CN1766088A - 可高产蛋白酶的芽孢杆菌及其诱变选育方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及的可高产蛋白酶的芽孢杆菌，其分类命名为芽孢杆菌Bacillus sp，于2004年6月28日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，保藏号为CGMCC No.1180。其为以保藏号CGMCC No1.769的枯草芽孢杆菌CAU208作为出发菌株，将其单细胞悬浮液依次并循环进行“变紫外线诱变→亚硝基胍诱变→紫外线与亚硝基胍复合诱变”，最后得到一株可高产蛋白酶的芽孢杆菌；可用于液体发酵制备大豆生物活性肽饲料添加剂、酶制剂、富酶益生素等。所制备的肽类饲料添加剂具有多种用途：提高禽蛋品质；满足消化***尚未成熟动物的营养需要；补充患过敏性疾病动物的蛋白需要或用来作为乳猪、仔猪等幼龄动物的优质蛋白源，防止豆粕(饼)等蛋白饲料对其产生的肠道粘膜过敏和水肿等疾病。
Description
发明领域
本发明属于生物技术领域，具体地说是涉及一种可高产蛋白酶的芽孢杆菌及其诱变选育方法和用途。
背景技术
许多年来在动物饲养和饲料中广泛使用抗生素、化学合成药物、激素等促生长保健剂，导致了畜禽和水产产品中药物残留严重、畜禽产品品质下降、细菌耐药性增强、耐药菌株增多，给人类安全和生态环境带来很大威胁。由于抗生素的诸多副作用，特别是近年来消费者对食品安全问题的关注，世界各国都在纷纷禁用或限制抗生素的使用，并加速开发、推广新型安全高效的绿色饲料添加剂，以减少或替代抗生素等药物添加剂。
微生态制剂和大豆生物活性肽因其独特的理化特性和生物学功能而成为新型绿色饲料添加剂领域的研究热点。目前国内市场上可见到大豆肽，多为进口产品，价格昂贵，主要是通过酶法来生产的。酶法是应用蛋白酶如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等植物蛋白酶或用胰蛋白酶、胃蛋白酶等动物蛋白酶，将大豆蛋白降解为小肽，但这种方法生产的大豆肽容易产生令人难以接受的腥味或苦味，且生产成本高，不适于在畜牧业中应用；微生物发酵法与酶法相比可将微生物产酶和酶解合二为一，缩短工序，降低成本，且大豆肽产品有天然的芳香味，口感好。
在工业微生物发酵生产的过程中，决定生产水平和生产成本高低的最主要因素有三个：生产菌种、发酵工艺和后提取工艺或后加工工艺，其中，最重要的是生产菌种的特性。从自然界分离出的菌种，由于生产能力低，往往不能满足工业上的需要。因为在正常生理条件下，微生物依靠其代谢调节***，趋向于快速生长和繁殖。但是，发酵工业的需要与此相反，需要微生物能够积累大量的代谢产物，如酶或其它活性成分等。为此，采用种种方法来打破菌种的正常代谢，使之失去自我保守性的调节控制，从而大量积累我们所需要的目标代谢产物(如蛋白酶)。要达至此目的，主要措施就是进行菌种选育，如进行物理和化学诱变等。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术制备活性肽饲料添加剂的成本高而不易于在动物养殖行业推广使用的缺陷，通过物理和化学的复合诱变选育一株可高产蛋白酶的芽孢杆菌，使其能经发酵生产出在饲料中的添加量低、功能明确，并具有提高动物对营养素(如蛋白质、矿物质、维生素等)吸收利用率、提高奶、肉、蛋产量和生产能力，且改善奶、肉、蛋的品质和风味，刺激动物免疫器官发育，提高抗病力和减少发病率，并能明显改善水产动物养殖水质，提高水产动物生长速度和存活率，能广泛用于禽、牛、羊、猪、水产和经济动物，可作为抗生素的替代品等优点的活性肽饲料添加剂。
