학적 감각 수용체를 함유하는 막은 G 단백질과 혼합된다. 잠재적인 억제제 및/또는 활성제 및 [35S]GTPγS 는 분석에 추가되고, [35S]GTPγS 의 G 단백질에의 결합이 측정된다. 결합은 액체 섬광 카운팅(counting), 또는 섬광 근접 측정법 (SPA)을 포함하는, 선행기술에 공지된 어떤 다른 수단에 의해 측정될 수 있다. 다른 분석 형식에서, 형광성으로 표지된 GTPγS 이 이용될 수 있다.
형광 편광 분석
다른 구현예에서, 형광 편광 ("FP")계 분석은 리간드 결합을 검출 및 모니터하기 위해 사용될 수 있다. 형광 편광은 평형상태 결합, 핵산 하이브리드화, 및 효소 활성을 측정하기 위한 다양한 실험실 기술이다. 형광 편광 분석은 분리 단계, 예컨대 원심분리, 여과, 크로마토그래피, 침전, 또는 전기영동를 필요로 하지 않는다는 점에서 동질적이다. 이들 분석은 용액에서 직접적으로 실시간으로 행해지고, 고정상을 필요로 하지 않는다. 편광 값은 반복적으로 그리고 시약의 첨가 후에 측정될 수 있는데, 그 이유는, 편광의 측정이 신속하고 샘플을 파괴하지 않기 때문이다. 일반적으로, 이러한 기술은 낮은 피코몰(picomolar)로부터 마이크로몰(micromolar) 수준으로의 형광염료의 편관 값을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 이 단락은, 형광 편광이 리간드의 본 발명의 T2R 폴리펩타이드에의 결합을 측정하기 위해서 어떻게 샘플에서 및 정량적 방법으로 사용될 수 있는 지를 기재하고 있다.
형광성으로 표지된 분자가 평면 편광으로 여기될 때, 분자 회전에 반비례인 평광도를 갖는 빛을 방출한다. 큰 형광성으로 표지된 분자는 여기 상태(플루오레세인의 경우에 4 나노초) 동안에 비교적 정적 상태를 유지하고, 빛의 편광은 여기 및 방출 사이에서 비교적 일정하게 유지된다. 작은 형광성으로 표지된 분자는 여기 상태 동안에 빠르게 회전하고 평광은 여기 및 방출 사이에서 상당히 변한다. 따라서, 작은 분자는 낮은 편광 값을 가지고, 큰 분자는 높은 편광 값을 갖는다. 예를 들어, 단일가닥 플루오레세인 표지된 올리고뉴클레오타이드는 비교적 낮은 편광 값을 갖지만, 상보적 가닥으로 하이브리드화될 때, 높은 편광 값을 갖는다. 본 발명의 화학적 감각 수용체를 활성화 또는 억제할 수 있는 미각 유발 화합물 결합을 검출 및 모니터하기 위해 FP 를 사용할 때, 형광 표지된 미각 유발 화합물 또는 자가형광 미각 유발 화합물이 사용될 수 있다.
형광 편광 (P) 은 하기와 같이 정의된다:
Figure 112010017594708-pct00047
여기서, Intpar 는 여기광 평면에 평행한 방출광의 세기이고, Intperp 는 여기광 평면에 수직인 방출광의 세기이다. 광 세기의 비인 P 는 무차원 수이다. 예를 들어, BeaconTM 및 Beacon 2000TM 시스템은 이들 분석과 관련하여 사용될 수 있다. 그와 같은 시스템은 전형적으로 밀리(milli)편광 단위(1 편광 단위 = 1000 mP 단위) 에서 편광을 나타낸다.
분자 회전과 크기 사이의 관계는 페린(Perrin) 방정식에 의해 기재되고, 독자는 참고로 본 명세서에 통합되어 있는 Jolley, M. E. (1991, Journal of Analytical Toxicology, pp. 236-240)를 주목하는데, 이는 상기 방정식의 철저한 설명을 제공한다. 마찬가지로, 상기 페린 방정식은, 편광이 회전 완화시간(분자가 대략 68.5° 각으로 회전하는데 걸리는 시간)에 직접적으로 비례한다는 것을 제시한다. 회전 완화시간은 하기 방정식에 의한 점도 (eta.), 절대온도 (T), 분자 부피 (V), 및 기체상수 (R) 과 관련된다: 2(회전 완화시간) = 3 VRT
회전 완화시간은 작은 분자(예를 들어 플루오레세인)에 대해서는 작고(약 나노초), 큰 분자(예를 들어 면역글로불린)에 대해서는 크다 (약 100 나노초. 점도 및 온도가 일정하게 유지되면, 회전 완화시간, 및 편광은 분자 부피에 직접 관련된다. 분자 부피의 변화는 다른 분자와의 상호작용, 형광성으로 표지된 분자의 분리, 중합, 분해, 하이브리드화, 또는 형태 변화에 기인할 수 있다. 예를 들어, 형광 편광은 프로테아제, DNase, 및 RNase 에 의한 큰 플루오레세인 표지된 폴리머의 효소 절단을 측정하기 위해 사용되었다. 또한 단백질/단백질 상호작용에 대한 평형상태 결합, 항체/항원 결합, 및 단백질/DNA 결합을 측정하기 위해 사용되었다.
고체 상태 및 가용성 고효율 분석
또 다른 구현예에서, 본 발명은 T2R 폴리펩타이드를 사용하는 가용 분석; 또는 T2R 폴리펩타이드를 발현시키는 세포 또는 조직을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 고효율 포맷으로 고상계 시험관내 분석을 제공하는데; 여기서 T2R 폴리펩타이드, 또는 T2R 폴리펩타이드를 발현시키는 세포 또는 조직은 고상 기질 또는 미각 자극 화합물에 부착되고, T2R 수용체와 접촉하고, 결합은 T2R 수용체에 대해 상승된 항체 또는 적합한 태그를 사용하여 검출된다.
본 발명의 고효율 분석에서, 하루에 수천 개의 상이한 조절제 또는 리간드를 스크리닝할 수 있다. 특히 미량역가판의 각 웰은 선택된 잠재적인 조절제에 대한 별개의 분석을 수행하기 위해 사용될 수 있고, 또는 농도 또는 배양 시간 효과가 관찰되면, 매 5 내지 10개의 웰은 단일 조절제를 테스트할 수 있다. 따라서, 단일 표준 미량역가판은 약 100개 (예를 들어, 96개)의 조절제를 분석할 수 있다. 1536개의 웰 플레이트가 사용되면, 그때, 단일 플레이트는 약 1000 내지 약 1500개의 상이한 화합물을 쉽게 분석할 수 있다. 또한 각 플레이트 웰에서 다수의 화합물을 분석할 수 있다. 하루에 몇 개의 상이한 플레이트를 분석할 수 있고; 약 6,000-20,000개까지의 상이한 화합물에 대한 분석 스크린은 본 발명의 통합 시스템을 사용하여 가능하다. 아주 최근에, 시약 처리에 대한 미세유체적인 접근이 개발되었다.
관심을 끄는 분자는 공유 또는 비공유연결을 통해, 예를 들어 태그를 통해 직접 또는 간접적으로 고체 상태 성분에 결합될 수 있다. 상기 태그는 어떤 다양한 성분일 수 있다. 일반적으로, 태그를 결합하는 분자(태그 바인더)는 고형 지지체에 고정되고, 관심을 끄는 태그된(tagged) 분자(예를 들어, 관심을 끄는 맛 전달 분자)는 태그 및 태그 바인더의 상호작용에 의해 고형 지지체에 부착된다.
수많은 태그 및 태그 바인더는 문헌에 잘 기재된 공지된 분자 상호작용을 근거로 사용될 수 있다. 예를 들어, 태그가 천연 바인더, 예를 들어, 바이오틴, 단백질 A, 또는 단백질 G 를 가지는 경우에, 적합한 태그 바인더 (아비딘, 스트렙트아비딘, 뉴트르아비딘, 면역글로불린의 Fc 부위 등)과 연계하여 사용될 수 있다. 바이오틴과 같은 천연 바인더를 갖는 분자에 대한 항체는 또한 널리 이용가능하고, 태그 바인더 (참조, SIGMA Immunochemicals 1998 catalogue SIGMA, St. Louis Mo.)를 전용할 수 있다.
마찬가지로, 어떤 합텐 또는 항원 화합물은 태그/태그 바인더 쌍을 형성하기 위해 적합한 항체와 조합하여 사용될 수 있다. 수천 개의 특이적 항체는 상업적으로 이용할 수 있고, 많은 추가 항체는 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 하나의 공통 구성에서, 태그는 제1 항체이고, 태그 바인더는 제1 항체를 인식하는 제2 항체이다. 항체-항원 상호작용에 추가하여, 수용체-리간드 상호작용은 또한 태그 및 태그-바인더 쌍으로서 적합하다. 예를 들어, 세포막 수용체의 작용물질 및 길항물질 (예를 들어, 세포 수용체-리간드 상호작용, 예컨대 트랜스페린, c-키트, 바이러스 수용체 리간드, 사이토킨 수용체, 케모카인 수용체, 인터루킨 수용체, 면역글로불린 수용체 및 항체, 캐드헤린 패밀리, 인테그린 패밀리, 셀렉틴 패밀리 등; 참고, 예를 들어, Pigott & Power, The Adhesion Molecule Facts Book I (1993)). 마찬가지로, 독소 및 독액, 바이러스 에피토프, 호르몬 (예를 들어, 아편제, 스테로이드 등), 세포내 수용체 (예를 들어, 이는 다양한 작은 리간드의 효과를 절단한다, 스테로이드, 갑상선 호르몬, 레티노이드 및 비타민 D; 펩타이드 포함), 약물, 렉틴, 당, 핵산 (선형 및 환형 폴리머 구성 모두), 올리고당, 단백질, 인지질 및 항체 모두는 다양한 세포 수용체와 상호작용할 수 있다.
합성 폴리머, 예컨대 폴리우레탄, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 폴리우레아, 폴리아미드, 폴리에틸렌이민, 폴리아릴렌 설파이드, 폴리실록산, 폴리이미드, 및 폴리아세테이트는 또한 적합한 태그 또는 태그 바인더를 형성할 수 있다. 많은 다른 태그/태그 바인더 쌍은 또한 본 명세서의 검토시 당업자에게 뚜렷한 바와 같이 본 명세서에 기재된 분석 시스템에 유용하다.
공통적인 링커, 예컨대 펩타이드, 폴리에테르 등은 또한 태그로서 쓰일 수 있고, 폴리펩타이드 서열, 예컨대 약 5 내지 200개의 아미노산의 poly gly 서열을 포함한다. 그와 같은 유동 링커는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) 링커는 Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala)로부터 이용할 수 있다. 이들 링커는 임의로 아미드 결합, 설프히드릴 결합, 또는 헤테로기능적 결합을 갖는다.
태그 바인더는 현재 이용가능한 다양한 방법들 중의 어떤 것을 사용하여 고형 기질에 고정된다. 고형 기질은 일반적으로 기질의 전부 또는 일부를, 태그 바인더의 일부와 반응하는 표현에 화학 기를 고정하는 화학 시약에 노출시켜서 유도 또는 기능화된다. 예를 들어, 장쇄 부분에 부합하기에 적합한 기는 아민, 하이드록실, 티올, 및 카르복실 기를 포함한다. 아미노알킬실란 및 하이드록시알킬실란은 다양한 표면, 예컨대 유리 표면을 기능화하기 위해 사용될 수 있다. 그와 같은 고상 생물고분자 어레이의 구성은 문헌에 기재되어 있다. 참조, 예를 들어, Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963) (예를 들어, 펩타이드의 고상 합성을 기재하고 있음); Geysen 등, J. Immun. Meth., 102:259-274 (1987) (핀(pin)에 대한 고상 성분의 합성을 기재하고 있음); Frank & Doring, Tetrahedron, 44:60316040 (1988) (셀룰로스 디스크에 대한 다양한 펩타이드 서열의 합성을 기재하고 있음); Fodor 등, Science, 251:767-777 (1991); Sheldon 등, Clinical Chemistry, 39(4):718-719 (1993); 및 Kozal 등, Nature Medicine, 2(7):753759 (1996) (모두는 고형 기질에 고정된 생물고분자의 어레이를 기재하고 있음). 태그 바인더를 기질에 고정하기 위한 비화학적 접근은 다른 일반적인 방법, 예컨대 열, UV 조사에 의한 가교결합 등을 포함한다.
세포 기반 분석
하나의 바람직한 구현예에서, T2R 단백질은 비변형 형태로, 또는 분비 경로를 통한 약물표적화 및 성숙을 촉진하는 이종의 샤페론 서열을 갖는, 바람직하게는 갖지 않는 키메라, 변이체 또는 절단 수용체로서 진핵세포에서 발현된다. 그와 같은 T2R 폴리펩타이드는 어떤 진핵세포, 예컨대 HEK-293 세포에서 발현될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 기능적 G 단백질, 예를 들어, Gα15 또는 키메라 Gα16, 구스트듀신 또는 트랜스듀신 또는 키메라 G 단백질, 예컨대 G16gust44 를 포함하는데, 이는 키메라 수용체를 세포내 신호전달 경로 또는 신호전달 단백질, 예컨대 포스포리파제 C 에 연결할 수 있다. 그와 같은 세포에서의 T2R 수용체의 활성은 어떤 표준 방법을 사용하여, 예컨대 세포내 FURA-2 의존 형광을 검출하여 세포내 칼슘의 변화를 검출하여 검출될 수 있다. 그와 같은 분석은 본 출원에 제공된 실험적 발견을 근거로 한다.
활성화된 GPCR 수용체는 종종 수용체의 C-말단 꼬리(및 가능한 다른 부위)를 인산화하는 키나아제를 위한 기질이다. 따라서, 활성제는 섬광 계수기로 분석될 수 있는, 방사능표지 ATP 로부터 수용체까지의 32P 의 이동을 촉진할 것이다. C-말단 꼬리의 인산화는 어레스틴과 같은 단백질의 결합을 촉진할 것이고, G 단백질의 결합을 방해할 것이다. GPCR 신호 전달 및 신호 전달을 분석하는 방법의 일반적인 검토에 대해, 예를 들어 하기를 참고한다: Methods in Enzymology, vols. 237 and 238 (1994) and volume 96 (1983); Bourne 등, Nature, 10:349:117-27 (1991); Bourne 등, Nature, 348:125-32 (1990); Pitcher 등, Annu. Rev. Biochem., 67:653-92 (1998).
T2R 조절은 추정 T2R 조절제로 처리된 T2R 폴리펩타이드의 반응을 미처리된 대조군 샘플 또는 공지된 "양성(positive)" 대조군을 함유하는 샘플의 반응을 비교함으로써 분석될 수 있다. 그와 같은 추정 T2R 조절제는 T2R 폴리펩타이드 활성을 억제 또는 활성하는 분자를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, T2R 을 활성화시키는 화합물로 처리된 대조군 샘플은 100 의 상대적인 T2R 활성 값이 지정된다. T2R 폴리펩타이드의 억제는, 대조군 샘플에 대한 T2R 활성 값이 약 90%, 임의로 50%, 임의로 25-0% 일 때 달성된다. T2R 폴리펩타이드의 활성은, 대조군에 대한 T2R 활성 값이 110%, 임의로 150%, 200-500%, 또는 1000-2000% 일 때 달성된다.
이온 유속의 변화는 T2R 폴리펩타이드를 발현시키는 세포 또는 막의 이온 편광 (즉, 전위)의 변화를 측정하여 평가될 수 있다. 세포 편광의 변화를 측정하는 하나의 수단은 전압고정 및 패치클램프(patch-clamp) 기술로 전류의 변화를 측정(이에 따라 편광의 변화를 측정한다)하는 것이다 (참조, 예를 들어, "세포 부착(cell-attached)" 방식, "인사이드아웃(inside-out)" 방식, 및 "전세포(whole cell)" 방식, 예를 들어, Ackerman 등, New Engl. J Med., 336:1575-1595 (1997)). 전세포 전류는 표준을 사용하여 편리하게 측정된다. 다른 공지의 분석은 전압 민감성 염료를 사용하는 방사능표지 이온 유속 분석 및 형광 분석을 포함한다 (참조, 예를 들어, Vestergarrd-Bogind 등, J. Membrane Biol., 88:67-75 (1988); Gonzales & Tsien, Chem. Biol., 4:269-277 (1997); Daniel 등, J. Pharmacol. Meth., 25:185-193 (1991); Holevinsky 등, J. Membrane Biology, 137:59-70 (1994)).
폴리펩타이드의 기능에 대한 테스트 화합물의 효과는 상기의 파라미터들 중 어떤 것을 테스트하여 측정될 수 있다. GPCR 활성에 영향을 미치는 어떤 적합한 생리 변화는 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 테스트 화합물을 영향을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 기능적 결과가 완전한 세포 또는 동물을 사용하여 측정될 때, 또한 다양한 효과, 예컨대 트랜스미터(transmitter) 방출, 호르몬 방출, 공지되고 특성이 없는 유전자 마커에 대한 전사적 변화 (예를 들어, 노던블롯(northern blot)), 세포 대사작용의 변화, 예컨대 세포 성장 또는 pH 변화, 및 세포내 제2 메신저, 예컨대 Ca2 +, IP3, cGMP, 또는 cAMP 의 변화를 측정할 수 있다.
GPCR 에 대한 바람직한 분석은 수용체 활성을 보고하기 위해 이온 또는 전압 민감성 염료로 채워진 세포를 포함한다. 그와 같은 수용체의 활성을 측정하기 위한 분석은 또한 테스트된 화합물의 활성을 평가하기 위해 대조군으로부터 다른 G 단백질 연결 수용체에 대한 공지된 작용물질 및 길항물질을 사용할 수 있다. 조절 화합물(예를 들어, 작용물질, 길항물질)을 확인하기 위한 분석에서, 세포질 또는 막 전압에서의 이온의 수준의 변화는 이온 민감성 또는 막 전압 형광 지시약을 각각 사용하여 모니터될 것이다. 사용될 수 있는 이온 민감성 지시약 및 전압 프로브 중에서, Molecular Probes 1997 Catalog 에 개시된 것이 있다. G 단백질 연결 수용체에 대해, 무차별적인 G 단백질, 예컨대 Gα15 및 Gα16 은 선택된 분삭에 사용될 수 있다 (Wilkie 등, Proc. Nat'l Acad. Sci., 88:10049-10053 (1991)). 대안적으로, 다른 G 단백질, 예컨대 구스트듀신, 트랜스듀신 및 키메라 G 단백질, 예컨대 Gα16gust44 또는 Galpha16t25 이 사용될 수 있다.
수용체 활성은 다음의 세포내 사건, 예를 들어, 제2 메신저의 증가를 일으킨다. 어떤 G 단백질 연결 수용체의 활성은 포스파티딜리노시톨의 포스포리파제 C 매개 가수분해를 통한 인노시톨 트리포스페이트(IP3)의 형성을 자극한다 (Berridge & Irvine, Nature, 312:315-21 (1984)). IP3 는 차례차례 세포내 칼슘 이온 저장의 방출을 자극한다. 따라서, 세포질 칼슘 이온 수준의 변호, 또는 제2 메신저 수준의 변화, 예컨대 IP3 는 G 단백질 연결 수용체 기능을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 그와 같은 G 단백질 연결 수용체를 발현시키는 세포는 세포내 저장으로부터의 칼슘 방출 및 원형질막 이온 채널을 통한 세포외 칼슘 유입 모두로부터 기여의 결과로서 증가된 세포질 칼슘 수준을 나타낼 수 있다.
바람직한 구현예에서, T2R 폴리펩타이드 활성은 수용체를 포스포리파제 C 신호 전달 경로에 연결하는 무차별적인 G 단백질로 이종 세포에서 T2R 유전자를 발현시킴으로써 측정된다 (참고, Offermanns & Simon, J. Biol. Chem., 270:15175-15180 (1995)). 바람직하게는, 세포주는 HEK-293 (이는 보통 T2R 유전자를 발현시키지 않음)이고, 무차별적인 G 단백질은 Gα15 (Offermanns & Simon, 상기) 또는 키메라 G 단백질, 예컨대 G16gust44 이다. 미각 전달의 조절은 T2R 폴리펩타이드와 관련된 분자의 투여를 통해 T2R 신호 전달 경로의 조절에 응하여 변화하는 세포내 Ca2 + 수준의 변화를 측정하여 분석된다. Ca2+ 수준의 변화는 형광 Ca2+ 지시약 염료 및 형광 이미징(imaging)을 사용하여 임의로 측정된다.
다른 구현예에서, 포스파티딜 이노시톨 (PI) 가수분해는 U.S. 특허 No. 5,436,128 에 따라 분석될 수 있고, 이는 참고로 본 명세서에 통합되어 있다. 간단히 말해서, 분석은 48시간 이상 동안 세포를 3H-마이오이노시톨로 표지화하는 것을 수반한다. 표지된 세포는 테스트 화합물 1시간 동안 처리되고, 처리된 세포는 분리되고, 클로로포름-메탄올-물에서 추출되고, 그 후, 이노시톨 포스페이트는 이온 교환 크로마토그래피로 분리되고, 섬광 계측으로 정량화된다. 폴드(fold) 자극은 작용물질 존재에서의 cpm 대 완충용액 대조군의 존재에서 cpm 의 비를 계산하여 측정된다. 마찬가지로, 폴드(fold) 억제는 길항물질 존재에서의 cpm 대 완충용액 대조군(이는 작용물질을 함유하거나 그렇지 않을 수 있음)의 존재에서의 cpm 의 비를 계산하여 측정된다.
다른 수용체 분석은 세포내 환형 뉴클레오타이드, 예를 들어, cAMP 또는 cGMP 의 수준을 측정하는 것을 수반할 수 있다. 수용체의 활성이 환형 뉴클레오타이드 수준의 감소로 귀결되는 경우에, 분석에서 수용체 활성 화합물을 세포에 첨가하기 전에, 세포내 환형 뉴클레오타이드 수준을 증가시키는 제제, 예를 들어, 포스콜린에 세포를 노출시키는 것이 바람직할 수 있다. 하나의 구현예에서, 세포내 cAMP 또는 cGMP 의 변화는 면역분석을 사용하여 측정될 수 있다. 하기에 기재되어 있는 방법은 cAMP 의 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있다: Offermanns & Simon, J. Bio. Chem., 270:15175-15180 (1995). 또한, 하기에 기재된 방법은 cGMP 의 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있다: Felley-Bosco 등, Am. J. Resp. Cell 및 Mol. Biol., 11:159-164 (1994). 또한, cAMP 및/또는 cGMP 를 측정하기 위한 분석 키트는 U.S. 특허 No. 4,115,538 에 기재되어 있고, 이는 참고로 본 명세서에 통합되어 있다.
다른 구현예에서, 전사 수준은 신호 전달에 대한 테스트 화합물 효과를 평가하기 위해 측정될 수 있다. 관심을 끄는 T2R 폴리펩타이드를 함유하는 숙주세포는 어떤 상호작용에 영향을 주는 충분한 시간을 위해 테스트 화합물과 접촉된 다음, 유전자 발현의 수준이 측정된다. 그와 같은 상호작용을 초래하는 시간의 양은 예컨대 시간대별로 수행하고 시간의 함수로서 전사의 수준을 측정하여 경험적으로 측정될 수 있다. 전사의 양은 적합한, 당업자에게 공지된 어떤 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 관심을 끄는 단백질의 mRNA 발현은 노던 블롯(northern blot)을 사용하여 검출될 수 있거나 이의 폴리펩타이드 생산물은 면역분석을 사용하여 확인될 수 있다. 대안적으로, 리포터(reporter) 유전자를 사용하는, 전사를 기초로 한 분석은 U.S. 특허 No. 5,436,128 에 기재되어 있고, 이는 참고로 본 명세서에 통합되어 있다. 리포터 유전자는 클로람페니콜, 아세틸트랜스페라제, 루시페라제, 베타-갈락토시다아제, 베타-락타마제 및 알칼리 포스파타제일 수 있다. 또한, 관심을 끄는 단백질은 제2 리포터, 예컨대 녹색형광 단백질에의 부착을 통해 직접적인 리포터로서 사용될 수 있다 (참조, 예를 들어, Mistili & Spector, Nature Biotechnology, 15:961-964 (1997)).
그 다음, 전사의 양은 테스트 화합물의 부재에서의 동일한 세포에서의 전사의 양과 비교되거나, 또는 관심을 R는 T2R 폴리펩타이드(들)이 부족한 실질적으로 동일한 세포에서의 전자의 양과 비교될 수 있다. 실질적으로 동일한 세포는 재조합 세포가 만들어 지지만 이종 DNA 의 도입에 의해 변형된 동일한 세포로부터 유도될 수 있다. 전사의 양에서의 어떤 차이는, 테스트 화합물이 관심을 끄는 T2R 폴리펩타이드의 활성을 어떤 식으로든 변경했다는 것을 나타낸다.
화학적 감각 수용체를 발현시키는 유전자도입 비인간 동물
본 발명의 하나 이상의 미각 수용체 서열을 발현시키는 비인간 동물은 또한 수용체 분석을 위해 사용될 수 있다. 그와 같은 발현은, 핵산 암호화 화학적 감각 수용체 또는 리간드 결합 부위로 안정하게 또는 일시적으로 형질감염된 비인간 동물을 테스트 화합물과 접촉시켜서 테스트 화합물이 포유동물 미각 막관통 수용체 복합물과 생체 내에서 특이적으로 결합하는 지를 측정하고, 동물이 수용체 폴리펩타이드 복합물에 특이적으로 결합하여 테스트 화합물에 반응하는 지를 측정하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 벡터로 형질감염 또는 감염된 동물은 특히 특이적 수용체 또는 수용체 세트에 결합할 수 있는 미각 자극을 확인하고 특성을 부여하기 위한 분석에 특히 유용하다. 인간 미각 수용체 서열을 발현시키는 그와 같은 벡터-감염된 동물은 마각 자극의 생체내 스크리닝, 및 예를 들어, 세포 생리 (예를 들어, 미각 뉴런), CNS, 또는 행동에 대한 이의 효과를 위해 사용될 수 있다.
개별적으로 또는 라이브러리로서 핵산 및 벡터를 감염/발현시키기 위한 수단은 선행기술에 공지되어 있다. 다양한 개별 세포, 기관, 또는 전체 동물 파라미터는 다양한 수단에 의해 측정될 수 있다. 본 발명의 T2R 서열은 예를 들어 감염인자, 예를 들어, 아데노바이러스 발현 벡터에 의한 전달로 동물 미각 조직에서 발현될 수 있다.
내생적 미각 수용체 유전자는 기능적인 것으로 남아 있을 수 있고, 야생형 (본래의) 활성은 여전히 존재할 수 있다. 다른 상황에서, 모든 미각 수용체 활성이 도입된 외생적 하이브리드 수용체에 의한 것이 바람직한 경우에, 녹아웃 라인(knockout line)의 사용이 바람직하다. 비인간 형질전환 동물의 구성, 및 형질변환된 세포를 산출하기 위한 재조합 구성의 선택 및 준비를 위한 방법은 선행기술에 공지되어 있다.
"녹아웃(knockout)" 세포 및 동물의 구성은, 포유동물 세포 중 특정 유전자의 발현의 수준은 억제될, 유전자의 DNA 서열의 어떤 부분을 방해하는데 도움이 되는 신규 DNA 서열을 게놈에 도입함으로써 완전히 폐기되거나 감소될 수 있다는 전제를 기초로 한다. 또한, "유전자 트랩(trap) 삽입"은 숙주 유전자를 파괴시키기 위해 사용될 수 있고, 마우스 배아줄기 (ES) 세포는 녹아웃 형질전환 동물을 생산하기 위해 사용될 수 있다 (참조, 예를 들어, Holzschu, Transgenic Res 6:97-106 (1997)). 외생적인 것의 삽입은 전형적으로 상보적 핵산 서열 사이의 동족 재조합에 의한다. 외생적 서열은 변형될 표적 유전자의 일부, 예컨대 엑소닉(exonic), 인트로닉(intronic) 또는 전사 조절 서열, 또는 표적 유전자의 발현의 수준에 영향을 미칠 수 있는 어떤 게놈 서열; 또는 이의 조합이다. 다능성 배아줄기 세포 중 동족 재조합을 통한 유전자 표적으로 관심을 끄는 게놈 서열을 정밀하게 변형할 수 있다. 어떤 기술은 녹아웃 동물을 만들고, 스크리닝하고, 번식시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 참고, Bijvoet, Hum. Mol. Genet. 7:53-62 (1998); Moreadith, J. Mol. Med. 75:208-216 (1997); Tojo, Cytotechnology 19:161-165 (1995); Mudgett, Methods Mol. Biol. 48:167-184 (1995); Longo, Transgenic Res. 6:321-328 (1997); U.S. 특허 Nos. 5,616,491; 5,464,764; 5,631,153; 5,487,992; 5,627,059; 5,272,071; WO 91/09955; WO 93/09222; WO 96/29411; WO 95/31560; WO 91/12650.
본 발명의 핵산은 "녹아웃" 인간 세포 및 이의 자손을 생산하기 위한 시약으로서 또한 사용될 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 핵산은 또한 마우스에서 "녹아웃 인스(knock-ins)"를 생산하기 위한 시약으로서 사용될 수 있다. 인간 또는 래트 T2R 유전자 서열은 마우스 게놈에서 상동체 T2R 를 대체할 수 있다. 이런 식으로, 인간 또는 래트 T2R 를 발현시키는 마우스가 생산된다. 그 다음, 이 마우스는 인간 또는 래트 T2R 의 기능을 분석하고 그와 같은 T2R 에 대한 리간드를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
조절제
T2R 패밀리 구성원의 조절제로서 테스트된 화합물은 어떤 작은 화합물, 또는 생물학적 실체, 예컨대 단백질, 당, 핵산 또는 지질일 수 있다. 대안적으로, 조절제는 T2R 패밀리 구성원의 유전적으로 변경된 버젼일 수 있다. 전형적으로, 테스트 화합물은 작은 화학 분자 및 펩타이드일 수 있다. 본질적으로 어떤 화합물은 본 발명의 분석에서의 잠재적인 조절제 또는 리간드로서 사용될 수 있지만, 대부분의 화합물은 종종 사용된 수성 또는 유기 (특히 DMSO 계) 용액에 용해될 수 있다. 분석은 분석 단계를 자동화하고 화합물을 어떤 편리한 공급원으로부터 분석(이는 전형적으로 병행하여 (예를 들어, 로봇이용 분석에서 미량역가판 상의 미량역가 포맷으로) 수행됨)까지 제공하여 큰 화학 라이브러리를 스크리닝하기 위해 설계될 수 있다. 하기를 포함하는, 화합물의 많은 공급자가 있다는 것을 인식할 것이다: Sigma (St. Louis, Mo.), Aldrich (St. Louis, Mo.), Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo.), FlukChemika-Biochemica Analytika (Buchs, Switzerland) 등.
하나의 구현예에서, 고효율 스크리닝(screening) 방법은 수많은 잠재적인 치료 화합물 (잠재적인 조절제 또는 리간드 화합물)을 함유하는 조합적인 화학 또는 펩타이드 라이브러리을 제공함을 수반한다. 그 다음, 그와 같은 "조합 화학 라이브러리" 또는 "리간드 라이브러리"는, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 목적하는 특징적인 활성을 나타내는 라이브러리 구성원 (특정 화학 종 또는 서브클래스)를 확인하기 위해 하나 이상의 분석에서 스크리닝된다. 따라서, 확인된 화합물은 종래의 "선도 화합물"로서 쓰일 수 있거나, 그 자체로 잠재적인 또는 실제적인 소비자 생산물로서 사용될 수 있다.
조합 화학 라이브러리는 수많은 화학 "빌딩 블록(building block)"을 조합하여 화학 합성 또는 생물 합성에 의해 산출된 다양한 화합물의 선택이다. 예를 들어, 선형 조합 화학 라이브러리, 예컨대 폴리펩타이드 라이브러리는 소정의 화합물 길이(폴리펩타이드 화합물 중 아미노산의 수)에 대한 모든 가능한 방법으로 화학 빌딩 블록(아미노산)의 세트를 조합하여 형성된다. 수많은 화합물은 화학 빌딩 블록의 그와 같은 조합적인 혼합을 통해 합성될 수 있다.
조합 화학 라이브러리의 제조 및 스크리닝은 당업자에게 공지되어 있다. 그와 같은 조합 화학 라이브러리는 펩타이드 라이브러리를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다 (참조, 예를 들어, U.S. 특허 No. 5,010,175, Furka, Int. J. Pept. Prot. Res., 37:487-93 (1991) 및 Houghton 등, Nature, 354:84-88 (1991)). 화학 다양성 라이브러리를 산출하기 위한 다른 화학이 또한 사용될 수 있다. 그와 같은 화학은 하기를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다: 텝토이드 (예를 들어, WO 91/19735), 암호화된 펩타이드 (예를 들어, WO 93/20242), 랜덤 바이오-올리고머 (예를 들어, WO 92/00091), 벤조디아제핀 (예를 들어, U.S. 특허 No. 5,288,514), 다이버조머(diversomer), 예컨대 히단토인, 벤조디아제핀 및 다이펩타이드 (Hobbs 등, PNAS., 90:6909-13 (1993)), 비닐위치 폴리펩타이드 (Hagihara 등, J. Amer. Chem. Soc., 114:6568 (1992)), 글로코스 골격을 갖는 비(非)펩타이드 펩타이도모방체 (Hirschmann 등, J. Amer. Chem. Soc., 114:9217-18 (1992)), 작은 화합물 라이브러리의 유사한 유기 합성 (Chen 등, J. Amer. Chem. Soc., 116:2661 (1994)), 올리고카바메이트 (Cho 등, Science, 261:1303 (1993)), 펩티딜 포스포네이트 (Campbell 등, J. Org. Chem., 59:658 (1994)), 핵산 라이브러리 (Ausubel, Berger, 및 Sambrook, all supra), 펩타이드 핵산 라이브러리 (U.S. 특허 No. 5,539,083), 항체 라이브러리 (Vaughn 등, Nature Biotechnology, 14(3):309-14 (1996) 및 PCT/US96/10287), 탄수화물 라이브러리 (Liang 등, Science, 274:1520-22 (1996) 및 U.S. 특허 No. 5,593,853), 작은 유기 분자 라이브러리 (벤조디아제핀, Baum, C&EN, Jan 18, page 33 (1993); 티아졸리디논 및 메타티아자논, U.S. 특허 No. 5,549,974; 피롤리딘, U.S. 특허 Nos. 5,525,735 및 5,519,134; 모르폴리노 화합물, U.S. 특허 No. 5,506,337; 벤조디아제핀, 5,288,514 등).
조합 라이브러리를 만들기 위한 설계는 상업적으로 이용할 수 있다: (참조, 예를 들어, 357 MPS, 390 MPS (Advanced Chem Tech, Louisville Ky.), Symphony (Rainin, Woburn, Mass.), 433A (Applied Biosystems, Foster City, Calif.), 9050 Plus (Millipore, Bedford, Mass.)). 또한, 수많은 조합 라이브러리는 자체로 상업적으로 이용할 수 있다 (참조, 예를 들어, ComGenex, Princeton, N.J.; Tripos, Inc., St. Louis, Mo.; 3D Pharmaceuticals, Exton, Pa.; Martek Biosciences; Columbia, Md. 등).
본 발명의 하나의 측면에서, T2R 조절제는 어떤 식품, 과자류, 약제학적 조성물, 또는 이의 성분에 사용하여 제품, 조성물 또는 성분의 미각을 원하는 방식으로 조절할 수 있다. 예를 들어, 쓴맛을 향상시키기 위한 T2R 조절제를 첨가하여 쓴맛을 제품 또는 조성물에 제공할 수 있지만, 쓴맛을 차단하는 T2R 조절제를 첨가하여 제품 또는 조성물의 쓴맛을 차단할 수 있다. 또한, 본 발명은 식품, 음료, 화장품 및 의약에 발견된 쓴맛 화합물을 확인하고 이의 감소된 양을 갖는 미각 개선 식품, 음료 및 의약을 생산하는 수단을 제공한다.
본 발명에 의해 확인된 화합물의 용도
본 발명에 따라 확인된 화합물을 식품, 음료, 화장품 또는 의약 조성물에 첨가하여 커피 및 관련 식품, 음료 및 의약 또는 구조적으로 관련된 화합물 또는 다른 쓴맛 화합물, 예를 들어, 쓴맛 감지를 유도하는 식품 및 음료 또는 의약 또는 화장품에 발견된 화합물에 존재하는 쓴맛 화합물에 의해 hT2R8 및/또는 hT2R14 중 적어도 하나의 활성에 의해 유발된 쓴맛을 조절, 바람직하게는 차단할 수 있다.
특히, 넓은 범위의 길항물질 특성을 기초로 한 화합물 C, 및 이의 유사체는 인간 또는 동물에 의해 소비되는 어떤 식품, 음료, 의약 또는 물질에서의 첨가제로서 사용될 수 있고, 여기서, 쓴맛은 바람직하게는 완화된다. 주어진 화합물 C 의 특성이 주어지면, 이들 물질은 특이적 쓴맛 리간드, 예컨대 hT2R3, 7, 10, 14, 16, 44, 51, 55, 61, 63, 64, 65, 또는 71 와 상호작용하고/하거나 hT2R5, 9, 13, 54, 67 및 75, 또는 이의 조합과 상호작용하는 것으로 공지되거나 쓴맛 수용체 선택성이 미확인된 쓴맛 화합물을 함유하는 쓴맛 리간드를 함유할 수 있다. 특히 바람직한 적용은 다수의 쓴맛 수용체를 활성화시키는 화합물을 함유하는 조성물이다.
또한, 화합물 C 을 포함하는 대상체 화합물은, 화합물 C 가 쓴맛을 차단하거나 억제하는 쓴맛 화합물을 확인하기 위해 쓴맛뿐만 아니라 경쟁적 결합 및 기능적 분석에 사용될 수 있다.
상기에서 언급한 바와 같이, 바람직하게는, 대상체 T2R 세포 기반 분석에서 확인된 화합물의 미각 조절 특성, 바람직하게는 쓴맛 차단 특성은 인간 또는 동물 미각 테스트, 바람직하게는 인간 미각 테스트에서 확인될 것이다.
키트
T2R 유전자 및 이의 동족체는 미각 수용체 세포의 확인, 포렌식스(forensics) 및 부계 결정, 및 미각 전달의 검사를 위한 유용한 도구이다. T2R 핵산, 예컨대 T2R 프로브 및 프라이머로 특이적으로 하이브리드화하는 T2R 패밀리 구성원 특이적 시약, 및 T2R 단백질, 예를 들어, T2R 항체로 특이적으로 결합하는 T2R 특이적 시약은 미각 세포 발현 및 미각 전달 조절을 검사하기 위해 사용된다.
샘플 중 T2R 패밀리 구성원에 대한 DNA 및 RNA 의 존재에 대한 핵산 분석은 당업자에게 공지된 수많은 기술, 예컨대 써던(southern) 분석, 노던(northern) 분석, 닷블롯(dot blot), RNase 보호, S1 분석, 증폭 기술, 예컨대 PCR, 및 인시투(in situ) 하이브리드화를 포함한다. 인시투 하이브리드화에서, 예를 들어, 표적 핵산은, 차후의 번역 및 분석에 대한 세포 형태를 보존하면서, 세포 내의 하이브리드화에 이용할 수 있도록 세포 환경으로부터 자유롭게 된다. 하기 논문은 인시투 하이브리드화의 기술의 개략을 제공한다: Singer 등, Biotchniques, 4:230250 (1986); Haase 등, Methods in Virology, vol. VII, 189-226 (1984); 및 Names 등, eds., Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (1987). 또한, T2R 단백질은 상기에 기재된 다양한 면역분석 기술로 검출될 수 있다. 테스트 샘플은 전형적으로 양성 대조군 (예를 들어, 재조합 T2R 단백질을 발현시키는 샘플) 및 음성 대조군 모두에 비교된다.
본 발명은 또한 T2R 패밀리 구성원의 조절제를 스크리닝하는 키트를 제공한다. 그와 같은 키트는 쉽게 이용가능한 물질 및 시약로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 그와 같은 키트는 어떤 하나 이상의 하기 물질을 포함할 수 있다: T2R 핵산 또는 단백질, 반응 튜브, 및 T2R 활성을 테스트하기 위한 설명서. 임의로, 키트는 기능적 T2R 폴리펩타이드를 함유한다. 다양한 키트 및 성분은 키트의 장래 사용자 및 사용자의 특별한 필요에 의존하여 본 발명에 따라 제조될 수 있다.
이제 본 발명을 전체적으로 기재하였기 때문에, 동일한 것은 하기 실시예를 참고로 더 쉽게 이해될 것이고, 상기 실시예는 설명하기 위한 것이지 제한하기 위한 것은 아니다. 다양한 변경 및 변화는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 명세서의 개시된 예시적인 구현예에 대해 행해질 수 있다.
실시예
실시예 1
hT2R8 및 hT2R14 는 쓴맛 커피 분획에 의해 활성화된다
커피로부터의 부분 정제 쓴맛 분획을, 이전 특허출원에 기재된 바와 같이 일시적으로 형질감염된 HEK 세포에서 25개의 인간 T2R 를 스크리닝하기 위해 사용했다. 간단히 말하면 (참고로 본 명세서에 통합되어 있는 미국 특허출원 No. 2003/0170608에 더욱 상세히 검토한 바와 같이), 큰 T-세포 항원 및 G15 단백질 (HEK-G15)을 안정하게 발현시키는 인간 배아 신장 세포를 (예를 들어, Ca2 + 포스페이트 또는 지질 기반 시스템의 사용에 의해) hT2R 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염했다. 추가로, 다른 HEK-G15 세포주를 다른 인간 T2R 로 일시적으로 형질감염했다. 그 후, 형광 이용 분석을, 일시적 형질감염된 세포에서 칼슘 농도의 변화를 검출하기 위해 사용했다. 테스트 화합물(들)과 형질감염된 세포와의 상호작용은 PLC 의 활성에 이르는 신호절단 케스케이드, 및 칼슘 민감성 형광 염료를 사용하여 검출된 형광의 증가로 귀결되는 세포내 칼슘 농도의 차후의 증가를 유도한다. 이들 변화를, 예를 들어 형광 현미경검사 및 적합하게 설계된 소프트웨어 (예컨대, Imaging Workstation, Axon)를 사용하여 모니터했다.
커피 분획은 분석을 방해하는 고수준의 형광을 갖는다. 상기 방해를 극복하기 위해, 수많은 청색 염료를 커피 분획으로부터 형광을 차단하는 능력에 대해 테스트했다. 도 1 에 보여진 바와 같이, 커피 분획은 일시적으로 형질감염된 세포를 사용하여 칼륨 이미징 분석으로 hT2R8 및 hT2R14 을 활성화했다. 도 1의 실험에 사용된 청색 염료는 1.9 mM 에서 FD&C 1 이다. 몇 개의 다른 hT2R 은 또한 이러한 커피 분획에 의해 활성화되는 것으로 보였다. 상이한 청색 염료로, hT2R 의 상이한 조합은 활성화된다 (표 1). 그러나, hT2R8 및 hT2R14 는 커피 분획에 반응함에 따라 꾸준히 늘어나고, 이들 2개의 수용체의 활성은 커피 분획 투여에 따른다 (도 2). 도 2의 실험에 사용된 청색 염료는 트립탄블루(tryptan blue)였다.
Figure 112010017594708-pct00048
이 분석을 사용하여, hT2R8 및 hT2R14를 발현시키는, 커피로부터 세포로의 쓴맛 분획의 첨가는 세포내 G 단백질을 활성화시켰다는 것이 발견되었다. 반대로, 동일한 분석을 사용하여, 커피로부터의 쓴맛 분획은 다른 hT2R 로 일시적으로 형질감염된 HEK-G15 세포를 특이적으로 활성화시키지 않았다. 이 실험은, 미각 수용체 hT2R8 및 hT2R14 이 커피에 존재하는 쓴맛 화합물(들)에 특이적으로 반응한다는 것을 뒷받침한다.
실시예 2
hT2R8 및 hT2R14 의 길항물질의 확인
길항물질을 확인하기 위해, 무차별적인 키메라 G16g44 단백질과 함께 hT2R8 및 hT2R14 을 각각 안정하게 발현시키는 세포주를 이전 특허출원에 기재된 바에 따라 산출했다. 고효율 분석을, 안정한 세포주 및 FLIPR (Fluorescent Imaging Plate Reader)을 사용하여 확립했다. hT2R8 또는 hT2R14 의 작용물질을, 각 최대 활성의 70 내지 80% 까지 수용체를 활성화시키기 위해 사용했다. hT2R8 에 대해, 사용된 작용물질은 안드로그라폴리드 (200 μM) 였고; hT2R14 에 대해서는, 아리스톨로킥산 (3 μM) 였다. 길항물질을 확인하기 위해, 다양한 화학 구조를 갖는 화합물을 작용물질과 함께 첨가했다. 수용체 활성의 통계적으로 상당한 감소를 야기하는 화합물을 함께 풀링(pooling)하고, 투여에 따른 억제 곡선으로 재확인한다. 화합물 A 및 화합물 B 를 hT2R8 길항물질로서 확인했다(도 3). 화합물 C 를 hT2R14 길항물질로서 확인했다(도 4).
실시예 2a
hT2R8 및 hT2R14 길항물질의 조합은 커피의 쓴맛을 감소시킨다
미각 테스트를, 4 내지 5명의 패널의 미각 패널로 대안적인 강제 선택 방법을 사용하여 커피 분획 및 2종의 인스턴트 커피 (중배 전두 및 강배 전두)에서 hT2R8 및 hT2R14 길항물질의 조합으로 수행했다. 길항물질을 갖는 커피 샘플을 길항물질 없는 동일한 샘플과 함께 미각 패널에게 주었고, 패널에게 2개 중 더 쓴맛 샘플을 확인할 수 있는 지를 물었다. 표 2에 보여진 바와 같이, 패널은 길항물질을 갖는 샘풀보다 더 쓴맛으로서 길항물질 없는 커피 분획 샘플을 꾸준히 확인했는데, 이는 길항물질이 커피 분획의 쓴맛을 감소시켰다는 것을 나타낸다. 마찬가지로, 표3에 보여진 바와 같이, 길항물질은 2개 타입의 인스턴트 커피의 쓴맛을 감소시켰다.
본 실시예의 미각 테스트에 의해 설명된 바와 같이, 쓴맛을 보이는 조성물(예를 들어, 식품, 음료 및/또는 의약) 중 쓴맛의 감지는 hT2R8 및/또는 hT2R14 의 길항물질의 그와 같은 조성물에의 혼입에 의해 감소 또는 제거될 수 있다.
개별 길항물질의 기여를 측정하기 위해, 미각 테스트를, 화합물 C 를 갖는 중배 전두 인스턴트 커피로 수행했다. 표 4에서 보는 바와 같이, hT2R14 길항물질 (화합물 C) 는 자력으로 본 실시예의 커피에서의 쓴맛을 충분히 감소시킨다.
Figure 112010017594708-pct00049
Figure 112010017594708-pct00050
Figure 112010017594708-pct00051
실시예 3
화합물 C 는 널리 작용하는 더 쓴맛 수용체 길항물질이다
상기의 실시예 2 는, 화합물 C 가 hT2R14 를 사용하는 고효율 스크리닝 분석에 의해 확인된 인간 T2R 길항물질이라는 것을 알려준다. 추가 실험은, 화합물 C 가 13개의 인간 T2R 에 대하여 널리 맞추어진 길항물질이고, 그보다는 덜하지만 6개의 다른 인간 T2R 에 대하여 반대로 작용한다. 더욱이, 미각 테스트 중의 이 화합물은 수많은 다양한 쓴맛 물질에 의해 유도된 쓴맛 강도를 차단한다.
구체적으로, 화합물 C 의 억제 선택성을 평가하기 위해, 이 화합물을, Senomyx 에 의해 탈오펀된(deorphaned) 22 인간 T2R 대해 테스트했다. 이들 인간 T2R 을 활성화시키는 이들 수용체 및 쓴맛 리간드는 참고로 본 명세서에 통합되어 있는 이전 특허출원에 보고되어 있다. 이들 22 인간 T2R 는 hT2R1, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 16, 44, 51, 54, 55, 61, 63, 64, 65, 67, 71 및 75 이다. 모든 이들 T2R 의 아미노산 및 핵산 서열은 이들 초기 특허출원에서 발견될 수 있다. 이들 인간 T2R 각각을, 무차별적인 G 단백질 G16g44 을 안정하게 발현시키는 HEK293 세포로 개별적이고 일시적으로 트랩스펙션하고, 기능적 분석을 이들 동일한 특허출원에 개시된 바와 같이 이들 수용체를 사용하여 수행했다. 이들 실험에서, 각 수용체를, 특정 T2R 를 활성화시키기 위해 이전 설명한 쓴맛 분자로부터 선택된 리간드 중의 하나로 활성화했다. 리간드를 EC80 농도 수준에서 사용했다. 이용된 쓴맛 리간드의 목록 및 테스트된 리간드 농도를 본 실시예에 표 5에 나타나 있다.
더욱이, 수용체 분석에서 이 화합물의 시험관내 할성을 확인하기 위해, 본발명자들은 생체내 화합물의 효과를 측정하기 위해 쌍을 이룬 비교 미각 테스트를 수행했다. 미각 패널에게 화합물 C 의 유무에 따라 쓴맛 물질의 맛을 보고 어느 샘플이 더 쓴 지를 확인하기를 요청했다. 각 패널은 다중 쌍의 맛을 보고 샘플의 크기를 증가시키고, 그 결과를, 적당한 통계적 방법으로 분석했다. 화합물 C 유무에 따른 샘플의 순서를 무작위로 고르고 대등하게 했다.
이 화합물의 넓은 길항물질 특성을 확립하기 위해서, 다수의 쓴맛 수용체를 활성화시키는 것으로 공지된 쓴맛 리간드 및 특이적 hT2R 을 활성화시키기 위해 아직 증명되지 않은 쓴맛 리간드에 의해 유도된 쓴만뿐만 아니라 다양한 쓴맛 리간드에 의해 유도된 쓴맛을 차단하는 능력에 대해서 테스트했다. 쓴맛 수용체를 활성화시키는 것으로 공지된 몇 개의 쓴맛 분자를, 화합물 C 에 의해 활성이 억제되는 지에 대해서 테스트했다. 구체적으로, 살리신은 hT2R16 를 활성화시키는 쓴맛 분자이고, 미각 테스트 결과는, 40 μM 에서의 화합물 C 가 쓴맛을 감소시킬 수 있다는 것을 보여주었다. 페닐티오우레아는 hT2R51 를 활성화시키는 쓴맛 분자이고, 화합물 C 는 25 μM 에서 쓴맛을 감소시켰다.
다수의 T2R 를 활성화시킬 수 있는 몇 개의 쓴맛 분자를, 화합물 C 로 유사하게 테스트했다. 이들 분자의 일부에 대한 쓴맛 수용체의 활성을 화합물 C 로 부분적으로 억제했다. 오메프라졸은 hT2R10, 14 및 75 을 활성화시키는 쓴맛 분자이다. 쓴맛이 다수의 쓴맛 수용체를 수반할 수 있을지라도, 쓴맛은 또한 화합물 C 에 의해 감지할 수 있을 정도로 감소되었다. 레바우디오사이드 A 는 적어도 7개의 인간 T2R 을 활성화시키는 강한 쓴맛을 갖는 천연 감미제가다. 이의 쓴맛은 또한 화합물 C 에 의해 감소한다.
또한, 화합물 C 는 일부 화합물, 예컨대 덱스트로메트로판 및 디펜히드라민에 대해 쓴맛을 억제했고, 여기서, 상호작용하는 수용체(들)은 공지되어 있지 않다. 이들 화합물에 대한 화합물 C 의 효과를 테스트하고 이의 쓴맛이 또한 감소한다는 것을 발견했다.
상기와 관련하여, 도 5는 실험 결과를 나타내고 있고, 여기서, 화합물 C 를 상이한 작용물질 화합물로 테스트했다. 억제 활성은 화합물 C 의 존재에서 수용체 활성의 감소로 나타낸다. 도 5는, 13개의 상이한 hT2R 이 화합물 C 에 의해 상당히(30% 초과) 억제되었다는 것을 나타내고 있다. 이들 13개의 hT2R 는 hT2R3, 7, 10, 14, 16, 44, 51, 55, 61, 63, 64, 65, 및 71 이다. hT2R5, 9, 13, 54, 67 및 75 를 포함하는 6개의 다른 수용체가, 적은 정도지만 또한 억제되었다.
Figure 112010017594708-pct00052
실시예 4
hT2R8 길항물질: 본 발명의 화합물의 제조
본 발명에 따른 예시적인 화합물을 하기와 같이 합성한다.
실시예 4-1: N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 피콜린아미드 .
Figure 112010017594708-pct00053
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 4-1a) (400 mg, 2.1 mmol), 피콜린산 (256 mg, 2.1 mmol), 및 HOBt (388 mg, 2.50 mmol)을 DCM (7 mL)에서 혼합했다. 반응물을 트리에틸아민 (670 mL, 4.8 mmol)로 처리하고, 15분 동안 실온에서 질소 대기 하에서 교반했다. EDC (598 mg, 3.1 mmol)을 첨가하고, 반응물을 추가 4시간 동안 교반했다. 그 다음, 반응물을 디클로로메탄 (5 mL)로 희석하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액(5 mL, 2x, 그 다음, 포화 염화나트륨 수용액(5 mL)로 세정했다. 유기층을 수집, 건조시키고, 여과했다. 용매를 진공 하에서 제거했다. 조 생성물을 EtOH (5 mL)에서 재현탁시키고, 역상 HPLC (물 중 5%-95% ACN: 25분 구배)로 정제했다. 순수 분획을 배합하고, 농축하여 N-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)피콜린아미드 (372 mg, 60%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.21(s, 3H), 2.44(s, 3H), 5.05(s, 2H), 7.49-7.47(m, 1H), 7.59(s, 1H), 7.93-7.88(dt, J=14, 2Hz, 1H), 8.07(s, 1H), 8.24-8.21(d, J=8Hz, 1H), 8.61-8.56(m, 1H), 9.83(bs, 1H). LC/MS; C15H15N5O2 에 대해 계산된 [M+H]; 예상치 297.1; 실측치 298.3. 융점: 135-137 ℃.
화합물은 0.57 μM의, hT2R8 쓴맛 수용체에 대한 IC50 를 가졌다.
실시예 4-1a: 1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-아민 하이드로 클로라이드
3급-부틸 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일카바메이트(실시예 4-1b) (592 mg, 2 mmol)을 실온에서 2시간 동안 디옥산(20 mL) 중 4N HCl 의 용액에서 교반했다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 1/1 에틸 아세테이트/헥산 (30 mL) 의 1:1 혼합물에서 취하고, 농축(2회)시켰다. 고형물을 헥산으로 분쇄하고, 여과로 수집하여 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (500 mg, 99%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 2.11(s, 3H), 2.38(s, 3H), 5.16(s, 2H), 7.51(s, 1H), 8.03(s, 1H), 10.27(bs, 3H).
실시예 4-1b: 3급-부틸 1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4- 일카바메이트
3,5-디메틸-4-((4-니트로-1H-피라졸-1-일)메틸)이속사졸(실시예 4-1c) (14.6 g, 66 mmol), Boc 무수물, 및 10% Pd/C (3.8g)을 1기압의 수소 하에서 MeOH (400 mL)에서 16시간 동안 실온에서 교반했다. 혼합물을 여과하고, 용액을 감압 하에서 제거했다. 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (헥산 중 20% 에틸 아세테이트)로 정제하여 3급-부틸 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일카바메이트 (12.7 g, 66%)를 옅은 분홍색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.41 (s, 9H), 2.10(s, 3H), 2.32(s, 3H), 4.90(s, 2H), 6.19(bs, 1H), 7.19(s, 1H), 7.50(s, 1H). MS 293 (MH+).
실시예 4-1c: 3,5-디메틸-4-((4-니트로-1H- 피라졸 -1-일) 메틸 ) 이속사졸
빙수조를 통해 0 ℃로 냉각된 DMF (80 mL) 중 4-니트로-1H-피라졸 (실시예 4-1d) (3.8 g, 34 mmol)에, t-BuOK (4.2 g, 38 mmol)를 첨가했다. 염기의 첨가 후, 빙조를 제거하고, 혼합물을 30분 동안 교반하고, 그 다음, 4-(클로로메틸)-3,5-디메틸이속사졸 (5 g, 34 mmol)을 첨가했다. 그 다음, 반응물을 16시간 동안 환류시키고, 그 다음, 실온으로 냉각했다. 물을 반응 혼합물에 첨가하고, 형성된 침전물을 여과로 수집했다. 침전물을 추가 물로 세정하고, 그 다음, 고진공 하에서 건조시켜 3,5-디메틸-4-((4-니트로-1H-피라졸-1-일)메틸)이속사졸(5.8 g, 78%)를 담황색 고형물로서로서 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.23(s, 3H), 2.46(s, 3H), 5.08(s, 2H), 8.02(s, 1H), 8.08(s, 1H).
실시예 4-1d: 4-니트로-1H- 피라졸
피라졸 (10 g, 147 mmol)을, 빙수조를 통해 50 ℃ 미만으로 내부 반응 온도를 유지하면서 진한 황산 (100 mL)에 나누어서 첨가했다. 그 다음, 진한 질산 (10 mL)을, 빙수조를 통해 50 ℃ 미만으로 내부 반응 온도를 유지하면서 적가했다. 빙수조를 제거하고, 반응물을 60 ℃ 로 가열하고, 4시간 동안 교반했다. 반응물을 빙수조를 통해 냉각하고, 18 N 수산화나트륨 수용액(150 mL)으로 염기성 약 pH 8 을 만들었다. 백색 고형물로서 침전된 생성물을 여과로 수집하고, 물로 세정하고, 고진공 하에서 건조시켜 4-니트로-1H-피라졸 (7g, 42%)를 백색 고형물로서 얻었다. 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 126.4, 137.0.
실시예 4-2: 3- 클로로 -N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-4-( 메틸설포닐 )티오펜-2- 카르복사미드
Figure 112010017594708-pct00054
빙수조를 통해 0 ℃ 로 냉각된 DCM (20 mL) 중 ((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 4-1a) (500 mg, 2 mmol)의 교반 혼합물에 트리에틸아민 (600 mg, 6 mmol)을 첨가했다. 혼합물을 모든 고형물이 용액에 있게 될 때까지 교반했다(약 10분). 2 mL CH3CN 중 3-클로로-4-(메틸설포닐)티오펜-2-카보닐 클로라이드 (543 mg, 2.1 mmol)을 0 ℃ 에서 주사기를 통해 유리 아민에 첨가했다. 빙조를 제거하고, 혼합물을 2시간 동안 교반했다. 반응물을 디클로로메탄 (100 mL)으로 희석하고, 유기 상을 물 (200 mL)로 세정했다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 농축했다. 고형물을 에틸 아세테이트/헥산 (1/5)로 분쇄하여 3-클로로-N-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-4 (메틸설포닐)티오펜-2-카르복사미드 (375 mg, 45%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.20(s, 3H), 2.43(s, 4H), 3.22(s, 3H), 5.05(s, 2H), 7.57(s, 1H), 7.94(s, 1H), 8.41(s, 1H), 8.59(bs, 1H). LC/MS; [M+H] 415.5. 융점: 202-204℃.
화합물은 2.09 μM의, hT2R8 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 4-3: (S)-N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-2- 페닐프로판아미드 .
Figure 112010017594708-pct00055
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 4-1a) (200 mg, 1 mmol), (S)-2-페닐프로피온산 (156 mg, 1 mmol), 및 PyBop (650 mg, 1.3 mmol)을 DMF (4 mL), 그 다음 트리에틸아민 (0.3 mL, 2.1 mmol)에 첨가했다. 반응물을 4시간 동안 실온에서 질소 대기 하에서 교반한 다음, 에틸 아세테이트 (20 mL)로 희석하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액(2x15 mL), 그 다음 포화 염화나트륨 수용액(15 mL)으로 세정했다. 유기 상을 건조, 여과하고, 로토바프(rotovap) 상에서 농축했다. 조 생성물을 메탄올 (3 mL) 에서 재현탁시키고, 역상 HPLC (물 중 5% - 95% ACN: 25분 구배)로 정제했다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 농축하여 (S)-N-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-2-페닐프로판아미드 (200 mg, 60%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1.36(d, J=7.2,Hz, 3H), 2.09(s, 3H), 2.36(s, 3H), 3.71-3.66(m, 1H), 5.05(s, 2H), 7.33-7.17(m, 5H), 7.37(s, 1H), 7.90(s, 1H), 10.05(s, 1H). MS 325 (M+H). 융점 108℃-110℃.
화합물은 0.41 μM의, hT2R8 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 4-4 : N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-2-(4-하이드록시-3,5- 디메톡시페닐 ) 아세트아미드 .
Figure 112010017594708-pct00056
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 4-1a) (376 mg, 1.7 mmol), 2-(4-하이드록시-3,5-디메톡시페닐)아세트산 (350 mg, 1.7 mmol), PyBop (1 g, 2 mmol) 및 트리에틸아민 (605 mg, 6 mmol)을 함께 DMF (10 mL)에서 함께 실온에서 2시간 동안 교반했다. 반응 혼합물을 수성 1N HCl (100 mL)으로 희석하고, DCM (3x, 75 mL)로 추출했다. 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 로토바프 상에서 농축했다. 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (헥산 중 30% 에틸 아세테이트) 로 정제하여 N-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-2-(4-하이드록시-3,5-디메톡시페닐)아세트아미드(189 mg, 29%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 2.10(s, 3H), 2.36(s, 3H), 3.40(s, 2H), 3.70(s, 6H), 5.07(s, 2H), 6.53(s, 2H), 7.39(s, 1H), 7.92(s, 1H), 8.18(s, 1H), 10.03(s, 1H). LC/MS; C19H22N4O5에 대해 계산된 [M+H]; 예상치 387.16; 실측치 387.6. 융점: 187-188℃.
화합물은 0.46 μM의, hT2R8 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 4-5 : N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-2- 페닐프로판아미드 .
Figure 112010017594708-pct00057
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 4-1a) (300 mg, 1.3 mmol), 2-페닐프로판산 (225 mg, 1.5 mmol), 트리에틸아민 (300 mg, 3 mmol), DMAP (61 mg, 0.5 mmol), 및 EDC (386 mg, 2 mmol)을 함께 DCM (10 mL)에서 실온에서 4시간 동안 교반했다. 반응 혼합물을 수성 1N HCl (100 mL)로 희석하고, DCM (3x, 75 mL)로 추출했다. 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 로토바프 상에서 농축했다. 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (헥산 중 30% 에틸 아세테이트)로 정제하여 N-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-2-페닐프로판아미드 (272 mg, 81%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.36(d, 3H, J=7.2Hz), 2.10(s, 3H), 2.37(s, 3H), 3.70(m, 1H, J=6.8Hz), 5.06(s, 2H), 7.20(t, 1H, J=8.4Hz), 7.31-7.28(m, 4H), 7.38(s, 1H), 7.91(s, 1H), 10.10(s, 1H). LC/MS; C18H20N4O2에 대해 계산된 [M+H]; 예상치 325.16; 실측치 325.5. 융점: 129-130℃.
화합물은 0.32 μM의, hT2R8 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 4-6: N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-2- 페닐아세트아미드 .
Figure 112010017594708-pct00058
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 염 (실시예 4-1a) (230 mg, 1 mmol) 및 트리에틸아민 (300 mg, 3 mmol)을 빙수조를 통해 0 ℃ 로 냉각된 DCM (10 mL)에서 교반했다. 2-페닐아세틸 클로라이드 (184 mg, 1.3 mmol)을 교반 반응 혼합물에 적가했다. 첨가가 완결되었을 때, 빙조를 제거하고, 반응물을 1시간 동안 교반했다. 혼합물을 DCM (50 mL)로 희석하고, 1N 수성 HCl (100 mL), 그 다음, 1N 수성 NaOH (100 mL), 그 다음 물 (100 mL)로 세정했다. 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 용매를 로토바프 상에서 제거했다. 수득한 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (헥산 중 50% 에틸 아세테이트)로 정제하여 에틸 아세테이트/헥산 (1/9)에서 분쇄된 210 mg 의 고형 생성물을 얻고 N-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-2-페닐아세트아미드 (188 mg, 68%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.15(s, 3H), 2.38(s, 3H), 3.69(s, 2H), 4.97(s, 2H), 7.15 b(s, 1H), 7.40-7.27(m, 6H), 7.84(s, 1H). LC/MS; C17H18N4O2 에 대해 계산된 [M+H]; 예상치 311.14; 실측치 311.40. 융점: 106-108 ℃.
화합물은 0.53 μM의, hT2R8 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 4-7: N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-3- 메톡시벤즈아미드 .
Figure 112010017594708-pct00059
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 4-1a) (300 mg, 1.3 mmol), 3-메톡시벤조산 (172 mg, 1.3 mmol), EDC (386 mg, 2 mmol), 및 트리에틸 아민(303 mg, 3 mmol)을 DCM (5 mL)에서 실온에서 6시간 동안. 반응물을 DCM (50 mL)로 희석하고, 유기 상을 수성 0.1 N HCL (150 mL), 그 다음, 수성 1N NaOH (150 mL)로 세정했다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 로토바프 상에서 농축했다. 조 생성물을 실리카겔 크로마토그래피 (헥산 중 40% 에틸 아세테이트)로 정제하여 225 mg 의 회색이 도는 백색 고형물로서 얻었다. 고형물을 에틸 아세테이트/헥산 (1/9)으로 분쇄하고, 백색 고형물을 여과로 수집했다. 순수 생성물을 무수 에탄올에 용해시키고, 로토바프 상에서 농축하여(4x, 25 mL) N-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-3-메톡시벤즈아미드 (185 mg, 43%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.20(s, 3H), 2.42(s, 3H), 3.85(s, 3H), 5.03(s, 2H), 7.09-7.06(m, 1H), 7.37-7.35(m, 2H), 7.41(m, 1H), 7.51(s, 1H), 7.93(bs, 1H), 8.03(s, 1H). LC/MS; C17H18N4O3 에 대한 계산된 [M+H]; 예상치 327.14; 실측치 327.30. 융점: 127-129 ℃.
화합물은 0.39 μM의, hT2R8 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 4-8: N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 벤조 [d][1,3] 디옥솔 -5- 카르복사미드
Figure 112010017594708-pct00060
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 1a) (8 mg, 35 μmol) 및 벤조[d][1,3]디옥솔-5-카르복실산 (7 mg, 42 μmol)을 각각 200 ㎕ 디메틸포름아미드에 용해시켰다. Si-카보디이미드 수지 (70 mg, 70 μmol)을 1.2 mL 96웰 그레니어 플레이트(Greiner plate)에 적재하고, 그 다음, 아민 및 산을 첨가했다. 하이드록시벤조트리아졸 (6 mg, 42 μmol)을 100 ㎕ 디메틸포름아미드에 용해시키고, 반응 웰에 첨가했다. 반응물을 밤새 실온에서 흔들었다. 과량의 카르복실산 및 하이드록시벤조트리아졸을 제거하기 위해, PS-트리스아민 수지 (35 mg, 70 μmol)을 반응 혼합물에 첨가하고, 밤새 실온에서 흔들었다. 200 ㎕ 의 아세토니트릴을 반응웰에 첨가하고, 1분 동안 흔들었다. 상부의 맑은 용액을 새로운 플레이트로 이동시켰다. 추출 공정을 2회 초과 반복했다. 용액을 진공 하에서 증발시키고, 목적 생성물을 얻었다. 수율 6%. MS M+H 계산치 341.1, 실측치 341.2.
화합물은 0.2 μM의, hT2R8 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 4-9: N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-2,5- 디메톡시벤즈아미드
Figure 112010017594708-pct00061
2,5-디메톡시벤조산 및 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 4-1a)로부터 실시예 4-8과 같이 제조했다. 수율 13%. MS M+H 계산치 357.5, 실측치 357.3.
화합물은 0.17 μM의, hT2R8 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 4-10: 3- 시아노 -N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 벤즈아미드
Figure 112010017594708-pct00062
3-시아노벤조산 및 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 4-1a)로부터 실시예 4-8과 같이 제조했다. 수율 15%. MS M+H 계산치 322.6, 실측치 322.3.
화합물은 0.2 μM의, hT2R8 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 4-11: N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1- 페닐사이클로프로판카르복사미드
Figure 112010017594708-pct00063
1-페닐사이클로프로판카르복실산 및 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 4-1a)로부터 실시예 4-8과 같이 제조했다. 수율 6%. MS M+H 계산치 337.6, 실측치 337.5.
화합물은 0.25 μM의, hT2R8 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 4-12: N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-3- 페닐부탄아미드
Figure 112010017594708-pct00064
3-페닐부타노산 및 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 4-1a)로부터 실시예 4-8과 같이 제조했다. 수율 6%. MS M+H 계산치 339.6, 실측치 339.5.
화합물은 0.28 μM의, hT2R8 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 4-13: N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1H-피롤-2- 카르복사미드
Figure 112010017594708-pct00065
1H-피롤-2-카르복실산 및 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 4-1a)로부터 실시예 4-8과 같이 제조했다. 수율 18%. MS M+H 계산치 286.6, 실측치 286.3.
화합물은 0.57 μM의, hT2R8 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 4-14: 2-사이클로 헥실 -N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 아세트아미드
Figure 112010017594708-pct00066
2-사이클로헥실아세트산 및 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 4-1a)로부터 실시예 4-8과 같이 제조했다. 수율 17%. MS M+H 계산치 317.6, 실측치 317.4.
화합물은 0.73 μM의, hT2R8 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 4-15: N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 신남아미드
Figure 112010017594708-pct00067
신남산 및 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 4-1a)로부터 실시예 4-8과 같이 제조했다. 수율 4%. MS M+H 계산치 322.6, 실측치 322.4.
화합물은 0.7 μM의, hT2R8 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 4-16: N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 아다만테인 .
Figure 112010017594708-pct00068
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (300 mg, 1.56 mmol), 아다만테인-1-카르복실산(281 mg, 1.56 mmol), PyBop (972 mg, 1.87 mmol), 및 트리에틸아민 (0.438 mL, 3.12 mmol)을 DMF (5 mL)에서 혼합했다. 반응물을 실온에서 4시간 동안 질소 대기 하에서 교반했다. 반응물을 에틸 아세테이트 (4 mL)로 희석하고, 포화 탄산수소나트륨 용액(2x, 3 mL), 그 다음, 포화 염화나트륨 용액(3 mL)으로 세정했다. 유기층을 추출, 건조시키고, 여과했다. 용매를 진공 하에서 제거했다. 조 생성물을 메탄올 (4 mL)에서 재현탁시키고, HPLC로 정제했다. 순수 생성물을 에탄올에서 재용해시키고, 진공 하에서 농축하여(3x3mL) N-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일) 아다만테인을 백색 고형물로서 얻었다. 수율 60%. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.79-1.70(m, 6H), 1.93-1.92(m, 6H), 2.08(bs, 3H), 2.18(s, 3H), 2.41(s, 3H), 4.98(s, 2H), 7.37(s, 1H), 7.38(s, 1H), 7.92(s, 1H). MS 355 (M+H). 융점 167-169 ℃.
화합물은 0.88 μM의, hT2R8 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
추가 화합물을 실시예 4-1 내지 4-16 에 기재된 것과 유사한 절차에 따라 합성했고, 실험적으로 테스트하고 실측한 결과, hT2R8 쓴맛 수용체의 억제제로서 비교적 고수준의 유효성을 갖는다. 테스트 결과는 하기의 표 A에 나타나 있다.
[표 A]
Figure 112010017594708-pct00069
Figure 112010017594708-pct00070
Figure 112010017594708-pct00071
Figure 112010017594708-pct00072
Figure 112010017594708-pct00073
Figure 112010017594708-pct00074
Figure 112010017594708-pct00075
Figure 112010017594708-pct00076
Figure 112010017594708-pct00077
Figure 112010017594708-pct00078
Figure 112010017594708-pct00079
Figure 112010017594708-pct00080
Figure 112010017594708-pct00081
Figure 112010017594708-pct00082
Figure 112010017594708-pct00083
Figure 112010017594708-pct00084
Figure 112010017594708-pct00085
Figure 112010017594708-pct00086

