CN102282168A - 人血清白蛋白接头以及其结合物 - Google Patents

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Abstract

本发明披露了一种人血清白蛋白(HSA)接头和与该HSA接头结合的结合剂、诊断剂、以及治疗剂。本发明还披露了一种结合物，其中该HAS接头共价结合于作为第一和第二单链Fv分子(scFv)的氨基端和羧基端结合部分。示例性的结合物可用于例如减少肿瘤细胞增殖，例如，用于治疗应用。本发明还披露了HSA接头结合物的诊断和治疗应用的方法和试剂盒。

Description

人血清白蛋白接头以及其结合物
技术领域
本发明提供了人血清白蛋白(HSA)接头结合物以及其结合、诊断、和治疗结合物。在一个实施方式中，HSA接头包括两种氨基酸取代。另一个实施方式是其中HSA接头共价结合于氨基和羧基端结合部分的结合物，该氨基和羧基端结合部分是第一和第二单链Fv分子(scFv)。示例性的结合物可用于，例如减少肿瘤细胞增殖，例如用于治疗应用。本发明进一步提供了用于制备和给予诊断和治疗HSA接头结合物的方法。
背景技术
抗体样结合部分(包括完整抗体中的那些抗体样结合部分，抗体片段、以及scFv)经常被用于治疗应用。抗体片段和scFv通常表现出比完整抗体更短的血清半衰期，并且在一些治疗应用中，增加具有这样的片段和scFv功能的治疗剂的体内半衰期是合乎需要的。
人血清白蛋白(HSA)是一种约66,500kD的蛋白质，由包括至少17个二硫桥的585个氨基酸构成。正如白蛋白家族的许多成员，人血清白蛋白在人生理学上具有重要作用并且基本上出现在每个人体组织和身体分泌物中。HSA能够结合并转运许多种循环***中的配体，包括长链脂肪酸，其否则不溶于循环血浆。
血清白蛋白属于蛋白质家族，其包括α-甲胎蛋白和人类群体特异性成分，还称作维生素D结合蛋白。血清白蛋白是循环***主要的可溶性蛋白并且有助于许多重要的生理过程。血清白蛋白通常包含按干重计约50％的总血液成分。白蛋白以及它们的相关血液蛋白在人体中在许多内源性和外源性配体的转运、分布、以及代谢方面还具有重要作用，包括各种各样的化学上不同的分子，如脂肪酸、氨基酸、类固醇、钙、金属如铜和锌、以及各种药剂。通常认为白蛋白家族分子会促进许多这些配体转移穿过器官循环界面，如肝、肠、肾、以及脑。因此白蛋白涉及各种各样的循环和代谢功能。
发明内容
第一方面，本发明提供了一种HSA接头结合物，该HSA接头结合物包括人血清白蛋白(HSA)接头(linker)，上述接头包括SEQID NO：6-15中的任何一个所列出的氨基酸序列以及第一和第二结合部分，该第一和第二结合部分选自抗体、单链Fv分子、双特异性单链Fv((scFv’)2)分子、域抗体、双抗体、三抗体、激素、Fab片段、F(ab’)2分子、串联scFv(taFv)片段、受体(例如，细胞表面受体)、配体、适体、以及它们的生物活性片段，其中第一结合部分结合于HSA接头的氨基末端而第二结合部分结合于HSA接头的羧基末端。在一个实施方式中，第一结合部分特异性地结合ErbB3而第二结合部分特异性地结合ErbB2。在其它实施方式中，HSA接头包含在SEQ ID NO：1、9、10、14或15中所列出的氨基酸序列。
第二方面，三个或更多结合部分(binding moieties)(例如，4、5、6、7、8、9、10、或更多个)可以包括在药剂中；可以将这些另外的结合部分加入药剂中，例如，以与第一或第二结合部分串联的形式(例如，2、3、4、或5或更多个串联)。
第三方面，本发明提供了一种HSA接头，该接头包含相对于在SEQ ID NO：1中列出的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，以及在SEQ ID NO：1中所列出的氨基酸序列在位置34处的丝氨酸残基和在位置503处的谷氨酰胺残基。在一个实施方式中，氨基酸序列相对于在SEQ ID NO：1中所列出的序列具有至少95％序列同一性。在另一个实施方式中，HSA接头包含在SEQ ID NO：1中所列出的氨基酸序列。在另一实施方式中，HSA接头具有在SEQ IDNO：1中列出的氨基酸序列。
第四方面，本发明提供了一种HSA接头结合物，该HSA接头结合物包括HSA接头，其相对于在SEQ ID NO：1中列出的序列具有至少90％氨基酸序列同一性，以及至少第一结合部分。在一个实施方式中，该HSA接头结合物包括第一肽连接物(connector)，该连接物将第一结合部分结合于HSA接头。
第五方面，本发明的特征在于一种HSA接头结合物，该HSA接头结合物包括HSA接头，其具有在SEQ ID NO：11-15中的任何一个列出的氨基酸序列、或这些序列的任何之一的片段或变体，以及至少第一结合部分。
本发明的第四或第五方面的某些实施方式中，上述HSA接头结合物进一步包括第一肽连接物(例如，AAS、AAQ、或AAAL(SEQID NO：5))，该连接物将第一结合部分结合于HSA接头的氨基或羧基末端。在一个实施方式中，第一连接物将第一结合部分共价结合于HSA接头。
本发明的第四或第五方面的某些实施方式中，上述HSA接头结合物进一步包括至少第二结合部分。在一个实施方式中，上述HSA接头结合物进一步包括第二肽连接物(例如，AAS、AAQ、或AAAL(SEQ ID NO：5))，该连接物将第二结合部分结合于HSA接头。在其它实施方式中，第二连接物将第二结合部分结合于HSA接头的氨基或羧基末端。在又一个实施方式中，第二连接物将第二结合部分共价结合于HSA接头。在其它实施方式中，上述HSA接头结合物进一步包括与第一或第二结合部分串联的三个或更多结合部分；上述三个或更多结合部分可以进一步包括连接物序列，该连接物序列使三个或更多结合部分连接于第一或第二结合部分以及使三个或更多结合部分彼此连接。
本发明的第四或第五方面的某些实施方式中，上述HSA接头结合物包括第一肽连接物，该连接物将第一结合部分共价结合于HSA接头的氨基末端，以及第二肽连接物，该连接物将第二结合部分共价结合于HSA接头的羧基末端。在一个实施方式中，第一连接物具有氨基酸序列AAS或AAQ，以及第二连接物具有在SEQ IDNO：5中列出的氨基酸序列。
本发明的第四或第五方面的某些实施方式中，第一或第二结合部分(或第三或更多结合部分)是抗体、单链Fv分子、双特异性单链Fv((scFv’)2)分子、域抗体、双抗体、三抗体、激素、Fab片段、F(ab’)2分子、串联scFv(taFv)片段、受体(例如，细胞表面受体)、配体、适体、或它们的生物活性片段。在其它实施方式中，本发明提供的HSA接头结合物包括这些不同类型的结合部分的组合。在一个实施方式中，至少第一或第二结合部分是人或人源化单链Fv分子。
在本发明的第一、第二、第三、第四、或第五方面的任何一方面的一个实施方式中，第一或第二结合部分(或者，如果存在的话，第三或另外结合部分)的一个或多个是或特异性地结合于选自以下的蛋白质，选自由***1受体(IGF 1R)、IGF2R、***(IGF)、间充质上皮转化因子受体(c-met；还称作肝细胞生长因子受体(HGFR))、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、TNF-β、叶酸受体(FOLR)、叶酸转铁蛋白受体(TfR)、间皮素、Fc受体、c-kit受体、c-kit、整联蛋白(例如，α4整联蛋白或β-1整联蛋白)、P-选择素、鞘氨醇-1-磷酸受体-1(S1PR)、透明质酸受体、白细胞功能抗原-1(LFA-1)、CD4、CD11、CD18、CD20、CD25、CD27、CD52、CD70、CD80、CD85、CD95(Fas受体)、CD106(血管细胞粘附分子1(VCAM1)、CD166(活化白细胞粘附分子(ALCAM))、CD178(Fas配体)、CD253(TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL))、ICOS配体、CCR2、CXCR3、CCR5、CXCL 12(基质细胞衍生因子1(SDF-1))、白细胞介素1(IL-1)、CTLA-4、MART1、gp100、MAGE-1、ephrin(Eph)受体、黏膜地址素细胞黏附分子1(MAdCAM-1)、癌胚抗原(CEA)、LewisY、MUC-1、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、癌抗原125(CA125)、***特异性膜抗原(PSMA)、TAG-72抗原、以及它们的片段组成的组。在又一个实施方式中，第一或第二结合部分(或者，如果存在的话，第三或另外结合部分)的一个或多个是或特异性地结合于成红细胞白血病病毒(erythroblastic leukemia viral)致癌基因同源物(ErbB)受体(例如，ErbB1受体；ErbB2受体；ErbB3受体；以及ErbB4受体)。在另一个实施方式中，第一或第二结合部分(或者，如果存在的话，第三或另外结合部分)的一个或多个是或特异性地结合于α-甲胎蛋白(AFP)或干扰素、或它们的生物活性片段。在又一个实施方式中，第一或第二结合部分(或者，如果存在的话，第三或另外结合部分)的一个或多个是那他珠单抗、英夫利昔单抗、阿达木单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、贝伐单抗、达珠单抗、依法利珠单抗、戈利木单抗、赛妥珠单抗、曲妥珠单抗、阿巴他塞、依那西普、帕妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗(panitumumab)、或阿那白滞素。
本发明的第一、第二、第三、第四、或第五方面的任何一方面，将HSA接头结合物连接于诊断剂、治疗剂、或两者。在一个实施方式中，诊断剂是可检测标记，如放射性标记、荧光标记、或重金属标记。在另一个实施方式中，治疗剂是细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、或免疫调节剂。细胞毒性剂包括烷化剂、抗生素、抗肿瘤剂、抗增殖剂、抗代谢物、微管蛋白抑制剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、激素激动剂或拮抗剂、免疫调节剂、DNA小沟结合剂、以及放射剂、或能够结合于肿瘤细胞并杀伤肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞增殖的任何药剂。抗肿瘤剂包括环磷酰胺、喜树碱、高喜树碱、秋水仙碱、combrestatin、combrestatin、根霉素、多拉司他汀(dolistatin)、安丝菌素p3、类美登碱(类美坦素，maytansinoid)、auristatin、卡奇霉素(caleachimicin)、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、多柔比星、紫杉醇、多西他赛、顺铂、卡铂、他莫昔芬、雷洛昔芬、来曲唑、表柔比星、贝伐单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、以及它们的衍生物。
本发明的第一、第二、第三、第四、或第五方面的任何一方面，HSA接头结合物与药用载体、赋形剂、或稀释剂混合。在一个实施方式中，药剂具有6小时至7天的体内半衰期。在另一个实施方式中，药剂具有大于8小时的体内半衰期。
第六方面，本发明的特征在于一种用于治疗患有疾病或障碍的哺乳动物的方法，该方法包括给予在本发明中描述的任何一种HSA接头结合物。在一个实施方式中，疾病或障碍与通过细胞表面受体的细胞信号传导有关。在另一个实施方式中，哺乳动物是人。在又一个实施方式中，疾病或障碍是增生性或自身免疫性疾病。增生性疾病包括这样的癌症，例如黑色素瘤、透明细胞肉瘤、头部和颈部癌症、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、***癌、涎腺癌、肺癌、肝癌、皮肤癌、以及脑癌。自身免疫病包括多发性硬化、银屑病、重症肌无力、葡萄膜炎、***性红斑狼疮、以及类风湿性关节炎。在一个实施方式中，连同一种或多种治疗剂，如抗肿瘤剂，给予HSA接头结合物。
第七方面，本发明的特征在于一种用于制备HSA接头结合物的方法，该方法包括分别将至少第一结合部分结合于HSA接头的氨基末端并将第二结合部分结合于HSA接头的羧基末端，该HSA接头具有在SEQ ID NO：1、3、或6-15中的任何一个列出的氨基酸序列、或相对于在SEQ ID NO：1、3、或6-15中的任何一个列出的序列具有至少90％、95％、97％、或100％序列同一性的序列。在一个实施方式中，第一或第二结合部分共价连接于HSA接头的氨基或羧基末端。在其它实施方式中，第三或另外的结合部分(例如，第四、第五、第六、第七、第八、第九、或第十结合部分)以与第一或第二结合部分串联的形式共价连接于HSA接头的氨基或羧基末端。在另一个实施方式中，第一或第二结合部分(或者，如果存在的话，第三或另外结合部分)的一个或多个是抗体、单链Fv分子、双特异性单链Fv((scFv’)2)分子、域抗体、双抗体、三抗体、激素、Fab片段、F(ab’)2分子、串联scFv(taFv)片段、受体(例如，细胞表面受体)、配体、或适体。在另一个实施方式中，第一或第二结合部分(或者，如果存在的话，第三或另外结合部分)是人或人源化单链Fv分子。在又一个实施方式中，第一或第二结合部分(或者，如果存在的话，第三或另外结合部分)的一个或多个是或特异性地结合于***1受体(IGF1R)、IGF2R、***(IGF)、间充质上皮转化因子受体(c-met；还称作肝细胞生长因子受体(HGFR))、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、TNF-β、叶酸受体(FOLR)、叶酸转铁蛋白受体(TfR)、间皮素、Fc受体、c-kit受体、c-kit、整联蛋白(例如，α4整联蛋白或β-1整联蛋白)、P-选择素、鞘氨醇-1-磷酸受体-1(S1PR)、透明质酸受体、白细胞功能抗原-1(LFA-1)、CD4、CD11、CD18、CD20、CD25、CD27、CD52、CD70、CD80、CD85、CD95(Fas受体)、CD106(血管细胞粘附分子1(VCAM1)、CD166(活化白细胞粘附分子(ALCAM))、CD178(Fas配体)、CD253(TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL))、ICOS配体、CCR2、CXCR3、CCR5、CXCL12(基质细胞衍生因子1(SDF-1))、白细胞介素1(IL-1)、CTLA-4、MART-1、gp100、MAGE-1、ephrin(Eph)受体、黏膜地址素细胞黏附分子1(MAdCAM-1)、癌胚抗原(CEA)、LewisY、MUC-1、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、癌抗原125(CA125)、***特异性膜抗原(PSMA)、TAG-72抗原、以及它们的片段。在又一个实施方式中，第一或第二结合部分(或者，如果存在的话，第三或另外结合部分)的一个或多个是或特异性地结合于成红细胞白血病病毒致癌基因同源物(ErbB)受体(例如，ErbB1受体；ErbB2受体；ErbB3受体；以及ErbB4受体)。在另一个实施方式中，第一或第二结合部分(或者，如果存在的话，第三或另外结合部分)的一个或多个是或特异性地结合于α-甲胎蛋白(AFP)或干扰素、或它们的生物活性片段。在又一个实施方式中，第一或第二结合部分(或者，如果存在的话，第三或另外结合部分)的一个或多个是那他珠单抗、英夫利昔单抗、阿达木单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、贝伐单抗、达珠单抗、依法利珠单抗、戈利木单抗、赛妥珠单抗、曲妥珠单抗、阿巴他塞、依那西普、帕妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗(panitumumab)、或阿那白滞素。在另一个实施方式中，药剂连接于诊断或治疗剂。在一个实施方式中，诊断剂是可检测标记，如放射性标记、生物发光标记、荧光标记、重金属标记、或表位标签。在另一个实施方式中，治疗剂是细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、或免疫调节剂。细胞毒性剂包括烷化剂、抗生素、抗肿瘤剂、抗增殖剂、抗代谢物、微管蛋白抑制剂、拓扑异构酶I和II抑制剂、激素激动剂或拮抗剂、免疫调节剂、DNA小沟结合剂、以及放射剂、或能够结合于肿瘤细胞并杀伤肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞增殖的任何药剂。抗肿瘤剂包括环磷酰胺、喜树碱、高喜树碱、秋水仙碱、combrestatin、combrestatin、根霉素、多拉司他汀(dolistatin)、安丝菌素p3、类美登碱(类美坦素)、auristatin、卡奇霉素(caleachimicin)、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、多柔比星、紫杉醇、多西他赛、顺铂、卡铂、他莫昔芬、雷洛昔芬、来曲唑、表柔比星、贝伐单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、以及它们的衍生物。在又一个实施方式中，药剂与药用载体、赋形剂、或稀释剂混合。
第八方面，本发明的特征在于一种用于制备HSA接头的方法，该方法包括用能够化学修饰的取代氨基酸取代在SEQ ID NO：1、3、以及6-15中的任何一个列出的氨基酸序列中的一个或多个表面暴露的氨基酸残基，其中上述化学修饰便于诊断或治疗剂的结合。在一个实施方式中，取代氨基酸是半胱氨酸而表面暴露的氨基酸残基是丝氨酸或苏氨酸。在另一个实施方式中，化学修饰导致取代氨基酸和诊断或治疗剂之间的共价结合。在又一个实施方式中，表面暴露的氨基酸残基是在位置496处的苏氨酸、在位置58处的丝氨酸、在位置76处的苏氨酸、在位置79处的苏氨酸、在位置83处的苏氨酸、在位置125处的苏氨酸、在位置236处的苏氨酸、在位置270处的丝氨酸、在位置273处的丝氨酸、在位置304的丝氨酸、在位置435处的丝氨酸、在位置478处的苏氨酸、在位置506处的苏氨酸、或在位置508处的苏氨酸。
第九方面，本发明的特征在于一种用于制备HSA接头的方法，该方法包括用天冬酰胺、丝氨酸、或苏氨酸取代在SEQ ID NO：1、3、以及6-15中的任何一个列出的氨基酸序列中的一个或多个残基，从而在HSA剂中包含糖基化位点。
第十方面，本发明的特征在于一种用于制备HSA接头的方法，该方法包括用不同于天冬酰胺、丝氨酸、或苏氨酸的任何氨基酸取代在SEQ ID NO：1、3、以及6-15中的任何一个列出的氨基酸序列中的一个或多个天冬酰胺、丝氨酸、或苏氨酸残基，从而从HSA剂除去糖基化位点。
第十一方面，本发明的特征在于一种HSA接头，该HSA接头包含相对于在SEQ ID NO：16-25中列出的氨基酸序列之一具有至少90％序列同一性的序列。在一个实施方式中，上述HSA接头相对于在SEQ ID NO：16-25中列出的氨基酸序列之一具有至少95％序列同一性。在另一个实施方式中，上述HSA接头包含具有在SEQ IDNO：16-25中列出的氨基酸序列之一。在另一个实施方式中，该HSA接头具有在SEQ ID NO：16-25中列出的氨基酸序列之一。
在又一个实施方式中，该HSA接头或HSA接头结合物连接于诊断或治疗剂。诊断剂包括可检测标记，如放射性标记、生物发光标记、荧光标记、或重金属标记、或表位标签。可以用作可检测标记的荧光分子包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强的GFP(eGFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、红色荧光蛋白(RFP)、以及dsRed。在一个实施方式中，生物发光分子是荧光素酶。在另一个实施方式中，表位标签是c-myc、血凝素、或组氨酸标签。在又一个实施方式中，治疗剂是细胞毒性多肽如细胞色素c、半胱天冬酶1-10、颗粒酶A或B、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、TNF-β、Fas、Fas配体、Fas相关死亡域样IL-1β转化酶(FLICE)、TRAIL/APO2L、TWEAK/APO3L、Bax、Bid、Bik、Bad、Bak、RICK、血管凋亡诱导蛋白1和2(VAP1和VAP2)、pierisin、凋亡诱导蛋白(AIP)、IL-1α前片段多肽(IL-1αpropiece polypeptide)、凋亡蛋白、凋亡蛋白相关蛋白1(AAP-1)、内皮生长抑素、血管生长抑素、以及它们的生物活性片段。HSA接头或HSA接头结合物可以合并于(例如连接于或在药物组合物中与其混合)一种或多种治疗剂如环磷酰胺、喜树碱、高喜树碱、秋水仙碱、combrestatin、combrestatin、根霉素、多拉司他汀(dolistatin)、安丝菌素p3、类美登碱(类美坦素)、auristatin、卡奇霉素(caleachimicin)、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、多柔比星、紫杉醇、多西他赛、顺铂、卡铂、他莫昔芬、雷洛昔芬、来曲唑、表柔比星、贝伐单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、以及它们的衍生物。
在本文所述任何方面的一个实施方式中，第一和第二结合部分(以及，如果存在的话，一个或多个第三或另外结合部分)特异性地结合相同的靶分子。在任何方面的另一个实施方式中，第一和第二结合部分(以及，如果存在的话，一个或多个第三或另外结合部分)特异性地结合不同的靶分子。在任何方面的又一个实施方式中，第一和第二结合部分(以及，如果存在的话，一个或多个第三或另外结合部分)特异性地结合在相同靶分子上的不同表位。
第十二方面，本发明的特征在于一种HSA接头，该HSA接头包含在SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的氨基酸残基25-44和494-513中的一个或两个。在一个实施方式中，HSA接头包含在SEQID NO：1中列出的氨基酸序列的氨基酸残基25-70和450-513。在另一个实施方式中，HSA接头包含在SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的氨基酸残基15-100和400-520。在又一个实施方式中，HSA接头包含在SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的氨基酸残基10-200和300-575。在另一个实施方式中，HSA接头包含在SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的氨基酸残基5-250和275-580。
本发明的第十二方面，为了形成HSA接头结合物，使该HSA接头连接于至少第一结合部分。在一个实施方式中，HSA接头结合物包括至少第一肽连接物，该连接物将第一结合部分结合于HSA接头的氨基或羧基末端。在另一个实施方式中，第一肽连接物将第一结合部分共价结合于HSA接头。在又一个实施方式中，HSA接头包括第二结合部分。在一个实施方式中，HSA接头包括第二肽连接物，该连接物将第二结合部分结合于HSA接头。在其它实施方式中，第二连接物使第二结合部分结合于HSA接头的氨基或羧基末端。在又一个实施方式中，第二连接物使第二结合部分共价结合于HSA接头。在其它实施方式中，HSA接头包括第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、或第十结合部分。在其它实施方式中，这些另外的结合部分是以与第一或第二结合部分之一或两者串联的形式存在。在另一些实施方式中，肽连接物(例如，AAS、AAQ、或AAAL(SEQ ID NO：5))使一个或多个这些另外的结合部分彼此、与第一或第二结合部分、或与HSA接头分开。
本发明的第十二方面，HSA接头包括第一肽连接物和第二多肽连接物，该第一多肽连接物使第一结合部分共价结合于多肽接头的氨基末端，该第二肽连接物使第二结合部分共价结合于HSA接头的羧基末端。在一个实施方式中，第一连接物具有氨基酸序列AAS或AAQ以及第二连接物具有在SEQ ID NO：5中列出的氨基酸序列。
本发明的第十二方面，第一或第二结合部分(或者，如果存在的话，第三或另外结合部分)的一个或多个是抗体、单链Fv分子、双特异性单链Fv((scFv’)2)分子、域抗体、双抗体、三抗体、激素、Fab片段、F(ab’)2分子、串联scFv(taFv)片段、受体(例如，细胞表面受体)、配体、适体、或它们的生物活性片段。在一个实施方式中，第一或第二结合部分(或者，如果存在的话，第三或另外结合部分)的一个或多个是人或人源化单链Fv分子。
本发明的第十二方面，第一或第二结合部分(或者，如果存在的话，第三或另外结合部分)的一个或多个是或特异性地结合于蛋白质，该蛋白质选自由***1受体(IGF1R)、IGF2R、***(IGF)、间充质上皮转化因子受体(c-met；还称作肝细胞生长因子受体(HGFR))、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、TNF-β、叶酸受体(FOLR)、叶酸转铁蛋白受体(TfR)、间皮素、Fc受体、c-kit受体、c-kit、整联蛋白(例如，α4整联蛋白或β-1整联蛋白)、P-选择素、鞘氨醇-1-磷酸受体-1(S1PR)、透明质酸受体、白细胞功能抗原-1(LFA-1)、CD4、CD11、CD18、CD20、CD25、CD27、CD52、CD70、CD80、CD85、CD95(Fas受体)、CD106(血管细胞粘附分子1(VCAM1)、CD166(活化白细胞粘附分子(ALCAM))、CD178(Fas配体)、CD253(TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL))、ICOS配体、CCR2、CXCR3、CCR5、CXCL12(基质细胞衍生因子1(SDF-1))、白细胞介素1(IL-1)、CTLA-4、MART1、gp100、MAGE-1、ephrin(Eph)受体、黏膜地址素细胞黏附分子1(MAdCAM-1)、癌胚抗原(CEA)、LewisY、MUC-1、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、癌抗原125(CA125)、***特异性膜抗原(PSMA)、TAG-72抗原、以及它们的片段组成的组。在又一个实施方式中，第一或第二结合部分是或特异性地结合于成红细胞白血病病毒致癌基因同源物(ErbB)受体(例如，ErbB1受体；ErbB2受体；ErbB3受体；以及ErbB4受体)。在另一个实施方式中，第一或第二结合部分(或者，如果存在的话，第三或另外结合部分)的一个或多个部分是或特异性地结合于α-甲胎蛋白(AFP)或干扰素、或它们的生物活性片段。在又一个实施方式中，第一或第二结合部分(或者，如果存在的话，第三或另外结合部分)的一个或多个部分是那他珠单抗、英夫利昔单抗、阿达木单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、贝伐单抗、达珠单抗、依法利珠单抗、戈利木单抗、赛妥珠单抗、曲妥珠单抗、阿巴他塞、依那西普、帕妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗(panitumumab)、或阿那白滞素。
本发明的第十二方面，HSA接头连接于诊断剂、治疗剂、或两者。在一个实施方式中，诊断剂是可检测标记，如放射性标记、荧光标记、或重金属标记。在另一个实施方式中，治疗剂是细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、或免疫调节剂。细胞毒性剂包括烷化剂、抗生素、抗肿瘤剂、抗增殖剂、抗代谢物、微管蛋白抑制剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、激素激动剂或拮抗剂、免疫调节剂、DNA小沟结合剂、以及放射剂、或能够结合于肿瘤细胞并杀伤肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞增殖的任何药剂。抗肿瘤剂包括环磷酰胺、喜树碱、高喜树碱、秋水仙碱、combrestatin、combrestatin、根霉素、多拉司他汀(dolistatin)、安丝菌素p3、类美登碱(类美坦素)、auristatin、卡奇霉素(caleachimicin)、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、多柔比星、紫杉醇、多西他赛、顺铂、卡铂、他莫昔芬、雷洛昔芬、来曲唑、表柔比星、贝伐单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、以及它们的衍生物。在一个实施方式中，结合的HSA接头与药用载体、赋形剂、或稀释剂混合。在另一个实施方式中，HSA接头具有6小时至7天的体内半衰期。在又一个实施方式中，HSA接头具有大于8小时的体内半衰期。
本发明的第十三方面的特征在于本发明的任何先前方面(1至12)的药剂，其中HSA接头被另一种多肽接头取代。例如，多肽接头序列可以是哺乳动物的非人血清白蛋白多肽序列，如，例如，牛、鼠、猫、以及犬血清白蛋白(BSA)多肽序列。在其它实施方式中，这种多肽接头序列的长度为5至1,000个氨基酸，例如，长度为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、或900个氨基酸，或在上述范围内的任何数目的氨基酸。在其它实施方式中，多肽接头序列包括单氨基酸(包括但不限于，例如，甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、以及缬氨酸)、或氨基酸的组合。
在另一个实施方式中，HSA接头被α-甲胎蛋白(AFP)的多肽取代，例如，哺乳动物AFP多肽，如人、鼠、牛、或犬AFP多肽。在一个实施方式中，AFP接对应于全长人AFP多肽序列(a.a.1-609；SEQ ID NO：58)、缺少氨基酸1-18的信号序列的成熟人AFP多肽序列(a.a.，SEQ ID NO：58的19-609)、或它们的片段。在其它实施方式中，AFP多肽接头包含SEQ ID NO：58的至少5至8个邻接氨基酸，优选至少10、20、或50个邻接氨基酸，更优选至少100个邻接氨基酸，以及最优选至少200、300、400、或更多邻接氨基酸，或相对于SEQ ID NO：58的具有一个或多个这些长度的邻接多肽序列具有至少90％序列同一性(例如，至少95％、97％、99％、或更大序列同一性)。例如，相对于对应于SEQ ID NO：58的氨基酸446-479的34聚体(34-mer  )人AFP  肽(LSEDKLLACGEGAADIIIGHLCIRHEMTPVNPGV；S EQ ID NO：59)具有90％序列同一性的AFP多肽接头序列可以包含多达3个改变自SEQ ID NO：58的446-479节段的氨基酸。在生物活性人AFP片段中序列偏差的一个这样的实例参见，例如，美国专利号5,707,963(以引用方式结合于本文)，其披露了人AFP(SEQ ID NO：59)的两个氨基酸残基(SEQ ID NO：59的氨基酸9和22)处具有柔性的34氨基酸片段。AFP多肽接头序列的其它实例包括，例如，SEQ ID NO：58的氨基酸19-198(人AFP域I)、SEQ ID NO：58的氨基酸217-408(人AFP域II)、SEQ ID NO：58的氨基酸409-609(人AFP域III)、SEQ ID NO：58的氨基酸19-408(人AFP域I+II)、SEQID NO：58的氨基酸217-609(人AFP域II+III)、以及SEQ ID NO：58的氨基酸285-609(人AFP片段I)。在另一个实施方式中，人AFP多肽接头序列是8氨基酸序列，其包括SEQ ID NO：58的氨基酸489-496(即，EMTPVNPG)。