本发明的另一目的在于提供一种可高产蛋白酶的芽孢杆菌的诱变选育方法。
本发明的再一目的在于该可高产蛋白酶的芽孢杆菌用于液体发酵制备大豆生物活性肽饲料添加剂或酶制剂、富酶益生素等的应用。
本发明的技术方案如下：
本发明提供的可高产蛋白酶的芽孢杆菌，其特征在于，该可高产蛋白酶的芽孢杆菌的分类命名为：芽孢杆菌Bacillus sp，于2004年6月28日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1180。
细胞呈直杆状，电子显微镜测量为0.5-0.6×1.1-3.5μm，常以成对或链状排列；大多数在幼龄培养时呈现革兰氏阳性；鞭毛侧生，能运动。芽孢呈椭圆形、柱状、圆形或卵圆，中生或偏生，0.8×1.5-1.8μm，能抗许多不良环境游，离孢子表面着色弱。洋菜培养基上的菌落圆形，表面色暗，可以起皱，可以变成奶油色或褐色；菌落的形状随培养基成分不同而有很大变化；当洋菜培养基表面潮湿时，菌落易于扩散；在洋菜上生长的菌苔在液体中不易扩散，在培养液中色暗、皱褶、完整的膜、清度混浊或不混浊。好氧或兼性厌氧，具有对热、pH和盐各种多样性的生理特性。化能异养菌，具有发酵或呼吸代谢类型，通常接触酶阳性。生长温度最高为45-55℃，最低为5-20℃。
本发明提供的可高产蛋白酶的芽孢杆菌的诱变选育方法，其诱变选育步骤如下：
1)以选购自《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，保藏号为CGMCCNo 1.769的枯草芽孢杆菌CAU208作为出发菌株；
2)诱变选育
(1)制备出发菌株CAU208单细胞悬浮液
将出发菌株芽孢杆菌CAU208接种于灭菌后的液体培养基A中，28～32℃摇瓶培养36～48h，离心，用无菌生理盐水洗涤，置于无菌的装有玻璃珠的三角瓶内，振荡，使其分散成单细胞悬液，用无菌玻璃棉过滤，得到出发菌株CAU208单细胞菌悬液；
所述的液体培养基A所含组分及配比为：蛋白胨1.3～2.5g，葡萄糖3～5g，糖蜜3～5g，可溶性淀粉10～20g，蔗糖10～30g，牛肉膏2～3g，酵母浸粉3.5～5g，水1000ml；
(2)紫外线诱变
调节步骤(1)所得出发菌株CAU208菌悬液的活菌数为106～108个/ml之间，液层厚度0.2～0.4cm；进行紫外线诱变，紫外线诱变所用紫外灯功率15～18W，照射时间2～5min，照射距离25～30cm；照射后立即稀释涂布在初筛分离培养基B上，27～32℃培养30～36h，挑选50～70个单菌落，进行摇瓶发酵复筛，用茚三酮法显色法测定水解度，选择2～4株水解能力最高的菌株，再分别作摇瓶发酵复筛，选出一株水解能力最高且稳定性好的菌株CAU208-N，并制成菌悬液用于下一步亚硝基胍诱变；
所述的初筛分离培养基B所含组分及配比为：蛋白胨1～3g，酵母浸粉2～4g，葡萄糖4～6g，脱脂奶粉5～8g，琼脂10～13g，水1000ml；
所述的摇瓶发酵复筛的步骤是：
制备发酵液：将氮源、碳源和水按重量份配比均匀混合后，在0.1～0.15mpa压力下，120～122℃灭菌，再冷却至30～37℃，制成发酵液；其中，氮源与碳源的重量份之和与水的重量份的配比为3～6∶100，氮源与碳源重量份配比为2～4∶1；所述氮源为豆粕粉、大豆分离蛋白粉等；所述碳源为玉米面或玉米面和糖蜜等；
将得到的50～70个单菌落种子液接种于容量为250ml装有100ml发酵液的三角瓶中，种子液和发酵液按体积比0.5～1.0∶10的比例均匀混合，以110～140rpm的速度在摇床上进行发酵；发酵温度为30℃～35℃，发酵结束时用茚三酮法显色法测定水解度；