실시예 4-67 내지 4-91:
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 4-1a) 및 이의 대응하는 관능화된 카르복실산으로부터 실시예 4-73 과 같이 제조했다. 목적 질량이 측정될 때 LCMS 로 특성을 부여했다.
실시예 4-73: N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-3,4-디하이드록시-5- 메톡시벤즈아미드
Figure 112010017594708-pct00087
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 4-1a) (228 mg, 1 mmol), 3,4-디하이드록시-5-메톡시벤조산 (184 mg, 1 mmol), HOBt (135 mg, 1 mmol), 및 EDC (191 mg, 1 mmol)을 마이크로웨이브 바이알(microwave vial)에서 2 mL DMF에 용해시키고, 그 다음, 트리에틸아민 (101 mg, 1 mmol)을 첨가했다. 반응물을 165℃의 마이크로웨이브에 5분 동안 두었다. 조 생성물을 바리안(Varian) HPLC (물 중 10%-95% ACN: 25분 구배)로 직접 정제했다. 순수 분획을 배합하고, 농축하여 N-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-3,4-디하이드록시-5-메톡시벤즈아미드를 얻었다. (280 mg, 70%). LC/MS; C17H18N4O5에 대해 계산된 [M+H]; 예상치 359.1; 실측치 359.1.
화합물은 2.2 μM의, hT2R8 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 4-92: N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-7- 메톡시벤조[d][1,3]디옥솔 -5- 카르복사미드
Figure 112010017594708-pct00088
N-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-3,4-디하이드록시-5-메톡시벤즈아미드 (실시예 73) (50 mg, 0.14 mmol) 및 세슘 카보네이트 (113 mg, 2.5 mmol)을 1 mL 아세톤에 용해시키고, 그 다음, 디브로모메탄 (239 mg, 1.4 mmol)를 첨가했다. 반응물을 120℃의 마이크로웨이브 반응기에 20분 동안 두었다. 반응물로부터 맑은 용액을 제거하고, 진공 하에서 증발시켰다. 조 생성물을 1 mL 에탄올에 용해시키고, 바리안(Varian) HPLC (물 중 10%-95% ACN: 25분 구배)로 정제했다. 순수 분획을 배합하고, 농축하여 N-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-2-(7-메톡시벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)아세트아미드를 얻었다. (12 mg, 23%). LC/MS; C18H18N4O5에 대해 계산된 [M+H]; 예상치 371.1; 실측치 371.1.
화합물은 0.7 μM의, hT2R8 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 4-93: N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-8- 메톡시 -2,3- 디하이드로벤조[b][1,4]디옥신 -6- 카르복사미드
Figure 112010017594708-pct00089
N-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-3,4-디하이드록시-5-메톡시벤즈아미드 (실시예 4-73), 세슘 카보네이트 및 디브로모에탄으로부터 실시예 4-92 와 같이 제조했다. 수율 20 %. MS M+H 계산치 385.1, 실측치 385.1.
화합물은 0.7 μM의, hT2R8 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 4-94: N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-7- 메톡시 -2-메틸벤조[ d][1,3]디옥솔 -5- 카르복사미드
Figure 112010017594708-pct00090
N-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-3,4-디하이드록시-5-메톡시벤즈아미드 (실시예 4-73), 세슘 카보네이트 및 1,1-디브로모에탄으로부터 실시예 4-92와 같이 제조했다. 수율 25 %. MS M+H 계산치 385.1, 실측치 385.1.
화합물은 0.7 μM의, hT2R8 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 4-95: N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-7- 메톡시 -2,3- 디하이드로벤조[b][1,4]디옥신 -6- 카르복사미드
Figure 112010017594708-pct00091
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 4-1a) 및 7-메톡시-2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-카르복실산 (실시예 4-95a)으로부터 실시예 4-73과 같이 제조했다. 수율 50 %. MS M+H 계산치 385.1, 실측치 385.1. 1H NMR (400 MHz, DMSO): 2.136 (s,3H), 2.410(s, 3H), 3.851(s, 3H), 4.214(bs, 2H), 4.296(bs, 2H), 5.120(s, 2H), 6.688(s, 1H), 7.290(s, 1H), 7.6006(s, 1H), 8.069(s, 1H), 9.856(s, 1H).
화합물은 0.7 μM의, hT2R8 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 4-95a: 7- 메톡시 -2,3- 디하이드로벤조[b][1,4]디옥신 -6- 카르복실산
Figure 112010017594708-pct00092
2mL 마이크로웨이브 바이알에서, 메틸 7-브로모-2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-카르복실레이트 (273 mg, 1 mmol) 및 CuBr (14.3 mg, 0.1 mmol)을 건조 DMF 에 용해시키고, 빙조에 넣었다. 나트륨 메톡시드 (540 mg, 10 mmol)을, 0 ℃ 에서 교반하면서 반응 혼합물에 첨가했다. 반응물을 실온으로 가온하고, 45분 동안 교반했다. 그 다음, 반응물을 마이크로웨이브 반응기에 5분 동안 135 ℃ 에서 두었다. 반응 혼합물을 물에 용해시키고, 에틸 아세테이트로 세정했다. 물 층을 수집하고, 1M HCl 로 pH 4 로 산성화했다. 생성물을 에틸 아세테이트로 추출한 다음, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발하여 목적 중간체인 7-메톡시-2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-카르복실산을 얻었는데, 이는 추가 정제없이 직접 사용되었다. 수율 57 %. MS M+H 계산치 211.1, 실측치 211.1.
실시예 5
hT2R14 길항물질: 본 발명의 화합물의 제조
하기 실시예는 본 발명의 다양한 예시적인 구현예를 설명하고 어떤 식으로든 제한하는 것은 아니다.
실시예 5-1: 4-(N-벤질-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00093
벤질 4-(N-벤질-N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조에이트 (실시예 5-1a) (517 mg, 1 mmol)을 6N NaOH(수성)/THF/MeOH (27 mL)의 10/1/2 용액에서 실온에서 6시간 동안 교반했다. 용액을 3N HCl (수성)로 약 pH 3 (약 50 mL)로 산성화하고, 수성 상을 에틸 아세테이트 (3x, 75 mL)로 추출했다. 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 로토바프 상에서 농축했다. 잔류물을 MeOH (15 mL)에서 취하고, 역상 HPLC (물 중 5-95% 아세토니트릴 구배: 25분)을 3개의 5 mL 분취액에서 정제했다. 순수 분획을 배합하고, 농축하여 백색 고형물로서 얻었다. 생성물을 15 mL 의 무수 에탄올에 용해시키고, 로토바프 (4x) 상에서 증발시켜 순수 4-(N-벤질-N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조산 (174 mg, 42%)를 백색 고형물로서 얻었다. M.p 161-163 ℃. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 3.78(s, 3H), 4.32(s, 2H), 4.36(s, 2H), 6.78(d, J=8.4Hz, 2H), 6.99(d, J=8.8Hz, 2H), 709-7.07(m, 2H), 7.27-7.24(m, 3H), 7.93(d, J=8.8Hz, 2H), 8.24(d, J=8Hz, 2H). MS 412 (MH+).
화합물은 0.22 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-1a: 벤질4 -(N-벤질-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 ) 벤조에이트
DMF (10 mL) 중 4-(N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조산 (실시예 5-1b) (450, mg, 1.4 mmol), 벤질 브로마이드 (770 mg, 4.5 mmol), 및 세슘 카보네이트 (1.5g, 4.5 mmol)을 80 ℃ 에서 2시간 동안 교반했다. 용액을 실온으로 냉각하고, 물 (200 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트(3x, 100 mL)로 추출했다. 배합된 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에서 농축했다. 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (헥산 중 10% 에틸 아세테이트)로 정제하여 벤질 4-(N-벤질-N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조에이트 (517 mg, 73 %)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.76(s, 3H), 4.28(s, 2H), 4.32(s, 2H0, 5.40(s, 2H), 6.79(d, J=8Hz, 2H), 6.96(d, J=8Hz, 2H), 7.04-7.07(m, 2H), 7.21-7.23(m, 3H), 7.35-7.47(m, 5H), 7.85(d, J=8Hz, 2H), 8.17(d, J=8.4Hz, 2H).
실시예 5-1b: 4-(N-(4-메톡시벤질) 설파모일 )벤조산
4-(클로로설포닐)벤조산 (5 g, 22.7 mmol)을, 빙수조를 통해 10분에 걸쳐 0 ℃로 냉각된 아세톤 (100 mL) 중 4-메톡시 벤질아민 (6.1 g, 45 mmol) 및 트리에틸아민 (2.3 g, 22.7 mmol) 의 교반 용액에 고형물로서 3번에 걸쳐 첨가했다. 빙조를 제거하고, 반응물을 추가 4시간 교반했다. 반응 혼합물을, 물 (150 mL) 중 5% 아세트산의 용액으로 희석하고, 에틸 아세테이트 (3x, 100 mL)로 추출했다. 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 로토바프 상에서 농축했다. 수득한 백색 고형물을 헥산/에틸 아세테이트 (9/1)로 분쇄하여 4-(N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조산 (5.1 g, 70 %)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO d6) δ 3.68(s, 3H), 3.91(s, 2H), 6.79(d, J=8.4Hz, 2H), 7.10(d, J=8.8Hz, 2H), 7.80(d, J=8.8Hz, 2H), 8.02(d, J=8.4Hz, 2H).
실시예 5-2 : 4-(N-(푸란-2- 일메틸 )-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00094
4-메톡시벤질 4-(N-(푸란-2-일메틸)-N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조에이트 (실시예 5-2a) (750 mg, 1.4 mmol)을 수성 2N LiOH/THF/MeOH (45 mL)의 2/2/1 혼합물에서 실온에서 3시간 동안 교반했다. 용액을 수성 1N 수성 HCl 로 약 pH 3 (약 100 mL)로 산성화하고, 에틸 아세테이트(3x, 100 mL)로 추출했다. 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 로토바프 상에서 농축했다. 잔류물을 MeOH (9 mL) 에서 취하고, 역상 HPLC (물 중 5-95% ACN 구배: 40분)로 3개의 3 mL 분취액에서 정제했다. 순수 분획을 배합하고, 백색 고형물로 농축했다. 생성물을 무수 에탄올에 용해시키고, 정제하여(4x, 20 mL) 순수 4-(N-(푸란-2-일메틸)-N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조산 (205 mg, 36 %)를 백색 고형물로서 얻었다. M.p. 151 -152 ℃. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 3.71(s, 3H), 4.24(s, 2H), 4.27(s, 2H), 6.14(d, 1H, J=3.2Hz), 6.26(m, 1H), 6.87(d, 2H, J=9.2Hz), 7.14(d, 2H, J=8.8Hz), 7.41(s, 1H), 7.89(d, 2H, J=8Hz), 8.06(d, 2H, J=8.4Hz), 13.48(bs, 1H). MS 400 (M-H).
화합물은 0.59 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-2a: 4-메톡시벤질 4-(N-(푸란-2- 일메틸 )-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 ) 벤조에이트 :
4-(N-(푸란-2-일메틸)설파모일)벤조산 (실시예 5-2b) (500 mg, 1.8 mmol), p-메톡시 벤질 클로라이드 (624 mg, 4.0 mmol), 및 세슘 카보네이트 (1.3 g, 4.0 mmol)을 DMF (10 mL)에 용해시키고, 80 ℃ 에서 1시간 동안 교반했다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물 (200 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트 (3x100 mL)로 추출했다. 배합된 유기물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 로토바프 상에서 농축했다. 생성물을 실리카겔 크로마토그래피 (헥산 중 15% 에틸 아세테이트)로 정제하여 4-메톡시벤질4-(N-(푸란-2-일메틸)-N-(4-메톡시벤질)설파모일) 벤조에이트 (753 mg, 80%)를 맑은 오일로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 3.70(s, 3H), 3.75(s, 3H), 4.22(s, 2H), 4.26(s, 2H), 5.39(s, 2H), 6.14(d, 1H, J=3.2Hz), 6.25(m, 1H), 6.87(d, 2H, J=8.8Hz), 6.97(d, 2H, J=8.8Hz), 7.13(d, 2H, J=8.4Hz), 7.39(m, 1H), 7.43(d, 2H, J=8.4Hz), 7.91(d, 2H, J=8.4Hz), 8.07(d, 2H, J=8.4 Hz).
실시예 5-2b: 4-(N-(푸란-2- 일메틸 ) 설파모일 )벤조산:
4-(클로로설포닐)벤조산 (5.0 g, 22.7 mmol)을, 빙수조를 통해 0 ℃ 로 냉각된 아세톤 (200 mL) 중 푸르푸릴 아민 (6.6 g, 68 mmol)의 교반 용액에 10분에 걸쳐 3번에 걸쳐 첨가했다. 설포닐 클로라이드의 첨가가 완결된 후, 빙조를 제거하고, 용액을 1시간 동안 실온에서 교반했다. 혼합물을 농축하고 실리카겔 크로마토그래피 (90% 에틸 아세테이트, 8% 헥산 및 2% 아세트산)로 정제하여 4-(N-(푸란-2-일메틸)설파모일)벤조산 (4.4 g, 68%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 4.04(d, 2H, J=6Hz), 6.13(d, 1H, J=3.2Hz), 6.25(m, 1H), 7.43(m, 1H), 7.83(d, 2H, J=8.4Hz), 8.05(d, 2H, J=8.4Hz), 8.36(t, 1H, J=6Hz), 13.4(bs, 1H).
실시예 5-3: 4-(N-(4- 에톡시벤질 )-N-(푸란-2- 일메틸 ) 설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00095
4-시아노-N-(4-에톡시벤질)-N-(푸란-2-일메틸)벤젠설폰아미드 (실시예 5-3a) (300 mg, 0.8 mmol)을 디옥산/1.5 N 수성 NaOH (100 mL)의 1/1 혼합물에서 80 ℃ 에서 16시간 동안 교반했다. 혼합물을 냉각하고, 1N 수성 HCl (100 mL)으로 산성화하고, 에틸 아세테이트로 추출했다(3x, 75 mL). 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 로토바프 상에서 농축했다. 고형물을 에틸 아세테이트/헥산 (약 1/9)으로 분쇄하고, 여과로 수집하여 4-(N-(4-에톡시벤질)-N-(푸란-2-일메틸)설파모일)벤조산 (250 mg, 69 %)를 백색 고형물로서 얻었다. NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 1.29(t, J=6.8Hz, 3H), 3.97(q, J=6.4Hz, 2H), 4.23(s, 2H), 4.27(s, 2H), 6.15(d, J=3.2Hz, 1H), 6.27(m, 1H), 6.84(d, J=8.8Hz, 2H), 7.11(d, J=8.8Hz, 2H), 7.39(m, 1H), 7.87(d, J=8.4Hz, 2H), 8.00(d, J=8.4Hz, 2H).
화합물은 3.0 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-3a: 4- 시아노 -N-(4- 에톡시벤질 )-N-(푸란-2- 일메틸 ) 벤젠설폰아미드 :
4-시아노벤젠-1-설포닐 클로라이드 (600 mg, 2.9 mmol)을 DCM (100 mL) 중 N-(4-에톡시벤질)-1-(푸란-2-일)메탄아민(실시예 5-3b) (685 mg, 2.9 mmol) 및 트리에틸아민(455 mg, 4.5 mmol)의 교반 용액에 첨가하고, 반응물을 2시간 동안 교반했다. 반응물을 물 (200 mL)로 희석하고, DCM 으로 추출했다(3x, 75 mL). 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 로토바프 상에서 농축했다. 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (헥산 중 10% 에틸 아세테이트)로 정제하여 4-시아노-N-(4-에톡시벤질)-N-(푸란-2-일메틸)벤젠설폰아미드 (665 mg, 68 %)를 회색이 도는 백색 고형물로서 얻었다. NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 1.29(t, J=7.2Hz, 3H), 3.97(q, J=6.8Hz, 2H), 4.23(s, 2H), 4.27(s, 2H), 6.15(d, J=3.2Hz, 1H), 6.27(m, 1H), 6.84(d, J=8.8Hz, 2H), 7.11(d, J=8.8Hz, 2H), 7.39(m, 1H), 7.92(d, J=8.4Hz, 2H), 8.03(d, J=8.4Hz, 2H).
실시예 5-3b : 4 N-(4- 에톡시벤질 )-1-(푸란-2-일) 메탄아민 :
메탄올 (50 mL), 트리메틸오르토포르메이트 (10 mL) 및 AcOH (1 mL)의 혼합물 중 4-에톡시 벤즈알데히드 (5 g, 33 mmol) 및 푸르푸릴 아민 (4.2 g, 43 mmoL)을 실온에서, 질소 대기 하에서 16시간 동안 교반했다. 나트륨 보로하이드라이드 (1.4 g, 35 mmol)을 30분에 걸쳐 4번에 걸쳐 첨가했다(발열 반응). 반응물을 추가 2시간 동안 실온에서 교반했다. 용매를 진공 하에서 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트 (150 mL)에서 취했다. 유기 상을 물 (200 mL)로 세정하고, 수성 상을 에틸 아세테이트 (2x, 100 mL)로 역추출했다. 배합된 유기층을 농축하고, 잔류물을 실리카겔 (약 0.5 % 트리에틸아민을 갖는 헥산 중 70% 에틸 아세테이트)로 정제하여 N-(4-에톡시벤질)-1-(푸란-2-일)메탄아민 (6.1 g, 80 %)를 맑은 오일로서 얻었다. NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.40(t, J=7.2Hz, 3H), 3.71(s, 2H), 3.76(s, 2H), 4.02(q, J=7.2Hz, 2H), 6.17(d, J=4Hz, 1H), 6.31(m, 1H), 6.84(d, J=8.8Hz, 2H), 7.23(d, J=8.8Hz, 2H), 7.36(m, 1H).
실시예 5-4: 4-(N-에틸-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00096
4-(N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조산 (실시예 5-1b) (160 mg, 0.5 mmol) 및 세슘 카보네이트 (325 mg, 1 mmol)을 마이크로웨이브 바이알에 넣고, 2 mL DMF 에 용해시켰다. 에틸요오다이드 (155 mg, 1 mmol)을 반응 혼합물에 첨가했다. 반응물을 마이크로웨이브 반응기에 넣고 165℃에서 5분 동안 가열했다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트에 용해시키고, 물로 세정했다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켰다. 조 생성물을 6N NaOH(수성)/테트라하이드로푸란 (3 mL)의 4/1 용액에 용해시키고, 실온에서 6시간 동안 교반했다. 용액을 3N HCl (수성)로 약 pH 3 로 산성화하고, 생성물을 에틸 아세테이트로 추출했다(3x, 75 mL). 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축했다. 잔류물을 메탄올 (3 mL)에서 취하고, 역상 HPLC (물 중 5-95 % 아세토니트릴 구배: 25분)로 정제했다. 화합물은 20 μM 의 IC50 으로 hT2R14을 억제하는 것으로 알려졌다. 수율 35%. MS M+H 계산치 350.11, 실측치 350.0.
화합물은 10 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-5: 4-(N-벤질-N-(푸란-2- 일메틸 ) 설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00097
4-(N-(푸란-2-일메틸)설파모일)벤조산 (실시예 5-2b) (140 mg, 0.5 mmol) 및 세슘 카보네이트 (325 mg, 1 mmol)을 마이크로웨이브 바이알에 넣고, 2 mL DMF 에 용해시켰다. (브로모메틸)벤젠 (170 mg, 1 mmol)을 반응 혼합물에 첨가했다. 반응물을 마이크로웨이브 반응기에 넣고 165℃에서 5분 동안 가열했다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트에 용해시키고, 물로 세정했다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에서 증발시켰다. 조 생성물을 6N NaOH(수성)/테트라하이드로푸란 (3 mL)의 4/1 용액에서 용해시키고, 실온에서 6시간 동안 교반했다. 용액을 3N HCl (수성)으로 약 pH 3 으로 산성화하고, 생성물을 에틸 아세테이트로 추출했다(3x, 75 mL). 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축했다. 잔류물을 메탄올 (3 mL)에서 취하고, 역상 HPLC (물 중 5-95 % 아세토니트릴 구배: 25분)로 정제했다. 수율 35 %. MS M+H 계산치 372.4, 실측치 372.0.
화합물은 4.6 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-6: 4-(N-(푸란-2- 일메틸 )-N-(3-메톡시벤질) 설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00098
1-(브로모메틸)-3-메톡시벤젠 및 4-(N-(푸란-2-일메틸)설파모일)벤조산 (실시예 5-2b)로부터 실시예 5-5 와 같이 제조했다. 수율 35 %. MS M+H 계산치 402.3, 실측치 402.0.
화합물은 10 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-7: 4-(N-(푸란-2- 일메틸 )-N-(2-메톡시벤질) 설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00099
1-(브로모메틸)-2-메톡시벤젠 및 4-(N-(푸란-2-일메틸)설파모일)벤조산 (실시예 5-2b)로부터 실시예 5-5 와 같이 제조했다. 수율 35%. MS M+H 계산치 402.3, 실측치 402.0.
화합물은 12 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-8: 4-(N-(4- 프로폭시벤질 )-N-(푸란-2- 일메틸 ) 설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00100
4-시아노-N-(4-프로폭시벤질)-N-(푸란-2-일메틸)벤젠설폰아미드 (실시예 5-8a) (300 mg, 0.8 mmol)을 디옥산/1.5 N 수성 NaOH (100 mL)의 1/1 혼합물에서 80 ℃ 에서 16시간 동안 교반했다. 혼합물을 냉각하고, 1N 수성 HCl (100 mL)로 산성화하고, 에틸 아세테이트로 추출했다(3x, 75 mL). 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 로토바프 상에서 농축했다. 고형물을 에틸 아세테이트/헥산 (약 1/9)로 분쇄하고, 여과로 수집하여 4-(N-(4-프로폭시벤질)-N-(푸란-2-일메틸)설파모일)벤조산 (165 mg, 63 %)를 백색 고형물로서 얻었다. NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 0.94(t, J=7.6Hz, 3H), 1.70(m, J=6.8Hz, 2H), 3.87(t, J=6.4Hz, 2H), 4.23(s, 2H), 4.27(s, 2H), 6.13(d, J=2.8Hz, 1H), 6.27(m, 1H), 6.84(d, J=6.8Hz, 2H), 7.11(d, J=8.8Hz, 2H), 7.39(m, 1H), 7.87(d, J=6.8Hz, 2H), 8.05(d, J=6.8Hz, 2H), 13.45(bs, 1H).
화합물은 2.5 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-8a : 4- 시아노 -N-(4- 프로폭시벤질 )-N-(푸란-2- 일메틸 ) 벤젠설폰아미드 :
4-시아노벤젠-1-설포닐 클로라이드 (600 mg, 2.9 mmol)을 DCM (100 mL) 중 N-(4-프로폭시벤질)-1-(푸란-2-일)메탄아민 (실시예 5-8b) (685 mg, 2.9 mmol) 및 트리에틸아민 (455 mg, 4.5 mmol) 의 교반 용액에 첨가하고 반응물을 2시간 동안 교반했다. 반응물을 물 (200 mL)로 희석하고, DCM 으로 추출했다(3x, 75 mL). 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 로토바프 상에서 농축했다. 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (헥산 중 10% 에틸 아세테이트)로 정제하여 4-시아노-N-(4-프로폭시벤질)-N-(푸란-2-일메틸)벤젠설폰아미드 (500 mg, 50 %)를 회색이 도는 백색 고형물로서 얻었다. NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 0.95(t, J=7.2Hz, 3H), 1.70(m, J=6.4Hz, 2H), 3.88(t, J=6.4Hz, 2H), 4.25(s, 2H), 4.28(s, 2H), 6.15(d, J=3.2Hz, 1H), 6.27(m, 1H), 6.84(d, J=6.8Hz, 2H), 7.11(d, J=8.8Hz, 2H), 7.39(m, 1H), 7.93(d, J=6.4Hz, 2H), 8.01(d, J=6.4Hz, 2H).
실시예 5-8b : 4 N-(4- 프로폭시벤질 )-1-(푸란-2-일) 메탄아민 :
메탄올 (50 mL), 트리메틸오르토포르메이트 (10 mL) 및 AcOH (약 1 mL)의 혼합물 중 4-프로폭시 벤즈알데히드 (5 g, 31 mmol) 및 푸르푸릴 아민 (3.9 g, 40 mmol)을 실온에서 질소 대기 하에서 16시간 동안 교반했다. 나트륨 보로하이드라이드 (1.4 g, 35 mmol)을 4번에 30분에 걸쳐 (발열 반응) 첨가했다. 반응물을 추가 2시간 동안 실온에서 교반했다. 용매를 로토바프 상에서 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트 (150 mL)에서 취했다. 유기 상을 물 (200 mL)로 세정하고, 수성 상을 에틸 아세테이트로 역추출했다(2x, 100 mL). 배합된 유기층을 농축하고, 잔류물을 실리카겔 (약 2% 트리에틸아민을 갖는 헥산 중 70 % 에틸 아세테이트)로 정제하여 N-(4-프로폭시벤질)-1-(푸란-2-일)메탄아민(5.3 g, 75 %)를 황색 오일로서 얻었다. NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.03(t, J=7.2Hz, 3H), 1.79(m, J=6.4Hz, 2H), 3.71(s, 2H), 3.76(s, 2H), 3.90(t, J=6.8Hz, 2H), 6.17(d, J=3.2Hz, 1H), 6.32(m, 1H), 6.85(d, J=8.4Hz, 2H), 7.22(d, J=8.8Hz, 2H), 7.37(m, 1H).
추가 화합물을 실험적으로 테스트하고 실측한 결과, hT2R14 쓴맛 수용체의 억제제로서 비교적 고수준의 유효성을 갖는다. 테스트 결과는 하기의 표 B에 나타나 있다.
[표 B]
Figure 112010017594708-pct00101