本发明的第十四方面的特征在于试剂盒，该试剂盒包括任何HSA接头、HSA接头结合物、或在上文中所讨论的第一、第二、第三、第四、第五、第十一、第十二、以及第十三方面中所描述的任何其它药剂。试剂盒进一步包括用法说明以便于使用者(例如，医生、护士、或患者)给予组合物以及包含在其中的药剂。在一个实施方式中，试剂盒包括多个包装的单或多剂量药物组合物，该药物组合物包含有效量的药剂，例如，本文中所述的HSA接头结合物或HSA接头，其包括，例如，一个或多个结合部分(例如，抗体或抗体片段(例如，scFv))、诊断剂(例如，放射性核素或螯合剂)、和/或治疗剂(例如，细胞毒性剂或免疫调节剂)。可选地，为给予药物组合物所必要的仪器或装置可以包括在试剂盒中。例如，试剂盒可以提供一个或多个预充满注射器，其包含有效量的HSA接头结合物或HSA接头、或与其结合的任何结合剂、诊断剂、和/或治疗剂。另外，试剂盒还可以包括附加成份如用法说明或给药时间表，以便患有疾病或病症(例如，癌症、自身免疫病、或心血管疾病)的患者使用药物组合物，该药物组合物包含，例如，HSA接头结合物或HSA接头、或与其结合的任何结合剂、诊断剂、和/或治疗剂。
定义
如在本文中可互换使用的，术语“抗体”包括整个抗体或免疫球蛋白以及其任何抗原结合片段或单链。如在本文中所使用的，抗体可以是哺乳动物(例如，人或小鼠)抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、合成产生抗体、或自然分离抗体。在大多数哺乳动物(包括人类)中，整个抗体具有由二硫键连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链。每个重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个域(CH1、CH2、以及CH3)和在CH1和CH2之间的铰链区构成。每个轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个域(CL)构成。VH和VL区可以进一步细分为高度可变区，即所谓的互补决定区(CDR)，与更加保守的区，即所谓的框架区(FR)交替存在。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，并从氨基末端至羧基末端以以下次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白结合于宿主组织或因子，包括免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体***的第一成分(Clq)。本发明的抗体包括所有已知形式的抗体以及具有抗体样性能的其它蛋白质骨架。例如，抗体可以是人抗体、人源化抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、或具有抗体样性能的蛋白质骨架，如纤连蛋白或锚蛋白重复序列。抗体还可以是Fab、Fab’2、scFv、SMIP、双抗体、纳米抗体、适体、或域抗体。抗体可以具有任何以下类型：IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3、以及IgG4)、IgM、IgA(例如，IgA1、IgA2、以及IgAsec)、IgD、或IgE。联合HSA接头一起可以用作结合部分的抗体，如本文中所定义的，包括但不限于那他珠单抗、英夫利昔单抗、阿达木单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、贝伐单抗、达珠单抗、依法利珠单抗、戈利木单抗、赛妥珠单抗、曲妥珠单抗、阿巴他塞、依那西普、帕妥珠单抗、西妥昔单抗、以及帕尼单抗(panitumumab)。
如在本文中所使用的，术语“抗体片段”是指抗体的一种或多种片段，其保留特异性地结合于抗原(例如，ErbB2)的能力。可以通过全长抗体的片段来实施抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，由VL、VH、CL、以及CH1域构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，一种二价片段，其包含由铰链区中的二硫桥连接的两个Fab片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1域构成；(iv)Fv片段，由抗体的单臂的VL和VH域构成；(v)dAb，包括VH和VL域；(vi)dAb片段((Ward et al.，Nature 341：544-546(1989)))，其由VH域构成；(vii)dAb，其由VH或VL域构成；(viii)分离的互补决定区(CDR)；以及(ix)两个或更多分离的CDR的组合，其中CDR可以可选地通过合成接头加以连接。另外，虽然Fv片段的两个域，VL和VH，由不同的基因编码，但可以利用重组方法并通过合成接头来连接它们，其中合成接头使得它们可以被制成单蛋白链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；参见例如，Bird et al.，Science 242：423-426(1988)以及Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988))。利用本领域技术人员已知的常规技术来获得这些抗体片段，并且对上述片段进行筛选以和完整抗体相同的方式来使用。可以通过重组DNA技术、或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割来产生抗体片段。
“自身免疫病”是指一种疾病，其中相对于自体表位或抗原产生免疫***反应。自身免疫病的实例包括但不限于局限性脱发、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、***、大疱性类天疱疮、心肌病、口炎性腹泻性皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、丘-斯综合征、瘢痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、克罗恩病、盘状狼疮、自发混合性冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯病、吉-巴综合征、桥本甲状腺炎、甲状腺功能减退症、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、幼年性关节炎、扁平苔藓、狼疮、美尼尔病、混合性***病、多发性硬化、寻常性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺性综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、雷诺现象、赖特尔综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、舍格伦综合征、斯蒂尔曼综合征、***性红斑狼疮(SLE)、高安动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎(例如，鸟枪弹丸样视网膜脉络膜病变葡萄膜炎(birdshot retinochoroidopathy uveitis)和结节病葡萄膜炎)、血管炎、白斑、韦格纳氏肉芽肿病、以及重症肌无力。
“结合部分”是指任何分子，该分子特异性地结合于靶抗原表位、抗原、配体、或受体。结合部分包括但不限于抗体(例如，单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体、以及嵌合抗体)、抗体片段(例如，Fab片段、Fab’2、scFv抗体、SMIP、域抗体、双抗体、小体、scFv-Fc、亲和体(affibodies)、纳米抗体、以及域抗体)、受体、配体、适体、以及具有已知结合伴侣(binding partner)的其它分子。
“生物活性的”是指，分子(包括生物分子，如核酸、肽、多肽、以及蛋白质)对本身或其它分子发挥物理或化学活性。例如，“生物活性”分子可以具有，例如，酶活性、蛋白结合活性(例如，抗体相互作用)、或细胞毒性活性。
术语“嵌合抗体”是指免疫球蛋白或抗体，其可变区来自第一物种并且其恒定区来自第二物种。嵌合抗体可以，例如，通过基因工程，构建自属于不同物种(例如，来自小鼠和人)的免疫球蛋白基因片段。
“连接物”或“肽连接物”是指长度为2至20个残基的氨基酸序列，其共价连接于HSA接头的一个或两个氨基或羧基末端，或共价连接于HSA接头的一个或多个残基(例如，在氨基和羰基末端残基之间的残基)。在优选实施方式中，连接于HSA接头的氨基末端的肽连接物具有氨基酸序列AAS或AAQ以及连接于羧基末端的连接物具有氨基酸序列“AAAL”(SEQ ID NO：5)。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指药剂(例如，结合有一个或多个结合部分或诊断或治疗剂并且有或没有连接物序列的HSA接头)的量，其足以产生所期望的结果，例如，杀伤癌细胞、减少肿瘤细胞增殖、减少在患病组织或器官中的炎症、或标记在组织、器官、或生物(例如，人)中的特定细胞群。
如在本文中所使用的，术语“人抗体”用来包括抗体、或其片段，其具有可变区，其中构架区和CDR区均来自如，例如，由Kabat etal.，(Sequences ofproteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242(1991))所描述的人种系免疫球蛋白序列。另外，如果抗体包含恒定区，则该恒定区也来自人种系免疫球蛋白序列。人抗体可以包括并不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变)。然而，如在本文中所使用的，术语“人抗体”并不用来包括这样的抗体，其中来自另一哺乳动物物种(如小鼠)种系的CDR序列已被移植到构架序列(即，人源化抗体或抗体片段)。
术语“人源化抗体”是指包括至少一个免疫球蛋白域的任何抗体或抗体片段，上述域具有可变区，该可变区包括基本上来自人免疫球蛋白或抗体的可变框架区以及基本上来自非人免疫球蛋白或抗体的互补决定区(例如，至少一个CDR)。
如在本文中所使用的，“炎性信号抑制剂”或“ISI”是一种药剂，其降低促炎细胞因子(例如，TNF-α、TNF-β、或IL-1)和它的受体(例如，分别为TNF受体1或2、或IL-1受体)之间的结合；降低激活分子与促炎细胞表面信号分子(例如，CD20、CD25、CTLA-4、CD80/CD86、或CD28)的结合；或降低细胞内信号分子的下游激活、或活性，其中上述细胞内信号分子在促炎细胞因子结合于它们的受体或激活分子结合于促炎细胞表面信号分子以后被激活(例如，一种药剂，其降低信号分子在p38MAPK信号通路中的激活、或活性)。ISI介导的降低可以是促炎细胞因子和其受体之间结合的降低、激活分子与促炎细胞表面信号分子的结合的降低、或在促炎细胞因子结合于它们的受体或激活分子结合于促炎细胞表面信号分子以后发生的分子内信号的降低。优选地，这样的由ISI介导的降低是至少约10％，优选至少20％、30％、40％、或50％，更优选至少60％、70％、80％、或90％(高达100％)的降低。ISI可以通过减少可自由获得的用来结合受体的促炎细胞因子(例如，TNF-α、TNF-β、或IL-1)的量来发挥作用。例如，ISI可以是可溶性促炎细胞因子受体蛋白(例如，可溶性TNF受体融合蛋白如依那西普
Figure BDA0000075609680000211
或来那西普)、或可溶性促炎细胞表面信号分子(例如，可溶性CTLA-4(阿巴他塞))、或导向促炎细胞因子或促炎细胞表面信号分子的抗体(例如，抗TNF抗体，如阿达木单抗、赛妥珠单抗、inflixamab、或戈利木单抗；抗CD20抗体，如利妥昔单抗；或TRU-015(Trubion Pharmaceuticals))。另外，ISI可以通过破坏内源性野生型促炎细胞因子或促炎细胞表面信号分子结合于其受体(例如，TNF受体1或2、IL-1受体如阿那白滞素、或CD11a如依法利珠单抗(
Figure BDA0000075609680000212
Genentech))的能力来发挥作用。显性失活(dominant-negative)TNF-α变体的实例是XENP345(TNF变体A145R/I97T的聚乙二醇化形式)和XproTM1595、以及另外的在美国专利申请公开号20030166559和20050265962(其以引用方式结合于本文)中披露的变体。显性失活IL-1变体的一个实例是阿那白滞素
Figure BDA0000075609680000213
其是IL-1的可溶形式，其中IL-1结合于IL-1受体而没有激活细胞内信号通路。可以用于本发明的炎性信号抑制剂也是小分子，其抑制或降低促炎细胞因子或促炎细胞表面信号分子(例如，DE 096)下游的信号通路。这种类型的ISI的实例包括p38MAP激酶的抑制剂，例如，5-氨基-2-羰基噻吩衍生物(5-amino-2-carbonylthiopene derivatives)(如在结合于本文的WO04/089929中所描述的)；ARRY-797；BIRB 796BS、(1-5-叔丁基-2-对甲苯基-2H-吡唑-3-基)-3-[4-2(吗啉-4-基-乙氧基)-萘-1-基]-脲)；CHR-3620；CNI-1493；FR-167653(Fujisawa Pharmaceutical，Osaka，日本)；ISIS 101757(Isis Pharmaceuticals)；ML3404；NPC31145；PD169316；PHZ1112；RJW67657、(4-(4-(4-氟苯基)-1-(3-苯基丙基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑-2-基)-3-丁炔-1-醇；SCIO-469；SB202190；SB203580、(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚硫酰基苯基)-5-(4-吡啶基)1H-咪唑)；SB239063、反-1-(4-羟基环己基)-4-(4-氟苯基-甲氧基嘧啶-4-基)咪唑(trans-1-(4-hydroxycyclohexyl)-4-(4-fluorophenyl-methoxypyridimidin-4-yl)imidazole)；SB242235；SD-282；SKF-86002；TAK 715；VX702；以及VX745。另外，ISI可以干扰促炎细胞因子(例如，TNF-α和TNF-β)从它的膜结合形式加工成它的可溶形式。TACE的抑制剂是这种类型的ISI。TACE的抑制剂的实例包括BB-1101、BB-3103、BMS-561392、丁炔基羟苯基β-砜哌啶氧肟酸盐(butynyloxyphenylβ-sulfone piperidinehydroxomates)、CH4474、DPC333、DPH-067517、GM6001、GW3333、Ro 32-7315、TAPI-1、TAPI-2、以及TMI 005。ISI的另外实例包括来自大肠杆菌热激蛋白的短肽，其设计成具有疾病特异性免疫调节活性(例如，dnaJP1)。
“整联蛋白拮抗剂”是指降低或抑制整联蛋白分子的生物活性的任何药剂(例如，相对于在没有整联蛋白拮抗剂的条件下的生物活性，降低或抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、或更大)，如整联蛋白分子的α4亚单位。上述药剂可以通过抑制α4整联蛋白亚单位的活性或表达直接或间接作用于α4整联蛋白亚单位(NCBI Accession No.P13612；Takada etal.，EMBO J. 8：1361-1368(1989))，或可以作用于包含α4亚单位的完整整联蛋白所结合的靶。例如，结合于血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)并因此防止α4β1整联蛋白结合于VCAM-1的抗体或封闭肽被认为是用于本发明的目的的整联蛋白拮抗剂。适用于本发明的非限制性的典型的整联蛋白拮抗剂可以包括蛋白质、封闭肽、抗体，如那他珠单抗
Figure BDA0000075609680000231
以及小分子抑制剂。α4整联蛋白拮抗剂的实例包括但不限于那他珠单抗(Elan/Biogen Idec；参见，例如，美国专利号5,840,299、6,033,665、6,602,503、5,168,062、5,385,839、以及5,730,978，以引用方式结合于本文)、oMEPUPA-V(Biogen；美国专利号6,495,525，以引用方式结合于本文)、alefacept、CDP-323(Celltech)；firategrast(SB-68399；GlaxoSmithKline)；TR-9109(Pfizer)；ISIS-107248(AntisenseTherapeutics)；R-1295(Roche)；以及TBC-4746(Schering-PloUgh)。α4整联蛋白拮抗剂的另外的非限制实例包括小分子，参见：美国专利号5,821,231、5,869,448、5,936,065、6,265,572、6,288,267、6,365,619、6,423,728、6,426,348、6,458,844、6,479,666、6,482,849、6,596,752、6,667,331、6,668,527、6,685,617、6,903,128、以及7,015,216(各自以引用方式结合于本文)；美国专利申请公开号2002/0049236、2003/0004196、2003/0018016、2003/0078249、2003/0083267、2003/0100585、2004/0039040、2004/0053907、2004/0087574、2004/0102496、2004/0132809、2004/0229858、2006/0014966、2006/0030553、2006/0166866、2006/0166961、2006/0241132、2007/0054909、以及2007/0232601(各自以引用方式结合于本文)；欧洲专利号EP 0842943、EP 0842944、EP 0842945、EP 0903353、以及EP 0918059；以及PCT公开号WO 95/15973、WO 96/06108、WO 96/40781、WO 98/04247、WO 98/04913、WO98/42656、WO 98/53814、WO 98/53817、WO 98/53818、WO98/54207、WO 98/58902、WO 99/06390、WO 99/06431、WO99/06432、WO 99/06433、WO 99/06434、WO 99/06435、WO99/06436、WO 99/06437、WO 99/10312、WO 99/10313、WO99/20272、WO 99/23063、WO 99/24398、WO 99/25685、WO99/26615、WO 99/26921、WO 99/26922、WO 99/26923、WO99/35163、WO 99/36393、WO 99/37605、WO 99/37618、WO99/43642、WO 01/42215、以及WO 02/28830，所有这些以引用方式结合于本文。α4整联蛋白拮抗剂的另外的实例包括苯基丙氨酸衍生物，参见美国专利号6,197,794、6,229,011、6,329,372、6,388,084、6,348,463、6,362,204、6,380,387、6,445,550、6,806,365、6,835,738、6,855,706、6,872,719、6,878,718、6,911,451、6,916,933、7,105,520、7,153,963、7,160,874、7,193,108、7,250,516、以及7,291,645(各自以引用方式结合于本文)。作为α4整联蛋白拮抗剂的另外的氨基酸衍生物包括那些衍生物。其描述于，例如，美国专利申请公开号2004/0229859和2006/0211630(以引用方式结合于本文)，以及PCT公开号WO 01/36376、WO 01/47868、以及WO 01/70670，所有这些以引用方式结合于本文。α4整联蛋白拮抗剂的其它实例包括肽、以及肽和半肽化合物，参见，例如，PCT公开号WO 94/15958、WO 95/15973、WO 96/00581、WO 96/06108、WO 96/22966(Leu-Asp-Val三肽；Biogen，Inc.)、WO 97/02289、WO 97/03094、以及WO 97/49731。α4整联蛋白拮抗剂的另外的实例是在美国专利申请公开号2007/066533(以引用方式结合于本文)中描述的聚乙二醇化分子。作为α4整联蛋白拮抗剂的抗体的实例包括在，例如，PCT公开号WO 93/13798、WO 93/15764、WO 94/16094、以及WO95/19790中描述的那些抗体。本文描述了α4整联蛋白拮抗剂的另外的实例。
“干扰素”是指哺乳动物(例如，人)干扰素-α、-β、-γ、或-τ多肽、或它们的生物活性片段，例如，IFN-α(例如，IFN-α-1a，参见美国专利申请号20070274950，其以引用方式结合于本文)，IFN-α-1b，IFN-α-2a(参见PCT申请号WO 07/044083，其以引用方式结合于本文)，以及IFN-α-2b)，IFN-β(例如，描述在美国专利号7,238,344中，其以引用方式结合于本文；IFN-b-1a(
Figure BDA0000075609680000241
和
Figure BDA0000075609680000242
)，如在美国专利号6,962,978中所描述的，其以引用方式结合于本文，以及IFN-β-1b(
Figure BDA0000075609680000243
如在美国专利号4,588,585、4,959,314、4,737,462、以及4,450,103中所描述的，它们以引用方式结合于本文)，IFN-g，以及IFN-t(如在美国专利号5,738,845以及美国专利申请公开号20040247565和20070243163中所描述的，它们以引用方式结合于本文)。
“HSA接头结合物”是指人血清白蛋白(HSA)接头连同(优选共价结合于)一种或多种结合部分、肽连接物、诊断剂、或治疗剂。
如在本文中所使用的，术语“单克隆抗体”是指获自基本均一抗体的群体的抗体，即，包括群体的个体抗体是相同的，不同之处在于可以少量存在的可能的自然发生的突变。单克隆抗体是高度特异的、导向单抗原位点。另外，不同于常规(多克隆)抗体药剂，其通常包括导向不同决定簇(抗原表位)的不同抗体，每种单克隆抗体导向抗原上的单决定簇。可以利用任何技术领域认可的技术和在本文中的那些技术来制备单克隆抗体，如，例如。杂交瘤方法，如由Kohler et al.，Nature 256：495(1975)描述的，转基因动物(例如，Lonberg et al.，Nature 368(6474)：856-859(1994))，重组DNA方法(例如，美国专利号4,816,567)，或使用噬菌体、酵母、或合成支架抗体文库并利用在，例如，Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)以及Marks et al.，J. Mol.Biol.222：581-597(1991)中描述的技术。
“药用载体”是指一种载体，该载体对于待治疗的哺乳动物来说是生理上可接受的，同时保留与其一起给予的化合物的治疗性能。一种典型的药用载体是生理盐水。其它生理上可接受的载体和它们的配方是本领域技术人员已知的并且描述在，例如，Remington’sPharmaceutical Sciences，(18thedition)，ed.A.Gennaro，1990，MackPublishing Company，Easton，PA中。
“增生性疾病”或“癌症”是指特征在于异常或未调节细胞生长的任何病症。增生性疾病的实例包括，例如，实体瘤如：肉瘤(例如，透明细胞肉瘤)、癌(例如，肾细胞癌)、以及淋巴瘤；以下组织、器官、或***的肿瘤：胸、结肠、直肠、肺、口咽、咽下部、食管、胃、胰、肝、胆囊、胆管、小肠、泌尿***(包括肾、膀胱、以及泌尿道的上皮)、女性生殖***(包括宫颈、子宫、卵巢、绒膜瘤、以及妊娠滋养层)、男性生殖***(包括***、精囊、以及睾丸)、内分泌腺(包括甲状腺、肾上腺、以及垂体)、皮肤(包括血管瘤、黑色素瘤、来自骨或软组织有肉瘤、以及卡波西肉瘤)、脑和脑膜(包括星形细胞瘤、神经星形细胞瘤、成海绵细胞瘤、成视网膜细胞瘤、神经瘤、成神经细胞瘤、神经鞘瘤和成神经细胞瘤)、神经、眼、血细胞生成***(包括绿色瘤性白血病、浆细胞瘤以及真皮T淋巴瘤/白血病)、以及免疫***(包括淋巴瘤，例如，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)。非实体瘤增生性疾病的一个实例是白血病(例如，急性成淋巴细胞白血病)。
术语“重组抗体”是指通过重组方式制备、表达、产生、或分离的抗体，如(a)分离自动物(例如，小鼠)的抗体，其对于免疫球蛋白基因(例如，人免疫球蛋白基因)或从其制备的杂交瘤来说是转基因的或转染色体的(transchromosomal)，(b)分离自被转化以表达抗体的宿主细胞，例如，分离自转染瘤的抗体，(c)分离自重组、组合抗体文库(例如，包含人抗体序列)的抗体，其中利用噬菌体、酵母、或合成支架(synthetic scaffold)展示，以及(d)通过任何其它方式制备、表达、产生、或分离的抗体，其中上述任何其它方式涉及将免疫球蛋白基因序列(例如、人免疫球蛋白基因)剪接成其它DNA序列。
“特异性结合”是指结合部分(例如，本文中描述的药剂的抗体、抗体片段、受体、配体、或小分子部分)优先结合于靶分子(例如，分泌靶分子，如细胞因子、趋化因子、激素、受体、或配体)或优先结合于含有靶分子(例如，细胞表面抗原，如受体或配体)的细胞或组织并且不优先结合于缺少靶分子的非靶细胞或组织。普遍认为，在结合部分和非靶分子(单独或连同细胞或组织一起存在)之间可以发生一定程度的非特异性相互作用。然而，特异性结合可以称之为通过靶分子的特异性识别加以介导。与在结合部分和例如，缺少靶分子的细胞之间的结合相比，特异性结合导致在结合部分(例如，抗体)和例如，含有靶分子(例如，抗原)的细胞之间更强的结合。和缺少靶分子或标记的细胞或组织相比，特异性结合通常导致与例如，含有靶分子或标记的细胞或组织的结合的结合部分的量(每单位时间)增加大于2倍，优选大于5倍，更优选大于10倍以及最优选大于100倍。结合部分结合于靶分子或标记，其中解离常数为例如，小于10-6M、更优选小于10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、或10-12M，以及最优选小于10-13M、10-14M、或10-15M。在上述条件下与蛋白质的特异性结合需要这样的结合部分，对该结合部分的选择是根据其对特定蛋白质的特异性。各种测定格式适用于选择能够特异性地结合特定靶分子的结合部分(例如，抗体)。例如，固相ELISA免疫测定常规地用来选择与蛋白质具有特异性免疫活性的单克隆抗体。关于可以用来确定特异性免疫反应活性的免疫测定格式和条件的描述，参见Harlow&Lane，Antibodies，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，New York(1988)。
术语“序列同一性”是指(当比较多核苷酸或多肽序列和参比序列时)当两个序列进行最佳比对时，多核苷酸或多肽序列与参比序列相同或有特定百分比的核苷酸或氨基酸残基与在参比序列中的相应位置相同。
“表面暴露的氨基酸残基”或“表面暴露的”是指存在于HSA多肽的折叠和构象正确三级结构的外表面上的氨基酸残基。上述残基可以被例如，其它化学活性的氨基酸(例如，半胱氨酸)取代，以便于诊断或治疗剂的位点特异性结合。另外，表面暴露的氨基酸残基可以被取代以便于(例如，通过添加丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺残基、或糖基化基序)或防止(例如，通过除去丝氨酸、苏氨酸、或天冬酰胺残基、或糖基化基序)糖基化。表面暴露的氨基酸残基包括但不限于在位置496处的苏氨酸、在位置58处的丝氨酸、在位置76处的苏氨酸、在位置79处的苏氨酸、在位置83处的苏氨酸、在位置125处的苏氨酸、在位置236处的苏氨酸、在位置270处的丝氨酸、在位置273处的丝氨酸、在位置304处的丝氨酸、在位置435处的丝氨酸、在位置478处的苏氨酸、在位置506处的苏氨酸、以及在位置508处的苏氨酸(氨基酸编号是相对于例如，列出在SEQ ID NO：1中的HSA接头的序列)。利用HSA晶体结构，本领域技术人员可以鉴定其它表面暴露残基(Sugio et al.，“Crystalstructure of human serum albumin at 2.5A resolution，”Protein Eng.12：439-446(1999))。“受治疗者”是指包含人肿瘤细胞的人类患者或裸鼠异种移植模型。
“靶分子”或“靶细胞”是指结合部分(例如，抗体)能够结合其的分子(例如，蛋白质、抗原表位、抗原、受体、或配体)或细胞、或HSA结合物(conjugate)，其包含一个或多个结合部分(例如，结合于一个或多个抗体或抗体片段的HSA接头)。优选的靶分子暴露于靶细胞的外部(例如，细胞表面或分泌蛋白)但靶分子可以可替代地或也可存在于靶细胞的内部。
“治疗”优选地提供了在受治疗者中降低(例如，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、或甚至100％)人疾病或障碍(例如，自身免疫性或增生性疾病)的进展或严重性，或降低人疾病或障碍的一种或多种症状的进展、严重性、或频率。
附图说明
图1是典型的HSA接头结合物的示意图。在氨基末端结合部分和HSA接头之间的连接物具有丙氨酸、丙氨酸以及丝氨酸的序列。在HSA接头和羧基末端结合部分之间的连接物具有丙氨酸、丙氨酸、丙氨酸、亮氨酸的序列(SEQ ID NO：5)。
图2是曲线图，其示出在ZR75-1乳腺癌细胞中B2B3变体抑制HRG诱导的pErbB3。
图3A-D是曲线图，其示出在BT474乳腺癌细胞中，在用B2B3HSA接头结合物B 1D2-2(A5-HSA-B 1D2，图3A)、B 1D2-1(H3-HSA-B1D2，图3B)、B2B3-10(H3-HSA-F5B6H2，图3C)、以及B2B3-8(F4-HSA-F5B6H2，图3D)预处理24小时以后磷酸化ErbB3的抑制。下文中(例如表6中)列出了关于这些HSA接头结合物的进一步细节。
图4A-D是曲线图，其示出在BT474乳腺癌细胞中在用B2B3HSA接头结合物B 1D2-2(A5-HSA-B 1D2，图4A)、B 1D2-1(H3-HSA-B1D2，图4B)、B2B3-10(H3-HSA-F5B6H2，图4C)、以及B2B3-8(F4-HSA-F5B6H2，图4D)预处理24小时以后磷酸化AKT的抑制。下文中(例如表6中)列出了关于这些HSA接头结合物的进一步细节。
图5A-D是曲线图，其示出在BT474乳腺癌细胞中，在用B2B3HSA接头结合物B1D2-2(A5-HSA-B1D2，图5A)、B1D2-1
(H3-HSA-B1D2，图5B)、B2B3-10(H3-HSA-F5B6H2，图5C)、以及B2B3-8(F4-HSA-F5B6H2，图5D)预处理24小时以后磷酸化ERK的抑制。下文中(例如表6中)列出了关于这些HSA接头结合物的进一步细节。
图6是曲线图，其示出，用B2B3-1变体对BT474乳腺癌细胞的处理会引起G1停止以及减少在S期中细胞的数目。
图7是流式细胞术柱形图，其示出，用1μM B2B3-1预温育BT-474-M3细胞会显著阻断HRG的结合。
图8A-D是曲线图，其示出，在B-T474-M3和ZR75-30细胞系中，B2B3-1会抑制ErbB3和AKT磷酸化。用剂量滴定的B2B3-1预处理乳腺癌细胞系BT-474-M3(图8A和8C)和ZR75-30(图8B和8D)24小时，然后用5nM的HRG 1βEGF域刺激10分钟。然后利用ELISA测定来检查ErbB3和AKT的磷酸化状态。
图9是蛋白质印迹照片，其示出在BT474乳腺癌细胞中用浓度增加的B2B3-1处理对信号蛋白的影响。“p-”表示信号蛋白的酪氨酸磷酸化形式。β微管蛋白(在本文中不是信号蛋白)提供了负载对照。β微管蛋白(在本文中不是信号蛋白)提供了负载对照。
图10是蛋白质印迹照片，其示出经B2B3-1处理的BT474乳腺癌细胞的免疫沉淀。β微管蛋白提供了对于输入到免疫沉淀反应中的细胞蛋白水平的对照。
图11A-C示出，BT-474细胞系的B2B3-1处理会引起G1停止以及在S期中细胞群体的减小(图11A)，以及和未处理细胞相比(图11B)会抑制BT-474和SKBr3细胞中的集落形成。此外，在细胞阻抗测定中，B2B3-1会抑制BT-474-M3细胞的增殖(图11C)。
图12是曲线图，其示出了在ZR75-1细胞中B2B3-1并不刺激ErbB3磷酸化。