(3)亚硝基胍诱变
将步骤(2)所得CAU208-N菌悬液的活菌数调至105～108个/ml，菌悬液中加入终浓度为800～1000ug/ml的亚硝基胍，30～35℃水浴处理20～30min，间歇震荡；诱变后立即涂于初筛分离培养基B上，27～32℃培养30～36h，挑选50～70个单菌落，进行摇瓶发酵复筛，得到水解能力最高的一株菌株CAU208-N1，并制成菌悬液用于下一步紫外线与亚硝基胍复合诱变；所述摇瓶发酵复筛的方法同步骤(2)；
(4)紫外线与亚硝基胍复合诱变
将步骤(3)所得CAU208-N1菌悬液的活菌数调至107～109个/m1，菌悬液中加入终浓度为900～1300ug/ml的亚硝基胍液，30～35℃水浴处理20～30min，间歇震荡，取亚硝基胍处理后的液层厚度0.2～0.4cm；进行紫外线诱变，所用紫外灯功率15～18W，照射时间6～9min，距离25～30cm；紫外照射诱变后立即涂于初筛分离培养基B上，27～32℃培养30～36h，挑选50～70个单菌落，进行摇瓶发酵复筛，得到水解能力最高的一株菌株CAU208-N5；所述的摇瓶发酵复筛方法同步骤(2)；
(5)循环重复紫外线诱变→亚硝基胍诱变→紫外线与亚硝基胍复合诱变2次，最后得到高产菌株CAU208-1。
本发明提供的可高产蛋白酶的芽孢杆菌的诱变选育方法，还包括将得到的高产菌株CAU208-1保存在固体斜面培养基C上，4℃保藏，每3个月转接一次；
所述的固体斜面培养基组成为：蛋白胨1.3～2.5g，葡萄糖3～5g，糖蜜3～5g，可溶性淀粉10～20g，蔗糖10～30g，牛肉膏2～3g，酵母浸粉3.5～5g，琼脂10～13g水1000ml。
本发明的可高产蛋白酶的芽孢杆菌的用途，其特征在于，该可高产蛋白酶的芽孢杆菌用于液体发酵制备大豆生物活性肽饲料添加剂或用于制备益生素、酶制剂等微生态饲料添加剂。
本发明的优点：
1.用物理和化学诱变剂相结合进行处理，能多角度的改变微生物的遗传性能，且循环处理多次，保证变异菌株的稳定性；
2.诱变剂来源方便，价格低廉，效果明显；
3.用其发酵制备大豆活性肽饲料添加剂可明显降低发酵成本，使大豆活性肽在畜牧业中的应用成为可能；
4.诱变选育的高产菌株可用于制备饲用益生素；
5.诱变选育的高产菌株可用于制备饲用酶制剂；
6.诱变选育的高产菌株可用于制备富酶益生素饲料添加剂。
具体实施方式
实施例1、诱变选育本发明的可高产蛋白酶的芽孢杆菌
按照本发明提供的诱变选育方法，诱变选育可高产蛋白酶的芽孢杆菌，其步骤如下：
1、以选购自《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，保藏号为CGMCCNo 1.769的枯草芽孢杆菌CAU208作为出发菌株；
2、诱变选育：
(1)制备出发菌株CAU208单细胞悬浮液
将出发菌株芽孢杆菌CAU208接种于灭菌后的液体培养基A中，30℃摇瓶培养36h，取1ml种子液离心，用无菌生理盐水洗涤3次，置于无菌的装有玻璃珠的三角瓶内，振荡20min，使其分散成单细胞悬液，用无菌玻璃棉过滤，得到出发菌株CAU208单细胞菌悬液；
所述的液体培养基A所含组分及配比为：蛋白胨1.3g，葡萄糖3g，糖蜜3g，马铃薯浸液50ml(其中含可溶性淀粉10g)，蔗糖10g，牛肉膏2g，酵母浸粉3.5g，水1000ml；
(2)紫外线诱变：
