KR20190140945A

KR20190140945A - NRG1 융합 유전자를 가지는 세포를 치료하기 위한 ErbB-2 및 ErbB-3 결합 이중특이적 항체

Info

Publication number: KR20190140945A
Application number: KR1020197032398A
Authority: KR
Inventors: 마크 스로스비; 세실리아 안나 윌헬미나 게위젠; 다비드 안드레 밥티스테 마우상-디테일레; 톤 로그텐베르그
Original assignee: 메뤼스 엔.페.
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2018-04-03
Publication date: 2019-12-20
Also published as: US20200102393A1; PH12019550202A1; AU2018246873B2; AU2018246873A1; CN110650752A; MX2019011660A; WO2018182422A1; EP3600413A1; IL310223A; IL269656A; US11780925B2; WO2018182422A8; BR112019020508A2; JP2020511993A; SG11201908971RA; IL269656B1; EA201992063A1; CA3058343A1

Abstract

본 발명은 항체 분야에 관한 것으로, 구체적으로는 ErbB-2/ErbB-3 양성 세포를 치료하기 위한 치료용 (인간)항체에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 상이한 염색체 위치의 서열에 융합된 NRG1 유전자의 적어도 일부분을 포함하는 NRG1-융합 유전자를 포함하는 종양의 치료에 관한 것이다.

Description

NRG1 융합 유전자를 가지는 세포를 치료하기 위한 ErbB-2 및 ErbB-3 결합 이중특이적 항체

본 출원은 2017년 3월 31일에 출원되고 그 내용이 본 명세서에 참조로서 삽입되어 있는 유럽출원 제17164292.9호에 대한 우선권 주장 출원이다.

NRG1(뉴레굴린-1)은 후보 종양 유전자로도, 후보 종양 억제 유전자로도 제안되어 왔다. 이 유전자는 ErbB-패밀리 수용체에 결합하는 리간드를 인코딩하기 때문에 상피성 암과 관련이 있다. 지금까지, NRG1 유전자로부터 유래한 16개가 넘는 가용성인 막관통 단백질이 보고되었다. 막관통 NRG1의 동형 단백질(isoform)들의 세포외 도메인이 분해되는 동안 가용성 인자들이 방출된다. HRG1-β1은 이 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 중 하나로서, Ig 도메인과, 수용체 티로신 인산화효소인 ErbB-3 및 ErbB-4과의 직접 결합에 필수적인 EGF-유사 도메인을 포함한다. NRG1 유전자 및 이의 동형 유전자(아형, isoform)들은 다음과 같은 수많은 별칭으로도 불리운다: 뉴레굴린 1; Pro-NRG1; HRGA; SMDF; HGL; GGF; NDF; NRG1 Intronic Transcript 2 (Non-Protein Coding); 헤레굴린, Alpha(45kD, ERBB2 P185-Activator); Acetylcholine Receptor-Inducing Activity; Pro-뉴레굴린-1, 막-결합 아형; Sensory And Motor Neuron Derived Factor; Neu 분화 Factor; Glial Growth Factor 2; NRG1-IT2; MSTP131; MST131; ARIA; GGF2; HRG1; 및 HRG. NRG1 유전자의 외부 ID는 HGNC: 7997; Entrez Gene: 3084; Ensembl: ENSG00000157168; OMIM: 142445 및 UniProtKB: Q02297 이다.

NRG1의 동형 단백질은 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 만들어지며, 막관통 형태, 외부에서 막에 결합한 형태, 분비된 형태 또는 세포 내에 존재하는 형태를 포함한다(Falls, 2003; Hayes and Gullick, 2008). 이들 단백질은 ErbB-3 또는 ErbB-4에 결합하여 (HER2)와 헤테로다이머를 이룬다. NRG1-인코딩된 단백질들은 대개 미토겐인 것으로 생각되나, 이들은 또한 강하게 세포사멸을 유발할 수 있으며, 특히 NRG1를 발현하는 세포는 이의 발현에 의해 사멸에 이를 수 있다(Weinstein et al., 1998).

The NRG1 유전자는 명백히 모순된 두가지 관점에서 종양과 밀접한 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 첫째, 이 유전자는 8번 염색체p[8번 염색체 단완(short arm)] 상에 존재하는 것으로 여겨지는 주요한 종양 억제 유전자 후보이다. 8번 염색체p의 손실은 유방암, 대장암, 방광암 및 전립선암을 포함하는 상피성 암에서의 가장 흔한 유전적 현상이다. 이는 이형접합성 상실, 비교유전체보합법(CGH) 및 어레이-CGH 연구(Birnbaum et al., 2003; Pole et al., 2006 참조)를 통해 성공적으로 입증되었다. 이러한 8번 염색체p의 손실은 전통적으로 종양 억제 유전자가 존재한다는 것으로 해석되었다. 암종 세포주에서 8번 염색체p의 손실을 형광-인 시투 혼성화 및 어레이-비교유전체보합법(array-CGH)을 이용하여 맵핑하였다. 대부분의 손실은 NRG1 가까이 혹은 실제 NRG1 내부에서 발생함으로써 NRG1 및 NRG1 말단에 위치한 유전자가 주요 종양 억제자 후보가 되었다(Pole et al., 2006; Cooke et al., 2008). 둘째로, NRG1는 유방암에서 염색체 이동의 타겟으로 예상되므로, 종양 유전자일 수 있다(Chua et al 2009 참조).

본 발명에서는 8번 염색체p 변형을 수반하는 종양이 의 세포외 부위에 결합하는 제1 항원-결합 부위와 ErbB-3의 세포외 부위에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체에 노출될 경우 성장이 억제된다는 사실을 발견하였다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 ErbB-2의 세포 외 부위에 결합할 수 있는 제1 항원-결합 부위와 ErbB-3의 세포 외 부위와 결합할 수 있는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포를 가지는 개체를 치료하는 방법으로, 상기 세포는 상이한 염색체 위치의 서열에 융합된 NRG1-유전자의 적어도 일부분을 포함하는 NRG1 융합 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

상기 세포는 암세포일 수 있다. 상기 암세포는 NRG1-융합에 의해 생성된 NRG1-융합 유전자 관련 암세포일 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 ErbB-2의 세포 외 부위에 결합할 수 있는 제1 항원-결합 부위와 ErbB-3의 세포 외 부위와 결합할 수 있는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 종양을 가지거나 상기 종양에 결릴 위험이 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 상기 종양 세포는 적어도 상이한 염색체 위치의 서열, 예를 들어 5’서열에 융합된 NRG1-유전자의 융합 부분, 예를 들어 3’말단을 포함하는 NRG1 융합 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

ErbB-2 및 ErbB-3 양성 종양에 결릴 위험이 있는 개체는 관해 상태의 개체일 수 있다.

바람직하게는, 상기 NRG1-융합 유전자는 NRG1 EGF-유사 도메인을 포함하는 단백지질을 발현한다. 바람직하게는, 상기 NRG-융합은 NRG1과 인간 8번 염색체 상의 유전자 간의 융합이다. 바람직하게는, 상기 인간 8번 염색체 상의 유전자는 분비된 단백질 또는 세포막 관련 단백질을 인코딩한다. 바람직하게는, 상기 NRG1 융합 유전자는 CD74; DOC4; TNFRSF10B; CLU; VAMP2; SLC3A2; RBPMS; WRN; SDC4; KIF13B; SLECA2; PDE7A; ATP1B1; CDK1; BMPR1B; MCPH1 및 RAB2IL1로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자의 5’서열과 NRG1-유전자의 3’말단의 융합이다.

바람직하게는, 상기 세포 상피 세포이다. 바람직하게는, 상기 세포는 유방암세포, 난소암세포, 비소세포 폐암과 같은 폐암세포 또는 이들의 전이이다.

바람직하게는, 상기 종양은 상피성 유래이다. 바람직하게는, 상기 종양은 유방암, 난소암, 폐암 또는 이들의 전이이다.

상기 세포는 암세포, 예를 들어 CLU-NRG1 융합 또는 RAB2IL1-NRG1를 포함하는 난소암 세포일 수 있다.

상기 세포는 암세포, 예를 들어 DOC4-NRG1 융합을 포함하는 유방암세포일 수 있다.

상기 세포는 암세포, 예를 들어 VAMP2-NRG1, RBPMS-NRG1, WRN-NRG1, SDC4-NRG1, SLEC3A2-NRG1, KIF13B-NRG1 또는 CD74-NRG1를 포함하는, 침습 점액 선암이라 불리는 아형과 같은 NSCLC(폐)암일 수 있다.

바람직하게는, 상기 개체는 EGFR 억제를 타겟으로 하는 치료를 받았으며, 바람직하게는 EGFR 결합 항체, 보다 바람직하게는 세툭시맙(cetuximab)을 이용한 치료를 받은 개체일 수 있다.

바람직하게는, 상기 방법은 상기 종양의 세포에서 ErbB-1 세포-표면 수용체 밀도; ErbB-2 세포-표면 수용체 밀도; ErbB-3 세포-표면 수용체 밀도; ErbB-4 세포-표면 수용체 밀도 또는 이들의 조합을 결정하는 단계를 추가적으로 포함한다. 바람직하게는, 상기 세포 또는 종양은 세포 당 400,000개 미만의 ErbB-1 세포-표면 수용체를 가지며, 바람직하게는 세포 당 200.000개 미만의 ErbB-1 세포-표면 수용체를 가진다.

바람직하게는, 상기 방법은 ErbB-1 억제제, 바람직하게는 세툭시맙을 개체에 투여하하는 단계를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 방법에서, 바람직하게는 ErbB-2/ErbB-3 양성 세포 또는 종양은 세포 당 50,000개 미만의 ErbB-3 세포-표면 수용체를 가진다.

본 발명의 방법에서, 바람직하게는 상기 세포 또는 상기 종양의 세포는 MCF7 세포에 비해 헤레굴린(heregulin) 발현 수준이 높다.

당업자에게 자명한 바와 같이, 본 발명의 이중특이적 항체는 치료용 의약의 제조에 사용될 수 있다.

특히 ErbB-2의 세포 외 부위에 결합할 수 있는 제1 항원-결합 부위와 ErbB-3의 세포 외 부위와 결합할 수 있는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체는 적어도 상이한 염색체 위치의 5’서열에 융합된 NRG1-유전자의 3’말단을 포함하는 NRG1-융합 유전자를 포함하는 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포를 가지는 개체를 치료하는 데에 사용될 수 있다.

상기 세포는 암세포일 수 있다. 상기 암세포는 NRG1-융합에 의해 생성된 암세포와 같은, NRG1-융합과 관련된 암세포일 수 있다.

아울러, 상기 이중특이적 항체는 종양 내 세포가 상이한 염색체 위치의 5’서열에 융합된 NRG1-유전자의 3’말단을 포함하는 NRG1-융합 유전자를 포함하는 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양을 치료하기 위한 용도로 사용될 수 있다.

바람직하게는 본 발명의 방법 및 용도에서, 상기 제1 항원-결합 부위는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하고, 상기 제2 항원-결합 부위는 ErbB-3의 도메인 Ⅲ에 결합하며, 바람직하게는 제1 항원-결합 부위의 ErbB-2에 대한 친화도가 제2 항원-결합 부위의 ErbB-3에 대한 친화도보다 낮다. 바람직하게는 상기 이중특이적 항체는 다음을 포함한다:

i) 적어도 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 및 MF1898로 구성된 군으로부터 선택되는 ErbB 2 특이적 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 또는 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 또는 MF1898의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 최대 3개 아미노산, 바람직하게는 최대 2개 아미노산, 바람직하게는 최대 1개 아미노산이 상이한 CDR 서열; 및 /또는

ii) 적어도 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074로 구성된 군으로부터 선택되는 ErbB 3 특이적 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 최대 3개 아미노산, 바람직하게는 최대 2개 아미노산, 바람직하게는 최대 1개 아미노산이 상이한 CDR 서열; 바람직하게는

i) MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 및 MF1898의 중쇄 가변영역 서열으로 구성된 군으로부터 선택되는 ErbB 2 특이적 중쇄 가변영역 서열, 또는 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 또는 MF1898의 중쇄 가변영역 서열과 최대 15개 아미노산이 상이한 중쇄 가변영역 서열; 및/또는

ⅱ) MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074의 중쇄 가변영역 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 ErbB 3 특이적 중쇄 가변영역 서열 또는 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 중쇄 가변영역 서열과 최대 15개 아미노산이 상이한 중쇄 가변영역 서열.

바람직하게는, 상기 항체는 적어도 ErbB-2 특이적 중쇄 가변영역 MF3958의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 이중특이적 항체는 서열 목록 파트 1D에서 기재한 바와 같이“erbB-2 결합을 위한 중쇄” 및 “erbB-3 결합을 위한 중쇄”를 포함한다.

바람직하게는, 상기 제1 항원 결합 부위와 상기 제2 항원 결합 부위는 IgVKl-39 유전자 단편, 가장 바람직하게는 가장 바람직하게는 재배열된 생식계열 인간 kappa 경쇄 IgVKl-39*01/IGJKl*01를 포함한다. 바람직하게는 상기 경쇄 가변영역은 서열 (RASQSISSYLN)을 가지는 CDR1, 서열 (AASSLQS)을 가지는 CDR2 및 서열 (QQSYSTPPT)을 가지는 CDR3를 포함한다.

[과제해결수단]

NRG1 융합 유전자는 상이한 염색체 위치의 서열과 융합된 NRG1-유전자의 적어도 일부분을 포함한다. “적어도 일부분”은 전체 NRG-1 유전자 또는 그 일부가 융합 상태에 있을 수 있음을 의미한다. 바람직하게는 상기 융합부위는 적어도 엑손 6, 7 및 8의 코딩 서열을 포함한다. NRG1-융합 유전자에서 NRG1 부분은 NRG1의 EGF-유사 도메인을 포함하고 있다는 특징으로도 정의될 수 있다. NRG1 유전자의 적어도 일부분은 상이한 염색체 위치의 서열에 융합됨으로써 NRG1 유전자의 적어도 일부분의 5’또는 3’에 위치할 수 있다.

바람직하게는, NRG1-유전자의 3’말단은 상이한 염색체 위치의 5’서열에 융합할 수 있다. NRG1-유전자는 NRG1의 다양한 동형 단백질을 코딩한다. 다양한 동형 단백질 및 이들의 예상되는 기능은 Adelaide 등(2003)에 기재되어 있다. GGF 및 GGF2 동형 단백질은 크링글(kringle)-유사 서열과 Ig 및 EGF-유사 도메인을 함유하고 있고, SMDF 동형 단백질은 다른 동형 단백질과 EGF-유사 도메인만을 공유한다. EGF-유사 도메인은 유전자의 3’말단에 의해 인코딩된다. EGF-유사 도메인은 본 발명의 모든 NRG1 융합 유전자에 존재한다. 융합은 상이한 염색체 위치의 5’이 적어도 하나의 세포외 도메인과 함께 분비 신호 및/또는 세포막 단백질의 막관통 도메인을 포함하는 경우에 일어났다. CD74-NRG1 융합이 그 예이다. 상이한 염색체 위치의 5’서열은 NRG1의 전사를 활성화시키는 서열, 예를 들어 프로모터나 인핸서를 삽입할 수 있다. 5’서열은 NRG1와 상이한 유전자에서 유래한 서열이다. 상기 서열은 코딩 부위, 프로모터나 인핸서 같은 발현조절서열 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. NRG-융합은 상이한 위치의 5’서열을 포함하는데 이러한 상이한 위치는 상이한 염색체 또는 8번 염색체의 또 다른 부분일 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면 5’서열은 인간 8번 염색체 상의 유전자에서 유래한다.

NRG1-유전자, 예를 들어 NRG-1 유전자의 3’말단은 바람직하게는 적어도 엑손 6, 7 및 8의 코딩 서열을 가진다. NRG1-융합 유전자에서 NRG1 부분은 NRG1의 EGF-유사 도메인을 포함하고 있다는 특징으로도 정의될 수 있다. 이 도메인은 NRG1 유전자의 3’말단(엑손 6-8)에 의해 인코딩되고 ErbB-3와의 결합에 필수적이다. NRG1-융합은 융합의 3’말단에서의 EGF-유사 도메인에 대한 프레임 코딩 부위를 유지한다.

EGF-유사 도메인은 원형(prototype)이 표피성장인자(EGF)[PMID: 2288911, PMID: 6334307, PMID: 1522591, PMID: 6607417, PMID: 3282918, PMID: 11498013]에서 발견되는, 전형적으로 30-40개 아미노산 잔기 길이를 가지는 서열이다. 이 서열은 수많은 다른, 주로 동물 단백질에서 다소간의 보존된 형태로 존재하는 것으로 알려졌다. EGF-유사 도메인의 일반적인 특징은 이들이 막-결합 단백질의 세포외 도메인 또는 분비되는 것으로 알려진 단백질에서 발견된다는 것이다(예외: 프로스타글란딘 G/H 합성효소). EGF 도메인은 전형적으로 (EGF에서) 이황화 결합에 참여하는 것으로 보이는 6개의 시스테인 잔기를 가진다. 주요 구조는 이중가닥 베타-쉬트 뒤에 C-말단의 짧은 이중가닥 쉬트로 루프가 이어지는 구조이다. 보존된 시스테인 간의 서브도메인은 길이가 다양하다.

NRG1 융합 유전자는 바람직하게는 NRG1-유전자의 3’말단과 CD74; DOC4; TNFRSF10B; CLU; VAMP2; SLC3A2; RBPMS; WRN; SDC4; KIF13B; SLECA2; PDE7A; ATP1B1; CDK1; BMPR1B; MCPH1 및 RAB2IL1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 유전자의 5’서열이 융합되었다.

NRG1 융합 유전자는 NRG1-유전자의 적어도 일부분과 상이한 염색체 위치의 3’서열이 융합된 것일 수 있다. 이러한 NRG1 융합 유전자는 NRG1-유전자의 최소 일부분과 상이한 염색체 위치인 CD74, STMN2, PMEPA1, PROSC 또는 PSAP의 3’과의 융합일 수 있다. 모든 NRG1 동형 단백질에 대한 수용체는 티로신 키나아제 막관통 수용체의 ErbB 패밀리이다. 패밀리는 인간 표피성장인자(EGF) 수용체 패밀리(HER)로 불리기도 한다. 이 패밀리는 ErbB(Erythroblastoma)-1, ErbB-2, ErbB-3 및 ErbB-4의 4개의 단백질이 포함된다. 표피성장인자(EGF) 수용체(EGFR, ErbB1 또는 HER1). 수용체는 상피 세포에서 광범위하게 발현된다(Yarden and Pines 2012). HER 수용체 또는 헤레굴린(HRG) 또는 표피성장인자(EGF)와 같은 이들의 리간드의 증가는 인간 암에서 흔히 발생한다(Wilson, Fridlyand et al. 2012). ErbB-1 및 ErbB-2의 과발현은 특히 상피성 종양에서 일어나며 종양 침습, 전이, 화학치료에 대한 내성 및 불량한 예후와 관련되어 있다(Zhang, Berezov et al. 2007). 정상인의 유방에서, ErbB-3는 내강 상피의 성장과 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 예를 들어, ErbB-3의 소실/억제는 내강 상피 위의 기저 세포의 선택적인 증식을 야기한다(Balko, Miller et al. 2012). RTK의 세포외 도메인에 리간드가 결합하면 동일하거나(호모다이머화) 상이한(헤테로다이머화) 수용체 아형 간의 다이머화가 유도된다. 다이머화는 세포 내 티로신 키나아제 도메인을 활성화시킴으로써 자가인산화를 거쳐 MAPK(mitogen-activated protein kinases)에 의해 매개되는 경로 및 전생존성(prosurvival) 경로인 Akt(reviewed in Yarden and Pines, 2012)를 포함하는 수많은 다운스트림의 전-증식성 신호경로를 활성화시킬 수 있다. ErbB-2에 특이적인 내재적 리간드가 동정된 적은 없으므로, 헤테로다이머화를 통해 신호가 전달될 것으로 여겨진다(Sergina, Rausch et al. 2007). ErbB-3은 리간드와의 결합을 통해 활성화된다. 이들 리간드는 뉴레굴린(NRG) 및 헤레굴린(HRG)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

ErbB-1은 다양한 동의어를 가지며, 이중 가장 잘 알려진 것은 EGFR이다. EGFR은 리간드 결합에 관여하는 2개와 호모다이머화 및 헤테로다이머화에 관여하는 2개의, 총 4개의 서브도메인으로 구성된 세포외 도메인(ECD)을 가진다. EGFR은 다양한 리간드에서 보내온 세포외 신호를 통합하여 여러 가지 세포 내 반응을 생성한다. EGFR에 의해 활성화되는 주요 신호전달 경로는 Ras-MAPK(mitogen-activated protein kinase) 세포분열 신호 전달계로 구성된다. 이 경로의 활성화는 티로신 인산화된 EGFR과 Grb2가 결합함으로써 개시된다. 이는 Grb2-결합 Ras-구아닌 뉴클레오타이드 교환 인자인 SOS(Son of Sevenless)를 통해 Ras의 활성화를 유발한다. 나아가, PI3-키나아제-Akt 신호전달 경로 역시 EGFR에 의해 활성화되며, 이러한 활성화는 ErbB-3(HER3)와 공발현될 경우 훨씬 강해진다. EGFR는 몇몇 인간의 상피성 악성 종양, 주로 유방암, 방광암, 비소세포 폐암, 대장암, 난소암 두경부암 및 뇌암과 관련이 있다. 수용체 및 이의 리간드의 과발현 뿐 아니라 유전자의 활성화 돌연변이도 자가분비 활성화의 순환 고리를 야기한다. 이러한 RTK는 암치료를 위한 타겟으로 널리 사용되었다. RTK를 타겟팅하는 저분자 억제제와 세포외 리간드-결합 도메인에 결합하는 단클론 항체(mAb)가 개발되어 지금까지 몇몇 임상적인 성공을 거두었으나 이는 일부 선정된 환자들에게만 효과가 있었다. 인간 EGFR 단백질 및 이를 인코딩하는 유전자의 데이터베이스 접근번호는 (GenBank NM_005228.3)이다. 이 접근번호는 타겟으로서의 EGFR 단백질을 동정하는 추가적인 방법을 제공한다. 항체와 결합하는 EGFR 단백질의 실제 서열은 다양할 수 있는데, 이는 예를 들어 몇몇 암 등에서 발생하는 인코딩 유전자의 돌연변이 때문일 수 있다.

본 명세서에서 용어“암”과“종양”은 특별히 달리 언급되지 않는 한 전형적으로 모두“암”을 의미한다.

본 명세서에서 EGFR를 언급할때, 특별히 달리 언급되지 않는 이상 인간 EGFR를 의미한다. EGFR에 결합하는 항원-결합 부위는 EGFR와 몇몇 EGFR 양성 종양에서 발현되는 이의 다양한 변이체에 결합한다.

본 명세서에서 용어‘ErbB-3’은 인간에서 ERBB3에 의해 인코딩되는 단백질을 의미한다. 이들 유전자 또는 단백질의 또 다른 이름은 다음과 같다: HER3; LCCS2; MDA-BF-1; c-ErbB-3; c-ErbB3; ErbB3-S; p180-ErbB3; p45-sErbB3; 및 p85-sErbB3. 본 명세서에서 ErbB-3를 언급할 때, 인간 ErbB-3를 의미한다. 항원-결합 부위를 가지는 ErbB-3에 대한 항체는 인간 ErbB-3과 결합한다. ErbB-3 항원-결합 부위는 인간과 다른 포유류 오솔로그(ortholog) 간의 서열 및 3차 구조의 유사성으로 인해 이러한 오솔로그에도 결합할 수 있으나 필연적으로 결합하는 것은 아니다. 인간 ErbB-3 단백질 및 이를 인코딩하는 유전자의 데이터베이스 접근번호는 (NP_001005915.1, NP_001973.2, NC_000012.11, NC_018923.2, NT_029419.12) 이다. 이 접근번호는 타겟으로서의 ErbB-3을 동정하는 추가적인 방법을 제공한다. 항체와 결합하는 ErbB-3 단백질의 실제 서열은 다양할 수 있는데, 이는 예를 들어 몇몇 암 등에서 발생하는 인코딩 유전자의 돌연변이 때문일 수 있다. ErbB-3 항원 결합 부위는 ErbB-3와 몇몇 ErbB-3 양성 종양에서 발현되는 이의 다양한 변이체에 결합한다. ErbB-3에 결합하는 항원-결합 부위는 바람직하게는 ErbB-3의 도메인 Ⅲ에 결합한다.