실시예 5-10: 4-(N-(4- 플루오로벤질 )-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00102
메틸 4-(N-(4-플루오로벤질)-N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조에이트 (실시예 5-10a) (3.7 g, 8.3 mmol)을 MeOH/THF (1:1.5, 30 mL)에서 용해시키고, 수성 NaOH (3 N, 15 mL)으로 처리했다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, MeOH 및 THF 을 진공에서 제거했다. 수득한 수성 용액을 6 N 수성 HCl 로 약 pH 3 으로 산성화하고, EtOAc로 추출했다(3x40 mL). 배합된 유기층을 물 및 염수로 세정하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축했다. 조 생성물을 EtOH 으로부터 재결정으로 정제하여 순수 4-(N-(4-플루오로벤질)-N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조산을 백색 결정질 고형물 (2.1 g, 58.6%)로서 얻었다. MS (M-H, 428.1); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.66(s, 3H), 4.23(s, 2H), 4.26(s, 2H), 6.72(d, 2H, J=8Hz), 6.95(m, 6H), 7.92 (d, 2H J=8Hz), 8.07(d, 2H, J=8 Hz).
화합물은 1.97 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-10a: 메틸 4-(N-(4- 플루오로벤질 )-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 )- 벤조에이트
메틸 4-(N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조에이트 (실시예 5-10b) (4.3 g, 12.8 mmol)을 아세톤 (70 mL)에 용해시켰다. 세슘 카보네이트 (8.57g, 25.6 mmol) 및 (4-플루오로벤질브로마이드 (1.76 mL, 14.08 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반했다. 유기 염을 여과 제거하고 아세톤을 진공에서 제거했다. 잔류물을 에틸 아세테이트에 재용해시키고, 물 및 염수로 세정하고, 그 다음, 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 농축했다. 조 생성물을 에틸 아세테이트/헥산에 의한 재결정으로 정제하여 순수 메틸 4-(N-(4-플루오로벤질)-N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조에이트 (3.7 g, 65 %)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (400MHz, CDCl3): δ, ppm: 3.77(s, 3H), 3.98(s, 3H), 4.27(s, 2H), 4.28(s, 2H), 6.74(d, 2H, J=8Hz), 6.92(m, 4H), 7.03(m, 2H), 7.88 (d, 2H J=8Hz), 8.16(d, 2H, J=8 Hz).
실시예 5-10b: 메틸 4-(N-(4-메톡시벤질) 설파모일 ) 벤조에이트 .
디클로로메탄 (40 mL) 중 메틸 4-(클로로설포닐)벤조에이트 (실시예 5-10c) (4 g, 17.09 mmol)의 용액에 0℃ 에서 빙조에서 (4-메톡시페닐)메탄아민 (2.56 mL, 19.65 mmol) 및 트리에틸아민 (2.38 mL, 17.1 mmol)을 첨가했다. 그 다음, 빙조를 제거하고, 혼합물을, 추가 2시간 동안 교반하면서 실온으로 가온했다. 완결시, (TLC 40 % 에틸 아세테이트/헥산으로 모니터), 용매를 진공에서 제거했다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (200 mL)에 재용해시키고, 1N HCl (수성, 20 mL), 물 (20 mL) 및 염수 (20 mL)로 세정한 다음, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 용액을 농축하고, 뜨거운 에틸 아세테이트/헥산에 의한 재결정으로 생성물을 정제하여 순수 메틸 4-(N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조에이트 (4.3 g, 74.8 %)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.67(s, 3H), 3.78(s, 3H), 3.93(s, 2H), 6.78(m, 2H), 7.09(m, 2H), 7.87(m, 2H), 8.08(m, 2H), 8.25(br, s, 1H).
실시예 5-10c: 메틸 4-( 클로로설포닐 ) 벤조에이트
디클로로에탄 (10 mL) 중 4-클로로설포닐 벤조산 (5 g, 23 mmol) 및 티오닐 클로라이드 (20 mL)을 80℃로 2시간 동안 가열했다. 반응 혼합물을 회전식 증발기를 통해 농축하여 갈색을 띤 고형물로서 얻었다. 고형물을 5분 동안 얼음 상에서 냉각시키고, 아주 차가운 메탄올 (40 mL)을, 0℃ 에서 5분 동안 교반하면서 첨가했다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 추가 10분 교반했다. 아주 차가운 물 (40 mL)을 첨가하고, 여과로 수집한 백색 고형물을 생성하고, 진공 하에서 건조시켜 순수 메틸 4-(클로로설포닐)벤조에이트 (4.5 g, 84 %)를 얻었다. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.84(s, 3H), 7.70(d, 2H, J=8.4Hz), 7.93(d, 2H, J=8.4Hz).
실시예 5-11: 4-((N-벤질-4- 메틸페닐설폰아미도 ) 메틸 )사이클로헥산- 카르복실산
Figure 112010017594708-pct00103
100 mL 의 2,2-디메톡시프로판 중 4-(아미노메틸)사이클로헥산카르복실산(1.57 g, 10 mmol)의 현탁액에 HCl (10 ml, 36% 수성)을 첨가했다. 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반한 다음, 농축했다. 잔류물을 최소량의 MeOH 에 용해시키고, 디에틸 에테르를 첨가하여 메틸 4-(아미노메틸)사이클로헥산카르복실레이트의 HCl 염을 회색이 도는 백색 고형물로서 침전시켰다. 이 물질을 추가의 정제 또는 특성규명없이 사용했다.
5 mL 의 디클로로메탄 중 메틸 4-(아미노메틸)사이클로헥산카르복실레이트(208 mg, 1 mmol)의 HCl 염의 혼합물에 0℃ 에서 빙조에서 트리에틸아민 (360 ㎕, 2.58 mmol) 및 4-메틸벤젠-1-설포닐 클로라이드 (190 mg, 1 mmol)을 첨가했다. 빙조를 서서히 실온으로 가온하고, 밤새 교반했다. 용매를 진공에서 제거했다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (20 mL)에 재용해시키고, 1N HCl (5 mL), 물 (5 mL) 및 염수 (5 mL)로 세정한 다음, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 농축했다. 이러한 조 생성물 (162 mg, 0.5 mmol)을 아세톤 (5 mL)에 재용해시키고, 탄산칼륨 (110 mg, 0.79 mmol) 및 (4-플루오로페닐)메탄아민 (1.76 mL, 14.08 mmol)으로 처리했다. 혼합물을 가압 용기에서 80℃에서 밤새 교반한 다음, 냉각하고, 유기 염을 여과 제거했다. 아세톤을 진공에서 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트에 재용해시키고, 물, 그 다음 염수로 세정했다. 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 농축했다. 조 생성물 (162 mg, 0.4 mmol)을 MeOH/THF (1:1.5, 10 mL)에 용해시키고, 수성 NaOH (10N, 400 ㎕)로 처리했다. 혼합물을 100℃에서 20분 동안 마이크로웨이브에서 교반하고, 그 다음, MeOH 및 THF 을 진공에서 제거했다. 잔류물을 6 N 수성 HCl 로 약 pH 3 으로 산성화하고, EtOAc로 추출했다; 배합된 유기층을 물 및 염수로 세정하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축했다. 조 생성물을 EtOH 으로부터 재결정으로 정제하여 순수 4-((N-벤질-4-메틸페닐설폰아미도)메틸)사이클로헥산카르복실산을 백색 고형물 (120 mg, 74%)로서 얻었다. MS (M+H, 402); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 0.68(m, 2H)), 0.91(m, 2H), 1.06 (br, s, 1H), 1.50 (d, 2H), 1.72(d, 2H), 2.0(1H), 2.41(s, 3H), 2.86(m, 2H), 4.21(s, 2H), 7.30(m, 5H), 7.43(m, 2H), 7.73(m, 2H), 11.97(br, s, 1H).
화합물은 0.014 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-12: 4-(N-(3- 플루오로벤질 )-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00104
메틸 4-(N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조에이트 (실시예 5-10b) (500 mg, 1.49 mmol), 3-플루오로벤질 브로마이드 (280 mg, 2.98 mmol), 및 세슘 카보네이트 (971 mg, 2.98 mmol)을 DMF (12 mL)에 넣고, 90℃에서 4시간 동안 교반했다. 용액을 실온으로 냉각시키고, 물 (200 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트 (3x, 100 mL)로 추출했다. 배합된 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에서 농축했다. 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (헥산 중 10-20 % 에틸 아세테이트)로 정제하여 메틸 4-(N-(3-플루오로벤질)-N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조에이트 (528 mg, 80 %)를 백색 고형물로서 얻었다.
메틸 4-(N-(3-플루오로벤질)-N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조에이트 (500 mg, 1.12 mmol)을 MeOH/THF (1:1, 40 mL)에 용해시키고, 수성 NaOH (10 N, 8 ml)의 용액으로 처리했다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, MeOH 및 THF 을 회전식 증발로 제거했다. 수득한 수성 용액을 EtOAc (10 mL)로 세정하고, 6 N 수성 HCl (약 15 mL)로 약 pH 4 로 산성화했다. 수성 용액을 EtOAc로 추출했다(3x, 40 mL) 및 배합된 유기층을 물, 염수로 세정하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 농축했다. 조 생성물을 EtOH 으로부터 재결정으로 정제하여 표제 화합물 4-(N-(3-플루오로벤질)-N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조산을 백색 결정질 고형물 (150 mg)로서 수율 30 % 로 얻었다. MS (M-H, 428.1); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.65(s, 3H), 4.27(s, 2H), 4.29(s, 2H), 6.75-7.00(m, 7H), 7.20(m, 1H), 7.95(d, 2H, J=8 Hz); 8.10(d, 2H, J=8 Hz).
실시예 5-13: 4-(N-벤질-N-(2,4- 디메톡시벤질 ) 설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00105
(2,4-디메톡시페닐)메탄아민, 메틸 4-(클로로설포닐)벤조에이트 (실시예 5-10c) 및 벤질 브로마이드로부터 실시예 5-10 과 같이 제조했다. MS (M-H, 440.10); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.50(s, 63H), 3.66(s, 3H), 4.20(s, 2H), 4.34(s, 2H), 6.29(s, 1H), 6.33(d, J=8.0Hz, 1H), 6.91(d, J=8.8Hz, 1H), 7.12-7.23(m, 5H), 7.80(d, J=8.0Hz, 2H), 8.01(d, J=8.4Hz, 2H), 13.49(s, 1H).
실시예 5-14: 4-(N-(3- 클로로벤질 )-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00106
메틸 4-(N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조에이트 (실시예 5-10b) 및 1-(브로모메틸)-3-클로로벤젠로부터 실시예 5-10 과 같이 제조했다. MS (M-H, 444.1); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.69(s, 3H), 4.30(m, 4H), 6.76-7.24(m, 8H), 7.99(m, 2H), 8.13(m, 2H).
화합물은 1.88 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-15: 4-(N-벤질-N-(2,4,6- 트리메톡시벤질 ) 설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00107
(2,4,6-트리메톡시페닐)메탄아민, 메틸 4-(클로로설포닐)벤조에이트 (실시예 5-10c) 및 벤질 브로마이드로부터 실시예 5-10 과 같이 제조했다. MS (M-H, 470.10); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.45(s, 6H), 3.69(s, 3H), 4.26(s, 2H), 4.28(s, 2H), 5.98(s, 2H), 7.11-7.26(m, 5H), 7.82(d, J=8.0Hz, 2H), 8.07(d, J=8Hz, 2H), 13.49(s, 1H). 원소분석 (실측치, %): C 61.05; H 5.49; N 2.98; (계산치, %): C61.13; H 5.34 및 N 2.97
화합물은 10.76 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-16: 4-((N-벤질-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 ) 메틸 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00108
메틸 4-(N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조에이트 (실시예 5-10b) 및 벤질 브로마이드로부터 실시예 5-10 과 같이 제조했다. MS (M-H, 424.1); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.72(s, 3H), 4.18 (d, 2H), 4.55(s, 2H), 6.83(m, 2H), 7.12(m, 2H), 7.21(m, 2H), 7.28(m, 3H), 7.43(m, 2H), 7.93(m, 2H).
실시예 5-17: 4-(N-(4-메톡시벤질)-N- 프로필설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00109
메틸 4-(N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조에이트 (실시예 5-10b) 및 n-프로필 브로마이드로부터 실시예 5-10 과 같이 제조했다. MS (M-H, 362.1); 1H NMR (400MHz, CDCl3): δ, ppm: 0.70(m, 3H), 1.35(m, 3H), 3.08(m, 2H), 3.73(s, 3H), 4.31(s, 2H), 6.83(m, 2H), 7.17(m, 2H), 7.93(m, 2H), 8.23(m, 2H).
화합물은 3.75 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-18: 4-(N-(4-메톡시벤질)-N- 페닐설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00110
아닐린, 메틸 4-(클로로설포닐)벤조에이트 (실시예 5-10c) 및 1-(클로로메틸)-4-메톡시벤젠로부터 실시예 5-10 과 같이 제조했다. MS (M-H, 396.1); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.66(s, 3H), 4.73(s, 2H), 6.78(d, J=8.4Hz, 2H), 7.00(d, J=7.6Hz, 2H), 7.12(d, J=8.0Hz, 2H), 7.24(d, J=8.0Hz, 2H), 8.11(d, J=8.4Hz, 2H), 13.49(s, 1H).
실시예 5-19: 4-(N-(4-메톡시벤질)-N- 펜에틸설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00111
2-페닐에탄아민, 메틸 4-(클로로설포닐)-벤조에이트 (실시예 5-10c) 및 1-(클로로메틸)-4-메톡시벤젠로부터 실시예 5-10 과 같이 제조했다. MS (M-H, 424.1); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 2.51(m, 2H), 3.23(m, 2H), 3.74(s, 3H), 4.31(s, 2H), 4.31(s, 2H), 6.92(m, 2H), 6.98(m, 2H), 7.20-7.27(m, 5H), 7.85(m, 2H), 8.06(m, 2H).
화합물은 4.58 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-20: 4-((N-(4- 플루오로벤질 )-4- 메틸페닐설폰아미도 ) 메틸 )-사이클로 헥산카르복실산
Figure 112010017594708-pct00112
1-(브로모메틸)-4-플루오로벤젠, 4-(아미노메틸)사이클로헥산카르복실산 및 4-메틸벤젠-1-설포닐클로라이드로부터 실시예 5-11 과 같이 제조했다. MS (M+H, 420); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 0.71(m, 2H)), 0.95(m, 2H), 1.15 (br, s, 1H), 1.51 (d, 2H), 1.76(d, 2H), 2.0(1H), 2.40(s, 3H), 2.85(m, 2H), 4.22(s, 2H), 7.14(m, 2H), 7.32(m, 2H), 7.40(m, 2H), 7.69(m, 2H), 11.93(br, s, 1H).
화합물은 0.083 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-21: 4-((4- 아세트아미도 -N- 벤질페닐설폰아미도 ) 메틸 )-사이클로 헥산카르복실산
Figure 112010017594708-pct00113
아세트아미도벤젠-1-설포닐 클로라이드, 4-(아미노메틸)사이클로헥산카르복실산 및 벤질 브로마이드로부터 실시예 5-11 과 같이 제조했다. MS (M+H, 445.2); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 0.65(m, 2H), 0.68(m, 2H), 1.05(m, 1H), 1.48(m, 2H), 1.70(m, 2H), 1.92(m, 1H), 2.00(s, 3H), 2.82(s, 2H), 4.21(s, 2H), 7.27(m, 5H), 7.76(m, 4H), 7.62(m, 2H), 10.1(s, 1H), 11.93(br, s, 1H).
화합물은 1.619 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-22: 4-((N-(4- 플루오로벤질 ) 페닐설폰아미도 ) 메틸 )-사이클로 헥산카르복실산
Figure 112010017594708-pct00114
벤젠설포닐 클로라이드, 4-(아미노메틸)-사이클로헥산카르복실산 및 1-(브로모메틸)-4-플루오로벤젠로부터 실시예 5-11 과 같이 제조했다. MS (M+H, 406); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 0.77(m, 2H), 0.94(m, 2H), 0.98(m, 2H), 1.50(m, 2H0, 1.75(m, 2H), 1.77(m, 1H), 2.80 (d, 2H), 4.28(s, 2H), 7.20(m, 2H), 7.38(m, 2H), 7.62(m, 2H), 7.70(m, 1H), 7.88(m, 2H), 11.93(br, s, 1H).
화합물은 0.240 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-23: 4-(N-(사이클로 헥실메틸 )-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 )-벤조산
Figure 112010017594708-pct00115
메틸 4-(N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조에이트 (실시예 5-10b) 및 사이클로헥실메탄아민로부터 실시예 5-10 과 같이 제조했다. MS (M-H, 416.1); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 0.63(m, 2H), 0.87(m, 3H), 0.94(m, 1H), 1.25-1.52(m, 5H), 1.70(m, 2H), 2.86(m, 2H), 3.70(s, 3H), 4.22(s, 2H), 6.84(m, 2H), 7.16(m, 2H), 7.91(m, 2H), 7.62(m, 2H), 8.09(m, 2H).
화합물은 3.47 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-24: 4-((N-(4- 플루오로벤질 )-1- 페닐메틸설폰아미도 ) 메틸 )-사이클로 헥산카르복실산
Figure 112010017594708-pct00116
페닐메탄설포닐 클로라이드 및 메틸 4-(아미노메틸)사이클로헥산카르복실레이트 및 1-(브로모메틸)-4-플루오로벤젠로부터 실시예 5-10 과 같이 제조했다. MS(M-H, 418); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 0.639(m, 2H), 0.897(m, 2H), 1.034(m, 1H), 1.467 (d, broad, 2H, J=11.2Hz), 1.709 (d, broad, 2H, J=11.2Hz), 1.961(m, 1H), 2.828(d, 2H, J=7.6Hz), 4.207(s, 2H), 4.449(s, 2H), 7.155 (t, 2H, J=9.2Hz), 7.377(m, 7H), 12 (s, broad, 1H)
화합물은 9.57 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-25: 4-(N-(2- 시아노벤질 )-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 ) 벤조산
Figure 112010017594708-pct00117
메틸 4-(N-(4-메톡시벤질)설파모일)-벤조에이트 (실시예 5-10b) 및 알파-브로모-o-톨루니트릴로부터 실시예 5-10 과 같이 제조했다. MS(M-H, 435.1); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.664(s, 2H), 4.348(s, 2H), 4.498(s, 2H), 6.728(d, 2H, J=8.4Hz), 7.036(d, 2H, j=8.4Hz), 7.352 (t, 2H, J=9.2Hz), 7.548(t, 1H, J=7.6Hz), 7.640(d, 1H, J=7.6Hz), 8.003(d, 2H, J=8Hz), 8.139(d, 2H, J=8.4Hz), 13.559 (s, broad, 1H).
화합물은 4.61 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-26: 4-(N-(4- 아세트아미도벤질 )-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00118
메틸 4-(N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조에이트 (실시예 5-10b) 및 N-(4-(클로로메틸)페닐)아세트아미드로부터 실시예 5-10 과 같이 제조했다. MS (M-H, 467.1); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 2.0(s, 3H), 3.69s, 3H), 4.23(s, 4H), 6.78(d, 2H, J=7.6Hz), 6.98(m, 4H), 7.41(d, 2H, J=8Hz), 7.94(d, 2H, J=8Hz), 8.09(d, 2H, J=8Hz), 9.90(s, 1H).
실시예 5-27: 4-(N-(푸란-3- 일메틸 )-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00119
110 mg 의 1-(푸란-3-일)-N-(4-메톡시벤질)메탄아민 (실시예 5-27a)을 DCM (5 mL) 중 메틸 4-(클로로설포닐)벤조에이트 (실시예 5-10c) (117 mg, 0.5mmol) 및 트리에틸 아민 (100 ㎕)과 혼합했다. 혼합물을 밤새 실온에서 교반하고, 농축했다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (20 mL)에 재용해시키고, 1N HCl (수성, 2mL), 그 다음, 물 (5 mL) 및 염수 (5 mL)로 세정한 다음, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 조 생성물을 분취 TLC (40 % 에틸 아세테이트/헥산)로 정제하여 메틸4-(N-(푸란-3-일메틸)-N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조에이트를 백색 고형물로서 얻었다. 실시예 5-10에 기재된 비누화로 4-(N-(푸란-3-일메틸)-N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조산을 백색 결정질 고형물 (68 mg, 64 % 수율)로서 얻었다. MS (M-H, 400.1); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.72(s, 3H), 4.13(s, 2H), 4.26(s, 2H), 5.99(s, 1H), 6.87(m, 4H), 6.87(d, 2H, J=8.8Hz), 7.13(d, 2H, J=8.8Hz), 7.39(s, 1H), 7.49(s, 1H), 7.95(d, 2H, J=8.4Hz), 8.09(d, 2H, J=8.8Hz).
실시예 5-27a: 1-(푸란-3-일)-N-(4-메톡시벤질) 메탄아민
MeOH (20 mL) 중 3-푸르알데히드 (5 mmol, 437 ㎕) 및 (4-메톡시페닐)메탄아민의 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 나트륨 보로하이드라이드 (300 mg, 7.89 mmol)을 서서히 첨가했다. 수득한 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하고, NaOH (1 N, 수성)으로 급랭시켰다. 메탄올을 진공에서 제거하고, 수득한 슬러리를 에틸 아세테이트에 재용해시키고, 그 다음, 물, 염수로 세정하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축했다. 실리카겔 크로마토그래피 (에틸 아세테이트: 헥산 7:3)로 정제하여 1-(푸란-3-일)-N-(4-메톡시벤질)메탄아민을 오일로서 얻었다. MS (M+H, 218.10); 1H NMR (400MHz, CDCl3): δ, ppm: 3.64(s, 2H), 3.74(s, 2H), 3.80(s, 3H), 6.39(m, 1H), 6.86(m, 1H), 6.88(m, 1H), 7.23(m, 1H), 7.25(m, 1H), 7.35(m, 1H), 7.38(m, 1H).
실시예 5-28: 4-(N,N- 디벤질설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00120
디벤질아민 및 메틸 4-(클로로설포닐)-벤조에이트 (실시예 5-10c)로부터 실시예 5-27과 같이 제조했다. MS (M-H, 380.1); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 4.52(s, 4H), 7.10(m, 4H), 7.25(m, 6H), 8.00(d, 2H, J=8.4Hz), 8.15 (d, 2H J=8.4Hz), 13.5 (s, broad, 1H).
화합물은 7.74 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-29: 4-(N-(4-메톡시벤질)-N- 메틸설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00121
1-(4-메톡시페닐)-N-메틸메탄아민 및 메틸 4-(클로로설포닐)-벤조에이트 (실시예 5-10c)로부터 실시예 5-27과 같이 제조했다. MS (M-H, 335.1); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 2.51(s, 3H), 3.71(s, 3H), 4.05(s, 2H), 6.88 (d, 2H), 7.18 (d, 2H), 7.91 (d, 2H); 8.13 (d, 2H). 원소 분석: (실측치): C 57.47%, H 4.77% 및 N 4.31%; (이론적): C 57.30%, H 5.11% 및 N 4.18%
실시예 5-30: 4-(N,N- 비스(4-메톡시벤질)설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00122
비스(4-메톡시벤질)아민 및 메틸 4-(클로로설포닐)-벤조에이트 (실시예 5-10c)로부터 실시예 5-27과 같이 제조했다. MS (M-H, 440.1); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.68(s, 6H), 4.20(s, 4H), 6.77 (d, 4H, J=10Hz), 6.98 (d, 4H, J=10Hz), 7.92 (dd, 2H J=8Hz), 8.06(dd, 2H, J=8 Hz). 원소 분석 (실측치): C 62.45%, H 5.19% 및 N 3.06%; (이론적): C 62.57%, H 5.25% 및 N 3.17%
화합물은 4.14 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-31: 4-(N-(2- 플루오로벤질 )-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00123
메틸 4-(N-(4-메톡시벤질)설파모일)-벤조에이트 (실시예 5-10b) 및 1-(브로모메틸)-2-플루오로벤젠로부터 실시예 5-10과 같이 제조했다. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.66(s, 3H), 4.29(s, 2H), 4.37(s, 2H), 6.72(d, 2H, J=8Hz), 7.01-7.03(m, 6H), 7.93(d, 2H, J=8Hz), 8.08(d, 2H, J=8Hz).
실시예 5-32: 4-(N-(2,5- 디플루오로벤질 )-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 )-벤조산
Figure 112010017594708-pct00124
메틸 4-(N-(4-메톡시벤질)설파모일)-벤조에이트 (실시예 5-10b) 및 2-(브로모메틸)-1,4-디플루오로벤젠로부터 실시예 5-10과 같이 제조했다. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.66(s, 3H), 4.31(s, 2H), 4.33(s, 2H), 6.74-7.06(m, 7H), 7.95(d, 2H, J=8Hz), 8.09(d, 2H, J=8Hz).
실시예 5-33: 4-(N-(2,3- 디플루오로벤질 )-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00125
메틸 4-(N-(4-메톡시벤질)설파모일)-벤조에이트 (실시예 5-10b) 및 1-(브로모메틸)-2,3-디플루오로벤젠로부터 실시예 5-10과 같이 제조했다. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.30(s, 3H), 4.29(s, 2H), 4.32(s, 2H), 6.87(d, 2H, J=8Hz), 7.02-7.20(m, 5H), 7.95(d, 2H, J=8Hz). 8.05(d, 2H, J=8Hz).
실시예 5-34: 4-(N-(3-메톡시벤질)-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 )-벤조산
Figure 112010017594708-pct00126
메틸 4-(N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조에이트 (실시예 5-10b) 및 3-브로마이드로부터 실시예 5-10과 같이 제조했다. MS (M-H, 440.50); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.58(s, 3H), 3.68(s, 3H), 4.24(s, 2H), 4.25(s, 2H), 6.50(s, 1H), 6.64(d, J=4Hz, 1H), 6.73(m, 1H), 6.77(d, J=8Hz, 2H), 7.00(d, J=8Hz, 2H), 7.12(t, J=8Hz, 1H), 7.94(d, J=8Hz, 2H), 8.09(d, J=8Hz, 2H), 13.49(s, 1H).
화합물은 2.46 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-35: 4-(N-벤질-N-(4- 메톡시페닐 ) 설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00127
4-(N-(4-메톡시페닐)설파모일)-벤조에이트 (실시예 5-35a) 및 벤질 브로마이드로부터 실시예 5-10과 같이 제조했다. MS (M-H, 396); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.66(s, 3H), 4.75(s, 2H), 6.76(d, J=8Hz, 2H), 6.90(d, J=8Hz, 2H), 7.23(m, 5H), 7.74(d, J=8Hz, 2H), 8.11(d, J=8Hz, 2H), 13.51(s, 1H).
실시예 5-35a: 4-(N-(4- 메톡시페닐 ) 설파모일 ) 벤조에이트
디클로로메탄 (10 mL) 중 4-메톡시벤젠아민 (580 mg, 4.71 mmol) 및 트리에틸아민 (1.48 mL, 10.7 mmol)에 메틸 4-(클로로설포닐)벤조에이트 (1.00 g, 4.28 mmol)을 첨가했다. 이 혼합물을 16시간 동안 실온에서 교반했다. 반응물을 디클로로메탄 (50 mL)으로 희석하고, 계속해서 물, 10 % 시트르산, 및 염수로 세정했다. 유기물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 로토바프로 농축했다. 수득한 조 물질을, 용리액으로서 100 % 디클로로메탄을 사용하여 실리카겔 상에서 크로마토그래피를 수행하여 4-(N-(4-메톡시페닐)설파모일)벤조에이트를 백색 결정질 고형물 (400 mg, 30 % 수율)로서 얻었다.
실시예 5-36: 4-(N-(3,4- 디플루오로벤질 )-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00128
N-(3,4-디플루오로벤질)(4-메톡시페닐)-메탄아민(실시예 5-36a) 및 메틸 4-(클로로설포닐)벤조에이트 (실시예 5-10c)로부터 실시예 5-10과 같이 제조했다. MS (M-H, 446); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ ppm: 3.69(s, 3H), 4.20(s, 4H), 6.73(d, J=8.8Hz, 2H), 6.93(m, 2H), 6.98(d, J=8.8Hz, 2H), 7.22(m, 1H), 7.74(d, J=8.4Hz, 2H), 7.99(d, J=8.4Hz, 2H).
실시예 5-36a: N-(3,4- 디플루오로벤질 )(4- 메톡시페닐 ) 메탄아민
디클로로메탄 (15 mL) 중 (4-메톡시페닐)메탄아민 (1.77 mL, 13.6 mmol) 및 아세트산 (2.7 mL, 45 mmol)에 3,4-디플루오로벤즈알데히드 (1.0 m, 9.08 mmol)을 첨가했다. 이 혼합물을 마이크로웨이브에서 100℃에서 15분 동안 가열했다. 반응물을 실온으로 냉각하고, 매크로포러스(macroporous) 시아노보로하이드라이드 수지 (9.8 g, 22.7 mmol)을 나누어서 첨가했다. 이 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반했다. 수지를 여과 제거하고 디클로로메탄으로 헹구고, 유기물을, 거품이 멈출 때까지 포화 중탄산나트륨으로 세정했다. 유기물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 로토바프로 농축했다. 수득한 조 물질을, 용리액으로서 메탄올 디클로로메탄 구배를 사용하여 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 N-(3,4-디플루오로벤질)(4-메톡시페닐)메탄아민을 황색을 띤 오일 (1.9 g, 80 % 수율)로서 얻었다. MS (M+H, 264); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 2.63 (br s, 1H), 3.56(s, 2H), 3.61(s, 2H), 3.71(s, 3H), 6.84(d, J=8.8Hz, 2H), 7.14(m, 1H), 7.21(d, J=8.4Hz, 2H), 7.34(m, 2H).
실시예 5-37: 4-((N-(4- 플루오로벤질 )-4- 메틸페닐설폰아미도 ) 메틸 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00129
4-(아미노메틸)페닐카르복실산, 4-메틸벤젠-1-설포닐클로라이드 및 4-플루오로벤질 브로마이드로부터 실시예 5-11과 같이 제조했다. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.11(s, 3H), 4.21(s, 2H), 4.24(s, 2H), 6.94-7.08(m, 6H), 7.40-7.42(d, 2H, J=8Hz), 7.63(d, 2H, J=8Hz), 7.73(d, 2H, J=8Hz).
화합물은 0.054 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-38: 4-((4- 카르복시 -N-(4-메톡시벤질) 페닐설폰아미도 ) 메틸 )-벤조산
Figure 112010017594708-pct00130
메틸 4-(브로모메틸)벤조에이트 및 메틸 4-(N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조에이트 (실시예 5-10b)로부터 실시예 5-10과 같이 제조했다. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.65(s, 3H), 4.24(s, 2H), 4.33(s, 2H), 6.71(d, 2H, J=8Hz), 6.95(d, 2H, J=8Hz), 7.14(d, 2H, J=8Hz), 7.73(d, 2H, J=8Hz), 7.89(d, 2H, J=8Hz), 8.06(d, 2H, J=8Hz).
실시예 5-39: 4-(N-벤질-N-(3,4- 디메톡시벤질 ) 설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00131
(3,4-디메톡시페닐)메탄아민, 메틸 4-(클로로설포닐)벤조에이트 (실시예 5-10c) 및 벤질 클로라이드로부터 실시예 5-10과 같이 제조했다. MS (M-H, 440.10); 1H NMR (400MHz, CD3OD): δ, ppm: 3.59(s, 3H), 3.76(s, 3H), 4.30(s, 2H), 4.36(s, 2H), 6.51(d, 1H, J=1.7Hz), 6.60(m, 1H), 6.76(d, 1H, J=8.2Hz), 7.12(m, 2H), 7.21(m, 3H), 7.95(d, 2H, J=8.6Hz), 8.18(d, 2H, J=8.6 Hz).
화합물은 0.678 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-40: 4-(N-(3,4- 디메톡시벤질 )-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00132
(3,4-디메톡시페닐)메탄아민, 메틸 4-(클로로설포닐)벤조에이트 (실시예 5-10c) 및 4-메톡시벤질브로마이드로부터 실시예 5-10과 같이 제조했다. MS (M-H, 470.10); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.49(s, 3H), 3.67(s, 3H), 3.68(s, 3H), 4.20(s, 2H), 4.22(s, 2H), 6.41(d, 1H, J=1.4Hz), 6.58 (dd, 1H, J1 = 8.2Hz, J2 = 1.4Hz), 6.78(m, 3H), 7.02(d, 2H, J=8.6Hz), 7.94(d, 2H, J=8.4Hz), 8.09(d, 2H, J=8.4 Hz).
화합물은 1.47 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-41: 4-(N-(3- 플루오로 -4-메톡시벤질)-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 )-벤조산
Figure 112010017594708-pct00133
4-(브로모메틸)-2-플루오로-1-메톡시벤젠 및 메틸 4-(N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조에이트 (실시예 5-10b)로부터 실시예 5-10과 같이 제조했다. MS (M-H, 458.10); 1H NMR (400MHz, CD3OD): δ, ppm: 3.73(s, 3H), 3.80(s, 3H), 4.24(s, 2H), 4.28(s, 2H), 6.75(m, 4H), 6.88(m, 1H), 6.97(d, 2H, J=8.6Hz), 7.88(d, 2H, J=8.3Hz), 8.14(d, 2H, J=8.3 Hz).
화합물은 1.11 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-42: 4-((4-하이드록시-N-(2-메톡시벤질) 페닐설폰아미도 ) 메틸 )-벤조산
Figure 112010017594708-pct00134
4-(N-(2-메톡시벤질)설파모일)페닐 아세테이트 (실시예 5-42a) (50 mg, 0.15 mmol)을 아세톤 (1.0 mL)에서 용해시키고, 그 다음, 세슘 카보네이트 (97 mg, 0.30 mmol) 및 메틸 4-(브로모메틸)벤조에이트 (38 mg, 0.17 mmol)을 첨가했다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 유기 염을 여과 제거했다. 아세톤을 진공에서 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트에 재용해시키고, 물, 그 다음 염수로 세정했다. 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 농축했다. 조 생성물을 용리액으로서 에틸 아세테이트/헥산에 의한 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 메틸 4-((4-아세트옥시-N-(2-메톡시벤질)페닐설폰아미도)메틸)벤조에이트를 얻었다.
메틸 4-((4-아세트옥시-N-(2-메톡시벤질)페닐설폰아미도)메틸)벤조에이트 (조(粗))을 THF (1.0 mL) 에 용해시키고, 수성 NaOH (1N, 2.0 mL, 2.0 mmol)로 처리했다. 혼합물을 1시간 동안 환류했다. 완결시, THF 를 진공에서 제거하고, 수득한 수성 용액을 6 N 수성 HCl 로 약 pH 3 로 산성화했다. 수성 상을 EtOAc로 추출하고(2x15 mL), 배합된 유기층을 물, 염수로 세정하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축했다. 조 생성물을 역상 HPLC 로 정제하여 10.8 mg 의 표제 화합물 (2단계에 걸쳐 15% 수율)을 얻었다. MS (M-H, 426.1); 1H NMR (400MHz, 아세톤-d6): δ, ppm: 3.65(s, 3H), 4.37(s, 2H), 4.43(s, 2H), 6.79(m, 2H), 7.01(d, 2H, J=8.0Hz), 7.17(m, 2H), 7.28(d, 2H, J=7.9Hz), 7.73(d, 2H, J=8.0Hz), 7.87(d, 2H, J=7.9 Hz).
화합물은 2.56 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-42a: 4-(N-(2-메톡시벤질) 설파모일 ) 페닐 아세테이트
5.0 mL 의 디클로로메탄 중 4-(클로로설포닐)페닐 아세테이트 (실시예 5-42b) (531 mg, 2.265 mmol)의 용액을 빙조에서 0℃ 냉각했다. (2-메톡시페닐)메탄아민 (325 ㎕, 2.492 mmol) 및 트리에틸아민 (347 ㎕, 2.492 mmol)을 첨가했다. 그 다음, 빙조를 제거하고, 혼합물을 실온으로 가온하고, 2시간 동안 교반했다. 반응 혼합물을 농축하고, 조 생성물을 칼럼 크로마토그래피 (헥산/에틸 아세테이트 = 90/10 내지 30/70)로 정제하여 순수 4-(N-(2-메톡시벤질)설파모일)페닐 아세테이트 (743 mg, 89 %)를 백색 고형물로서 얻었다. MS (M+H, 336.1) 1H NMR (400MHz, CDCl3): δ, ppm: 2.32(s, 3H), 3.71(s, 3H), 4.18(d, 2H, J=5.8Hz), 5.15(t, 1H, J=5.8Hz), 6.71(d, 1H, J=8.2Hz), 6.82(br t, 1H, J=7.4Hz), 7.07(br d, 1H, J=7.4Hz), 7.10(d, 2H, J=8.7Hz), 7.19(br t, 1H, J=7.8Hz), 7.74(d, 2H, J=8.7 Hz).
실시예 5-42b: 4-( 클로로설포닐 ) 페닐 아세테이트
6.285 g (36.08 mmol) 의 4-하이드록시벤젠설폰산을 30 mL 의 아세트산 무수물 및 15 mL 의 아세트산의 혼합물에 용해시키고, 6시간 동안 환류했다. 휘발성 물질을 증발시키고, 고진공 하에서 밤새 두었다. 수득한 조 생성물을 100 mL 의 DCM 에 용해시키고, 4.72 mL 의 옥살릴 클로라이드 (54.12 mmol) 및 139 ㎕ 의 DMF (1.804 mmol)로 0 ℃ 에서 처리했다. 가스 발생이 멈출 때까지 교반을 계속한 다음, 반응물을 농축하고, EtOAc 에 용해시켰다. 유기층을 2 N 황산으로 2회 세정하고, 염수 및 황산마그네슘으로 건조시켰다. 농축하여 7.067 g 의 4-(클로로설포닐)페닐 아세테이트를 짙은 흑색 오일로서 얻었는데, 이는 결국 고형화된다 (2단계에 걸쳐 83 % 수율).
1H-NMR (400MHz, CDCl3): δ, ppm: 2.35(s, 3H), 7.37(d, 2H, J=8.9Hz), 8.06(d, 2H, J=8.9 Hz). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ, ppm: 21.13, 123.05, 128.91, 141.15, 155.80, 168.29.
실시예 5-43: 4-((4-하이드록시-N-(3-메톡시벤질) 페닐설폰아미도 ) 메틸 )-벤조산
Figure 112010017594708-pct00135
(3-메톡시페닐)메탄아민 및 메틸 4-(브로모메틸)벤조에이트로부터 실시예 5-42과 같이 제조했다. MS (M-H, 426.10); 1H NMR (400MHz, 아세톤-d6): δ, ppm: 3.66(s, 3H), 4.32(s, 2H), 4.40(s, 2H), 6.65 (br s, 1H), 6.73(m, 2H), 7.05(d, 2H, J=8.5Hz), 7.12(t, 1H, J=8.0Hz), 7.27(d, 2H, J=8.0Hz), 7.82(d, 2H, J=8.5Hz), 7.88(d, 2H, J=8.0 Hz).
화합물은 0.188 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-44: 4-((4-하이드록시-N-(4-메톡시벤질) 페닐설폰아미도 ) 메틸 )-벤조산
Figure 112010017594708-pct00136
(4-메톡시페닐)메탄아민 및 메틸 4-(브로모메틸)벤조에이트로부터 실시예 5-42과 같이 제조했다. MS (M-H, 426.10); 1H NMR (400MHz, 아세톤-d6): δ, ppm: 3.73(s, 3H), 4.27(s, 2H), 4.35(s, 2H), 6.76(d, 2H, J=8.0Hz), 7.04 (d, 4H), 7.24(d, 2H, J=7.8Hz), 7.79(d, 2H, J=8.2Hz), 7.88(d, 2H, J=7.8 Hz).
화합물은 3.43 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-45: 4-((N-(3- 플루오로벤질 )-4-하이드록 시페닐설폰아미도 ) 메틸 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00137
(3-플루오로페닐)메탄아민 및 메틸 4-(브로모메틸)벤조에이트로부터 실시예 5-42과 같이 제조했다. MS (M-H, 414.1), 1H NMR (400MHz, 아세톤-d6): δ, ppm: 4.37(s, 2H), 4.42(s, 2H), 6.94(m, 3H), 7.06(d, 2H, J=8.3Hz), 7.21(m, 1H), 7.28(d, 2H, J=7.6Hz), 7.81(d, 2H, J=8.3Hz), 7.87(d, 2H, J=7.6 Hz).
화합물은 0.459 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-46: N-벤질-N-(4-메톡시벤질)-4-(1 H - 테트라졸 -5-일)벤젠- 설폰아미드
Figure 112010017594708-pct00138
N-벤질-4-시아노-N-(4-메톡시벤질)벤젠설폰아미드 (실시예 5-46a, 400 mg, 1 mmol) 및 트리메틸주석 아지드 (400 mg, 2 mmol)을 톨루엔 (10 mL)에서 용해시키고, 150℃ 에서 3시간 동안 마이크로파 처리했다. 추가 2 당량의 트리메틸주석 아지드를 첨가하고, 반응물을 150℃ 에서 추가 3시간 동안 마이크로파 처리했다. 혼합물을 냉각하고, 여과하여 MEOH/진한 HCl (50 mL : 20 mL)에서 가수분해된 조 주석 테트라졸을 얻었다. 물을 첨가하고, 수득한 침전물을 여과로 수집했다. 생성물을 무수 에탄올 및 물로 재결정화하여 N-벤질-N-(4-메톡시벤질)-4-(1H-테트라졸-5-일)벤젠-설폰아미드를 백색 고형물로서 얻었다. MS (M+H, 436.10); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.65(s, 3H), 4.27(s, 2H), 4.30(s, 2H), 6.75(d, J=8.4Hz, 2H), 6.98(d, J=8.4Hz, 2H), 7.08(m, 2H), 7.20(m, 3H), 8.05(d, J=8.4Hz, 2H), 8.22(d, J=9.2Hz, 2H).
화합물은 3.67 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 5-46a: N-벤질-4- 시아노 -N-(4-메톡시벤질) 벤젠설폰아미드 .
4-시아노벤젠-1-설포닐클로라이드 (600 mg, 3 mmol)을 디클로로메탄 (15 mL) 중 N-벤질-1-(4-메톡시페닐)메탄아민 (실시예 5-46b, 750 mg, 3.3 mmol) 및 트리에틸아민 (500 mg, 3.6 mmol)의 용액에 첨가했다. 반응물을 실온에서 4시간 동안 교반한 다음, 로토바프 상에서 농축했다. 조 생성물을 실리카겔 상에서 정제하여 N-벤질-4-시아노-N-(4-메톡시벤질)벤젠-설폰아미드를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.68(s, 3H), 4.26(s, 2H), 4.31(s, 2H), 6.75(d, J=8.4Hz, 2H), 6.97(d, J=9.2Hz, 2H), 7.07(m, 2H), 7.21(m, 3H), 7.98(d, J=8.4Hz, 2H), 8.04(d, J=8.8Hz, 2H).
실시예 5-46b: N-벤질-1-(4- 메톡시페닐 ) 메탄아민 .
4-메톡시벤즈알데히드 (5 g, 35 mmol) 및 벤질아민 (3.8 g, 35 mmol)을 디클로로에탄 (125 mL) 중 나트륨 트리아세톡시보로하이드라이드 (10.4 g, 49 mmol)에 첨가했다. 반응물을 실온에서 2시간 교반한 다음, 농축했다. 혼합물을 디클로로메탄 (200 mL)으로 희석하고, 포화 수성 탄산수소나트륨 (200 mL), 염수 (200 mL) 로 세정하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 조 아민을 농축하고, 실리카겔 크로마토그래피 (헥산 중 70% 에틸 아세테이트)로 정제하여 N-벤질-1-(4-메톡시페닐)메탄아민을 오일로서 얻었다. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.59(s, 2H), 3.64(s, 2H), 3.71(s, 3H), 6.86(d, J=8.8Hz, 2H), 7.28(m, 7H).
실시예 5-47: 2-(4-(N-벤질-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 ) 페닐 )아세트산.
Figure 112010017594708-pct00139
메틸 2-(4-(클로로설포닐)페닐)아세테이트 (실시예 5-47a), 4-메톡시벤즈알데히드 및 벤질아민로부터 실시예 5-27과 같이 제조했다. MS (M-H, 424.10); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.66(s, 3H), 3.72(s, 2H), 4.18(s, 2H), 4.22(s, 2H), 6.73(d, J=8.4Hz, 2H), 6.91(d, J=8.4Hz, 2H), 7.02(m, 2H), 7.19(m, 3H), 7.49(d, J=8.4Hz, 2H), 7.80(d, J=8Hz, 2H).
실시예 5-47a: 메틸 2-(4-( 클로로설포닐 ) 페닐 )아세테이트.
2-(4-(클로로설포닐)페닐)아세트산 (600 mg, 2.6 mmol)을 티오닐 클로라이드 (3 mL)에 첨가하고, 80 ℃ 에서 1시간 동안 가열했다. 반응 혼합물을 농축하고, 빙조에서 0℃ 로 냉각하고, 얼음같이 차가운 메탄올을 적가했다. 혼합물을 30분 동안 교반하고, 농축하여 메틸 2-(4-(클로로설포닐)페닐)-아세테이트를 오일로서 얻었다. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.57(s, 3H), 3.65(s, 2H), 7.21(d, J=8Hz, 2H), 7.55(d, J=8Hz, 2H).
실시예 5-48: 4-((N-벤질-4- 카르복시페닐설폰아미도 ) 메틸 )벤조산.
Figure 112010017594708-pct00140
메틸-4-(클로로설포닐) 벤조에이트 (실시예 5-10c), 벤질 아민 및 메틸 4-(브로모메틸)벤조에이트로부터 실시예 5-10과 같이 제조했다. MS (M+H, 426.10); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 4.29(s, 2H), 4.34(s, 2H), 7.03(m, 2H), 7.12(m, 2H), 7.68(d, J=8Hz, 2H), 7.94(d, J=8.8Hz, 2H), 8.06(d, J=8.8Hz, 2H), 13.03(s, 2H).
실시예 5-49: 4-( 벤질(4-메톡시벤질)카르바모일 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00141
4-(클로로카보닐)벤조에이트 및 N-벤질-1-(4-메톡시페닐)메탄아민로부터 실시예 5-27과 같이 제조했다. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.72(d, J=7.6Hz, 3H), 4.26(s, 1H), 4.30(s, 1H), 4.50(s, 1H), 4.55(s, 1H), 6.89(m, 2H), 7.02(m, 1H), 7.10(m, 1H), 7.10(m, 1H), 7.20(m, 1H), 7.28(m, 4H), 7.55(m, 2H), 7.96(m, 2H), 13.13(s, 1H).
실시예 5-50: 4-(N-(4- 플루오로 -3-메톡시벤질)-N-(4-메톡시벤질) 설파모일 )-벤조산
Figure 112010017594708-pct00142
4-(브로모메틸)-4-플루오로-3-메톡시벤젠 및 메틸 4-(N-(4-메톡시벤질)설파모일)벤조에이트 (실시예 5-10b)로부터 실시예 5-10과 같이 제조했다. MS (M-H, 458.10); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.59(s, 3H), 3.67(s, 3H), 4.25(s, 2H), 4.25(s, 2H), 6.62(m, 2H), 6.77(d, J=8.4Hz, 2H), 7.02(m, 3H), 7.97(d, J=8Hz, 2H), 8.01(d, J=8.8Hz, 2H), 13.49(s, 1H).
화합물은 1.65 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
추가 화합물을 실험적으로 테스트하고 실측한 결과, hT2R14 쓴맛 수용체의 억제제로서 비교적 고수준의 유효성을 갖는다. 테스트 결과는 하기의 표 C에 나타나 있다.
[표 C]
Figure 112010017594708-pct00143
Figure 112010017594708-pct00144
Figure 112010017594708-pct00145
Figure 112010017594708-pct00146
Figure 112010017594708-pct00147
Figure 112010017594708-pct00148
Figure 112010017594708-pct00149
Figure 112010017594708-pct00150
Figure 112010017594708-pct00151
Figure 112010017594708-pct00152
Figure 112010017594708-pct00153
Figure 112010017594708-pct00154
Figure 112010017594708-pct00155
Figure 112010017594708-pct00156
Figure 112010017594708-pct00157
Figure 112010017594708-pct00158
Figure 112010017594708-pct00159
Figure 112010017594708-pct00160
Figure 112010017594708-pct00161
Figure 112010017594708-pct00162
Figure 112010017594708-pct00163
Figure 112010017594708-pct00164
Figure 112010017594708-pct00165
Figure 112010017594708-pct00166
Figure 112010017594708-pct00167
Figure 112010017594708-pct00168
Figure 112010017594708-pct00169
Figure 112010017594708-pct00170
Figure 112010017594708-pct00171
Figure 112010017594708-pct00172
Figure 112010017594708-pct00173
Figure 112010017594708-pct00174