调节步骤(1)所得出发菌株CAU208菌悬液的活菌数为107个/ml，液层厚度0.2cm；进行紫外线诱变，紫外线诱变所用紫外灯功率15W，照射时间2min，照射距离25cm；照射后立即稀释涂布在初筛分离培养基B上，27℃培养30h，挑选50个水解圈大(该菌产生的蛋白酶可分解培养基中的蛋白质从而产生水解圈)的单菌落，进行摇瓶发酵复筛，用茚三酮法显色法测定水解度，选择2株水解能力最高的菌株，再分别作摇瓶发酵复筛，选出一株水解能力最高且稳定性好的菌株CAU208-N，并制成菌悬液用于下一步亚硝基胍诱变；
所述的初筛分离培养基B所含组分及配比为：蛋白胨3g，酵母浸粉4g，葡萄糖6g，脱脂奶粉5g，琼脂13g，水1000ml；
所述的摇瓶发酵复筛的步骤是：
(2-1)制备发酵液：将氮源、碳源和水按重量份配比均匀混合后，在0.15mpa压力下，120℃灭菌，再冷却至37℃，制成发酵液；其中，氮源与碳源的重量份之和与水的重量份的配比为3∶100，氮源与碳源重量份配比为2∶1；所述氮源为粉碎至40目的大豆分离蛋白粉；所述碳源为玉米面和糖蜜；
(2-2)将得到的50个单菌落种子液分别与发酵液按体积比0.5∶10的比例均匀混合；以110rpm的速度在摇床上进行发酵；发酵温度为30℃，发酵结束时用茚三酮法显色法测定水解度。
(3)亚硝基胍诱变
将CAU208-N菌悬液的活菌数调至105个/ml，加入至浓度为1000ug/ml的亚硝基胍中，30℃水浴处理30min，间歇震荡；诱变后立即涂于初筛分离培养基B上，32℃培养36h，挑选70个单菌落，进行摇瓶发酵复筛，其摇瓶发酵复筛的方法同步骤(2)，得到水解能力最高的一株菌株CAU208-N1，并制成菌悬液用于下一步紫外线与亚硝基胍复合诱变；
(4)紫外线与亚硝基胍复合诱变
将CAU208-N1菌悬液的活菌数调至109个/ml加入至亚硝基胍液，使亚硝基胍终浓度为1300ug/ml，30℃水浴处理20min，间歇震荡，取亚硝基胍处理后的液层厚度0.4cm；进行紫外线诱变，紫外线诱变所用紫外灯功率15W，照射时间6min，距离25cm；诱变后立即涂于初筛分离培养基B上，27℃培养30h，挑选70个单菌落，进行摇瓶发酵复筛，其摇瓶发酵复筛同步骤(2)，得到水解能力最高的一株菌株CAU208-N5；
(5)循环重复紫外线诱变→亚硝基胍诱变→紫外线与亚硝基胍复合诱变2次，最后得到高产菌株CAU208-1，于2004年6月28日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其分类命名为：芽孢杆菌Bacillus sp，其保藏号为CGMCCNo.1180。
将得到的高产菌株CAU208-1于4℃保藏在固体斜面培养基C上，每3个月转接一次；
所述的固体斜面培养基C组成为：蛋白胨2.5g，葡萄糖3g，糖蜜5g，可溶性淀粉20g，蔗糖30g，牛肉膏3g，酵母浸粉3.5g，琼脂10g，水1000ml。
实施例2、诱变选育本发明的可高产蛋白酶的芽孢杆菌
按照本发明提供的诱变选育方法，诱变选育可高产蛋白酶的芽孢杆菌，其步骤如下：
1、以选购自《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，保藏号为CGMCCNo 1.769的枯草芽孢杆菌CAU208作为出发菌株；
2、诱变选育：
(1)制备出发菌株CAU208单细胞悬浮液
将出发菌株芽孢杆菌CAU208接种于灭菌后的液体培养基A中，28℃摇瓶培养48h，取1ml种子液离心，用无菌生理盐水洗涤3次，置于无菌的装有玻璃珠的三角瓶内，振荡20min，使其分散成单细胞悬液，用无菌玻璃棉过滤，得出发菌株CAU208单细胞菌悬液；