본 명세서에서 용어‘ErbB-2’는 인간에서 ERBB-2 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 의미한다. 이 유전자 또는 단백질의 또 다른 이름은 다음을 포함한다: CD340; HER-2; HER-2/neu; MLN 19; NEU; NGL; TKR1. ERBB-2 유전자는 종종 HER2로 불리운다(“Human Epidermal Growth factor Receptor 2”에서 유래함). 본 명세서에서 ErbB-2를 언급할 때, 인간 ErbB-2를 의미한다. 항원-결합 부위를 가지는 ErbB-2에 대한 항체는 인간 ErbB-2와 결합한다. ErbB-2 항원-결합 부위는 인간과 다른 포유류 오솔로그(ortholog) 간의 서열 및 3차 구조의 유사성으로 인해 이러한 오솔로그에도 결합할 수 있으나 필연적적으로 결합하는 것은 아니다. 인간 ErbB-2 단백질 및 이를 인코딩하는 유전자의 데이터베이스 접근번호는 (NP_001005862.1, NP_004439.2 NC_000017.10 NT_010783.15 NC_018928.2)이다. 이 접근번호는 타겟으로서의 ErbB-2를 동정하는 추가적인 방법을 제공한다. 항체와 결합하는 ErbB-2 단백질의 실제 서열은 다양할 수 있는데, 이는 예를 들어 몇몇 암 등에서 발생하는 인코딩 유전자의 돌연변이 때문일 수 있다. ErbB-2 항원 결합 부위는 ErbB-2와 몇몇 ErbB-2 양성 세포 또는 종양 세포에서 발현되는 것과 같은 이의 다양한 변이체에 결합한다. ErbB-3에 결합하는 항원-결합 부위는 바람직하게는 ErbB-3의 도메인 Ⅲ에 결합한다. ErbB-2에 결합하는 항원-결합 부위는 바람직하게는 ErbB-2의 도메인 Ⅰ에 결합한다.

CD74는 다양한 별칭으로도 알려져 있으며 그중 일부는 다음과 같다: CD74 분자; CD74 항원(주조직적합 복합체의 불변 폴리펩타이드, Ⅱ형 항원(Invariant Polypeptide Of Major Histocompatibility Complex, Class Ⅱ Antigen); CD74 분자, 주조직적합 복합체, Ⅱ형 불변쇄 (Major Histocompatibility Complex, Class Ⅱ Invariant Chain); HLA-DR 항원-관련 불변쇄(Antigens-Associated Invariant Chain); Ⅱ형 항원의 감마쇄(Gamma Chain Of Class Ⅱ Antigens); Ia-관련 불변쇄(Ia-Associated Invariant Chain); MHC HLA-DR 감마쇄(Gamma Chain); HLA-DR-감마(Gamma); DHLAG; P33; HLA 2형 주조직적합 항원 감마쇄(Class Ⅱ Histocompatibility Antigen Gamma Chain); Ia 항원-관련 불변쇄(Antigen-Associated Invariant Chain); Ia-GAMMA 및 HLADG. CD74에 대해 외부에서 사용하는 Id는 HGNC: 1697; Entrez Gene: 972; Ensembl: ENSG00000019582; OMIM: 142790 및 UniProtKB: P04233 이다.

DOC4 또는 테네우린 막관통 단백질 4(TENM4)은 Protein Odd Oz/Ten-M Homolog 4; Tenascin-M4; Ten-M4; Ten-4; ODZ4; TNM4; Odz, Odd Oz/Ten-M Homolog 4 (초파리); Odz, Odd Oz/Ten-M Homolog 4; 테네우린-4; KIAA1302; Doc4; 및 ETM5과 같은 많은 다른 이름을 가진다. DOC4에 대해 외부에서 사용하는 Id는 HGNC: 29945; Entrez Gene: 26011; Ensembl: ENSG00000149256; OMIM: 610084 및 UniProtKB: Q6N022이다.

TNFRSF10B 또는 TNF 수용체 수퍼패밀리 멤버 10b는 종양괴사인자 수용체 수퍼패밀리, 멤버 10b; TNF-관련 세포사멸-유도 리간드 수용체 2(TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptor 2); Death Receptor 5; TRAIL-R2; TRAILR2; KILLER; TRICK2; ZTNFR9; DR5; P53-조절된 DNA 손상-유도 세포사 수용체(P53-Regulated DNA Damage-Inducible Cell Death Receptor)(Killer); 종양괴사인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 10B; 종양 괴사인자 수용체-유사 단백질 ZTNFR9; Death Domain Containing Receptor For TRAIL/Apo-2L; 세포사멸 유도 단백질 TRICK2A/2B; 세포사멸 유도 수용체 TRAIL-R2; Cytotoxic TRAIL Receptor-2; Fas-유사 단백질; TRAIL Receptor 2; CD262 항원; KILLER/DR5; TRICK2A; TRICK2B; TRICKB; 및 CD262와 같은 많은 다른 이름으로 알려져 있다. TNFRSF10B에 대해 외부에서 사용하는 Id는 HGNC: 11905; Entrez Gene: 8795; Ensembl: ENSG00000120889; OMIM: 603612; 및 UniProtKB: O14763이다.

The CLU 유전자 또는 클러스테린(Clusterin)은 테스토스테론-억제된 전립선 메세지 2(Testosterone-Repressed Prostate Message 2); 아포지단백질 J; 보체-결합 단백질 SP-40,40; 보체 세포용해 억제제; 보체 세포용균 억제제; 황화 당단백질 2(Sulfated Glycoprotein 2; Ku70-결합 단백질 1; NA1/NA2; TRPM-2; APO-J; APOJ; KUB1; CLI; 클러스테린(Clusterin, (Complement Lysis inhibitor, SP-40,40, 황화 당단백질 2, 테스토스테론-억제된 전립선 메세지 2, 아포지단백질 J); 연령-관련 유전자 4 단백질(Aging-Associated Gene 4 Protein); 연령 관련 단백질 4(Aging-Associated Protein 4); SGP-2; SP-40; TRPM2; AAG4; CLU1; CLU2; 및 SGP2와 같은 많은 다른 이름으로 알려져 있다. CLU에 대해 외부에서 사용하는 Id는 HGNC: 2095; Entrez Gene: 1191; Ensembl: ENSG00000120885; OMIM: 185430; 및 UniProtKB: P10909이다.

VAMP2 또는 소포체 결합 막단백질 2(Vesicle Associated Membrane 단백질 2)는 시냅토브레빈 2(synaptobrevin 2); SYB2; 소포체 결합 막단백질 2; 및 시냅토브레빈-2와 같은 다른 이름으로 알려져 있다. VAMP2에 대해 외부에서 사용하는 Id는 HGNC: 12643; Entrez Gene: 6844; Ensembl: ENSG00000220205; OMIM: 185881; 및 UniProtKB: P63027이다.

SLCA3A2 또는 용질 담체 패밀리 2 멤버 3(Solute Carrier family 3 Member 2)는 림프구 활성화 항원 4F2 큰 서브유닛(Lymphocyte Activation Antigen 4F2 Large Subunit); 용질 담체 패밀리 3(이염기성 및 중성 아미노산 수송 활성화제), 멤버 2; 단클론 항체 4F2에 의해 인식되는 항원, TRA1.10, TROP4, And T43; 용질 담체 패밀리 3 (아미노산 수송체 중쇄), 멤버 2; 4F2 세포-표면 항원 중쇄; CD98 중쇄; 4F2HC; MDU1; 단클론 항체 4F2에 의해 인식되는 항원, 중쇄; 단클론 항체 4F2에 의해 인식되는 항원; 4F2 중쇄 항원; 4F2 중쇄; CD98 항원; CD98HC; 4T2HC; NACAE; CD98 및 4F2와 같은 다른 이름으로 알려져 있다. SLC3A2에 대해 외부에서 사용하는 Id는 HGNC: 11026; Entrez Gene: 6520; Ensembl: ENSG00000168003; OMIM: 158070; 및 UniProtKB: P08195이다.

RBPMS 또는 다중 스플라이싱을 수반하는 RNA 결합 단백질(RNA Binding Protein With Multiple Splicing)은 심장 및 RRM 발현 서열(Heart And RRM Expressed Sequence); HERMES; 스플라이싱을 수반하는 RNA-결합 단백질; 및 RBP-MS와 같은 다른 이름으로 알려져 있다. RBPMS에 대해 외부에서 사용하는 Id는 HGNC: 19097; Entrez Gene: 11030; Ensembl: ENSG00000157110; OMIM: 601558; 및 UniProtKB: Q93062이다.

WRN 또는 베르너 증후군 RecQ 유사 헬리케이스(Werner Syndrome RecQ Like Helicase)는 베르너 증후군 RecQ 유사 헬리케이스; DNA 헬리케이스, RecQ-유사 타입 3; RecQ 단백질-유사 2; 엔도뉴클리에이즈 WRN; RECQL2; RECQ3; 베르너 증후군 ATP-의존성 헬리케이스; 베르너 증후군, RecQ 헬리케이스-유사; 베르너 증후군; EC 3.6.4.12; EC 3.1.-.-; EC 3.6.1; 및 RECQL3와 같은 다른 이름으로 알려져 있다. WRN에 대해 외부에서 사용하는 Id는 HGNC: 12791; Entrez Gene: 7486; Ensembl: ENSG00000165392; OMIM: 604611 및 UniProtKB: Q14191.

SDC4 또는 신데칸 4(Syndecan 4)는 Syndecan 4(앰피클리칸(Amphiglycan), 류도칸(Ryudocan)); 신데칸 프로테오글리칸 4(Syndecan Proteoglycan 4); 류도칸 코어 단백질; 앰피클리칸; SYND4; 류도칸 앰피클리칸; 및 신데칸-4와 같은 다른 이름으로 알려져 있다. SDC4에 대해 외부에서 사용하는 Id는 HGNC: 10661; Entrez Gene: 6385; Ensembl: ENSG00000124145; OMIM: 600017; 및 UniProtKB: P31431이다.

다양한 NRG1 융합 유전자는 Dhanasekaran 등(2014)에 기재되어 있다.

본 발명은 ErbB-2 및 ErbB-3 양성세포 또는 종양을 가진 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 혹은, 상기 개체는 종양에 걸릴 위험이 있는 개체일 수 있다. 상기 방법은 ErbB-2의 세포 외 부위에 결합할 수 있는 제1 항원-결합 부위와 ErbB-3의 세포 외 부위에 결합할 수 있는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법에서, 상기 세포 또는 종양의 세포는 적어도 상이한 염색체 위치의 5’서열에 융합된 NRG1-유전자의 3’말단을 포함하는 NRG1 융합 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.

항체의 항원-결합 부위는 전형적으로 가변 도메인에 존재한다. 가변 도메인은 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 포함한다.

상기 개체는 바람직하게는 EGFR 억제를 타겟으로 하는 치료를 받았으며, 바람직하게는 EGFR 결합 항체, 보다 바람직하게는 세툭시맙을 이용한 치료를 받은 개체이다.

본 발명의 치료 방법은 바람직하게는 세포 또는 종양의 세포 표면에서 ErbB-1 세포-표면 수용체; ErbB-2 세포-표면 수용체; ErbB-3 세포-표면 수용체; ErbB-4 세포-표면 수용체 또는 이들의 조합의 수를 측정하는 단계를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 치료 방법은 바람직하게는 상기 세포가 NRG1-융합을 포함하는지 또는 상기 종양이 NRG1-융합을 가지는 세포를 포함하는지 여부를 결정하는 단계를 추가적으로 포함한다. 이는 예를 들어 생체검사 시료의 세포에 대해 수행될 수 있다. 다양한 방법이 사용될 수 있으며 많은 방법이 당업계에 알려져 있다. NRG1-융합이 일어하는 경우 염색체 절단이 발생하므로 당업자는 통상적인 방법으로 종양이 NRG1-융합을 포함하는지 여부를 결정할 수 있다. 하나의 방법은 NRG1 융합 부위를 걸치는 프라이머를 이용하여 PCR-증폭을 수행하는 것이다. 이는 이미 발생했음을 알고 있는 NRG1-융합에 대해 용이하게 수행될 수 있고, 새로운 융합도 쉽게 검출될 수 있다. 적합한 방법은 예를 들어 레트로바이러스 유전자의 삽입 부위를 찾기 위해 사용되는 접합부 클로닝(junction junction) 기술을 사용하는 것이다. 적합한 방법은 LAM-PCR를 이용하는 것으로, Schmidt et al Nature Methods 4, 1051-1057(2007) doi:10.1038/nmeth1103를 참조할 수 있다.

본 발명의 치료 방법에서, 바람직하게는 상기 세포 또는 종양은 세포 당 400,000개 미만의 ErbB-1 세포-표면 수용체를 가지고, 바람직하게는 세포 당 200.000개 미만의 ErbB-1 세포-표면 수용체를 가진다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 치료 방법은 상기 개체에 ErbB-1 억제제, 바람직하게는 세툭시맙을 투여하는 단계를 추가적으로 포함한다.

본 발명에서 서술한 치료 방법은 치료 용도를 가지는 물질 또는 물질들의 조합으로 정의될 수도 있다. 적합한 조성물의 조합은 본 발명에서 서술한 이중특이적 항체와 ErbB-1 억제제의 조합이다.

세포 또는 종양이 ErbB-2 및 ErbB-3에 대해 양성인지 여부를 조사하기 위해 당업자는 예를 들어 ErbB-2 및 ErbB-3 증폭 및/또는 면역조직화학적 염색을 수행할 수 있다. ErbB-2 및 ErbB-3 모두에 대해 양성인 종양세포가 생체검사 시료 내 최소 10%가 존재해야 한다. 생체검사 시료는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 그 이상의 양성 세포를 포함할 수 있다. ErbB-1 양성 종양도 유사하게 동정될 수 있다.

바람직하게는 상기 암은 유방암, 예를 들어 초기 유방암이다. 그러나, 본 발명은 위암, 직장암, 대장암, 위-식도암, 식도암, 자궁내막암, 난소암, 유방암, 간암, 비소세포 폐암을 포함하는 폐암, 투명세포육종, 타액선암, 두경부암, 뇌암, 방광암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 피부암, 흑색종 등과 같은 광범위한 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 암에 적용될 수 있다. 상기 세포는 바람직하게는 상피 세포이다. 또는, 세포 또는 종양은 바람직하게는 상피성 유래 세포 또는 종양이다. 바람직한 구현예에 따르면 상기 세포 또는 종양은 유방암, 난소암, 폐암 또는 이들의 전이이다. 바람직하게는 상피성 유래의 종양이다. 바람직하게는, 상기 종양은 유방암, 난소암, 폐암 또는 이들의 전이이다.

ErbB 2 양성 세포 또는 종양 세포를 가지는 환자는 종양세포 표면상의 ErbB-2 수용체의 숫자에 기반하여 분류될 수 있다. 세포 표면에 1,000,000개 이상의 ErbB-2 수용체를 가지는 종양은 전형적으로 ErbB-2 [+++]로 분류되며, 150,000개 내지 1,000,000개를 가지는 종양은 ErbB-2 [++]로 분류되고, 150,000개 미만을 가지는 종양은 ErbB-2[+]로 분류된다. 바람직하게는, 상기 환자는 ErbB-2[++] 또는 ErbB-2 [+++]로 분류된다. 바람직하게는, 상기 ErbB-2/ErbB-3 양성 종양은 세포 당 최소 1,000,000개의 ErbB-2 세포-표면 수용체를 가진다.

바람직하게는, 본 발명의 방법에서 ErbB-2/ErbB-3 양성 세포 또는 종양은 세포 당 최소 150,000개의 ErbB-2 세포-표면 수용체를 가지며, 세포 당 50,000개 미만의 ErbB-3 세포-표면 수용체를 가진다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서 ErbB-2/ErbB-3 양성 세포 또는 종양은 세포 당 최소 1,000,000개의 ErbB-2 세포-표면 수용체를 가지고 50,000개 미만의 ErbB-3 세포-표면 수용체를 가진다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 ErbB-1, ErbB-2, 및/또는 ErbB-3 세포-표면 수용체 밀도에 기반하여 특정 환자군이 먼저 결정된다는 점에서 이점이 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 바람직하게는 상기 세포 또는 종양의 ErbB-1 세포-표면 수용체 밀도, ErbB-2 세포-표면 수용체 밀도, ErbB-3 세포-표면 수용체 밀도 및/또는 ErbB-4 세포-표면 수용체 밀도를 결정하는 단계를 포함한다. 본 명세서에서 용어“세포-표면 수용체 밀도”는 세포 당 표면에 존재하는 수용체의 수를 의미한다.

바람직하게는, 본 발명의 방법은 상기 세포에 대해 ErbB-2 세포-표면 수용체 밀도를 결정하는 단계를 추가적으로 포함한다. 환자는 면역조직화학 또는 형광 인 시투 혼성화를 이용하여 분류될 수 있다. ErbB-2 또는 ErbB-3 세포표면 수용체 밀도를 결정하기 위해, Dako Denmark A/S가 판매하는 HercepTest^TM및/또는 HER2FISH(pharmDx™), 및/또는 Monogram Biosciences가 판매하는 HERmark®assay가 적합한 예시적인 분석수단이다. ErbB-2 수용체 세포 밀도를 결정하는 다른 분석방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. ErbB-2를 결정하는 인 비보 방법도 역시 알려졌다(예를 들어 Chernomoridik et al. MolImaging. 2010 Aug;9(4):192-200 및 Ardeshirpour et al. Technol Cancer Res Treat. 2014Oct;13(5):427-434 참조). 바람직하게는, 본 발명의 방법은 상기 세포 또는 종양에 대해 ErbB-2세포-표면 수용체 밀도를 결정하는 단계를 추가적으로 포함한다. 이러한 방법은 당업자에게 알려져 있다(vander Woning and van Zoelen Biochem Biophys Res Commun. 2009 Jan 9;378(2):285-9). 바람직하게는, 본 발명의 방법은 상기 세포 또는 종양에 대해 ErbB-1 세포-표면 수용체 밀도를 결정하는 단계를 추가적으로 포함한다. 이러한 방법은 당업자에게 잘 알려져있다(예를 들어, EGFR pharmDx^TMKit(Dako) 및 McDonagh et al. Mol Cancer Ther 2012;11:582 참조). ErbB-4 세포 표면 수용체 밀도를 결정하기 위해 유사한 방법이 사용될 수 있다.

일 구현예에 따르면, ErbB-1, ErbB-2, ErbB-3 및 ErbB-4 세포-표면 수용체 밀도는 생체검사된 종양세포에 대한 FACS 분석을 통해 결정될 수 있다.

바람직하게는, ErbB-2/ErbB-3 양성 세포 또는 종양은 상대적으로 헤레굴린 발현 수준이 높다. 헤레굴린은 ErbB 3 양성 세포 또는 종양 세포의 성장에 관여하는 성장인자이다. 전형적으로, 세포 또는 종양 세포가 헤레굴린을 고발현할 경우(헤레굴린 스트레스라고 불림), 트라스투주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab) 및 라파티닙(lapatinib)과 같은 현재 알려진 치료제들이 더 이상 세포 또는 종양의 성장을 억제할 수 없다. 이러한 현상, 특히 MCF7 세포보다 높은 헤레굴린 발현 수준을 헤레굴린 저항성이라 부른다. 헤레굴린 발현 수준은 예를 들어 세포 또는 종양 RNA를 이용한 qPCR을 통해 측정하거나(예를 들어 Shames et al. PLOS ONE, February 2013, Vol.8, Issue 2, pp 1-10 및 Yonesaka et al., Sci.transl.Med., Vol.3, Issue 99 (2011); pp1-11에서 기재된 방법) 또는 ELISA와 같은 단백질 검출 방법을 통해 측정할 수 있으며, 바람직하게는 혈액, 혈장 또는 혈청 시료를 이용하여 측정할 수 있다(예를 들어 Yonesaka et al., Sci. transl. Med., Vol.3, Issue 99 (2011); pp1-11에 기재된 방법).

높은 헤레굴린 수준은 전이의 형성 기간(예를 들어 세포 또는 종양 세포 또는 종양줄기세포의 이동, 침습, 성장 및/또는 분화)에 전형적으로 나타난다. 전형적으로, 종양줄기세포(tumor initiating cell)는 CD44, CD24, CD133 및/또는 ALDH1와 같은 줄기세포 마커에 기반하여 동정된다. 이러한 절차는 따라서 트라스투주맙 및 퍼투주맙과 같은 현재 알려진 치료방법과 반작용을 일으키지 않는다. 본 발명의 이중특이적 항체는 상이한 염색체 위치의 5’서열에 융합된 NRG1-유전자의 3’말단을 포함하는 NRG1 융합 유전자를 포함하는 세포 또는 종양을 가진 개체에서 전이가 형성되는 것을 저해할 수 있다.

본 발명은 또한 ErbB-2의 세포 외 부위에 결합할 수 있는 제1 항원-결합 부위와 ErbB-3의 세포 외 부위와 결합할 수 있는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 세포 또는 종양을 가지는 개체에서 전이를 저해하는 방법으로서, 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 세포 또는 종양은 헤레굴린 발현 수준이 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레굴린 발현 수준의 최소 60%, 바람직하게는 최소 70%, 보다 바람직하게는 최소 80%, 보다 더 바람직하게는 최소 85%, 보다 바람직하게는 최소 90% 또는 95%인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 전이 형성을 예방 또는 치료하는 용도로 사용하기 위한 ErbB-2의 세포 외 부위에 결합할 수 있는 제1 항원-결합 부위와 ErbB-3의 세포 외 부위와 결합할 수 있는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체로서, 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 세포 또는 종양은 헤레굴린 발현 수준이 BXPC3 or MCF7 세포의 헤레굴린 발현 수준의 최소 60%, 바람직하게는 최소 70%, 보다 바람직하게는 최소 80%, 보다 더 바람직하게는 최소 85%, 보다 바람직하게는 최소 90% 또는 95%인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체를 제공한다. 또한 본 발명은 전이 형성을 치료 또는 예방하는 의약을 제조하기 위한 이중특이적 항체의 용도로서, 상기 ErbB-2, ErbB-3 또는 ErbB-2/ErbB-3 양성 세포 또는 종양은 헤레굴린 발현 수준이 BXPC3 또는 MCF7 세포의 헤레굴린 발현 수준의 최소 60%, 바람직하게는 최소 70%, 보다 바람직하게는 최소 80%, 보다 더 바람직하게는 최소 85%, 보다 바람직하게는 최소 90% 또는 95%인 것을 특징으로 하는 용도를 제공한다.

상기 개체는 바람직하게는 인간이다. 상기 개체는 바람직하게는 트라스투주맙과 같은 ErbB-2 특이적 항체를 이용한 단클론 항체 치료에 적합한 개체이다.

환자에게 투여되는 이중특이적 항체의 양은 전형적인 치료범위(therapeutic window) 내로서, 즉 치료 효과를 얻기에 충분한 양을 의미하며, 수용가능한 정도를 넘어서는 부작용을 일으키는 임계값을 초과하지 않는다. 원하는 치료효과를 얻기 위한 항체의 양이 낮을수록 치료범위는 넓을 것이다. 용량은 투여 경로, 투여 시간, 적용된 특정 약물의 방출 속도, 치료 기간, 병용 투여되는 다른 약물, 화합물 및 성분, 환자의 나이, 성별, 체중, 상태, 전반적인 건강 상태 및 투약 이력 기타 의학 분야에서 잘 알려진 인자들을 포함한 다양한 변수에 따라 결정된다. 용량은 트라스투주맙의 용량 범위 내이거나 더 낮을 수 있다.