图13A-B是曲线图，其示出B2B3-1特异性地结合于ErbB3(图13A)和ErbB2(图13B)。
图14是曲线图，其示出，与ErbB2唯一的结合变体SKO-3，以及ErbB3唯一的结合变体SKO-2相比，B2B3-1与MALME-3细胞的亲和力结合导致表观结合亲和力的显著增加。
图15A-C是曲线图，其示出B2B3-1在小鼠、食蟹猴、以及人血清中的稳定性。在小鼠(图15A)、食蟹猴(图15B)、或人(图15C)血清中并在37℃下温育100nM B2B3-1达120小时。在0、24、48、72、96以及120小时除去样品，并通过ELISA(RLU＝相对光单位)来测量B2B3-1结合ErbB2和ErbB3的能力。
图16是曲线图，其示出在BT-474-M3乳腺癌异种移植模型中的B2B3-1剂量反应。在BT-474-M3胸肿瘤系中并在指定剂量下评估的B2B3-1剂量与肿瘤反应的关系。以52.5mg/kg给予HSA，其是90mg/kg B2B3-1剂量的等摩尔剂量。
图17A-E是曲线图，其示出，以ErbB2依赖性方式，B2B3-1在多种异种移植模型中是有效的。示出Calu-3(人肺腺癌；图17A)、SKOV-3(人卵巢腺癌；图17B)、NCI-N87(人胃癌；图17C)、ACHN(人肾腺癌；图17D)、以及MDA-MB-361(人胸腺癌；图17E)异种移植模型。每3天用30mg/kg的B2B3-1或用与B2B3-1等摩尔剂量的HSA对照，来治疗小鼠。
图18A-B是曲线图，其示出，ErbB2的过度表达使B2B3-1非反应者ADRr乳腺癌异种移植模型转化成反应者。利用反转录病毒表达***，ErbB2过度表达在野生型ADRr异种移植物中(图18A)以及ADRr-E2异种移植物中(图18B)。
图19A-B表明，B2B3-1活性与体外(图19A)和体内(图19B)ErbB2表达水平正相关。
图20A-B表明，B2B3-1治疗会改变肿瘤细胞周期。图20A包括荧光显微照片，其表明，B2B3-1处理BT474-M3胸肿瘤细胞6小时会导致细胞周期抑制剂p27kip1易位到细胞核。烟酸己可碱染色用来鉴定细胞核。图20B是用B2B3-1处理72小时的BT-474-M3细胞的蛋白质印迹，其导致细胞周期调节剂细胞周期蛋白D1的水平的降低。在此实验中，细胞骨架蛋白纽蛋白用作蛋白负荷对照。
图21A-B是显微照片，其表明，B2B3-1处理BT474胸肿瘤异种移植物导致p27kip1易位到细胞核。每3天用剂量为30mg/kg的B2B3-1(图21A)或用等摩尔剂量的HSA(图21B)处理BT474胸肿瘤异种移植物，总共为4次给药，然后对p27kip1进行染色。
图22A-B是荧光显微照片，其表明B2B3-1处理导致在BT474-M3乳腺癌异种移植物中增殖标记Ki67的减少。每3天用剂量为30mg/kg的B2B3-1(图22A)或用等摩尔剂量的HSA(图22B)处理BT474-M3胸肿瘤异种移植物，总共为4次给药。
图23A-B是荧光显微照片，其表明B2B3-1处理导致在BT474-M3乳腺癌异种移植肿瘤中血管密度的减小(如通过CD31着色的减少所确定的)。每3天用剂量为30mg/kg的B2B3-1(图23A)或用等摩尔剂量的HSA(图23B)处理BT474-M3胸肿瘤异种移植物，总共为4次给药。
图24A-B表明，B2B3-1在体内抑制ErbB3的磷酸化。使来自单独的BT-474-M3异种移植肿瘤并经B2B3-1(M1-M5)或对照HSA(H1-H2)处理的溶胞产物进行SDS-PAGE并利用蛋白质印迹分析检测pErbB3和β微管蛋白(图24A)。平均pErbB3信号相对于平均β微管蛋白信号的归一化表明，经B2B3-1治疗的肿瘤比HSA肿瘤包含少得多的pErbB3(图24B)。
图25A和B是曲线图，其示出B2B3-1在BT-474-M3shPTEN和sh对照异种移植物中的体内活性。用对照载体(图25A)或用表达shPTEN的反转录病毒载体(图25B)转染培养的BT-474-M3肿瘤细胞，其敲除PTEN活性。由此将基因工程改造的敲除PTEN活性的BT-474-M3乳腺癌细胞注入小鼠右胁腹，同时将用对照载体转染的细胞注入相同小鼠的左胁腹。每3天用30mg/kg B2B3-1或每周用10mg/kg曲妥珠单抗治疗小鼠，并且注射相对于B2B3-1等摩尔剂量的HSA作为对照。B2B3-1和曲妥珠单抗促进由对照BT-474-M3乳腺癌细胞形成的肿瘤尺寸的减小(图25A)，而仅B2B3-1(并且不是曲妥珠单抗)促进由缺少PTEN表达的BT-474-M3乳腺癌细胞形成的肿瘤尺寸的减小(图25B)。
图26A-B表明，在具有降低的PTEN活性的BT-474-M3异种移植物中，B2B3-1会抑制AKT的磷酸化。在完成处理(q3dx11)以后，溶解肿瘤并通过蛋白质印迹分析测试PTEN、pErbB3、以及pAKT表达水平(图26A)。对pAKT的谱带强度(归一化到总AKT和总蛋白)的密度测定结果表明，当曲妥珠单抗不能时，B2B3-1能够抑制这种蛋白的磷酸化(图26B)。
图27A-D是曲线图，其示出在nu/nu小鼠中B2B3-1的5(图27A)、15(图27B)、30(图27C)、以及45(图27D)mg/kg大丸剂剂量的单剂量药物动力学性能。通过HSA测定或ErbB2/ErbB3测定测得的B2B3-1血清浓度是相当的，这表明在循环中保留了B2B3-1的抗原结合活性。
图28示出在裸鼠中B2B3-1的5、15、30、以及45mg/kg大丸剂剂量的剂量暴露关系。剂量的增加导致对B2B3-1的总暴露的线性增加。
图29示出在每3天给予剂量共4个剂量的食蟹猴中测得的B2B3-1血清浓度，其中剂量为4mg/kg(n＝2)、20mg/kg(n＝2)以及200mg/kg(长达336小时，n＝4，对于384、552以及672小时时间点，n＝2)。
图30示出B2B3-1表达质粒pMP10k4H3-mHSA-B1D2。
图31示出新霉素抗性质粒pSV2-neo。
图32示出潮霉素抗性质粒pTK-Hyg。
图33示出了代表q7d给予B2B3-1的数据，等同于q3d给药的效力。
图34示出了代表B2B3-1和曲妥珠单抗表现出不同的ErbB3抑制机制的蛋白质印记数据。
图35A-C示出了实施例43中的详细实验结果，其中在作为人乳腺癌模型的各种人类乳腺癌细胞系的球状体细胞中研究了B2B3-1与曲妥珠单抗的组合治疗。图35A示出了利用BT-474-M3细胞获得的数据，图35B示出了利用SKBR3细胞获得的数据，且图35C示出了利用MDA-MB-361细胞获得的数据。单独的或组合的B2B3-1的摩尔浓度沿X轴给出。单独的或组合的曲妥珠单抗的摩尔浓度是每一所示的B2B3-1浓度的三分之一。
图36示出了在实施例44中具体进行的体内肿瘤异种移植实验的结果。X轴上的“天”表示肿瘤移植后的天数。每一个数据点的误差条代表对至少两种独立生物异种移植物的响应。
图37示出了获自基本上如实施例44中描述的异种移植模型的数据，除所使用的肿瘤细胞是N-87胃肿瘤细胞，N-87胃肿瘤细胞可获自美国国家癌症研究所(US National Cancer Institute)。
图38示出了图36中所示的亚组的数据。
具体实施方式
本发明提供了人血清白蛋白(HSA)接头，以及包含HSA接头和一个或多个另外部分(例如结合部分)的HSA接头结合物(例如，结合、诊断、或治疗剂)。这样的HSA接头结合物具有希望的性质，例如，增加的6小时至7天的体内半衰期，并且当体内给予哺乳动物(例如，人)时并不诱导显著的体液或细胞介导的免疫反应。一方面，本发明提供了突变HSA接头，该接头具有两个限定的氨基酸取代(即，“C34S”和“N503Q”取代，如在SEQ ID NO：1中所列出的)。另一方面，本发明提供了结合于一种或多种结合部分(例如，抗体、抗体片段、受体/配体、或小分子)的HSA接头，用于在哺乳动物(例如，人)中的体内诊断或治疗用途，或体外连同哺乳动物细胞、组织、或器官一起使用。又一方面，HSA接头可以连接于一种或多种免疫调节剂、细胞毒性或细胞生长抑制剂、可检测标记、或放射剂，用于哺乳动物(或连同哺乳动物细胞、组织、或器官)的诊断或治疗用途。包括HSA接头的HSA接头结合物可以可选地合并一种或多种药用载体或赋形剂，并且可以配制成以静脉内途径、肌内途径、口服、吸入途径、胃肠道外途径、腹腔内途径、动脉内途径、透皮途径、舌下途径、鼻腔途径、通过使用栓剂、经颊途径、脂质体途径、脂肪途径、眼途径、眼内途径、皮下途径、鞘内途径、局部途径、或局部途径给药。HSA接头结合物能够，但不是必需合并一种或多种生物活性剂(例如，生物或化学剂，如化疗剂和抗肿瘤剂)或与它们一起给予。又一方面，本发明提供了带有用法说明的试剂盒，用于将结合部分(例如，抗体、抗体片段、受体或配体)、免疫调节剂、细胞毒性或细胞生长抑制剂、可检测标记、或放射剂结合于HSA接头，以制备可用于诊断或治疗用途的HSA接头结合物。
人血清白蛋白(HSA)接头
HSA接头可以包含各种类型的HSA氨基酸序列，如SEQ IDNO：3中列出的。可替代地，该HSA接头可包含一种改变的、或突变的序列。一种突变的HSA接头包含相对于在SEQ ID NO：3中列出的野生型HSA氨基酸序列在位置34和503处的两个氨基酸突变。在位置34处的半胱氨酸残基(即，C34)可以被突变成不同于半胱氨酸的任何氨基酸残基(例如，丝氨酸、苏氨酸、或丙氨酸)。同样，在位置503处的天冬酰胺残基(即，N503)可以被突变成不同于天冬酰胺的任何氨基酸残基(例如，谷氨酰胺、丝氨酸、组氨酸、或丙氨酸)。在一个实施方式中，HSA接头具有分别列出在SEQ ID NO：1和2中的氨基酸和相应的核苷酸序列。这种突变HSA接头包含两个氨基酸取代(即，丝氨酸取代在氨基酸残基34处的半胱氨酸(“C34S”)以及谷氨酰胺取代在氨基酸残基503处的天冬酰胺(“N503Q”))。相对于在没有HSA接头存在的条件下这些药剂的药理性能，HSA接头当结合于一种或多种结合部分(例如，抗体、抗体片段(例如，单链抗体)、或其它靶向或生物活性剂(例如，受体和配体))时，可以赋予那些结合物和连接的另外的诊断或治疗剂(例如，免疫调节剂、细胞毒性或细胞生长抑制剂、可检测标记、或放射剂))若干有利的药理性能。这些益处可以包括当给予哺乳动物(例如，人)时降低的免疫原性(例如，接头-抗体结合物的降低的宿主抗体中和)、HSA接头结合物的增加的检测(例如，通过质谱法)以及增加的药理半衰期(例如，大于6小时、8小时、12小时、24小时、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、或7天的半衰期)。具体地说，丝氨酸取代在氨基酸残基34处的半胱氨酸导致HSA接头的降低的氧化和蛋白质异质性。在野生型HSA中，在氨基酸残基503处的天冬酰胺对脱氨作用是敏感的，同样导致降低的药理半衰期。谷氨酰胺取代在氨基酸残基503处的天冬酰胺可以导致HSA接头的延长的药理半衰期，因而，当给予哺乳动物(例如，人)或其细胞、组织、或器官时，相应地增加包括HSA接头的结合剂的药理半衰期。
在其它实施方式中，突变HSA接头包括HSA的域I(SEQ IDNO：53；SEQ ID NO：1的残基1-197)、HSA的域III(SEQ ID NO：55；SEQ ID NO：1的残基381-585)、HSA的域I和III的组合、或HSA的域I或III与HSA的域II的组合(SEQ ID NO：54；SEQ ID NO：1的残基189-385)。例如，HSA接头可以包括域I和II、I和III、或II和III。此外，在域I(SEQ ID NO：53)的位置34处的半胱氨酸残基(即，C34)可以被突变成不同于半胱氨酸的任何氨基酸残基(例如，丝氨酸、苏氨酸、或丙氨酸)。同样，在域III(SEQ ID NO：55)的位置503处的天冬酰胺残基(即，N503)可以被突变成不同于天冬酰胺的任何氨基酸残基(例如，谷氨酰胺、丝氨酸、组氨酸、或丙氨酸)。可以将这些HSA接头加入HSA接头结合物，其包括一种或多种的肽连接物、结合部分、以及治疗或诊断剂，下文对每一种进行详细描述。
肽连接物
为了促进如本文中所定义的结合部分结合于HSA接头，可以将短(例如，长度为2-20个氨基酸)肽连接物(例如，共价(例如，肽键)、离子、或疏水结合、或经由高亲和力蛋白-蛋白结合相互作用(例如，生物素和抗生物素蛋白))结合于HSA接头的氨基或羧基末端。这些连接物提供了本文描述的任何结合部分可以与其连接的柔性链。肽连接物可以长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多氨基酸。在一个实施方式中，连接物是例如，甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、或缬氨酸残基的序列。虽然本文中未具体列举，但连接物可以仅是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、或缬氨酸残基，可以是这些残基的任何组合(长度达约20个氨基酸)。在一个优选的实施方式中，连接于HSA接头的氨基末端的连接物具有氨基酸序列AAS或AAQ以及连接于羧基末端的连接物具有氨基酸序列“AAAL”(SEQ ID NO：5)。连接物可以共价结合于HSA接头的氨基或羰基末端残基、结合于HSA接头中的氨基酸残基，或可以包括在一个或多个结合部分(如果存在的话)之间。
HSA接头制备
HSA接头，其具有或没有一种或多种肽连接物、以下描述的一种或多种结合部分、基于多肽的可检测标记、以及基于其它多肽的治疗剂，可以重组产生。例如，编码HSA接头(以及一种或多种可选元件)的核苷酸序列可以表达(例如，在质粒、病毒载体中，或转基因地)在细菌(例如，大肠杆菌)、昆虫、酵母、或哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)，或哺乳动物组织、器官、或生物中(例如，转基因啮齿动物、有蹄动物(例如，山羊)、或非人灵长类)。在宿主细胞、组织、或器官中表达HSA接头以后，利用标准蛋白质纯化方法(例如，FPLC或亲和层析)，本领域技术人员可以分离和纯化HSA接头。用于生产HSA接头连同两个结合部分的重组表达***示于图1中。
可替代地，具有或没有以上描述的一种或多种可选元件的HSA接头可以合成产生。例如，可以通过通常在肽合成领域建立的技术，如固相方式，来制备HSA接头或HSA接头结合物。固相合成涉及将氨基酸残基逐步加入连接于不溶性载体或基质(如聚苯乙烯)的生长的肽链。首先将肽的羧基末端残基锚定于商用载体，其中它的氨基基团受到N-保护剂的保护，如叔丁氧基羰基基团(tBoc)或芴基甲氧基羰基(FMOC)基团。用适宜的去保护剂如在tBOC或哌啶(用于FMOC)的情况下的TFA除去氨基保护基团，接着连同偶联剂如双环碳二亚胺(DCC)一起添加下一个氨基酸残基(以N保护形式)。在形成肽键以后，将试剂从载体洗去。在添加最后残基以后，用适宜的试剂，如三氟乙酸(TFA)或氟化氢(HF)，从载体上切割药剂。如果需要的话，具有或没有以上描述的一种或多种可选的元件的HSA接头可以制备成一个、两个、三个、或更多节段，然后可以将其连接起来以形成整个HSA接头构建体。
结合部分
HSA接头结合物可包括一种或多种结合部分，如抗体、抗体片段(如本文中所定义的，例如，单链Fv(scFv))或受体/配体(即，蛋白或糖蛋白配体或受体)，其便于HSA接头结合物选择性地和特异性结合于靶细胞、组织、或器官。可以将结合部分结合于HSA接头(例如，经由共价(例如，肽键)、离子、或疏水键，或经由高亲和力蛋白-蛋白结合相互作用(例如，生物素和抗生物素蛋白))。
可以将一种或多种结合部分结合于HSA接头。在一个实施方式中，可以将两种或更多种相同的结合部分(即，具有相同结构和结合亲和力的部分)结合于HSA接头，一种或多种(例如，串联)各自在氨基和羧基末端，从而HSA接头提供结合部分与它们的靶抗原的更强的亲和力。可替换地，可以将两种或更多种不同的结合部分(例如，抗体，如对于两种或更多种不同的靶分子具有结合亲和力的scFv，或对于相同靶分子上的两种或更多种不同的抗原表位具有结合亲和力的scFv)结合于HSA接头(例如，双特异性HSA接头结合物)，以便于HSA接头结合物结合于多个靶抗原或抗原表位。在另一个实施方式中，还可以将不同物种的结合部分结合于HSA接头，以赋予接头结合物，例如，两种或更多种不同的结合特异性或激动/拮抗生物性能。用于制备双特异性HSA接头结合物的结合部分对的有利组合披露于，例如，国际专利申请出版物WO2006/091209和WO 2005/117973，其以引用方式结合于本文。在其它实施方式中，可以将两种以上的结合部分(例如，相同或不同的结合部分)结合于HSA接头以形成HSA接头结合物。
本发明的特征在于一种HSA接头结合物，该HSA接头结合物具有至少第一和第二结合部分，每一部分可以结合于HSA接头的氨基或羧基末端，或结合于存在于任一末端或两个末端的肽连接物(如本文中所定义的)。图1示出典型的突变HSA接头，其中通过氨基末端肽连接物AAS和羧基末端肽连接物AAAL(SEQ IDNO：5)，两个结合部分(“臂1”和“臂2”)结合于突变HSA接头。还可以，例如，共价地或离子地，例如，利用生物素-抗生物素蛋白相互作用，将结合部分(例如，抗体或scFv)结合于其它位置(例如，HSA接头的内部氨基酸残基)。胺(例如，赖氨酸残基)和硫氢基(例如，半胱氨酸残基)氨基酸侧链的生物素化在本领域是已知的并且可以用来将结合部分连接于HSA接头。
可以包括在HSA接头结合物中的结合部分包括抗体、抗体片段、受体、以及配体。结合于HSA接头的结合部分可以是重组的(例如，人、鼠、嵌合、或人源化的)、合成的、或天然的。典型的结合部分包括，例如，完全抗体、域抗体、双抗体、三抗体、双特异性抗体、抗体片段、Fab片段、F(ab’)2分子、单链Fv(scFv)分子、双特异性单链Fv((scFv’)2)分子、串联scFv片段、抗体融合蛋白、激素、受体、配体、和适体，以及它们的生物学活性片段。
抗体
抗体包括IgG、IgA、IgM、IgD、以及IgE类型。如在本文中所使用的，它们的抗体或抗体片段包含一个或多个互补决定区(CDR)或结合肽，其结合于存在于靶细胞的外部或内部的靶蛋白、糖蛋白、或抗原表位。
本文描述的许多抗体、或它们的片段可以在可变区和恒定区进行非关键氨基酸取代、添加或缺失而没有丧失结合特异性或效应子功能、或结合亲和力的过度减小(例如，低于约10-7M)。通常，包含上述改变的抗体或抗体片段相对于它所源自的参比抗体或抗体片段具有明显的序列同一性。有时，和所源自的参比抗体或抗体片段相比，可以选择具有相同特异性和增加的亲和力的突变抗体或抗体片段。噬菌体展示技术提供了有力的技术来选择上述抗体。参见，例如，Dower et al.，WO 91/17271 McCafferty et al.，WO92/01047；以及Huse，WO 92/06204，其以引用方式结合于本文。
还可以将HSA接头结合于抗体的一个或多个片段，抗体的一个或多个片段保留特异性地结合于靶抗原的能力。抗体片段包括分离的重链可变区、轻链可变区、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、以及scFv。可以通过完整免疫球蛋白的酶促或化学分离来产生片段。例如，通过用胃蛋白酶在pH3.0-3.5下进行蛋白水解消化并利用标准方法如在Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Pubs.，N.Y(1988)中所描述的那些标准方法，F(ab′)2片段可以获自IgG分子。通过有限还原，Fab片段可以获自F(ab′)2片段，或通过在有还原剂存在的条件下用木瓜蛋白酶进行消化，Fab片段可以获自整个抗体。还可以通过重组DNA技术来产生片段。通过用限制性内切酶消化全长编码序列、或通过从头合成来产生编码所选片段的核酸的节段。经常以噬菌体外壳融合蛋白的形式来表达片段。这种表达方式有利于加强抗体的亲和力。
人源化抗体
人源化抗体可与HSA接头组合使用，其中一个或多个抗体CDR来自非人抗体序列，以及一个或多个，但优选所有的，CDR特异性地结合于抗原(例如，蛋白、糖蛋白、或其它适宜的抗原表位)。
人源化抗体包含基本上来自人抗体的恒定框架区(所谓的受体抗体)，以及，在一些情况下，大多数的可变区来自人抗体。一个或多个CDR(所有或其部分，以及围绕一个或多个CDR的离散的氨基酸)提供自非人抗体，如小鼠抗体。抗体的恒定区可以或可以不存在。
如果人可变域构架采用和CDR所源自的小鼠可变构架相同或类似的构象，则一个或多个小鼠CDR取代进入人可变域构架更可能导致它们保留正确的空间取向。这是通过从人抗体获得人可变域来实现的。其中人抗体的构架序列与CDR所源自的鼠可变构架域具有高度的序列和结构同一性。重链和轻链可变框架区可以来自相同或不同的人抗体序列。人抗体序列可以是自然发生的人抗体的序列、若干人抗体的共有序列，或可以是人种系可变域序列。参见，例如，Kettleborough et al.，Protein Engineering 4：773(1991)；Kolbinger et al.，Protein Engineering 6：971(1993)。
通过小鼠可变区的氨基酸序列和已知人抗体的序列的序列对比来鉴定适宜的人抗体序列。分开地对重链和轻链进行比较，但原理是类似的。
用于制备嵌合和人源化抗体以及抗体片段的方法描述于，例如，美国专利号4,816,567、5,530,101、5,622,701、5,800,815、5,874,540、5,914,110、http://patft.uspto.gov/netacgi/- hOhttp://patft.uspto.gov/netacgi/-h25,928,904、6,210,670、6,677,436、以及7,067,313，以及美国专利申请号2002/0031508、2004/0265311、以及2005/0226876。抗体或其片段的制备进一步描述在，例如，美国专利号6,331,415、6,818,216、以及7,067,313中。
受体和配体
在某些HSA接头结合物中，蛋白或糖蛋白受体或配体结合于HSA接头。结合有受体或配体的HSA接头可以用来，例如，特异性地靶向分泌蛋白、细胞(例如，癌细胞)、组织、或器官。另外，靶受体或配体的HSA接头-受体或-配体结合物的特异性结合可以关联在细胞内或细胞间信号通路中引起激动或拮抗生物活性。正如本文描述的其它结合部分一样，可以将受体和配体、或它们的片段连接于HSA接头的氨基和/或羧基末端、或连接于连接于HSA接头的肽连接物或连接于HSA接头中的氨基酸残基。
可以连接于HSA接头的典型的受体和配体包括但不限于***1受体(IGF1R)、IGF2R、***(IGF)、间充质上皮转化因子受体(c-met；还称作肝细胞生长因子受体(HGFR))、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、TNF-β、叶酸受体(FOLR)、叶酸转铁蛋白受体(TfR)、间皮素、Fc受体、c-kit受体、c-kit、α4整联蛋白、P-选择素、鞘氨醇-1-磷酸受体-1(S 1PR)、透明质酸受体、白细胞功能抗原-1(LFA-1)、CD4、CD 11、CD18、CD20、CD25、CD27、CD52、CD70、CD80、CD85、CD95(Fas受体)、CD106(血管细胞粘附分子1(VCAM1)、CD 166(活化白细胞粘附分子(ALCAM))、CD178(Fas配体)、CD253(TNF-相关凋亡诱导配体(TRAIL))、ICOS配体、CCR2、CXCR3、CCR5、CXCL12(基质细胞衍生因子1(SDF-1))、白细胞介素1(IL-1)、CTLA-4、受体α和β、MART-1、gp100、MAGE-1、ephrin(Eph)受体、黏膜地址素细胞黏附分子1(MAdCAM-1)、癌胚抗原(CEA)、LewisY、MUC-1、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、癌抗原125(CA125)、***特异性膜抗原(PSMA)、TAG-72抗原、以及它们的生物活性片段。
利用上文描述的任何方法，受体和配体可以被表达、分离、或连接于HSA接头。
诊断剂
可以将HSA接头、或与其结合的任何结合部分(例如，抗体、抗体片段、受体、或配体)连接于螯合剂或连接于可检测标记以形成诊断剂。还设想HSA接头结合物，其包括可检测标记(如本文中描述的)、以及本文描述的一种或多种治疗剂或结合部分。
可通过使HSA接头(或HSA接头结合物)的苏氨酸残基的游离氨基基团和螯合剂的适当的官能团，如羧基基团或激活酯反应来结合HSA接头(或HSA接头结合物)和螯合剂成分。例如，当用乙烯链上的羧基取代基官能化时，可以通过加入配位化学领域常见的螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)来实现这样的结合。这种类型的EDTA衍生物的合成报道于Arya et al.(Bioconjugate Chemistry2：323(1991))，其描述了用叔丁基基团阻断四个配位羧基基团的每一个，同时在乙烯链上的羧基取代基可以自由和药剂的肽部分的氨基基团反应。
HSA接头或HSA接头结合物可以结合金属螯合剂成分，金属螯合剂成分是肽，即与固相肽合成相容。在这种情况下，可以以和上述EDTA相同的方式结合螯合剂，或更方便地，可以合成螯合剂和HSA接头或HSA接头结合物：完全开始于HSA接头或HSA接头结合物的羧基末端残基，并结束于螯合剂的氨基末端残基。
HSA接头或HSA接头结合物可以进一步结合连接基团成分，其用来将HSA接头连接于螯合剂，同时并不有害地影响HSA接头的生物性能、HSA接头结合物的结合部分的靶向功能、或螯合剂的金属结合功能。适宜的连接基团包括用活性基团官能化的氨基酸链和烷基链，以便偶合于HSA接头或HSA接头结合物并偶合于螯合剂。当螯合剂是肽时，氨基酸链是优选的连接基团，以便可以完全通过固相技术来合成HSA接头或HSA接头结合物。通过反应HSA接头的肽部分的苏氨酸残基的氨基基团和在烷基链上的第一官能团，如羧基基团或激活酯，可以将烷基链-连接基团加入HSA接头或HSA接头结合物。随后，通过反应在烷基链上的第二官能团和螯合剂上的适当基团，将螯合剂连接于烷基链以完成HSA接头或HSA接头结合物的形成。在烷基链上的第二官能团选自这样的取代基，其对于螯合剂上的官能团具有反应性，但对于突变HSA接头的苏氨酸残基则没有反应性。例如，当螯合剂结合官能团如羧基基团或激活酯时，烷基链-连接基团的第二官能团可以是氨基基团。应当明了，HSA接头或HSA接头结合物的形成可能需要存在的官能团的保护和去保护，以避免形成不期望的产物。利用有机合成领域常见的保护基团、试剂、以及方法，来完成保护和去保护。尤其是，可以使用以上描述的用于固相肽合成的保护和去保护技术。
一种可替换的用于烷基链的化学连接基团是聚乙二醇(PEG)，其以和上述烷基链相同的方式被官能化，以加入HSA接头或HSA接头结合物。应当明了，可以可替换地将连接基团首先结合于螯合剂，然后结合于HSA接头或HSA接头结合物。
一方面，HSA接头或HSA接头结合物被结合于诊断上有用的能够形成复合物的金属。适宜的金属包括，例如，放射性核素，如以它们的不同形式存在的锝和铼(例如，99mTcO3+、99mTcO2 +、ReO3+、以及ReO2 +)。可以通过在配位化学领域中常见的各种方法将金属加入HSA接头或HSA接头结合物。当金属是锝-99m时，以下一般程序可以用来形成锝复合物。通过将HSA接头或HSA接头结合物溶解在含水醇如乙醇中最初形成HSA接头-螯合剂结合物溶液。然后对溶液进行脱气以除去氧，接着用适宜的试剂，例如，用氢氧化钠，除去硫羟保护基团，然后用有机酸，如乙酸(pH6.0-6.5)进行中和。在标记步骤中，将获自钼发生器的化学计算过量的高锝酸钠加入结合物的溶液，其中还原剂如氯化亚锡的量足以还原锝，并加热。通过层析法，例如，借助于C-18Sep Pak柱体，可以将标记HSA接头或HSA接头结合物分离自污染物99mTcO4 -和胶态99mTcO2。
在一个可替换方法中，可以通过跨螯合反应(transchelationreaction)来标记HSA接头。锝源是复合于不稳定配体的锝的溶液，以促进配体与所选螯合剂的交换。用于跨螯合的适宜配体包括酒石酸盐、柠檬酸盐、以及庚葡糖酸盐(heptagluconate)。在这种情况下，优选的还原剂是连二硫酸钠(sodium dithionite)。应当明了，可以利用以上描述的技术来标记HSA接头或HSA接头结合物，或可替换地，可以标记螯合剂本身，然后连接于HSA接头，以形成HSA接头-螯合剂结合物；一种称作“预标记配体”方法的过程。
用于标记HSA接头、或与其结合的任何药剂的另一种方式涉及通过在金属螯合作用下被切割的连接将HSA接头-螯合剂结合物免疫固定在固相载体上。当通过一个络合原子，螯合剂连接于载体的官能团时，就可以实现。优选地，将络合硫原子连接于载体，该载体用硫保护基团如马来酰亚胺加以官能化。
当标记有诊断上有用的金属时，通过在诊断成像领域建立的程序，包括HSA接头-螯合剂结合物的药剂可以用来检测这样的组织，其具有发展以下疾病的风险：癌症(例如，肺癌、乳腺癌、结肠癌、以及***癌)、年龄相关疾病(例如，心血管疾病、脑血管疾病、或阿尔茨海默病)、烟草相关疾病(例如，气肿、主动脉瘤、食管癌、或头部和颈部的鳞状细胞癌)。可以通过静脉内注射并用药用溶液，如等渗盐水，或通过本文描述的其它方法，将结合有用放射性核素金属，如锝-99m标记的HSA接头的药剂给予哺乳动物(例如，人)。适合于给予的标记药剂的量取决于所选HSA接头或HSA接头结合物的分布特性，这意味着：和结合有较慢清除的HSA接头或HSA接头结合物的药剂相比，结合有较快清除的HSA接头或HSA接头结合物的药剂可以以更高剂量给予。对于70kg个体，可接受的用于成像组织的单位剂量为约5-40mCi。在给予以后的适当时间，通常在30分钟和180分钟之间并且长达约5天(其取决于相对于在非靶组织处的清除率，在靶部位的积聚速率)，可以通过本文描述的标准技术来示踪结合有标记HSA接头或HSA接头结合物的药剂的体内分布和局部化。
还可以修饰或标记HSA接头、或与其结合的任何分子或部分，以方便诊断或治疗应用。可以将可检测标记如放射性标记、荧光标记、重金属标记、或其它分子标记结合于任何药剂。药剂的单、双、或多重标记可以是有利的。例如，借助于一个或多个残基的放射性碘化作用的双标记连同另外的例如，90Y经由螯合基团结合于含胺侧或活性基团，将便于组合标记。这可以有利于特定的诊断需要如鉴定广泛分布的小瘤细胞质量。
还可以修饰HSA接头、或与其结合的任何分子或部分，例如，通过卤化肽成分的酪氨酸残基。卤素包括氟、氯、溴、碘、以及砹。可以可检测地标记上述卤化剂，例如，如果卤素是放射性同位素，如，例如，18F、75Br、77Br、122I、123I、124I、125I、129I、131I、或211At。卤化剂包含卤素，该卤素共价结合于至少一个氨基酸，并且优选结合于在每个药剂分子中的D-Tyr残基。其它适宜的可检测修饰包括将其它化合物(例如，荧光色素如荧光素)结合于药剂的赖氨酸残基、或类似物，尤其是具有包括赖氨酸的接头的药剂或类似物。
用于放射性标记HSA接头、或与其结合的任何分子或部分的放射性同位素包括任何放射性同位素，其可以共价结合于药剂或其类似物的肽成分的残基。放射性同位素还可以选自发射β或γ辐射的放射性同位素，或可替换地，可以修饰任何药剂以包含螯合基团，该螯合基团，例如，可以共价结合于HSA接头或与其结合的任何肽剂的赖氨酸残基。然后可以修饰螯合基团以包含任何各种放射性同位素，如镓、铟、锝、镱、铼、或铊(例如，125I、67Ga、111In、99mTc、169Yb、186Re)。
可以通过附着放射性同位素来修饰HSA接头、或与其结合的任何分子或部分。优选的放射性同位素是那些放射性同位素，其放射性半衰期对应于、或长于所用HSA结合物的生物半衰期。更优选地，放射性同位素是卤素原子的放射性同位素(例如，氟、氯、溴、碘、以及砹的放射性同位素)，甚至更优选75Br、77Br、76Br、122I、123I、124I、125I、129I、131I、或211At。
可以将结合有HSA接头、或与其结合的任何分子或部分的药剂连接于放射性金属并用于射线照相成像或放射疗法。优选的放射性同位素还包括99mTc、51Cr、67Ga、68Ga、111In、168Yb、140La、90Y、88Y、153Sm、156Ho、165Dy、64Cu、97Ru、103Ru、186Re、188Re、203Pb、211Bi、212Bi、213Bi、以及214Bi。金属的选择取决于所期望的治疗或诊断用途。
可以将HSA接头、或与其结合的任何分子或部分连接于金属成分，以产生诊断或治疗剂。可检测标记可以是来自重元素的金属离子或稀土离子，如Gd3+、Fe3+、Mn3+、或Cr2+。结合有具有与其连接的顺磁或超顺磁金属的HSA接头的药剂可以在MRI成像应用中用作诊断剂。顺磁金属包括但不限于铬(III)、锰(II)、铁(II)、铁(III)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、镨(III)、钕(III)、钐(III)、钆(III)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)、以及镱(III)。