所述的液体培养基A所含组分及配比为：蛋白胨2.5g，葡萄糖4g，糖蜜4g，马铃薯浸液50ml(其中含可溶性淀粉20g)，蔗糖20g，牛肉膏3g，酵母浸粉5g，水1000ml；
(2)紫外线诱变：
调节步骤(1)所得出发菌株CAU208菌悬液的活菌数为108个/ml之间，液层厚度0.4cm；进行紫外线诱变，紫外线诱变所用紫外灯功率18W，照射时间5min，照射距离25cm；照射后立即稀释涂布在初筛分离培养基B上，27℃培养36h，挑选70个单菌落，进行摇瓶发酵复筛，测定水解度，选择3株水解能力最高的菌株，再分别作摇瓶发酵复筛，选出一株水解能力最高且稳定性好的菌株CAU208-N，并制成菌悬液用于下一步亚硝基胍诱变；
所述的初筛分离培养基B所含组分及配比为：蛋白胨1g，酵母浸粉3g，葡萄糖4g，脱脂奶粉8g，琼脂10g，水1000ml；
所述的摇瓶发酵复筛的步骤是：
(2-1)制备发酵液：将氮源、碳源和水按重量份配比均匀混合后，在0.1mpa压力下，122℃灭菌，再冷却至30℃，制成发酵液；其中，氮源与碳源的重量份之和与水的重量份的配比为6∶100，氮源与碳源重量份配比为4∶1；所述氮源为粉碎至40目的大豆分离蛋白粉；所述碳源为玉米面和糖蜜；
(2-2)将得到的70个单菌落种子液和发酵液按体积比1.0∶10的比例均匀混合，在摇床上进行摇瓶发酵；
(3)亚硝基胍诱变
将CAU208-N菌悬液的活菌数调至107个/ml，加入至浓度为800ug/ml的亚硝基胍中，35℃水浴处理20min，间歇震荡；诱变后立即涂于初筛分离培养基B上，27℃培养30h，挑选50个单菌落，进行摇瓶发酵复筛，其摇瓶发酵复筛的方法同步骤(2)，得到水解能力最高的一株菌株CAU208-N1，并制成菌悬液用于下一步紫外线与亚硝基胍复合诱变；
(4)紫外线与亚硝基胍复合诱变
将CAU208-N1菌悬液的活菌数调至107个/ml加入至亚硝基胍液，使亚硝基胍终浓度为900ug/ml，35℃水浴处理30min，间歇震荡，取亚硝基胍处理后的液层厚度0.2cm；进行紫外线诱变，紫外线诱变所用紫外灯功率18W，照射时间9min，距离30cm；诱变后立即涂于初筛分离培养基B上，32℃培养36h，挑选70个单菌落，进行摇瓶发酵复筛，其摇瓶发酵复筛同步骤(2)，得到水解能力最高的一株菌株CAU208-N5；
(5)循环重复紫外线诱变→亚硝基胍诱变→紫外线与亚硝基胍复合诱变2次，最后得到高产菌株CAU208-1。
将得到的高产菌株CAU208-1于4℃保藏在固体斜面培养基C上，每3个月转接一次；
所述的固体斜面培养基C组成为：蛋白胨2，葡萄糖4g，糖蜜4g，可溶性淀粉15g，蔗糖20g，牛肉膏2.5g，酵母浸粉4g，琼脂12g，水1000ml。
实施例3、诱变选育本发明的可高产蛋白酶的芽孢杆菌
按照本发明提供的诱变选育方法，诱变选育可高产蛋白酶的芽孢杆菌，其步骤如下：
1、以选购自《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，保藏号为CGMCCNo 1.769的枯草芽孢杆菌CAU208作为出发菌株；
2、诱变选育：
(1)制备出发菌株CAU208单细胞悬浮液
将出发菌株芽孢杆菌CAU208接种于灭菌后的液体培养基A中，30℃摇瓶培养42h，取1ml种子液离心，用无菌生理盐水洗涤3次，置于无菌的装有玻璃珠的三角瓶内，振荡20min，使其分散成单细胞悬液，用无菌玻璃棉过滤，得到出发菌株CAU208单细胞菌悬液；
所述的液体培养基A所含组分及配比为：蛋白胨2g，葡萄糖5g，糖蜜5g，马铃薯浸液50ml(其中含可溶性淀粉15g)，蔗糖30g，牛肉膏2.5g，酵母浸粉4g，水1000ml；