본 발명의 이중특이적 항체는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제, 및 추가적이고 선택적인 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 항체 및 항체를 포함하는 조성물은 비경구, 장내 및 국소 투여를 포함한 어떠한 경로로도 투여될 수 있다. 비경구 투여는 주로 주사를 통해 이루어지는데, 예를 들어 정맥주사, 근육내 주사, 동맥주사, 척수내 주사, 뇌실주사, 관절강내 주사, 안와주사, 심장내 주사, 피내주사, 복강주사, 경기관내 주사, 피하주사, 표피주사, 관절내 주사, 피막하 주사, 지주막하 주사, 척수관 주사, 뇌척수내 주사, 종양내 주사 및 대조내 주사 및 주입을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, ErbB-1 억제제가 본 발명의 이중특이적 항체와 병용하여 사용될 수 있다. ErbB-1 억제제는 이중특이적 항체와 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. ErbB-1 억제제의 처리는 이중특이적 항체의 처리시기와 수분, 수시간 또는 수일 간 분리되어 이루어질 수 있다. 바람직하게는, ErbB-2/ErbB3 양성 세포 또는 종양은 ErbB1에 대해서도 양성이다. 바람직하게는, 병용치료는 세포 당 5,000개 이상의 표면 수용체, 바람직하게는 세포 당 20,000개 이상의 표면 수용체, 보다 바람직하게는 세포 당 50,000개 이상의 표면 수용체를 가지는 ErbB-2/ErbB3 양성 세포 또는 종양의 치료에 적합하다.

적합한 ErbB-1 억제제는 당업계에 알려져 있으며 ErbB-1(EGFR)의 적어도 한가지 생물학적 활성을 억제하는 물질, 특히 ErbB-1의 발현 또는 신호전달 활성을 감소시키는 물질을 의미한다. 바람직한 ErbB-1 억제제는 티로신 키나아제 수용체 분자의 세포외 결합부위에 결합하며 EGF와 같은 자연적인 리간드의 결합을 차단한다. 이러한 억제제는 세포외 EGF 수용체 결합 도메인을 타겟팅하는 항체, 항체 일부분 및 에피토프를 함유하는 펩타이드를 포함한다. 바람직하게는, ErbB-1 억제제는 항-ErbB-1 항체이고, 바람직하게는 세툭시맙(cetuximab), 마투주맙(matuzumab), 네시투무맙(necitumumab), 니모투주맙(nimotuzumab), 파니투무맙(panitumumab), 또는 잘루투무맙(zalutumumab)으로부터 선택된다. 본 발명은 또한 세포 내 인산화 부위 또는 티로신 키나아제 수용체 분자의 도메인과 결합하거나 상호작용할 수 있는 ErbB-1 억제제에 관한 것이다. 이는 특히 저분자 물질(화합물) 의약에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 억제제는 아파티닙(afatinib), 에를로티닙(erlotinib), 게피티닙(gefitinib), 라파티닙(lapatinib), 오시머티닙(osimertinib) 및 네라티닙(neratinib)을 포함한다.

본 발명은 본 발명에서 기술하는 방법 및 치료 용도로 사용하기 위한 이중특이적 항체를 제공한다. 적합한 이중특이적 항체는 ErbB-2의 세포 외 부위에 결합할 수 있는 제1 항원-결합 부위와 ErbB-3의 세포 외 부위와 결합할 수 있는 제2 항원-결합 부위를 포함하며, ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포 상의 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능을 감소시키거나 감소시킬 수 있다. 바람직한 항체 및 이들의 제조 방법은 WO2015/130173에 개시되어 있으며, 본 명세서에서 참조로서 삽입되어 있다. WO2015/130173의 실시예에서는 리간드 결합 및 에피토프 매핑과 같은 항체의 많은 특성들을 추가적으로 기재하고 있다.

본 명세서에서 용어 "항원-결합 부위"는 이중특이적 항체로부터 유래하거나 바람직하게는 이중특이적 항체 내에 존재하는, 항원과 결합할 수 있는 부위를 의미한다. 변형되지 않은 항원-결합 부위는 전형적으로 항체의 가변 도메인 내에 존재한다. 가변 도메인은 항원-결합 부위를 함유한다. 항원과 결합하는 가변 도메인은 항원과 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 가변 도메인이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 항체 가변 도메인은 중쇄 가변영역 (VH) 및 경쇄 가변영역(VL)을 포함한다. 항원-결합 부위는 조합된 VH/VL 가변 도메인에 존재할 수도 있고, VH 영역 또는 VL 영역에만 존재할 수도 있다. 항원-결합 부위가 두 개의 가변 도메인 중 하나에만 존재할 경우, 다른 한 쪽의 가변영역은 결합 가변영역의 폴딩 및/또는 안정성에 기여할 수 있으나, 항원 결합 자체에는 의미있는 기여를 하지 않는다.

본 명세서에서 용어“항원-결합”은 항체의 항원에 대한 전형적인 결합 능력을 의미한다. ErbB-2에 결합하는 항원-결합 부위를 가지는 항체는 ErbB-2에 결합하고, 같은 조건 하에서 동일한 종의 상동 수용체인 ErbB-1 및 ErbB-4 보다 최소 100배 낮은 친화도로 결합한다. rbB-3에 결합하는 항원-결합 부위를 가지는 항체는 ErbB-3에 결합하고, 같은 조건 하에서 동일한 종의 상동 수용체인 ErbB-1 및 ErbB-4과 결합하지 않는다. ErbB-패밀 리가 세포 표면 수용체의 패밀리임을 고려하면, 결합은 전형적으로 수용체를 발현하는 세포에서 측정한다. 항체와 항원간의 결합은 다양한 방법으로 측정할 수 있는데, 그 중 하나는 항체를 항원(바람직하게는 항원을 발현하는 세포)과 함께 배앵하고, 결합하지 않은 항체를 제거(바람직하게는 세척 단계)한 뒤 결합한 항체를 이에 결합하는 표지된 항체를 이용하여 측정하는 것이다.

항체와 항원 간의 결합은 전형적으로 항체의 상보성 부위에 의해 매개되며, 항원과 가변 도메인의 특정 3차원 구조가 이들 두 구조물이 정확하게 결합하도록(마치 열쇠와 열쇠구멍 처럼) 만든다. 항체가 전형적으로 항원의 에피토프를 인식하고 이러한 에피토프가 다른 물질에도 존재할 수 있으므로, ErbB-2 및/또는 ErbB-3에 결합하는 본 발명의 항체는 동일한 에피토프를 가지는 다른 단백질도 인식할 수 있다. 따라서, 용어“결합”에는 본 발명의 항체와 동일한 에피토프를 가지는 다른 단백질간의 결합을 제외하는 의미가 아니다. 이러한 다른 단백질은 바람직하게는 인간 단백질이 아니다. 본 발명에서 정의한 ErbB-2 항원-결합 부위 및 ErbB-3 항원-결합 부위는 전형적으로 출생 후, 바람직하게는 성인 인간의 세포막 상의 다른 단백질에 결합하지 않는다. 본 명세서에서 언급하는 이중특이적 항체는 하기에서 상술하는 바와 같이 전형적으로 최소 1x10e^-6 M의 친화도로 ErbB-2 및 ErbB-3에 결합할 수 있다.

본 명세서에서 용어“결합의 간섭”은 항체가 ErbB-3 상의 에피토프와 결합함으로써 ErbB-3와 결합하는 리간드와 경쟁함을 의미한다. 항체는 예를 리간드가 ErbB-3에 결합하는 것을 최소한 부분적으로 차단하는 공간적 방해를 통해 리간드 결합을 감소시킬 수도 있고, 이미 ErbB-3와 결합한 리간드를 대체할 수도 있다.

본 명세서에서 용어“항체”는 단백질 분자로서, 바람직하게는 항원의 에피토프에 결합하는 하나 이상의 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린 부류에 속하는 단백질로서, 이러한 도메인은 항체의 가변 도메인에서 유래하거나 이와 서열 유사성을 공유한다. 치료 용도의 항체는 치료 대상체의 천연 항체와 가능한 한 유사한 것이 바람직하다(예를 들어 인간 대상체에 대해 인간 항체를 사용). 항체 결합여부는 특이성과 친화도로 표현될 수 있다. 특이성은 어떤 항원 또는 이의 에피토프에 결합 도메인이 특이적으로 결합할지를 결정한다. 친화도는 특정 항원 또는 에피토프와의 결합 강도에 대한 척도이다. 특이적 결합은 친화도(KD)가 최소 1x10e- 6M, 보다 바람직하게는 1x10e-7 M, 보다 바람직하게는 1x10e-9 M 초과인 결합으로 정의된다. 전형적으로, 치료적 용도의 항체는 1x10e-10 M 또는 그 이상의 친화도를 가진다. 본 발명의 이중특이적 항체와 같은 항체는 자연적 항체의 불변 도메인(Fc 부위)을 포함한다. 본 발명의 항체는 전형적으로 이중특이적 전장(full length) 항체이며, 바람직하게는 인간 IgG 아형이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간 IgG1 아형이다. 이러한 항체는 우수한 ADCC 특성을 가지고, 인간에게 인 비보 투여시 우수한 반감기를 가지며, CH3 조작 기술에 의해 공발현시 호모다이머 보다는 헤테로다이머를 더 잘 형성하는 변형된 중쇄를 제공할 수 있다.

본 발명의 항체는 바람직하게는“전장”항체이다. 용어‘전장(full length)’은 완전한 항체를 필수적으로 포함함을 의미하나, 천연의 항체의 모든 기능을 반드시 다 가질 필요는 없다. 다시 말해, 전장 항체는 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 가진다. 각각의 쇄는 불변(C) 부위와 가변(V) 부위를 가지는데, 이들은 다시 CH1, CH2, CH3, VH, CL 및 VL 도메인으로 나누어진다. 항체는 Fab 부위에 포함된 가변 도메인을 경유하여 항원에 결합하며, 결합 후 불변 도메인, 주로 Fc 부위를 통해 면역체계의 분자나 세포와 상호작용할 수 있다. 본 명세서에서 용어‘가변 도메인’, ‘VH/VL 쌍’, ‘VH/VL’는 서로 교환되어 쓰일 수 있는 용어이다. 본 발명의 전장 항체는 바람직한 특성을 제공하는 돌연변이를 가지는 항체를 포함한다. 이러한 돌연변이는 어떠한 부위가 실질적으로 삭제된 형태여서는 안된다. 그러나, 결합 특성을 본질적으로 변경시키기 않는 하나 또는 몇 개의 아미노산 잔기의 삭제를 수반하는 항체는“전장 항체”에 포함된다. 예를 들어, IgG 항체는 불변 부위에 1-20개 아미노산 잔기의 삽입, 삭제 또는 이들의 조합이 포함될 수 있다. 예를 들어, 항체의 ADCC 활성은 항체의 불변 부위를 조금 변형함으로써 항체 자체가 낮은 ADCC 활성을 가질 경우 개선될 수 있다(Junttila, T. T., K. Parsons, et al. (2010). "Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2- Amplified Breast Cancer." Cancer Research 70(11): 4481-4489).

전장 IgG 항체는 반감기 면에서 유리하고 완전한 자가(인간) 분자에 가깝다는 점에서 면역원성 측면에서 바람직하다. 본 발명의 항체는 바람직하게는 이중특이적 IgG 항체이고, 바람직하게는 이중특이적 전장 IgG1 항체이다. IgG1는 인간에서 긴 순환 반감기를 가져 바람직하다. 인간에서의 면역원성을 차단하기 위해, 이중특이적 IgG 항체는 인간 IgG1인 것이 바람직하다.

용어‘이중특이적’(bs)은 항체의 첫 번째 부분(상기 정의된 바와 같은)은 항원의 하나의 에피토프에 결합하고 두 번째 부분은 상이한 에피토프에 결합하는 특성을 의미한다. 상이한 에피토프 전형적으로 상이한 항원 상에 존재한다. 제1 및 제2 항원은 사실상 2개의 상이한 단백질이다. 바람직한 이중특이적 항체는 두 개의 상이한 단클론 항체를 포함함으로써 두 개의 상이한 타입의 항원과 결합하는 항체이다. 이중특이적 항체의 한쪽 암(arm)은 전형적으로 하나의 항체의 가변 도메인을 포함하고, 다른쪽 암은 또 다른 항체의 가변 도메인을 포함한다. 이중특이적 항체의 중쇄 가변영역은 전형적으로 서로 상이한 반면, 경쇄 가변영역은 바람직하게는 서로 동일하다. 상이한 중쇄 가변영역이 동일하거나 공통의 경쇄와 결합한 이중특이적 항체도 공통의 경쇄를 가지는 이중특이적 항체로 불리운다.

바람직한 이중특이적 항체는 두 개의 상이한 중쇄와 공통의 경쇄를 단일 세포에서 공배양함으로써 수득할 수 있다. 야생형 CH3 도메인이 사용될 경우, 두 개의 상이한 중쇄와 공통의 경쇄의 공발현을 통해 AA, AB 및 BB의 3개의 상이한 항체 종이 생성된다. 원하는 이중특이적 산물(AB)의 비율을 높이기 위해 CH3 조작 기술이 사용될 수 있는데, 즉 후술하는 바와 같이 적합한 헤테로다이머화 도메인을 가지는 중쇄를 사용할 수 있다.

본 명세서에서 용어‘적합한 헤테로다이머화 도메인’은 변형된(engineered) 도메인 A’가 우선적으로 변형된 도메인 B’와 함께 헤테로다이머를 형성하거나 그 반대의 작용을 하고, A’-A’ 및 B’-B’사이의 호모다이머화는 감소되도록 변형된 단백질 도메인을 의미한다.

용어‘공통 경쇄’는 동일하거나 전장 항체의 결합 특이성에 영향을 미치지 않을 정도의 아미노산 서열 상이성을 가지는 경쇄를 의미한다. 예를 들어 동일하지는 않지만 기능적으로 동등한 경쇄를 발견하거나 제작하는 것은 보존적인 아미노산 변형을 도입하고 이를 시험하여 중쇄 등과 결합하였을 때 결합특이성에 영향을 미치지 않거나 부분적으로만 미치는지를 확인함으로써 가능하다. ‘재배열된(rearranged)’이라는 용어의 부가 여부와 무관하게, 용어‘공통 경쇄’, ‘공통 VL’,‘단일 경쇄’,‘단일 VL’는 본 명세서에서 모두 서로 교환되어 쓰일 수 있는 용어이다.

공통 경쇄(가변영역)는 바람직하게는 생식계열 서열을 가진다. 바람직한 생식계열 서열은 인간 레퍼토리에서 흔히 사용되는 것으로서 열역학적 안정성, 수율 및 가용성이 뛰어난 경쇄 가변영역이다. 바람직한 구현예에 따르면 상기 경쇄는 서열 1C “공통 경쇄 IGKV1-39/jk1”에 기재된 바와 같은 O12 / IgVκ1-39*01 유전자 단편의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 영역을 포함하며, 상기 아미노산 서열은 0-10개, 바람직하게는 0-5개의 아미노산 삽입, 삭제, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. IgVκ1-39는 면역글로불린 가변 카파(Immunoglobulin Variable Kappa) 1-39 유전자의 약어이다. 상기 유전자는 면역글로불린 카파(kappa) 가변(Immunoglobulin Kappa Variable) 1-39; IGKV139; IGKV1-39; O12a 또는 O12로도 알려졌다. 상기 유전자의 외부 ID는 HGNC: 5740; Entrez Gene: 28930; Ensembl: ENSG00000242371이다. IGKV1-39의 가변영역은 서열 1C에 나열되어 있다. V-영역은 5개의 J-영역 중 하나와 조합될 수 있다. 서열 1C는 2개의 J-영역과 결합한 IgVκ1-39의 바람직한 서열을 기재하고 있다. 조합된 서열은 IGKV1-39/jk1 및 IGKV1-39/jk5료 표시하였으며, 또 다른 명칭은 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01(월드와이드웹imgt.org의 IMGT 데이터베이스에 따른 명명법).

경쇄 가변영역을 가지는 O12 / IgVκ1-39*01는 생식계열 서열인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 경쇄 가변영역을 가지는 IGJκ1*01 또는 /IGJκ5*01는 생식계열 서열이다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 IGKV1-39/jk1 또는 IGKV1-39/jk5 경쇄 가변영역은 생식계열 서열이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 경쇄 가변영역은 생식계열 O12 / IgVκ1-39*01이다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 경쇄 가변영역은 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01를 포함한다. 바람직한 구현예에 따르면, IgVκ1-39*01/IGJκ1*01이다. 상기 경쇄 가변영역은 바람직하게는 생식계열 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 생식계열 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01를, 바람직하게는 생식계열 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01를 포함한다.

당업자는 용어“공통(common)”이 아미노산 서열이 동일하지 않은 경쇄의 기능적 동등성을 의미함을 명백하게 인식할 수 있다. 상기 경쇄에 대해, 기능적 결합영역의 형성에 현저하게 영향을 미치지 않는 돌연변이(삭제, 치환, 첨가)를 가지는 많은 변이체가 존재한다. 상기 경쇄는 상술한 경쇄에서 1 - 5개 아미노산이 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합이 발생한 경쇄일 수 있다.

바람직하게는, 상기 제1 항원 결합 부위 및 상기 제2 항원 결합 부위는 모두 서열 (RASQSISSYLN)을 가지는 CDR1, 서열 (AASSLQS)을 가지는 CDR2 및 서열 (QQSYSTPPT)을 가지는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함한다.

본 명세서에서 용어‘ErbB-2’는 ERBB-2 유전자에 의해 인코딩되는 인간 단백질을 의미한다. 상기 유전자 또는 단백질의 또 다른 이름은 CD340; HER-2; HER-2/neu; MLN 19; NEU; NGL; TKR1를 포함한다. ERBB-2 유전자는 흔히 HER2(human epidermal growth factor receptor 2)로 불리운다. 본 명세서에서 ErbB-2를 언급할 때, 이는 인간 ErbB-2를 의미한다. ErbB-2에 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 항체는 인간 ErbB-2에 결합한다. ErbB-2 항원-결합 부위는 인간과 다른 포유류 오솔로그(ortholog) 간의 서열 및 3차 구조의 유사성으로 인해 이러한 오솔로그에도 결합할 수 있으나 필연적으로 결합하는 것은 아니다. 인간 ErbB-2 단백질 및 이를 인코딩하는 유전자의 데이터베이스 접근번호는 (NP_001005862.1, NP_004439.2 NC_000017.10 NT_010783.15 NC_018928.2)이다. 이 접근번호는 타겟으로서의 ErbB-2를 동정하는 추가적인 방법을 제공한다. 항체와 결합하는 ErbB-3 단백질의 실제 서열은 다양할 수 있는데, 이는 예를 들어 몇몇 암 등에서 발생하는 인코딩 유전자의 돌연변이 때문일 수 있다. ErbB-2 항원 결합 부위는 ErbB-2와 몇몇 ErbB-2 양성 세포 또는 종양세포에서 발현되는 것과 같은 이의 다양한 변이체에 결합한다.

본 명세서에서 용어‘ErbB-3’는 인간에서 ERBB-3 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 의미한다. 이 유전자 또는 단백질의 또 다른 이름은 다음과 같다: HER3; LCCS2; MDA-BF-1; c-ErbB-3; c-erbb-3; erbb-3-S; p180-Erbb-3; p45-sErbb-3; 및 p85-sErbb-3. 본 명세서에서 ErbB-3를 언급할 때, 인간 ErbB-3를 의미한다. 항원-결합 부위를 가지는 ErbB-3에 대한 항체는 인간 ErbB-3과 결합한다. ErbB-3 항원-결합 부위는 인간과 다른 포유류 오솔로그(ortholog) 간의 서열 및 3차 구조의 유사성으로 인해 이러한 오솔로그에도 결합할 수 있으나 필연적적으로 결합하는 것은 아니다. 인간 ErbB-3 단백질 및 이를 인코딩하는 유전자의 데이터베이스 접근번호는 (NP_001005915.1 NP_001973.2, NC_000012.11 NC_018923.2 NT_029419.12)이다. 이 접근번호는 타겟으로서의 ErbB-2를 동정하는 추가적인 방법을 제공한다. 항체와 결합하는 ErbB-2 단백질의 실제 서열은 다양할 수 있는데, 이는 예를 들어 몇몇 암 등에서 발생하는 인코딩 유전자의 돌연변이 때문일 수 있다. ErbB-2 항원 결합 부위는 ErbB-3와 몇몇 ErbB-3 양성 세포 또는 종양 세포에서 발현되는 것과 같은 이의 다양한 변이체에 결합한다.

본 명세서에서 용어‘ErbB-4’는 인간에서 ERBB-4 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 의미한다. 이 유전자 또는 단백질의 또 다른 이름은 다음을 포함한다: HER4, Erb-B2 수용체 티로신 인산화효소 4, 및 인간 표피성장인자 수용체 4. 본 명세서에서 ErbB-4를 언급할 때, 인간 ErbB-4를 의미한다.

본 발명의 항체는 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포에서 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능을 감소시킬 수 있다. 과량의 ErbB-2가 존재할 때, ErbB-2/ErbB-3 헤테로다이머는 헤테로다이머 내의 ErbB-3에 대한 검출 가능한 리간드가 없을 경우 발현 세포에 성장 신호를 전달할 수 있다. 본 명세서에서는 이러한 ErbB-3 수용체 기능을 ErbB-3의 리간드-비의존성 수용체 기능이라 명명한다. ErbB-2/ErbB-3 헤테로다이머는 또한 ErbB-3 리간드의 존재 하에 발현 세포에 성장 신호를 전달한다. 본 명세서에서 이러한 ErbB-3 수용체 가능을 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능이라 명명한다.

본 명세서에서 용어 "ErbB-3 리간드"는 ErbB-3에 결합하여 이를 활성화하는 폴리펩타이드를 의미한다. ErbB-3 리간드의 예로는 뉴레굴린 1(NRG) 및 뉴레굴린 2, 베타세룰린, 헤파린-결합 표피성장인자 및 에피레굴린을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 용어는 천연 펩타이드의 생물학적 활성을 가지는 절편 및/또는 변이체를 포함한다.

바람직하게는, ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능은 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포의 ErbB-3 리간드-유도 성장이다. 바람직하게는, 상기 세포는 MCF-7 세포(ATCC® HTB-22™); SKBR3(ATCC® HTB-30™) 세포; NCI-87 (ATCC® CRL-5822™) 세포; BxPC-3-luc2 세포(Perkin Elmer 125058), BT-474 세포(ATCC® HTB-20™) 또는 JIMT-1 세포(DSMZ no.: ACC 589)이다.

본 발명에서 사용되는 리간드-유도 수용체의 기능은 최소 20%, 바람직하게는 최소 30, 40, 50 60, 또는 최소 70% 감소하며, 특히 바람직한 구현에에 따르면 리간드-유도 수용체 기능은 80, 보다 바람직하게는 by 90% 감소한다. 상기 감소는 바람직하게는 본 발명의 이중특이적 항체의 존재 하에 리간드-유도 수용체 기능을 측정하여 동일한 조건 하에서 상기 항체의 부존재 하의 동일한 기능과 비교함으로써 결정된다. 상기 조건은 최소한 ErbB-3 리간드의 존재여부를 포함한다. 존재하는 리간드의 양은 바람직하게는 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포주의 최대 성장의 절반을 유도할 수 있는 양이다. 시험을 위한 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포주는 바람직하게는 MCF-7 세포주 (ATCC® HTB-22™), SKBR3 세포주 (ATCC® HTB-30™) 세포, JIMT-1 세포주 (DSMZ ACC 589) 또는 NCI-87 세포주(ATCC® CRL-5822™)이다. ErbB-3 리간드-유도 수용체의 기능을 결정하기 위한 시험 및/또는 리간드는 바람직하게는 실시예에서 특정하는 바와 같이 ErbB-3 리간드로 유도된 성장의 감소에 대한 시험이다.