실시예 6-1: ( Z )-3-(5-(2,5- 디메톡시벤질리덴 )-4-옥소-2- 티옥소티아졸리딘 -3-일) 프로판산
Figure 112010017594708-pct00175
3-(4-옥소-2-티옥소티아졸리딘-3-일)프로판산 (200 mg, 1 mmol), 2,5-디메톡시 벤즈알데히드 (168 mg, 1 mmol) 및 피페리딘 (0.3 mL)을 에탄올 (3 mL)에서 배합하고, 마이크로웨이브에서 100℃에서 10분 동안 가열했다. 반응물을 냉각하고, 고형물을 여과로 수집하고, 에틸 아세테이트/헥산 (1/1)로 세정하고, 에탄올로부터 재결정화하여 85 % 수율의 표제 화합물(309 mg, 갈색-오렌지색 고형물)을 얻었다. MS (M+H, 284); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 2.57 (t, 2H)), 3.74 (s, J=6.8Hz, 3H), 3.84(s, 3H), 4.19 (t, 2H), 6.90(s, 1H), 7.10(s, 2H), 7.86(s, 1H).
화합물은 2.75 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 6-2: (E)-2- 시아노 -3-(푸란-2-일)-N-(5- 페닐 -1,3,4- 티아디아졸 -2-일) 아크릴아미드
Figure 112010017594708-pct00176
5-페닐-1,3,4-티아디아졸-2-아민 (600 mg, 3.3 mmol), 시아노 아세트산 (300 mg, 3.6 mmol), 및 EDC-HCl (861 mg, 4.5 mmol)을 아세토니트릴 (15 mL)에서 실온에서 2시간 동안 교반했다. 혼합물을 수성 1N HCl 로 희석하고, 수성 상을 에틸 아세테이트로 추출했다. 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축했다. 잔류물을 에틸 아세테이트/헥산 (1/9)로 분쇄하여 2-시아노-N-(5-페닐-1,3,4-티아디아졸-2-일)아세트아미드를 백색 고형물로서 얻었는데, 이는 추가 정제없이 사용되었다.
312 mg 의 2-시아노-N-(5-페닐-1,3,4-티아디아졸-2-일)아세트아미드 및 150 ㎕ 의 푸란-2-카르브알데히드를 2.5 mL 의 DMF 에서 혼합하고, 마이크로웨이브에서 150℃에서 15분 동안 가열했다. 5 mL 의 물을 첨가하고, 수득한 침전물을 수집하고, 물 (4x)로 세정하여 조 생성물을 얻었다. 에탄올로부터 재결정화하여 180 mg 의 순수 생성물을 갈색 고형물로서 얻었다. MS (M+H, 323); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 6.82(m, 1H)), 7.43 (d, 1H), 7.49(m, 4H), 7.87(m, 2H), 8.15(s, 1H), 8.22 (br, s, 1H).
화합물은 0.499 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 6-3: N-(2,3- 디하이드로벤조[b][1,4]디옥신 -6-일)-1,4-디메틸-2,3- 디옥소 -1,2,3,4-테 트라하이드로 퀴녹살린-6- 설폰아미드
Figure 112010017594708-pct00177
1,4-디메틸-2,3-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로퀴녹살린-6-설포닐클로라이드 (실시예 6-3a, 450 mg, 1.6 mmol)을 디클로로메탄 (10 mL) 중 2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-아민 (215 mg, 1.4 mmol) 및 트리에틸아민 (170 mg, 1.7 mmol)의 교반 용액에 첨가했다. 반응물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 농축했다. 조 생성물을 실리카겔 크로마토그래피 (헥산 중 0-30 % 에틸 아세테이트)로 정제하여 N-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)-1,4-디메틸-2,3-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로퀴녹살린-6-설폰아미드를 백색 고형물로서 얻었다. MS (M+H, 404.10); 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.47(s, 3H), 3.49(s, 3H), 4.12(m, 4H), 6.55(m, 1H), 6.61(d, J=2.4Hz, 1H), 6.69(d, J=8.4Hz, 1H), 7.53(m, 1H), 7.59(d, J=2Hz, 1H), 10.00(s, 1H).
화합물은 7.71 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 6-3a: 1,4-디메틸-2,3- 디옥소 -1,2,3,4- 테트라하이드로퀴녹살린 -6- 설포닐클로라이드
클로로설폰산 (3 mL)을 65℃ 로 가열하고, 1,4-디메틸퀴녹살린-2,3(1H,4H)-디온 (실시예 6-3b, 1 g, 5.5 mmol)을 0.5시간에 걸쳐 나누어서 첨가했다. 반응 혼합물을 4시간 동안 교반한 다음, 실온으로 냉각하고, 얼음에 서서히 부었다. 수득한 침전물을 여과하고, 물로 세정하여 1,4-디메틸-2,3-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로퀴녹살린-6-설포닐 클로라이드를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.50(s, 6H), 7.25(m, 2H), 7.38(m, 4H).
실시예 6-3b: 1,4- 디메틸퀴녹살린 -2,3(1H,4H)- 디온
DMF (200 mL) 중 NaH (2.5 g)의 용액에 퀴녹살린-2,3(1H,4H)-디온 (5 g)을 나누어서 첨가하고, 그 다음, 메틸 요오다이드 (3.8 mL)를 서서히 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한 다음, 물(200 mL)을 첨가했다. 수득한 침전물을 여과로 수집하고, 물로 세정하여 1,4-디메틸퀴녹살린-2,3(1H,4H)-디온을 백색 고형물로서 95 % 수율로 얻었다. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 3.50(s, 6H), 7.25(m, 2H), 7.38(m, 4H).
실시예 6-4: 1,4-디메틸-2,3- 디옥소 -N-(4-(피리딘-2- 일메틸 ) 페닐 )-1,2,3,4- 테트라하이드로퀴녹살린 -6- 설폰아미드 .
Figure 112010017594708-pct00178
화합물은 상업적으로 이용할 수 있고, Ryan Scientific 로 구매할 수 있다.
화합물은 6.14 μM의, hT2R14 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
추가 화합물을 실험적으로 테스트하고 실측한 결과, hT2R14 쓴맛 수용체의 억제제로서 비교적 고수준의 유효성을 갖는다. 테스트 결과는 하기의 표 D에 나타나 있다.
[표 D]
Figure 112010017594708-pct00179
Figure 112010017594708-pct00180
Figure 112010017594708-pct00181
Figure 112010017594708-pct00182
Figure 112010017594708-pct00183
Figure 112010017594708-pct00184