(2)紫外线诱变
调节步骤(1)所得的出发菌株CAU208菌悬液的活菌数为106个/ml，液层厚度0.3cm；进行紫外线诱变，紫外线诱变所用紫外灯功率17W，照射时间3.5min，照射距离28cm；照射后立即稀释涂布在初筛分离培养基B上，30℃培养33h，挑选60个单菌落，进行摇瓶发酵复筛，测定水解度，选择4株水解能力最高的菌株，再分别作摇瓶发酵复筛，选出一株水解能力最高且稳定性好的菌株CAU208-N，并制成菌悬液用于下一步亚硝基胍诱变；
所述的初筛分离培养基B所含组分及配比为：蛋白胨2g，酵母浸粉2g，葡萄糖5g，脱脂奶粉7g，琼脂11g，水1000ml；
所述的摇瓶发酵复筛的步骤是：
(2-1)制备发酵液：将氮源、碳源和水按重量份配比均匀混合后，在0.12mpa压力下，121℃灭菌，再冷却至35℃，制成发酵液；其中，氮源与碳源的重量份之和与水的重量份的配比为4∶100，氮源与碳源重量份配比为3∶1；所述氮源为粉碎至40目的大豆分离蛋白粉；所述碳源为玉米面；
(2-2)将得到的60个单菌落种子液和发酵液按体积比10∶0.5的比例均匀混合，在摇床上进行摇瓶发酵；
(3)亚硝基胍诱变
将CAU208-N菌悬液的活菌数调至108个/ml，加入至浓度为900ug/ml的亚硝基胍中，33℃水浴处理25min，间歇震荡；诱变后立即涂于初筛分离培养基B上，30℃培养33h，挑选65个单菌落，进行摇瓶发酵复筛，其摇瓶发酵复筛的方法同步骤(2)，得到水解能力最高的一株菌株CAU208-N1，并制成菌悬液用于下一步紫外线与亚硝基胍复合诱变；
(4)紫外线与亚硝基胍复合诱变
将CAU208-N1菌悬液的活菌数调至108个/ml加入至亚硝基胍液，使亚硝基胍终浓度为1100ug/ml，31℃水浴处理25min，间歇震荡，取亚硝基胍处理后的液层厚度0.3cm；进行紫外线诱变，紫外线诱变所用紫外灯功率17W，照射时间7min，距离28cm；诱变后立即涂于初筛分离培养基B上，29℃培养34h，挑选55个单菌落，进行摇瓶发酵复筛，其摇瓶发酵复筛同步骤(2)，得到水解能力最高的一株菌株CAU208-N5；
(5)按步骤(4)循环重复紫外线诱变→亚硝基胍诱变→紫外线与亚硝基胍复合诱变2次，最后得到高产菌株CAU208-1。
将得到的高产菌株CAU208-1于4℃保藏在固体斜面培养基C上，每3个月转接一次；
所述的固体斜面培养基C组成为：蛋白胨1.3g，葡萄糖5g，糖蜜3g，可溶性淀粉10g，蔗糖10g，牛肉膏2g，酵母浸粉5g，琼脂13g，水1000ml。
对上述三个实施例所得可高产蛋白酶的芽孢杆菌进行水解能力进行测试，实施例1所得可高产蛋白酶的芽孢杆菌水解能力最强为25.78％(如表1所示)。将实施例1所得可高产蛋白酶的芽孢杆菌于2004年6月28日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，分类命名为：芽孢杆菌Bacillus sp，其保藏号为CGMCCNo.1180。
实施例1中各步骤突变株与母株的对大豆蛋白发酵的水解能力比较见下表1：
表1、出发菌株与诱变株水解能力的比较
| 菌株编号 | 48h DH％ |
| CAU208CAU208-NCAU208-N1CAU208-N5CAU208-1 | 15.416.8818.2722.3225.78 |
蛋白质的水解度是指利用生物的或化学的方法对天然蛋白质进行催化水解，由水解而断裂的肽键占蛋白质分子中总肽键的比例称水解度(DH％)。
茚三酮法显色法测定水解度(Degree of Hydrolysi s，DH)的方法如下：