ErbB-2 단백질은 몇몇 도메인을 포함한다(Landgraf, R Breast Cancer Res. 2007; 9(1): 202-의 도 1 참조). 세포외 도메인은 도메인 I-IV로 명명한다. 본 명세서에서 언급하는 항체의 항원-결합 부위에서의 각 도메인의 결합부위는 매핑되어 있다. ErbB-2의 도메인 I 또는 도메인 IV에 결합하는 항원-결합 부위(제1 항원-결합 부위)를 가지는 이중특이적 항체는 다양한 경쇄와 조합되었을 때 ErbB-2에 대한 결합 특이성 및 친화도를 유지하는 중쇄 가변영역을 포함한다. ErbB-2의 도메인 I 또는 도메인 IV에 결합하는 항원-결합 부위(제1 항원-결합 부위)와 ErbB-3에 대한 항원-결합 부위(제2 항원-결합 부위)를 가지는 이중특이적 항체는 ErbB-2의 다른 세포 외 도메인에 결합하는 항원-결합 부위(제1 항원-결합 부위)를 가지는 이중특이적 항체에 비하여 ErbB-3의 리간드-유도 수용체 기능을 저해하는 데에 보다 효율적이다. ErbB-2에 결합하는 항원-결합 부위(제1 항원-결합 부위)를 가지는 이중특이적 항체는 상기 항원-결합 부위가 ErbB-2의 도메인 I 또는 도메인 IV에 결합하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 상기 항원-결합 부위는 ErbB-2의 도메인 IV에 결합한다. 바람직한 항체는 ErbB-2의 도메인 I에 결합하는 제1 항원-결합 부위와 ErbB-3의 도메인 Ⅲ에 결합하는 제2 항원-결합 부위를 가진다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항체는 T144, T164, R166, P172, G179, S180 및 R181로 구성된 군으로부터 선택되는 ErbB-2의 도메인 I의 적어도 하나의 아미노산 또는 상기 T144, T164, R166, P172, G179, S180 또는 R181로부터 약 5개 이내의 아미노산 위치에 있는 표면-노출된 아미노산과 결합하는 항원-결합 부위를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항체는 바람직하게는 R426 및 천연의 ErbB-3 단백질의 R426에서 11.2 Å 이내 위치에 있는 표면-노출된 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 ErbB-3의 도메인 Ⅲ의 최소 하나의 아미노산과 결합하는 항원-결합 부위를 가진다.

ErbB-2에 결합하는 항원-결합 부위(제1 항원-결합 부위)를 가지고 추가적으로 ADCC를 가지는 이중특이적 항체는 유의한 ADCC 활성을 가지는 다른 ErbB-2 결합 항체보다, 특히 인 비보에서, 더 효과적이다. 따라서, ADCC를 보이는 이중특이적 항체가 보다 바람직하다. 상기 제1 항원-결합 부위가 ErbB-2의 도메인 IV에 결합하는 항체는 고유의 ADCC 활성을 가지는 것으로 나타났다. 낮은 ADCC 활성을 가지는 도메인 I에 결합하는 ErbB-2 결합 항체는 ADCC 활성이 강화되도록 대식세포, 자연살해 세포, B-세포 및 호중구와 같은 면역작용 세포 상의 상이한 수용체에 결합함으로써 항체의 기능을 매개하는 Fc 부위를 조작할 수 있다. CD16A(FcγRⅢA) 및 CD32A(FcγRⅡA)와 같은 이들 수용체 일부는 세포를 활성화하여 항원에 대해 반응하도록 만든다. CD32B와 같은 다른 수용체는 면역 세포의 활성화를 억제한다. 활성화 수용체에 더 높은 선택성으로 결합하도록 Fc 부위를 조작함으로써(아미노산 치환을 통해), 항체는 항암용 단클론 항체에 요구되는 세포 독성을 더 잘 발휘하도록 만들어질 수 있다.

항체의 ADCC를 강화하는 기술 중 하나로 탈푸코스화(afucosylation)가 있다(예를 들어 Junttila, T. T., K. Parsons, et al. (2010). "Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer." Cancer Research 70(11): 4481-4489). 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 탈푸코스화된 이중특이적 항체를 제공한다. 택일적으로, 혹은 추가적으로, ADCC 강화를 위해 예를 들어 당질공학(glycoengineering)(Kyowa Hakko/Biowa, GlycArt (Roche) and Eureka Therapeutics) 및 돌연변이 유발(Xencor and Macrogenics)을 포함하는 많은 다른 전략이 사용될 수 있는데, 이들은 모두 seek to improve Fc가 낮은-친화도의 활성화 FcγRⅢa에 잘 결합하도록 하거나 및/또는 낮은 친화도의 억제성 FcγRⅡb와의 결합을 감소시키기 위한 것이다.

항체 또는 작용 세포의 ADCC 유도 효율을 측정하기 위한 몇몇 인 비트로 방법이 존재하는데, 이들 중에는 크롬-51[Cr51] 방출 어세이, 유로퓸[Eu] 방출 어세이 및 황-35[S35] 방출 어세이가 있다. 보통, 특정한 표면-노출 항원을 발현하는 표지된 타겟 세포주를 상기 항원에 특이적인 항체와 함께 배양한다. 세척한 뒤, Fc 수용체인 CD16을 발현하는 작동세포(effector cell)를 전형적으로 항체-표지된 타겟 세포와 함께 공배양한다. 이어서 타겟 세포 용해를 일반적으로 세포 내 표지물질의 방출, 예를 들어 신틸레이션 계수기 또는 분광광도계를 통해 측정한다.

바람직한 이중특이적 항체에서, 상기 ErbB-3 양성 세포에 대한 제2 항원-결합 부위의 친화도는 상기 ErbB-2 양성 세포에 대한 제1 항원-결합 부위의 친화도와 동일하거나 바람직하게는 그 보다 높다. 상기 ErbB-3 양성 세포에 대한 제2 항원-결합 부위의 친화도(KD)는 바람직하게는 2.0 nM 이하이며, 보다 바람직하게는 1.5 nM 이하이고, 보다 바람직하게는 1.39 nM 이하이며, 보다 바람직하게는 0.99 nM 이하이다. 바람직한 구현에에 따르면, SK-BR-3 세포 상의 ErbB-3에 대한 제2 항원-결합 부위의 친화도는 2.0 nM 이하이고, 보다 바람직하게는 1.5 nM 이하이며, 보다 바람직하게는 1.39 nM 이하이고, 바람직하게는 0.99 nM 이하이다. 일 구현예에 따르면, 상기 친화도 1.39-0.59 nM의 범위 내이다. 바람직한 구현에에 따르면, BT-474 세포 상의 ErbB-3에 대한 제2 항원-결합 부위의 친화도는 2.0 nM 이하이고, 보다 바람직하게는 1.5 nM 이하이며, 보다 바람직하게는 1.0 nM 이하이고, 보다 바람직하게는 0.5 nM 이하이며, 보다 바람직하게는 0.31 nM 이하이고, 보다 바람직하게는 0.23 nM 이하이다. 일 구현예에 따르면, 상기 친화도는 0.31-0.15 nM의 범위 내이다. 상술한 친화도는 바람직하게는 WO2015/ 130173의 실시예에서 기재하는 바와 같이 세포를 방사성 표지된 항체를 이용하여 4℃에서 배양하고 세포에 결합된 방사능을 측정하는 정상기(steady state) 세포 친화도 측정법을 이용하여 측정된다.

상기 ErbB-2 양성 세포에 대한 제1 항원-결합 부위의 친화도(KD)는 바람직하게는 5.0 nM 이하이며, 보다 바람직하게는 4.5 nM 이하이고, 보다 바람직하게는 3.9 nM 이하이다. 바람직한 구현예에 따르면, SK-BR-3 세포 상의 ErbB-2에 대한 제1 항원-결합 부위의 친화도는 5.0 nM 이하이고, 바람직하게는 4.5 nM 이하이며, 보다 바람직하게는 4.0 nM 이하이고, 보다 바람직하게는 3.5 nM 이하이며, 보다 바람직하게는 3.0 nM 이하이고, 보다 바람직하게는 2.3 nM 이하이다. 일 구현예에 따르면, 상기 친화도는 3.0-1.6 nM의 범위 내이다. 바람직한 구현예에 따르면, BT-474 세포 상의 ErbB-2에 대한 제1 항원-결합 부위의 친화도는 5.0 nM 이하이고, 바람직하게는 4.5 nM 이하이며, 보다 바람직하게는 3.9 nM 이하이다. 일 구현예에 따르면, 상기 친화도는 4.5-3.3 nM의 범위 내이다. 상술한 친화도는 바람직하게는 WO2015/130173의 실시예에서 기재하는 바와 같이 세포를 방사성 표지된 항체를 이용하여 4℃에서 배양하고 세포에 결합된 방사능을 측정하는 정상기(steady state) 세포 친화도 측정법을 이용하여 측정된다.

바람직하게는, 본 발명의 방법에서 사용되는 이중특이적 항체는 심근세포(cardiomyocyte)의 생존에 유의한 영향을 미치지 않는다. 심장 독성(cardio독성)은 ErbB-2 표적치료에서의 위험 요인으로 알려져 있고, 트라스투주맙이 안트라사이클린과 함께 사용되어 심장 스트레스를 유도하는 합병증의 빈도가 증가하고 있다.

본 발명의 이중특이적 항체는 바람직하게는 인간에게 사용된다. 따라서, 바람직한 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체이다. 폴리펩타이드에 대한 인간의 내성은 다양한 특징에 의해 결정된다. 면역은, T-세포 매개이든, B-세포 매개이든 혹은 다른 경로로 매개되든, 인간의 폴리펩타이드에 대한 내성에 관여하는 변수 중의 하나이다. 이중특이적 항체의 불변 부위는 바람직하게는 인간 불변 부위이다. 불변 부위는 천연의 인간 항체의 불변 부위와 비교하여 하나 이상, 바람직하게는 10개 이하, 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 차이를 포함할 수 있다. 불변 부위는 전체적으로 천연의 인간 항체로부터 유래하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 제작되는 다양한 항체는 인간 항체 가변 도메인 라이브러리에서 유래한다. 이에, 이들 가변 도메인은 인간 유래이다. 특이적인 CDR 부위는 인간으로부터 유래하거나, 합성되거나 또는 다른 생물로부터 유래할 수 있다. 가변영역은 천연의 인간 항체와 CDR 부위는 다르더라도 가변영역의 아미노산 서열이 동일할 경우 인간 가변영역으로 간주된다. 항체에서 ErbB-2 결합 VH, ErbB-3 결합 VH 또는 경쇄의 가변영역은 천연의 인간 항체의 가변영역과 비교하여 CDR 부위의 가능한 아미노산 서열 차이를 제외하고 하나 이상의, 바람직하게는 10개 이하의, 바람직하게는 5개 이하의 아미노산 차이를 가질 수 있다. 이러한 돌연변이는 체세포 과돌연변이(somatic hypermutation)에서도 자연적으로 발생한다.

항체는 적어도 중쇄 가변영역에 관해선 다양한 동물종에서 유래할 수 있다. 예를 들어 뮤린 중쇄 가변영역을 인간화하는 것은 통상적인 기술이다. 이를 위해 다양한 방법이 적용될 수 있는데, 그 중엔 뮤린 중쇄 가변영역의 3차원 구조에 맞게 입체적으로 인간 중쇄 가변영역에 CDR을 이식하는 방법; 바람직하게는 T- 또는 B- 세포의 알려진 에피토프 또는 에피토프로 예상되는 부위의 제거를 통한 중쇄 가변영역의 탈면역화(deimmunization)가 있다. 제거는 전형적으로 에피토프 내의 1개 이상의 아미노산을 다른 아미노산(전형적으로 보존적인 아미노산)으로 치환하여 에피토프의 서열이 더 이상 T- 또는 B-세포 에피토프로 기능하지 못하도록 변형하는 것이다.

이러한 탈면역화된 뮤린 중쇄 가변영역은 본래의 뮤린 중쇄 가변영역에 비하여 인간에서의 면역원성이 떨어진다. 바람직하게는 가변영역 또는 도메인이 추가적으로 인간화되어 베니어링(veneering)될 수 있다. 베니어링 기술을 이용하여, 면역체계에 이미 노출된 외부의 잔기가 선택적으로 인간 잔기로 대체되어 약한 면역원성을 가지거나 실질적으로 탈면역화된 베니어된 표면을 가지는 하이브리드 분자를 제공할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 동물은 바람직하게는 포유류이고, 보다 바람직하게는 영장류이며, 가장 바람직하게는 인간이다.

본 발명의 이중특이적 항체는 바람직하게는 인간 항체의 불변 부위를 포함한다. 중쇄 불변 도메인의 차이에 따라, 항체는 IgG, IgA, IgM, IgD, 및 IgE의 5개 클래스 또는 아형으로 분류된다. 이들 클래스 또는 아형은 상응하는 그리스 문자로 명명된 적어도 하나의 중쇄를 포함한다. 바람직하게는 상기 불변 부위는 IgG 불변 부위, 보다 바람직하게는 IgG1 불변 부위, 바람직하게는 변이된 IgG1 불변 부위를 포함한다. IgG1의 불변 부위 내에서 동종이형(allotype)인 G1m1, 17 및 G1m3와 같은 자연적인 몇몇 변이가 발생하고, 이들 변이는 항체의 면역학적 특성에 영향을 미치지 않는다. 전형적으로 1-10개 사이의 아미노산 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합이 불변 부위에서 일어날 수 있다.

바람직한 이중특이적 항체는 다음을 포함한다:

- MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 및 MF1898로 구성된 군으로부터 선택되는 ErbB-2 특이적 중쇄 가변영역의 적어도 CDR3 서열, 바람직하게는 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 또는 상술한 중쇄 가변영역과 서열최대 15개 아미노산, 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산, 보다 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산이 차이가 나는 중쇄 가변영역 서열; 및/또는

- MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074로 구성된 군으로부터 선택되는 ErbB-3 특이적 중쇄 가변영역의 적어도 CDR3 서열, 바람직하게는 적어도 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 또는 상술한 중쇄 가변영역과 서열최대 15개 아미노산, 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산, 보다 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산이 차이가 나는 중쇄 가변영역 서열.

CDR 서열은 예를 들어 최적화를 위해 변형될 수 있으며, 바람직하게는 항체의 결합 효율 또는 안정성을 개선하기 위해 변형될 수 있다. 최적화는 예를 들어 돌연변이 형성을 통해 수행될 수 있는데, 이 과정에서 항체의 안정성 및/또는 결합 친화도를 시험하여 향상된 ErbB-2 또는 ErbB-3 특이적 CDR 서열이 선정된다. 최소 하나의 변형된 CDR 서열을 포함하는 항체 변이체를 생성시키는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환이 적용될 수 있다. 보존적 아미노산 치환의 예에는 이소루신, 발린, 루신 또는 메티오닌과 같은 소수성 잔기를 다른 소수성 잔기로 치환하는 것, 그리고 아르기닌을 라이신으로, 글루탐산을 아스파르틱산으로, 또는 글루타민을 아스파라진으로 치환하는 것과 같이 극성 잔기를 다른 극성 잔기로 치환하는 것이 포함된다.

바람직한 항체는 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인을 포함하되, 상기 가변 도메인의 VH 쇄는 MF2926; MF2930; MF1849; MF2973; MF3004; MF3958(인간화된 MF2971); MF2971; MF3025; MF2916; MF3991(인간화된 MF3004); MF3031; MF2889; MF2913; MF1847; MF3001, MF3003 또는 MF1898의 VH 쇄의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 MF2926; MF2930; MF1849; MF2973; MF3004; MF3958(인간화된 MF2971); MF2971; MF3025; MF2916; MF3991(인간화된 MF3004); MF3031; MF2889; MF2913; MF1847; MF3001, MF3003 또는 MF1898의 VH 쇄의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상술한 VH 쇄 서열에 대해 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 보다 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지는 서열을 포함한다. ErbB-2에 결합하는 가변 도메인의 VH 쇄는 바람직하게는 다음의 아미노산 서열을 포함한다:

- MF1849; 또는

- MF2971 또는 이의 인간화된 형태로서, 바람직하게는 MF3958의 아미노산을 포함하는 인간화된 형태; 또는

- MF3004 또는 이의 인간화된 형태로서 바람직하게는 MF3991의 아미노산 서열을 포함하는 인간화된 형태. 일 구현예에 따르면, ErbB-2에 결합하는 가변 도메인의 VH 쇄는 MF1849; 또는 MF2971 또는 이의 인간화된 형태의 아미노산 서열을 포함하되, 상기 인간화된 형태 바람직하게는 MF3958; 또는 MF3004 또는 이의 인간화된 형태의 아미노산 서열을 포함하되, 상기 인간화된 형태 바람직하게는 MF3991의 아미노산 서열을 포함하고, 상술한 VH 서열은 각각의 서열에서 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 보다 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가진다. 바람직한 구현예에 따르면 ErbB-2에 결합하는 가변 도메인의 VH 쇄는 MF3958의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 보다 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지는 MF3958의 아미노산 서열을 포함한다.

Erb-B3에 결합하는 가변 도메인의 VH 쇄는 바람직하게는 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 VH 쇄의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 보다 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지는 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 VH 쇄의 아미노산 서열을 포함한다. Erb-B3에 결합하는 가변 도메인의 VH 쇄는 바람직하게는 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 보다 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지는 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에 따르면 ErbB-3에 결합하는 가변 도메인의 VH 쇄는 MF3178의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 보다 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 포함하는 MF3178의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상술한 아미노산 삽입, 삭제 및 치환은 CDR3 부위에 존재하지 않는다. 상술한 아미노산 삽입, 삭제 및 치환은 바람직하게는 CDR1 및 CDR2 부위에도 존재하지 않는다. 상술한 아미노산 삽입, 삭제 및 치환은 바람직하게는 FR4 부위에도 존재하지 않는다.

바람직하게는, 상기 항체는 MF1849, MF2971, MF3958, MF3004 또는 MF3991의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 가장 바람직하게는 MF3958의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다. 상기 항체는 바람직하게는 적어도 MF3178, MF3176, MF3163, MF6058, MF6061 또는 MF6065의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 가장 바람직하게는 MF3178의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다.

바람직하게는, ErbB-2 특이적 중쇄 가변영역은 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 보다 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 포함하는 VH 쇄 MF3958의 아미노산 서열을 포함한다(바람직하게는 상기 삽입, 삭제, 치환은 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에 존재하지 않는다). 바람직하게는, ErbB-3 특이적 중쇄 가변영역은 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 보다 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 포함하는 VH 쇄 MF3178의 아미노산 서열을 포함한다. 하나 이상의 아미노산 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합은 바람직하게는 VH 쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3 부위 내에 존재하지 않는다. 이들은 바람직하게는 FR4 부위에도 존재하지 않는다. 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산의 치환이다.

바람직하게는, ErbB-2 특이적 중쇄 가변영역은 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 보다 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지는 VH 쇄 MF3991의 아미노산 서열을 포함한다(바람직하게는 상기 삽입, 삭제, 치환은 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에 존재하지 않는다). 바람직하게는, ErbB-3 특이적 중쇄 가변영역은 최대 15개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 보다 바람직하게는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 가지는 VH 쇄 MF3178의 아미노산 서열을 포함한다. 하나 이상의 아미노산 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합은 바람직하게는 VH 쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3 부위 내에 존재하지 않는다. 이들은 바람직하게는 FR4 부위에 존재하지 않는다. 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이다.

바람직하게는, 항체의 제1 항원-결합 부위는 적어도 MF3958의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 또는 MF3958의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 최대 세개, 바람직하게는 최대 두개, 바람직하게는 최대 한개 아미노산이 차이가 나는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하며, 상기 제2 항원-결합 부위는 적어도 MF3178의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열, 또는 MF3178의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 최대 세개, 바람직하게는 최대 두개, 바람직하게는 최대 한개 아미노산이 차이가 나는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함한다.

바람직하게는, 이중특이적 항체는 i) MF3958의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 ErbB-2 특이적 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 제1 항원 결합 부위 및 ⅱ) MF3178의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 ErbB-3 특이적 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 제2 항원 결합 부위를 포함한다.

바람직하게는, ErbB-2 특이적 중쇄 가변영역은 MF3958 서열을 가지며 ErbB-3 특이적 중쇄 가변영역은 MF3178 서열을 가진다. 이러한 조합은 PB4188 항체라고도 명명된다. 바람직하게는, PB4188 항체는 탈푸코스화(afucosylated)되어 있다.

바람직하게는, 상기 이중특이적 항체는 서열목록 파트 1D에 기재된 바와 같은“erbB-2 결합을 위한 중쇄”와 서열목록 파트 1D에 기재된 바와 같은“erbB-3 결합을 위한 중쇄”를 포함한다.

바람직하게는, 상기 이중특이적 항체의 항원 결합 부위는 생식계열 경쇄 O12를 포함하며, 바람직하게는 재배열된 생식계열 인간 카파경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 이들의 절편 또는 이들의 기능적 변이체 (월드와이드웹 imgt.org의 IMGT 데이터베이스에 따른 명명법)를 포함한다. 용어“생식계열 인간 카파경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01”, “IGKV1-39/IGKJ1”, “huVκ1-39 경쇄”또는 줄여서“huVκ1-39”가 사용된다. 상기 경쇄는 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이며, 상기 삽입, 삭제, 치환 또는 이들의 조합은 바람직하게는 VL 쇄의 CDR3 부위 내에 존재하지 않고, 바람직하게는 VL 쇄의 CDR1, CDR2 또는 CDR3 부위 또는 FR4 부위에 존재하지 않는다. 바람직하게는, 제1 항원 결합 부위와 제2 항원 결합 부위는 동일한 경쇄 가변영역을 가지거나, 혹은 공통 경쇄를 가진다. 바람직하게는, 상기 경쇄 가변영역은 서열 (RASQSISSYLN)을 가지는 CDR1, 서열 (AASSLQS)을 가지는 CDR2 및 서열 (QQSYSTPPT)을 가지는 CDR3을 포함한다. 바람직하게는, 경쇄 가변영역은 서열목록 파트 1C에 기재된 바와 같은 공통 경쇄 서열을 포함한다.

이중특이적 항체를 생산하는 다양한 방법을 이용할 수 있으며, WO2015/130173에 기재되어 있다. 하나의 방법은 두 개의 상이한 중쇄 및 두 개의 상이한 경쇄를 하나의 세포에서 발현시키고 생성된 항체를 수집하는 것이다. 이런 방법으로 생산된 항체는 전형적으로 중쇄와 경쇄가 다양하게 조합된 항체를 수득할 수 있으며, 이중 일부가 원하는 이중특이적 항체의 구성을 가지게 된다. 이중특이적 항체는 수집 후 정제될 수 있다.

세포에 의해 생성된 이중특이적 항체의 다른 항체에 대한 비율은 다양한 방법에 의해 증가될 수 있다. 바람직하게는, 상기 비율은 세포 내에서 두 개의 상이한 경쇄가 아니라 두 개의 동일한 경쇄를 발현함으로서 증가될 수 있다. 당업계에서 이러한 개념은“공통 경쇄”방법이라 불린다. 본질적으로 동일한 경쇄가 상이한 두 개의 중쇄와 함께 작용하여 상이한 항원-결합 부위를 가지는 가변 도메인을 형성함으로써 상이한 결합 특성을 가지게 되면, 세포에서 생성되는 다른 항체에 대한 이중특이적 항체의 비율이 상이한 경쇄가 발현되는 경우에 비하여 유의하게 증가한다. 세포에 의해 생성되는 이중특이적 항체의 비율은 두 개의 서로 다른 중쇄의 결합을 동일한 중쇄끼리의 결합보다 촉진시킴으로써 증가시킬 수 있다. 이러한 중쇄의 헤테로다이머화를 위한 다양한 방법이 알려져 있다. 이러한 방법 중 하나는 '놉-인투-홀(knob into hole)' 이중특이적 항체를 제작하는 것이다(미국특허출원 제20030078385호(Arathoon et al. -Genentech) 참조). 또 다른 바람직한 방법은 PCT 출원번호 PCT/NL2013/050294 (WO2013/157954 A1)에 기재되어 있으며, 본 명세서에 참조로서 삽입되어 있다. 단일특이적 항체에 비해 이중특이적 항체의 형성에 보다 적합한, 단일 세포로부터 이중특이적 항체를 생산하는 방법 및 수단이 개시되어 있다.

본 발명에서 언급된 서열은 하기 및 도 1에 표시하였다.