螯合基团可以用来将可检测标记或其它分子间接连接于HSA接头或与其结合的药剂。螯合基团可以连接药剂和放射性标记，如双官能稳定的螯合剂，或可以被连接于一个或多个末端或内部氨基酸活性基团。可以经由异硫氰酸盐β-Ala或适当的非α-氨基酸接头(其防止埃德孟降解)来连接HSA接头、或与其结合的任何分子或部分。本领域已知的螯合剂的实例包括，例如，亚氨基羧酸(ininocarboxylic acid)和聚氨基聚羧酸(polyaminopolycarboxylic)活性基团、亚氨基羧酸和聚氨基聚羧酸活性基团、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、以及1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)。
HSA接头，当重组表达时，可以连接于肽可检测标记或诊断剂。可以用作HSA接头的可检测标记的肽和蛋白包括但不限于荧光蛋白、生物发光蛋白、以及表位标签，下文详细讨论它们的每一种。还可以将一种或多种的这些可检测标记加入HSA接头结合物，其还包括治疗剂、细胞毒性剂、或细胞生长抑制剂。
荧光蛋白或荧光色素，如绿色荧光蛋白(GFP；SEQ ID NO：47)、增强的GFP(eGFP)、黄色荧光蛋白(SEQ ID NO：48；YFP)、青色荧光蛋白(SEQ ID NO：49；CFP)、以及红色荧光蛋白(SEQ ID NO：50；RFP或DsRed)可以用作连接于HSA接头的可检测标记。在用编码荧光蛋白的核苷酸序列的表达性载体转染或转导细胞以后，可以将荧光蛋白重组表达在细胞(例如，血细胞，如淋巴细胞)中。在荧光蛋白暴露于光的刺激频率以后，荧光蛋白将以低、中、或高强度发射光，其可以通过在显微镜下用眼或通过光学成像装置观测到。适合用作药剂的诊断序列的典型的荧光蛋白描述于，例如，美国专利号7,417,131和7,413,874，其各自以引用方式结合于本文。
生物发光蛋白还可以用作加入HSA接头的可检测标记。生物发光蛋白，如荧光素酶(例如，萤火虫(SEQ ID NO：51)、Renilla(SEQ ID NO：52)、以及Omphalotus荧光素酶)和水母素，作为与物质(例如，荧光素和coelenterazine)的化学反应的一部分发射光。在一个实施方式中，编码荧光素酶基因的载体提供了细胞(例如，血细胞，如淋巴细胞)的体内、体外、或在活体外检测，其中上述细胞已根据如本文中描述的那些标准方法加以转导或转染。适合用作诊断序列的典型的生物发光蛋白以及它们的使用方法描述于，例如，美国专利号5,292,658、5,670,356、6,171,809、以及7,183,092，其各自以引用方式结合于本文。
表位标签是短氨基酸序列，例如，长度为5-20个氨基酸残基，其可以作为可检测标记加入HSA接头结合物，以方便表达在细胞中、分泌自细胞、或结合于靶细胞以后的检测。可以通过与相对于表位标签具有特异性的抗体、抗体片段、或其它结合分子的相互作用来检测结合有表位标签作为诊断序列的药剂。可以通过克隆天然基因的适当部分或通过合成编码表位标签的多核苷酸来产生编码表位标签的核苷酸序列。结合表位标签的抗体、抗体片段、或其它结合分子可以直接结合可检测标记(例如，荧光色素、放射性标记、重金属、或酶如辣根过氧化物酶)或本身作为结合有上述标记的二抗、抗体片段、或其它结合分子的靶。可以用作诊断序列的典型的表位标签包括c-myc(SEQ ID NO：33)、血凝素(HA；SEQ IDNO：34)、以及组氨酸标签(His6；SEQ ID NO：35)。另外，荧光(例如，GFP)和生物发光蛋白也可以用作表位标签，因为商业上可获得抗体、抗体片段、以及其它结合分子来检测这些蛋白。
可以利用显微镜、流式细胞器、光度计、或其它现有技术的光学成像装置，如
Figure BDA0000075609680000511
Imaging System(Caliper LifeSciences，Hopkinton，MA)，在体内、体外、或在活体外检测、成像、或示踪HSA接头结合物，HSA接头结合物结合有诊断序列(例如，荧光蛋白、生物发光蛋白、或表位标签)或表达HSA接头结合物或与其结合的任何细胞。
连接于HSA接头的治疗剂或细胞毒性剂
可以将HSA接头、或与其结合的任何分子或部分连接于任何已知的细胞毒性或治疗部分以形成药剂(HSA接头结合物)，可以给予该药剂以治疗、抑制、减少、或改善疾病(例如，癌症、自身免疫病、或心血管疾病)或疾病的一种或多种症状。实例包括但不限于抗肿瘤剂如：阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；多柔比星；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美蒽醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；安曲霉素；天冬酰妥酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；盐酸比生群；甲磺酸双奈法德；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素c；卡普睾酮；喜树碱；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；考布他汀a-4(combretestatin a-4)；甲磺酸克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；daca(n-[2-(二甲基氨基)乙基]吖啶-4-咪唑羧酰胺)；放线霉素d；盐酸柔红霉素；道诺霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎呱宁；甲磺酸地扎呱宁；地吖醌；多西他赛；多拉司他汀(dolasatins)；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；椭圆玫瑰树碱；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀硫酸酯钠；依他硝唑；乙碘油i 131；依托泊苷；磷酸依托泊苷；氯苯乙嘧胺；盐酸法倔唑；法扎拉滨；芬维a胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；5-fdump；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；金au 198；高喜树碱；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；干扰素α-2a；干扰素α-2b；扰素α-nl；干扰素α-n3；干扰素β-ia；干扰素γ-ib；异丙铂；盐酸依立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；乙酸亮丙立德；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；洛莫司汀；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美坦生；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；美法仑；美诺立尔；巯嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星；丝裂红素；米托洁林；米托马星；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；麦考酚酸；诺考达唑；诺拉霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；奈莫司汀；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；泊非霉素；泼尼莫司汀；盐酸丙卡巴肼；嘌罗霉素；盐酸嘌罗霉素；吡唑呋林；根霉素；根霉素d；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠；司帕霉素；盐酸锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；链黑霉素；链佐星；氯化锶sr89；磺氯苯脲；他利霉素；紫杉烷；taxoid；替可加兰钠；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；thiamiprine；硫鸟嘌呤；塞替派；thymitaq；噻唑呋林；替拉扎明；拓优得；top53；盐酸托泊替康；枸橼酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；磷酸曲西立滨；三甲曲沙；葡糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；乌拉莫司汀；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；长春碱；硫酸长春碱；长春新碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸长春罗辛；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星；2-氯脱氧腺苷；2′脱氧间型霉素；9-氨基喜树碱；雷替曲塞；N-炔丙基-5，8-二脱氮杂叶酸(N-propargyl-5，8-dideazafolic acid)；2氯-2′-***-氟-2′-脱氧腺苷(2chloro-2’-arabino-fluoro-2’-deoxyadenosine)；2-氯-2′-脱氧腺苷；茴香霉素；曲古抑霉素A；hPRL-G129R；CEP-751；利诺胺；硫芥子气；氮芥；环磷酰胺；美法仑；苯丁酸氮芥；异环磷酰胺；白消安；N-甲基-N亚硝基脲(MNU)；N，N′-二(2-氯乙基)-N-亚硝基脲(BCNU)；N-(2-氯乙基)-N′环己基-N-亚硝基脲(CCNU)；N-(2-氯乙基)-N′-(反-4-甲基环己基-N-亚硝基脲(MeCCNU)；N-(2-氯乙基)-N′-(二乙基)乙膦酸酯-N-亚硝基脲(福莫司汀)；链佐星(streptozotocin)；diacarbazine(DTIC)；米托唑胺；替莫唑胺；塞替派；丝裂霉素C；AZQ；阿多来新；顺铂；卡铂；奥马铂；奥沙利铂；C1-973；DWA 2114R；JM216；JM335；二(铂)；拓优得；阿扎胞苷；阿糖胞苷；吉西他滨；6-巯基嘌呤；6-硫鸟嘌呤；次黄嘌呤；替尼泊苷9-氨基喜树碱；托泊替康；CPT-11；多柔比星；道诺霉素；表柔比星；darubicin；米托蒽醌；洛索蒽醌；放线霉素D；安吖啶；吡唑吖啶(pyrazoloacridine)；全反式视黄醇；14-羟基-逆-视黄醇；全反式视黄酸；N-(4-羟基苯基)视黄酰胺(N-(4-Hydroxyphenyl)retinamide)；13-顺式视黄酸；3-甲基TTNEB；9-顺式视黄酸；氟达拉滨(2-F-ara-AMP)；或2-氯脱氧腺苷(2-Cda)。
其它治疗性化合物包括但不限于20-pi-1，25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；adecypenol；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司灯；amidox；氨磷汀；5-氨基酮戊酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；antarelix；抗背侧化形态发生蛋白-1(anti-dorsalizing morphogenetic protein-1)；抗雄激素药，***癌；抗***药；抗瘤酮；反义寡核苷酸；氨基乙酸阿非迪霉素；细胞凋亡基因调节剂；细胞凋亡调节剂；无嘌呤酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；asulacrine；阿他美坦；阿莫司汀；axinastatin 1；axinastatin 2；axinastatin 3；阿扎司琼；阿扎毒素；azatyrosine；浆果赤霉素III衍生物；balanol；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟酚；苯甲酰星孢素；β内酰胺衍生物；β-alethine；betaclamycin B；白桦脂酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双吖丙啶基精胺；双奈法德；bistratene A；比折来新；breflate；博来霉素A2；博来霉素B2；溴匹立明；布度钛；buthioninesulfoximine；卡泊三醇；calphostin C；喜树碱衍生物(例如，10-羟基-喜树碱)；金丝雀痘IL-2；卡培他滨；咪唑羧酰胺-氨基-***；羧基酰氨基***；CaRest M3；CARN 700；源自软骨的抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；粟精胺；杀菌肽B；西曲瑞克；二氢卟酚；氯喹噁啉磺酰胺(chloroquinoxaline sulfonamide)；西卡前列素；顺式卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；collismycin A；collismycin B；考布他汀A4；考布他汀类似物；conagenin；crambescidin 816；克立那托；cryptophycin 8；cryptophycinA衍生物；curacin A；环戊蒽酮(cyclopentanthraquinones)；cycloplatam；cypemycin；cytarabine ocfosfate；溶细胞因子；细胞生长抑制素(cytostatin)；达昔单抗；地西他滨；dehydrodidemnin B；2′脱氧助间型霉素(DCF)；地洛瑞林；dexifosfamide；右雷佐生；右维拉帕米；地吖醌；didemnin B；didox；diethylnorspermine；二氢-5-氮杂胞苷；二氢taxol，9-；dioxamycin；二苯螺莫司汀；discodermolide；二十二烷醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈***酚；duocarmycin SA；依布硒啉；依考莫司汀；依地福新；依决可单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；epothilones(A，R＝H；B，R＝Me)；epithilones；依立雄胺；雌莫司汀类似物；***激动剂；***拮抗剂；依他硝唑；依托泊苷；依托泊苷4′-磷酸(凡毕复)；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；flavopiridol；氟卓斯汀；fluasterone；氟达拉滨；fluorodaunorunicin hydrochloride；福酚美克；福美坦；福司曲星钠；福莫司汀；钆texaphyrin；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；hepsulfam；神经生长因子；亚己基二乙酰胺；高三尖杉酯碱(HHT)；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；咪唑并吖啶酮；咪喹莫特；免疫刺激肽；***-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白细胞介素；碘苄胍；碘多柔比星；依波米醇，4-；伊立替康；伊罗普拉；伊索拉定；isobengazole；isohomohalicondrin B；伊他司琼；j asplakinolide；kahalalide F；lamellarin-N三醋酸；兰瑞肽；leinamycin；来格司亭；硫酸香菇多糖；leptolstatin；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙立德+***+***；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；线性多胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；lissoclinamide 7；洛铂；lombricine；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛索立宾；勒托替康；镥texaphyrin；lysofylline；裂解肽；美坦生；mannostatinA；马立马司他；马索罗酚；maspin；matrilysin抑制剂；间质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；rnerbarone；美替瑞林；蛋氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；ifepristone；米替福新；米立司亭；错配双链RNA；光辉霉素；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；mitotoxin成纤维细胞生长因子-saporin；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；单克隆抗体、人绒促性素；单磷酰脂质A+myobacterium细胞壁sk；莫哌达醇；抗多药基因抑制剂；基于多肿瘤抑制剂1的疗法；芥子抗癌剂；mycaperoxide B；分支杆菌细胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰基地那林；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林；那瑞替喷；纳洛酮+喷他佐辛；napavin；naphterpin；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性肽链风切酶；尼鲁米特；nisamycin；氧化氮调节剂；nitroxide抗氧化剂；nitrullyn；06-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；oracin；口服细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；oxaunomycin；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；palauamine；棕榈酰根霉素；帕米膦酸；人参三醇；帕诺米芬；parabactin；帕折普汀；培门冬酶；培得星；戊聚硫钠；喷司他丁；pentrozole；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏子醇；phenazinomycin；乙酸苯酯；磷酯酸酶抑制剂；溶血性链球菌药剂；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；placetin A；placetin B；纤溶酶原激活抑制剂；铂复合物；铂化合物；铂-三胺复合物；鬼白毒素；卟吩姆钠；泊非霉素；丙基二吖啶酮；***素J2；蛋白酶体抑制剂；基于A蛋白的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂，microalgal；蛋白酪氨酸磷酯酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；红紫素；吡唑吖啶；吡多醛化血红蛋白聚氧乙烯结合物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法呢酰基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；脱甲基的瑞替普汀；依替膦酸铼Re 186；根霉素；核酶；RII视黄酰胺；罗谷亚胺；rohitukine；罗莫肽；罗喹美克；rubiginoneB 1；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；SarCNU；sarcophytol A；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；源自衰老的抑制剂1；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐喃；索布佐生；硼卡钠；苯乙酸钠；solverol；生长调节素结合蛋白；索纳明；膦门冬酸；穗霉素D；螺莫司汀；splenopentin；spongistatin1；角鲨胺；干细胞抑制剂；干细胞***抑制剂；stipiamide；基质溶素抑制剂；sulfinosine；超活性血管活性肠肽拮抗剂；suradista；苏拉明；八氢吲嗪三醇；合成糖胺多糖；他莫司汀；他莫昔芬甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；替加氟；tellurapyrylium；端粒酶抑制剂；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷；四氯癸氧化物；tetrazomine；thaliblastine；沙利度胺；噻可拉林；血小板生成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新；胸腺素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；本紫红素乙酯锡；替拉扎明；二氯化二茂钛；托泊替康；topsentin；托瑞米芬；全能干细胞因子；翻译抑制剂；维甲酸；三乙酰尿苷；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；tyrphostins；UBC抑制剂；乌苯美司；源自尿殖窦的生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；变曲霉素B；载体***，红细胞基因疗法；维拉雷琐；veramine；verdins；维替泊芬；长春瑞滨；vinxaltine；vitaxin；伏氯唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C；以及净司他丁斯酯。
HSA接头结合物还可以包括位点特异性结合的分子和部分。位点特异性结合便于受控化学计量连接于细胞毒性剂、免疫调节剂、或细胞生长抑制剂的HSA接头中的特定残基，上述细胞毒性剂、免疫调节剂、或细胞生长抑制剂包括，例如，抗微管蛋白剂、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂、蒽环霉素、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化疗或辐射敏化剂、duocarmycins、依托泊苷、氟化嘧啶、离子载体、lexitropsins、亚硝基脲、必克雷、嘌呤抗代谢物、嘌罗霉素、类固醇、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂、以及长春花生物碱或本文描述的任何其它分子或部分。
用于将治疗剂结合于蛋白质、尤其结合于抗体的技术是众所周知的(例如，Arnon et al.，“Monoclonal Antibodies ForImmunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy，”in  MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy  (Reisfeld et al.，eds.，Alan R.Liss，Inc.，1985)；Hellstrom et al.，“Antibodies For Drug Delivery，”inControlled Drug Delivery(Robinson et al.，eds.，Marcel Dekker，Inc.，2nd ed.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents InCancer Therapy：A Review，”in Monoclonal Antibodies′84：B iologicalAnd Clinical Applications (Pinchera et al.，eds.，1985)；“Analysis，Results，and Future Prospective of the Therapeutic Use of RadiolabeledAntibody In Cancer Therapy，”in Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy (Baldwin et al.，eds.，Academic Press，1985)；Thorpe et al.，Immunol.Rev.62：119-58(1982)；以及Doronina etal.，“Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates forcancer therapy，”Nature Biotech.21：(7)778-784(2003))。还参见，例如，PCT出版物WO 89/12624。
还可以将HSA接头、或与其结合的任何分子或部分连接于裂解肽。上述裂解肽诱导细胞死亡并且包括但不限于链球菌溶血素O；stoichactis毒素；鹅膏肽素；葡萄球菌α毒素；海参素A；毛地黄皂苷；蜂毒肽；溶血卵磷酯；心脏毒素；以及cerebratulus A毒素(Kemet al.，J. Biol.Chem.253(16)：5752-5757，1978)。可将HSA接头、或与其结合的任何分子或部分(例如，抗体或抗体片段结合物)结合于合成肽来形成本发明的药剂，上述合成肽和任何自然发生的肽细胞溶素共有一定的序列同源性或化学特性；上述特性包括但不限于线性、正电荷、两亲性、以及在疏水环境中形成α-螺旋结构(Leuschner et al.，Biology of Reproduction 73：860-865，2005)。还可以将HSA接头、或与其结合的任何分子或部分连接于诱导补体介导的细胞溶胞的药剂如，例如，免疫球蛋白Fc亚单位。还可以将HSA接头、或与其结合的任何分子或部分连接于磷脂酶家族的任何成员(包括磷脂酶A、磷脂酶B、磷脂酶C、或磷脂酶D)或连接于它们的催化活性亚单位。
还可以将HSA接头、或与其结合的任何分子或部分连接于放射剂以形成可以用于检测或治疗用途的药剂。可以使用的放射剂包括但不限于碘纤维蛋白原125I；氟脱氧葡糖18F；氟多巴18F；胰岛素125I；胰岛素131I；碘苄胍123I；胆影钠131I；碘安替比林131I；碘胆甾醇131I；碘马尿酸钠123I；碘马尿酸钠125I；碘马尿酸钠131I；碘奥酮125I；碘奥酮131I；盐酸碘非他胺123I；碘美丁125I；碘美丁131I；碘拉他酸钠125I；碘拉他酸钠131I；酪氨酸131I；碘塞罗宁125I；碘塞罗宁131I；乙酸汞丙醇197Hg；乙酸汞丙醇203Hg；汞丙醇197Hg；硒蛋氨酸75Se；三硫化锑锝99mTc胶体；比西酸锝99mTc；地索苯宁锝99mTc；依替膦酸锝99mTc；依美沙肟锝99mTc；锝99mTc呋膦；葡庚糖酸锝99mTc；利多苯宁锝99mTc；甲溴苯宁锝99mTc；亚甲膦酸锝99mTc；锝99mTc亚甲膦酸二钠；锝99mTc巯替肽；奥昔膦酸锝99mTc；喷替酸锝99mTc；锝99mTc喷替酸钙钠；司他比锝99mTc；西硼肟锝99mTc；二巯丁二酸锝99mTc；锝99mTc硫胶体；替肟锝99mTc；替曲膦锝99mTc；锝99mTc Tiatide；甲状腺素125I；甲状腺素131I；碘托泊酮131I；三油酸甘油酯碘125I；或三油酸甘油酯碘131I。
另外，可以将放射性同位素位点特异性地连接于HSA接头或HSA接头结合物。可获得的活性基团可以用来结合位点特异性双官能螯合剂，用于标记放射性同位素，包括123I、124I、125I、121I、99mTc、111In、64Cu、67Cu、186Re、188Re、177Lu、90Y、77As、72As、86Y、89Zr、211At、212Bi、213Bi、或225Ac。
加入或连接于HSA接头或HSA接头结合物的治疗或细胞毒性剂可以进一步包括，例如，抗癌辅助强化剂，其包括但不限于：三环类抑郁药(例如，丙米嗪、地昔帕明、阿米替林、氯米帕明、曲米帕明、多塞平、去甲替林、普罗替林、阿莫沙平、以及马普替林)；非三环类抑郁药(例如，舍曲林、曲唑酮、以及西酞普兰)；Ca2+拮抗剂(例如，维拉帕米、硝苯地平、尼群地平、以及卡罗维林)；钙调素抑制剂(例如，普尼拉明、三氟培拉嗪、以及氯米帕明)；两性霉素B；曲帕拉醇类似物(例如，他莫昔芬)；抗心律失常药(例如，奎尼丁)；抗高血压药(例如，利舍平)；硫羟排空剂(Thioldepleters)(例如，buthionine和sulfoximine)；以及抗多药性还原剂如聚氧乙烯蓖麻油。
还可以将包括HSA接头、或与其结合的任何分子或部分的药剂连接于一种或多种细胞因子或连同一种或多种细胞因子(例如，粒细胞集落刺激因子、干扰素-α、以及肿瘤坏死因子-α)一起给予。还可以将HSA接头、或与其结合的任何分子或部分连接于抗代谢剂。抗代谢剂包括但不限于以下化合物以及它们的衍生物：硫唑嘌呤、克拉屈滨、阿糖胞苷、达卡巴嗪、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、gencitabine chlorhydrate、巯嘌呤、甲氨蝶呤、二溴甘露醇、米托坦、盐酸氯胍、乙胺嘧啶、雷替曲塞、葡糖醛酸三甲曲沙、尿烷、硫酸长春碱、硫酸长春新碱等。更优选地，可以将HSA接头或结合物连接于叶酸型抗代谢物，一类药剂，其包括，例如，甲氨蝶呤、盐酸氯胍、乙胺嘧啶、甲氧苄啶、或葡糖醛酸三甲曲沙、或这些化合物的衍生物。
还可以将HSA接头、或与其结合的任何分子或部分连接于瘤形成剂的蒽环霉素家族的成员，其包括但不限于盐酸阿柔比星、盐酸柔红霉素、盐酸多柔比星、盐酸表柔比星、盐酸伊达比星、吡柔比星、或盐酸佐柔比星；喜树碱、或它的衍生物或相关化合物，如10，11-亚甲二氧基喜树碱；或类美登碱(类美坦素)化合物家族的成员，其包括各种结构相关化合物，例如，安丝菌素P3、美坦生、2’-N-脱甲基美坦布亭、以及maytanbicyclinol。
HSA接头、或与其结合的任何分子或部分可以利用已知的化学方法直接连接于细胞毒性剂或治疗剂，或经由间接连接间接连接于细胞毒性剂或治疗剂。例如，可以将HSA接头连接于螯合基团，该螯合基团连接于细胞毒性剂或治疗剂。螯合基团包括但不限于亚氨基羧酸和聚氨基聚羧酸活性基团、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、以及1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)。关于一般方法，参见，例如，Liu et al.，Bioconjugate Chem.12(4)：653，2001；Cheng et al.，WO 89/12631；Kieffer et al.，WO 93/12112；Albert et al.，U.S.P.N.5,753,627；以及WO 91/01144(其各自以引用方式结合于本文)。
HSA接头结合物包括，例如，HSA接头、一个或多个结合部分(有或没有间隔肽连接物，如本文中所定义的)、以及治疗或细胞毒性剂，可以通过结合部分(例如，抗体、抗体片段、或受体/配体)特异性地靶向细胞或组织，从而便于选择地破坏结合部分所导向的靶细胞或组织。例如，当HSA接头结合物包括特异性地结合于器官中的癌细胞的结合部分时，HSA接头结合物可以用来靶向和破坏肺、胸、***、以及结肠的癌细胞，以预防、稳定、抑制源自上述器官的癌症的进展，或治疗癌症。此外，例如，通过靶向，在例如自身免疫病的情况下，自身反应T细胞(例如，通过结合于并激动在自身反应T细胞上存在的肿瘤坏死因子受体2(TNFR2))，HSA接头结合物可以用来靶向和破坏脉管***、脑、肝、肾、心脏、肺、***、结肠、鼻咽、口咽、喉、支气管、以及皮肤的细胞，以预防、稳定、抑制年龄相关、烟草相关、或自身免疫病或与这些器官有关的病症的进展，或对它们进行治疗。