표 7: 23개의 쓴맛 수용체에 대한 대표적인 스크리닝 결과.
실시예 5 및 6 으로부터의 화합물을 23개의 쓴맛 수용체의 패널에 대하여 스크리닝했다. 쓴맛 수용체를 상응하는 작용물질로 EC80 로 활성화했고, 25 μM 의 농도에서 상기 화합물로 처리했다. 데이타는 하기의 표에 요약되어 있다.
80% 이상의 억제율 = ++++
60% 내지 80% 의 억제율 = +++
40% 내지 60% 의 억제율 = ++
20% 내지 40% 의 억제율 = +
Figure 112010017594708-pct00185
Figure 112010017594708-pct00186

실시예 7. 실시예 10-10에 대한 감각 데이터.
개별 길항물질의 유효성을 측정하기 위해, 미각 테스트를 T2R8 특이적 작용물질, 관심 대상 화합물 및 참조 쓴맛 차단제로 수행했다. 본 출원인은 U.S. 가출원 시리즈 No. 60/957,129 (2007년 8월 21일 출원)으로부터의 실시예 4-8: N-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)벤조[d][1,3]디옥솔-5-카르복사미드의 미각 효과를 갖는 것으로 증명된 우수한 hT2R8 길항물질을 이전에 기재하였다. 거피 자체 및 넓은 스펙트럼 쓴맛 차단제와 배합한 거피의 쓴맛을 감소시키는 것을 보여주었다. 표 6에 보여진 바와 같이, 본 발명의 대조 길항물질 (실시예 10-8)과 비교할 때, 실시예 10-10의 hT2R8 길항물질은 감지된 쓴맛를 차단하기 위한 큰 능력을 보여준다.
Figure 112010017594708-pct00187
이 실시예의 미각 테스트에 의해 설명된 바와 같이, 쓴맛의 감지는 hT2R8 의 길항물질의 혼입에 의해 감소 또는 제거될 수 있고, 실시예 10-10의 길항물질은 N-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)벤조[d][1,3]디옥솔-5-카르복사미드 (7767)와 같은 공지된 쓴맛 길항물질과 비교할 때 더 잠재적인 유사체인 것으로 보인다. 쓴맛의 감지는 음식, 음료수 및/또는 의약과 같은 조성물 내에 hT2R8 의 길항물질의 혼입에 의해 감소 또는 제거될 수 있다는 것은 틀림없는데, 여기서 쓴맛은 T2R8 작용물질에 의해 유도된다.
실시예 8. hT2R8 의 길항물질의 확인
길항물질을 확인하기 위해, 무차별적인 키메라 G16g44 단백질과 함께 hT2R8를 안정하게 발현시키는 세포주는 이전의 특허 출원에 기재된 바와 같이 산출되었다. 고처리량의 분석은 안정한 세포주 및 FLIPR (Fluorescent Imaging Plate Reader)를 사용하여 행해졌다. hT2R8 의 작용물질은 각각의 최대 활성의 70-80% 이하로 수용체를 활성시키기 위해 사용되었다. hT2R8 에 대해, 사용된 작용물질은 안드로그라폴리드(200 μM)였다. 길항물질을 확인하기 위해, 다양한 화학 구조를 갖는 화합물은 작용물질과 함께 첨가되었다. 수용체 활성의 상당한 감소를 통계적으로 야기할 수 있는 화합물은 풀링되고, 투여에 따른 억제 곡선으로 재확인된다. 골격 A 및 골격 B 는 hT2R8 길항물질로서 확인되었다 (도 1). 구체적인 예는 표 1에 제공된다.
실시예 9. hT2R8 길항물질
실시예 9-1: 2-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 이소인돌린 -1,3- 디온 .
Figure 112010017594708-pct00188
2-(1H-피라졸-4-일)이소인돌린-1,3-디온 (실시예 9-1a) (1.5 g, 7 mmol), 4-(클로로메틸)-3,5-디메틸이속사졸 (1.5 g, 10 mmol), 및 세슘 카보네이트 (3.3g, 10 mmol)을 DMF (20 mL) 에서 80 ℃ 에서 3시간 동안 교반했다. 반응물을 냉각하고, 물 (150 mL)으로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출했다(3x, 75 mL). 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 로토바프 상에서 농축했다. 고형 생성물을 에틸 아세테이트/헥산 (1/9)로 분쇄하고, 환류 무수 에탄올 (30 mL)로부터 재결정화하여 2-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이소인돌린-1,3-디온 (900 mg, 38%)를 담황색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 1.36(d, 3H), 2.16(s, 3H), 2.41(s, 3H, J=7.2Hz), 5.22(s, 2H), 7.81(s, 1H), 7.91-7.83(m, 4H), 8.21(s, 1H). MS M+H 계산치 323.11 실측치 323.1. 융점: 170-171 ℃. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.18 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 9-1a: 1-토실-1H- 피라졸 -4-아민
Figure 112010017594708-pct00189
1-토실-1H-피라졸-4-아민 (실시예 9-1b) (3g, 12.7 mmol) 및 이소벤조푸란-1,3-디온 (1.9 g, 13 mmol)을 DMF/아세토니트릴 (1/1) (20 mL)에서 100 ℃ 에서 1시간 동안 교반했다. 혼합물을 냉각하고, 물로 희석했다. 침전물을 여과로 수집하고, 추가 물, 그 다음, 에틸 아세테이트 및 헥산으로 세정했다. 고형 생성물을 고진공 하에서 건조시켜 2-(1H-피라졸-4-일)이소인돌린-1,3-디온 (2.5 g, 92%)를 황색 고형물로서 얻었다. MS M+H 계산치 214.1 실측치 214.1. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.93-8.10(m, 6H), 13.03(bs, 1H).
실시예 9-1b: 1-토실-1H- 피라졸 -4-아민.
Figure 112010017594708-pct00190
MeOH (150 mL) 중 4-니트로-1-토실-1H-피라졸 (실시예 9-1c) (3 g, 11.2 mmol) 및 10 % Pd/C (800 mg)을 2기압의 수소 하에서 파르(Parr) 수소발생기 상에서 3시간 동안 교반했다. 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 농축하고, 실리카겔 크로마토그래피 (헥산 중 80% 에틸 아세테이트)로 정제하여 1-토실-1H-피라졸-4-아민 (1.9 g, 71%)를 분홍색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 2.40(s, 3H), 3.01(bs, 2H), 7.29(d, 2H, J=8Hz), 7.41(d, 1H, J=1.2Hz), 7.53(d, 1H, J=1.2Hz), 7.81(d, 2H, J=8 Hz).
실시예 9-1c: 4-니트로-1-토실-1H- 피라졸 .
Figure 112010017594708-pct00191
4-니트로-1H-피라졸 (500 mg, 4.4 mmol), 4-메틸벤젠-1-설포닐 클로라이드 (840 mg, 4.4 mmol), 및 트리에틸아민 (510 mg, 5 mmol)을 DMF (25 mL)에서 80 ℃ 에서 1시간 동안 교반했다. 반응물을 냉각하고, 물 (200 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트 (3x, 100 mL)로 추출했다. 유기 상을 수성 1N HCl (200 mL) 및 물 (200 mL)로 세정하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 로토바프 상에서 농축했다. 고형물을 헥산으로 분쇄하여 4-니트로-1-토실-1H-피라졸 (600 mg, 50%)를 회색이 도는 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 2.40(s, 3H), 7.52(d, 2H, J=8.4Hz), 7.98(d, 2H, J=8.8Hz), 8.57(s, 1H), 9.58(s, 1H).
실시예 9-2: 2-((1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4- 일아미노 ) 메틸 ) 벤조니트릴
Figure 112010017594708-pct00192
DMF (3 mL) 중 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민-하이드로클로라이드 (100 mg, 0.44 mmol), 2-(브로모메틸)벤조니트릴 (115 mg, 0.6 mmol), 및 트리에틸아민 (0.5 mL, 3.5 mmmol)을 마이크로웨이브 반응기에서 80 ℃ 에서 10분 동안 가열하고, 교반했다. 반응물을 냉각하고, 물 (50 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출했다(3x, 30 mL). 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 로토바프 상에서 농축했다. 잔류물을 에탄올 (70 mL), 물 (3 mL) 및 아세트산 (1 mL)에 용해시키고, 혼합물을 2시간 동안 환류했다. 용액을 로토바프 상에서 농축하고, 메탄올 (3 mL)에서 취하고, 3-1 mL 분취액 중 역상 HPLC (물 중 5 내지 95% 아세토니트릴: 16분 구배)로 정제했다. 순수 분획을 배합하고, 로토바프 상에서 농축했다. 잔류물을 에틸 아세테이트/헥산 (1/9)로 분쇄하여 2-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이소인돌린-1-온 (85 mg, 61%)를 순수 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 2.18(s, 3H), 2.43(s, 3H), 4.97(s, 2H), 5.18(s, 2H), 7.58-7.68(m, 3H), 7.77(s, 1H), 8.10(d, J=8Hz, 1H), 8.27(s, 1H), 9.19(bs, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 30 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 9-3: 2-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 이소인돌린 -1-온
Figure 112010017594708-pct00193
2-((1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일아미노)메틸)벤조니트릴 (실시예 9-2) (30 mg, 0.14 mmol)을 MeOH/ 2N 수성 NaOH (5 mL)의 혼합물에서 100 ℃ 에서 30분 동안 마이크로웨이브 반응기에서 교반했다. 반응물을 1N 수성 HCl (100 mL)로 산성화하고, 에틸 아세테이트로 추출했다(3x, 70 mL). 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축했다. 잔류물을 MeOH (3 mL)에 용해시키고, 2-1.5 mL 분취액 중 역상 HPLC (물 중 5 내지 95% 아세토니트릴: 16분 구배)로 정제했다. 순수 분획을 배합하고, 농축하여 2-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이소인돌린-1-온 (21 mg, 50%)를 순수 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 2.15(s, 3H), 2.41(s, 3H), 4.81(s, 2H), 5.17(s, 2H), 7.48-7.50(m, 1H), 7.51-7.52(m, 2H), 7.72(d, J=7.2Hz, 1H), 7.75(s, 1H), 8.20(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 11 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 9-4: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 퀴나졸린 -2,4(1H,3H)- 디온
Figure 112010017594708-pct00194
아세토니트릴 (3 mL) 중 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (75 mg, 0.33 mmol), 메틸 2-이소시아나토벤조에이트, 및 트리에틸아민 (200 mg, 2 mmol)을 마이크로웨이브 반응기에서 100 ℃ 에서 30분 동안 가열했다. 반응물을 냉각하고, 물 (75 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출했다(3x, 50 mL). 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 로토바프 상에서 농축했다. 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (헥산 중 75% 에틸 아세테이트)로 정제하여 3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)퀴나졸린-2,4(1H,3H)-디온 (20 mg, 18%)를 옅은 분홍색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 2.16(s, 3H), 2.40(s, 3H), 5.17(s, 2H), 7.17-7.22(m, 2H), 7.50(s, 1H), 7.66(dt, J=8, 1.2Hz, 1H), 7.92(d, J=6.8Hz, 1H), 7.95(s, 1H), 11.52(bs, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 1.5 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 9-5: 1-벤질-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일) 테트라하이드로피리미딘 -2(1 H )-온
Figure 112010017594708-pct00195
DMF (3 mL) 중 1-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)테트라하이드로피리미딘-2(1H)-온 (실시예 9-5a) (50 mg, 0.18 mmol) 및 60% 나트륨 하이드라이드 (8 mg, 0.20 mmol)을 실온에서 15분 동안 교반한 다음, 0 ℃ 로 냉각했다. 벤질 브로마이드 (31 mg, 0.18 mmol)을 혼합물에 첨가하고, 실온에서 가온한 다음, 2시간 동안 교반했다. 반응물을 메탄올로 급랭시키고, 농축했다. 반응물을 염수 (50 mL)로 희석하고, 디클로로메탄으로 추출했다(2x, 50 mL). 배합된 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 로토바프 상에서 농축했다. 잔류물을 디클로로메탄 (5 mL)에서 취하고, 실리카 칼럼 크로마토그래피 (메탄올 중 100% 내지 90% 디클로로메탄: 30분 구배)로 정제하여 1-벤질-3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)테트라하이드로피리미딘-2(1H)-온 (20 mg, 30%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ 1.85-1.91(m, 2H), 2.10(s, 3H), 2.37(s, 3H), 3.12(m, 2H), 3.55(t, J=5.8Hz, 2H), 4.48(s, 2H), 5.05(s, 2H), 7.22-7.31(m, 5H), 7.49(s, 1H), 7.84(s, 1H). LC/MS; C20H23N5O2 에 대해 계산된 [M+H]; 예상치 366.19; 실측치 366.15. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 1.65 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 9-5a: 1-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일) 테트라하이드로피리미딘 -2(1 H )-온
Figure 112010017594708-pct00196
DMF (2 mL) 중 1-(3-클로로프로필)-3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)1H-피라졸-4-일)우레아 (실시예 9-5b) (200 mg, 0.64 mmol) 및 60% 나트륨 하이드라이드 (28 mg, 0.71 mmol)을 0℃ 에서 15분 동안 교반한 다음, 실온까지 가온하고, 2시간 동안 교반했다. 반응물을 메탄올로 급랭시키고, 농축했다. 반응물을 염수 (50 mL)로 희석하고, 디클로로메탄으로 추출했다(2x, 50 mL). 배합된 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축했다. 잔류물을 디클로로메탄 (5 mL)에서 취하고, 실리카 칼럼 크로마토그래피 (메탄올 중 100% 내지 90% 디클로로메탄: 30분 구배)로 정제하여 1-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)테트라하이드로피리미딘-2(1H)-온 (84 mg, 48%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ 1.85-1.91(m, 2H), 2.10(s, 3H), 2.37(s, 3H), 3.12(m, 2H), 3.48(t, J=6.0Hz, 2H), 5.05(s, 2H), 6.57(s, 1H), 7.46(s, 1H), 7.80(s, 1H). LC/MS; C13H17N5O2 에 대해 계산된 [M+H] 예상치 276.14; 실측치 276.10.
실시예 9-5b: 1-(3- 클로로프로필 )-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일) 우레아
Figure 112010017594708-pct00197
아세토니트릴 (5 mL) 중 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 (342 mg, 1.78 mmol) 및 2-클로로프로필 이소시아네이트 (213 mg, 1.78 mmol)을 65℃에서 16시간 동안 가열했다. 반응물을 실온으로 냉각하고, 농축하고, 잔류물을 디클로로메탄 (5 mL)에 용해시키고, 실리카 칼럼 크로마토그래피 (메탄올 중 100% 내지 90% 디클로로메탄: 30분 구배)로 정제했다. 순수 분획을 배합하고, 농축한 다음, 에틸 아세테이트/헥산 (1/9)로 분쇄하여 (1-(3-클로로프로필)-3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)1H-피라졸-4-일)우레아 (218 mg, 39%)를 백색 고형물로서 얻었다. LC/MS; C12H16ClN5O2 에 대해 계산된 [M+H]; 예상치 298.10; 실측치 298.10.
실시예 9-6: 1-벤질-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일)-1,3,5- 트리아지난 -2-온
Figure 112010017594708-pct00198
디클로로메탄 (1 mL) 중 1-벤질-5-(2,4-디메톡시벤질)-3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1,3,5-트리아지난-2-온(실시예 9-6a) (44 mg, 0.09 mmol), 아니솔 (9 mg, 0.09 mmol), 및 50% 트리플루오로아세트산/디클로로메탄 용액(1 mL)을 실온에서 2시간 동안 교반했다. 반응물을 농축하고, 포화 중탄산나트륨 (50 mL)으로 급랭시키고, 에틸 아세테이트로 추출하고(2x, 50 mL), 염수 (50 mL)로 세정했다. 배합된 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축했다. 실리카 칼럼 크로마토그래피 (메탄올 중 100% 내지 90% 디클로로메탄: 30분 구배)로 정제하여 1-벤질-3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1,3,5-트리아지난-2-온 (19 mg, 62%)를 백색 고형물로서 얻었다. LC/MS; C19H22N6O2 에 대해 계산된 [M+H]; 예상치 367.18; 실측치 367.20. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 5.84 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 9-6a: 1-벤질-5-(2,4- 디메톡시벤질 )-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H-피라졸-4-일)-1,3,5- 트리아지난 -2-온
Figure 112010017594708-pct00199
1-벤질-3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)우레아 (실시예 9-6b) (50 mg, 0.15 mmol), 2,4-메톡시 벤질 아민 (26 mg, 0.15 mmol), 및 포름알데히드 (물 중 37 중량%) (25 mg, 0.31 mmol)을 100℃에서 16시간 동안 가열했다. 반응물을 실온으로 냉각하고, 염수 (50 mL)로 희석하고, 디클로로메탄으로 추출했다(2x, 50 mL). 배합된 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축했다. 잔류물을 실리카 칼럼 크로마토그래피 (메탄올 중 100% 내지 90% 디클로로메탄: 30분 구배)로 정제하여 1-벤질-5-(2,4-디메톡시벤질)-3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1,3,5-트리아지난-2-온 (44 mg, 56%)를 오일로서 얻었다. LC/MS; C28H32N6O4 에 대해 계산된 [M+H]; 예상치 517.25; 실측치 517.20.
실시예 9-6b: 1-벤질-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 우레아
Figure 112010017594708-pct00200
아세토니트릴 (5 mL) 중 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 (287 mg, 1.49 mmol) 및 벤질 이소시아네이트 (199 mg, 1.49 mmol)을 65℃에서 16시간 동안 가열했다. 반응물을 실온으로 냉각하고, 농축했다. 잔류물을 실리카 칼럼 크로마토그래피 (메탄올 중 100% 내지 90% 디클로로메탄: 30분 구배) 및 에틸 아세테이트/헥산 (1/9)로 분쇄하여 1-벤질-3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)우레아 (246 mg, 51%)를 백색 고형물로서 얻었다. LC/MS; C17H19N5O2 에 대해 계산된 [M+H]; 예상치 326.15; 실측치 326.10.
실시예 9-7: 5-벤질-1-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일)-3- 펜에틸 -1,3,5-트리아지난-2-온
Figure 112010017594708-pct00201
1-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-3-펜에틸우레아 (실시예 9-7a), 포름알데히드, 및 벤질 아민으로부터 실시예 9-6a 와 같이 제조했다. 수율: 15%. 1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ 2.11(s, 3H), 2.37(s, 3H), 2.69(t, J=7.6Hz, 2H), 3.39(t, J=7.8Hz, 2H), 3.81(s, 2H), 4.16(s, 2H), 4.42(s, 2H), 5.05(s, 2H), 7.17-7.32(m, 10H), 7.42(s, 1H), 7.78(s, 1H). LC/MS; C27H30N6O2 에 대해 계산된 [M+H]; 예상치 471.24; 실측치 471.15. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 2.64 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 9-7a: 1-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-3- 펜에틸우레아
Figure 112010017594708-pct00202
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 및 펜에틸 이소시아네이트로부터 실시예 9-6b 와 같이 제조했다. 수율: 29%. 1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ 2.10(s, 3H), 2.36(s, 3H), 2.69(t, J=7.2Hz, 2H), 3.25(q, J=7.4Hz, 2H), 5.02(s, 2H), 6.00(t, J=5.8Hz, 1H), 7.16-7.30(m, 6H), 7.68(s, 1H), 8.13(s, 1H). LC/MS; C18H21N5O2 에 대해 계산된 [M+H]; 예상치 340.17; 실측치 340.20.
실시예 9-8: 1-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일)-3- 펜에틸 -1,3,5- 트리아지난 -2,4,6-트리온
Figure 112010017594708-pct00203
THF (2 mL) 중 1-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-3-펜에틸우레아 (실시예 9-7a) (100 mg, 0.29 mmol)을 0℃ 로 냉각하고, n-클로로카보닐 이소시아네이트 (93 mg, 0.88 mmol)을 서서히 첨가했다. 첨가 후, 반응물을 실온으로 가온하고, 1시간 동안 교반했다. 반응물을 농축하고, 잔류물을 실리카 칼럼 크로마토그래피 (메탄올 중 100% 내지 90% 디클로로메탄: 30분 구배)로 정제하여 (1-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-3-펜에틸-1,3,5-트리아지난-2,4,6-트리온 (100 mg, 83%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ 2.13(s, 3H), 2.39(s, 3H), 2.82(t, J=5.8Hz, 2H), 3.88(t, J=8.0Hz, 2H), 5.17(s, 2H), 7.19-7.31(m, 5H), 7.44(s, 1H), 7.89(s, 1H), 11.84(s, 1H). LC/MS; C20H20N6O4 에 대해 계산된 [M+H]; 예상치 409.15; 실측치 409.20. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 3.03 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 9-9: 1-벤질-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일)-1,3,5- 트리아지난 -2,4,6-트리온
Figure 112010017594708-pct00204
THF (2 mL) 중 1-벤질-3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)우레아 (실시예 95b) (100 mg, 0.31 mmol)을 0℃ 로 냉각하고, n-클로로카보닐 이소시아네이트 (97 mg, 0.92 mmol)을 서서히 첨가했다. 첨가 후, 반응물을 실온까지 가온하고, 1시간 동안 교반했다. 반응물을 농축하고, 잔류물을 실리카 칼럼 크로마토그래피 (메탄올 중 100% 내지 90% 디클로로메탄: 30분 구배)로 정제하여 1-벤질-3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1,3,5-트리아지난-2,4,6-트리온 (112 mg, 93%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ 2.12(s, 3H), 2.38(s, 3H), 4.87(s, 2H), 5.16(s, 2H), 7.23-7.34(m, 5H), 7.45(s, 1H), 7.90(s, 1H), 11.93(s, 1H). LC/MS; C19H18N6O4 에 대해 계산된 [M+H]; 예상치 395.14; 실측치 395.15. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 1.14 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10. hT2R8 길항물질: 본 발명의 화합물의 제조
실시예 10-1: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00205
톨루엔 (100 mL) 중 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-카보닐 아지드 (실시예 10-1a) (6 g, 25.5 mmol)을 1시간 동안 환류하고, 실온으로 질소 대기 하에서 냉각했다. 글라이신 메틸 에스테르-하이드로클로라이드 (3.1 g, 26 mmol) 및 트리에틸아민 (3.2 g, 32 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 16시간 동안 환류했다. 반응물을 냉각하고, 용매를 로토바프 상에서 제거했다. 고형물을 에틸 아세테이트 (100 mL)에서 재용해시키고, 유기 상을 1N HCl 용액으로 세정했다(2x, 150 mL). 수성 상을 에틸 아세테이트로 역추출했다(2x, 75 mL) 및 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축했다. 수득한 고형물을 에틸 아세테이트/헥산 (1/9)로 분쇄하고, 고진공 하에서 건조시켜 3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (5.2 g, 74%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 2.19(s, 3H), 2.42(s, 3H), 4.09(s, 2H), 5.06(s, 2H), 5.68(bs, 1H), 7.90(s, 1H), 8.05(1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 1.7 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-1a: 1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4- 카보닐 아지드
Figure 112010017594708-pct00206
아질산나트륨 (450 mg, 6.5 mmol, 물 중) (10 mL)을 10% 수성 아세트산 (50 mL) 중 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-카보히드라지드 (실시예 10-1b) (1g, 4.3 mmol)의 현탁액에 10분에 걸쳐 적가하고, 빙수조를 통해 0 ℃ 로 냉각했다. 반응물을 추가 15분 교반한 다음, 에틸 아세테이트로 추출했다(3x, 75 mL). 배합된 유기 추출물을 수성 포화 나트륨 카보네이트 (100 mL), 그 다음, 물 (100 mL)로 세정했다. 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축했다. 고형 생성물을 에틸 아세테이트/헥산 (1/9)로 분쇄하고, 진공에서 건조시켜 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-카보닐 아지드 (1g, 93%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.20(s, 3H), 2.44(s, 3H), 5.07(s, 2H), 7.81(s, 1H), 7.93(s, 1H).
실시예 10-1b: 1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-카보 히드라지드
Figure 112010017594708-pct00207
에틸 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-카르복실레이트 (실시예 10-1c) (6 g, 24 mmol) 및 히드라진 (7.5g, 240 mmol)을 12시간 동안 환류 하에서 EtOH (100 mL)에서 교반했다. 용액을 로토바프 상에서 농축하고, 고형 생성물을 에틸 아세테이트/헥산 (1/9)로 분쇄하고, 고진공 하에서 건조시켜 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-카보히드라지드 (5.5 g, 97%)를 순수 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 2.11(s, 3H), 2.39(s, 3H), 5.15(s, 2H), 7.81(s, 1H), 8.17(s, 1H), 9.31(bs, 1H).
실시예 10-1c: 1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4- 카르복실레이트
Figure 112010017594708-pct00208
DMF (50 mL) 중 에틸 1H-피라졸-4-카르복실레이트 (4.2g, 30 mmol), 4-(클로로메틸)-3,5-디메틸이속사졸 (5.1 g, 35 mmol), 및 세슘 카보네이트 (9.8 g, 30 mmol)을 80 ℃ 에서 12시간 동안 교반했다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, 0.1 N HCl (150 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출했다(3x, 75 mL). 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 로토바프 상에서 농축했다. 고형 생성물을 에틸 아세테이트/헥산(1/9)로 분쇄하고, 여과로 수집하여 에틸 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-카르복실레이트 (6g, 80%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.34(t, J=7.2Hz, 3H), 2.19(s, 3H), 2.43(s, 3H), 4.29(q, J=7.2Hz, 2H), 5.06(s, 2H), 7.77(s, 1H), 7.91(s, 1H).
실시예 10-2: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00209
(+/-)-페닐알라닌 메틸 에스테르 하이드로클로라이드 및 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-카보닐 아지드로부터 실시예 10-1 과 같이 제조했다. 수율: 58%. 1H NMR (아세톤-d6, 400 MHz): δ 2.17(s, 3H), 2.43(s, 3H), 3.07(dd, J=14.4, 6.4Hz, 1H), 3.20(dd, J=14, 4.4Hz, 1H), 4.53(t, J=4.8Hz, 1H), 5.18(s, 2H), 7.27-7.19(m, 5H), 7.46(bs, 1H), 7.79(s, 1H), 7.99(s, 1H). MS M+H 계산치 366.15; 실측치 366.1. 융점: 169-171 ℃. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.18 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-3: (S)-5-벤질-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00210
(S)-페닐알라닌 메틸 에스테르 하이드로클로라이드 및 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-카보닐 아지드 (실시예 6a)로부터 실시예 10-1 과 같이 제조했다. 수율: 13% (키랄 크로마토그래피로부터 분리됨) 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.19(s, 3H), 2.42(s, 3H), 2.88(dd, J=13.6, 9.2Hz, 1H), 3.35(dd, J=13.6, 3.6Hz, 1H), 4.31-4.35(m, 1H), 5.06(s, 2H), 5.53(bs, 1H), 7.21-7.36(m, 5H), 7.85(s, 1H), 8.01(s, 1H). LC/MS; C19H19N5O3 에 대해 계산된 [M+H]; 예상치 366.15; 실측치 366.1. [α]D= (-)-136, c=0.1, 에탄올. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.12 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-4: (R)-5-벤질-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00211
(R)-페닐알라닌 메틸 에스테르 하이드로클로라이드 및 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-카보닐 아지드로부터 실시예 10-1 과 같이 제조했다. 수율: 9% (키랄 크로마토그래피로부터 분리됨) 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.19(s, 3H), 2.42(s, 3H), 2.88(dd, J=13.6, 9.2Hz, 1H), 3.35(dd, J=13.6, 3.6Hz, 1H), 4.31-4.35(m, 1H), 5.06(s, 2H), 5.53(bs, 1H), 7.21-7.36(m, 5H), 7.85(s, 1H), 8.01(s, 1H). MS M+H 계산치 366.15; 실측치 366.1. [α]D= (+)-124, c=0.2, 에탄올. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.11 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-5: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(2- 펜옥시에틸 ) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00212
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) (200 mg, 0.7 mmol), (2-브로모에톡시)벤젠 (200 mg, 1 mmol), 및 세슘 카보네이트 (325 mg, 1 mmol)을 마이크로웨이브 반응기에서 85 ℃ 에서 20분 동안 가열했다. 반응물을 실온으로 냉각하고, 수성 1N HCl (100 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출했다(3x, 75 mL). 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축했다. 잔류물을 메탄올 (10 mL)에서 취하고, 역상 HPLC (물 중 5 내지 95% 아세토니트릴: 25분 구배)로 정제했다. 순수 분획을 풀링하고, 농축한 다음, 무수 에탄올에서 재용해시키고, 로토바프 상에서 농축하여(4x), 3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1-(2-펜옥시에틸)이미다졸리딘-2,4-디온(150 mg, 54%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (CDCl3 2.18, 400 MHz): δ(s, 3H), 2.41(s, 3H), 3.86(t, J=5.2Hz, 2H), 4.19(t, J=4.4Hz, 2H), 4.25(s, 2H), 5.05(s, 2H), 6.88(dd, J=9.2, 1.2Hz, 2H), 7.00(dt, J=7.6, 1.2Hz, 1H), 7.27-7.32(m, 2H), 7.89(s, 1H), 8.05(s, 1H). MS M+H 계산치 396.17; 실측치 396.1. 융점: 117-118 ℃. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.06 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-6: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(3-메톡시벤질) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00213
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 6) 및 3-메톡시-벤질 브로마이드로부터 실시예 10-5 와 같이 제조했다. 수율: 55%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.19(s, 3H), 2.42(s, 3H), 3.81(s, 3H), 3.85(s, 2H), 4.58(s, 2H), 5.06(s, 2H), 6.81-6.88(m, 3H), 7.26-7.31(m, 1H), 7.92(s, 1H), 8.08(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.07 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-7: 메틸 3-((3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-2,4- 디옥소이미다졸리딘 -1-일) 메틸 ) 벤조에이트
Figure 112010017594708-pct00214
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 및 3-메톡시-벤질 브로마이드로부터 실시예 10-5 와 같이 제조했다. 수율: 83%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.20(s, 3H), 2.43(s, 3H), 3.86(s, 2H), 3.93(s, 3H), 4.67(s, 2H), 5.07(s, 2H), 7.45-7.52(m, 2H), 7.93(s, 1H), 7.95(s, 1H), 8.03(dd, J=7.2, 1.6Hz, 1H), 8.08(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.09 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-8: 3-((3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-2,4- 디옥소이미다졸리딘 -1-일) 메틸 )벤조산
Figure 112010017594708-pct00215
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (500 mg, 1.8 mmol) (실시예 10-5), 메틸 3-(브로모메틸)벤조에이트 (456 mg, 2 mmol), 및 세슘 카보네이트 (650 mg, 2 mmol)을 DMF (4 mL) 마이크로웨이브 반응기에서 85 ℃ 에서 20분 동안 교반했다. 반응물을 냉각하고, 1N 수성 HCl (100 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출했다(3x, 75 mL). 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축했다. 조 에스테르를 메탄올 (5 mL)에서 용해시키고, 수성 NaOH (50 mL, 10 중량%)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반했다. 반응물을 1N HCl (150 mL)로 산성화하고, 에틸 아세테이트로 추출했다(3x, 75 mL). 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 로토바프 상에서 농축했다. 유리 산을 에틸 아세테이트/헥산 (1/9)로 분쇄하고, 진공 하에서 건조시켜 3-((3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-2,4-디옥소이미다졸리딘-1-일)메틸)벤조산(610 mg, 83%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 2.13(s, 3H), 2.29(s, 3H), 4.00(s, 2H), 4.59(s, 2H), 5.18(s, 2H),MHz): δ 7.46-7.59(m, 2H), 7.78(s, 1H), 7.85-7.88(m, 2H), 8.18(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 1.8 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-9: 3-((3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-2,4- 디옥소이미다졸리딘 -1-일) 메틸 )-N- 메틸벤즈아미드
Figure 112010017594708-pct00216
아세토니트릴 (3 mL) 중 3-((3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-2,4-디옥소이미다졸리딘-1-일)메틸)벤조산 (100 mg, 0.24 mmol) (실시예 10-8), 메틸아민 하이드로클로라이드 (67 mg, 1 mmol), 트리에틸아민 (155 mg, 1.5 mmol), 및 EDC (57 mg, 0.3 mmol)을 마이크로웨이브 반응기에서 80 ℃ 에서 10분 동안 가열했다. 반응물을 냉각하고, 수성 1N HCl (100 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출했다(3x, 75 mL). 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축했다. 조 생성물을 MeOH (3 mL)에 용해시키고, 역상 HPLC (물 중 5 내지 95% 아세토니트릴: 25분 구배)로 정제하여 3-((3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-2,4-디옥소이미다졸리딘-1-일)메틸)-N-메틸벤즈아미드 (25 mg, 25%)를 백색 고형물로서 얻었다. MS M+H 계산치 423.17; 실측치 423.2. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.14 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-10: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(3-하이드록 시벤질 ) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00217
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-카보닐 아지드 (실시예 10-1a) 및 메틸 2-(3-하이드록시벤질아미노)아세테이트 (실시예 10-10a)로부터 실시예 10-1 과 같이 제조했다. 수율: 24%. 1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 2.15(s, 3H), 2.41(s, 3H), 3.99(s, 2H), 4.45(s, 2H), 5.21(s, 2H), 6.70(m, 3H), 7.15 (m,H), 7.80(s, 1H), 8.19(s, H), 9.44(s, H). LC/MS; [M+H] 예상치 382.1; 실측치 382.1. 융점: 35-136 ℃. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.035 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-10a: 메틸 2-(3-하이드록 시벤질아미노 )아세테이트:
Figure 112010017594708-pct00218
글라이신 메틸 에스테르 (500 mg, 4 mmol) 및 3-하이드록시벤즈알데히드 (480 mg, 4 mmol)을 5 mL THF/메탄올 (1:1)에 용해시켰다. THF (4.8mL, 4.8 mmol) 중 아세트산(240 mg, 4 mmol), 및 1M 나트륨 시아노보로하이드라이드를 반응물에 서서히 첨가했다. 반응물을 마이크로웨이브 반응기에서 85 ℃ 에서 15분 동안 가열하고, 실온으로 냉각하고, 염을 여과로 제거했다. 맑은 용액을 농축하고, 잔류물을 역상 HPLC (물 중 10 내지 95% 아세토니트릴 : 25분 구배)로 정제하여 표제 화합물을 맑은 겔로서 얻었다. 수율 45%. MS M+H 계산치 196.1; 실측치 196.1.
실시예 10-11 : 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(2-하이드록 시벤질 ) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00219
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-카보닐 아지드 (실시예 10-1a) 및 메틸 2-(2-하이드록시벤질아미노)아세테이트 (실시예 10-11a)로부터 실시예 10-1 과 같이 제조했다. 수율: 28%. 1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 2.12(s, 3H), 2.38(s, 3H), 4.00(s, 2H), 4.45(s, 2H), 5.17(s, 2H), 6.83(m, 2H), 7.10(m, 2H), 7.78(s, 1H), 8.16(s, H), 9.66(s, H). LC/MS; [M+H] 예상치 382.1; 실측치 382.2. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.07 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-11a: 메틸 2-(2-하이드록 시벤질아미노 )아세테이트:
Figure 112010017594708-pct00220
글라이신 메틸 에스테르 및 2-하이드록시벤즈알데하이드로부터 실시예 10-10a 와 같이 제조했다. 수율 40%. MS M+H 계산치 196.1; 실측치 196.1
실시예 10-12: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(4-하이드록 시벤질 ) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00221
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-카보닐 아지드 및 메틸 2-(4-하이드록시벤질아미노)아세테이트 (실시예 10-12a)로부터 실시예 10-1 과 같이 제조했다. 수율 9%. 1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 2.117(s, 3H), 2.383(s, 3H), 3.918(s, 2H), 4.387(s, 2H), 5.174(s, 2H), 6.719(J=8.8, d, 2H), 7.108(J=8.8, m, 2H), 7.761(s, 1H), 8.154(s, H), 9.399(s, H). LC/MS; [M+H] 예상치 382.1; 실측치 382.2. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.06 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-12a: 메틸 2-(4-하이드록 시벤질아미노 )아세테이트:
Figure 112010017594708-pct00222
글라이신 메틸 에스테르 및 4-하이드록시벤즈알데하이드로부터 실시예 10-10a 과 같이 제조했다. 수율 40%. MS M+H 계산치 196.1; 실측치 196.1
실시예 10-13: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(3-하이드록시-4-메톡시벤질) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00223
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-카보닐 아지드 (실시예 10-1a) 및 메틸 2-(3-하이드록시-4-메톡시벤질아미노)아세테이트 (실시예 10-13a)로부터 실시예 10-1 과 같이 제조했다. 수율 22%. 1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 2.119(s, 3H), 2.383(s, 3H), 3.716(s, 3H), 3.923(s, 2H), 4.361(s, 2H), 5.117(s, 2H), 6.667(m, 2H), 6.863(J=8.4, d, 1H), 7.766(s, H), 8.159(s, H). MS M+H 계산치 412.1; 실측치 412.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.1 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-13a: 메틸 2-(3-하이드록시-4- 메톡시벤질아미노 )아세테이트:
Figure 112010017594708-pct00224
글라이신 메틸 에스테르 및 3-하이드록시-4-메톡시벤즈알데하이드로부터 실시예 10-10a 과 같이 제조했다. 수율 47%. MS M+H 계산치 226.1; 실측치 226.1
실시예 10-14: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(3-(2-메톡시에톡시)벤질) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00225
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-카보닐 아지드 (실시예 10-1a) 및 메틸 2-(3-(2-메톡시에톡시)벤질아미노)아세테이트 (실시예 10-14a)로부터 실시예 10-1 과 같이 제조했다. 수율 27%. 1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 2.12(s, 3H), 2.38(s, 3H), 3.26(s, 3H), 3.62(t, J=4.4, 2H), 3.98(s, 2H), 4.06(t, J=4.4, 2H), 4.48(s, 2H), 5.18(s, 2H), 6.86(m, 3H), 7.24(t, J=8, 1H), 7.78(s, 1H), 8.17(s, 1H). MS M+H 계산치 440.2; 실측치 440.2. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.07 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-14a: 메틸 2-(3-(2- 메톡시에톡시 ) 벤질아미노 )아세테이트:
Figure 112010017594708-pct00226
글라이신 메틸 에스테르 및 3-(2-메톡시에톡시)벤즈알데하이드로부터 실시예 10-10a 과 같이 제조했다. 수율 55%. MS M+H 계산치 254.1; 실측치 254.1
실시예 10-15: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(2-( 메틸티오 )벤질)이미다졸리딘-2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00227
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-카보닐 아지드 (실시예 10-1a) 및 메틸 2-(2-(메틸티오)벤질아미노)아세테이트(실시예 10-15a)로부터 실시예 10-1 과 같이 제조했다. 수율 67%. 1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 2.12(s, 3H), 2.39(s, 3H), 2.48(s, 3H), 3.98(s, 2H), 4.54(s, 2H), 5.19(s, 2H), 7.18(m, 1H), 7.30(m, 3H), 7.79(s, 1H), 8.18(s, 1H). LC/MS; [M+H] 예상치 412.1; 실측치 412.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.03 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-15a: 메틸 2-(2-( 메틸티오 ) 벤질아미노 )아세테이트:
Figure 112010017594708-pct00228
글라이신 메틸 에스테르 및 2-(메틸티오)벤즈알데하이드로부터 실시예 10-10a 과 같이 제조했다. 수율 50%. MS M+H 계산치 226.1; 실측치 226.1
실시예 10-16: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(2-(2-메톡시에톡시)벤질) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00229
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1-(2-하이드록시벤질)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-11) 및 2-브로모에틸 메틸 에테르로부터 실시예 10-5 과 같이 제조했다. 수율 19%. 1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 2.11(s, 3H), 2.08(s, 3H), 3.25(s, 3H), 3.64(t, J=3.6, 2H), 4.00(s, 2H), 4.11(t, J=3.2, 2H), 4.27(s, 2H), 5.17(s, 2H), 6.90(m, 1H), 7.00(m, 1H), 7.26(m, 2H), 7.76(s, 1H), 8.15(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.1 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-17: 33-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(2-( 메틸설피닐 )벤질) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00230
20mL 마이크로웨이브 바이알에서, 3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1-(2-(메틸티오)벤질)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-15) (70 mg, 0.17 mmol) 및 m-CPBA (58 mg, 0.34 mmol)을 디클로로메탄에 0 ℃ 에서 용해시켰다. 반응물을 0℃ 에서 교반하고, 4시간 동안 실온까지 가온했다. 반응물의 용매를 진공하에서 제거하고, 조 생성물을 1mL 에탄올에 용해시키고,바리안(Varian) HPLC (10 내지 95% 아세토니트릴/물; 25분)로 정제했다. 정제된 분획을 진공 하에서 증발하여 표제 화합물을 얻었다. MS M+H 계산치 428.1; 실측치 428.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.4 μM 의 IC50 을 가졌다. 수율: 12 mg, 17%.
실시예 10-18: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(2-메톡시벤질) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00231
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 1-(브로모메틸)-2-메톡시벤젠 (199 mg, 1 mmol)로부터 실시예 10-5 과 같이 제조했다. 수율: 33%. MS M+H 계산치 396.1; 실측치 396.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.06 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-19: 2-((3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-2,4- 디옥소이미다졸리딘 -1-일) 메틸 ) 벤조니트릴 :
Figure 112010017594708-pct00232
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 2-(브로모메틸)벤조니트릴로부터 실시예 10-5 과 같이 제조했다. 수율: 27%. MS M+H 계산치 391.1; 실측치 391.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.5 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-20: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(2- 메틸벤질 ) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00233
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 1-(브로모메틸)-2-메틸벤젠으로부터 실시예 10-5 과 같이 제조했다. 수율: 21%. MS M+H 계산치 380.1; 실측치 380.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.1 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-21: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(2- 플루오로벤질 ) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00234
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 1-(브로모메틸)-2-플루오로벤젠으로부터 실시예 10-5 과 같이 제조했다. 수율 42%. MS M+H 계산치 384.1; 실측치 384.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.08 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-22: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(2-( 트리플루오로메틸 )벤질) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00235
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 1-(브로모메틸)-2-(트리플루오로메틸)벤젠으로부터 실시예 10-5 과 같이 제조했다. 수율: 37%. MS M+H 계산치 434.1; 실측치 434.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.2 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-23 : 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(2- 니트로벤질 ) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00236
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 1-(브로모메틸)-2-니트로벤젠으로부터 실시예 10-5 과 같이 제조했다. 수율 22%. MS M+H 계산치 411.1; 실측치 411.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.07 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-24: 3-((3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-2,4- 디옥소이미다졸리딘 -1-일) 메틸 ) 벤즈알데히드 :
Figure 112010017594708-pct00237
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 3-(브로모메틸)벤즈알데하이드로부터 실시예 10-5 과 같이 제조했다. 수율: 35%. 1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 2.123(s, 3H), 2.388(s, 3H), 4.035(s, 2H), 4.631(s, 2H), 5.186(s, 2H), 7.581(m, 1H), 7.643(m, 1H), 7.787(m, 3H), 8.178(s, H), 9.997(s, H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.2 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-25: 3-((3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-2,4- 디옥소이미다졸리딘 -1-일) 메틸 ) 벤조니트릴 :
Figure 112010017594708-pct00238
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 3-(브로모메틸)벤조니트릴로부터 실시예 10-5 과 같이 제조했다. 수율 21%. MS M+H 계산치 411.1; 실측치 411.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 1 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-26: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(3- 메틸벤질 ) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00239
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 1-(브로모메틸)-3-메틸벤젠으로부터 실시예 10-5 과 같이 제조했다. 수율 25%. MS M+H 계산치 380.1; 실측치 380.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.02 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-27: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(3- 플루오로벤질 ) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00240
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 1-(브로모메틸)-3-플루오로벤젠으로부터 실시예 10-5 과 같이 제조했다. 수율 27%. MS M+H 계산치 384.1; 실측치 384.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.06 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-28: 1-((1,5-디메틸-1H- 피라졸 -3-일) 메틸 )-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00241
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 3-(브로모메틸)-1,5-디메틸-1H-피라졸로부터 실시예 10-5 과 같이 제조했다. 수율: 22%. MS M+H 계산치 384.1; 실측치 384.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.3 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-29: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(4-메톡시벤질) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00242
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 1-(브로모메틸)-4-메톡시벤젠으로부터 실시예 10-5 과 같이 제조했다. 수율 19%. MS M+H 계산치 396.1; 실측치 396.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.07 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-30: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(4-메 틸벤 질) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00243
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 1-(브로모메틸)-4-메틸벤젠으로부터 실시예 10-5 과 같이 제조했다. 수율 25%. MS M+H 계산치 380.1; 실측치 380.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.06 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-31: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(4- 플루오로벤질 ) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00244
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 1-(브로모메틸)-4-플루오로벤젠으로부터 실시예 10-5 과 같이 제조했다. 수율 33%. MS M+H 계산치 384.1; 실측치 384.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.05 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-32: 4-((3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-2,4- 디옥소이미다졸리딘 -1-일) 메틸 ) 벤조니트릴 :
Figure 112010017594708-pct00245
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 4-(브로모메틸)벤조니트릴로부터 실시예 10-5 과 같이 제조했다. 수율 21%. MS M+H 계산치 391.1; 실측치 391.2. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.05 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-33: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(3-(하이드록 시메틸 )벤질) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00246
3-((3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-2,4-디옥소이미다졸리딘-1-일)메틸)벤즈알데히드 (실시예 10-24) (131 mg, 0.3 mmol)을 2 mL 에탄올에 용해시켰다. 용액을, 유속 1ml/분에서 10% Pd/C 촉매를 사용하여 실온에서 H-큐브(Cube) 기구를 통해 통과시켰다. 수집된 분획을 농축하고, 2 mL 에탄올에 재용해시키고 HPLC (10-95% 아세토니트릴/물, 25분)로 정제했다. 정제된 분획을 배합하고, 농축하여 표제 화합물을 얻었다. 1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 2.123(s, 3H), 2.388(s, 3H), 3.978(s, 2H), 4.516(s, 2H), 5.182(s, 2H), 7.242(m, 4H), 7.779(s, 1H), 8.172(s, 1H), 8.505(s, 1H). MS M+H 계산치 396.1; 실측치 396.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.3 μM 의 IC50 을 가졌다. 수율: 24 mg, 18%.
실시예 10-34: 1-(2- 아미노벤질 )-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00247
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1-(2-니트로벤질)이미다졸리딘-2,4-디온(실시예 10-23) (126 mg, 0.3 mmol)을 2 mL 에탄올에 용해시켰다. 용액을, 유속 1ml/분에서 10% Pd/C 촉매를 사용하여 실온에서 H-큐브(Cube) 기구를 통해 통과시켰다. 수집된 분획을 농축하고, 2mL 에탄올에 재용해시키고, HPLC (10-95% 아세토니트릴/물, 25분)로 정제했다. 정제된 분획을 배합하고, 농축하여 표제 화합물을 얻었다. 수율 26%. MS M+H 계산치 381.1; 실측치 381.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.02 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-35: 1 -(3,4- 디메톡시벤질 )-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)이미다졸리딘-2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00248
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) (275 mg, 1 mmol), (3,4-디메톡시페닐)메탄올 (201 mg, 1.2 mmol), N,N,N,N-테트라메틸아조디카르복사미드 (344 mg, 2 mmol)을 2 mL 무수 THF 에 용해시켰다. 트리부틸포스핀 (404 mg, 2 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 마이크로웨이브 반응기에 90 ℃에서 5분 동안 두었다. 반응물을 여과하고, 농축하고, HPLC (10-95% 아세토니트릴/물, 25분)로 정제하여 표제 화합물을 얻었다. 수율: 25 mg, 6%. 1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 2.119(s, 3H), 2.385(s, 3H), 3.724(J=6.4 d, 6H), 3.946(s, 2H), 4.435(s, 2H), 5.178(s, 2H), 6.885(m, 3H), 7.776(s, 1H), 8.166(s, 1H). MS M+H 계산치 426.1; 실측치 426.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.06 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-36: 1-( 벤조[d][1,3]디옥솔 -5- 일메틸 )-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00249
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 벤조[d][1,3]디옥솔-5-일메탄올로부터 실시예 10-35 와 같이 제조했다. 수율: 19%. 1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 2.143(s, 3H), 2.408(s, 3H), 3.977(s, 2H), 4.440(s, 2H), 5.202(s, 2H), 6.003(s, 2H), 6.897(m, 3H), 7.788(s, 1H), 8.181(s, 1H). MS M+H 계산치 410.1; 실측치 410.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.07 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-37: 1-(3-((디메틸아미노) 메틸 )벤질)-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00250
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) (275 mg, 1 mmol) 1,3-비스(브로모메틸)벤젠(263 mg, 1 mmol), 및 세슘 카보네이트 (325 mg, 1 mmol)을 2 mL DMF 에서 용해시키고, 마이크로웨이브 반응기에서 165 ℃ 에서 5분 동안 가열했다. 반응물을 실온으로 냉각하고, 염 침전물을 여과로 제거했다. 조 생성물 함유 맑은 용액을 농축하고, 에틸 아세테이트에서 재용해시켰다. 유기 용액을 물로 2회 세정하고, 그 다음, 염수로 세정했다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고 증발시켜, 추가 정제 및 특성규명없이 다른 단계에 사용되는 조 생성물을 얻었다. 1-(3-(브로모메틸)벤질)-3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 42a) (152 mg, 0.3 mmol), 디메틸아민 (THF 중 2 M 용액) (1.5 mL, 3 mmol), 및 나트륨 하이드라이드 (9 mg, 0.36 mmol)을 1 mL 무수 THF 에 용해시켰다. 반응물을 마이크로웨이브 반응기에 120 ℃ 에서 5분 동안 두었다. 조 생성물을 2 mL 에탄올에 재용해시키고 HPLC (10-95% 아세토니트릴/물, 25분)로 정제하여 1-(3-((디메틸아미노)메틸)벤질)-3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온(16 mg, 13%). MS M+H 계산치 423.1; 실측치 423.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 1.2 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-38: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-((1- 메틸 -1H-피라졸-3-일) 메틸 ) 이미다졸리딘 -2,4- 디온 :
Figure 112010017594708-pct00251
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 3-(브로모메틸)-1-메틸-1H-피라졸로부터 실시예 10-5 와 같이 제조했다. 수율 19%. MS M+H 계산치 370.1; 실측치 370. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.4 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-39: N-(2-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-2H- 테트라졸 -5-일)-3- 메톡시벤즈아미드
Figure 112010017594708-pct00252
아세토니트릴 (3 mL) 중 2-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-2H-테트라졸-5-아민 (실시예 10-39a) (102 mg, 0.528 mmol), 3-메톡시벤조일 클로라이드 (0.065 mL, 0.528 mmol) 및 피리딘 (0.043 mL, 0.528 mmol)을 100℃에서 1시간 동안 교반했다. 반응물을 디클로로메탄 (30 mL)으로 희석하고, 염수 (30 mL)로 세정했다. 유기물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축하고, 역상 HPLC (용매계: 아세토니트릴/물 10% 내지 100% 구배), 25분 시행)로 정제하여 N-(2-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-2H-테트라졸-5-일)-3-메톡시벤즈아미드를 백색 결정질 고형물 (60 mg, 35 % 수율)로서 얻었다. MS M+H 계산치 329.1, 실측치 329. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 2.02(s, 3H), 2.46(s, 3H), 3.81(s, 3H), 5.78(s, 2H), 7.16(m, 1H), 7.42(t, J=8Hz, 2H), 7.54(m, 1H), 11.3(s, 1H). 화합물은 1.87 μM 의, hT2R8 쓴맛 수용체에 대한 IC50 을 가졌다.
실시예 10-39a:2-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-2H- 테트라졸 -5-아민
Figure 112010017594708-pct00253
DMF (20 mL) 중 2H-테트라졸-5-아민 (1.29 g, 12.5 mmol), 4-(클로로메틸)-3,5-디메틸이속사졸 (1.56 mL, 12.5 mmol) 및 탄산칼륨 (1.73 g, 15.5 mmol)을, 16시간 동안 교반하면서 80℃로 가열했다. 반응물을 실온으로 냉각하고, 디클로로메탄 (100 mL)으로 희석하고, 염수 및 물로 계속해서 세정했다. 유기물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 회전식 증발로 농축했다. 조 생성물을 실리카겔 크로마토그래피 (0-10 % 구배 에틸 아세테이트/디클로로메탄)로 정제하여 2-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-2H-테트라졸-5-아민을 백색 결정질 고형물 (970 mg, 40 % 수율)로서 얻었다. MS M+H 계산치 195.1, 실측치 195.
실시예 10-40: N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 이미다졸 -4-일) 벤조 [d][1,3]디옥솔-5- 카르복사미드
Figure 112010017594708-pct00254
디클로로메탄 중 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-이미다졸-4-아민 (실시예 10-40a) (110 mg, 0.57 mmol), 벤조[d][1,3]디옥솔-5-카보닐 클로라이드 (105 mg, 0.57 mmol), 및 트리에틸아민 (90 ㎕, 0.69 mmol)을 16시간 동안 교반했다. 반응물을 디클로로메탄 (30 mL)으로 희석하고, 염수 및 물로 계속해서 세정했다. 유기물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 회전식 증발로 농축했다. 조 생성물을 역상 HPLC (용매계: 아세토니트릴/물, 10% 내지 100% 구배, 25분 시행)로 정제하여 N-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-이미다졸-4-일)벤조[d][1,3]디옥솔-5-카르복사미드를 백색 결정질 고형물 (32 mg, 15 % 수율)로서 얻었다. MS M+H 계산치 341.3, 실측치 341.3. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 2.08(s, 3H), 2.41(s, 3H), 5.02(s, 2H), 6.07(s, 2H), 6.95(d, J=8.4Hz, 1H), 7.27(d, J=1.6Hz, 1H), 7.54(m, 3H), 10.6(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체에 대한 12.1 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-40a: 1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 이미다졸 -4-아민
메탄올 (40 mL) 중 3,5-디메틸-4-((4-니트로-1H-이미다졸-1-일)메틸)이속사졸 (실시예 10-40b) (1.0 g, 4.5 mmol) 및 10% Pd/C (200 mg)을 2.5 bar 의 압력 하에서 수소 2시간 동안 파르 쉐이커(Parr shaker) 상에서 흔들었다. 셀라이트의 플러그, 그 다음, 회전식 증발을 통해 여과하여 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-이미다졸-4-아민을 황색을 띤 적색 고형물 (800 mg, 93 % 수율)로서 얻었다. MS M+H 계산치 193, 실측치 193.
실시예 10-40b: 3,5-디메틸-4-((4-니트로-1H- 이미다졸 -1-일) 메틸 ) 이속사졸