서열 1A (erbB-2 특이적)

MF2926: erbB-2 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

핵산 서열 (밑줄친 서열은 리더 펩타이드의 말단을 인코딩함):

1 ggcccagccggccatggcccaggtccagctgcagcagtctggacctgagctggtgaaacc

61 tggggcttca gtgatgattt cctgcaaggc ttctggttac tcattcactg gctaccacat

121 gaactgggtg aagcaaagtc ctgaaaagag ccttgagtgg attggagaca taaatcctag

181 cattggtacg actgcccaca accagatttt cagggccaag gccacaatga ctgttgacaa

241 atcctccaac acagcctaca tgcagctcaa gagcctgaca tctgaagact ctggagtctt

301 ttactgtgtt agaagagggg actggtcctt cgatgtctgg ggcacaggga ccacggtcac

361 cgtctccagt

아미노산 서열:

QVQLQQSGPELVKPGASVMISCKASGYSFTGYHMNWVKQSPEKSLEWIGDINPSIGTTAHNQIFRAKATMTVDKSSNTAYMQLKSLTSEDSGVFYCVRRGDWSFDVWGTGTTVTVSS

CDR1: GYHMNWVKQSPEKSLE

CDR2: NQIFRA

CDR3: RGDWSFDV

MF2930: erbB-2 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 ggcccagccggccatggccgaggtccagctgcagcagtctggggctgaactggtgaagcc

61 tggagcctca gtgatgatgt cctgtaaggt ttctggctac accttcactt cctatcctat

121 agcgtggatg aagcaggttc atggaaagag cctagagtgg attggaaatt ttcatcctta

181 cagtgatgat actaagtaca atgaaaactt caagggcaag gccacattga ctgtagaaaa

241 atcctctagc acagtctact tggagctcag ccgattaaca tctgatgact ctgctgttta

301 ttactgtgca agaagtaacc cattatatta ctttgctatg gactactggg gtcaaggaac

361 ctcggtcacc gtctccagt

아미노산 서열:

EVQLQQSGAELVKPGASVMMSCKVSGYTFTSYPIAWMKQVHGKSLEWIGNFHPYSDDTKYNENFKGKATLTVEKSSSTVYLELSRLTSDDSAVYYCARSNPLYYFAMDYWGQGTSVTVSS

CDR1: SYPIAWMKQVHGKSLE

CDR2: NENFKG

CDR3: SNPLYYFAMDY

MF1849: erbB-2 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 ggcccagccggccatggcccaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcc

61 tgggaggtcc ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc accttcagta gctatggcat

121 gcactgggtc cgccaggctc caggcaaggg gctggagtgg gtggcagtta tatcatatga

181 tggaagtaat aaatactatg cagactccgt gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa

241 ttccaagaac acgctgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gctgaggaca cggccgtgta

301 ttactgtgca aaaggtgact acggttctta ctcttcttac gcctttgatt attggggcca

361 aggtaccctg gtcaccgtct ccagt

아미노산 서열:

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGDYGSYSSYAFDYWGQGTLVTVSS

CDR1: SYGMH

CDR2: VISYDGSNKYYADSVKG

CDR3: GDYGSYSSYAFDY

MF2973: erbB-2 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 ggcccagccggccatggcccaggtgcagctgaagcagtctggggctgagctggtgaggcc

61 tggggcttca gtgaagttgt cctgcaaggc ttctggctac attttcactg gctactatat

121 aaactggttg aggcagaggc ctggacaggg acttgaatgg attgcaaaaa tttatcctgg

181 aagtggtaat acttactaca atgagaagtt caggggcaag gccacactga ctgcagaaga

241 atcctccagc actgcctaca tgcagctcag cagcctgaca tctgaggact ctgctgtcta

301 tttctgtgca agagggcccc actatgatta cgacggcccc tggtttgttt actggggcca

361 agggactctg gtcaccgtct ccagt

아미노산 서열:

QVQLKQSGAELVRPGASVKLSCKASGYIFTGYYINWLRQRPGQGLEWIAKIYPGSGNTYYNEKFRGKATLTAEESSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARGPHYDYDGPWFVYWGQGTLVTVSS

CDR1: GYYINWLRQRPGQGLE

CDR2: NEKFRG

CDR3: GPHYDYDGPWFVY

MF3004: erbB-2 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 ggcccagccggccatggcccaggtgcagctgaagcagtctggggctgagctggtgaggcc

61 tggggcttca gtgaagctgt cctgcaaggc ttctggctac actttcactg gctactatat

121 aaactgggtg aagcagaggc ctggacaggg acttgagtgg attgcaagga tttatcctgg

181 aagtggttat acttactaca atgagaagtt caagggcaag gccacactga ctgcagaaga

241 atcctccagc actgcctaca tgcacctcag cagcctgaca tctgaggact ctgctgtcta

301 tttctgtgca agaccccact atggttacga cgactggtac ttcggtgtct ggggcacagg

361 caccacggtc accgtctcca gt

아미노산 서열:

QVQLKQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTGYYINWVKQRPGQGLEWIARIYPGSGYTYYNEKFKGKATLTAEESSSTAYMHLSSLTSEDSAVYFCARPHYGYDDWYFGVWGTGTTVTVSS

CDR1: GYYINWVKQRPGQGLE

CDR2: NEKFKG

CDR3: PHYGYDDWYFGV

MF2971: erbB-2 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 ggcccagccggccatggcccaggtgcagctgaagcagtctggggctgagctggtgaggcc

61 tggggcttca gtgaaactgt cctgcaaggc ttctggctac actttcactg cctactatat

121 aaactgggtg aagcagaggc ctggacaggg acttgagtgg attgcaagga tttatcctgg

181 aagtggctat acttactaca atgagatttt caagggcagg gccacactga ctgcagacga

241 atcctccagc actgcctaca tgcaactcag cagcctgaca tctgaggact ctgctgtcta

301 tttctgtgca agacctccgg tctactatga ctcggcctgg tttgcttact ggggccaagg

361 gactctggtc accgtctcca gt

아미노산 서열:

QVQLKQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTAYYINWVKQRPGQGLEWIARIYPGSGYTYYNEIFKGRATLTADESSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARPPVYYDSAWFAYWGQGTLVTVSS

CDR1: AYYINWVKQRPGQGLE

CDR2: NEIFKG

CDR3: PPVYYDSAWFAY

MF3025: erbB-2 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 ggcccagccggccatggcccaggtgcagctgaagcagtctggggctgagctggtgaggcc

61 tgggacttca gtgaagctgt cctgcaaggc ttctggctac actttcactg gctactatat

121 aaactgggtg aagcagaggc ctggacaggg acttgagtgg attgcaagga tttatcctgg

181 aagtggttat acttactaca atgagaagtt caagggcaag gccacactga ctgcagaaga

241 atcctccaac actgcctata tgcacctcag cagcctgaca tctgaggact ctgctgtcta

301 tttctgtgca aggccccact atggttacga cgactggtac ttcgctgtct ggggcacagg

361 gaccacggtc accgtctcca gt

아미노산 서열:

QVQLKQSGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTGYYINWVKQRPGQGLEWIARIYPGSGYTYYNEKFKGKATLTAEESSNTAYMHLSSLTSEDSAVYFCARPHYGYDDWYFAVWGTGTTVTVSS

CDR1: GYYINWVKQRPGQGLE

CDR2: NEKFKG

CDR3: PHYGYDDWYFAV

MF2916: erbB-2 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 ggcccagccggccatggcccaggtccagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcc

61 tggggcttca gtgaagctgt cctgcaaggc ttctggctac actttcactg gctactatat

121 aaactgggtg aagcagaggc ctggacaggg acttgagtgg attgcaagga tttatcctgg

181 cagtggtcat acttcctaca atgagaagtt caagggcaag gccacactga ctacagaaaa

241 atcctccagc actgcctaca tgcagctcag cagcctgaca tctgaggact ctgctgtcta

301 tttctgtgca agacctatct actttgatta cgcagggggg tacttcgatg tctggggcac

361 aagaacctcg gtcaccgtct ccagt

아미노산 서열:

QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTGYYINWVKQRPGQGLEWIARIYPGSGHTSYNEKFKGKATLTTEKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARPIYFDYAGGYFDVWGTRTSVTVSS

CDR1: GYYINWVKQRPGQGLE

CDR2: NEKFKG

CDR3: PIYFDYAGGYFDV

MF3958: erbB-2 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 ggcccagccggccatggcccaggtgcagctggtgcagtctggcgccgaagtgaagaaacc

61 tggcgccagc gtgaagctga gctgcaaggc cagcggctac accttcaccg cctactacat

121 caactgggtc cgacaggccc caggccaggg cctggaatgg atcggcagaa tctaccccgg

181 ctccggctac accagctacg cccagaagtt ccagggcaga gccaccctga ccgccgacga

241 gagcaccagc accgcctaca tggaactgag cagcctgcgg agcgaggata ccgccgtgta

301 cttctgcgcc agaccccccg tgtactacga cagcgcttgg tttgcctact ggggccaggg

361 caccctggtc accgtctcca gt

아미노산 서열:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFTAYYINWVRQAPGQGLEWIGRIYPGSGYTSYAQKFQGRATLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARPPVYYDSAWFAYWGQGTLVTVSS

CDR1: AYYIN

CDR2: RIYPGSGYTSYAQKFQG

CDR3: PPVYYDSAWFAY

MF3031: erbB-2 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 ggcccagccggccatggcccaggtccagctgcagcagtctggggctgagctggtgaggcc

61 tggggcttca gtgaagctgt cctgcaaggc ttctggctac actttcactg cctactatat

121 aaactgggtg aagcagaggc ctggacaggg acttgagtgg attgcaaaga tttatcctgg

181 aagtggttat acttactaca atgagaattt caggggcaag gccacactga ctgcagaaga

241 atcctccagt actgcctaca tacaactcag cagcctgaca tctgaggact ctgctgtcta

301 tttctgtgca agaggcgtct atgattacga cggggcctgg tttgcttact ggggccaagg

361 gactctggtc accgtctcca gt

아미노산 서열:

QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTAYYINWVKQRPGQGLEWIAKIYPGSGYTYYNENFRGKATLTAEESSSTAYIQLSSLTSEDSAVYFCARGVYDYDGAWFAYWGQGTLVTVSS

CDR1: AYYINWVKQRPGQGLE

CDR2: NENFRG

CDR3: GVYDYDGAWFAY

MF3991: erbB-2 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 GGCCCAGCCG GCCATGGCCC AGGTGCAGCT GGTGCAGTCT GGCGCCGAAG TGAAGAAACC

61 TGGCGCCAGC GTGAAGCTGA GCTGCAAGGC CAGCGGCTAC ACCTTCACCG CCTACTACAT

121 CAACTGGGTC CGACAGGCCC CAGGCCAGGG CCTGGAATGG ATCGGCAGAA TCTACCCCGG

181 CTCCGGCTAC ACCAGCTACG CCCAGAAGTT CCAGGGCAGA GCCACCCTGA CCGCCGACGA

241 GAGCACCAGC ACCGCCTACA TGGAACTGAG CAGCCTGCGG AGCGAGGATA CCGCCGTGTA

301 CTTCTGCGCC AGACCCCACT ACGGCTACGA CGACTGGTAC TTCGGCGTGT GGGGCCAGGG

361 CACCCTGGTC ACCGTCTCCA GT

아미노산 서열:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFTAYYINWVRQAPGQGLEWIGRIYPGSGYTSYAQKFQGRATLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARPHYGYDDWYFGVWGQGTLVTVSS

CDR1: AYYIN

CDR2: RIYPGSGYTSYAQKFQG

CDR3: PHYGYDDWYFGV

서열 1B (erbB-3 특이적)

MF3178: erbB-3 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 ggcccagccg gccatggccc aggtgcagct ggtgcagtct ggggctgagg tgaagaagcc

61 tggggcctca gtgaaggtct cctgcaaggc ttctggatac accttcaccg gctactatat

121 gcactgggtg cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg atgggatgga tcaaccctaa

181 cagtggtggc acaaactatg cacagaagtt tcagggcagg gtcacgatga ccagggacac

241 gtccatcagc acagcctaca tggagctgag caggctgaga tctgacgaca cggctgtgta

301 ttactgtgca agagatcatg gttctcgtca tttctggtct tactggggct ttgattattg

361 gggccaaggt accctggtca ccgtctccag t

아미노산 서열:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDHGSRHFWSYWGFDYWGQGTLVTVSS

CDR1: GYYMH

CDR2: WINPNSGGTNYAQKFQG

CDR3: DHGSRHFWSYWGFDY

MF3176: erbB-3 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 ggcccagccggccatggccgaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcc

61 tggggggtcc ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc acctttagca gctatgccat

121 gagctgggtc cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtctcagcta ttagtggtag

181 tggtggtagc acatactacg cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa

241 ttccaagaac acgctgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggctgtgta

301 ttactgtgca agagattggt ggtacccgcc gtactactgg ggctttgatt attggggcca

361 aggtaccctg gtcaccgtct ccagt

아미노산 서열:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDWWYPPYYWGFDYWGQGTLVTVSS

CDR1: SYAMS

CDR2: AISGSGGSTYYADSVKG

CDR3: DWWYPPYYWGFDY

MF3163: erbB-3 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 ggcccagccggccatggcccaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcc

61 tggggcctca gtgaaggtct cctgcaaggc ttctggatac accttcaccg gctactatat

121 gcactgggtg cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg atgggatgga tcaaccctaa

181 cagtggtggc acaaactatg cacagaagtt tcagggcagg gtcacgatga ccagggacac

241 gtccatcagc acagcctaca tggagctgag caggctgaga tctgacgaca cggccgtgta

301 ttactgtgca aaagattctt actctcgtca tttctactct tggtgggcct ttgattattg

361 gggccaaggt accctggtca ccgtctccag t

아미노산 서열:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAKDSYSRHFYSWWAFDYWGQGTLVTVSS

CDR1: GYYMH

CDR2: WINPNSGGTNYAQKFQG

CDR3: DSYSRHFYSWWAFDY

MF3099: erbB-3 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 ggcccagccggccatggccgaggtccagctgcagcagcctggggctgagctggtgaggcc

61 tgggacttca gtgaagttgt cctgcaaggc ttctggctac accttcacca gctactggat

121 gcactgggta aagcagaggc ctggacaagg ccttgagtgg atcggaattc ttgatccttc

181 tgatagttat actacctaca atcaaaagtt caagggcaag gccacattaa cagtagacac

241 atcctccagc atagcctaca tgcagctcag cagcctgaca tctgaggact ctgcgctcta

301 ttactgtgca agagggggag attacgacga gggaggtgct atggactact ggggtcaagg

361 aacctcggtc accgtctcca gt

아미노산 서열:

EVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGILDPSDSYTTYNQKFKGKATLTVDTSSSIAYMQLSSLTSEDSALYYCARGGDYDEGGAMDYWGQGTSVTVSS

CDR1: SYWMH

CDR2: ILDPSDSYTTYNQKFKG

CDR3: GGDYDEGGAMDY

MF3307: erbB-3 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 ggcccagccggccatggcccaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcc

61 tggggcctca gtgaaggtct cctgcaaggc ttctggatac accttcaccg gctactatat

121 gcactgggtg cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg atgggatgga tcaaccctaa

181 cagtggtggc acaaactatg cacagaagtt tcagggcagg gtcacgatga ccagggacac

241 gtccatcagc acagcctaca tggagctgag caggctgaga tctgacgaca cggccgtgta

301 ttactgtgca agaggttctc gtaaacgtct gtctaactac ttcaacgcct ttgattattg

361 gggccaaggt accctggtca ccgtctccag t

아미노산 서열:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGSRKRLSNYFNAFDYWGQGTLVTVSS

CDR1: GYYMH

CDR2: WINPNSGGTNYAQKFQG

CDR3: GSRKRLSNYFNAFDY

서열 1C

공통 경쇄

IGKV1-39A의 가변영역

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP

CDR 1: RASQSISSYLN

CDR 2: AASSLQS

CDR 3: QQSYSTPPT

IGKV1-39/jk1

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIK

공통 경쇄 IGKV1-39/jk1 (불변 부위에 밑줄침)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

IGKV1-39/jk5 공통 경쇄 가변 도메인

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIK

서열 1D (erbB-2 특이적)

erbB-2 결합을 위한 중쇄

QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFTAYYINWVRQAPGQGLEWIGRIYPGSGYTSYAQKFQGRATLTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARPPVYYDSAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTDPPSREEMTKNQVSLTCEVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

erbB-3 결합을 위한 중쇄

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDHGSRHFWSYWGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTKPPSREEMTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열 1E

HER2-특이적 Ab 서열

MF2889: erbB-2 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 ggcccagccggccatggccgaggtccagctgcagcagtctggagctgagctggtaaggcc

61 tgggacttca gtgaaggtgt cctgcaaggc ttctggatac gccttcacta attatttgat

121 agagtgggta aagcagaggc ctggccaggg ccttgagtgg attggagtga tttatcctga

181 aggtggtggt actatctaca atgagaagtt caagggcaag gcaacactga ctgcagacaa

241 atcctccagc actgcctaca tgcagctcag cggcctgaca tctgaggact ctgcggtcta

301 tttctgtgca agaggagact atgattacaa atatgctatg gactactggg gtcaaggaac

361 ctcggtcacc gtctccagt

아미노산 서열:

EVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVIYPEGGGTIYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARGDYDYKYAMDYWGQGTSVTVSS

CDR1: NYLIE

CDR2: VIYPEGGGTIYNEKFKG

CDR3: GDYDYKYAMDY

MF2913: erbB-2 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 ggcccagccggccatggccgaggtcaagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcc

61 tggcgcttca gtgaagatat cctgcaaggc ttctggttac tcattcactg actacaaaat

121 ggactgggtg aagcagagcc atggaaagag cctcgaatgg attggaaata ttaatcctaa

181 cagtggtggt gttatctaca accagaagtt caggggcaag gtcacattga ctgttgacag

241 gtcctccagc gcagcctaca tggagctccg cagcctgaca tctgaggaca ctgcagtcta

301 ttattgttca agaggactgt gggatgctat ggactcctgg ggtcaaggaa cctcggtcac

361 cgtctccagt

아미노산 서열:

EVKLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYKMDWVKQSHGKSLEWIGNINPNSGGVIYNQKFRGKVTLTVDRSSSAAYMELRSLTSEDTAVYYCSRGLWDAMDSWGQGTSVTVSS

CDR1: DYKMDWVKQSHGKSLE

CDR2: NQKFRG

CDR3: GLWDAMDS

MF1847: erbB-2 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 ggcccagccggccatggcccaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcc

61 tgggaggtcc ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc accttcagta gctatggcat

121 gcactgggtc cgccaggctc caggcaaggg gctggagtgg gtggcagtta tatcatatga

181 tggaagtaat aaatactatg cagactccgt gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa

241 ttccaagaac acgctgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gctgaggaca cggccgtgta

301 ttactgtgca aaaggttggt ggcatccgct gctgtctggc tttgattatt ggggccaagg

361 taccctggtc accgtctcca gt

아미노산 서열:

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWWHPLLSGFDYWGQGTLVTVSS

CDR1: SYGMH

CDR2: VISYDGSNKYYADSVKG

CDR3: GWWHPLLSGFDY

MF3001: erbB-2 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 ggcccagccggccatggccgaggtccagctgcagcagtctggggctgaactggcaaaacc

61 tggggcctca gtgaagctgt cctgcaagac ttctggctac aactttccta tctactggat

121 gcactgggta aaacagaggc ctggacgggg tctggaatgg attggataca ttaatcctag

181 tactggttat attaagaaca atcagaagtt caaggacaag gccaccttga ctgcagacaa

241 atcctccaac acagcctaca tgcagctgaa cagcctgaca tatgaggact ctgcagtcta

301 ttactgtaca agagaaggga taactgggtt tacttactgg ggccaaggga ctctggtcac

361 cgtctccagt

아미노산 서열:

EVQLQQSGAELAKPGASVKLSCKTSGYNFPIYWMHWVKQRPGRGLEWIGYINPSTGYIKNNQKFKDKATLTADKSSNTAYMQLNSLTYEDSAVYYCTREGITGFTYWGQGTLVTVSS

CDR1: IYWMHWVKQRPGRGLE

CDR2: NQKFKD

CDR3: EGITGFTY

MF1898: erbB-2 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 ggcccagccggccatggcccaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcc

61 tgggaggtcc ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc accttcagta gctatggcat

121 gcactgggtc cgccaggctc caggcaaggg gctggagtgg gtggcagtta tatcatatga

181 tggaagtaat aaatactatg cagactccgt gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa

241 ttccaagaac acgctgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gctgaggaca cggccgtgta

301 ttactgtgca aaagatggtt tccgtcgtac tactctgtct ggctttgatt attggggcca

361 aggtaccctg gtcaccgtct ccagt

아미노산 서열:

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGFRRTTLSGFDYWGQGTLVTVSS

CDR1: SYGMH

CDR2: VISYDGSNKYYADSVKG

CDR3: DGFRRTTLSGFDY

MF3003: erbB-2 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 ggcccagccggccatggcccaggtgcagctgaagcagtctggacctgagctggtgaagcc

61 tggggcctca gtgaagattt cctgcaaggc ttctggcgac gcattcagtt actcctggat

121 gaactgggtg aagcagaggc ctggaaaggg tcttgagtgg attggacgga tttatcctgg

181 agatggagat attaactaca atgggaagtt caagggcaag gccacactga ctgcagacaa

241 atcctccagc acagcccacc tgcaactcaa cagcctgaca tctgaggact ctgcggtcta

301 cttctgtgca agaggacagc tcggactaga ggcctggttt gcttattggg gccaggggac

361 tctggtcacc gtctccagt

아미노산 서열:

QVQLKQSGPELVKPGASVKISCKASGDAFSYSWMNWVKQRPGKGLEWIGRIYPGDGDINYNGKFKGKATLTADKSSSTAHLQLNSLTSEDSAVYFCARGQLGLEAWFAYWGQGTLVTVSS

CDR1: YSWMNWVKQRPGKGLE

CDR2: NGKFKG

CDR3: GQLGLEAWFAY

HER3-특이적 Ab 서열s

MF6058: erbB-3 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 GGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGACGTGAAGAAGCC

61 TGGGGCCTCA GTGAAGGTCA CGTGCAAGGC TTCTGGATAC ACCTTCACCG GCTACTATAT

121 GCACTGGGTG CGACAGGCCC CTGGACAAGC TCTTGAGTGG ATGGGATGGA TCAACCCTCA

181 AAGTGGTGGC ACAAACTATG CAAAGAAGTT TCAGGGCAGG GTCTCTATGA CCAGGGAGAC

241 GTCCACAAGC ACAGCCTACA TGCAGCTGAG CAGGCTGAGA TCTGACGACA CGGCTACGTA

301 TTACTGTGCA AGAGATCATG GTTCTCGTCA TTTCTGGTCT TACTGGGGCT TTGATTATTG

361 gggccaaggt accctggtca ccgtctccag t

아미노산 서열:

QVQLVQSGADVKKPGASVKVTCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQALEWMGWINPQSGGTNYAKKFQGRVSMTRETSTSTAYMQLSRLRSDDTATYYCARDHGSRHFWSYWGFDYWGQGTLVTVSS

CDR1: GYYMH

CDR2: WINPQSGGTNYAKKFQG

CDR3: DHGSRHFWSYWGFDY

MF6061: erbB-3 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 GGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCC

61 TGGGGCCTCA GTGAAGGTCT CCTGCAAGGC TTCTGGATAC ACCTTCACCG GCTACTATAT

121 GCACTGGGTG CGACAGGCCC CTGGACAAGG GCTTGAGTGG ATGGGATGGA TCAACCCTCA

181 GAGTGGTGGC ACAAACTATG CACAGAAGTT TAAGGGCAGG GTCACGATGA CCAGGGACAC

241 GTCCACCAGC ACAGCCTACA TGGAGCTGAG CAGGCTGAGA TCTGACGACA CGGCTGTGTA

301 TTACTGTGCA AGAGATCATG GTTCTCGTCA TTTCTGGTCT TACTGGGGCT TTGATTATTG

361 gggccaaggt accctggtca ccgtctccag t

아미노산 서열:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPQSGGTNYAQKFKGRVTMTRDTSTSTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDHGSRHFWSYWGFDYWGQGTLVTVSS

CDR1: GYYMH

CDR2: WINPQSGGTNYAQKFKG

CDR3: DHGSRHFWSYWGFDY

MF6065: erbB-3 결합 항체의 중쇄 가변영역 서열

1 GGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCC

61 TGGGGCCTCA GTGAAGGTCT CCTGCAAGGC TTCTGGATAC ACCTTCACCT CTTACTATAT

121 GCACTGGGTG CGACAGGCCC CTGGACAAGG GCTTGAGTGG ATGGGATGGA TCAACCCTCA

181 GGGGGGTTCT ACAAACTATG CACAGAAGTT TCAGGGCAGG GTCACGATGA CCAGGGACAC

241 GTCCACCAGC ACAGTGTACA TGGAGCTGAG CAGGCTGAGA TCTGAGGACA CGGCTGTGTA

301 TTACTGTGCA AGAGATCATG GTTCTCGTCA TTTCTGGTCT TACTGGGGCT TTGATTATTG

361 gggccaaggt accctggtca ccgtctccag t

아미노산 서열:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPQGGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSRLRSEDTAVYYCARDHGSRHFWSYWGFDYWGQGTLVTVSS

CDR1: SYYMH

CDR2: WINPQGGSTNYAQKFQG

CDR3: DHGSRHFWSYWGFDY

명확하고 간결한 설명을 위해 본 발명의 특징을 동일하거나 분리된 구현예로 서술하였으나, 발명의 범위에는 서술된 기술적 특징들의 전부 또는 일부가 조합된 구현예들도 포함될 수 있는 것으로 인정된다.