HSA接头，当重组表达时，可以连接于细胞毒性多肽。细胞毒性多肽，当接触靶细胞(例如，癌细胞)时，对细胞施加细胞毒性或细胞抑制效应。例如，细胞毒性多肽，当连接于HSA接头，在结合靶细胞以后，可以在靶细胞中诱导，其导致细胞死亡(通过，例如，凋亡、坏死、或衰老)。可替换地，连接于HSA接头的细胞毒性多肽可以干扰或抑制正常的细胞生物活性，如***、代谢、以及生长，或异常的细胞生物活性，如转移。
例如，连接于半胱天冬酶3的HSA接头将结合靶细胞(例如，癌细胞)并被胞吞。在被靶细胞内化以后，HSA接头结合物的半胱天冬酶部分可以启动促凋亡半胱天冬酶级联反应，最终导致靶细胞的凋亡。
在一个优选的实施方式中，HSA接头结合物包括能够杀伤癌细胞的细胞毒性多肽。在另一个实施方式中，细胞毒性多肽抑制癌细胞的生长或转移。连接于HSA接头的细胞毒性多肽还可以用来杀伤或抑制对于癌生长有关的、必要的、或有利的细胞生长，如形成遍布实体瘤的血管的内皮细胞。
在一个实施方式中，HSA接头结合物可以包括两种或更多种细胞毒性多肽，以调节(例如，增加)对靶细胞(例如，癌细胞)的细胞毒性或细胞抑制作用的特异性、强度、或持续时间。
在另一个实施方式中，HSA接头连接于细胞毒性多肽的可激活形式(例如，生物无活性前药，在被酶或药物切割以后其能够被激活)。在这种实施方式中，细胞毒性多肽前药暴露(例如，体内)于能够剪切细胞毒性多肽的酶或药物会使细胞毒性多肽变成生物活性的(例如，细胞毒性或细胞抑止)。供HSA接头使用的可以转化成生物活性形式的生物无活性细胞毒性多肽的一个实例是前半胱天冬酶(例如，前半胱天冬酶8或3)。例如，在靶细胞(例如，癌细胞)的内化作用以后，可以通过TRAIL或FasL来切割HSA接头的前半胱天冬酶8域。在切割以后，生物活性的半胱天冬酶8可以促进靶细胞的凋亡。
在一个实施方式中，连接于HSA接头的细胞毒性多肽可以包括全长肽、多肽、或蛋白、或它们的生物活性片段(例如，“死亡域”)，已知其具有细胞毒性或细胞抑制性能。可以改变(例如，通过进行氨基酸取代、突变、截短、或添加)具有细胞毒性或细胞抑制性能的肽、多肽、或蛋白，以促进细胞毒性序列加入本文所述的药剂。所期望的改变包括，例如，变化成这样的氨基酸序列，其可以促进蛋白表达、延长寿命、细胞分泌、以及靶细胞毒性。
本发明还提供了编码细胞毒性多肽的核酸分子作为与HSA接头的融合蛋白，可选地包括结合部分和肽连接物。可以将核酸分子加入载体(例如，表达性载体)，以致，在用载体转染或转导的细胞中表达HSA接头以后，可以操作上连接(例如，融合、相邻连接、或限定在一起)细胞毒性多肽、HSA接头、以及结合部分(如果存在的话)。可以用作本发明的细胞毒性多肽的肽、多肽、以及蛋白的实例包括但不限于凋亡诱导蛋白如细胞色素c(SEQ IDNO：39)；半胱天冬酶(例如，半胱天冬酶3(SEQ ID NO：36)和半胱天冬酶8(SEQ ID NO：37))；前半胱天冬酶，颗粒酶(例如，颗粒酶A和B(SEQ ID NO：38))；肿瘤坏死因子(TNF)和TNF受体家族成员，包括TNF-α(TNF α；SEQ ID NO：40))、TNF-β、Fas(SEQ ID NO：41)以及Fas配体；Fas相关死亡域样IL-1β转化酶(FLICE)；TRAIL/APO2L(SEQ ID NO：45)和TWEAK/APO3L(参见，例如，美国专利申请公开号2005/0187177，以引用方式结合于本文)；Bcl-2家族的促凋亡成员，包括Bax(SEQ ID NO：46)、Bid、Bik、Bad(SEQ ID NO：42)、Bak、以及RICK(参见，例如，美国专利申请公开号2004/0224389，以引用方式结合于本文)；血管凋亡诱导蛋白1和2(VAP1和VAP2；Masuda et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.278：197-204(2000))；pierisin(SEQ ID NO：44；Watanabe et al.，Biochemistry 96：10608-10613(1999))；凋亡诱导蛋白(SEQ ID NO：43；AIP；Murawaka et al.，Nature 8：298-307(2001))；IL-1α前片多肽(参见，例如，美国专利6,191,269，以引用方式结合于本文)；凋亡蛋白和凋亡蛋白相关蛋白如AAP-1(参见，例如，欧洲专利申请公开号EP 1083224，以引用方式结合于本文)；抗血管形成因子如内皮生长抑素和血管生长抑素；以及其它凋亡诱导蛋白，包括在以下国际和美国专利申请出版物(各自以引用方式结合于本文)中描述的那些凋亡诱导蛋白：U.S.2003/0054994、U.S.2003/0086919、U.S.2007/0031423、WO 2004/078112、WO2007/012430、以及WO 2006/0125001(δ1和有缺口1的细胞内域)。
野生型HSA接头结合物
在形成结合、诊断、或治疗剂时，本发明还包括天然发生的野生型HSA接头，其氨基酸和核苷酸序列分别提供在SEQ ID NO：3和4中。在利用具有列在SEQ ID NO：3中的氨基酸序列的HSA接头的所有实施方式中，将一个或多个肽连接物(如上所述)共价连接于HSA接头的氨基和/或羧基末端，或共价连接于HSA接头序列中的氨基酸残基，以促进一个或多个结合部分的结合。
截短
本发明还提供了利用截短的野生型HSA多肽形成的HSA接头结合物，其可选地结合于一种或多种肽连接物或结合部分。可能将缺少全长野生型HSA氨基酸序列(即，SEQ ID NO：3)的1、2、3、4、5、10、15、20、50、100、200或更多氨基酸的野生型HSA多肽连接于本文描述的任何结合部分或诊断或治疗剂。截短可以发生在HSA接头的一端或两端，或可以包括内部残基的缺失。一个以上氨基酸残基的截短无需是线性的(即，连续的)。野生型HSA接头的实例包括那些野生型HSA接头，连同一种或多种的肽连接物或结合部分，其具有一种或多种的域I(SEQ ID NO：56；SEQ ID NO：3的残基1-197)、域II(SEQ ID NO：54；SEQ ID NO：3的残基189-385)、或域III(SEQ ID NO：57；SEQ ID NO：3的残基381-585)、或它们的组合，例如，域I和II、I和III、以及II和III。
通过测试包含截短的野生型HSA接头的结合物(如上所述)，可以优化结合物(例如，双特异性HSA-药物或包含放射性同位素的药剂)的血清清除率。
另外的HSA接头修饰
可通过在HSA接头中氨基酸残基的位点特异性化学修饰来修饰HSA接头，但不是必需的。HSA的正确折叠三级结构在蛋白的外面呈现某些氨基酸残基。化学活性氨基酸残基(例如，半胱氨酸)可以取代这些表面暴露残基以允许诊断或治疗剂的位点特异性结合。
可替代地或另外，可以通过从HSA接头序列添加或除去天冬酰胺、丝氨酸、或苏氨酸残基，以改变这些氨基酸残基的糖基化从而可选地修饰HSA接头。加入HSA接头的糖基化位点优选是表面暴露的(如本文所讨论的)。可以将引入HSA接头的糖基或其它碳水化合物部分直接结合于诊断、治疗、或细胞毒性剂。
半胱氨酸(硫羟)结合物
HSA接头的表面暴露的氨基酸残基可被半胱氨酸残基取代，以便于诊断、治疗、或细胞毒性剂的化学结合。暴露在HSA接头的表面上的半胱氨酸残基(当折叠成它的天然三级结构时)便于诊断、治疗、或细胞毒性剂特异性结合于硫羟活性基团如马来酰亚胺或卤代乙酰基。半胱氨酸残基的硫羟官能团与马来酰亚胺基团的亲核反应性高于蛋白中的任何其它氨基酸官能团(如赖氨酸残基的氨基基团或氨基末端氨基基团)约1000倍。在碘乙酰基和马来酰亚胺试剂中的硫羟特异性官能团可以和胺基团反应，但需要更高pH(＞9.0)和更长反应时间(Garman，1997，Non-Radioactive Labelling：APractical Approach，Academic Press，London)。可以利用标准埃尔曼测定来估计蛋白质中自由硫羟基的量。在一些情况下，需要用试剂如二硫苏糖醇(DTT)或硒醇来还原二硫键(Singh et al.，Anal.Biochem.304：147-156(2002))以产生反应性自由硫羟基。
可以通过分析HSA接头的表面可及性(例如，在以下实施例1中描述的适用于取代的丝氨酸和苏氨酸残基的鉴定)来鉴定用于半胱氨酸取代的位点。表面可及性可以表示为可以由溶剂分子例如水接触的表面积(例如，平方埃)。水占据的空间大约是半径为1.4埃的球体。用于计算蛋白质的每个氨基酸的表面可及性的软件是自由可获得的或是特许的。例如，晶体学程序的CCP4Suite，其中晶体学程序采用算法来计算具有已知的源自X射线晶体学的坐标的蛋白质的每个氨基酸的表面可及性(“The CCP4Suite：Programs forProtein Crystallography”Acta.Cryst.D50：760-763(1994)；www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html)。还可以利用下载自SwissInstitute of B ioinformatics的免费软件DeepView Swiss PDB Viewer来评估溶剂可及性。在表面暴露位点半胱氨酸的取代便于将反应性半胱氨酸结合于连接到诊断或治疗剂的硫羟活性基团。
糖基化
此外，可以通过在HSA接头中设计糖基化位点来改变血清清除率。在某些实施方式中，HSA接头被糖基化。多肽的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X表示除脯氨酸以外的任何氨基酸，是识别序列，用于将碳水化合物部分酶促附着于天冬酰胺侧链。因此，在多肽中这些三肽序列的任何一种的存在会产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化是指N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见丝氨酸或苏氨酸，虽然也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列来方便地完成HSA接头的糖基化位点的添加或缺失，以致产生一种或多种上述三肽序列(用于N-连接糖基化位点)。还可以通过对最初HSA接头(用于O-连接糖基化位点)的序列进行一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基的添加、缺失、或取代来进行上述改变。获得的在HSA上的碳水化合物结构还可以用于如上所述的细胞毒性、免疫调节剂或细胞生长抑制剂的位点特异性结合。
与其他治疗剂联合的HSA接头结合物
本文描述的HSA接头结合物可以与本文描述的一种或多种的治疗剂、细胞毒性剂、或细胞生长抑制剂联合给予。例如，可以给予乳腺癌患者包含ErbB2的HSA接头，并且可以联合，例如，多柔比星、环磷酰胺、以及紫杉醇一起共同给予ErbB3scFv(例如，B2B3-1)，一种用于治疗乳腺癌的常见化疗方案。对于这种应用而言的一种优选治疗剂是曲妥珠单抗。以下的实施例42-44中列出了关于这种组合的数据。本文中列出了可用于治疗癌症的另外的生物和化学剂，例如在附录2中。
-与放射疗法或手术联合的HSA接头结合物
HSA接头结合物可在放射疗法或手术以前、期间、或以后给予。例如，在癌性组织部位进行靶向放射疗法或手术介入(例如，局部病灶切除术或***切除术)的同时，患有增生性疾病(例如，乳腺癌)的患者可以单独接受HSA接头结合物或一起接受如本文描述的其它治疗剂、细胞毒性剂、或细胞毒性剂和HSA接头结合物。适合于联合HSA接头结合物一起使用的放射疗法包括近程疗法和靶向术中放射疗法(TARGIT)。
药物组合物
本文提供的药物组合物包含治疗或诊断有效量的HSA接头结合物，其包括一种或多种的结合部分(例如，抗体或抗体片段)、诊断剂(例如，放射性核素或螯合剂)、或治疗剂(例如，细胞毒性剂或免疫调节剂)。活性组分，HSA接头结合物(制备有一种或多种的结合部分、诊断剂、或治疗剂)可以配制用于各种药物递送***。一种或多种生理上可接受的赋形剂或载体还可以包括在组合物中以便进行适当配制。用于本发明的适宜剂型参见Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Philadelphia，PA，17th ed.(1985)。关于药物递送方法的简要综述，参见LangerScience 249：1527-1533(1990)。药物组合物用于胃肠道外给予、鼻内给予、局部给予、口服、或局部给予，如通过透皮方式，用于进行预防性和/或治疗性治疗。通常，胃肠道外(例如，通过静脉内、肌内、或皮下注射)、或通过口服法、或通过局部施加，来给予药物组合物。因此，用于胃肠道外给予的组合物可包括HSA接头，有或没有与其结合的一种或多种结合、诊断、和/或治疗剂，并溶解或悬浮在可接受的载体中，优选含水载体，例如，水、缓冲水、盐水、PBS等。组合物可以包含为接近生理条件所需要的药用辅助物质，如pH调节和缓冲剂、渗透性调节剂、润湿剂、去污剂等。本发明还提供了用于口服的组合物，该组合物可以包含惰性组分如用于配制片剂、胶囊剂等的粘合剂或填充剂。另外，本发明提供了用于局部给予的组合物，该组合物可以包含惰性组分如用于配制乳膏剂、软膏剂等的溶剂或乳化剂。
可以通过常规灭菌技术对这些组合物进行灭菌，或可以对这些组合物进行滤过除菌。获得的水溶液可以原样被包装以供使用，或被冷冻干燥，在给予以前，冷冻干燥药剂合并于无菌含水载体。药剂的pH通常为3至11，更优选5至9或6至8，以及最优选7至8，如7至7.5。可以将获得的固体形式的组合物包装在多个单剂量单位中，每个包含在例如片剂或胶囊剂的密封包装中的固定量的HSA接头结合物(制备有一种或多种的结合剂、诊断剂、和/或治疗剂)。还可以将固体形式的组合物包装在具有可变量的容器中，如包装在设计用于可局部施加乳膏剂或软膏剂的可挤压管中。可以将包含有效量的HSA接头结合物(制备有一种或多种的结合、诊断、和/或治疗剂)的组合物给予哺乳动物(例如，人)，用于预防性和/或治疗性治疗。预防性应用中，将包含HSA接头结合物(制备有一种或多种的结合、诊断、和/或治疗剂)的组合物给予易患或具有发展疾病或病症(例如，癌症、自身免疫病、或心血管疾病)的患者。上述量被定义为“预防有效剂量”。在这种应用中，精确量再次取决于患者的健康状况，但通常为每次给药约0.5mg至约400mg的HSA接头结合物(制备有一种或多种的结合、诊断、和/或治疗剂)(例如，10mg、50mg、100mg、200mg、300mg、或400mg或更多/剂量)以及每次给药约0.1μg至约300mg的一种或多种免疫调节剂(例如，10μg、30μg、50μg、0.1mg、10mg、50mg、100mg、或200mg/剂量)。可以每小时、天、周、月、或年一次或多次(例如，2、4、5、6、7、8、9、10、11、或12次/小时、天、周、月、或年)预防性地给予患者HSA接头结合物(制备有一种或多种的结合、诊断、和/或治疗剂)的剂量。更通常地，每周给予单剂量的HSA接头结合物(制备有一种或多种的结合、诊断、和/或治疗剂)。
在治疗用途中，将一定剂量的HSA接头结合物(制备有一种或多种的结合、诊断、和/或治疗剂)给予已经患有疾病或病症(例如，癌症、自身免疫病、或心血管疾病)的哺乳动物(例如，人)，其中给予量足以治愈或至少部分阻止或缓和疾病或病症的一种或多种症状以及其合并症。适合于实现上述目的的量被定义为“治疗有效剂量”。有效用于上述用途的量可以取决于疾病或病症的严重性和患者的一般状况，但通常为每次给药约0.5mg至约400mg的HSA接头结合物(制备有一种或多种的结合、诊断、和/或治疗剂)(例如，10mg、50mg、100mg、200mg、300mg、或400mg或更多/剂量)。可以将一定剂量的HSA接头结合物(制备有一种或多种的结合、诊断、和/或治疗剂)治疗性地每小时、天、周、月、或年给予患者一次或多次(例如，2、4、5、6、7、8、9、10、11、或12次/小时、天、周、月、或年)。更通常地，每周给予单剂量的HSA接头结合物(制备有一种或多种的结合、诊断、和/或治疗剂)。
在若干实施方式中，患者可以接受约0.5至约400mg/剂量的HSA接头结合物(制备有一种或多种的结合、诊断、和/或治疗剂)每周一次或多次(例如，2、3、4、5、6、或7或更多次/周)，优选每周一次或多次，每次给药约5mg至约300mg，以及甚至更优选每周一次或多次，每次给药约5mg至约200mg。患者还可以接受每两周剂量的HSA接头结合物(制备有一种或多种的结合、诊断、和/或治疗剂)(约50mg至约800mg)或每月剂量的HSA接头、或与其结合的任何结合、诊断、或和/或治疗剂(约50mg至约1,200mg)。
在其它实施方式中，可以将在典型剂量范围中的HSA接头结合物(制备有一种或多种的结合、诊断、和/或治疗剂)给予患者：约0.5mg/周至约2000mg/周、约1.0mg/周至约1000mg/周、约5mg/周至约500mg/周、约10mg/周至约100mg/周、约20mg/周至约80mg/周、约100mg/周至约300mg/周、或约100mg/周至约200mg/周。另一方面，向70kg的患者给予的本文所述的HSA接头结合物的剂量范围可以为，例如，约1μg至约5000mg、约2μg至约4500mg、约3μg至约4000mg、约4μg至约3,500mg、约5μg至约3000mg、约6μg至约2500mg、约7μg至约2000mg、约μg至约1900mg、约9μg至约1,800mg、约10μg至约1,700mg、约15μg至约1,600mg、约20μg至约1,575mg、约30μg至约1,550mg、约40μg至约1,500mg、约50μg至约1,475mg、约100μg至约1,450mg、约200μg至约1,425mg、约300μg至约1,000mg、约400μg至约975mg、约500μg至约650mg、约0.5mg至约625mg、约1mg至约600mg、约1.25mg至约575mg、约1.5mg至约550mg、约2.0mg至约525mg、约2.5mg至约500mg、约3.0mg至约475mg、约3.5mg至约450mg、约4.0mg至约425mg、约4.5mg至约400mg、约5mg至约375mg、约10mg至约350mg、约20mg至约325mg、约30mg至约300mg、约40mg至约275mg、约50mg至约250mg、约100mg至约225mg、约90mg至约200mg、约80mg至约175mg、约70mg至约150mg、或约60mg至约125mg。可调节剂量方案以提供最佳的治疗反应。另一方面，可以给予HSA接头结合物(制备有一种或多种的结合、诊断、和/或治疗剂)每隔一天约0.5mg至每隔一天约500mg，优选每隔一天约5mg至每隔一天约75mg，更优选每隔一天约10mg至每隔一天约50mg，以及甚至更优选每隔一天20mg至每隔一天约40mg。还可以给予HSA接头结合物(制备有一种或多种的结合、诊断、和/或治疗剂)约0.5mg每周三次至约100mg每周三次，优选约5mg每周三次至约75mg每周三次，更优选约10mg每周三次至约50mg每周三次，以及甚至更优选约20mg每周三次至约40mg每周三次。
在本发明的方法的非限制性实施方式中，可以将HSA接头结合物(制备有一种或多种的结合、诊断、和/或治疗剂)给予哺乳动物(例如，人)连续1、2、3、或4小时；一天1、2、3、或4次；每隔一天或每个第三、第四、第五、或第六天；一周1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10次；每两周；一月1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30次；每两个月；每六个月1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10次；一年1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20次；或每两年。在治疗方案期间，可以以不同频率给予HSA接头结合物(制备有一种或多种的结合、诊断、和/或治疗剂)。在另外的实施方式中，可以以相同频率或以不同频率将HSA接头结合物(制备有一种或多种的结合、诊断、和/或治疗剂)给予患者。
为达到所期望的治疗效应所需要的一种或多种诊断或治疗剂以及HSA接头、或与其结合的任何药剂的量取决于若干因素，如所选择的特定诊断或治疗剂、给予方式、以及受者的临床条件。技术人员将能够确定适当剂量的一种或多种诊断或治疗剂和HSA接头、或与其结合的任何药剂，以达到所期望的结果。
可以单次或多次给予包含有效量的HSA接头结合物(制备有一种或多种的结合、诊断、和/或治疗剂)的组合物，其中剂量水平和模式由治疗医师选择。基于在哺乳动物(例如，人)中疾病或病症的严重性，可以确定和调节剂量和给药时间表，在治疗的整个过程中按照通常实施的方法，临床医师或本文描述的那些人可以监测上述严重性。
可以直接或连同本领域已知的任何药用载体或盐，将HSA接头结合物(制备有一种或多种的结合、诊断、和/或治疗剂)给予哺乳动物主体，如人。药用盐可以包括通常用于制药业的非毒性酸加成盐或金属复合物。酸加成盐的实例包括有机酸如乙酸、乳酸、双羟萘酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、丁二酸、苯甲酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸、或三氟乙酸等；高分子酸如鞣酸、羧甲基纤维素等；以及无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等。金属复合物包括锌、铁等。一种典型的药用载体是生理盐水。其它生理上可接受的载体以及它们的剂型是本领域技术人员已知的并且例如描述在Remington’s Pharmaceutical Sciences，(18th edition)，ed.A.Gennaro，1990，Mack PublishingCompany，Easton，PA中。
诊断和治疗应用
HSA接头结合物可以用于人的诊断和治疗应用，包括，例如，诊断或治疗增生性疾病(例如，癌症，如黑色素瘤、透明细胞肉瘤、以及肾癌)和自身免疫病(例如，多发性硬化、类风湿性关节炎、以及葡萄膜炎)。以下人增生性和自身免疫病的讨论是用来向技术人员提供HSA接头结合物如何可以应用于诊断和治疗应用的一般理解，而不是用来限制本发明的范围。
增生性疾病(癌症)
HSA接头结合物可以用来诊断、治疗、预防、或消除增生性疾病如但不限于乳腺癌、黑色素瘤、透明细胞肉瘤、肾癌(例如，肾细胞癌)、***癌、肺癌、胃癌、以及卵巢癌。待连接于HSA接头并用于诊断或治疗怀疑患有或患有增生性疾病的患者的结合部分的选择可以基于它们特异性地结合、激动、激活、拮抗、或抑制与增生性疾病有关的靶分子(例如，细胞表面受体如酪氨酸激酶受体)的能力。可以将结合部分连接于HSA接头以诊断或治疗增生性疾病，其中上述结合部分靶向，例如，***受体(IGFR，例如，IGF 1R和IGF2R)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、表皮生长因子受体(EGFR，例如，ErbB2(HER2/neu))、Fc受体、c-kit受体、或间充质上皮转化因子受体(c-met；还称作肝细胞生长因子受体(HGFR))。HSA接头结合物与癌细胞的特异性结合可以便于检测(例如，连接于可检测标记的HSA接头，如本文中所定义的)或破坏(例如，连接于细胞毒性剂的HSA接头)所结合的癌细胞。下文描述HSA接头结合物在治疗胸和肾癌方面的具体应用。
乳腺癌
乳腺癌的通常形式包括侵袭性导管癌、在胸导管中的恶性癌症、以及浸润性小叶癌、在胸小叶中的恶性癌症。已知一些类型的乳腺癌细胞会表达高水平的表皮生长因子受体，尤其是ErbB2(即，HER2/neu)。EGFR的异常信号或未调节的激活已与许多癌症(包括乳腺癌)的发展和进展有关。可以在各种上皮起源的实体瘤中发现经由功能异常的EGFR途径介导的不受控制的细胞增殖，并且数据表明肿瘤EGFR表达、过度表达、以及调节异常与进展的疾病、转移性表型、对化疗的抗性、以及总的不良预后有关。
连接于对于EGFR具有特异性的一种或多种结合部分(例如，抗ErbB2；曲妥珠单抗)的HSA接头可以连同诊断剂(例如，可检测标记)或细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、或治疗剂(如本文描述的)一起使用，以诊断或治疗乳腺癌。可替换地，包含对于ErbB2和ErbB3具有特异性的结合部分的双特异性HSA接头结合物，如“B2B3-1”(下文进一步描述)，可以用来诊断或治疗癌症，例如，胸、肾、卵巢、以及肺癌。
如上所述，可以在放射疗法或手术介入以前(例如，新辅助化疗)、同时、或以后(例如，辅助性化疗)给予用来治疗乳腺癌的HSA接头结合物。还可以连同可用于治疗乳腺癌的其它化合物(例如，抗肿瘤剂，如生物或化学治疗剂)一起联合给予HSA接头结合物。例如，列在表1中的抗肿瘤剂，其包括有丝***抑制剂(例如，紫杉烷)、拓扑异构酶抑制剂、烷化剂(包括，例如，基于铂的药剂)、选择性***调节剂(SERM)、芳香酶抑制剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素(例如，蒽环霉素抗生素)、抗VEGF剂、抗ErbB2(HER2/neu)剂、以及抗ErbB3剂，已知特别有利于乳腺癌的治疗。临床医师可以联合任何化合物一起给予HSA接头结合物，其中上述化合物包括列在附录2中的化合物，列在附录2中的化合物已知或认为其有益于乳腺癌的治疗。
表1：连同HSA接头结合物一起用于治疗乳腺癌的典型的抗肿瘤剂。
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肾癌
肾癌，如肾细胞癌，对于传统的放射和化学疗法，特别具有抗性。因此，连同HSA接头一起使用生物治疗剂，对于患有这些癌症的患者，是一种很好的选择。例如，连接于结合部分(其激动I型干扰素或白细胞介素2受体)的HSA接头可以用来治疗肾癌。作为实体瘤，靶向和抑制肿瘤血管化的结合部分(例如，抗血管内皮生长因子(VEGF)抗体如贝伐单抗)也可以用于治疗效应。
自身免疫病
HSA接头结合物可以用来诊断、治疗、预防、或稳定例如病人的自身免疫病和病症，如，例如，多发性硬化(MS)、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、类风湿性关节炎(RA)、葡萄膜炎、舍格伦综合征、格雷夫斯病、银屑病、以及重症肌无力。自身免疫病和病症是由免疫***的自反应性成分(例如，T细胞、B细胞、以及自反应性抗体)引起。因此，抑制、阻断、拮抗、或排除自反应性免疫细胞和抗体的结合部分(例如，抗淋巴细胞或抗胸腺细胞球蛋白；巴利昔单抗、达珠单抗、或莫罗单抗-CD3单克隆抗体)可以连接于HSA接头，用于治疗用途。作为炎性信号抑制剂(ISI)(如本文中所定义的)的结合部分可以连接于HSA接头，用于治疗自身免疫。此外，抑制或拮抗整联蛋白功能的结合部分(例如，整联蛋白拮抗剂，如本文中所定义的)可以改善或停止疾病进展。
在其它实施方式中，结合部分是可溶性TNF受体，如依那西普或来那西普；导向促炎细胞因子或促炎细胞表面信号分子的抗体，如阿达木单抗、赛妥珠单抗、英夫利昔单抗、戈利木单抗、以及rituxan；显性失活促炎细胞因子变体，如XENP345、XPROTM1595、阿那白滞素、以及在美国专利申请公开号20030166559和20050265962中所披露的变体；促炎细胞因子或促炎细胞表面信号分子下游的信号通路的抑制剂，如DE 096、5-氨基-2-羰基噻吩衍生物(如在WO2004089929中所描述的)、ARRY-797、BIRB 796BS、(1-5-叔丁基-2-对甲苯基-2H-吡唑-3-基)-3-[4-2(吗啉4-基-乙氧基)-萘-1-基]-脲、CHR-3620、CNI-1493、FR-167653(Fujisawa Pharmaceutical，Osaka，日本)、ISIS 101757(IsisPharmaceuticals)、ML3404、NPC31145、PD169316、PHZ1112、RJW67657、4-(4-(4-氟苯基)-1-(3-苯基丙基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑-2-基)-3-丁炔-1-醇、SCIO-469、SB202190、SB203580、(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚硫酰基苯基)-5-(4-吡啶基)1H-咪唑)、SB239063、反-1-(4-羟基环己基)-4-(4-氟苯基-甲氧基嘧啶-4-基)咪唑、SB242235、SD-282、SKF-86002、TAK 715、VX702、以及VX745；或TNF-α转化酶(TACE)的抑制剂，如BB-1101、BB-3103、BMS-561392、丁炔基羟苯基β-砜哌啶hydroxomates、CH4474、DPC333、DPH-067517、GM6001、GW3333、Ro 32-7315、TAPI-1、TAPI-2、以及TMI 005)；或抗独特型剂，如单克隆抗体、LJP 394(阿贝莫司，
Figure BDA0000075609680000771
La Jolla Pharmaceuticals)。
在其它实施方式中，结合部分是干扰素(如本文描述的)。可以连接于HSA接头的结合部分包括，例如，干扰素-β(
Figure BDA0000075609680000772
(IFN-β-1a)、
Figure BDA0000075609680000773
(IFN-β-1a)、以及
Figure BDA0000075609680000774
(IFN-β-1b))、干扰素-t(TAUFERONTM)、干扰素-α(例如，ROFERON-
Figure BDA0000075609680000775
(IFN-α-2a)、INTRON-
Figure BDA0000075609680000776
(IFN-α-2b)、(IFN-α-2b)、
Figure BDA0000075609680000778
(IFN-α-n3)、
Figure BDA0000075609680000779
(IFN-α-2b，共价结合于单甲氧基聚乙二醇)、
Figure BDA00000756096800007710
(非自然发生的1型干扰素，相对于IFN-α-2b具有88％的同源性)、或
Figure BDA00000756096800007711
(聚乙二醇化IFN-α-1a))、以及
Figure BDA00000756096800007712
(IFN-g-1b)。
本发明进一步提供了具有结合部分的HSA接头结合物，其中上述结合部分拮抗这些促炎分子或它们的特异性受体以治疗自身免疫。以下描述HSA接头结合物在诊断和治疗MS和RA方面的具体应用。
多发性硬化
多发性硬化(MS)是一种神经性疾病，其特征在于中枢神经***(CNS)的神经的不可逆变性。虽然基础原因不清楚，但MS中的神经变性是脱髓鞘、或髓磷脂剥落的直接结果，上述髓磷脂是一种蛋白质，其通常位于外层并使神经绝缘。在MS的发展中T细胞具有关键作用。发炎的MS病变，不是正常的蛋白质，可以具有浸润性CD4+T细胞，其响应由MHC类II-连接分子如人HLA-DR2呈递的自体抗原。浸润性CD4T细胞(TH1细胞)产生促炎细胞因子IL-2、IFN-γ、以及TNF-α，其激活抗原呈递细胞(APC)如巨噬细胞以产生另外的促炎细胞因子(例如，IL-1β、IL-6、IL-8、以及IL-12)。IL-12会进一步诱导IFN-γ合成。结果是神经元髓鞘的逐渐脱髓鞘，从而导致人疾病。
HSA接头结合物可以用来帮助诊断MS。包括结合部分的诊断HSA接头结合物会特异性地靶向一种或多种(例如，双特异性HSA接头结合物)免疫细胞激活标记(例如，CD69、CD28、HLA-DR、以及CD45)。可以通过使用连接于诊断剂(例如，放射性同位素或荧光色素)的HSA接头结合物来测量一种或多种这些促炎或免疫细胞激活介质相对于其它因子或细胞的失衡。