3,5-디메틸-4-((4-니트로-1H-이미다졸-1-일)메틸)이속사졸을 4-니트로-1H-이미다졸의 알킬화에 의한 실시예 10-41c 와 유사한 방식으로 제조하여 3,5-디메틸-4-((4-니트로-1H-이미다졸-1-일)메틸)이속사졸을 백색 결정질 고형물 (5.0 g, 80% 수율)로서 얻었다. MS M+H 계산치 223, 실측치 223. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ, ppm: 2.09(s, 3H), 2.43(s, 3H), 5.15(s, 2H), 7.90(d, J=1.6Hz, 1H), 8.35(d, J=1.9Hz, 1H).
실시예 10-41: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-5-메틸이미다졸리딘-2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00255
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 10-41a) (1.0 g, 5.20 mmol), 에틸-2-이소시네이트프로피오네이트 (0.745 g, 5.20 mmol) 및 트리에틸아민(1.5 mL, 10.4 mmol)을 EtOH (20 mL)에서 혼합했다. 반응물을 12시간 동안 환류한 다음, 실온으로 냉각했다. 용매를 진공 하에서 제거하고, 정치시 결정을 형성했다. 결정물을 수집하고, 헥산으로 세정하여 3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-5-메틸이미다졸리딘-2,4-디온을 80% 수율의 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 1.53-1.51(d, 3H), 2.19(s, 3H), 2.42(s, 3H), 4.21-4.19(m, 1H), 5.06(s, 2H), 6.00(bs, 1H), 7.90(s, 1H), 8.05(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 1.3 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-41a: 1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-아민 하이드로 클로라이드
Figure 112010017594708-pct00256
3급-부틸 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일카바메이트 (실시예 10-41b) (592 mg, 2 mmol)을 디옥산 (20 mL) 중 4N HCl 의 용액에서 실온에서 2시간 동안 교반했다. 용매를 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트/헥산 (30 mL)의 1/1 혼합물에 용해시키고, 2회 농축했다. 고형물을 헥산으로 분쇄하고, 여과로 수집하여 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드(500 mg, 99%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 2.11(s, 3H), 2.38(s, 3H), 5.16(s, 2H), 7.51(s, 1H), 8.03(s, 1H), 10.27(bs, 3H).
실시예 10-41b: 3급-부틸 1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4- 일카바메이트
Figure 112010017594708-pct00257
3,5-디메틸-4-((4-니트로-1H-피라졸-1-일)메틸)이속사졸(실시예 10-41c) (12 g, 53.8 mmol) 및 BOC 무수물 (12.8 g, 64 mmol)을 파르(Parr) 반응 용기에서 MeOH/EtOH/THF (300 mL)의 3/1/1 혼합물에서 용해시키고, 그 다음, 10% Pd/C (1.5 g)을 첨가했다. 혼합물을 파르(Parr) 수소발생기에서, 2기압의 수소 하에서 3시간 동안 흔들었다. 혼합물을 3인치의 셀라이트 플러그를 통해 여과하고, 로토바프 상에서 농축했다. 분홍색 오일은 실리카겔 크로마토그래피 (헥산 중 25% 에틸 아세테이트)로 정제하여 3급-부틸 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일카바메이트(12.6 g, 80%)을, 정치시 옅은 분홍색 고형물로서 고화된 분홍색/적색 오일로서 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.41(s, 9H), 2.10(s, 3H), 2.32(s, 3H), 4.90(s, 2H), 6.19(bs, 1H), 7.19(s, 1H), 7.50(s, 1H).
실시예 10-41c: 3,5-디메틸-4-((4-니트로-1H- 피라졸 -1-일) 메틸 ) 이속사졸
Figure 112010017594708-pct00258
1H-피라졸 (10 g, 147 mmol)을 조금씩 진한 황산 (100 mL)에 첨가하고, 빙수조를 통해 0 ℃ 로 냉각하고, 내부 반응 온도를 40 ℃ 미만으로 유지했다. 진한 HNO3 (10 mL)을, 내부 반응 온도를 55 ℃ 미만으로 유지한 반응 혼합물에 주의하여 적가했다. 그 다음, 반응물을 55 ℃로 가열하고, 5시간 동안 교반했다. 혼합물을 0 ℃ 로 냉각하고, 백색 침전물이 형성될 때까지 수산화나트륨 수용액(150 mL 물 중 110 g NaOH)으로 염기성(약 pH 8)으로 만들었고, 용액의 내부 온도를 40 ℃ 미만으로 주의하여 유지하도록 했다. 백색 고형물을 여과로 수집하고, 에틸 아세테이트/헥산 (1/3)로 세정한 다음, 진공에서 건조시켜 4-니트로-1H-피라졸 (7g, 42%, 분리된 수율)을 얻었다. 13C NMR (DMSO-d6, 137.0, 126.4. DMF (100 mL) 중 4-니트로-1H-피라졸 (9 g, 80 mmol)에 세슘 카보네이트 (26 g, 80mmol)를 첨가하고, 그 다음, 4-(클로로메틸)-3,5-디메틸이속사졸 (12.3 g, 85 mmol)를 첨가했다. 반응 혼합물을 DMF (100 mL)에서 80 ℃ 에서 30분 동안 교반한 다음, 냉각하고, 물 (150 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출했다(3x, 75 mL). 배합된 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축했다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (200 mL)에서 취하고 물 (2x, 100 mL)로 세정했다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축했다. 고형 생성물을 에틸 아세테이트/헥산(1/9)로 분쇄하고, 여과로 수집했다. 생성물을 고진공 하에서 건조시켜 3,5-디메틸-4-((4-니트로-1H-피라졸-1-일)메틸)이속사졸 (12g, 67%)를 담황색 고형물로서로서 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.23(s, 3H), 2.46(s, 3H), 5.08(s, 2H), 8.02(s, 1H), 8.08(s, 1H).
실시예 10-42: 5-벤질-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1- 메틸이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00259
5-벤질-3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-2) 및 요오도메탄으로부터 실시예 10-5 와 같이 제조했다. 수율: 95%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.04(s, 3H), 2.15(s, 3H), 2.96(s, 3H), 3.24-3.23(m, 2H, J=4.0Hz), 4.23-4.21(m, 1H), 5.00(s, 2H), 7.24-7.23(m, 5H, J=4.0Hz), 7.70(s, 1H), 7.87(s, 1H).
표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.15 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-43: 1-벤질-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-5- 메틸이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00260
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-5-메틸이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-41) 및 벤질 브로마이드로부터 실시예 10-5 와 같이 제조했다. 수율: 50%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.44(s, 3H), 2.19(s, 3H), 3.88(s, 3H), 4.18(d, J=8Hz, 2H), 4.22(t, 1H, J=4 Hz)), 5.06(s, 2H), 7.39-7.29(m, 5H), 7.94(s, 1H), 8.10(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.02 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-44: 2-(1-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-2,5- 디옥소이미다졸리딘 -4-일)아세트산
Figure 112010017594708-pct00261
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-카보닐 아지드 (실시예 10-1a) 및 H-Asp-OMe 로부터 실시예 10-1 와 같이 제조했다. 수율: 85%. MS M+H 계산치 334.1; 실측치 334.1
실시예 10-45: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-5- 펜에틸이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00262
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-카보닐 아지드 (실시예 10-1a) 및 메틸 2-아미노-4-페닐부타노에이트로부터 실시예 10-1 와 같이 제조했다. 수율: 15%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.09-2.02(m, 2H), 2.19(s, 3H), 2.41(s, 3H), 2.83-2.78(m, 2H), 4.13-4.09(t, 1H, J=8Hz), 5.05(s, 2H), 5.95(bs, 1H), 7.30-7.19(m, 5H), 7.95(s, 1H), 8.03(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.22 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-46: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-5-(3- 페닐프로필 ) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00263
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-카보닐 아지드 (실시예 10-1a) 및 메틸 2-아미노-5-페닐펜타노에이트로부터 실시예 10-1 와 같이 제조했다. 수율: 20%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.72-1.68(m, 1H), 1.85-1.78(m, 2H), 1.99-1.91(m, 1H), 2.19(s, 3H), 2.41(s, 3H), 2.69-2.63(t, J=8Hz, 2H), 4.13(bs, 1H), 5.05(s, 2H), 5.95(bs, 1H), 7.30-7.19(m, 5H), 7.95(s, 1H), 8.03(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.17 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-47: 5-( 벤질옥시메틸 )-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00264
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-카보닐 아지드 (실시예 10-1a) 및 메틸 2-아미노-3-(벤질옥시)프로파노에이트로부터 실시예 10-1 와 같이 제조했다. 수율: 32%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.19(s, 3H), 2.43(s, 3H), 3.70-3.67(m, 1H), 3.89-3.86(m, 1H), 4.31-4.30(m, 1H), 4.56-4.32(d, J=1.6Hz, 2H), 5.05(s, 2H), 5.62(bs, 1H), 7.35-7.29(m, 5H), 7.88(s, 1H), 8.04(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.76 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-48: 2-(1-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-2,5- 디옥소이미다졸리딘 -4-일)-N- 페닐아세트아미드
Figure 112010017594708-pct00265
3-(1-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-2,5-디옥소이미다졸리딘-4-일)아세트산 (실시예 10-44) (100 mg, 0.3 mmol), 아닐린 (33 mg, 0.36 mmol), Pybop (187 mg, 0.36 mmol) 및 트리에틸 아민 (0.05 mL, 0.36 mmol)을 DMF (1 mL)에서 혼합했다. 반응물을 65℃에서 4시간 동안 교반했다. 반응물을 실온으로 냉각한 다음, 에틸 아세테이트 (2 mL)로 희석했다. 유기 상을 포화 중탄산나트륨 용액(2x, 2 mL), 그 다음, 포화 염화나트륨 용액(1 ml)으로 세정했다. 유기 상을 추출하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과했다. 조 생성물을 MeOH (1mL)에서 재현탁시키고, 역상 HPLC (물 중 5-95% 아세토니트릴; 16분 구배)로 정제했다. 순수 분획을 배합하고, 용매를 로토바프 상에서 제거하여 2-(1-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-2,5-디옥소이미다졸리딘-4-일)-N-페닐아세트아미드를 백색 고형물 (50%)로서 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.18(s, 3H), 2.40(s, 3H), 2.72(m, 1H), 3.14-3.13(d, 1H, J=4Hz), 4.54-4.51(d, J=8Hz, 1H), 5.04(s, 2H), 6.53(bs, 1H), 7.15-7.13(m, 1H), 7.33-7.22(m, 2H), 7.47-7.45(d, J=8Hz, 2H), 7.78(bs, 1H), 7.09(s, 1H), 8.05(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.75 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-49: N-벤질-2-(1-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-2,5- 디옥소이미다졸리딘 -4-일) 아세트아미드
Figure 112010017594708-pct00266
3-(1-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-2,5-디옥소이미다졸리딘-4-일)아세트산 (실시예 10-44) 및 벤질 아민으로부터 실시예 10-48 과 같이 제조했다. 수율: 30%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.18(s, 3H), 2.41(s, 3H), 2.56-2.52(m, 1H, J=16Hz), 2.56-2.52(m, 1H), 3.00-2.96(m, 1H), 4.45-4.44(d, J=5.6Hz, 2H), 5.04(s, 2H), 5.96(bs, 1H), 6.36(bs, 1H), 7.36-7.25(m, 5H), 7.90(s, 1H, 8.05(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 1.3 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-50: 2-(1-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-2,5- 디옥소이미다졸리딘 -4-일)-N-(3-메톡시벤질) 아세트아미드
Figure 112010017594708-pct00267
3-(1-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-2,5-디옥소이미다졸리딘-4-일)아세트산 (실시예 10-44) 및 (3-메톡시페닐)메탄아민로부터 실시예 10-48 과 같이 제조했다. 수율: 50%. LC/MS; 예상치 453; 실측치 453.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 1.7 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-51: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1- 메틸이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00268
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) (50 mg, 0.182 mmol) 및 세슘 카보네이트 (60 mg, 0.185 mmol)을 DMF (1 mL)에서 15분 동안 질소 대기 하에서 실온에서 혼합했다. 그 다음, 요오도메탄 (14 mg, 0.185 mmol)을 첨가하고, 반응물을 추가 2시간 동안 계속 교반했다. 물 (2 mL)을 첨가하고, 생성물을 에틸 아세테이트로 추출했다(1mL, 2x). 유기 상을 수집하고, 포화 중탄산나트륨 용액(2ml, 2x)으로 세정하고, 건조시키고, 여과했다. 용매를 질소 흐름 하에서 제거한 다음, 고진공 하에서 추가 건조시켜 3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1-메틸이미다졸리딘-2,4-디온을 백색 고형물 (42 mg, 80%)로서 얻었다. 수율: 80%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.18(s, 3H), 2.41(s, 3H), 3.06(s, 3H), 3.95(s, 2H), 5.05(s, 2H), 7.89(s, 1H), 8.05(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.58 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-52: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1,5,5- 트리메틸이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00269
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-5-메틸이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-41) (50 mg, 0.173 mmol) 및 60% NaH (8 mg, 0.190 mmol)을 DMF (1 mL)에서 30분 동안 혼합했다. MeI (0.04mL, 0.190 mmol)을 첨가하고, 반응물을 추가 4시간 교반했다. 반응물을 1N HCl 로 산성화하고, 에틸 아세테이트 (2 mL)로 희석했다. 유기 상을 건조, 여과하고, 용매를 질소 흐름 하에서 제거했다. 조 생성물을 MeOH (1 mL)에서 재현탁시키고, 역상 HPLC (물 중 5 내지 95% 아세토니트릴: 16분 구배)로 정제했다. 순수 분획을 배합하고, 용매를 진공 하에서 제거하여 3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1,5,5-트리메틸이미다졸리딘-2,4-디온을 백색 고형물 (25 mg, 50%)로서 얻었다. 1H NMR (CDCl3, (CDCl3, 400 MHz): δ 1.45(s, 6H), 2.19(s, 3H), 2.42(s, 3H), 2.94(s, 3H), 5.05(s, 2H), 7.92(s, 1H), 8.08(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.80 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-53: 1-벤질-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00270
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 벤질 브로마이드로부터 실시예 10-5 와 같이 제조했다. 수율: 40%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.18(s, 3H), 2.42(s, 3H), 3.84(s, 2H), 4.61(s, 2H), 5.06(s, 2H), 7.40-7.27(m, 5H), 7.92(s, 1H), 8.08(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.09 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-54: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(피리딘-2- 일메틸 )이미다졸리딘-2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00271
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 및 2-(브로모메틸)피리딘으로부터 실시예 10-5 와 같이 제조했다. 수율: 50%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.19(s, 3H), 2.41(s, 3H), 4.12(s, 2H), 4.71(s, 2H), 5.05(s, 2H), 7.72-7.23(m, 4H), 7.92(s, 1H), 8.08(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.68 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-55: 1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00272
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 및 4-(클로로메틸)-3,5-디메틸이속사졸로부터 실시예 10-5 와 같이 제조했다. 수율: 50%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): 2.19(s, 3H), 2.27(s, 3H), 2.43-2.42(d, J=5.2Hz, 6H), 3.82(s, 2H), 4.40(s, 2H), 5.05(s, 2H), 7.92(s, 1H), 8.05(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.04 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-56: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-5-(3-메톡시벤질) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00273
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (400 mg, 2.08 mmol), 디피리딘-2-일 카보네이트 (450 mg, 2.08 mmol) 및 트리에틸아민 (0.290 mL, 2.08 mmol)을 디클로로메탄 (7 mL)에서 12시간 동안 실온에서 교반했다. 반응물을 진공 하에서 농축하여 4-((4-이소시아나토-1H-피라졸-1-일)메틸)-3,5-디메틸이속사졸을 회색이 도는 백색 고형물로서 정량 수율로 얻었다. 에탄올 (1 mL)을 메틸 2-아미노-3-(3-메톡시페닐)프로파노에이트 (68 mg, 0.327 mmol) 및 트리에틸아민 (0.064 mL, 0.461 mmol)와 함께 첨가했다. 반응물을 12시간 동안 환류에서 교반하고, 실온으로 냉각했다. 용매를 질소 흐름 하에서 제거했다. 조 생성물을 MeOH (1 mL)에서 재현탁하고, 역상 HPLC (물 중 5 내지 95% 아세토니트릴: 16분 구배)로 정제했다. 순수 분획을 배합하고, 용매를 진공 하에서 제거하여 3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-5-(3-메톡시벤질)이미다졸리딘-2,4-디온을 백색 고형물로서 수율 50% 로 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.19(s, 3H), 2.41(s, 3H), 3.34-3.33(d, J=3.2Hz, 1H), 3.31-3.29(d, J=8Hz, 1H), 3.76(s, 3H), 4.33-4.30(m, 1H), 5.05(s, 2H), 5.95(bs, 1H), 7.25-7.21(t, 1H), 6.82-6.78(m, 3H), 7.85(s, 1H), 7.99(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.13 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-57: 5-(사이클로 헥실메틸 )-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)이미다졸리딘-2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00274
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 10-41a) 및 메틸 2-아미노-3-사이클로헥실프로파노에이트로부터 실시예 10-56 과 같이 제조했다. 수율: 30%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.06-0.95(m, 2H), 1.29-1.15(m, 3H), 1.60-1.50(1H) 1.77-1.67(7H), 1.91-1.85(m, 1H), 2.19(s, 3H), 2.41(s, 3H), 4.19-4.15(m, 1H), 5.05(s, 2H), 6.01(bs, 1H), 7.91(s, 1H), 8.05(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.96 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-58: 5-(사이클로 펜틸메틸 )-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)이미다졸리딘-2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00275
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 10-41a) 및 메틸 2-아미노-3-사이클로펜틸프로파노에이트로부터 실시예 10-56 과 같이 제조했다. 수율: 50%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.20-1.14(m, 3H), 1.68-1.55(m, 6H), 2.04-1.92(m, 2H), 2.19(s, 3H), 2.42(s, 3H), 4.14-4.11(m, 1H), 5.05(s, 2H), 5.52(bs, 1H), 7.90(s, 1H), 8.06(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.31 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-59: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-5-(4-하이드록 시벤질 ) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00276
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 10-41a) 및 메틸 2-아미노-3-(4-하이드록시페닐)프로파노에이트로부터 실시예 10-56 과 같이 제조했다. 수율: 50%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.41(s, 3H), 2.85(s, 3H), 3.26-3.25(d, 1H, J=4Hz), 3.23-3.22(d, J=4Hz, 1H), 4.31-4.28(m, 1H), 5.04(s, 2H), 5.77-5.74(bs, 1H), 7.07-7.04(d, J=12Hz, 2H), 6.75-6.73(d, J=8Hz, 2H), 7.06(s, 1H), 7.97(s, 1H), 9.43(bs, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.33 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-60: 5-(3,4- 디하이드록시벤질 )-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00277
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 10-41a) 및 메틸 2-아미노-3-(3,4-디하이드록시페닐)프로파노에이트로부터 실시예 10-56 과 같이 제조했다. 수율: 50%. MS M+H 계산치 398.1; 실측치 398.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.51 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-61: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-5- 이소부틸이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00278
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 10-41a) 및 에틸 2-이소시아나토-4-메틸펜타노에이트로부터 실시예 10-41 과 같이 제조했다. 수율: 50%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.01-0.98(m, 8H), 1.87-1.82(m, 1H), 2.19(s, 3H), 2.41(s, 3H), 4.13-4.12(t, 1H), (5.05(s, 2H), 5.70(bs, 1H), 7.90(s, 1H), 8.05(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 1.0 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-62: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-5- 이소프로필이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00279
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 하이드로클로라이드 (실시예 10-41a) 및 에틸 2-이소시아나토-3-메틸부타노에이트로부터 실시예 10-41 과 같이 제조했다. 수율: 30%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 0.96-0.94(d, 3H, J=7.2Hz), 1.09-1.07(d, 3H, J=8Hz), 2.19(s, 3H), 2.26-2.22(m, 1H), 2.40(s, 3H), 4.02(s, 1H), 5.05(s, 2H), 5.53(bs, 1H), 7.90(s, 1H), 8.05(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 1.1 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-63: (Z)-5- 벤질리덴 -3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00280
빙초산 (3 mL) 중 3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) (275 mg, 1 mmol), 벤즈알데히드 (140 mg, 1.3 mmol), 및 나트륨 아세테이트 (205 mg, 2.5 mmol)을 마이크로웨이브 반응기에서 7시간 동안 185 ℃ 에서 가열했다. 냉각시, 혼합물을 물 (100 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출했다(3x, 50 mL). 배합된 유기 추출물을 포화 탄산나트륨 수용액으로 세정하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축했다. 고형 생성물을 에틸 아세테이트/헥산 (1/1)으로 분쇄하고, 고진공 하에서 건조시켜 (Z)-5-벤질리덴-3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (173 mg, 48%)를 담황색 고형물로서로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 2.14(s, 3H), 2.40(s, 3H), 6.59(s, 1H), 5.20(s, 2H), 7.33-7.40(m, 3H), 7.66(s, 2H), 7.81(s, 1H), 8.21(s, 1H), 11.01(bs, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.34 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-64: 4-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1- 메틸 -1,2,4- 트리아졸리딘 -3,5- 디온
Figure 112010017594708-pct00281
에틸 4-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-2-메틸-3,5-디옥소-1,2,4-트리아졸리딘-1-카르복실레이트 (3.2 g, 8.8 mmol)을 MeOH/1N 수성 NaOH (100 mL)의 (1/1) 혼합물에서 실온에서 30분 동안 교반했다. 혼합물을 수성 1N HCl (150 mL)으로 산성화하고, 에틸아세테이트(3x, 100 mL)로 추출하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하여 4-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1-메틸-1,2,4-트리아졸리딘-3,5-디온 (2.3 g, 89%)를 황색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 2.18(s, 3H), 2.44(s, 3H), 3.05(s, 3H), 5.17(s, 2H), 7.94(s, 1H), 8.13(s, 1H).
실시예 10-64a: 에틸 4-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-2- 메틸 -3,5- 디옥소 -1,2,4- 트리아졸리딘 -1- 카르복실레이트
Figure 112010017594708-pct00282
에틸 클로로포르메이트 (1.3 g, 12 mmol)을 아세토니트릴 (100 ml) 중 N-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1-메틸히드라진카르복사미드 (실시예 10-64b) (2.5 g, 9 mmol) 및 트리에틸아민 (1.2 g, 12 mmol)의 혼합물에 첨가했다. 혼합물을 1시간 동안 환류한 다음, 냉각하고, 1N 수성 HCl (150 mL)으로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출했다(3x, 75 mL). 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 로토바프 상에서 농축했다. 고형물을 에틸 아세테이트/헥산 (1/3)으로 분쇄하고, 고진공 하에서 건조시켜 에틸 4-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-2-메틸-3,5-디옥소-1,2,4-트리아졸리딘-1-카르복실레이트 (3.2 g, 94%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 1.28(t, J=7.2Hz, 3H), 2.13(s, 3H), 2.40(s, 3H), 3.24(s, 3H), 4.30(t, J=7.2Hz, 2H), 5.21(s, 2H), 7.73(m, 1H), 8.16(s, 1H).
실시예 10-64b: N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1- 메틸히드라진카르복사미드
Figure 112010017594708-pct00283
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-카보닐 아지드 (실시예 10-1a) (1.25 g, 5.3 mmol)을 톨루엔 (30 mL)에서 환류 온도에서 40분 동안 교반했다. 혼합물을 실온으로 냉각하고, 메틸 히드라진 (0.3 mL, 260 mg, 5.6 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 환류했다. 반응물을 실온으로 냉각한 후, 용매를 로토바프 상에서 제거하고, 고형 생성물을 에틸 아세테이트/헥산 (2/5)로 분쇄하고, 고진공 하에서 건조시켜 N-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1-메틸히드라진카르복사미드(1.1 g, 79%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 2.09(s, 3H), 2.36(s, 3H), 2.98(s, 3H), 4.61(s, 2H), 5.02(s, 2H), 7.42(s, 1H), 7.72(m, 1H), 8.78(s, 1H).
실시예 10-65: 1-벤질-4-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-2- 메틸 -1,2,4-트리아졸리딘-3,5- 디온
Figure 112010017594708-pct00284
4-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1-메틸-1,2,4-트리아졸리딘-3,5-디온 (실시예 10-64) (785 mg, 2.7 mmol)을 아세토니트릴 (50 mL)에 용해시켰다. 트리에틸아민 (1 g, 10 mmol) 및 벤질 브로마이드 (510 mg, 3 mmol)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 12시간 동안 교반했다. 그 다음, 혼합물을 로토바프 상에서 농축하고, 메탄올 (5 mL)에 용해시키고, 역상 HPLC (물 중 5-95% 아세토니트릴: 25분 구배)로 정제했다. 순수 분획을 풀링하고, 농축하고, 생성물을 에탄올로부터 재결정화하여 1-벤질-4-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-2-메틸-1,2,4-트리아졸리딘-3,5-디온 (210 mg, 20%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 2.13(s, 3H), 2.39(s, 3H), 3.09(s, 3H), 4.81(s, 2H), 5.18(s, 2H), 7.30-7.35(m, 5H), 7.76(s, 1H), 8.18(s, 1H). MS M+H 계산치 381.1; 실측치 381.1. 융점: 124-126 ℃. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.02 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-66: 1-벤질-4-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-2- 메틸 -1,2,4-트리아졸리딘-3,5- 디온
Figure 112010017594708-pct00285
4-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1-메틸-1,2,4-트리아졸리딘-3,5-디온 (실시예 10-64) 및 1-(2-브로모에틸)-4-플루오로벤젠으로부터 실시예 10-65 와 같이 제조했다. 수율: 14%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.18(s, 3H), 2.40(s, 3H), 2.87(t, J=6.8Hz, 2H), 3.14(s, 3H), 3.83(t, J=7.2Hz, 2H), 5.03(s, 2H), 6.95(t, J=8.4Hz, 2H), 7.14(t, J=8Hz, 2H), 7.77(s, 1H), 7.95(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.01 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-67: 4-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1- 메틸 -2-(2- 펜옥시에틸 )-1,2,4- 트리아졸리딘 -3,5- 디온
Figure 112010017594708-pct00286
4-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1-메틸-1,2,4-트리아졸리딘-3,5-디온 (실시예 10-64) 및 (2-브로모에톡시)벤젠으로부터 실시예 10-65 와 같이 제조했다. 수율: 20%. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 2.13(s, 3H), 2.40(s, 3H), 3.15(s, 3H), 3.99(t, J=4.4Hz, 2H), 4.13(t, J=4.8Hz, 2H), 5.20(s, 2H), 6.80(d, J=8Hz, 2H), 6.90(t, J=7.1Hz, 1H), 7.22(t, J=8Hz, 2H), 7.75(s, 1H), 8.17(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.031 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-68: 4-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1,2,4-트리아졸리딘-3,5- 디온
Figure 112010017594708-pct00287
1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-카보닐 아지드 (실시예 10-1a) (1g, 4.1 mmol)을 톨루엔 (100 mL)에서 1시간 동안 환류했다. 반응물을 실온으로 냉각하고, 에틸 히드라진카르복실레이트 (0.45g, 43 mmol)을 첨가했다. 반응물을 가열 환류하고, 1시간 동안 교반한 다음, 냉각하고, 로토바프 상에서 농축했다. 잔류물을 에탄올 (100 ml)에서 취하고, 탄산칼륨 (100 mg)을 첨가했다. 혼합물을 12시간 동안 환류한 다음, 여과하고, 실온으로 냉각시키고, 아세트산 (약 7 방울)로 중화시켰다. 용매를 로토바프 상에서 제거하고, 수득한 고형물을 에틸 아세테이트/헥산 (1/9)로 분쇄하여 4-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1,2,4-트리아졸리딘-3,5-디온(0.98 g, 85%)를 회색이 도는 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.18(s, 3H), 2.41(s, 3H), 4.98(s, 2H) 7.16(s, 1H), 7.38(s, 1H).
실시예 10-69: 4-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1,2-디메틸-1,2,4- 트리아졸리딘 -3,5- 디온
Figure 112010017594708-pct00288
4-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1,2,4-트리아졸리딘-3,5-디온 (실시예 10-68) (100 mg, 0.36 mmol), 메틸 요오다이드 (141 mg, 1 mmol), 및 세슘 카보네이트 (325 mg, 1 mmol)을 아세토니트릴/DMF (5 mL)의 2/1 혼합물에서 실온에서 2시간 동안 교반했다. 혼합물을 수성 1N HCl (100 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출했다(3x, 50 mL). 배합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축하고, 조 잔류물을 MeOH 에서 취하고, 역상 HPLC (물 중 5 내지 95% 아세토니트릴: 25분 구배)로 정제했다. 순수 분획을 풀링하고, 농축하여 4-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1,2-디메틸-1,2,4-트리아졸리딘-3,5-디온 (89 mg, 80%)를 맑은 반고형물로서 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.18(s, 3H), 2.41(s, 3H), 3.22(s, 6H), 5.04(s, 2H), 7.88(s, 1H), 8.03(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.6 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-70: 1,2- 디벤질 -4-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1,2,4- 트리아졸리딘 -3,5- 디온
Figure 112010017594708-pct00289
4-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1,2-디메틸-1,2,4-트리아졸리딘-3,5-디온 (실시예 10-69) 및 벤질 브로마이드로부터 실시예 10-65 와 같이 제조했다. 수율: 69%. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 2.14(s, 3H), 2.36(s, 3H), 4.65(s, 4H), 4.99(s, 2H), 7.06-7.08(m, 4H), 7.19-7.25(m, 6H), 7.86(s, 1H), 8.02(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.8 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-71: 3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1-((6-(하이드록시메틸)피리딘-2-일)메틸)이미다졸리딘-2,4-디온
Figure 112010017594708-pct00290
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 및 6-브로모메틸-2-피리딘메탄올로부터 실시예 10-5 와 같이 제조했다. 수율: 35%. MS M+H 계산치 397.2; 실측치 397.2. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.72 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-72: 1-((3,4- 디메톡시피리딘 -2-일) 메틸 )-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00291
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 및 3,4-디메톡시-2-클로로메틸 피리딘 하이드로클로라이드로부터 실시예 10-5 와 같이 제조했다. 수율: 26%. MS M+H 계산치 360.2; 실측치 360.2. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 1.0 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-73: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일)-1-((6-(테트라하이드로푸란-2-일) 메틸 ) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00292
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 및 테트라하이드로푸르푸릴 브로마이드로부터 실시예 10-52 와 같이 제조했다. 수율: 28%. MS M+H 계산치 427.2; 실측치 427.2. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 1.4 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-74: 1-(사이클로 헥실메틸 )-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일)이미다졸리딘-2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00293
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 브로모메틸사이클로헥산으로부터 실시예 10-52 와 같이 제조했다. 수율: 20%. 1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ 0.88(q, J=10.4Hz, 2H), 1.09-1.19(m, 3H), 1.58-1.65(m, 6H), 2.12(s, 3H), 2.38(s, 3H), 3.13(d, J=7.2Hz, 2H), 4.06(s, 2H), 5.17(s, 2H), 7.75(s, 1H), 8.14(s, 1H). MS M+H 계산치 372.2; 실측치 372.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.28 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-75: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일)-1-((6-메톡시피리딘-2-일) 메틸 ) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00294
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (100 mg, 0.4 mmol), (6-메톡시-피리딘-2-일)-메탄올 (실시예 10-75a) (101 mg, 0.7 mmol), 트리부틸포스핀 (147 mg, 0.7 mmol), 및 1,1'-아조비스(N,N-디메틸포름아미드) (125 mg, 0.7 mmol)을 THF (5 mL)에서 용해시키고, 실온에서 15시간 동안 교반했다. 반응물을 염수 (100 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출했다(2x, 100 mL). 배합된 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 로토바프 상에서 농축했다. 잔류물을 메탄올 (5 mL)에서 취하고, 역상 HPLC (물 중 5 내지 95% 아세토니트릴: 25분 구배)로 정제했다. 순수 분획을 배합하고, 농축한 다음, 에틸 아세테이트/헥산 (1:9)에서 재용해시켰다. 용액을 5℃에서 15시간 동안 냉각하고, 여기서 백색 고형물을 형성했다. 침전물을 수집하여 3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1-((6-메톡시피리딘-2-일)메틸)이미다졸리딘-2,4-디온 (5 mg, 4%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ 2.11(s, 3H), 2.37(s, 3H), 3.74(s, 3H), 4.17(s, 2H), 4.54(s, 2H), 5.17(s, 2H), 6.69(d, J=7.6Hz, 1H), 6.96(d, J=6.8Hz, 1H), 7.67(d, J=6.8Hz, 1H), 7.76(s, 1H), 8.17(s, 1H). MS M+H 계산치 397.2; 실측치 397.2. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.23 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-75a: (6- 메톡시피리딘 -2-일)메탄올
Figure 112010017594708-pct00295
무수 메탄올 (20 mL) 중 메틸-6-메톡시피리딘-2-카르복실레이트 (2g, 11.96 mmol)을 질소 하에서 0℃로 냉각하고, 나트륨 보로하이드라이드 (1.36g, 35.89 mmol)을 상기 용액에 서서히 첨가했다. 반응물을 0℃ 에서 30분 동안 교반시키고, 그 다음, 1시간 동안 실온으로 가온했다. 반응물을 물로 급랭시키고, 로토바프 상에서 농축했다. 반응물을 염수 (100 mL)로 희석하고, 디클로로메탄/2-프로판올 용액(2:1)으로 추출했다(3x, 150 mL). 배합된 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 로토바프 상에서 농축하여 (6-메톡시피리딘-2-일)메탄올 (500 mg, 30%)를 오일로서 얻었다. MS M+H 계산치 140.1; 실측치 140.1.
실시예 10-76: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일)-1-(2- 메톡시펜에틸 ) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00296
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 6) 및 2-메톡시펜에틸 브로마이드로부터 실시예 10-52 와 같이 제조했다. 수율: 52%. 1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ 2.11(s, 3H), 2.38(s, 3H), 2.80(t, J=7.2Hz, 2H), 3.51(t, J=7.2Hz, 2H), 3.75(s, 3H), 4.03(s, 2H), 5.17(s, 2H), 6.85(t, J=7.2Hz, 1H), 6.95(d, J=8.4Hz, 1H), 7.16-7.21(m, 2H), 7.73(s, 1H), 8.13(s, 1H). MS M+H 계산치 410.2; 실측치 410.1. 융점: 97-98 ℃. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.14 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-77: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일)-1-(3- 플루오로펜에틸 )이미다졸리딘-2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00297
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 3-플루오로펜에틸 브로마이드로부터 실시예 10-52 와 같이 제조했다. 수율: 22%. 1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ 2.11(s, 3H), 2.38(s, 3H), 2.80(t, J=7.2Hz, 2H), 3.57(t, J=7.2Hz, 2H), 4.06(s, 2H), 5.17(s, 2H), 6.85(dt, J=8.4, 2.0Hz, 1H), 7.11(t, J=8.4Hz, 2H), 7.32(q, J=7.8Hz, 1H), 7.73(s, 1H), 8.12(s, 1H). MS M+H 계산치 398.2; 실측치 398.1. 융점: 110-111 ℃. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.06 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-78: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일)-1- 펜에틸이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00298
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 펜에틸브로마이드로부터 실시예 10-52 와 같이 제조했다. 수율: 37%. 1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ 2.11(s, 3H), 2.38(s, 3H), 2.83(t, J=6.4Hz, 2H), 3.55(t, J=7.4Hz, 2H), 4.03(s, 2H), 5.17(s, 2H), 7.18-7.30(m, 5H), 7.73(s, 1H), 8.13(s, 1H). MS M+H 계산치 380.2; 실측치 380.1. 융점: 95-96 ℃. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.14 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-79: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일)-1-(4- 메톡시펜에틸 ) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00299
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 4-메톡시펜에틸 브로마이드로부터 실시예 10-52 와 같이 제조했다. 수율: 32%. 1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ 2.11(s, 3H), 2.38(s, 3H), 2.78(t, J=7.4Hz, 2H), 3.50(t, J=7.4Hz, 2H), 3.69(s, 3H), 4.02(s, 2H), 5.16(s, 2H), 6.84(d, J=8.4Hz, 2H), 7.15(d, J=8.4Hz, 2H), 7.73(s, 1H), 8.12(s, 1H). MS M+H 계산치 410.18; 실측치 410.2. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.04 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-80: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일)-1-(2-나프탈렌-1-일)에틸) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00300
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 1-(2-브로모에틸)나프탈렌으로부터 실시예 10-52 와 같이 제조했다. 수율: 20%. MS M+H 계산치 430.18; 실측치 430.2. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 1.27 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-81: 1-(2- 클로로펜에틸 )-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00301
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 2-클로로펜에틸 브로마이드로부터 실시예 10-52 와 같이 제조했다. 수율: 25%. MS M+H 계산치 414.13; 실측치 414.2. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.25 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-82: 1-(3- 클로로펜에틸 )-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00302
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 3-클로로펜에틸 브로마이드로부터 실시예 10-52 와 같이 제조했다. 수율: 27%. MS M+H 계산치 414.13; 실측치 414.2. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.20 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-83: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일)-1-(2- 플루오로펜에틸 )이미다졸리딘-2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00303
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 2-플루오로펜에틸 브로마이드로부터 실시예 10-52 와 같이 제조했다. 수율: 24%. MS M+H 계산치 398.16; 실측치 398.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.13 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-84: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일)-1-(4- 플루오로펜에틸 )이미다졸리딘-2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00304
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 4-플루오로펜에틸 브로마이드로부터 실시예 10-52 와 같이 제조했다. 수율: 34%. MS M+H 계산치 398.16; 실측치 398.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.01 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-85: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일)-1-(3- 메톡시펜에틸 ) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00305
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 3-메톡시펜에틸 브로마이드로부터 실시예 10-52 와 같이 제조했다. 수율: 34%. MS M+H 계산치 410.18; 실측치 410.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.16 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-86: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일)-1-(4-하이드록 시펜에틸 )이미다졸리딘-2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00306
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 4-하이드록시펜에틸 브로마이드로부터 실시예 10-52 와 같이 제조했다. 수율: 31%. MS M+H 계산치 396.16; 실측치 396.1. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.41 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-87: 1-(3,4- 디메톡시펜에틸 )-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00307
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 3,4-디메톡시펜에틸 브로마이드로부터 실시예 10-52 와 같이 제조했다. 수율: 36%. MS M+H 계산치 440.19; 실측치 440.2. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.26 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-88: 1-벤질-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일) 이미다졸리딘 -2-온
Figure 112010017594708-pct00308
DMF (3 mL) 중 1-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2-온 (실시예 10-88a) (50 mg, 0.19 mmol) 및 60% 나트륨 하이드라이드 (8 mg, 0.21 mmol)을 실온에서 15분 동안 교반한 다음, 0 ℃ 로 냉각했다. 벤질브로마이드 (33 mg, 0.19 mmol)을 혼합물에 첨가하고, 2시간 동안 실온으로 가온했다. 반응물을 메탄올로 급랭시키고, 로토바프 상에서 농축했다. 반응물을 염수 (50 mL)로 희석하고, 디클로로메탄으로 추출했다(2x, 50 mL). 배합된 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 로토바프 상에서 농축했다. 잔류물을 실리카 칼럼 크로마토그래피 (메탄올 중 100% 내지 90% 디클로로메탄: 30분 구배)로 정제하여 1-벤질-3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2-온(21 mg, 31%)를 백색 고형물로서 얻었다. MS M+H 계산치 352.17; 실측치 352.2. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.71 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-88a: 1-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 이미다졸리딘 -2-온
Figure 112010017594708-pct00309
DMF (2 mL) 중 1-(2-클로로에틸)-3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)1H-피라졸-4-일)우레아 (실시예 10-88b) (115 mg, 0.39 mmol) 및 60% 나트륨 하이드라이드 (17 mg, 0.42 mmol)을 0℃ 에서 15분 동안 교반한 다음, 2시간 동안 교반하면서 실온으로 가온했다. 반응물을 메탄올로 급랭시키고, 로토바프 상에서 농축했다. 반응물을 염수 (50 mL)로 희석하고, 디클로로메탄으로 추출했다(2x, 50 mL). 배합된 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 로토바프 상에서 농축했다. 잔류물을 실리카 칼럼 크로마토그래피 (메탄올 중 100% 내지 90% 디클로로메탄: 30분 구배)로 정제하여 1-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2-온 (98 mg, 97%)를 백색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ 2.10(s, 3H), 2.37(s, 3H), 3.35-3.39(m, 2H), 3.61(d, J=8.8Hz, 1H), 3.63(d, J=10.4Hz, 1H), 5.07(s, 2H), 6.71(s, 1H), 7.42(s, 1H), 7.74(s, 1H). MS M+H 계산치 262.12; 실측치 262.1.
실시예 10-88b: 1-(2- 클로로에틸 )-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 우레아
Figure 112010017594708-pct00310
아세토니트릴 (5 mL) 중 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-아민 (419 mg, 2.18 mmol) 및 2-클로로에틸 이소시아네이트 (230 mg, 2.18 mmol)을 65℃에서 16시간 동안 가열했다. 반응물을 실온으로 냉각하고, 로토바프 상에서 농축했다. 잔류물을 실리카 칼럼 크로마토그래피 (메탄올 중 100% 내지 90% 디클로로메탄: 30분 구배)로 정제하고, 건조시키고, 에틸 아세테이트/헥산 (1/9)로 분쇄하여 (1-(2-클로로에틸)-3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)1H-피라졸-4-일)우레아 (258 mg, 40%)를 황색 고형물로서 얻었다. MS M+H 계산치 298.10; 실측치 298.1
실시예 10-89: 1-벤질-4-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일)-2-( 메톡시메틸 )-1,2,4- 트리아졸리딘 -3,5- 디온
Figure 112010017594708-pct00311
1-벤질-4-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1,2,4-트리아졸리딘-3,5-디온 (실시예 10-91a) 및 브로모메틸 메틸에테르로부터 실시예 10-91 과 같이 제조했다. 수율: 18%. MS M+H 계산치 411.17; 실측치 411.2. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.02 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-90: 1-((1,3-디메틸-1H- 피라졸 -4-일) 메틸 )-3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H-피라졸-4-일) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00312
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (10a)(200 mg, 0.7 mmol), 4-(클로로메틸)-1,3-디메틸-1H-피라졸 (144 mg, 1 mmol), 및 세슘 카보네이트 (325 mg, 1 mmol)을 2 mL DMF 에서 용해시키고, 마이크로웨이브 반응기에서 165 ℃ 에서 5분 동안 가열했다. 반응물을 실온으로 냉각하고, 염 침전물을 여과로 제거했다. 조 생성물 함유 맑은 용액을 얻고, HPLC (10 내지 95% 아세토니트릴/물; 25분)로 정제하여 1-((1,3-디메틸-1H-피라졸-5-일)메틸)-3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (150 mg, 53%)를 담갈색 고형물로서 얻었다. 1H NMR (DMSO, 400 MHz): δ 2.09(s, 3H), 2.14(s, 3H), 2.20(s, 3H), 3.70(s, 3H), 3.99(s, 2H), 4.55(s, 2H), 5.19(s, 2H), 6.06(s, H), 7.77(s, H), 8.17(s, H). MS M+H 계산치 384.2; 실측치 384.2. 융점: 145-146 ℃.
실시예 10-91: 1-벤질-4-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일)-2-에틸-1,2,4- 트리아졸리딘 -3,5- 디온
Figure 112010017594708-pct00313
DMF (5 mL) 중 1-벤질-4-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1,2,4-트리아졸리딘-3,5-디온 (100 mg, 0.27 mmol), 브로모에탄 (149 mg, 1.36 mmol), 및 세슘 카보네이트 (355 mg, 1.1 mmol)을 80℃에서 15시간 동안 가열했다. 반응물을 실온으로 냉각하고, 염수 (50 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출했다(2x, 50 mL). 배합된 유기 추출물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 로토바프 상에서 농축했다. 잔류물을 HPLC (물 중 5 내지 95% 아세토니트릴: 25분 구배)로 정제하여 1-벤질-4-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-2-에틸-1,2,4-트리아졸리딘-3,5-디온 (40 mg, 37%)를 오일로서 얻었다. 1H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz): δ 0.97(t, J=7.2Hz, 3H), 2.13(s, 3H), 2.39(s, 3H), 3.58(q, J=6.8Hz, 2H), 4.80(s, 2H), 5.18(s, 2H), 7.28-7.36(m, 5H), 7.77(s, 1H), 8.19(s, 1H). MS M+H 계산치 395.18; 실측치 395.2. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.04 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-91a: 1-벤질-4-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1,2,4- 트리아졸리딘 -3,5- 디온
Figure 112010017594708-pct00314
아세토니트릴 (50 mL) 중 1-벤질-N-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)히드라진카르복사미드 (2.00g, 5.88 mmol), 에틸 클로로포르메이트 (6.38g, 58.77 mmol), 및 트리에틸아민 (1.78g, 17.63 mmol)을 100℃에서 48시간 동안 가열했다. 혼합물을 80 ℃ 로 냉각하고, 1 M NaOH(수성) (5 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반했다. 반응물을 실온으로 냉각하고, 로토바프 상에서 농축했다. 잔류물을 디클로로메탄에 용해시키고, 여과하여 염을 제거하고, 용액을 농축하여 1-벤질-4-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1,2,4-트리아졸리딘-3,5-디온 (1.28 g, 60%)를 황색 오일로서 얻었다. MS M+H 계산치 367.14; 실측치 367.2.
실시예 10-91b: 1-벤질-N-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일) 히드라진카르복사미드
Figure 112010017594708-pct00315
톨루엔 (70 mL) 중 1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸-1H-피라졸-4-카보닐 아지드 (2.79 g, 11.33 mmol)을 4시간 동안 가열 환류하여 4-((4-이소시아나토-1H-피라졸-1-일)메틸)-3,5-디메틸이속사졸을 인시투(in situ) 얻었다. 벤질히드라진 디하이드로클로라이드 (2.44 g, 12.45 mmol) 및 트리에틸아민 (2.29 g, 22.64 mmol)을 혼합물에 첨가했다. 혼합물을 100℃ 에서 추가 4시간 동안 가열했다. 반응물을 실온으로 냉각하고, 에틸 아세테이트 (150 mL)로 희석하고, 셀라이트를 통해 여과했다. 그 다음, 모액을 염수 (150 mL)로 세정하고, 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축했다. 잔류물을 실리카 칼럼 크로마토그래피 (메탄올 중 100% 내지 90% 디클로로메탄: 30분 구배)로 정제하여 1-벤질-N-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)히드라진카르복사미드 (2.00g, 52%)를 오일로서 얻었다. MS M+H 계산치 341.16; 실측치 341.2.
실시예 10-92: 1-벤질-4-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일)-2-(2- 메톡시에틸 )-1,2,4- 트리아졸리딘 -3,5- 디온
Figure 112010017594708-pct00316
1-벤질-4-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1,2,4-트리아졸리딘-3,5-디온 (실시예 10-91a) 및 2-브로모에틸 메틸에테르로부터 실시예 10-91 과 같이 제조했다. 수율: 20%. MS M+H 계산치 425.19; 실측치 425.2. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.06 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-93: 1-벤질-4-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일)-2-프로필-1,2,4-트 리아 졸리딘-3,5- 디온
Figure 112010017594708-pct00317
1-벤질-4-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1,2,4-트리아졸리딘-3,5-디온 (실시예 10-91a) 및 1-브로모프로판으부터 실시예 10-91 과 같이 제조했다. 수율: 38%. MS M+H 계산치 409.19; 실측치 409.2. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.06 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-94: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-1-(3- 페닐프로필 ) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00318
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) 및 (3-브로모프로필)벤젠으부터 실시예 10-52 와 같이 제조했다. 수율: 36%. MS M+H 계산치 394.2; 실측치 394.2. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.26 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-95: 1-벤질-2-부틸-4-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1 H - 피라졸 -4-일-1,2,4- 트리아졸리딘 -3,5- 디온
Figure 112010017594708-pct00319
1-벤질-4-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-1,2,4-트리아졸리딘-3,5-디온 (실시예 10-91a) 및 1-브로모부탄부터 실시예 10-91 과 같이 제조했다. 수율: 22%. MS M+H 계산치 423.21; 실측치 423.15. 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.41 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-96: 3급-부틸 3-((3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-2,4- 디옥소이미다졸리딘 -1-일) 메틸 ) 벤질카바메이트
Figure 112010017594708-pct00320
3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)이미다졸리딘-2,4-디온 (실시예 10-1) (070 mg, 0.254 mmol), 3급-부틸 3-(하이드록시메틸)벤질카바메이트 (0.254 mmol, 60 mg), 디에틸 아조디카르복실레이트 (0.50 mmol, 86 mg), 및 P-tBu3(125 mL, 0.50 mmol)을 THF (1 mL)에서 4시간 동안 교반했다. 반응물을 에틸 아세테이트 (1.5 mL)로 희석하고, 포화 중탄산나트륨 용액(2x, 1.5 mL)으로 세정했다. 유기 상을 수집하고, 혼합물을 진한 질소 흐름 하에서. 조 생성물을, 용리액으로서 에틸 아세테이트를 사용하여 실리카겔 상에서 칼럼 크로마토그래피로 정제했다. 순수 분획을 배합하고, 용매를 로토바프 상에서 제거하여 3급-부틸 3-((3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-2,4-디옥소이미다졸리딘-1-일)메틸)벤질카바메이트를 백색 고형물 (112 mg, 90%)로서 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 1.44 (s, 9H), 2.19(s, 3H), 2.42(s, 3H), 3.48(bs, 1H), 3.84(s, 2H), 4.31-4.30(d, J=6Hz, 1H), 4.60(s, 2H), 4.87(bs, 1H), 5.06(s, 2H), 7.36-7.16(m, 4H), 7.92(s, 1H), 8.08(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 0.90 μM 의 IC50 을 가졌다.
실시예 10-97: 3-(1-((3,5- 디메틸이속사졸 -4-일) 메틸 )-1H- 피라졸 -4-일)-5-(하 이드록시메틸 ) 이미다졸리딘 -2,4- 디온
Figure 112010017594708-pct00321
4-((4-이소시아네이토-1H-피라졸-1-일)메틸)-3,5-디메틸이속사졸 (실시예 10-1) (784 mg, 3.6 mmol), 세린 메틸 에스테르 하이드로클로라이드(672 mg, 4.32 mmol) 및 트리에틸아민 (1 mL, 7.2 mmol)을 톨루엔 (16 mL)에서 8시간 동안 환류했다. 반응물을 실온으로 냉각한 다음, 용액을 로보바프 상에서 농축했다. 생성물을 역상 HPLC (물 중 5 내지 95% 아세토니트릴 : 16분 구배)로 정제하여 3-(1-((3,5-디메틸이속사졸-4-일)메틸)-1H-피라졸-4-일)-5-(하이드록시메틸)이미다졸리딘-2,4-디온을 백색 고형물(60 mg, 25%)로서 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ(s, 3H), 2.40(s, 3H), 3.13-3.07(m, 1H), 3.94-3.93(d, J=4Hz, 2H), 4.21-4.19(t, J=4Hz, 1H), 5.03(s, 2H), 6.68(bs, 1H), 7.87(s, 1H), 7.99(s, 1H). 표제 화합물은 hT2R08 쓴맛 수용체를 억제하는 것을 보여주었고 3 μM 의 IC50 을 가졌다.
Figure 112010017594708-pct00322
Figure 112010017594708-pct00323
Figure 112010017594708-pct00324
Figure 112010017594708-pct00325
Figure 112010017594708-pct00326
Figure 112010017594708-pct00327
Figure 112010017594708-pct00328
Figure 112010017594708-pct00329
Figure 112010017594708-pct00330
Figure 112010017594708-pct00331
Figure 112010017594708-pct00332
Figure 112010017594708-pct00333
Figure 112010017594708-pct00334
Figure 112010017594708-pct00335
Figure 112010017594708-pct00336
Figure 112010017594708-pct00337
Figure 112010017594708-pct00338
Figure 112010017594708-pct00339
Figure 112010017594708-pct00340
Figure 112010017594708-pct00341
Figure 112010017594708-pct00342