도 1은 MF3178 변이체의 아미노산 정렬을 보여주는 그림이다. 각 점은 해당 위치에서 MF3178와 동일한 아미노산을 가짐을 나타내고, MF3178의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 밑줄 친 굵은 글자로 나타내었다.
도 2는 이중특이적 항체가 단클론 항체에 비해 인 비보에서 종양-타겟팅이 증가하였음을 보여주는 그림이다. 마이크로-PET 이미지를 통해 PB4188 변이체가 HER3 단클론에 비해 보다 효율적으로 종양 내에 축적됨을 확인하였다(도 2a). 감마 계수기(Gamma-counter)를 이용한 종양 내 방사성의 정량을 통해 종양 내 PB4188 변이체 수준이 부모의 항-HER3 항체에 비해 2.5배 높음(도 2b). 4 mAb에서 48시간 동안의 종양 흡수의 정량적인 생체 분포를 측정한 결과를 조직의 그램당 주입된 용량(%ID/g)으로 표시하였으며, 에러바는 ±S를 나타낸다(도 2c).
도 3은 EGFR:HER2, HER2:HER3 및 HER2:HER4 어세이의 항체 길항제 용량 반응 곡선을 나타낸 그림이다. EGFR:HER2는 리포터 세포를 37℃에서 4시간 동안 2.5K/웰로 씨딩하고 HER2:HER3 및 HER2:HER4의 경우 5K/웰로 씨딩하였다. 항체를 순차적으로 희석하여 37℃에서 3시간 동안 배양한 다음, 16시간 동안 10ng/ml의 EGF(EGFR:HER2의 경우) 또는 30 ng/ml의 HRG-β2(HER2:HER3 및 HER2:HER4의 경우)로 각각 자극하였다. 리간드 만의 적정을 24시간 동안 인큐베이션함으로써 아고니스트의 기준 자극 곡선을 수득하였다. 각 데이터 포인트는 각 용량 당 4회 실험에 대한 평균 및 표준 편차를 나타낸다. GraphPad Prism에서 데이터를 플롯팅하고‘log(억제제) vs 반응^-다양한 반응(4개 파라미터)’을 이용하여 곡선 적합(Curve fitting)을 수행하여 IC50을 계산하였다.
도 4는 상이한 군(그룹)에서 각 마우스의 체중 변화를 보여주는 그림이다. OV-10-0050로 확립된 종양을 가지는 암컷 BALB/c 누드 마우스에 MCLA-128, PG2863 및 PG2869 항체를 투여한 뒤 체중의 변화를 관찰하였다. 데이터 포인트는 각 군의 평균 체중을 나타내며, 에러바는 평균값에 대한 표준 오차(SEM)를 나타낸다.
도 5는 상대적인 체중 변화량(%)을 나타내는 그림이다. 체중 변화는 투여 첫날의 동물의 체중을 기반으로 계산하였다. 데이터 포인트는 각 군의 체중의 평균 변화량(%)을 의미하며, 에러바는 평균값에 대한 표준 오차(SEM)를 나타낸다.
도 6은 종양의 성장 곡선을 나타낸다. OV-10-0050로 확립된 종양을 가지는 BALB/c 누드 마우스에 MCLA-128, PG2863 및 PG2869 항체를 투여한 뒤 종양의 부피를 조사하였다. 데이터 포인트는 각 군의 평균을 의미하며, 에러바는 평균값에 대한 표준 오차(SEM)를 나타낸다.
도 7은 종양 세포주인 MDA-MB-175 및 OV-10-0050의 성장이 인 비트로와 인 비보에서 억제됨을 보여주는 그림이다. DOC4-NRG1 및 CLU-NRG1 유전자 융합이 각각 MDA-MB-175 세포주(유방암) 및 OV-10-0050 PDX(난소암)에서 발현되었다. 좌측 패널은 인 비트로에서 MCLA-128를 처리하자 MDA-MB-175 세포 증식이 억제됨을 보여주고, 우측 패널은 인 비보에서 MCLA-128를 처리하자(28일째까지 매주 25 mg/kg) 종양의 성장이 감소하면서 6/8 동물에서 종양이 소멸함을 보여준다.

실시예

HER2 x HER3 이중특이적 항체(PB4188)와 HER3 2가(bivalent) 단클론 항체를 비교하면서 이미지화 실험을 수행하였다. PB4188의 변이체와 항-HER3 MF3178(부모 항체)를 64Cu로 표지하고 HER2 유전자-증폭된 JIMT-1 종양을 이식한 마우스에 정맥 주사하였다. 마이크로-PET 이미지를 통해 PB4188 변이체가 HER3 단클론 항체보다 더 효과적으로 종양 내에 축적됨을 알 수 있었다(도 2a). 종양 내의 방사능에 대한 감마 계수기 정량화 결과 종양 내의 PB4188 변이체 수준이 항-HER3 항체보다 2.5배 높음을 확인하였다(도 2b). 종합하면, 인 비트로 및 인 비보 데이터를 통해 HER2-타겟팅을 통해 종양세포 상의 PB4188에 대한 결합이 강화될 수 있음을 알 수 있다.

항-HER2 (MF3958) 항체를 이용하여 추가적인 연구를 수행하였다. 64Cu로 표지된 각각의 항체를 HER2 유전자-증폭된 JIMT-1 종양이 이식된 마우스에 주입한 결과를 도 2c에 요약하였다(각 항체를 처리한 마우스 n=4).

실험방법

체내 분포 연구. bAb PB4188, 항-HER2 MF3958 및 항-HER3 MF3178의 변이체를 양기능성(bifunctional) 킬레이터에 접합시켰다[Paterson 2014 Dalton Transactions]. 타겟에 접합된 생성물들의 결합 특성은 유세포 분석-기반 어세이로 확인하였다. 이후 단백질을 64Cu로 표지하고 JIMT-1 유방암이 이식된 마우스 꼬리 정맥(도 2a-2b 및 도 2c 중“i.v.”) 또는 복강 (도 2c 중“i.p.”)으로 방사능 표지된 항체를 주사하였다. 주사 48시간 뒤 마이크로PET/CT 이미지를 수득한 다음, 종양을 잘라내고 감마 계수기로 방사성을 측정하였다. 측정 결과는 조직(g) 당 주사된 용량 백분율로 표현하였다.

실시예 2: 헤테로다이머 형성의 억제

효소절편 상보기술(enzyme fragment complementation technology)에 기반한 효소절편 헤테로다이머화 어세이를 사용하였다. β-갈락토시다제 효소는 인위적으로 두 개의 비활성 절편으로 쪼개질 수 있는데, 이들 효소 공여자 및 효소 수용자는 가까이 접근해야만 결합하여 활성의 효소가 될 수 있다. 효소 공여자 또는 효소 수용자를 인코딩하는 각 서열은 각 헤테로다이머화 파트너의 세포외 및 막관통 도메인에 연결되어 있다. 양 유전자는 이후 U2OS 세포에 공-형질전환되어 β-갈락토시다제의 한쪽 도메인(ED 또는 EA)에 연결된 RTK 수용체의 세포외 도메인을 발현한다. 하나의 RTK 수용체를 주동적으로 자극하면, 양 RTK 수용체는 다이머화되어 완전한 형태의 활성형 β-갈락토시다제 효소의 형성을 유도한다. 궁극적으로, β-갈락토시다제 활성은 가수분해시 빛을 방출하는 기질을 첨가함으로서 측정된다.

항체는 EGFR:HER2, HER2:HER3 및 HER3:HER4 헤테로다이머화 리포터 세포주에서 시험하였다. RTK 헤테로다이머화 어세이를 MCLA-128 (MF3178 암(arm) 및 MF3958 암); 항-HER3 항체 MF3178/PG3178 및 PG3793/AMG-888/파트리투맙; 및 항-HER2 항체 MF3958/PG3958, PG2867/트라스투주맙, PG2869/퍼투주맙 및 퍼제타(Perjeta)(퍼투주맙의 임상시험용 배치)의 이중특이적 항체를 가지고 수행하였다. EGFR:HER2 및 HER2:HER3, HER2:HER4 어세이에서의 EGF 및 HRG 역가는 용량-의존적 아고니스트 반응을 보였다(도 3). MCLA-128은 특히 HER2:HER3 다이머 형성을 완전히 억제하였으며 EGFR:HER2 또는 HER2:HER4 헤테로다이머화에는 영향을 미치지 않았다. 반면, 트라스투주맙(PG2867)은 EGFR:HER2 및 HER2:HER3 어세이에서 부분적 길항제로 작용하였다.

MCLA-128 및 PG3178은 가장 강력하게 HRG-유도 HER2:HER3 다이머화를 완전히 억제하였다(표 1).

RTK 헤테로다이머화 어세이에서 시험한 항체의 EC50값. EC50은 Prism에서 비선형 회귀분석(4개 파라미터)으로 측정함.

IC50 (nM)	EGFR:HER2	HER2:HER3	HER2:HER4
PG1337	-	-	-
PB4188	-	1.12	-
PG3187	-	1.27	-
PG3958	-	-	1.69
PG2867	0.30	4.91	0.63
PG2869	0.47	4.22	2.91
PG3793	-	3.23	-
Perjeta	0.61	6.26	5.44
아고니스트	0.02	0.22	0.08

트라스투주맙의 효능은 HER2:HER3 어세이에서 MCLA-128 또는 PG3178에 비해 4배 낮았다. 퍼제타(임상용 퍼투주맙)는 세 개의 어세이 모두에서 완전한 길항제로서 작용하였으며, PG2867(퍼투주맙)과 유사한 특성을 보였다. HER2:HER4 어세이에서, 항-HER2 PG3958 및 PG2867(퍼투주맙) 모두 용량 의존적으로 다이머화가 조금 감소하였다. EGFR:HER2 어세이에서 PG1337, MCLA-128, PG3178 및 PG3958의 농도가 높을 때, 비특이적 반응이 조금 관찰되었다.

MCLA-128는 HER2:HER3 헤테로다이머만을 특이적으로 억제하였다. 이는 HER2와 결합 시, MCLA-128은 EGF를 자극할 때 HER2와 EGFR 간의 상호작용을 방해해서도 안되고, HRG를 자극할 때 HER2와 HER4의 헤테로다이머화를 방해해서도 안된다는 것을 보여준다.

후자는 T47D 세포의 HRG-유도 세포 주기-기반 증식 어세이에서 관찰된 바와 일치한다. 이들 세포를 이용한 어세이로는 HER4가 HER3에 비해 많이 발현되는 데에 기여하는 것으로 보이는 MCLA-128 또는 PG3178의 억제제 활성을 측정할 수 없었다. HRG는 바람직하게는 T47D 세포에서 HER2:HER3가 아니라 HER2:HER4를 경유하여 신호를 전달하는 것으로 생각되며, 이 때문에 MCLA-128의 효능이 없는 것으로 보이고, 이는 MCLA-128가 HRG-유도 HER2:HER4 다이머가 아닌 HRG-유도 HER2:HER3 다이머에 대해 특이성을 가짐을 말해준다.

최근 연구에서, 트라스투주맙은 EGFR:HER2 및 HER2:HER3의 EGF- 및 HRG-유도 헤테로다이머화를 각각 차단하였다. 트라스투주맙 및 퍼투주맙은 각각 부분적 및 전체적으로 길항제로 작용했는데, 이는 트라스투주맙이 HER2의 리간드-비의존성 활성화를 차단하는 반면 퍼투주맙은 리간드-의존성 신호전달을 억제한다는, 일반적으로 받아들여지는 주장과 일치한다. 트라스투주맙의 억제적 반응이 관찰된 것은 양쪽 타겟의 과발현에 기인한 것을 수 있다. 이는 종래의 면역침강 실험보다 더 민감한 정보를 제공한다.

마지막으로, PG3793이 PG3178보다 MCF-7에 대해 더 낮은 결합 친화도를 보인 반면, HER2:HER3 헤테로다이머화 어세이에서의 낮은 효력은 덜 심각했다(다이머화 어세이에서는 2.5배 차이이고 결합 어세이 친화도에서는 30배 차이). 이러한 결합 친화도와 길항능력 간의 불일치는 MCLA-128 및 PG3178의 경우에 관찰된 바 있다. PG3178가 MCF-7에 MCLA-128보다 조금 더 나은 친화도로 결합하는 반면, MCLA-128가 세포 주기-기반 증식 어세이에서는 PG3178보다 우수했다.

실시예 3

연구 목적 및 규정 준수

본 연구의 목적은 인간 난소암 PDX 모델의 BALB/c 누드 마우스에 MCLA-128, PG2863 및 PG2869 항체를 피하주사했을 때의 인 비보 항-종양 효능을 평가하는 것이다.

실험 설계

실험 설계는 표 2에 나타냈다. 모든 그룹에서, 2일 째(1차 투여 24시간 뒤)에 4마리 동물에서, 그리고 6일째(1차 투여 5일 뒤)에 나머지 4마리 동물에서 혈액을 샘플링하였다. 지정된 시점에, 50-100μl 혈액을 살균 튜브(Microvette CB300Z 응고 활성화제/혈청, Sarstedt B.V. cat#16.440.100)에 채취하여 시료가 45분 동안 상온에서 응고되도록 하고, 10분간 3000 rpm에서 원심분리한 액상의 층(약 20μl 혈청)을 취하여 다른 살균된 에펜도르프 튜브에 담아 -80℃로 즉각 저장하였다. 시료는 드라이 아이스에 넣어 선적하였다.

실험 설계

그룹	_N ^a	처리	용량 mg/kg	용량 부피 ml/kg	Conc. mg/ml
1	8	비이클 대조군 (DPBS)	--	10	--
2	8	MCLA-128	25	10	2.5
3	8	PG2863	25	10	2.5
4	8	PG2869	25	10	2.5

a. N: 그룹당 돌물 수;

b. 용량 부피: 체중 10μl/g에 기반하여 투여 부피 조절.

모든 동물은 1, 8, 15, 22, 29 일째에 투여하였다(5 주간 주 1회).

모든 동물에서 I.P. 경로로 투여하였다.

종양 시료를 마지막 투여 후 48시간 뒤에 수집하였다(31일 째). 종양을 중성 완충된 포르말린에 24시간 동안 고정하고(조직:고정액 비율은 최소 1:20), FFPE 블록으로 전환하였다.

중성 완충 포르말린의 제작: PBS 분말 주머니 하나를 투명한 5L-부피측정 플라스크에 넣고，4.5 L 탈이온수를 첨가한 다음 교반함으로써 투명한 용액이 될 때까지 분말을 분산시켰다. 이후 500 ml 포름알데히드를 첨가하여 균질 용액이 수득될 때 까지 교반하였다.

실험 재료

동물 : 종: Mus musculus: 주(Strain): BALB/c 누드; 연령: 6-8 주; 성별: 암컷 체중: 18-22 g; 동물 수: 32마리 마우스 및 예비동물

동물 제공자: Shanghai Sino-British SIPPR/BK Laboratory Animal Co., LTD.

식이: 연구 전 기간 동안, 동물들을 방사선 멸균된 건조 알갱이 먹이에 자유롭게 접근하도록 하였다; 물: 동물들이 멸균 식수에 자유롭게 접근할 수 있도록 하였다.

항체 패키지 및 보관 조건:

MCLA-128; 냉동바이알(cryovial), 2.5 mg/ml의 10 x 1.5 ml/바이알을 4℃에 보관.

PG2863; 냉동 바이알, 2.5mg/ml의 10 x 1.5ml/바이알을 4℃에 보관.

PG2869; 냉동 바이알, 2.5mg/ml의 10 x 1.5ml/바이알을 4℃에 보관.

PDX 모델의 제작

인간 난소암 PDX 모델인 OV-10-0050를 3기 난소 선암에 걸린 48세 여성 환자로부터 확립하였다. 외과적으로 절개한 임상 시료를 누드 마우스(P0(passage 0)으로 정의)에 이식하고 이후의 연속된 이식을 P1, P2,.. 등으로 정의하였다. 본 연구에서는 P6 종양 조직이 사용되었다.

종양 이식

각 마우스에 가위로 자른 OV-10-0050 P6 종양 조각(~30 mm³)이 우측면에 피하로 이식하여 종양을 발달시켰다. 약물 처리는 평균 종양 크기가 대략 152 mm³에 도달하는 종양 이식 30일 후에 개시하였다. 32마리의 종양 이식 마우스를 층화 무작위 배정(stratified randomization) 방법으로 무작위로 4 그룹을 나누어 각 그룹은 8마리의 종양-이식 마우스로 구성되었다. 무작위 배정을 한 날을 1일로 설정하여 약물 처리를 시작하였다. 시험 물질을 실험 설계표(표 2)에 나타난 미리 정해진 투약 계획에 따라 마우스에 투여하였다.

관찰

본 연구에서 동물을 취급하고 다루고 처리하는 모든 절차는 실험동물관리평가인증협회(AAALAC)의 지침을 따르는 WuXi AppTec의 동물실험윤리위원회(IACUC)의 승인을 받은 가이드라인에 따라 수행되었다. 일상적인 모니터링 시에, 동물에서 종양의 성장과 운동성, 음식 및 음수의 소모(육안 관찰), 체중 증가/감소 (체중은 주 2회 측정), 눈/모발 무광택도와 같은 정상적인 행동 및 프로토콜에 기재된 다른 이상 효과에 대한 영향을 매일 체크하였다. 사망 및 관찰된 임상적 신호를 각 집단 내 동물의 수에 기반하여 기록하였다.

종양 측정

종양 성장이 지연되거나 마우스가 치료될 수 있는지 여부를 시험하였다. 종양 크기는 매주 2회 캘리퍼스를 이용하여 2차원적으로 측정하였고, 부피는 V = 0.5 a x b2(a 및 b는 각각 종양의 긴 직경과 짧은 직경)의 식을 이용하여 mm³로 표시하였다. 종양 크기를 이용하여 T-C, T/C 및 TGI 값을 계산하였다. T-C는 처리 그룹의 종양이 미리 정해진 크기(예를 들어 500 mm³)에 도달하는데 필요한 중앙 시간(일수)이며, C는 대조군 그룹의 종양이 동일한 크기에 도달하는데 필요한 중앙 시간(일수)이다. T/C 값(백분율)은 항종양 효력의 척도이다; T 및 C는 각각 주어진 시점(일수)에서 처리군과 대조군의 평균 부피이다. 각 그룹에 대한 TGI는 다음의 식을 이용하여 계산하였다: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)] ×100; Ti는 주어진 시점에서의 처리군의 평균 종양 부피, T0는 처리 첫날에서의 처리군의 평균 종양 부피, Vi는 Ti와 동일한 날의 비이클 대조군 그룹의 평균 종양 부피, 그리고 V0는 처리 첫날에서의 비이클 그룹의 평균 종양 부피이다.

통계적 분석

평균 및 평균의 표준 오차(SEM)를 포함하는 요약통계(Summary statistics)를 각 시점에서의 각 그룹의 종양 부피에 대해 계산하였다(표 3에 상술). 최종 투여(그루핑 후 29일 경과) 후 가장 최선의 치료 시점에 수득한 데이터에 대해 그룹 간 종양 부피의 차이에 대한 통계적 분석과 약물 상호 작용에 대한 분석을 수행하였다.

그룹 간 종양 부피를 비교하기 위해 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 수행하였으며, 유의한 F-통계량(P <0.001, 오차분산과 처리분산의 비율)이 얻어질 경우, Games-Howell을 이용하여 그룹 간 비교를 수행하였다. 모든 데이터는 SPSS 17.0를 이용하여 분석하였으며, p<0.05인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

결과

사망, 질병 및 체중의 증감

독성을 간접적으로 측정하기 위해, 실험동물의 체중을 정기적으로 모니터링하였다. 시험물질 투여로 인해 체중이 감소한 그룹은 없었으며(도 4) 사망이나 질환도 관찰되지 않았다. 따라서, MCLA-128, PG2863 및 PG2869 항체를 종양-이식 BALB/c 누드 마우스에 투여함으로서 나타나는 명백한 독성은 없는 것으로 보인다.

MCLA-128, PG2863 및 PG2869 항체를 투여한 OV-10-0050 이식 암컷 BALB/c 누드 마우스에서의 체중 변화는 도 4 및 도 5에 나타내었다. MCLA-128, PG2863 및 PG2869 항체를 투여한 OV-10-0050 이식 암컷 BALB/c 누드 마우스에서 시간에 따른 평균 종양 부피는 표 3에 나타내었다. 도 6은 종양의 성장을 보여준다.

시간 경과에 따른 종양 부피(mm³)^a

날 ^b	비이클(DPBS)	MCLA-128 25mg/kg	PG2863 25mg/kg	PG2869 25mg/kg
1	152±17	151±21	152±18	152±21
5	239±18	75 ±12	87 ±10	41±8
8	332±26	69 ±15	115±10	12±1
12	434±50	47 ±11	98 ±13	9 ±1
15	520±63	36 ±10	108±16	6 ±1
19	598±64	26±8	92 ±16	4 ±1
22	718±88	23±8	106±21	3 ±1
26	911±118	21±9	91 ±16	2 ±1
29	1,161±182	23 ±11	108±22	1 ±0

a. 평균 ± 표준오차; b. 실험 날짜

실험결과 및 고찰

본 연구에서 단일 제제로서의 MCLA-128, PG2863 및 PG2869 항체의 치료 효능을 OV-10-0050 인간 난소암 이식 모델에서 평가하였다. 각 그룹에서 종양 접종 후 상이한 시점에서 측정한 종양 크기를 표 3, 표 4 및 도 4에 나타내었다.

비이클 처리 대조군 마우스의 평균 종양 크기는 그루핑 29일 뒤에 1,161 mm³에 이르렀다. 시험물질인 MCLA-128, PG2863 및 PG2869 항체를 25 mg/kg(QW x 5주) 처리하자 유의한 항종양 활성이 나타났다: 이들의 평균 종양크기는 동일한 시점에 각각 23, 108 및 1 mm³였고(T/C 값=1.95%, 9.28% 및 0.06%; TGI 값 =112.78%, 104.37% 및 114.96%; p값=0.002, 0.003 및 0.002), 이들의 종양 성장은 500mm³의 종양크기에서 비이클 그룹에 비해 모두 14일 이상 지연되었다. 투여를 통해 종양의 부분적 관해(regression) 또는 완전한 관해가 일어났다. 3번의 연속적인 측정을 통해 종양 부피가 1일차 때 부피에서 50% 이상 감소하고 세 번의 측정 중 한번 이상이 ≥13.5mm³감소한 경우 마우스는 부분적 관해(PR)가 일어난 것으로 간주하였다. 세번의 연속적인 측정 모두 <13.5mm³감소한 경우 완전한 관해(CR)가 나타난 것으로 판단하였다. 본 연구 종료시까지 명백한 종양이 검출되지 않은 경우 무종양 생존으로 간주하였다.

MCLA-128, PG2863 및 PG-2869로 처리하자 상이한 PR, CR 및 TFS 비율이 나타났다. 각 그룹 내에서 PR, CR 및 TFS를 보이는 마우스 숫자를 표 5에 표시하였다. 모든 시험물질은 종양-이식 동물에 의해 잘 흡수되었다. 모든 처리 그룹에서 체중 손실은 관찰되지 않았다.

요약하면, 이들 3개의 시험 항체는 단일 제제로서 OV-10-0050 인간 난소암 이식 모델에 대해 유의한 항종양 활성을 나타내었다. 이는 종양-이식 동물에 의해 잘 흡수되었다. 이러한 결과는 상기 항체가 안전하고 효과적인 항암제임을 보여준다.