HSA接头结合物可以用来治疗具有发展成MS的风险或患有MS的人，或用来预防、改善、或治愈上述疾病的症状。例如，结合部分，其特异性地靶向和拮抗α4整联蛋白(例如，那他珠单抗)、CD52(例如，阿仑单抗)、CD80、P-选择素、鞘氨醇-1-磷酸受体-1(S1PR1)、透明质酸受体、白细胞功能抗原-1(LFA-1)、CD11(例如，依法利珠单抗)、CD18、CD20(例如，利妥昔单抗)、CD85、ICOS配体、CCR2、CXCR3、或CCR5，当连接于HSA接头时可以用于治疗MS患者。类似地，中和I型干扰素(例如，干扰素-α和-β)或拮抗I型干扰素受体(例如，IFNαR1)的结合部分也可以连接于HSA接头，用于治疗用途。
类风湿性关节炎
类风湿性关节炎(RA)是一种慢性炎性自身免疫病，其引起免疫***攻击关节。它是一种致残疾和疼痛的炎性病症，由于疼痛和关节破坏，其可以导致移动性的基本丧失。RA是一种***性疾病，经常影响整个身体的关节外组织，包括皮肤、血管、心脏、肺、以及肌肉。
RA患者经常具有HLA-DR4/DR1簇的增加的细胞表达。对于这些细胞表面分子的一种或两种具有特异性的HSA接头结合物可用于RA的诊断。
HSA接头结合物可以用来治疗具有发展成RA的风险或患有RA的人，以预防、改善、或治愈上述疾病的症状。例如，结合部分(如本文中所定义的)，其特异性地靶向和拮抗TNF-α(例如，依那西普、英夫利昔单抗、以及阿达木单抗)、IL-1(例如，阿那白滞素)、或CTLA-4(例如，阿巴他塞)。还可以将特异性地靶向和排除B细胞的结合部分(例如，抗CD20抗体，如利妥昔单抗)连接于本文中描述的HSA接头以治疗或预防RA。
葡萄膜炎
葡萄膜炎特指眼中层的炎症，但可以指涉及眼内部的任何炎性过程。葡萄膜炎在起源上可以是自身免疫的或特发的。
HSA接头结合物可以用来治疗具有发展成自身免疫性葡萄膜炎的风险或患有自身免疫性葡萄膜炎的人，以预防、改善、或治愈上述疾病的症状。例如，可以将α-甲胎蛋白(例如，人AFP；NCBIAccession No.NM 001134)、或其生物活性片段连接于HSA接头，以减轻或消除与自身免疫性或特发性葡萄膜炎有关的炎症。
试剂盒
本发明还提供了试剂盒，该试剂盒包括药物组合物，其包含HSA接头、以及一种或多种结合部分(例如，抗体或抗体片段)，诊断剂(例如，放射性核素或螯合剂)，以及治疗剂(例如，细胞毒性剂或免疫调节剂)，以及可以用来将它们结合于HSA接头的试剂，必要时，包括药用载体，并具有治疗疾病或病症的治疗有效量(例如，癌症、自身免疫病、或心血管疾病)。试剂盒包括用法说明以便于使用者(例如，医生、护士、或患者)给予其中包含的组合物。
优选地，试剂盒包括多个包装的单剂量药物组合物，其包含有效量的HSA接头、或其任何结合(例如，抗体或抗体片段(例如，scFv))、诊断(例如，放射性核素或螯合剂)、和/或治疗(例如，细胞毒性剂或免疫调节剂)结合物。可选地，为给予药物组合物所必要的仪器或装置可以包括在试剂盒中。例如，试剂盒可以提供一个或多个预充满注射器，该注射器包含有效量的HSA接头、或与其结合的任何结合、诊断、和/或治疗剂。另外，试剂盒还可以包括附加组成部份如用法说明或给药时间表，以便疾病或病症(例如，癌症、自身免疫病、或心血管疾病)患者使用药物组合物，该组合物包含HSA接头、或与其结合的任何结合、诊断、和/或治疗剂。
对于本领域技术人员来说，显而易见的是，可以对本发明的组合物、方法、以及试剂盒进行各种改进和变化，而不偏离本发明的精神或范围。因此，本发明涵盖本发明的改进和变化，只要它们在所附权利要求以及它们的等同范围内。
实施例
以下实施例是说明性的而不是限制性的。本领域技术人员将容易地理解，可以变化或改进各种非关键参数以产生基本上相同或类似的结果。
实施例1：用来鉴定在HSA接头中用于位点特异性结合细胞毒性或细胞抑制药物的残基的方法。
为了鉴定药物特异性结合于HSA的位点，研究了晶体结构并鉴定了表面暴露的丝氨酸和苏氨酸残基。然后可以将这些特定的表面暴露氨基酸突变成半胱氨酸，以便于药物结合于取代的半胱氨酸，其中使用硫羟特异性结合剂如马来酰亚胺。在药物结合以前可能需要轻度还原。所结合的药物的数目是由引入HSA中的表面暴露半胱氨酸残基的数目来控制。丝氨酸和苏氨酸被选为用于突变的最适宜的残基，因为它们和半胱氨酸共有最大的结构同一性，然而，还可以将其它表面暴露残基突变成半胱氨酸并成功地结合于细胞抑制或细胞毒性药物。
HSA的晶体结构存储于RSCB Protein Data Bank(1bm0-Sugioet al.，“Crystal structure of human serum albumin at 2.5A resolution，”Protein Eng.12：439-446(1999))。利用下载自Swiss Institute ofBioinformatics的DeepView Swiss PDB Viewer分析了上述结构。具有50％、40％、以及30％表面暴露的丝氨酸和苏氨酸残基被鉴定为最适合突变成半胱氨酸(表2)。可以利用标准分子生物学程序来引入突变。可以利用标准蛋白化学技术来测试硫羟反应性药物或螯合剂与引入的半胱氨酸的结合。
表2
  表面暴露％   残基
  50   T496
  40   S58
  30   T76、T79、T83、T125、T236、S270、S273
  S304、S435、T478、T506、T508
实施例2：用来鉴定在HSA接头中用于引入天冬酰胺-连接糖基化位点的残基的方法。
为了鉴定在HSA中用于引入天冬酰胺-连接糖基化位点的区，研究了晶体结构以鉴定可以适用于突变的表面暴露(＞30％)天冬酰胺、丝氨酸以及苏氨酸残基。当存在共有序列天冬酰胺-x-丝氨酸/苏氨酸时，其中x不能是脯氨酸，在天冬酰胺残基上发生糖基化。表2列出在HSA中用于引入天冬酰胺-连接糖基化的可能的突变位点。
表3
  残基   提议的突变
  Gln32   Asn
  Val46   Ser/Thr
  Asp56   Asn
  Asp63   Ser/Thr*
  Glu231   Asn
  Asp237   Asn
  Gln268   Asn
  Asp269   Ser/Thr
  Glu285   Asn
  Ala320   Ser/Thr*
  Asp340   Asn
  Glu354   Asn
  Gln437   Asn
  Glu425   Asn
  Glu465   Asn
  Asp494   Asn*
*还已报道这些突变很少发生在HSA中(Carlson et al.，“Alloalbuminemia in Sweden：Structural study and phenotypicdistribution of nine albumin variants，”Proc.Nat.Acad.Sci.USA 89：8225-8229(1992)；Madison et al.，“Genetic variants of human serumalbumin in Italy：pomt mutants and a carboxyl-terminal variant，”Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：6476-6480(1994)；Hutchinson et al.，“TheN-terminal sequence of albumin Redhill，a variant of human serumalbumin，”FEBSLett.193：211-212(1985)；Brennan et al.，“AlbuminRedhill (-1Arg，320Ala-Thr)：a glycoprotein variant of human serumalbumin whose precursor has an aberrant signal peptidase cleavagesite，”Proc.Nat.Acad.Sci.USA 87：26-30(1990)；Minchiotti et al.，“Structural characterization of four genetic variants of human serumalbumin associated with alloalbuminemia in Italy，”Eur.J.Biochem.247：476-482(1997)；Peach et al.，“Structural characterization of aglycoprotein variant of human serum albumin：albumin Casebrook(494Asp-Asn)，”Biochim.Biophys.Acta 1097：49-54(1991))。
实施例3
B2B3-1是一种双特异性scFv抗体融合分子，包括B1D2，一种人抗ErbB2scFv抗体(SEQ ID NO：27)，以及H3，一种人抗ErbB3scFv(SEQ ID NO：26)。通过修饰人血清白蛋白(HSA)接头来连接上述两种scFv。将抗ErbB3scFv，H3重组融合于结合有短连接物多肽的HSA接头的氨基末端，并将抗ErbB2scFv，B1D2重组融合于结合有另外的短连接物多肽的修饰HSA接头的羧基末端。每种连接物多肽的选择是基于蛋白酶抗性性能。修饰HSA接头包含两个氨基酸取代。在天然HSA的位置34处的半胱氨酸残基被突变成丝氨酸，以降低潜在的蛋白异质性(由于在此位点处的氧化)。在天然HSA的氨基酸503处的天冬酰胺残基，其在天然HSA中可能会对导致药理半衰期减小的脱酰胺敏感，被突变成谷氨酰胺。人们认为借助于高亲合力抗ErbB2scFv结合部分，B2B3-1选择性地结合过度表达肿瘤的ErbB2，其具有10.0nM至0.01nM的kD，并且更优选约0.3nM的kD。随后抗ErbB3scFv与ErbB3的结合，其具有50至1nM的kD并且更优选约16nM，会抑制HRG诱导的ErbB3的磷酸化。修饰HSA接头赋予双特异性分子延长的循环半衰期。B2B3-1具有119.6kDa的分子量并且优选未被糖基化。
B2B3-1抑制配体诱导的具有亚纳摩尔效力的ErbB3的磷酸化；这种活性被认为至少部分是由于其二聚化伴侣ErbB2的高丰度表达，这促进了表达两种受体的癌细胞的特异性靶向。
实施例4
如图2所示，B2B3-1变体在ZR75-1乳腺癌细胞中抑制HRG诱导的pErbB3。用一定剂量范围的B2B3-1变体处理ZR75-1乳腺癌细胞24小时，接着HRG刺激。通过ELISA测量在细胞溶胞产物中的pErbB3水平并连同抑制百分比一起计算IC50值。示出的是平均IC50值(Y轴)，其中误差条表示重复的实验。抑制百分比值示在相应条的上方。
ELISA测定
除了所指出的以外，用于总ELISA和磷-ErbB3ELISA的ELISA试剂均以DUOSET试剂盒的形式购自R&D Systems。用50μl的抗体涂覆96-孔NUNC MAXISORB板并在室温下温育过夜。次日早晨，在BIOTEK板清洗机中用1000μl/孔的添加有Tween洗涤剂(PBST)(0.05％Tween-20)的无钙或镁的杜伯科磷酸缓冲盐(PBS)清洗板3次。接着在室温下用PBS中的2％BSA封闭板约1小时。在BIOTEK板清洗机中用1000μl/孔的PBST清洗板3次。细胞在37℃和5％二氧化碳下生长，用冷的PBS清洗细胞，然后用哺乳动物蛋白质提取物(MPER)裂解缓冲液(Pierce，78505)富集细胞，其中添加有150mM NaCl、5mM焦磷酸钠、10μM bpV(phen)、50uM苯胂、1mM原钒酸钠、以及蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，P2714)。在50％裂解缓冲液和1％BSA中稀释的50μL细胞溶解物和标准物以双份实施以用于进一步处理。样品在板振荡器上在4℃温育2小时并如前所述进行清洗。在2％BSA中稀释约50μl的检测抗体，加入PBST并在室温下温育约1-2小时。对于磷-ErbB3，检测抗体直接结合于辣根过氧化物酶(HRP)，而对于总ErbB3和生物素化的鼠抗人ErbB3，使用第二检测抗体。如前所述清洗板。对于总ErbB3，加入约50μl的抗生蛋白链菌素-HRP并温育30分钟，并如前所述清洗板。加入约50μL的SUPERSIGNALELISA Pico  (Thermo Scientific)底物，然后利用FUSION读板器进行读板。取双份样品的平均值，并且所示出的误差条代表两份样品之间的标准差。
实施例5
在用B2B3-1变体A5-HSA-B 1D2(图3-5的图片A)、H3-HSA-B1D2(图3-5的图片B)、H3-HSA-F5B6H2(图3-5的图片C)、以及F4-HSA-F5B6H2(图3-5的图片D)预处理24小时以后，测量磷酸化ErbB3(图3A-D)、AKT(图4A-D)、以及ERK(图5A-D)的抑制。用一定剂量范围的B2B3-1变体处理BT474乳腺癌细胞24小时，接着HRG刺激。通过ELISA测量在细胞溶胞产物中的pErbB3、pAKT、以及pERK水平，并且连同抑制百分比一起计算IC50值。这些结果表明，在10-8或更高的摩尔浓度下，B1B2-1是仅有的在所测试的能够对AKT、ERK和ErbB3的HRG-诱导的磷酸化提供大于50％抑制的HSA接头连接物。
实施例6
如图6所示，用B2B3-1变体处理BT474胸肿瘤细胞会引起G1细胞周期阻滞和S期细胞群体的减少。用1μM的B2B3-1变体和对照处理BT474细胞72小时。在处理结束以后，胰蛋白酶消化细胞，温和再悬浮在包含碘化丙啶的低渗溶液中，然后通过流式细胞术分析单细胞。利用设计用于细胞周期分析的曲线拟合算法(FlowJo软件细胞周期平台)测量了在G1和S期中的细胞周期分布。
实施例7
利用其二聚伴侣，ErbB2的高丰度表达，B2B3-1(SEQ IDNO：16)可以抑制ErbB3激活，从而靶向肿瘤细胞。高亲和力抗ErbB2scFv抗体，B1D2，促进B2B3-1靶向过度表达ErbB2的肿瘤细胞。通过修饰HSA接头将B1D2连接于低亲和力抗ErbB3scFv抗体H3，其阻断ErbB3的配体HRG的结合。认为由B2B3-1介导的ErbB3磷酸化和下游AKT信号的抑制是由于这种阻断造成的。结合scFv的ErbB2，B1D2，源自亲代scFv C6.5，其对于ErbB2既不具有激动活性也不具有拮抗活性。因此，B1D2同样仅作为靶向剂。ErbB3结合scFv的低亲和力结合被认为可以防止B2B3-1与正常、非癌性组织(其表达ErbB3但很少或不表达ErbB2)的强结合，从而减少非特异性毒性的效力。在表达ErbB2和ErbB3的肿瘤细胞中，存在的结合于两种受体的双特异性B2B3-1的亲和效应会克服ErbB3scFv的低亲和力，从而允许HRG与ErbB3受体复合物的相互作用的强抑制。
利用流式细胞术(FACS)，研究了B2B3-1抑制HRG结合于ErbB3的能力。用1μM B2B3-1预处理人乳腺癌细胞系(BT-474的变体，其过度表达ErbB2)的细胞，然后用10nM生物素化HRG 1βEGF域温育。在充分洗涤以后，利用链抗生物素蛋白-AlexaFluor 647结合物评估了结合。在4℃下进行所有温育。图7表明，B2B3-1能够阻断HRG与ErbB3的结合，并且在1μM的浓度下提供100％的阻断。
实施例8
在表明了B2B3-1阻断HRG结合于ErbB3的能力以后，研究了体外对表达ErbB3和过度表达ErbB2的两种细胞系B2B3-1对ErbB3信号的影响。人乳腺癌细胞系BT-474-M3(在例如Drummondet al.(2005)Clin.Cancer Res.11：3392；Park et al.(2002)Clin.CancerRes.8：1172；Kirpotin et al.(2006)Cancer Res.66：6732中描述的)和ZR7530(可获自US NIH Lawrence Berkeley National Laboratory乳腺癌细胞采集物)被血清饥饿过夜，用剂量滴定的B2B3-1预处理24小时，然后用5nM的HRG 1βEGF域刺激10分钟。然后利用ELISA测定，检查了ErbB3和AKT的磷酸化状态，ELISA测定基本上如前文所述。结果表明，在两种细胞系中，B2B3-1以剂量依赖性方式抑制HRG诱导的ErbB3和AKT磷酸化的激活，并具有有效的IC50(图8A-D)。
实施例9
图9示出在BT474乳腺癌细胞中B2B3-1处理对信号蛋白的影响。用一定剂量范围的B2B3-1处理细胞24小时，接着神经生长因子刺激。通过蛋白质印迹分析，确定了细胞溶胞产物的pErbB2、pErbB3、pErk以及pAKT水平，以及它们相应的总蛋白水平。结果表明，通过B2B3-1处理，至少pErbB2和pErbB3的水平以剂量依赖的方式降低。
实施例10
图10示出B2B3-1处理的BT474乳腺癌细胞的免疫沉淀-蛋白质印迹分析。用一定剂量范围的B2B3-1处理细胞24小时，接着神经生长因子刺激。利用抗ErbB2抗体，从细胞溶胞产物分离ErbB2结合复合物，接着蛋白质印迹分析，以检测pErbB2和pErbB3以及相应的总蛋白水平。结果表明，B2B3-1使ErbB2与ErbB3交联，以使得实质上更多的ErbB3和磷-ErbB3可通过抗-ErbB2抗体被沉淀。
实施例11
利用若干测定，体外研究了B2B3-1的抗肿瘤活性。在第一测定中，检查了B2B3-1对G1期的BT-474或SKBR3细胞的积聚以及伴随的对细胞周期的S期的细胞的减少的影响。简单地说，用1μM B2B3-1或PBS载体处理细胞72小时。在处理结束以后，胰蛋白酶消化细胞，温和再悬浮在包含碘化丙啶的低渗溶液中，然后通过流式细胞术来分析单细胞。利用设计用于细胞周期分析的曲线拟合算法(FlowJo软件细胞周期平台，Tree Star，Inc.)测量了在G1和S期中的细胞周期分布。研究发现，B2B3-1温和降低S期细胞的百分比并且增加G1期细胞的群体(图11A)。在第二实验中，研究了在用B2B3-1处理以后形成的细胞集落的数目。在有1μMB2B3-1存在的条件下，平板接种BT-474和SKBR3乳腺癌细胞，并比较仅平板接种在介质中的细胞。每3天仅补充介质或补充包括处理的介质。在14天以后，计数集落的数目并和未处理细胞比较。图11B表明，与对照细胞相比，当用B2B3-1处理细胞时，所形成的集落数目减少40-45％。最后，用细胞阻抗测定并利用实时细胞电子传感***(RT-CES：ACEA Biosciences)评估了B2B3-1抑制细胞增殖的能力。将BT-474细胞接种在结合有微电子传感器阵列的平板上，然后用剂量滴定的B2B3-1或仅介质处理72小时。每小时收集反映细胞-电极阻抗反应发生的数据，时间为72小时，然后在处理后68小时计算IC50值。图11C表明，B2B3-1能够抑制BT-474细胞的阻抗并且IC50为33nM。
实施例12
我们还基于同时结合和交联ErbB2和ErbB3受体的能力研究了B2B3-1是否具有激动活性。用1μM B2B3-1或PBS载体温育血清饥饿的ZR75-1乳腺癌细胞24小时。还用B2B3-1或PBS载体处理细胞24小时，接着用5nM HRG 1βEGF域刺激10分钟。溶解细胞并通过基本上如上文所述的ELISA评估溶胞产物的pErbB3含量。图12表明，仅用B2B3-1处理的细胞包含的磷酸化ErbB3的水平与未处理细胞中的水平相当，这表明B2B3-1并不是作为促进ErbB3磷酸化的激动剂起作用。
实施例13
通过ELISA，研究了B2B3-1特异性地结合于ErbB2和ErbB3且不结合于相关ErbB家族成员EGFR和ErbB4的能力。平板涂布有ErbB2或ErbB3的重组胞外域。在有EGFR、ErbB2、ErbB3或ErbB4的系列稀释的竞争性重组胞外域存在的条件下，用半最大结合浓度的B2B3-1阻断和温育平板。结果表明，仅可溶性ErbB2胞外域阻断B2B3-1结合于ErbB2涂布的平板(图13A)。同样，仅可溶性ErbB3胞外域阻断B2B3-1结合于ErbB3涂布的平板(图13B)。这些结果被认为证明了抗ErbB2臂B1D2对ErbB2的特异性，以及抗ErbB3臂H3对ErbB3的特异性。当在ErbB3涂布的平板上用B2B3-1温育可溶性ErbB2胞外域时观测到的增加的信号被认为是由于在平板上ErbB2、ErbB3、B2B3-1复合物的形成。
实施例14
利用B3B3-1的单特异性变体研究了B2B3-1结合于表达ErbB2和ErbB3的肿瘤细胞的能力。SKO-2(SEQ ID NO：67)和SKO-3(SEQ ID NO：68)是B2B3-1的变体，其分别缺少与ErbB2或ErbB3相互作用的能力。
SKO-2和SKO-3是利用QUIKCHANGE Site DirectedMutagenesis试剂盒(STRATAGENE)构建的，其使用各自互补于模板载体的相反链的寡核苷酸引物对。在产生含有交错切口的突变质粒的温度循环过程中延伸这些引物。在温度循环后，用DpnI处理产物，其被用于消化亲本DNA模板。然后将含有期望突变的带切口的载体DNA转运到XL1-BLUE超感受态细胞(STRATAGENE)中以扩增质粒DNA。
为了制备SKO-2，抗-ErbB2scFv，B 1D2的VH CDR3环中的5个核苷酸发生突变以产生以下的氨基酸取代；H95A、W100hA、和E100jA。在这些位置处的突变已被证明敲除了B1D2亲本scFv，C6.5与ErbB2的结合(Schier et al，1996JMB)。以分步的方式将突变引入到B2B3-1质粒pMP9043(SEQ ID NO：60)中。首先，利用引物5′-GTA CTT TTG TGC CCG GGC CGA TGT GGG CTA CTG C-3′(SEQ ID NO：61)和5′-GCA GTA GCC CAC ATC GGC CCG GGCACA AAA GTA C-3′(SEQ ID NO：62)和在95℃持续1分钟，接着95℃持续1分钟循环30次，55℃持续1分钟，并且在65℃持续17.2分钟的温度循环下产生突变c295g和a296c。通过质粒DNA的DNA测序来确认突变。为了在t334g、g335c、和a341c处引入突变，利用引物5′-GAC ATG TGC CAA GGC CCC CGC GTG GCTGGG AGT G-3′(SEQ ID NO：63)和5′-CAC TCC CAG CCA CGCGGG GGC CTT GGC ACA TGT C-3′(SEQ ID NO：64)和在95℃持续30秒并在95℃持续30秒循环18次，55℃持续1分钟并在68℃持续17.2分钟的温度循环下，在具有已确认序列的突变的质粒上的c295g和a296c处实施第二轮定点诱变。通过所得的质粒DNA的DNA测序来确认突变。
为了产生SKO-3，将突变的B1D2scFv亚克隆到原来的B2B3-1质粒中以代替抗-ErbB3scFv，H3。将引物与SKO-2退火，使用5’ACAGTGGCGGCCGCCACCATGGGCTGGTCTCTGATCCTGCTGTTCCTGGTGGCCGTGGCCACGCGTGTGCTGTCCCAGGTGCAGCTCGTCCAGAGCGGCGC (SEQ ID NO：65)和5’GGAGGCGGCGCCCAGGACTGTCAGCTTGGTGCCACCGCCG(SEQ ID NO：66)从SKO-2分离突变的B1D2scFv并将用于亚克隆的Kas I和Not I限制性位点引入到Kas I/Not I限制性消化的B2B3-1质粒中。如下实施PCR：94℃持续1分钟接着94℃持续30秒循环30次，58℃持续1分钟，72℃持续1分钟，接着72℃持续5分钟循环一次以扩增突变体B1D2。通过DNA测序来监测连续克隆。在摇瓶或10L WAVE袋中由CHO-K1稳定表达SKO-2和SKO-3质粒并利用Blue SEPHAROSE和阳离子交换色谱由条件培养基进行纯化。
在有饱和浓度的山羊抗HSA Alexafluor-647结合抗体存在的条件下，用系列稀释的B2B3-1、SKO-2、或SKO-3温育MALME-3M黑色素瘤细胞，其表达大约相等数目的ErbB2和ErbB3受体。通过流式细胞术评估了细胞结合并确定了每种分子的表观结合亲和力。仅用二抗温育对照细胞。没有观测到SKO-2可测量的细胞结合，SKO-2仅保留由H3介导的与ErbB3的低亲和结合并且缺少与ErbB2的结合活性。SKO-3，其保留功能性、高亲和ErbB2结合B1D2scFv但缺少结合ErbB3的能力，具有6.7nM的KD。B2B3-1结合细胞，KD为0.2nM，这表明了由这种分子的双特异性设计介导的结合增加(图14)。
实施例15
通过在37℃下在人、食蟹猴、或小鼠血清中温育100nMB2B3-1达120小时，评估了在生理条件下B2B3-1的稳定性。在0、24、48、72、96以及120小时取样品并通过ELISA测量B2B3-1结合ErbB2和ErbB3的能力。上述ELISA涉及用重组ErbB2胞外域涂布96孔平板过夜，接着是阻断步骤，然后用系列稀释的B2B3-1进行温育。然后用Fc-ErbB3胞外域融合蛋白接着用山羊抗人Fc-HRP结合物温育平板。通过添加超信号化学发光底物来显影平板。图15A-C表明，在生理条件下在来自所有三种物种的血清中B2B3-1仍然是稳定的，并在测量的所有时间点保留相当的结合ErbB2和ErbB3的能力。
实施例16：在BT-474-M3人乳腺癌体内异种移植模型中B2B3-1剂量反应。
利用携带人BT-474-M3异种移植物的裸鼠评估了B2B3-1的体内效力。每组10只小鼠，每3天以0.3、1、3、10、30或90mg/kg的量12次给予B2B3-1。以相对于90mg/kg B2B3-1剂量的等摩尔剂量给予对照组PBS载体或HSA。所有剂量是腹膜内(i.p.)给予。每周两次测量肿瘤大小并计算相应的肿瘤容积。结果表明，和对照组相比，B2B3-1治疗导致BT-474-M3肿瘤体积的显著减小(图16)。除用最低剂量的B2B3-1(0.1mg/kg)治疗的小鼠以外，在每个B2B3-1治疗组中均观测到完全消退。
实施例17
如图17A-E所示，B2B3-1在多种异种移植模型中以ErbB2依赖性方式使肿瘤尺寸减小。在表达ErbB2＞1x105受体/细胞的Calu-3(图17A)、SKOV-3(图17B)、NCI-N87(图17C)、以及MDA-MB-361(图17E)异种移植模型中B2B3-1是有效的，但在表达4.5x104ErbB2受体/细胞的ACHN(图17D)异种移植模型中则作用较小。每3天用30mg/kg的B2B3-1治疗小鼠。
实施例18
ErbB2的过度表达将B2B3-1非反应者ADRr乳腺癌异种移植模型转化成对B2B3-1的反应者(图18A和18B)。利用反转录病毒表达***，在ADRr乳腺癌细胞中过度表达ErbB2。利用FACS来选择表达高水平ErbB2的转染细胞(ADRr-E2)，随后对裸鼠进行皮下注射以建立异种移植肿瘤。每3天用30mg/kg的B2B3-1治疗小鼠。虽然在野生型ADRr异种移植物(图18A)中没有观测到对B2B3-1的反应，但ADRr-E2异种移植物(图18B)对B2B3-1有反应。
实施例19
如图19A-B所示，B2B3-1活性与体外(图19A)和体内(图19B)的ErbB2表达水平正相关。利用ELISA测定，在ErbB2的表达水平为5x104受体/细胞至2.4x106受体/细胞的9种肿瘤细胞系中确定了ErbB3磷酸化的B2B3-1抑制。研究发现，相对于基本水平(pErbB3抑制％)，B2B3-1抑制ErbB3磷酸化的能力的程度正相关于ErbB2表达水平。类似地，在表达低至高水平ErbB2的10种肿瘤异种移植模型中评估了B2B3-1活性。异种移植反应也正相关于ErbB2表达水平。
实施例20
BT474-M3胸肿瘤细胞的B2B3-1处理导致p27kip1易位到细胞核(图20A)。用1μM的B2B3-1处理BT474-M3细胞6小时。利用免疫荧光技术评估了p27kip1的亚细胞位置。在经B2B3-1处理的细胞中，p27kip1易位到细胞核，已表明其导致细胞增殖的抑制。p27kip1仍然在未处理细胞的细胞质中。
为了进一步研究B2B3-1对细胞周期的影响，利用蛋白质印迹分析，检查了经B2B3-1处理72小时的BT-474-M3细胞的细胞周期调节子细胞周期蛋白D1(图20B)。在此实验中细胞骨架蛋白纽蛋白用作蛋白负荷对照。和未处理细胞相比，B2B3-1处理导致细胞周期蛋白D1水平的降低。
实施例21
如图21A-B所示，BT474-M3胸肿瘤异种移植物的B2B3-1处理导致p27kip1易位到细胞核。每3天用剂量为30mg/kg的B2B3-1(图21A)或用等摩尔剂量的HSA(图21B)处理BT474胸肿瘤异种移植物，总共给药4次。与HSA对照肿瘤相比，在B2B3-1治疗的肿瘤中观测到p27kip1的增加的核染色，表明了B2B3-1体内的抗增殖效应。
实施例22
B2B3-1治疗导致在BT474乳腺癌异种移植肿瘤中增殖标记Ki67的减少。每3天用剂量为30mg/kg的B2B3-1(图22A)或用等摩尔剂量的HSA(图22B)处理BT474-M3胸肿瘤异种移植物，总共给药4次。随后肿瘤切片的Ki67染色表明，与HSA处理的肿瘤相比，B2B3-1处理的肿瘤具有降低的表达模式。
实施例23
B2B3-1治疗导致在BT474-M3乳腺癌异种移植肿瘤中血管密度的减小，如通过测定CD31表达所确定的(图23A-B)。每3天用剂量为30mg/kg的B2B3-1(图23A)或用等摩尔剂量的HSA(图23B)处理BT474胸肿瘤异种移植物，总共给药4次。肿瘤染色以检查血管标记CD31的存在。与用HSA处理的对照肿瘤相比，用B2B3-1处理的肿瘤显示显著降低的血管密度。
实施例24：B2B3-1体内抑制ErbB3的磷酸化。
每3天用30mg/kg的B2B3-1或17.5mg/kg的HSA治疗BT-474-M3异种移植肿瘤，总共给药4次，并在最后给药后的24小时收集肿瘤。使肿瘤溶解并进行SDS-PAGE接着进行蛋白质分析，以评估B2B3-1的靶ErbB3的磷酸化的相对水平。在每个泳道中加载等量的蛋白质并通过检查β微管蛋白来控制总蛋白水平。利用对于磷酸化ErbB3具有特异性的抗体进行的蛋白质印迹分析表明，与HSA治疗的肿瘤相比，B2B3-1治疗的肿瘤包含更少的pErbB3(图24A)。蛋白质印迹分析的密度测定法和接着平均pErbB3积分谱带强度归一化到平均β微管蛋白积分谱带强度说明了，和对照HSA治疗的肿瘤相比，B2B3-1治疗的肿瘤包含显著更少的pErbB3(图24B)。这些数据证实了，B2B3-1体内抑制其靶ErbB3的磷酸化。
实施例25：在具有降低的PTEN活性的BT-474-M3异种移植物中B2B3-1的体内活性。
ShRNA技术用来在BT-474-M3乳腺癌细胞中敲除肿瘤抑制性基因磷酯酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)的活性。简单地说，借助于反转录病毒转染，用shPTEN或shControl RNA转染培养的BT-474-M3细胞。利用FACS来选择具有降低的PTEN的转染细胞，随后皮下注射到裸鼠的右胁腹，以建立异种移植肿瘤。将用对照载体转染的细胞注入相同小鼠的左胁腹。每3天用30mg/kg的B2B3-1或每周用10mg/kg曲妥珠单抗治疗小鼠。以相对于B2B3-1的等摩尔剂量，注射HSA作为对照。所有注射到腹腔。
B2B3-1和曲妥珠单抗促进减小由对照BT-474-M3乳腺癌细胞形成的肿瘤的尺寸(图25A)，而仅B2B3-1(但不是曲妥珠单抗)促进减小缺少PTEN的表达的BT-474-M3人乳腺癌细胞形成的肿瘤的尺寸(图25B)。
实施例26：B2B3-1抑制在具有降低的PTEN活性的BT-474-M3乳腺癌细胞中的ErbB3信号。
利用上文描述的PTEN缺陷型BT-474-M3模型，研究了在肿瘤异种移植物中B2B3-1抑制ErbB3信号的磷酸化的能力。每3天用30mg/kg的B2B3-1、17.5mg/kg的HSA，或每周用10mg/kg曲妥珠单抗，治疗工程改造的细胞系或对照细胞系的异种移植肿瘤，并在最后给药以后的24小时收集肿瘤。使肿瘤溶解并进行SDS-PAGE接着蛋白质分析，以评估B2B3-1的靶ErbB3、AKT的磷酸化的相对水平、以及总PTEN水平。在每个泳道中加载等量的蛋白并通过检查PCNA来控制总蛋白水平。利用对于磷酸化ErbB3具有特异性抗体进行的蛋白质印迹分析表明，和HSA治疗的或曲妥珠单抗治疗的肿瘤相比，B2B3-1治疗的肿瘤包含较少的pAKT(图26A)。蛋白质印迹分析的密度测定法和接着平均pAKT积分谱带强度归一化到平均PCNA积分谱带强度说明了，和对照HSA治疗和曲妥珠单抗治疗的肿瘤相比，B2B3-1治疗的肿瘤包含显著更少的pAKT(图26B)。
实施例27
在nu/nu小鼠中研究了B2B3-1的药物动力学参数。将动物随机分组并静脉内(IV)给予单次给予5、15、30、或45mg/kg的B2B3-1(分别为图27A-D)。给药前以及给药后0.5、4、8、24、48、72、以及120小时收集血液。三只小鼠用于每个时间点。利用两种ELISA方法测量了B2B3-1的血清水平。第一种方法需要B2B3-1功能性结合于ErbB2和ErbB3，而第二种方法仅测量在血清中B2B3-1的HSA成分。HSA ELISA采用多克隆抗HSA捕捉抗体和HRP结合多克隆抗HSA检测抗体。与HSA方法比较，利用ErbB2/ErbB3结合方法测得的B2B3-1血清浓度的减小将表明功能性B2B3-1的丧失。图27A-D示出，当利用任何一种ELISA方法进行评估时，B2B3-1的药物动力学性能是相当的，这表明在小鼠的循环中B2B3-1是稳定的。