실시예 11. hT2R8 은 hT2R43 및 hT2R44 유전자의 "비-미각감별사( non -taster)" 버전( version )인 사람에 대한 사카린의 쓴맛의 원인이 된다
도 6은 hT2R43, hT2R44 및 hT2R8 의 변이체를 발현시키는 형질감염된 세포에서 수용체 활성에 대한 사카린의 효과 및 투여에 따른 관계를 보여주고 있다. hT2R8 은 "미각감별사(taster)" hT2R43-W35 및 hT2R44-W35 대립유전자보다 시험관내 분석에서 사카린에 덜 반응하지만, "비-미각감별사" hT2R43-S35 및 hT2R44-R35 대립유전자보다 더 반응한다. Pronin 등, Curr . Biol . 17: 1403-8 (2007). "미각감별사" 대립유전자 (hT2R43-W35 및/또는 hT2R44-W35)를 갖는 5개의 개체 및 "비-미각감별사" 대립유전자 (hT2R43-S35 및 hT2R44-R35)를 갖는 5개의 개체를 유전자형 분석으로 선택했다. 각 대상체에 6쌍의 용액을 제공하고, 1쌍의 샘플 중 어떤 것이 더 쓴맛인지를 결정했다. 표 8에 보여진 결과에 따르면, hT2R8 블록커(blocker) Cpd-D 는 hT2R43 및 hT2R44 의 "비-미각감별사" 대립유전자를 갖는 사람에 대해 사카린의 쓴맛을 감소시키고, 그 유전자의 "미각감별사" 대립유전자를 갖는 사람에 대해서는 효과를 갖지 않는다.
미각 테스트 결과
미각
테스트 		쓴맛
작용물질 		유전자형 군 더 쓴 것으로서 선택됨 P값
없음 + Cpd -D
1 사카린 hT2R43-W35 및/또는
hT2R44-W35 		13 17 0.82
2 사카린 hT2R43-S35 및
hT2R44-R35 		27 3 <0.001
본 발명에 의해 제공되고/되거나 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 다른 예시적인 화합물은 하기 화학식의 화합물을 포함한다.
첫 번째 측면에서, 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
[화학식 I]
Figure 112010017594708-pct00343
상기 화학식에서,
Ar1 은 5원 또는 6원 아릴, 헤테로아릴 또는 사이클로알킬 환이고;
m 은 0, 1, 2 또는 3 이고;
R1 은 SO2; C=O; C=S; 또는 C=NOR4 이고;
X 는 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각 R1'은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나; 또는
X 및/또는 적어도 하나의 R1'는 이들이 결합되는 원자와 함께 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로헤테로알킬 또는 치환된 사이클로헤테로알킬 환을 형성하고, 여기서, 상기 환은 다른 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로헤테로알킬 또는 치환된 사이클로헤테로알킬 환에 임의 융합되고;
R4 내지 R8 는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬 및 치환된 헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R5 및 R6, R6 및 R7, R7 및 R8, 는 이들이 결합되는 원자와 함께 사이클로헤테로알킬 또는 치환된 사이클로헤테로알킬 환을 형성하고;
A 및 B 는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
b 는 0, 1, 또는 2 이다.
두 번째 측면에서, 화학식 (II)의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
[화학식 II]
Figure 112010017594708-pct00344
상기 화학식에서,
Ar1, Ar2 및 Ar3 는 독립적으로 5원 또는 6원 아릴, 헤테로아릴, 또는 사이클로알킬 환이고;
m 은 0, 1, 2 또는 3 이고;
n 및 p 는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4 이고;
r 및 t 는 독립적으로 0,1 또는 2 이고;
Y 및 Z 는 CR6R7, C=O, C=S, C=NOR6, O, NR6, 및 S(O)b 로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R1 은 SO2, C=O, C=S, 및 C=NOR4 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X 는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고;
X 는 바람직하게는 수소, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, S(O)bR6, CONR6R7, -CO2R6, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
각 R1'은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각 R2'은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), 및 P(O)(OR5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각 R3'은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나; 또는
X 및/또는 적어도 하나의 R1'은 이들이 결합하고 있는 원자와 함께 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로헤테로알킬 또는 치환된 사이클로헤테로알킬 환을 형성하고, 여기서 환은 다른 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로헤테로알킬 또는 치환된 사이클로헤테로알킬 환에 임의로 융합되고;
R4 내지 R8 은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬 또는 치환된 헤테로아릴알킬이거나, 또는 R5 및 R6, R6 및 R7, R7 및 R8 은 이들이 결합하고 있는 원자와 함께 사이클로헤테로알킬 또는 치환된 사이클로헤테로알킬 환을 형성하고;
b 는 0, 1, 또는 2 이다.
다른 측면에서, 본 발명은 화학식 (III)의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
[화학식 III]
Figure 112010017594708-pct00345
상기 화학식에서,
Ar1, Ar2 및 Ar3 은 독립적으로 5원 또는 6원 아릴, 헤테로아릴, 또는 사이클로알킬 환이고, Ar2 및 Ar3 는 임의로 제외될 수 있고;
m 은 0, 1, 2 또는 3 이고;
n 및 p 는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4 이고;
각 R1'은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각 R2'은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각 R3'은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R5 내지 R8 은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬 또는 치환된 헤테로아릴알킬이거나, 또는 R5 및 R6, R6 및 R7, R7 및 R8 은 이들이 결합하고 있는 원자와 함께 사이클로헤테로알킬 또는 치환된 사이클로헤테로알킬 환을 형성하고;
b 는 0, 1, 또는 2 이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
Figure 112010017594708-pct00346
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
Figure 112010017594708-pct00347
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
Figure 112010017594708-pct00348
관련 측면에서, 본 발명은 하기 화학식(IV)의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
[화학식 IV]
Figure 112010017594708-pct00349
상기 화학식에서,
Ar4 및 Ar5 은 독립적으로 5원 또는 6원 아릴 또는 헤테로아릴 환이고;
W 는 CR6R7, C=O, C=S; C=NOR6; O, NR6, S, SO, SO2, 및 (CH2)n 으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
n 은 0, 1, 2, 또는 3 이고;
G 는 CR6R7, C=O, C=S, C=NOR6, 및 S(O)b 로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R20 은 수소, 아릴알케닐, 헤테로아릴알케닐, 아릴알킬, 헤테로아릴알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬, 알콕시-알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 치환된 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R21 은 아릴알케닐, 헤테로아릴알케닐, 아릴알킬, 헤테로아릴알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬, 알콕시-알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 치환된 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R6 및 R7 은 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬 또는 치환된 헤테로아릴알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R6 및 R7 은 이들이 결합하고 있는 원자와 함께 사이클로헤테로알킬 또는 치환된 사이클로헤테로알킬 환을 형성하고;
b 는 0, 1, 또는 2 이다.
다른 관련 측면에서, 화학식 (V)의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
[화학식 V]
Figure 112010017594708-pct00350
상기 화학식에서,
Ar4 및 Ar5 은 독립적으로 5원 또는 6원 아릴 또는 헤테로아릴 환이고;
n 은 0, 1, 2, 또는 3 이고;
R21 은 아릴알케닐, 헤테로아릴알케닐, 아릴알킬, 헤테로아릴알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬, 알콕시-알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 치환된 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R35 는 수소, 알킬, 및 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 구현예에서, 본 발명은 화학식 (VI)의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
[화학식 VI]
Figure 112015024725280-pct00518
상기 화학식에서,
R30 은 아릴알케닐, 헤테로아릴알케닐, 아릴알킬, 헤테로아릴알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알킬, 알콕시-알킬, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 치환된 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R35 는 수소, 알킬, 및 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한층 추가적인 구현예에서, 본 발명은 하기 구조의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
Figure 112015024725280-pct00519
상기 화학식에서,
각 R 은 독립적으로 Cl, MeO, CN, EtO, OH, Me, -SO2Me, F, 또는 H 이고,
n 은 0, 1, 2, 3 또는 4 이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 구조의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
Figure 112015024725280-pct00520
상기 화학식에서,
각 R 은 독립적으로 MeO 또는 OH 이고,
n 은 0, 1, 2, 3 또는 4 이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 구조의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
Figure 112015024725280-pct00521
상기 화학식에서, R 은 H, Me, Et, OCOMe, CH2OH, OMe, 또는 Ph 이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 구조의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
Figure 112015024725280-pct00522
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 구조의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
Figure 112015024725280-pct00523
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 구조의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 제공한다:
Figure 112015024725280-pct00524