①标准曲线的绘制：首先配制标准甘氨酸溶液，其浓度为20ug/ml；然后依表2所列加样量顺序加样。
表2、甘氨酸、茚三酮和乙醇的加样量
| 试管编号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 标准甘氨酸溶液加样量(ml)蒸馏水加样量(ml)终体积2ml时甘氨酸终浓度(ug/ml) | 02.00 | 0.21.82 | 0.41.64 | 0.61.46 | 0.81.28 | 1.01.010 | 1.50.515 | 2.0020 |
| 茚三酮加样量(ml)40％乙醇加样量(ml) | 15 | 15 | 15 | 15 | 15 | 15 | 15 | 15 |
按表2所列加样量，于具塞试管中依次加入标准甘氨酸溶液、蒸馏水和茚三酮显色剂，在沸水中加热15min，然后于冷水中冷却5min；再加入40％的乙醇溶液终止反应，放置15min；以空白管调零于570nm处测定A(吸光度)值。
②水解蛋白液中-NH2含量的测定
取一定量的蛋白水解液于4000rpm下离心15min，取上清液100μl于25ml容量瓶，定容，亦即稀释250倍。吸取2ml稀释液于具塞试管中并加入1ml茚三酮显色剂，混匀后于沸水中加热15min；然后于冷水中冷却5min；再加5ml 40％的乙醇溶液终止反应，放置15min后，待测。最后，利用标准曲线计算蛋白水解液中-NH2的含量(umol/ml)。
③水解度(DH％)计算
在上式中：
蛋白水解液的相对甘氨酸浓度：是指按上述方法测出的蛋白水解液的吸光度后，由标准曲线换算出的甘氨酸浓度。
发酵底物的蛋白浓度：是指发酵底物(如大豆蛋白等)的蛋白质浓度。
75.07：是甘氨酸的分子量。
7.8mmol/g：是大豆蛋白完全水解后的肽键数(常数)。
0.33mmol/g：是发酵底物(原料)中的肽键数(常数)。
本发明的可高产蛋白酶的芽孢杆菌可用于液体发酵制备大豆生物活性肽饲料添加剂。
其具体用法：
1)制备种子液
将本发明的可高产蛋白酶的芽孢杆菌～Bacillus sp接入灭菌后的液体培养基中，于25～35℃培养24～48小时，得到种子液；
所述液体培养基按下述比例配制：蛋白胨1.3～2.5g，葡萄糖3～5g，糖蜜3～5g，马铃薯浸液50～100ml，可溶性淀粉10～20g，蔗糖10～30g，牛肉膏2～3g，酵母浸粉3.5～5g，豆粕1.5～2g，生长因子1～2ml，水1000ml；其中的生长因子为含有MgSO4.7H2O 20.00～30.00mg/ml，CaCl2.2H2O 2.20～3.50mg/ml，ZnSO4.7H2O 0.81～1.10mg/ml，FeSO4.7H2O 0.44～0.60mg/ml，MnSO4.H2O 0.13～0.20mg/ml和CuSO4.5H2O0.02～0.04mg/ml的混合物；
2)发酵降解制备肽类饲料添加剂
将发酵底物粉碎到40～120目后放入发酵罐中，依次加入水和碳源，所加入水的重量与发酵底物所含蛋白质的重量份配比为100∶3～20，所加入碳源的含碳量与发酵底物的含氮量的重量份配比为1∶2～30，将发酵液在0.1～0.13MPa，115～125℃灭菌10～30分钟，冷却到37℃，再加入上述步骤制备的种子液，种子液和发酵液的体积比为0.3～1∶10，混合均匀后在25～37℃，以0.5～2.5vvm的速度通入无菌空气，以150～300rpm速度搅拌发酵24～120小时，得到蛋白水解液，于140～145℃灭菌2～8秒，得到液态肽类饲料添加剂；还可将该肽类饲料添加剂进行离心除渣、超滤、浓缩、干燥等，得到粉状肽类饲料添加剂。