实施例28
利用两室、双指数模型来拟合B2B3-1血清浓度并显示双相分布。对于5、15、30、或45mg/kg剂量，最终半衰期分别计算为17、16、23、以及18小时，并列在表4中。B2B3-1剂量的增加导致暴露的线性增加(图28)。
表4：在小鼠和食蟹猴中B2B3-1的药物动力学性能
Figure BDA0000075609680000971
实施例29
用于药物动力学分析的血液样品还获自对雌性食蟹猴进行的剂量范围寻找的毒理学研究。在此研究中，对动物输注4、20或200mg/kg的B2B3-1，每3天给予，共4次给药。在每个给予剂量日，(研究日1、4、7以及10)在给予剂量以前和以后5分钟进行采样以提供剂量前和峰/谷浓度，并在第1天的第一次输注结束后的1、2、4、8、24以及48小时并在第10天的最后一次输注后的1、2、4、8、24、48、72以及120小时进行采样。对于给药剂量200mg/kg的恢复动物，还在最后一次输注后的168、336以及456小时收集血清样品。
利用先前描述的ErbB2/ErbB3ELISA方法测定了食蟹猴血清样品。对于每种剂量，随时间的血清浓度示于图29中。分析表明，在第1天和第10天给予剂量以后血清B2B3-1的平均浓度-时间分布是定性上类似的：浓度通常随时间从最大浓度降低。平均半衰期估计值为在第1天38.3-67.2小时以及在第10天45.0至121.0小时(表4)。
实施例30
产生编码B2B3-1双特异性scFv抗体融合蛋白的质粒，其合并有独特的人抗ErbB3scFv(称为“H3”)、人抗ErbB2scFv(称为“B1D2”)、以及修饰人血清白蛋白(HSA)接头的基因序列。借助于连接肽(Ala-Ala-Ser)将抗ErbB3scFv，H3，重组连接于HSA接头的氨基末端，以及借助于连接肽(Ala-Ala-Ala-Leu-SEQ IDNO：5)将抗ErbB2scFv，B1D2，基因连接于HSA接头的羧基末端。肽连接物是通过在构建哺乳动物表达性载体期间引入限制位点形成并且连同单链抗体片段和HSA接头以对于哺乳动物表达优先使用的密码子合成。
B1D2scFv选自通过诱变ErbB2结合scFv C6.5所产生的组合噬菌体展示文库，其选自非免疫噬菌体展示文库。H3scFv选自最初由Sheets等制备的非免疫噬菌体展示文库。按照CHO细胞密码子偏好优化编码B1D2和H3单链抗体片段的基因序列并合成用于B2B3-1编码质粒的随后构建。
修饰的HSA接头包含两个氨基酸取代。将在位置34处的半胱氨酸残基突变成丝氨酸以降低潜在的蛋白异质性(由于在此位点的氧化)。将在氨基酸503处的天冬酰胺残基突变成谷氨酰胺，其在野生型HSA中对脱氨作用敏感并会导致药理半衰期缩短。
用对于哺乳动物表达的优化的密码子运用来合成编码修饰HSA接头的基因序列，用于随后构建B2B3-1编码质粒。
实施例31
利用标准分子生物学技术将B2B3-1编码序列克隆到pMP10k基础载体，以产生图30所示的质粒pMP10k4H3-mHSA-B1D2。对于大部分来说，这种构建体采用常用的基因元件。B2B3-1表达是由人GAPD启动子推动。这种载体采用称作间质连接区或MAR元件的基因元件。MAR基因元件控制染色质的动态组织，并使附近的基因与周围染色质的影响隔离，从而增加依赖于拷贝数的与位置无关的基因表达。已表明，MAR元件可以改善分离克隆的概率，其中克隆呈现为生产重组蛋白所期望水平的表达，以及增加生产的稳定性。在B2B3-1构建体中所使用的MAR元件是非编码人MAR元件。除B2B3-1质粒以外，新霉素抗生素抗性质粒(图31)和潮霉素抗性质粒(图32)还用来选择稳定的转化体。
实施例32：基因转染的第一轮
中国仓鼠卵巢CHO-K1细胞购买自ATCC(ATCC#CCL-61)。CHO-K1细胞系是由T.T.Puck产生的亲代CHO细胞系的血清和脯氨酸依赖性黏附亚克隆。在转染以前，使用于B2B3-1转染的CHO-K1细胞预先适合于在无血清介质中悬浮生长。重复转染程序用来生长B2B3-1细胞系。在转染前24小时，在补充有8mM L-谷氨酰胺、0.1mM次黄嘌呤钠、以及0.016mM胸苷的SFM4CHO(无血清)介质(HyClone，Logan，UT)中将CHO-K1细胞亚传代至1.0x106细胞/mL。在转染日，将细胞再悬浮在OptiMEM介质(Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)中并将40,000个细胞放置在24孔板的每个孔中。在第一次转染中，利用75：1(B2B3-1：新霉素抗性)的摩尔质粒比将B2B3-1表达质粒(pMP10k4H3-mHSA-B1D2)和新霉素抗性质粒(图30；pSV2-neo(Selexis，Inc.，Marlborough，MA)混合在一起。随后使质粒混合物混合于阳离子脂质转染试剂(Lipofectamine LTX，Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)并允许脂质/DNA复合物形成30分钟。然后将DNA/脂质复合物加入CHO-K1细胞并将24孔平板放置在37℃、5％CO2的恒温箱中。
实施例33：高生产者的选择和筛选
用PBS洗涤每个转染孔的内含物，胰蛋白酶消化并分布于两个、96孔平板。所使用的生长培养基包括含有10％FBS(InvitrogenCorp，Carlsbad，CA)的DMEM/F12(Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)以及500mg/L新霉素(G418；Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)。在第4天将在96孔平板中的介质改变成补充有8mM L-谷氨酰胺、0.1mM次黄嘌呤钠、0.016mM胸苷、以及500mg/L新霉素的SFM4CHO介质。在选择介质中再培养两周后，存活细胞已形成界限分明的集落。利用定量斑点印迹技术来评估克隆。胰蛋白酶消化顶部产生的集落，并扩展到24孔平板的单孔。
7天生产力测定用来筛选高B2B3-1生产集落。在扩展以后，使24孔平板中的细胞可以在补充有8mM L-谷氨酰胺、0.1mM次黄嘌呤钠、以及0.016mM胸苷的SFM4CHO介质中增殖7天。确定在用过的培养基中的B2B3-1浓度。将来自24孔规模的顶部克隆扩展到125mL隔板式摇瓶。在摇瓶中补充有8mM L-谷氨酰胺、0.1mM次黄嘌呤钠、以及0.016mM胸苷的SFM4CHO介质中的7天研究用来筛选用于生长和B2B3-1生产的细胞群。
实施例34：基因转染的第二轮
对根据第一轮转染(上文)确定的最高生产细胞群转染第二次以增加生产。在转染前24小时，在补充有8mM L-谷氨酰胺、0.1mM次黄嘌呤钠、以及0.016mM胸苷的SFM4CHO(无血清)介质中将细胞群亚传代到1.0x106细胞/mL。在转染日，将细胞再悬浮在OptiMEM介质(Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)中并将40,000个细胞放置在24孔平板的每个孔中。在第一次转染中，以50：1(B2B3-1：潮霉素抗性)的摩尔质粒比将B2B3-1和潮霉素抗性质粒(图32；pTK-Hyg(Clontech，Mountain View，CA))混合在一起。随后将质粒混合物混合于阳离子脂质转染试剂(Lipofectamine LTX，Invitrogen Corp)并使脂质/DNA复合物可以形成30分钟。然后将DNA/脂质复合物加入细胞群并将24孔平板放置在37℃、5％CO2的恒温箱中。
实施例35：从第二次转染选择和筛选高生产者
用PBS洗涤每个转染孔的内含物，胰蛋白酶消化，然后分布于两个96孔平板。所使用的生长培养基包括补充有10％FBS的DMEM/F12和400mg/L的潮霉素B(Invitrogen Corp)。在第4天，将在96孔平板中的介质改变成补充有8mM L-谷氨酰胺、0.1mM次黄嘌呤钠、0.016mM胸苷、以及400mg/L潮霉素B的HycloneSFM4CHO介质。在继续选择两周以后，存活细胞已形成界限分明的集落。利用定量斑点印迹技术来评估克隆。胰蛋白酶消化顶部产生的集落，并扩展到24孔平板的单孔。
7天生产力测定用来筛选高B2B3-1生产集落。在扩展以后，使细胞可以增殖7天，然后确定在用过的培养基中的B2B3-1浓度。
将来自24孔平板的顶部克隆扩展到包含补充有8mM L-谷氨酰胺、0.1mM次黄嘌呤钠、以及0.016mM胸苷的Hyclone SFM4CHO介质的125mL隔板式摇瓶中。在摇瓶中的7天研究用来筛选用于生长和B2B3-1生产的细胞群。利用Protein Aresin和HPLC仪器对用过的培养基进行量化。
实施例36：限制稀释克隆
从125mL摇瓶转移通过生产力测定鉴定的最好生长和最高B2B3-1产量的集落，并以用来产生一个细胞/孔的细胞浓度平板接种在5个96孔平板中。将96孔平板放置在37℃和5％CO2的恒温箱中。每两周检查孔以跟踪集落的形成。基于集落的对称形状，鉴定了来自单细胞的集落。对包含上述集落的孔进行标记，以用于通过24孔7天评估、以及125mL摇瓶7天评估来进一步筛选。
以与第一轮类似的方式进行第二轮的限制稀释克隆。评价另外100mL供给的材料以证实克隆选择。冷藏预接种库。
实施例37：B2B3-1的配制
经由静脉内输注一周一次给予B2B3-1，时间为60或90分钟，其取决于患者耐受能力。
可以将B2B3-1配制在无菌20mM L-组氨酸盐酸盐、150mM氯化钠、pH 6.5溶液中，浓度为25mg/mL，用于给予患者(例如，人)。
实施例38：乳腺癌的治疗
如果患者的癌症被认为是表达高水平的表皮生长因子受体，包括ErbB2(HER2/neu)，然后用结合于ErbB结合部分的HSA接头处理，例如示出了B2B3-1、B2B3-2、v-3、B2B3-4、B2B3-5、B2B3-6、B2B3-7、B2B3-8、B2B3-9、或B3B3-10(参见下表6)。当癌活检的基因型或组织学筛选揭示了患者肿瘤中的ErbB2表达增加的情况下也是如此。
可以通过一周一次或一周两次地静脉内输注一段时间，以不高于30mg/kg的剂量将B2B3HSA接头结合物(如B2B3-1，SEQ IDNO：6)给予诊断患有乳腺癌的患者，时间为例如，60或90分钟，其取决于患者耐受能力。可以将B2B3HSA接头结合物配制在无菌20mM L-组氨酸盐酸盐、150mM氯化钠、pH6.5溶液中，浓度为25mg/mL，用于给予患者。监督给予B2B3HSA接头结合物的临床医师遵循通常的配制和给药实践以确定用于患者的适当疗程。
临床医师还可以将一种或多种治疗剂与B2B3HSA接头结合物联合给予。例如，一种或多种治疗性药物或化合物可与B2B3HSA接头结合物组合给予，例如用于治疗乳腺癌的通常化疗方案，其中包括多柔比星、环磷酰胺以及紫杉醇。可替换地，临床医师可以连同外科或放射疗法一起给予B2B3HSA接头结合物以治疗对其需要的患者的乳腺癌。
实施例39卵巢癌的治疗
如果认为患者的癌症表现出高水平的表皮生长因子受体，包括ErbB2(HER2/neu)，则用连接于ErbB2选定部分(biding moiety)的HSA接头进行治疗，例如所列出的B2B3-1、B2B3-2、v-3、B2B3-4、B2B3-5、B2B3-6、B2B3-7、B2B3-8、B2B3-9、或B3B3-10(参见下表6)。当癌活检的基因型或组织学筛选揭示了患者肿瘤中的ErbB2表达增加的情况下也是如此。
将B2B3HSA接头结合物(例如B2B3-1，SEQ ID NO：16)单独给予或与基本上在前一实施例中描述的一种或多种其他治疗剂组合给予诊断患有卵巢癌的患者。
实施例40：其他HSA接头结合物
可以利用列在下表5中的一种或多种成分(组A-E)来构建HSA接头结合物。尤其是，HSA接头结合物，其显示为下表5中的组C，结合一种或多种选自表5所示组A和E的结合部分。此外，HSA接头结合物还可以在HSA接头的氨基或羧基末端包括一种或多种肽连接物，其选自表5中的组B和D。可以重复或截短肽连接物以增加或减小连接物序列的长度。
实施例41：体内q7d给予B2B3-1表现出与q3d给予B2B3-1等同的效力
在来自Charles River Labs的5-6周龄雌性无胸腺裸鼠(nu/nu)中确定利用q7d(每7天一次)剂量方案的B2B3-1效力，雌性无胸腺裸鼠具有人乳腺癌细胞系BT-474-M3的异种移植物肿瘤(图33)。小鼠在注射PBS中的20×106人BT-474-M3细胞前24小时在相对侧胁腹接受皮下释放***的移植(0.72mg小丸，60天，缓慢释放，Innovative Research of America，Sarasota，FL)。当肿瘤开始生长(肿瘤体积大约为400mm3)时开始给药并且以30mg/kg每3天一次(q3d)的研究时程或以22mg/kg、66mg/kg、132mg/kg或198mg/kg每7天一次通过腹膜内注射向每组10只小鼠给予B2B3-1。利用数字测径器每周两侧测量肿瘤。利用以下公式计算肿瘤体积：π/6×(W2×L)，其中W为短直径而L为长直径。药代动力学计算表明，q7d给药66mg/kg应给出与q3d给药30mg/kg的异种移植肿瘤类似的B2B3-1暴露。使用PBS载体作为阴性对照。对于q3d给药30mg/kg和q7d给予的三个最高剂量的B2B3-1，B2B3-1效力是等同的，这表明B2B3-1的q7d剂量方案在该模型中是适合的。
实施例42：B2B3-1和曲妥珠单抗具有不同的ErbB抑制机制
利用蛋白质印记分析来测试B2B3-1抑制诱导ErbB3活性的神经生长因子的能力。用100nM B2B3-1或曲妥珠单抗处理无血清BT-474-M3细胞单层24小时，然后用5nM HRG 1βEGF刺激10分钟。再用10nM和100nM B2B3-1或10nM和100nM曲妥珠单抗处理细胞并使其不受到刺激。使溶解产物经受ErbB3、pErbB3、AKT、和pAKT的免疫印记分析。蛋白质印记分析(图34)表明，B2B3-1处理导致了pErbB3和pAKT以配体依赖性方式的抑制，而在不存在配体时仅观察到曲妥珠单抗对pErbB3和pAKT的抑制。
实施例43：当体外与曲妥珠单抗一起给予时B2B3-1具有另外的效果
利用四种不同的乳腺癌细胞系来研究B2B3-1、曲妥珠单抗以及两种药物的组合对癌细胞球状体生长的影响。将2000个BT-474-M3、SKBR3(ATCC)、或MDA-MB-361(ATCC)人乳腺癌细胞接种到圆底低粘附性96孔板中(
Figure BDA0000075609680001051
96Well ClearRound Bottom Ultra Low Attachment Microplate-产品号#7007)并在第二天用B2B3-1、曲妥珠单抗以及以B2B3-1对曲妥珠单抗3倍摩尔过量的比率的二者组合的剂量范围测量并处理该球状体。在生长12天后，测量球状体的表面积并与未处理的细胞进行比较。如在图35A-C中所示，在所测试的所有细胞系中，B2B3-1与曲妥珠单抗的组合在一定浓度范围内均导致比单药剂更大的球状体生长的抑制，而药物的浓度最低。这些结果还表明，B2B3-1不会与曲妥珠单抗竞争结合于ErbB2(HER2)。
实施例44：当与曲妥珠单抗一起体内给予时B2B3-1具有叠加效应
利用BT-474-M3异种移植模型在来自Charles River Labs的5-6周龄雌性无胸腺裸鼠(nu/nu)中研究了当与曲妥珠单抗一起体内给予时B2B3-1的影响。在注射PBS中的20×106人BT-474-M3细胞前24小时，使小鼠在对侧胁腹皮下接受释放***的移植物(0.72mg丸剂，60天，缓慢释放，Innovative Research ofAmerica，Sarasota，FL)。当肿瘤生长确立时(肿瘤体积大约为400mm3)开始给药。利用数字测径器每周测量肿瘤两次。利用以下公式计算肿瘤体积：π/6x(W2x L)，其中W为短直径而L为长直径。在研究过程中，通过腹膜内注射对10只小鼠/组以3mg/kg或10mg/kg q3d给予B2B3-1，以1mg/kg或0.1mg/kgq7d给予曲妥珠单抗，或两种药物联合给予。对于相应的单药剂而言，给予B2B3-1和曲妥珠单抗的所有组合(10mg/kg B2B3-1+1mg/kg曲妥珠单抗、10mg/kgB2B3-1+0.1mg/kg曲妥珠单抗、3mg/kg B2B3-1+1mg/kg曲妥珠单抗、3mg/kg B2B3-1+0.1mg/kg曲妥珠单抗)。
如图36所示，与单药剂相比，对于所有组合观察到明显更大的效力，并且从给予10mg/kg B2B3-1以及同时给予曲妥珠单抗及3mg/kg B2B3-1和1mg/kg曲妥珠单抗的组合之前的至少20天就观察到显著的效力。在10mg/kg B2B3-1+1mg/kg曲妥珠单抗组合组中，10只小鼠中的5只具有完全消退的肿瘤，相比之下，给予与组合中相等剂量的单药剂组中的10只小鼠均不具有完全消退的肿瘤。在3mg/kg B2B3-1+1mg/kg曲妥珠单抗组合组中，10只小鼠中的7只具有完全消退的肿瘤，相比之下，给予与组合相等剂量的单药剂组中的10只小鼠均不具有完全消退的肿瘤。这些结果表明，B2B3-1不会与曲妥珠单抗竞争结合于ErbB2(HER2)。这些结果还表明，用至少3mg/kg B2B3-1和至少0.1mg/kg曲妥珠单抗的组合进行治疗比仅用3mg/kg或10mg/kg的B2B3-1或仅用0.1mg/kg或1mg/kg的曲妥珠单抗进行治疗更加有效。尤其是，至少3mg/kgB2B3-1和1mg/kg曲妥珠单抗的组合诱导了至少约50％的携带人乳腺癌细胞异种移植物的裸鼠中的基本上完全的肿瘤消退，而单独给予相同浓度的B2B3-1或曲妥珠单抗却不能提供这样的小鼠中的10％完全消退。
还提供了以上描述的HSA接头、肽连接物、以及结合部分的具体实施方式。下表6列出10种HSA接头结合物，其在HSA接头的氨基和羧基末端具有不同的ErbB2特异性或ErbB3特异性结合部分、以及肽连接物。
本领域技术人员将认识到，并且利用不超过常规实验的手段能够获知并实施本文所描述的具体实施方式的等同替代。这样的等同替代方式包括在所附的权利要求中。从属权利要求中所披露的实施方式的任意组合都包括在本文公开内容的范围内。
本文中所引用的每一美国和外国专利以及在审专利申请和出版物的披露内容均以其全部内容结合于本文作为参考。
表6
Figure BDA0000075609680001071
附录1
序列、序列注释和序列比对
SEQ ID NO：60
pMP9043
gtgccgacgatagagcagacctcgctaaatatatctgcgagaatcaggattccattagctctaagctga
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SEQ ID NO：67
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SEQ ID NO：68
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Figure BDA0000075609680001152
51 RFTI SRDDAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR
Figure BDA0000075609680001154
101 WGR GTLVTVSSAS TGGGGSGGGG SGGGGSQSAL TQPASVSGSP
151  GQSITISC
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301  AKTCVADESA ENCDKSLHTL FGDKLCTVAT LRETYGEMAD CCAKQEPERN
351  ECFLQHKDDN PNLPRLVRPE VDVMCTAFHD NEETFLKKYL YEIARRHPYF
401  YAPELLFFAK RYKAAFTECC QAADKAACLL PKLDELRDEG KASSAKQRLK
451  CASLQKFGER AFKAWAVARL SQRFPKAEFA EVSKLVTDLT KVHTECCHGD
501  LLECADDRAD LAKYICENQD SISSKLKECC EKPLLEKSHC IAEVENDEMP
551  ADLPSLAADF VESKDVCKNY AEAKDVFLGM FLYEYARRHP DYSVVLLLRL
601  AKTYETTLEK CCAAADPHEC YAKVFDEFKP LVEEPQNLIK QNCELFEQLG
651  EYKFQNALLV RYTKKVPQVS TPTLVEVSRN LGKVGSKCCK HPEAKRMPCA
701  EDYLSVVLNQ LCVLHEKTPV SDRVTKCCTE SLVNRRPCFS ALEVDETYVP
751  KEFQAETFTF HADICTLSEK ERQIKKQTAL VELVKHKPKA TKEQLKAVMD
801  DFAAFVEKCC KADDKETCFA EEGKKLVAAS QAALGI
Figure BDA0000075609680001159
QVQLVQS GAE
851  VKKPGESLKI SCKGSGYSFT
Figure BDA00000756096800011510
WVRQM PGKGLEYMG
Figure BDA00000756096800011511
901
Figure BDA00000756096800011512
QVTI SVDKSVSTAY LQWSSLKPSD SAVYFCAR
Figure BDA00000756096800011513
951
Figure BDA00000756096800011514
WG QGTLVTVSSG GGGSSGGGSG GGGSQSVLTQ PPSVSAAPGQ
1001  KVTISC
Figure BDA00000756096800011515
W  YQQLPGTAPK LLIY
Figure BDA00000756096800011516
GVPDRFSGS
1051  KSGTSASLAI SGFRSEDEAD YYC FGGGTK LTVLG
在H3(加下划线的1-248，具有黑体倾斜的CDR)和B1D2(加下划线的841-1095，具有黑体倾斜的CDR)中突出CDR环。以点状下划线示出修饰HSA的连接物。
包含B2B3和mHSA的各种HAS接头结合物的序列对比
                       1                                         45
A5-mHSA-ML3.9       (1)QVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFNTYDMNWVRQAPGKGL
A5-mHSA-B1D2        (1)QVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFNTYDMNWVRQAPGKGL
A5-mHSA-F5B6H2      (1)QVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFNTYDMNWVRQAPGKGL
B12-mHSA-B1D2     (1)QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGL
B12-mHSA-F5B6H2   (1)QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGL
F4-mHSA-B1D2      (1)QVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL
F4-mHSA-F5B6H2    (1)QVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGL
H3-mHSA-B1D2      (1)QVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGL
H3-mHSA-F5B6H2    (1)QVQLQESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGL
                    46                                         90
A5-mHSA-ML3.9    (46)EWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAED
A5-mHSA-B1D2     (46)EWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAED
A5-mHSA-F5B6H2   (46)EWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAED
B12-mHSA-B1D2    (46)EWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRPED
B12-mHSA-F5B6H2  (46)EWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRPED
F4-mHSA-B1D2     (46)EWVSTISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED
F4-mHSA-F5B6H2   (46)EWVSTISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED
H3-mHSA-B1D2     (46)EWVANINRDGSASYYVDSVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAED
H3-mHSA-F5B6H2   (46)EWVANINRDGSASYYVDSVKGRFTISRDDAKNSLYLQMNSLRAED
                     91                                       135
A5-mHSA-ML3.9    (91)TAVYYCARDG---VATTPFDYWGQGTLVTVS---SGGGGSGGGGS
A5-mHSA-B1D2     (91)TAVYYCARDG---VATTPFDYWGQGTLVTVS---SGGGGSGGGGS
A5-mHSA-F5B6H2   (91)TAVYYCARDG---VATTPFDYWGQGTLVTVS---SGGGGSGGGGS
B12-mHSA-B1D2    (91)TAVYYCARDLGAKQWLEGFDYWGQGTLVTVSSASTGGGGSGGGGS
B12-mHSA-F5B6H2  (91)TAVYYCARDLGAKQWLEGFDYWGQGTLVTVSSASTGGGGSGGGGS
F4-mHSA-B1D2     (91)TAVYYCAKGYSSSWSEVASGYWGQGTLVTVSSASTGGGGSGGGGS
F4-mHSA-F5B6H2   (91)TAVYYCAKGYSSSWSEVASGYWGQGTLVTVSSASTGGGGSGGGGS
H3-mHSA-B1D2     (91)TAVYYCARDR----GVGYFDLWGRGTLVTVSSASTGGGGSGGGGS
H3-mHSA-F5B6H2   (91)TAVYYCARDR----GVGYFDLWGRGTLVTVSSASTGGGGSGGGGS
                     136                                      180
A5-mHSA-ML3.9   (130)GGGGSQSVLTQPPS-VSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQ
A5-mHSA-B1D2    (130)GGGGSQSVLTQPPS-VSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQ
A5-mHSA-F5B6H2  (130)GGGGSQSVLTQPPS-VSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQ
B12-mHSA-B1D2   (136)GGGGSSYELTQDPA-VSVALGQTVRITCQGDSLRS---YYASWYQ
B12-mHSA-F5B6H2 (136)GGGGSSYELTQDPA-VSVALGQTVRITCQGDSLRS---YYASWYQ
F4-mHSA-B1D2    (136)GGGGSAIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIR---NDLGWYQ
F4-mHSA-F5B6H2  (136)GGGGSAIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIR---NDLGWYQ
H3-mHSA-B1D2    (132)GGGGSQSALTQPAS-VSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNFVSWYQ
H3-mHSA-F5B6H2  (132)GGGGSQSALTQPAS-VSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNFVSWYQ
                     181                                      225
A5-mHSA-ML3.9   (174)QLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAED
A5-mHSA-B1D2    (174)QLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAED
A5-mHSA-F5B6H2  (174)QLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAED
B12-mHSA-B1D2   (177)QKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSTSGNSASLTITGAQAED
B12-mHSA-F5B6H2 (177)QKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSTSGNSASLTITGAQAED
F4-mHSA-B1D2    (178)QKAGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDD
F4-mHSA-F5B6H2  (178)QKAGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDD
H3-mHSA-B1D2    (176)QHPGKAPKLMIYDVSDRPSGVSDRFSGSKSGNTASLIISGLQADD
H3-mHSA-F5B6H2  (176)QHPGKAPKLMIYDVSDRPSGVSDRFSGSKSGNTASLIISGLQADD
                    226                                       270
A5-mHSA-ML3.9   (219)EADYYCQSYDSS-LSALFGGGTKLTVLG-AASDAHKSEVAHRFKD
A5-mHSA-B1D2    (219)EADYYCQSYDSS-LSALFGGGTKLTVLG-AASDAHKSEVAHRFKD
A5-mHSA-F5B6H2  (219)EADYYCQSYDSS-LSALFGGGTKLTVLG-AASDAHKSEVAHRFKD
B12-mHSA-B1D2   (222)EADYYCNSRDSSGNHWVFGGGTKVTVLG-AASDAHKSEVAHRFKD
B12-mHSA-F5B6H2 (222)EADYYCNSRDSSGNHWVFGGGTKVTVLG-AASDAHKSEVAHRFKD