OV-10-0050 모델에서 MCLA-128; PG2863 및 PG2869 항체 주입 후 그루핑 29일 뒤에 종양부피를 측정하여 계산한 종양성장억제 결과

처리	종양 크기 (mm³)^a	T/C^b (%)	TGI (%)	T-C (days) At 500mm³	p 값^c
비이클 (DPBS)	1,161 ± 182	-		0	-
MCLA-128 (25mg/kg)	23 ± 11	1.95	112.78	>14	0.002
PG2863 (25 mg/kg)	108 ± 22	9.28	104.37	>14	0.003
PG2869 (25 mg/kg)	1 ± 0	0.06	114.96	>14	0.002

a. 평균 ± 표준오차.

b. 종양성장 억제는 처리군의 그룹 평균 종양 부피를 대조군의 룹 평균 종양 부피로 나눔으로써 계산하였다(T/C). 시험 물질이 항-종양 활성을 가지는 것으로 간주하려면, T/C는 50% 이하여야 한다. TGI는 TGI(%) = [1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)]×100의 식을 이용하여 계산하였다.

c. p 값은 비이클 그룹과 비교한 종양 크기에 기반하여 계산하였다.

상이한 처리에 대한 PR, CR 및 TFS 통계값

처리	PR	CR	TFS
MCLA-128(25mg/kg)	3	5	0
PG2863(25mg/kg)	3	0	0
PG2869(25mg/kg)	0	8	3

실시예 4

MCLA-128은 암세포의 증식과 생존에 관여하는 HER2 및 HER3 수용체인 티로신 인산화효소(RTK)를 타겟팅하는 이중특이적 항체이다. MCLA-128은 헤레굴린(HRG)-유도 HER3 신호전달 및 증식 측면에서 심도 있게 연구된 바 있다. 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 HER2:HER3 신호를 각각 차단할 수 있는 항-HER2 항체인 퍼투주맙(PG2869)과 트라스투주맙(PG2867)의 조합[Agus 2002; Juntilla 2009]; HRG-유도 HER3 활성화를 차단할 수 있는 항-HER3 MM-121 (PG2863)[Schoeberl 2010]보다 강력한 인 비트로 활성을 가지는 것으로 나타났다.

MCLA-128는 HRG 유전자를 포함하는 융합 유전자 발현 세포에서 항-종양 활성도 나타낸다. MDA-MB-175 세포주는 DOC4-NRG1 유전자 융합을 포함하여, 결과적으로 NRG1 발현에 기인한 증식성의 자가분비 순환이 일어난다. 이러한 유전자 융합은 아직 암 환자에서는 발견된 바 없다[Sanchez-Valdivieso 2002].

유방암 세포주의 패널에서, MDA-MB-175 세포는 MCLA-128 단일 제제에 민감성을 보임으로써 HER3/HRG 신호축이 이 세포주에서 중요함을 알 수 있었다(도7 좌측 패널). 인 비보에서도 이 세포주에서 퍼투주맙 단일 투여에 의해 HER2의 활성화되어 정위(orthotopic) MDA-MB-175 종양 성장을 억제함이 확인되었으나, 트라스투주맙은 그렇지 않았다. 유방암 환자에서 DOC4-NRG1 유전자 융합이 관련되었는지 논란이 되어왔으나[S

nchez-Valdivieso 2002], 다른 유전자 융합이 주의를 끌게 되었다. 특히, CD74-NRG1 융합은 비소세포 폐암의 하위 그룹인 침습적 점액 선암의 독립적 그룹에서 보고되었다[Fernandez-Cuesta 2014, Duruisseaux 2016]. 폐암에서도 VAMP2-NRG1, RBPMS-NRG1 및 WRN-NRG1과 같은 몇몇 다른 NRG1 유전자 융합이 검출되었으며, 난소암에서도 RAB2IL1-NRG1가 검출되었다[Jung 2015, Dhanasekaran, 2014]. 이러한 유전자 융합의 다양성은 위치 이동이 잘 일어나는 8번 염색체 상의 NRG1 유전자의 위치와 관련되어있을 수 있다[Adela

de 2003].

OV-10-0050은 HER-의존성인 것으로 나타났다. 아파티닙(afatinib, HER3의 트랜스-인산화도 억제하는 EGFR 및 HER2에 대한 비가역적 억제제)를 처리할 경우 종양 성장이 억제되었다. MCLA-128의 항-종양 효능을 PBS와 비교하였다(도 7, 우측 패널).

마우스: NOD-SCID, Crl:NU(NCr)-Foxn1nu 및 BALB/c 누드 마우스. 항체는 4주간 25 mg/kg 용량으로 투여하였다. 종양 부피는 주 2회 캘리퍼스로 측정하였다.

실시예 5: 고형 종양 환자에서 HER2 및 HER3를 타겟팅하는 전장 IgG1 이중특이적 항체 MCLA-128의 I/Ⅱ기 연구

연구 기간

본 연구의 용량 확대 부분(파트 1, 2015년 2월 3일에 첫 환자 투여)은 28명의 환자를 선발한 뒤에 완료하였다. 파트 2의 첫 환자는 용량 확대 단계에서 2016년 1월 15일에 유럽에서 투여하였다. 파트 2의 전체 기간은 대략 25 - 32개월이나, 실질적인 기간은 예를 들어 전체 대상자 선발률과 같은 몇몇 변수에 의해 영향을 받는다.

장소의 수:

13개에 이르는 장소에서 연구가 진행되었다. 만족할만한 등록률을 담보하거나 미등록/철회된 장소를 대체하기 위해 그 밖의 장소가 추가될 수 있다.

환자 수:

28명의 환자를 파트 1에 배당하였다. 파트 2에는 최소 20명의 평가 가능한 환자, 최대 약 40명의 환자를 침습적 점액선암 또는 기록된 NRG1 융합(NSCLC)을 가지는 진행성/전이성 비소세포폐암 그룹에 등록시켰다.

질환 진행 이외의 다른 이유로 최소 2 순환의 연구 처리(투여)를 완료하지 못한 환자는 효능 평가에서 제외하고 각 그룹 내에서 다른 환자로 대체되었다.

본 실시예에서는 파트 2에 대해 기술한다. 본 실시예가 Erb-2, Erb-3 결합 이중특이적 항체인 MCLA-128의 투여에 대해 기술하고 있으나, 이에 의해 이러한 특정 구현예의 용도가 제한되는 것은 아니며, 본 발명에서 언급하는 다른 이중특이적 항체에도 적용된다.

연구 목적:

파트 1

목적
1차:
MCLA-128의 MTD 및/또는 MRD의 결정	이상사례(AEs) 및 용량제한독성(DLT)의 평가.
2차:
MCLA-128의 안정성 및 내성 조사.	AEs/심각한 이상사례(SAE)의 빈도 및 특성.
MCLA-128의 PK 프로파일.	총 노출, 최대 농도(C_max) 청고율(clearance), 분포용적(V), 정체기 분포용적(V_ss), 반감기(t_1/2), AUC_0-t(제로 시간에서 시간 t까지의 농도 대 시간 곡선의 면적), AUC_0-∞(농도 대 시간 곡선의 면적), t_max(최대 농도에 이르는 시간)을 포함하는 PK 변수 평가.
MCLA-128의 면역원성.	CLA-128에 대한 항-약물 항체반응의 발생률 및 혈청 역가.
항-종양 반응 및 CBR의 평가.	RECIST v1.1에 의한 항-종양 활성 및 임상적 이점 평가 전체 객관적 반응률(ORR), 반응 기간(DOR), 무진행 생존(PFS) 및 생존; CBR은 완전반응(CR) 또는 부분적 반응(PR) 또는 안정적 질환(SD)이 관찰된 환자의 비율로 정의된다(SD 기간은 최소 12주).
조사(선택적 평가 포함):
Presence of 바이오마커s and 약물역학 (PD) responses to MCLA-128.	보관 종양 및/또는 신규한 종양 생체검사 시료 및 혈액에서 관련된 종양 바이오마커 및 MCLA-128 활성의 평가. 다음의 후보 바이오마커를 평가한다: HER2, HER3, pHER2, pHER3 및 헤레굴린; KRAS, NRAS, PIK3CA, BRAF 변이 상태(전이 대장암 (mCRC) 환자만); HER2/HER3 신호전달과 관련된 유전자에서 순환 종양 디옥시리보핵산(DNA) 및 돌연변이; MAPK 및 AKT 신호 경로에서 인산화된 분자.

파트 2

목적
1차 (안전성):
MCLA-128의 안정성 및 내성 조사..	AE의 빈도 및 특성.
1차 (효능):
MCLA-128의 항-종양 활성과 질환 관련 바이오마커 간의 관계 조사	지역 조사자의 평가 별로 RECIST 1.1 당 전체 반응률(ORR), DOR, CBR(CR 또는 PR이 관찰되거나, 12주의 최소한의 기간 동안 SD가 관찰된 환자의 비율로 정의됨). 항-종양 활성과 HER2, HER3, 및 헤레굴린 바이오마커간의 발현, CA-125(난소, 자궁내막), CA-19-9(위)과 같은 혈청 바이오마커의 발현 간의 관계를 조사함
2차:
MCLA-128의 PK 프로파일.	총 노출, C_max, V, V_ss, t_1/2, AUC_0-t, AUC_0-∞, t_max를 포함하는 PK 변수의 평가 집단 PK 분석
MCLA-128의 면역원성.	MCLA-128에 대한 항-약물 항체반응의 발생률 및 혈청 역가.
PFS 및 전체 생존률, 반응 기간의 평가
조사(선택적 평가 포함):
바람직하게는 신규 종양 시료/생체검사 시료 또는 보관 시료나 혈액에서 다른 관련 종양 바이오마커 및 MCLA-128 활성 마커의 평가	충분한 시료를 이용할 수 있는 경우 다음의 후보 바이오마커를 평가한다: 종양 시료 pHER2, pHER3, HER2:HER3 다이머화; 헤레굴린 및 (사용 가능성에 따라) HER2 및 HER3와 관련된 암 유전자 돌연변이; MAPK 및 AKT 신호 경로에서의 인산화된 분자; 헤레굴린-유전자 융합. 혈액 Fc 감마 수용체 다형성; 순환 종양 DNA 및 HER2/HER3 신호전달과 관련된 암 유전자의 돌연변이 분석; 순환 종양 세포 및 HER2 상태

실험설계:

본 연구는 MCLA-128의 안전성, 내약성, PK, PD, 면역원성 및 항-종양 활성을 평가하기 위한 임상 I/Ⅱ 상의, 공개 표지(open-label), 다기관(multi-center), 다국적, 용량 확대, 단일 그룹 평가이다.

연구는 2개 파트로 설계되었다:

파트 1

본 연구의 파트 1의 구성은 2015년 11월 24일에 이루어졌으며 2017년 1월 24일 모든 파트 1 환자에 대한 연구가 완료되었다. 다음의 9개의 용량 레벨을 조사하였다: 1명 환자의 코호트에서의 40 mg, 80 mg, 160 mg, 3명 환자의 코호트에서의 240 mg, 360 mg, 480 mg, 600 mg, 750 mg 및 900 mg. MCLA-128은 3주 치료 주기에서 1일차에 대략 60분간 투여되었다. 파트 1 연구 동안 주입 기간은 2시간으로 연장되었으며, 주입-관련 반응(IRR)을 완화시키기 위해 선택적으로 4 시간으로 연장되기도 했다.

어떤 용량에서도 용량제한독성(DLT)은 나타나지 않았다. 충분한 PK 정보를 얻기 위해 3명의 추가적인 환자에 600 mg 및 750 mg를 투여하였다.

MTD는 900 mg 용량 수준에 이르지 못했기 때문에, MCLA-128-CL01의 데이터 검토 위원회(DRC)는 누적된 안전성, 사용 가능한 PK 데이터 및 PK 시뮬레이션에 기반하여 750 mg의 용량을 RP2D에 할당하였다.

파트 2

파트 2에서는 선정된 환자 집단의 확장된 그룹에서 MCLA-128의 선택된 용량에서의 안전성 및 내약성을 추가적으로 조사하면서, 더불어 CR 또는 PR이 관찰되거나, 최소 12주 기간 동안 SD가 지속되는 환자의 비율로 정의되는 CBR의 평가도 진행하였다.

4주 주기에서 주간 투여 처방은 새롭게 선발된 환자에서 평가하였는데, 첫 2주기에는 매주 400 mg의 편평 용량을 투여하되 최초 투여시에는 800 mg 로딩 용량을 투여하였다. 3주기부터는, MCLA-128를 3주간 매주 400 mg를 투여하고 다음 한주는 투여를 멈추었다. IRR를 완화하기 위해 의무적인 사전 투여(pre-medication)가 이루어졌다. 그러나, 1주기의 1일째 로딩 용량 투여 전의 사전 투여는 코르티코스테로이드만이 필수적으로, 이후의 뒤따르는 약물 주입이 있는 경우에만 IRR를 조절하고자 하는 연구자의 판단에 따라 사용되어야 한다.

첫 5명 환자의 최소 2회 투여 주기가 완료된 후 도입기(run-in period) 동안에 주간 투약 계획의 안전성을 검토한다. DRC가 3-4 등급 독성, IRR의 발생률 및 심각성, 그리고 규정 준수에 초점을 맞추어 모든 안전성 데이터를 검토한다. DRC의 검토 결과 독성이 용일된 수 없는 수준이면, 후원자는 코호트 당 충분한 수의 환자가 등록될 때까지 3주 주기 투여에 대한 환자 등록을 계속한다.

파트 2에서, 환자 내 용량확장은 허용하지 않는다.

파트 2에서 평가될 환자 집단은 다음과 같다:

NRG1 융합의 의해 입증된 NSCLC로서 아시아에서만 모집

최소 20명에서 대략 40명에 이르는 환자가 코호트당 최소 10명을 포함하는 각 그룹에 등록되어 매주 권장량을 투여하였다. 이미 종료된 코호트도 가시 개시될 수 있다.

처리 지속 기간

파트 1 및 2의 환자는 모두 질환의 진행, 사망, 용인될 수 없는 독성 또는 다른 여하한 이유에 의해 중단될 때까지 계속 투약하였다.

데이터 검토 위원회(DRC):

파트 1에서의 모든 용량 확대는 모든 안정성 데이터 및 PK 데이터를 검토하기 위해 소집된 DRC가 결정하였다. DRC 참여자로서 책임연구원(또는 이들의 대표자), 후원자의 의료 지도관, 연구의료위원, 연구 약물감시 의사, 연구과제 책임자, 연구 통계의원 및 초빙 전문가(임상 약물 전문가와 같은)가 요구된다.

파트 2에서, DRC는 이후의 모든 환자들에서 주간 투여량을 확장하기 전에 도입기의 주간 용량 안정성을 검토한다.

연구 평가:

연구는 4주(28일)에 이르는 스크리닝 기간의 분자적 사전-스크리닝 평가와 뒤이은 철회 또는 종료시까지의 투여 주기로 구성된다. 투여 주기의 기간은 파트 2에서 초기 권장용량을 투여 받은 환자의 경우 3주(21일)이고, 파트 2에서 주간(weekly) 권장용량을 투여받은 환자의 경우 4주(28일)이다. 모든 환자는 투여 종료 1주일 내에 투여 종료 방문에, 투여 종료 또는 연구 중단 후 30일 뒤에 최종 연구 방문(Final Study Visit)에 참석하여야 한다.

계속 연구를 진행할 수 없거나 최종 연구 방문의 완료에 대한 동의를 철회한 환자는 다음 항암치료를 개시하기 전까지는 약 2년 동안 3개월마다 질환의 진행 및/또는 생존 상황을 추적한다.

임상시험 동안의 안전성 데이터, PK, PD 및 항-종양 활성 데이터의 평가를 통해 다른 투여 빈도에 대한 평가가 필요하다고 판단되거나 파트 2에서 다른 환자 집단에 대한 평가가 필요하다고 판단될 경우, 이러한 변화는 상기의 평가를 수행하기 전에 프로토콜 보정에서 명시되어야 한다.

분자적 사전-스크리닝 및 스크리닝:

NRG1 융합에 대한 분자 스크리닝을 수행할 수 있는 지역 연구소에서 분자적 사전-스크리닝을 수행한다. 사전-스크리닝을 개시하기 위해 환자는 다음의 기준을 만족하여야 한다:

IMA로 조직학적 진단되고 EGFR/ALK의 변형이 없음이 입증됨. 주의: NRG1에 융합에 대한 사전-스크리닝 시험을 하지 않은 IMA 환자도 임상에 참여 가능하다.

또는

병리학적 검사로는 IMA 진단이 허용되지 않으나, 연구자는 증상, 이미지 특성(예를 들어 국소화된 석화, 다발성 양측결절 또는 석화), 비흡연 및 EGFR/ALK 변형의 부존재를 통해 IMA를 의심할 수 있다.

신규 또는 보관 종양 조직을 NRG1 융합 상태 결정을 위한 분석에 사용하기 전에 연구 참여자인 NSCLC 환자는 분자적 사전-스크리닝의 피험자 동의서(ICF)에 반드시 서명하여야 한다. 시험은 질환의 자연적 진행의 어느 시점(예를 들어 진단 시, 1차 치료 시, 진행 시 등)에서도 수행될 수 있으며 최대 1주기 상의 1일차 기준으로 1년 전에 수행될 수 있다. NRG1 융합 여부를 조사하기 위해서는 신규 종양 시료(포르말린-고정 파라핀 포매됨; FFPE) 또는 1년 이내의 보관 종양 시료가 필요하다. 시료는 NRG1 융합 상태에 대한 분자 프로파일링(PCR, 차세대 시퀀싱[DNA 또는 RNA] 또는 FISH)이 가능한 지역 연구소에 제출되어야 한다. 국소적 NRG1 융합에 양성 결과를 보이는 환자는 주 연구에 참여할 의지가 있을 경우 주 연구 ICF에 서명한다.

주연구 피험자 동의서

모든 환자는 여하한 스크리닝 절차 또는 평가가 수행되기 전에 주연구 ICF에 서명하여야 한다. 스크리닝 평가는 1 주기의 1일차의 7일 내에 수행해야 하는 혈청 임신 검사를 제외하고 1 주기의 1일차의 4주 전 내에 수행한다. 스크리닝을 위해, 신규 또는 보관 조직에서 유래한 기저선 필수(mandatory) 종양 시료, 바람직하게는 블록(block)이 필요하다. 후원인은 신규 조직 선호를 표방한다. 보관 조직도 사용될 수 있으며 스크리닝 전 2년 내에 수득한 것이어야 하고, NSCLC 이외의 시료는 1년 이내의 것이어야 한다. NSCLC 환자에 있어, 사전-스크리닝 생체검사 시료가 지역의 NRG1 검사를 위해 공급되었다고 하더라도 스크리닝에 사용될 기저선 생체검사 시료가 여전히 필요함을 주의하여야 한다. 모든 필수 스크리닝 평가 및 모든 자격 기준의 확인이 완료된 후 환자는 1주기 1일차 투여를 시작할 수 있다.

안전성 평가

동반 질환은 기저선에서 포착하였다; AE 및 이에 수반하는 치료는 모든 실험 참가자들에게서 모니터링하였다. 안전성 평가에는 동부 종양학협력그룹(ECOG)의 수행 상태, 신체검사(신장 및 체중 포함), 생명 징후 및 심전도(ECG)의 검토가 포함된다. 스크리닝에서 좌심실구혈률(LVEF)을 통한 심장기능 검사도 4주기 종료 시(또는 5 주기의 1일째)의 투여종료 방문시 또는 연구 기간 중 어느 때건 임상적으로 필요한 시점에 수행되었다. 실험실 평가는 임상 화학, 혈액학, 응고 검사, 소변 검사 및 임신 검사를 포함한다. 사이토카인 패널 분석은 2017년 8월 1일까지 수행하였다.

MCLA-128를 투여하는 모든 날에, 환자는 생명 신호 관찰 및 반복을 위해 주입 종료 후 최소 60분간(PK 시료가 필요한 경우 더 긴 시간 동안) 진료실에 남아있어야 한다. 임상적으로 필요한 경우 추가적인 안전성 평가를 수행하여야 하고 연구자의 판단에 따라 진료실에 남아있는 시간을 연장하여야 한다.

면역원성 평가

1, 2, 3, 4 주기 각각의 1일 째 사전 투여시에 항-MCLA-128 항체의 혈청 역가를 측정하고, 이후 4주기마다(8, 12, 16 주기 등), 그리고 MCLA-128 투여 3일 전의 투여 종료 방문 및 최종 연구 방문 시에 측정한다.

약물동력학 평가

파트 1 및 파트 2 초기 권장 투여 스케줄: 1 주기(Cycle 1)에서, PK 분석을 위한 혈액 시료를 1일 차 사전 투여시, 주입 종료시(EOI), EOI 후 1, 2, 4, 8, 24시간 뒤, 그리고 4일 (또는 3일), 8일 및 15일에 수집하였다. 2-4 주기에는 사전 투여 및 EOI에서만 혈액 시료를 수집하였다.

파트 2 주간 권장 투여 스케줄: 1 주기(Cycle 1)에서, PK 분석을 위한 혈액 시료를 1일 차 사전 투여시, EOI, EOI 후 2, 4, 24시간 뒤,8일 및 15일째의 사전 투여시, 22일째의 EOI에 수집하였다. 2 및 3 주기에는 15일째의 사전 투여 및 EOI에서 혈액 시료를 수집하였다. 4 주기에서는 1일 차 사전 투여시, 그리고 15일 째 사전 투여시 및 EOI에서 혈액 시료를 수집하였다. 이후 2 주기마다(6, 8, 10주기 등) 15일째에 사전 투여 혈액 시료를 수집하였다.

종양 평가

종양은 지역의 조사자별로 RECIST version 1.1에 따라 평가한다. 스크리닝시, 그리고 3주 주기의 투여를 받는 환자의 경우 매 2 주기가 종료될 때마다, 4주 주기의 투여를 받는 환자의 경우 매 6주마다 이미지를 수득하였다.

바이오마커 및 약물역학 평가

바이오마커 및 약물역학 시험은 이용가능 여부, 추가적 종양 시료에 대한 동의 및 특이적 바이오마커 시험에 대한 동의 여부에 따라 보관 및/또는 신규 종양 시료 및/또는 혈액(액상 생체검사 시료)에 대해 수행되었다.

충분한 시료를 이용할 수 있는 경우 다음의 후보 바이오카머를 평가하였다:

- HER2, HER3, HER2:HER3 다이머화, 인산화된 HER2(pHER2) 및 HER3(pHER3) 및 헤레굴린;

- 순환 혈장 종양 DNA(ctDNA) 및 종양시료 DNA(가용 여부에 따라)를 이용하여 HER2 및 HER3 신호전달에 관여하는 유전자를 포함한 암 유전자의 돌연변이를 조사하였다.

- MAPK 및 AKT 신호 경로 내의 인산화된 분자;

- Fc 감마 수용체 다형성;

- HER2의 순환 종양 세포;

- 헤레굴린-유전자 융합

생식계열 DNA 평가는 포함되지 않았다(Fc 감마 수용체 다형성 제외).

기저선에서 환자는 신규 또는 보관 조직에서 유래한 의무(mandatory) 종양 시료, 바람직하게는 블록을 제공하여야 한다. 후원인은 신규 조직 선호를 표방한다. 보관 조직도 사용될 수 있으며 스크리닝 전 2년 내에 수득한 것이어야 하고, NSCLC 이외의 시료는 1년 이내의 것이어야 한다. 또한 환자는 선택적으로 4주기 종료시 및 선택적으로 투여 종료 방문시에 종양 시료/생체검사 시료를 제공하여야 한다.

이 시점에 액상 생체검사 시료 검사를 위해 혈액 시료도 채취한다.

자격 기준:

NSCLC 환자를 선발하였다.