또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기 구조의 화합물을 제공한다:
Figure 112015024725280-pct00525
하나의 측면에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드, 또는 프로드러그에 관한 것이다:
Figure 112010017594708-pct00359
상기 화학식에서,
Ar6 및 Ar7 는 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 5원 또는 6원 아릴 기 또는 5원 또는 6원 헤테로아릴 기이고;
Alk 는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
R36 및 R37 는 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 H 또는 알킬이거나, R36 및 R37 는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 임의 치환된 5원 또는 6원 헤테로사이클을 형성하고;
R38 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이다.
하나의 측면에서, 본 발명의 화합물은 5원 헤테로사이클을 함유한다. 하나의 구현예에서, 5원 헤테로사이클은 히단토인 또는 치환 또는 비치환된 사이클릭 우레아이다.
하나의 구현예에서, 히단토인은 하기 화학식의 히단토인 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드 또는 프로드러그이다:
Figure 112010017594708-pct00360
상기 화학식에서,
Ar6 및 Ar7 은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 5원 또는 6원 아릴 기 또는 5원 또는 6원 헤테로아릴 기이고;
Alk 는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
R38 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이고;
R39 및 R40 은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 할로알킬이거나, 또는 R39 및 R40 는 이들이 부착되어 있는 탄소원자와 함께 C=O 기 또는 치환 또는 비치환된 알케닐 기를 형성한다.
다른 측면에서, 본 발명의 화합물은 우라졸인 5원 헤테로사이클을 함유한다. 하나의 구현예에서, 우라졸은 하기 화학식의 우라졸 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드 또는 프로드러그이다:
Figure 112010017594708-pct00361
상기 화학식에서,
Ar6 및 Ar7 은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 5원 또는 6원 아릴 기 또는 5원 또는 6원 헤테로아릴 기이고;
Alk 는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
R38 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이고;
R41 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이다.
다른 측면에서, 본 발명의 화합물은 6원 헤테로사이클을 함유한다. 하나의 구현예에서, 6원 헤테로사이클은 하기 화학식의 6원 헤테로사이클 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드 또는 프로드러그이다:
Figure 112010017594708-pct00362
상기 화학식에서,
R38 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이고;
R42, R43, R44, R45, 및 R46 은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬이거나, 또는 R42 및 R43, 또는 R45 및 R46 은 이들이 부착되어 있는 탄소원자와 함께 C=O 기를 형성한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드 또는 프로드러그에 관한 것이다:
Figure 112010017594708-pct00363
상기 화학식에서,
Alk 는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
M1 은 N 또는 CR49 이고, 여기서 R49 는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
M2 은 N 또는 CR50 이고, 여기서, R50 는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
R36 및 R37 은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 H, 알킬이거나, 또는 R36 및 R37 는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 임의 치환된 5원 또는 6원 헤테로사이클을 형성하고;
R38 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이고;
R47 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이고;
R48 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드 또는 프로드러그에 관한 것이다:
Figure 112010017594708-pct00364
상기 화학식에서,
Alk 는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
T1 는 C=O 이고, Q 는 CR51R52 또는 NR51 이고, 여기서, R51 및 R52 은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 할로알킬이거나, 또는 R51 및 R52 는 이들이 부착되어 있는 탄소원자와 함께 C=O 기 또는 치환 또는 비치환된 알케닐 기를 형성하고;
M1 은 N 또는 CR49 이고, 여기서, R49 는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
M2 은 N 또는 CR50 이고, 여기서, R50 는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
R38 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이고;
R47 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이고;
R48 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드 또는 프로드러그에 관한 것이다:
Figure 112010017594708-pct00365
Figure 112010017594708-pct00366
Figure 112010017594708-pct00367
Figure 112010017594708-pct00368
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드 또는 프로드러그에 관한 것이다:
Figure 112010017594708-pct00369
또 다른 측면에서, 본 발명은 화학식
Figure 112010017594708-pct00370
(여기서, R56, R57, 및 Alk 는 하기 정의한 바와 같고, J 는 이탈기이다)의 화합물을 화학식
Figure 112010017594708-pct00371
(여기서, M1 및 M2 는 하기 정의한 바와 같다)의 화합물과 반응시켜 NO2 기를 갖는 화학식
Figure 112010017594708-pct00372
의 화합물을 얻고;
NO2 기를 환원시켜서 NH2 기를 갖는 화합물을 얻고;
NH2 기를 갖는 화합물을 화학식
Figure 112010017594708-pct00373
(여기서, J2 는 이탈기이고, T2 및 R53 는 하기 정의한 바와 같다)의 화합물과 반응시키는 것을 포함하는, 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드 또는 프로드러그의 제조 방법에 관한 것이다:
Figure 112010017594708-pct00374
상기 화학식에서,
Alk 는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
T2 는 C=S, C=O, 또는 S(O)2 이고;
R53 은 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 아릴, 또는 치환 또는 비치환된 아릴알킬이고;
M1 은 N 또는 CR54 이고, 여기서, R54 는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
M2 은 N 또는 CR55 이고, 여기서, R55 는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
R56 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이고;
R57 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 화학식
Figure 112010017594708-pct00375
(여기서, R47, R48, Alk, M1, 및 M2 는 하기 정의한 바와 같다)의 화합물을 가열하여 -CON3 기를 -N=C=O 기로 전환시킨 다음, 화학식
Figure 112010017594708-pct00376
(여기서, J3 는 이탈기이고, R38, R51, 및 R52 는 하기 정의한 바와 같다)의 화합물과 반응시킴을 포함하는, 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드 또는 프로드러그의 제조 방법에 관한 것이다:
Figure 112010017594708-pct00377
상기 화학식에서,
Alk 는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
R51 및 R52 은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 할로알킬이거나, 또는 R51 및 R52 는 이들이 부착되어 있는 탄소원자와 함께 치환 또는 비치환된 알케닐 기를 형성하고;
M1 은 N 또는 CR49 이고, 여기서, R49 는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
M2 은 N 또는 CR50 이고, 여기서, R50 는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
R38 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이고;
R47 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이고;
R48 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 화학식
Figure 112010017594708-pct00378
(여기서, R47, R48, Alk, M1, 및 M2 는 하기 정의한 바와 같다)의 화합물을 가열하여 -CON3 기를 -N=C=O 기로 전환시킨 다음, 화학식
Figure 112010017594708-pct00379
(여기서, R38 는 하기 정의한 바와 같다)의 히드라진과 반응시킴을 포함하는, 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드 또는 프로드러그의 제조 방법에 관한 것이다:
Figure 112010017594708-pct00380
상기 화학식에서,
Alk 는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
R52 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 할로알킬이고;
M1 은 N 또는 CR49 이고, 여기서, R49 는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
M2 은 N 또는 CR50 이고, 여기서, R50 는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
R38 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬 알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이고;
R47 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이고;
R48 은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 화학식
Figure 112010017594708-pct00381
(여기서, J 는 이탈기이다)의 화합물을 화학식
Figure 112010017594708-pct00382
의 화합물과 반응시켜서 생성물을 얻고;
상기 생성물을 화학식
Figure 112010017594708-pct00383
(여기서, J 는 이탈기이다)의 화합물과 반응시킴을 포함하는, 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물, N-옥사이드 또는 프로드러그의 제조 방법에 관한 것이다:
[화학식 III]
Figure 112010017594708-pct00384
상기 화학식에서,
Ar1, Ar2 및 Ar3 은 독립적으로 5원 또는 6원 아릴, 헤테로아릴, 또는 사이클로알킬 환이고, Ar2 및 Ar3 는 임의로 제외될 수 있고;
m 은 0, 1, 2 또는 3 이고;
n 및 p 는 독립적으로 0, 1, 2, 3 또는 4 이고;
각 R1'은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각 R2'은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
각 R3'은 수소, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 아실, 치환된 아실, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 치환된 헤테로아릴알킬, CN, NO2, OR6, S(O)bR6, NR6R7, CONR6R7, CO2R6, NR6CO2R7, NR6CONR7R8, NR6CSNR7R8, NR6C(=NH)NR7R8, SO2NR5R6, NR5SO2R6, NR5SO2NR6R7, B(OR5)(OR6), P(O)(OR5)(OR6), 및 P(O)(R5)(OR6)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
R5 내지 R8 은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬 또는 치환된 헤테로아릴알킬이거나, 또는, R6 및 R7, R7 및 R8 는 이들이 결합하고 있는 원자와 함께 사이클로헤테로알킬 또는 치환된 사이클로헤테로알킬 환을 형성하고;
b 는 0, 1, 또는 2 이다.
키메릭 G 단백질 및 hT2R 유전자 및 폴리펩타이드의 서열
로돕신 태그의 단백질 서열: (서열번호 1)
Figure 112010017594708-pct00385

G16gust44 의 단백질 서열: (서열번호 2)
Figure 112010017594708-pct00386

hT2R8 서열:
DNA-(서열번호 3)
Figure 112010017594708-pct00387
단백질-(서열번호 4)
Figure 112010017594708-pct00388

hT2R14 서열:
DNA-(서열번호 5)
Figure 112010017594708-pct00389
단백질-(서열번호 6)
Figure 112010017594708-pct00390
상기의 상세한 설명은 본 발명의 몇 개의 구현예를 기재하였지만, 상기의 기재는 단지 설명하기 위한 것이지 개시된 발명을 제한하는 것은 아닌 것으로 이해해야 한다. 본 발명은 단지 하기의 특허청구범위에 의해 제한되어야 한다.
<110> Senomyx, Inc. <120> Human T2R bitterness receptors and uses thereof <130> 67824.704002 <150> US 60/957,129 <151> 2007-08-21 <150> US 61/047,187 <151> 2008-04-23 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 1 Met Asn Gly Thr Glu Gly Pro Asn Phe Tyr Val Pro Phe Ser Asn Lys 1 5 10 15 Thr Gly Val Val Arg Ser Pro Phe Glu Ala Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala 20 25 30 Glu Pro Trp 35 <210> 2 <211> 374 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic chimeric protein <400> 2 Met Ala Arg Ser Leu Thr Trp Arg Cys Cys Pro Trp Cys Leu Thr Glu 1 5 10 15 Asp Glu Lys Ala Ala Ala Arg Val Asp Gln Glu Ile Asn Arg Ile Leu 20 25 30 Leu Glu Gln Lys Lys Gln Asp Arg Gly Glu Leu Lys Leu Leu Leu Leu 35 40 45 Gly Pro Gly Glu Ser Gly Lys Ser Thr Phe Ile Lys Gln Met Arg Ile 50 55 60 Ile His Gly Ala Gly Tyr Ser Glu Glu Glu Arg Lys Gly Phe Arg Pro 65 70 75 80 Leu Val Tyr Gln Asn Ile Phe Val Ser Met Arg Ala Met Ile Glu Ala 85 90 95 Met Glu Arg Leu Gln Ile Pro Phe Ser Arg Pro Glu Ser Lys His His 100 105 110 Ala Ser Leu Val Met Ser Gln Asp Pro Tyr Lys Val Thr Thr Phe Glu 115 120 125 Lys Arg Tyr Ala Ala Ala Met Gln Trp Leu Trp Arg Asp Ala Gly Ile 130 135 140 Arg Ala Cys Tyr Glu Arg Arg Arg Glu Phe His Leu Leu Asp Ser Ala 145 150 155 160 Val Tyr Tyr Leu Ser His Leu Glu Arg Ile Thr Glu Glu Gly Tyr Val 165 170 175 Pro Thr Ala Gln Asp Val Leu Arg Ser Arg Met Pro Thr Thr Gly Ile 180 185 190 Asn Glu Tyr Cys Phe Ser Val Gln Lys Thr Asn Leu Arg Ile Val Asp 195 200 205 Val Gly Gly Gln Lys Ser Glu Arg Lys Lys Trp Ile His Cys Phe Glu 210 215 220 Asn Val Ile Ala Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Glu Tyr Asp Gln 225 230 235 240 Cys Leu Glu Glu Asn Asn Gln Glu Asn Arg Met Lys Glu Ser Leu Ala 245 250 255 Leu Phe Gly Thr Ile Leu Glu Leu Pro Trp Phe Lys Ser Thr Ser Val 260 265 270 Ile Leu Phe Leu Asn Lys Thr Asp Ile Leu Glu Glu Lys Ile Pro Thr 275 280 285 Ser His Leu Ala Thr Tyr Phe Pro Ser Phe Gln Gly Pro Lys Gln Asp 290 295 300 Ala Glu Ala Ala Lys Arg Phe Ile Leu Asp Met Tyr Thr Arg Met Tyr 305 310 315 320 Thr Gly Cys Val Asp Gly Pro Glu Gly Ser Asn Leu Lys Lys Glu Asp 325 330 335 Lys Glu Ile Tyr Ser His Met Thr Cys Ala Thr Asp Thr Gln Asn Val 340 345 350 Lys Phe Val Phe Asp Ala Val Thr Asp Ile Ile Ile Lys Glu Asn Leu 355 360 365 Lys Asp Cys Gly Leu Phe 370 <210> 3 <211> 930 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgttcagtc ctgcagataa catctttata atcctaataa ctggagaatt catactagga 60 atattgggga atggatacat tgcactagtc aactggattg actggattaa gaagaaaaag 120 atttccacag ttgactacat ccttaccaat ttagttatcg ccagaatttg tttgatcagt 180 gtaatggttg taaatggcat tgtaatagta ctgaacccag atgtttatac aaaaaataaa 240 caacagatag tcatttttac cttctggaca tttgccaact acttaaatat gtggattacc 300 acctgcctta atgtcttcta ttttctgaag atagccagtt cctctcatcc actttttctc 360 tggctgaagt ggaaaattga tatggtggtg cactggatcc tgctgggatg ctttgccatt 420 tccttgttgg tcagccttat agcagcaata gtactgagtt gtgattatag gtttcatgca 480 attgccaaac ataaaagaaa cattactgaa atgttccatg tgagtaaaat accatacttt 540 gaacccttaa ctctctttaa cctgtttgca attgtcccat ttattgtgtc actgatatca 600 tttttccttt tagtaagatc tttatggaga cataccaagc aaataaaact ctatgctacc 660 ggcagtagag accccagcac agaagttcat gtgagagcca ttaaaactat gacttcattt 720 atcttctttt ttttcctata ctatatttct tctattttga tgacctttag ctatcttatg 780 acaaaataca agttagctgt ggagtttgga gagattgcag caattctcta ccccttgggt 840 cactcactta ttttaattgt tttaaataat aaactgaggc agacatttgt cagaatgctg 900 acatgtagaa aaattgcctg catgatatga 930 <210> 4 <211> 309 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Phe Ser Pro Ala Asp Asn Ile Phe Ile Ile Leu Ile Thr Gly Glu 1 5 10 15 Phe Ile Leu Gly Ile Leu Gly Asn Gly Tyr Ile Ala Leu Val Asn Trp 20 25 30 Ile Asp Trp Ile Lys Lys Lys Lys Ile Ser Thr Val Asp Tyr Ile Leu 35 40 45 Thr Asn Leu Val Ile Ala Arg Ile Cys Leu Ile Ser Val Met Val Val 50 55 60 Asn Gly Ile Val Ile Val Leu Asn Pro Asp Val Tyr Thr Lys Asn Lys 65 70 75 80 Gln Gln Ile Val Ile Phe Thr Phe Trp Thr Phe Ala Asn Tyr Leu Asn 85 90 95 Met Trp Ile Thr Thr Cys Leu Asn Val Phe Tyr Phe Leu Lys Ile Ala 100 105 110 Ser Ser Ser His Pro Leu Phe Leu Trp Leu Lys Trp Lys Ile Asp Met 115 120 125 Val Val His Trp Ile Leu Leu Gly Cys Phe Ala Ile Ser Leu Leu Val 130 135 140 Ser Leu Ile Ala Ala Ile Val Leu Ser Cys Asp Tyr Arg Phe His Ala 145 150 155 160 Ile Ala Lys His Lys Arg Asn Ile Thr Glu Met Phe His Val Ser Lys 165 170 175 Ile Pro Tyr Phe Glu Pro Leu Thr Leu Phe Asn Leu Phe Ala Ile Val 180 185 190 Pro Phe Ile Val Ser Leu Ile Ser Phe Phe Leu Leu Val Arg Ser Leu 195 200 205 Trp Arg His Thr Lys Gln Ile Lys Leu Tyr Ala Thr Gly Ser Arg Asp 210 215 220 Pro Ser Thr Glu Val His Val Arg Ala Ile Lys Thr Met Thr Ser Phe 225 230 235 240 Ile Phe Phe Phe Phe Leu Tyr Tyr Ile Ser Ser Ile Leu Met Thr Phe 245 250 255 Ser Tyr Leu Met Thr Lys Tyr Lys Leu Ala Val Glu Phe Gly Glu Ile 260 265 270 Ala Ala Ile Leu Tyr Pro Leu Gly His Ser Leu Ile Leu Ile Val Leu 275 280 285 Asn Asn Lys Leu Arg Gln Thr Phe Val Arg Met Leu Thr Cys Arg Lys 290 295 300 Ile Ala Cys Met Ile 305 <210> 5 <211> 954 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atgggtggtg tcataaagag catatttaca ttcgttttaa ttgtggaatt tataattgga 60 aatttaggaa atagtttcat agcactggtg aactgtattg actgggtcaa gggaagaaag 120 atctcttcgg ttgatcggat cctcactgct ttggcaatct ctcgaattag cctggtttgg 180 ttaatattcg gaagctggtg tgtgtctgtg tttttcccag ctttatttgc cactgaaaaa 240 atgttcagaa tgcttactaa tatctggaca gtgatcaatc attttagtgt ctggttagct 300 acaggcctcg gtacttttta ttttctcaag atagccaatt tttctaactc tatttttctc 360 tacctaaagt ggagagttaa aaaggtggtt ttggtgctgc ttcttgtgac ttcggtcttc 420 ttgtttttaa atattgcact gataaacatc catataaatg ccagtatcaa tggatacaga 480 agaaacaaga cttgcagttc tgattcaagt aactttacac gattttccag tcttattgta 540 ttaaccagca ctgtgttcat tttcataccc tttactttgt ccctggcaat gtttcttctc 600 ctcatcttct ccatgtggaa acatcgcaag aagatgcagc acactgtcaa aatatccgga 660 gacgccagca ccaaagccca cagaggagtt aaaagtgtga tcactttctt cctactctat 720 gccattttct ctctgtcttt tttcatatca gtttggacct ctgaaaggtt ggaggaaaat 780 ctaattattc tttcccaggt gatgggaatg gcttatcctt catgtcactc atgtgttctg 840 attcttggaa acaagaagct gagacaggcc tctctgtcag tgctactgtg gctgaggtac 900 atgttcaaag atggggagcc ctcaggtcac aaagaattta gagaatcatc ttga 954 <210> 6 <211> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Gly Gly Val Ile Lys Ser Ile Phe Thr Phe Val Leu Ile Val Glu 1 5 10 15 Phe Ile Ile Gly Asn Leu Gly Asn Ser Phe Ile Ala Leu Val Asn Cys 20 25 30 Ile Asp Trp Val Lys Gly Arg Lys Ile Ser Ser Val Asp Arg Ile Leu 35 40 45 Thr Ala Leu Ala Ile Ser Arg Ile Ser Leu Val Trp Leu Ile Phe Gly 50 55 60 Ser Trp Cys Val Ser Val Phe Phe Pro Ala Leu Phe Ala Thr Glu Lys 65 70 75 80 Met Phe Arg Met Leu Thr Asn Ile Trp Thr Val Ile Asn His Phe Ser 85 90 95 Val Trp Leu Ala Thr Gly Leu Gly Thr Phe Tyr Phe Leu Lys Ile Ala 100 105 110 Asn Phe Ser Asn Ser Ile Phe Leu Tyr Leu Lys Trp Arg Val Lys Lys 115 120 125 Val Val Leu Val Leu Leu Leu Val Thr Ser Val Phe Leu Phe Leu Asn 130 135 140 Ile Ala Leu Ile Asn Ile His Ile Asn Ala Ser Ile Asn Gly Tyr Arg 145 150 155 160 Arg Asn Lys Thr Cys Ser Ser Asp Ser Ser Asn Phe Thr Arg Phe Ser 165 170 175 Ser Leu Ile Val Leu Thr Ser Thr Val Phe Ile Phe Ile Pro Phe Thr 180 185 190 Leu Ser Leu Ala Met Phe Leu Leu Leu Ile Phe Ser Met Trp Lys His 195 200 205 Arg Lys Lys Met Gln His Thr Val Lys Ile Ser Gly Asp Ala Ser Thr 210 215 220 Lys Ala His Arg Gly Val Lys Ser Val Ile Thr Phe Phe Leu Leu Tyr 225 230 235 240 Ala Ile Phe Ser Leu Ser Phe Phe Ile Ser Val Trp Thr Ser Glu Arg 245 250 255 Leu Glu Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ser Gln Val Met Gly Met Ala Tyr 260 265 270 Pro Ser Cys His Ser Cys Val Leu Ile Leu Gly Asn Lys Lys Leu Arg 275 280 285 Gln Ala Ser Leu Ser Val Leu Leu Trp Leu Arg Tyr Met Phe Lys Asp 290 295 300 Gly Glu Pro Ser Gly His Lys Glu Phe Arg Glu Ser Ser 305 310 315

Claims (182)

  1. 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드.
    Figure 112015024725280-pct00432

    상기 화학식에서,
    Ar6 및 Ar7은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 5원 또는 6원 아릴 기 또는 5원 또는 6원 헤테로아릴 기이고;
    Alk는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
    R36 및 R37은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 H, 또는 알킬이거나, 또는 R36 및 R37은 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 임의 치환된 5원 또는 6원 헤테로사이클을 형성하고;
    R38은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이다.
  2. 제1항에 있어서, R36 및 R37에 의해 형성된 5원 헤테로사이클이 히단토인, 또는 치환 또는 비치환 사이클릭 우레아인 화합물, 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드.
  3. 제1항에 있어서, R36 및 R37에 의해 형성된 5원 헤테로사이클이 히단토인인 화학식
    Figure 112015024725280-pct00526
    의 화합물(여기서, Ar6 및 Ar7은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 5원 또는 6원 아릴 기 또는 5원 또는 6원 헤테로아릴 기이고;
    Alk는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
    R38은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이고;
    R39 및 R40은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이거나, 또는
    R39 및 R40은 이들이 부착되어 있는 탄소원자와 함께 C=O 기 또는 치환 또는 비치환된 알케닐 기를 형성한다), 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드, 또는 화학식
    Figure 112015024725280-pct00500

    Figure 112015024725280-pct00501

    Figure 112015024725280-pct00502

    Figure 112015024725280-pct00503

    Figure 112015024725280-pct00504
    의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드.
  4. 제1항에 있어서, R36 및 R37에 의해 형성된 5원 헤테로사이클이 우라졸인 화학식
    Figure 112015024725280-pct00505
    의 화합물(여기서, Ar6 및 Ar7은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 5원 또는 6원 아릴 기 또는 5원 또는 6원 헤테로아릴 기이고;
    Alk는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
    R38은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이고;
    R41은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이다), 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드, 또는
    화학식
    Figure 112015024725280-pct00506

    Figure 112015024725280-pct00507
    의 화합물, 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드.
  5. 제1항에 있어서, R36 및 R37에 의해 형성된 6원 헤테로사이클이 6원 헤테로사이클인 하기 화학식의 화합물, 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드.
    Figure 112015024725280-pct00435

    상기 화학식에서,
    R38은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이고;
    R42, R43, R44, R45, 및 R46은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬이거나, 또는
    R42 및 R43, 또는 R45 및 R46은 이들이 부착되어 있는 탄소원자와 함께 C=O 기를 형성한다.
  6. 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드.
    Figure 112015024725280-pct00436

    상기 화학식에서,
    Alk는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
    M1은 N 또는 CR49이고, 여기서, R49는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
    M2는 N 또는 CR50이고, 여기서, R50는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
    R36 및 R37은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 H, 또는 알킬이거나, 또는,
    R36 및 R37은 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 임의 치환된 5원 또는 6원 헤테로사이클을 형성하고;
    R38은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이고;
    R47은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이고;
    R48은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이다.
  7. 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드.
    Figure 112015024725280-pct00437

    상기 화학식에서,
    Alk는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
    G는 C=O 이고,
    Q는 CR51R52 또는 NR51이고, 여기서,
    R51 및 R52는 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이거나, 또는
    R51 및 R52는 이들이 부착되어 있는 탄소원자와 함께 C=O 기 또는 치환 또는 비치환된 알케닐 기를 형성하고;
    M1은 N 또는 CR49이고, 여기서, R49는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
    M2은 N 또는 CR50이고, 여기서, R50는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
    R38은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이고;
    R47은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이고;
    R48은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이다.
  8. 인간 또는 동물이 섭취하는 조성물에 약 0.001 ppm 내지 약 100 ppm의 농도로 제3항 또는 제4항에 따른 적어도 하나의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 첨가함을 포함하는, 인간 또는 동물이 섭취하는 조성물의 쓴맛을 감소 또는 완화시키는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 조성물이 식품, 음료, 또는 의약인, 방법.
  10. (i) 제3항 또는 제4항에 따른 적어도 하나의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드 및 (ii) 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 조성물이 인간이 소비하는 식품, 음료 또는 의약인, 조성물.
  12. 쓴맛을 갖는 식품, 음료, 또는 의약인 조성물로서, 쓴맛을 제3항 또는 제4항에 따른 적어도 하나의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드를 첨가하여 완화 또는 감소시킨, 조성물.
  13. 조성물 중 적어도 하나의 쓴맛 화합물의 쓴맛이 제3항 또는 제4항에 따른 화합물, 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드에 의해 차단되는 지를 검출하거나 정량하기 위한 분석방법으로서,
    hT2R8 쓴맛 수용체를 활성화시키는 적어도 하나의 쓴맛 화합물을 함유하는 조성물을 접촉시키는 단계, 및
    상기 hT2R8 쓴맛 수용체의 활성화가 제3항 또는 제4항에 따른 화합물, 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드에 의해 차단 또는 억제되는 지를 검출하는 단계를 포함하며,
    제3항 또는 제4항에 따른 화합물, 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드가 길항물질 화합물인, 분석방법.
  14. 제13항에 있어서, 적어도 하나의 쓴맛 화합물 및 상기 길항물질 화합물을 별도로 및 조합하여 맛을 봐서 쓴맛이 길항물질 화합물에 의해 완화되는 것을 확인하는 미각 테스트를 추가로 포함하는, 분석방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 hT2R8 쓴맛 수용체가 세포막, 분리된 세포막, 완전한 세포, 진핵 세포, 양서류 세포, 포유동물 세포 또는 곤충 세포상에서 발현되는, 분석방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 진핵 세포가 HEK293 세포, BHK 세포, COS 세포, HEK293T 세포, CHO 세포 또는 제노푸스 난모세포인, 분석방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 분석이 형광 분석, 결합 분석, 형광 편광 분석 또는 고효율 분석인, 분석방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 분석이 세포내 이온 농도, 세포막 포텐셜, 리포터 유전자의 전사, 세포내 cAMP, cGMP 또는 IP3에 대한 효과 분석에 의한 상기 적어도 하나의 쓴맛 화합물의 효과; 인간 T2R 수용체-리간드 결합의 분광 특성, 수력학적 특성, 색층 특성 또는 용해도 특성의 변화; 또는 G 단백질과 인간 T2R 쓴맛 수용체의 복합체를 검출하는, 분석방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 세포내 이온이 나트륨 또는 칼슘인, 분석방법.
  20. 제8항에 있어서, 상기 적어도 하나의 화합물의 농도가 약 0.1 ppm 내지 약 100 ppm인, 방법.
  21. 제8항에 있어서, 상기 적어도 하나의 화합물의 농도가 약 1 ppm 내지 약 25 ppm인, 방법.
  22. 제12항에 있어서, 음료 조성물이 휴대용, 가용성 또는 건조 커피 음료; 커피 음료 믹스, 커피 음료 농축액, 커피 음료용 낙농 크리머, 비낙농 크리머 또는 분말크림; 치약, 구강세정제 또는 츄잉검; 또는 비-식용 제품이고, 상기 비-식용 제품이 보충물, 기능식품, 기능성 식품, 조제약, 일반 의약품, 구강 케어 제품 또는 화장품인, 식품, 음료 또는 의약 조성물.
  23. 화학식
    Figure 112015024725280-pct00450
    의 화합물(여기서, R47, R48, Alk, M1, 및 M2는 하기 정의한 바와 같다)을 가열하여 -CON3 기를 -N=C=O 기로 전환시킨 다음, 화학식
    Figure 112015024725280-pct00451
    의 화합물(여기서, J3는 이탈기이고, R38, R51, 및 R52는 하기 정의한 바와 같다)과 반응시킴을 포함하는, 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드의 제조 방법.
    Figure 112015024725280-pct00452

    상기 화학식에서,
    Alk는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
    R51 및 R52은 서로 독립적으로 동일 또는 상이한 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이거나, 또는
    R51 및 R52는 이들이 부착되어 있는 탄소원자와 함께 치환 또는 비치환된 알케닐 기를 형성하고;
    M1은 N 또는 CR49이고, 여기서, R49는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
    M2은 N 또는 CR50이고, 여기서, R50는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
    R38은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이고;
    R47은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이고;
    R48은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이다.
  24. 화학식
    Figure 112015024725280-pct00453
    의 화합물(여기서, R47, R48, Alk, M1, 및 M2는 하기 정의한 바와 같다)을 가열하여 -CON3 기를 -N=C=O 기로 전환시킨 다음, 화학식
    Figure 112015024725280-pct00454
    의 히드라진(여기서, R38는 하기 정의한 바와 같다)과 반응시킴을 포함하는, 하기 화학식의 화합물 또는 이의 염, 수화물, 용매화물 또는 N-옥사이드의 제조 방법.
    Figure 112015024725280-pct00455

    상기 화학식에서,
    Alk는 헤테로원자에 의해 임의로 방해된 알킬 기이고;
    R52은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이고;
    M1은 N 또는 CR49이고, 여기서, R49는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
    M2은 N 또는 CR50이고, 여기서 R50는 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
    R38은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴아미도알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴알콕시, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 또는 할로알킬이고;
    R47은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이고;
    R48은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 알콕시, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아릴알킬, 또는 할로이다.
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