F4-mHSA-B1D2    (223)FATYFCQQAHSF--PPTFGGGTKVEIKRGAASDAHKSEVAHRFKD
F4-mHSA-F5B6H2  (223)FATYFCQQAHSF--PPTFGGGTKVEIKRGAASDAHKSEVAHRFKD
H3-mHSA-B1D2    (221)EADYYCSSYGSSSTHVIFGGGTKVTVLG-AASDAHKSEVAHRFKD
H3-mHSA-F5B6H2  (221)EADYYCSSYGSSSTHVIFGGGTKVTVLG-AASDAHKSEVAHRFKD
                    271                                       315
A5-mHSA-ML3.9   (262)LGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES
A5-mHSA-B1D2    (262)LGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES
A5-mHSA-F5B6H2  (262)LGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES
B12-mHSA-B1D2   (266)LGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES
B12-mHSA-F5B6H2 (266)LGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES
F4-mHSA-B1D2    (266)LGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES
F4-mHSA-F5B6H2  (266)LGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES
H3-mHSA-B1D2    (265)LGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES
H3-mHSA-F5B6H2  (265)LGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADES
                   316                                        360
A5-mHSA-ML3.9   (307)AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFL
A5-mHSA-B1D2    (307)AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFL
A5-mHSA-F5B6H2  (307)AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFL
B12-mHSA-B1D2   (311)AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFL
B12-mHSA-F5B6H2 (311)AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFL
F4-mHSA-B1D2    (311)AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFL
F4-mHSA-F5B6H2  (311)AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFL
H3-mHSA-B1D2    (310)AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFL
H3-mHSA-F5B6H2  (310)AENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFL
                    361                                       405
A5-mHSA-ML3.9   (352)QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPY
A5-mHSA-B1D2    (352)QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPY
A5-mHSA-F5B6H2  (352)QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPY
B12-mHSA-B1D2   (356)QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPY
B12-mHSA-F5B6H2 (356)QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPY
F4-mHSA-B1D2    (356)QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPY
F4-mHSA-F5B6H2  (356)QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPY
H3-mHSA-B1D2    (355)QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPY
H3-mHSA-F5B6H2  (355)QHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPY
                    406                                       450
A5-mHSA-ML3.9   (397)FYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASS
A5-mHSA-B1D2    (397)FYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASS
A5-mHSA-F5B6H2  (397)FYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASS
B12-mHSA-B1D2   (401)FYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASS
B12-mHSA-F5B6H2 (401)FYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASS
F4-mHSA-B1D2    (401)FYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASS
F4-mHSA-F5B6H2  (401)FYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASS
H3-mHSA-B1D2    (400)FYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASS
H3-mHSA-F5B6H2  (400)FYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASS
                   451                                495
A5-mHSA-ML3.9   (442)AKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDL
A5-mHSA-B1D2    (442)AKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDL
A5-mHSA-F5B6H2  (442)AKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDL
B12-mHSA-B1D2   (446)AKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDL
B12-mHSA-F5B6H2 (446)AKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDL
F4-mHSA-B1D2    (446)AKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDL
F4-mHSA-F5B6H2  (446)AKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDL
H3-mHSA-B1D2    (445)AKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDL
H3-mHSA-F5B6H2  (445)AKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDL
                     496                                      540
A5-mHSA-ML3.9   (487)TKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPL
A5-mHSA-B1D2    (487)TKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPL
A5-mHSA-F5B6H2    (487)TKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPL
B12-mHSA-B1D2     (491)TKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPL
B12-mHSA-F5B6H2   (491)TKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPL
F4-mHSA-B1D2      (491)TKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPL
F4-mHSA-F5B6H2    (491)TKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPL
H3-mHSA-B1D2      (490)TKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPL
H3-mHSA-F5B6H2    (490)TKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPL
                      541                                       585
A5-mHSA-ML3.9     (532)LEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLG
A5-mHSA-B1D2      (532)LEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLG
A5-mHSA-F5B6H2    (532)LEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLG
B12-mHSA-B1D2     (536)LEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLG
B12-mHSA-F5B6H2   (536)LEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLG
F4-mHSA-B1D2      (536)LEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLG
F4-mHSA-F5B6H2    (536)LEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLG
H3-mHSA-B1D2      (535)LEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLG
H3-mHSA-F5B6H2    (535)LEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLG
                       586                                      630
A5-mHSA-ML3.9     (577)MFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKV
A5-mHSA-B1D2      (577)MFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKV
A5-mHSA-F5B6H2    (577)MFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKV
B12-mHSA-B1D2     (581)MFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKV
B12-mHSA-F5B6H2   (581)MFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKV
F4-mHSA-B1D2      (581)MFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKV
F4-mHSA-F5B6H2    (581)MFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKV
H3-mHSA-B1D2      (580)MFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKV
H3-mHSA-F5B6H2    (580)MFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKV
                       631                                      675
A5-mHSA-ML3.9     (622)FDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQV
A5-mHSA-B1D2      (622)FDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQV
A5-mHSA-F5B6H2    (622)FDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQV
B12-mHSA-B1D2     (626)FDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQV
B12-mHSA-F5B6H2   (626)FDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQV
F4-mHSA-B1D2      (626)FDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQV
F4-mHSA-F5B6H2    (626)FDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQV
H3-mHSA-B1D2      (625)FDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQV
H3-mHSA-F5B6H2    (625)FDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQV
                      676                                       720
A5-mHSA-ML3.9     (667)STPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL
A5-mHSA-B1D2      (667)STPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL
A5-mHSA-F5B6H2    (667)STPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL
B12-mHSA-B1D2     (671)STPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL
B12-mHSA-F5B6H2   (671)STPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL
F4-mHSA-B1D2      (671)STPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL
F4-mHSA-F5B6H2    (671)STPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL
H3-mHSA-B1D2      (670)STPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL
H3-mHSA-F5B6H2    (670)STPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL
                     721                                         765
A5-mHSA-ML3.9     (712)HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFT
A5-mHSA-B1D2      (712)HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFT
A5-mHSA-F5B6H2    (712)HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFT
B12-mHSA-B1D2     (716)HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFT
B12-mHSA-F5B6H2   (716)HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFT
F4-mHSA-B1D2      (716)HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFT
F4-mHSA-F5B6H2    (716)HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFT
H3-mHSA-B1D2     (715)HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFT
H3-mHSA-F5B6H2   (715)HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFQAETFT
                     766                                       810
A5-mHSA-ML3.9    (757)FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAA
A5-mHSA-B1D2     (757)FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAA
A5-mHSA-F5B6H2   (757)FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAA
B12-mHSA-B1D2    (761)FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAA
B12-mHSA-F5B6H2  (761)FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAA
F4-mHSA-B1D2     (761)FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAA
F4-mHSA-F5B6H2   (761)FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAA
H3-mHSA-B1D2     (760)FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAA
H3-mHSA-F5B6H2   (760)FHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAA
                     811                                       855
A5-mHSA-ML3.9    (802)FVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAAALQVQLVQSGA
A5-mHSA-B1D2     (802)FVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAAALQVQLVQSGA
A5-mHSA-F5B6H2   (802)FVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAAALQVQLVESGG
B12-mHSA-B1D2    (806)FVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAAALQVQLVQSGA
B12-mHSA-F5B6H2  (806)FVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAAALQVQLVESGG
F4-mHSA-B1D2     (806)FVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAAALQVQLVQSGA
F4-mHSA-F5B6H2   (806)FVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAAALQVQLVESGG
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附录2
抗癌剂
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其它实施方式
虽然在具体实施方式中描述了本发明，但应当明了，它能够进一步改进并且本申请用来涵盖本发明的任何变化、应用、或改进，其一般遵循本发明的原则并且包括与本发明披露内容不同的差异，其属于本发明相关领域中的已知的或通常的作法并且适用于上文陈述的基本特点。
本说明书中提及的所有专利和专利申请以引用方式结合于本文，相当于每个指出的独立的专利或专利申请专门并特别地通过引用以其全文结合于本文。
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Claims (36)

1.一种HSA接头结合物，包含：
i)包含在SEQ ID NO：6-15中的任何一个所列出的氨基酸序列的人血清白蛋白(HSA)接头；以及
ii)选自由抗体、单链Fv分子、双特异性单链Fv((scFv’)2)分子、域抗体、双抗体、三抗体、激素、Fab片段、F(ab’)2分子、串联scFv(taFv)片段、受体、配体、适体、以及它们的生物活性片段组成的组中的第一和第二结合部分，其中所述第一结合部分结合于所述HSA接头的氨基末端，所述第二结合部分结合于所述HSA接头的羧基末端。
2.根据权利要求1所述的HSA接头结合物，其中所述HSA接头包含在SEQ ID NO：1中所列出的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的HSA接头结合物，其中，所述第一结合部分特异性地结合ErbB3，所述第二结合部分特异性地结合ErbB2。
4.具有或包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HSA接头结合物B2B3-1。
5.具有或包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HSA接头结合物B2B3-2。
6.具有或包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HSA接头结合物B2B3-3。
7.具有或包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的HSA接头结合物B2B3-4。
8.具有或包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HSA接头结合物B2B3-5。
9.具有或包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的HSA接头结合物B2B3-6。
10.具有或包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的HSA接头结合物B2B3-7。
11.具有或包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的HSA接头结合物B2B3-8。
12.具有或包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的HSA接头结合物B2B3-9。
13.具有或包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的HSA接头结合物B2B3-10。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的HSA接头结合物与药用载体、赋形剂、或稀释剂混合。
15.一种用于治疗患有疾病或紊乱的患者的方法，其中所述方法包括向所述哺乳动物给予有效量的权利要求1-13中任一项所述的HSA接头结合物。
16.一种组合物，包含与一种或多种治疗剂联用的权利要求1-13中任一项所述的HAS接头结合物，所述治疗剂选自由以下组成的组中：环磷酰胺、喜树碱、高喜树碱、秋水仙碱、combrestatin、combrestatin、根霉素、多拉司他汀(dolistatin)、安丝菌素p3、类美登碱、auristatin、卡奇霉素(caleachimicin)、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、多柔比星、紫杉醇、多西他赛、顺铂、卡铂、他莫昔芬、雷洛昔芬、来曲唑、表柔比星、贝伐单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、以及它们的衍生物。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述治疗剂是曲妥珠单抗。
18.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述HSA接头结合物是具有或包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HSA接头结合物B2B3-1。
19.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述治疗剂是曲妥珠单抗且所述HSA接头结合物是具有或包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HSA接头结合物B2B3-1。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中，当以第一剂量的所述治疗剂和第二剂量的所述HSA接头结合物利用人乳腺癌细胞在裸鼠人异种移植模型中进行测试时，所述组合提供的效力比仅以第一剂量的所述治疗剂或仅以第二剂量的所述HSA接头结合物在所述相同的模型中提供的效力更大。
21.根据权利要求20所述的组合物，剂量形式为给予受治疗者以提供至少3mg/kg的B2B3-1和至少0.1mg/kg的曲妥珠单抗。
22.根据权利要求21所述的组合物，剂量形式为适合于给予受治疗者以提供3mg/kg的B2B3-1和0.1mg/kg的曲妥珠单抗。
23.根据权利要求21所述的组合物，剂量形式为适合于给予受治疗者以提供10mg/kg的B2B3-1和1mg/kg的曲妥珠单抗。
24.根据权利要求22所述的组合物，其中，向受治疗者给予3mg/kg的B2B3-1和0.1mg/kg的曲妥珠单抗比仅用3mg/kg的B2B3-1或仅用0.1mg/kg的曲妥珠单抗对匹配受治疗者的治疗更有效。
25.根据权利要求23所述的组合物，其中，向受治疗者给药以提供10mg/kg的B2B3-1和1mg/kg的曲妥珠单抗比仅用10mg/kg的B2B3-1或仅用1mg/kg的曲妥珠单抗对匹配受治疗者的治疗更有效。
26.根据权利要求22所述的组合物，其中，当向多个受治疗者给药以为每一个提供3mg/kg的B2B3-1和0.1mg/kg的曲妥珠单抗时，在20天后会诱导超过10％的所述受治疗者体内的肿瘤消退。
27.根据权利要求23所述的组合物，其中，当向多个受治疗者给药以为每一个提供10mg/kg的B2B3-1和1mg/kg的曲妥珠单抗时，在20天后会诱导至少50％的所述受治疗者体内的肿瘤消退。
28.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述治疗剂是拉帕替尼。
29.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述治疗剂是紫杉烷。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中，所述治疗剂是多西他赛。
31.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述治疗剂是来曲唑。
32.根据权利要求3所述的HSA接头结合物，其中，所述第一结合部分以约16nM的Kd结合ErBb3且所述第二结合部分以约0.3nM的Kd结合ErbB2。
33.一种治疗受治疗者的方法，所述受治疗者需要肿瘤治疗，所述治疗包括向所述受治疗者给予有效量的权利要求1-14和32中任一项所述的HSA接头结合物。
34.一种治疗受治疗者的方法，所述受治疗者需要肿瘤治疗，所述治疗包括向所述受治疗者给予有效量的权利要求16-30中任一项所述的组合物。
35.权利要求1-14和32中任一项所述的HSA接头结合物在制备用于***的药物中的应用。
36.权利要求16-30中任一项所述的组合物在制备用于***的药物中的应用。
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