파트 2 환자의 일반적 선발 기준

1. 18세 이상;

2. RECIST v1.1에 따라 최소 하나의 측정 가능한 장애;

3. ECOG 0 또는 1의 수행 상태;

4. 최소 12주의 추정 기대수명;

5. 종래의 항암치료로 인해 탈모, 임상적 유의성 없는 림프구 감소증, 2등급 감각신경독성을 제외한 ≤1등급(Grade 1) 독성 발생;

6. 마지막 방사선 치료와 최초 MCLA-128 투여 예정일 간 최소 4주 간격이 있을 것(통증 경감을 위해 1x8 Gy를 받은 경우 제외);

7. 주요 수술로부터 완전히 회복(안정적이고 <2등급 독성 수인 가능);

8. 스크리닝에서의 실험실 값:

a.콜로니 자극 인자 없이 절대호중구수≥1.5 x 10⁹/L;

b. 혈소판 ≥100 x 10⁹/L;

c. 헤모글로빈 ≥9 g/dL 또는 ≥2.2 mmol/L(수혈에 의하지 않음);

d. 총 빌리루빈이 정상치 상한값(ULN) <1.5배 (Gilbert 증후군에 의하지 않음);

e. 간으로 전이된 진행성 고형 종양을 가지는 환자의 경우 AST(SGOT)≤2.5 x ULN; ALT(SGPT)≤2.5 x ULN; ≤5 x ULN; 골 전이가 확인된 환자는 별도로 ALP >5 x ULN에서의 연구가 허용됨;

f. 혈청 크레아티닌 ≤1.5 x ULN 또는 Cockroft-Gault 식에 따라 계산된 사구체 여과율(GFR)이 >50 mL/min;

g. 응고 기능(INR 및 aPTT ≤1.5 ULN, 치료를 위해 항응고제를 투여받지 않은 경우)

h. 소변 단백질 ≤2+(딥스틱으로 측정한 경우) 또는 ≤100 mg/24시간 소변;

9. 신규(선호됨) 또는 보관 조직에서 유래한 기저선 필수 종양 생체검사 시료(FFPE), 바람직하게는 블록의 제공이 가능함. 보관 조직은 스크리닝 전 2년 내에 수득한 것이어야 하고, NSCLC 이외의 시료는 1년 이내의 것이어야 함.

10. 스크리닝 기간 및 1 주기 1일차의 7일 내에 가임기 여성(≤50세 이하 여성 또는 연구 개시 전 무월경 기간이 ≤12개월인 여성으로 정의)의 소변 또는 혈액 내 인간 융모성 생식선 자극호르몬(hCG) 검사를 통한 임신 테스트 음성 결과.

11. 가임기의 성적으로 활발한 남성 및 여성 환자는 전체 연구기간 동안 및 MCLA-128의 최종 투여 6개월 후까지 효과적인 산아 제한 방법(예를 들어 살정제, 경구 또는 비경구 피임약 및/또는 자궁내 장비을 이용한 차단 피임법)을 사용하는 데에 동의하여야 한다. 여성 환자의 불임은 반드시 환자의 의료기록으로 확인하여야 함을 주의해야 하며 다음과 같이 정의될 수 있다: 양쪽 난소의 외과적 절제술, 나팔관 수술, 마지막 월경 이후 1년 넘게 경과한 자연적 폐경; 마지막 월경 이후 1년 넘게 경과하고 방사선으로 인한 난소 제거; 마지막 월경 후 1년 간격의 화학 치료로 인한 폐경;

12. 연구-특정 스크리닝 절차에 앞서 서면의 고지된 동의서를 제공할 수 있는 능력이 있고 상기 동의서가 어떠한 편견도 없이 환자에 의해 철회될 수 있음을 이해할 수 있을 것;

13. 필수적 및 선택적인 프로토콜 요구사항을 이해할 능력이 있으며, 연구 프로토콜 절차를 준수할 의지와 능력을 가지고 주요 고지 동의서에 서명하였을 것. 여하한 선택적인 생체검사 시료채취(조직 및/또는 혈액)과 시료의 장기간 보관에는 추가적인 동의서가 요구된다;

14. 임상적 이점을 가진다고 알려진 모든 가능한 치료와 함께 투여를 받은 뒤 질환이 진행된 전이성 암 환자.

15. 다음 중 하나의 조건을 만족하는 절제할 수 없거나 전이성인 NSCLC:

- 생체검사 시료를 통해 입증된 침습적 점액 선암(IMA). 주의: NRG1에 융합에 대한 사전-스크리닝 시험을 하지 않은 IMA 환자도 임상에 참여 가능하다.

또는

- NRG1 융합을 가지는 NSCLC인 것으로 적합한 지역 연구소가 알려진 암 유발 돌연변이(driver mutation) 또는 EGFR/ALK 유전자의 융합이 없는 환자에서 PCR, 차세대 시퀀싱[DNA 또는 RNA] 또는 FISH와 같은 방법을 이용하는 분자 프로파일링을 통해 결정.

16. 국부적으로 진행하거나 전이된 상황에서 최소 하나의 표준 치료를 시행한 경우 조사자의 평가에 의해 질환이 진행된 것으로 입증.

통계적 분석:

파트 1 및 파트 2

항-종양 및 임상적 이점 변수는 파트 2의 각 그룹에 대해 서술적으로 요약된다. 적절한 경우, 변수는 절대 변화량 및 기저선으로부터의 상대 변화량으로 표시된다. 명확한 데이터를 백분율 및 빈도 표(frequency tabulation)로 나타낸다.

적절한 경우, 파트 1 연구 동안 MTD 또는 MRD로 밝혀진 것을 투여 받은 환자 또는 파트 2에서 동일한 투여를 받은 환자의 데이터는 병합하여 요약할 수도 있고, 각각 독립적으로 요약할 수도 있다.

심각하거나 심각하지 않은 AE의 빈도 및 특성을 절대적 및 상대적 빈도로 평가하고 이를 MedDRA 의학사전에 따라 작성한다.

파트 1

데이터 평가는 서술적으로 설명하였다. 환자 통계, 질환 특성과 약물동력학 및 약물역학 변수를 각 용량 수준에서 요약하였다. DLT의 빈도 및 특성도 각 용량 수준에서 요약하였다.

파트 2

파트 2의 코호트 당 N=20인 경우, 관찰된 임상적 의미를 가지는 상관 계수 0.38은 95% 신뢰도로 0과 구분되고; 임상적으로 의미가 적거나 없는 상관계수는 0과 구분되지 않는다. 따라서 파트 2의 코호트당 20명의 대상체는 항-종양 활성 of MCLA-128의 항-종양 활성 및 질환 관련 바이오마커 간의 관계를 조사하기에 충분한 것으로 간주된다.

임상적 활성의 징후가 관찰되면, 약 40명에 이르는 환자가 추가적으로 모집될 수 있다. 40명의 환자를 통해 진정한 임상적 반응률, 예를 들어 10% 내지 50%가 약 ±5% 내지±8%의 합리적인 정확도로 산정될 수 있다.

파트 1의 각 코호트 및 파트 2의 각 종양 그룹에 대해 PK 파라미터를 요약하였다. 중간값, 범위, SD 및 %CV에 더하여 산술적 평균 및 기하학적 평균값을 표시하였다. AUC는 사다리꼴 공식(trapezoid rule)에 따라 계산하였다. 각 그룹에 대해 시간에 따른 혈청 농도 프로파일 곡선을 그렸다.

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SEQUENCE LISTING <110> Merus N.V. <120> ErbB-2 and ErbB3 binding bispecific antibodies for use in the treatment of tumors that have an NGR1 fusion gene. <130> P115067PC00 <140> PCT/NL2018/050206 <141> 2018-04-03 <150> EP 17164292.9 <151> 2017-03-31 <160> 138 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 370 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MF2926 <220> <221> CDS <222> (20)..(370) <400> 1 ggcccagccg gccatggcc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg 52 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu 1 5 10 gtg aaa cct ggg gct tca gtg atg att tcc tgc aag gct tct ggt tac 100 Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Met Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 15 20 25 tca ttc act ggc tac cac atg aac tgg gtg aag caa agt cct gaa aag 148 Ser Phe Thr Gly Tyr His Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys 30 35 40 agc ctt gag tgg att gga gac ata aat cct agc att ggt acg act gcc 196 Ser Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Asn Pro Ser Ile Gly Thr Thr Ala 45 50 55 cac aac cag att ttc agg gcc aag gcc aca atg act gtt gac 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Val Arg Arg Gly Asp Trp Ser Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF2926 CDR1 <400> 3 Gly Tyr His Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys Ser Leu Glu 1 5 10 15 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF2926 CDR2 <400> 4 Asn Gln Ile Phe Arg Ala 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF2926 CDR3 <400> 5 Arg Gly Asp Trp Ser Phe Asp Val 1 5 <210> 6 <211> 379 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MF2930 <220> <221> CDS <222> (20)..(379) <400> 6 ggcccagccg gccatggcc gag gtc cag ctg cag cag tct ggg gct gaa ctg 52 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu 1 5 10 gtg aag cct gga gcc tca gtg atg atg tcc tgt aag gtt tct ggc tac 100 Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Met Met Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr 15 20 25 acc ttc act tcc tat cct ata gcg tgg atg aag cag gtt cat gga aag 148 Thr Phe Thr Ser Tyr Pro Ile Ala Trp Met Lys Gln Val His Gly Lys 30 35 40 agc cta gag tgg att gga aat ttt cat cct tac agt gat gat act aag 196 Ser Leu Glu Trp Ile Gly Asn Phe His Pro Tyr Ser Asp Asp Thr Lys 45 50 55 tac aat gaa aac ttc aag ggc aag gcc aca ttg act gta gaa aaa tcc 244 Tyr Asn Glu Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Glu Lys Ser 60 65 70 75 tct agc aca gtc tac ttg gag ctc agc cga tta aca tct gat gac tct 292 Ser Ser Thr Val Tyr Leu Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Ser 80 85 90 gct gtt tat tac tgt gca aga agt aac cca tta tat tac ttt gct atg 340 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asn Pro Leu Tyr Tyr Phe Ala Met 95 100 105 gac tac tgg ggt caa gga acc tcg gtc acc gtc tcc agt 379 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Met Met Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Pro Ile Ala Trp Met Lys Gln Val His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Phe His Pro Tyr Ser Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Glu Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Asn Pro Leu Tyr Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF2930 CDR1 <400> 8 Ser Tyr Pro Ile Ala Trp Met Lys Gln Val His Gly Lys Ser Leu Glu 1 5 10 15 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF2930 CDR2 <400> 9 Asn Glu Asn Phe Lys Gly 1 5 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF2930 CDR3 <400> 10 Ser Asn Pro Leu Tyr Tyr Phe Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 11 <211> 385 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MF1849 <220> <221> CDS <222> (20)..(385) <400> 11 ggcccagccg gccatggcc cag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg 52 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val 1 5 10 gtc cag cct ggg agg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc 100 Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 15 20 25 acc ttc agt agc tat ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag 148 Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 30 35 40 ggg ctg gag tgg gtg gca gtt ata tca tat gat gga agt aat aaa tac 196 Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr 45 50 55 tat gca gac tcc gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc 244 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 60 65 70 75 aag aac acg ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aga gct gag gac acg 292 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 80 85 90 gcc gtg tat tac tgt gca aaa ggt gac tac ggt tct tac tct tct tac 340 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Asp Tyr Gly Ser Tyr Ser Ser Tyr 95 100 105 gcc ttt gat tat tgg ggc caa ggt acc ctg gtc acc gtc tcc agt 385 Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 <210> 12 <211> 122 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Ser 80 85 90 gct gtc tat ttc tgt gca aga ggg ccc cac tat gat tac gac ggc ccc 340 Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Pro His Tyr Asp Tyr Asp Gly Pro 95 100 105 tgg ttt gtt tac tgg ggc caa ggg act ctg gtc acc gtc tcc agt 385 Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 <210> 17 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Leu Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Lys Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Glu Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Pro His Tyr Asp Tyr Asp Gly Pro Trp Phe Val Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial 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Pro Gly Ser Gly Tyr Thr Tyr 45 50 55 tac aat gag aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act gca gaa gaa tcc 244 Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Glu Glu Ser 60 65 70 75 tcc agc act gcc tac atg cac ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct 292 Ser Ser Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 80 85 90 gct gtc tat ttc tgt gca aga ccc cac tat ggt tac gac gac tgg tac 340 Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Pro His Tyr Gly Tyr Asp Asp Trp Tyr 95 100 105 ttc ggt gtc tgg ggc aca ggc acc acg gtc acc gtc tcc agt 382 Phe Gly Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 <210> 22 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Tyr Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala 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caagggcagg gccacactga ctgcagacga 240 atcctccagc actgcctaca tgcaactcag cagcctgaca tctgaggact ctgctgtcta 300 tttctgtgca agacctccgg tctactatga ctcggcctgg tttgcttact ggggccaagg 360 gactctggtc accgtctcca gt 382 <210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF2971 CDR1 <400> 27 Ala Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu 1 5 10 15 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF2971 CDR2 <400> 28 Asn Glu Ile Phe Lys Gly 1 5 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF2971 CDR3 <400> 29 Pro Pro Val Tyr Tyr Asp Ser Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 30 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MF3025 <220> <221> CDS <222> (20)..(382) <400> 30 ggcccagccg gccatggcc cag gtg cag ctg aag cag tct ggg gct gag ctg 52 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu 1 5 10 gtg agg cct ggg act tca gtg aag ctg tcc tgc aag gct tct ggc tac 100 Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 15 20 25 act ttc act ggc tac tat ata aac tgg gtg aag cag agg cct gga cag 148 Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln 30 35 40 gga ctt gag tgg att gca agg att tat cct gga agt ggt tat act tac 196 Gly Leu Glu Trp Ile Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Tyr Thr Tyr 45 50 55 tac aat gag aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act gca gaa gaa tcc 244 Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Glu Glu Ser 60 65 70 75 tcc aac act gcc tat atg cac ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct 292 Ser Asn Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 80 85 90 gct gtc tat ttc tgt gca agg ccc cac tat ggt tac gac gac tgg tac 340 Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Pro His Tyr Gly Tyr Asp Asp Trp Tyr 95 100 105 ttc gct gtc tgg ggc aca ggg acc acg gtc acc gtc tcc agt 382 Phe Ala Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 <210> 31 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 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tac ttc gat gtc tgg ggc aca aga acc tcg gtc acc gtc tcc agt 385 Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Arg Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 <210> 36 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Ser Gly His Thr Ser Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Glu Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Ile Tyr Phe Asp Tyr Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Thr Arg Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 37 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF2916 CDR3 <400> 37 Pro Ile Tyr Phe Asp Tyr Ala Gly Gly Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 38 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys 30 35 40 agc ctc gaa tgg att gga aat att aat cct aac agt ggt ggt gtt atc 196 Ser Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Val Ile 45 50 55 tac aac cag aag ttc agg ggc aag gtc aca ttg act gtt gac agg tcc 244 Tyr Asn Gln Lys Phe Arg Gly Lys Val Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser 60 65 70 75 tcc agc gca gcc tac atg gag ctc cgc agc ctg aca tct gag gac act 292 Ser Ser Ala Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr 80 85 90 gca gtc tat tat tgt tca aga gga ctg tgg gat gct atg gac tcc tgg 340 Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Gly Leu Trp Asp Ala Met Asp Ser Trp 95 100 105 ggt caa gga acc tcg gtc acc gtc tcc agt 370 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 89 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 89 Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 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ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc 100 Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 15 20 25 acc ttc agt agc tat ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag 148 Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 30 35 40 ggg ctg gag tgg gtg gca gtt ata tca tat gat gga agt aat aaa tac 196 Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr 45 50 55 tat gca gac tcc gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc 244 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 60 65 70 75 aag aac acg ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aga gct gag gac acg 292 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 80 85 90 gcc gtg tat tac tgt gca aaa ggt tgg tgg cat ccg ctg ctg tct ggc 340 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Trp Trp His Pro Leu Leu Ser Gly 95 100 105 ttt gat tat tgg ggc caa ggt acc ctg gtc acc gtc tcc agt 382 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 <210> 94 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial 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aga gaa ggg ata act ggg ttt act tac tgg 340 Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Ile Thr Gly Phe Thr Tyr Trp 95 100 105 ggc caa ggg act ctg gtc acc gtc tcc agt 370 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 <210> 99 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 99 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Asn Phe Pro Ile Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Ile Lys Asn Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Gly Ile Thr Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 100 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF3001 CDR1 <400> 100 Ile Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu 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Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 60 65 70 75 aag aac acg ctg tat ctg caa atg aac agc ctg aga gct gag gac acg 292 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 80 85 90 gcc gtg tat tac tgt gca aaa gat ggt ttc cgt cgt act act ctg tct 340 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Gly Phe Arg Arg Thr Thr Leu Ser 95 100 105 ggc ttt gat tat tgg ggc caa ggt acc ctg gtc acc gtc tcc agt 385 Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 <210> 104 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 104 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 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act gca gac aaa tcc 244 Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser 60 65 70 75 tcc agc aca gcc cac ctg caa ctc aac agc ctg aca tct gag gac tct 292 Ser Ser Thr Ala His Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 80 85 90 gcg gtc tac ttc tgt gca aga gga cag ctc gga cta gag gcc tgg ttt 340 Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gln Leu Gly Leu Glu Ala Trp Phe 95 100 105 gct tat tgg ggc cag ggg act ctg gtc acc gtc tcc agt 379 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 <210> 107 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 107 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Ile Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala His 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr 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cga cag gcc cct gga caa 148 Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 30 35 40 gct ctt gag tgg atg gga tgg atc aac cct caa agt ggt ggc aca aac 196 Ala Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Gln Ser Gly Gly Thr Asn 45 50 55 tat gca aag aag ttt cag ggc agg gtc tct atg acc agg gag acg tcc 244 Tyr Ala Lys Lys Phe Gln Gly Arg Val Ser Met Thr Arg Glu Thr Ser 60 65 70 75 aca agc aca gcc tac atg cag ctg agc agg ctg aga tct gac gac acg 292 Thr Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr 80 85 90 gct acg tat tac tgt gca aga gat cat ggt tct cgt cat ttc tgg tct 340 Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp His Gly Ser Arg His Phe Trp Ser 95 100 105 tac tgg ggc ttt gat tat tgg ggc caa ggt acc ctg gtc acc gtc tcc 388 Tyr Trp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 110 115 120 agt 391 Ser <210> 112 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 112 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Asp Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 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Ile Asn Pro Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp His Gly Ser Arg His Phe Trp Ser Tyr Trp Gly Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 136 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF6072 <400> 136 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Ser Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp His Gly Ser Arg His Phe Trp Ser Tyr Trp Gly Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 137 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF6073 <400> 137 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Ser Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp His Gly Ser Arg His Phe Trp Ser Tyr Trp Gly Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 138 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MF6074 <400> 138 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Ser Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp His Gly Ser Arg His Phe Trp Ser Tyr Trp Gly Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims

상이한 염색체 위치의 서열에 융합된 NRG1 유전자의 적어도 일부분을 포함하는 NRG1-융합 유전자를 포함하는 ErbB-2 및 ErbB-3 양성 세포를 가지는 개체를 치료하는 용도로 사용하기 위한 ErbB-2의 세포 외 부위에 결합할 수 있는 제1 항원-결합 부위와 ErbB-3의 세포 외 부위와 결합할 수 있는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체.
제 1 항에 있어서, 상기 NRG1 융합 유전자는 적어도 상이한 염색체 위치의 5’서열에 융합된 NRG1-유전자의 3’말단을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 세포는 암세포인 것을 특징으로 하는 항체.
제 3 항에 있어서, 상기 암세포는 NRG1-융합과 관련된 것을 특징으로 하는 항체.
제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 암세포는 NRG1-융합에 의해 만들어진 것을 특징으로 하는 항체.
앞선 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포는 유방암세포, 난소암세포, 비소세포 폐암과 같은 폐암세포 또는 이들의 전이인 것을 특징으로 하는 항체.
ErbB-2 및 ErbB-3 양성 종양을 가지거나 상기 종양에 걸릴 위험이 있는 개체를 치료하는 용도로 사용하기 위한 ErbB-2의 세포 외 부위에 결합할 수 있는 제1 항원-결합 부위와 ErbB-3의 세포 외 부위와 결합할 수 있는 제2 항원-결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체로서, 상기 종양의 세포는 적어도 상이한 염색체 위치의 5’서열에 융합된 NRG1-유전자의 3’말단을 포함하는 NRG1 융합 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 항체.
제 7 항에 있어서, 상기 종양은 유방암, 난소암, 비소세포 폐암과 같은 폐암 또는 이들의 전이인 것을 특징으로 하는 항체.
앞선 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 NRG1-융합 유전자는 NRG1 EGF-유사 도메인을 포함하는 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 항체.
앞선 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 NRG-융합은 NRG1과 인간 8번 염색체 상의 유전자 간의 융합인 것을 특징으로 하는 항체.
제 10 항에 있어서, 상기 인간 8번 염색체 상의 유전자는 분비된 단백질 또는 세포막 관련 단백질을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 항체.
앞선 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 NRG1 융합 유전자는 NRG1-유전자의 3’말단과 CD74; DOC4; TNFRSF10B; CLU; VAMP2; SLC3A2; RBPMS; WRN; SDC4; KIF13B; SLECA2; PDE7A; ATP1B1; CDK1; BMPR1B; MCPH1 및 RAB2IL1으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자의 5’서열과의 융합인 것을 특징으로 하는 항체.
앞선 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포 또는 종양은 상피성 기원(epithelial origin)인 것을 특징으로 하는 항체.
앞선 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 개체는 EGFR 억제를 타겟으로 하는 치료를 받았으며, 바람직하게는 EGFR 결합 항체, 보다 바람직하게는 세툭시맙을 이용한 치료를 받은 것을 특징으로 하는 항체.
앞선 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포 또는 상기 종양의 세포에서 ErbB-1 세포-표면 수용체 밀도; ErbB-2 세포-표면 수용체 밀도; ErbB-3 세포-표면 수용체 밀도; ErbB-4 세포-표면 수용체 밀도 또는 이들의 조합이 결정된 것을 특징으로 하는 항체.
앞선 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포 또는 종양은 세포 당 400,000개 미만의 ErbB-1 세포-표면 수용체를 가지고, 바람직하게는 세포 당 200.000개 미만의 ErbB-1 세포-표면 수용체를 가지는 것을 특징으로 하는 항체.
앞선 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 개체에 ErbB-1 억제제, 바람직하게는 세툭시맙을 투여하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
앞선 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 부위는 ErbB-2의 도메인 I에 결합할 수 있고 상기 제2 항원-결합 부위는 ErbB-3의 도메인 Ⅲ에 결합할 수 있으며, 바람직하게는 제1 항원-결합 부위의 ErbB-2에 대한 친화도가 제2 항원-결합 부위의 ErbB-3에 대한 친화도보다 낮은 것을 특징으로 하는 항체.
i) 적어도 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 및 MF1898로 구성된 군으로부터 선택되는 ErbB 2 특이적 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 또는 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 또는 MF1898의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 최대 3개 아미노산, 바람직하게는 최대 2개 아미노산, 바람직하게는 최대 1개 아미노산이 상이한 CDR 서열; 및 /또는
ii) 적어도 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074로 구성된 군으로부터 선택되는 ErbB 3 특이적 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 최대 3개 아미노산, 바람직하게는 최대 2개 아미노산, 바람직하게는 최대 1개 아미노산이 상이한 CDR 서열; 바람직하게는
i) MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 및 MF1898의 중쇄 가변영역 서열으로 구성된 군으로부터 선택되는 ErbB 2 특이적 중쇄 가변영역 서열, 또는 MF2926, MF2930, MF1849; MF2973, MF3004, MF3958, MF2971, MF3025, MF2916, MF3991, MF3031, MF2889, MF2913, MF1847, MF3001, MF3003 또는 MF1898의 중쇄 가변영역 서열과 최대 15개 아미노산이 상이한 중쇄 가변영역 서열; 및/또는
ⅱ) MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 및 MF6074의 중쇄 가변영역 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 ErbB 3 특이적 중쇄 가변영역 서열, 또는 MF3178; MF3176; MF3163; MF3099; MF3307; MF6055; MF6056; MF6057; MF6058; MF6059; MF6060; MF6061; MF6062; MF6063; MF6064; MF 6065; MF6066; MF6067; MF6068; MF6069; MF6070; MF6071; MF6072; MF6073 또는 MF6074의 중쇄 가변영역 서열과 최대 15개 아미노산이 상이한 중쇄 가변영역 서열.
제 18 항에 있어서, 상기 항체는 적어도 ErbB 2 특이적 중쇄 가변영역인 MF3958의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하고, 적어도 ErbB 3 특이적 중쇄 가변영역인 MF3178의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
앞선 항 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제1 항원 결합 부위를 포함하는 가변 도메인 및 상기 제2 항원 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 IgVKl-39 유전자 단편을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하고, 가장 바람직하게는 재배열된 생식계열 인간 kappa 경쇄 IgVKl-39*01/IGJKl*01를 포함하며, 바람직하게는 상기 제1 항원 결합 부위를 포함하는 가변 도메인 및 상기 제2 항원 결합 부위를 포함하는 가변 도메인은 서열 (RASQSISSYLN)을 가지는 CDR1, 서열 (AASSLQS)을 가지는 CDR2 및 서열 (QQSYSTPPT)을 가지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.