所述的发酵底物为选自大豆蛋白、谷蛋白中的一种或几种的混合物；
所述的大豆蛋白包括大豆分离蛋白、豆粕、豆饼、大豆；
所述的谷蛋白包括玉米蛋白、玉米蛋白粉和小麦蛋白；
所述的碳源包括玉米面、红糖、食用白糖、玉米糖浆、淀粉、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜。
制备的肽类饲料添加剂具有多种用途：
1)该肽类饲料添加剂可用于提高禽蛋品质，大幅度提高蛋黄色度，增加蛋黄中有益成分，提高蛋壳质量和产蛋率等生产性能。
2)该肽类饲料添加剂能够迅速吸收，以满足幼龄动物消化***尚未成熟时的营养需要，可用于幼龄动物的饲料中。
3)该肽类饲料添加剂具有低过敏原性，可用来补充患过敏性疾病的动物的蛋白需要或用来作为乳猪、仔猪等幼龄动物的饲料，以防止豆粕(豆饼)等蛋白饲料对其产生的肠道粘膜过敏和水肿等疾病。
4)该肽类饲料添加剂能提高动物对矿物质元素的利用率，是理想的矿物质螯合剂。
5)该肽类饲料添加剂有降低血脂和胆固醇、调节脂肪代谢，提高畜产品质，作为动物的营养再分配剂。
6)该肽类饲料添加剂可用作调味剂，提高饲料适口性。
实施例4、使用本发明的可高产蛋白酶的芽孢杆菌制备的活性肽饲料添加剂在养猪生产中应用
表3、在养猪生产中的使用效果
| 处理/重复 | 29～50日龄平均日增重(Kg) | 29～50日龄料重比 |
| 空白对照组 | 0.2707±0.01 | 2.23±0.09 |
| 抗生素对照组(金霉素100mg/kg) | 0.3261±0.02 | 1.68±0.08 |
| 活性肽1组(40mg/kg) | 0.3049±0.01 | 1.76±0.07 |
| 活性肽2组(120mg/kg) | 0.3364±0.02 | 1.68±0.07 |
| 活性肽3组(200mg/kg) | 0.3171±0.01 | 1.84±0.17 |
从表3可以看出，添加了该活性肽饲料添加剂的3个活性肽组的平均日增重和饲料转化效率均好于空白对照组，可明显提高猪只的生产性能，即日增重和饲料转化效率。
其中活性肽2组(有效成分120mg/kg饲料)的平均日增重和饲料转化效率显著好于空白对照组及抗生素组，可以完全替代抗生素。
实施例5、使用本发明的可高产蛋白酶的芽孢杆菌制备的活性肽饲料添加剂在蛋鸡饲养中的应用
表4、在蛋鸡饲养中的应用
注：同行数字右肩标有不同小写字母者(a，b，c为统计学上显著性检验的表示方法)为差异显著(P＜0.05)，有相同字母者为差异不显著(p＞0.05)。
从表4可以看出，随着活性肽饲料添加剂的添加量的增加，产蛋率明显增加，且A、B、C三组间均存在显著性差异(p＜0.05)，其中，添加活性肽140ppm使产蛋率提高了4.6％。在饲料转化效率(料/蛋比)方面，添加活性肽能明显降低料蛋比，即明显提高了饲料转化效率，且差异显著(p＜0.05)，但B组与C组差异不显著(p＞0.05)；在蛋鸡日粮中添加活性肽140ppm能明显增加蛋重达3.5克/枚，增加幅度达5.4％，与对照组差异显著(p＜0.05)，还明显可降低死淘率和破蛋率，这些都有助于降低养殖成本。总之，本试验表明，在蛋鸡饲料中添加活性肽饲料添加剂能可明显提高蛋禽产蛋率，增加蛋重，降低料蛋比、破蛋率，降低死淘率，提高饲料利用率、生产性能和降低生产成本。
实施例6、本发明的可高产蛋白酶的芽孢杆菌制备的活性肽饲料添加剂在蛋鸭饲养中的应用
将55周龄的蛋鸭随机分成5个组，每个组100只鸭，分别为
A组，空白对照组，仅饲喂蛋鸭基础日粮；
B组，添加肽类饲料添加剂组，除饲喂蛋鸭基础日粮外，每吨饲料添加2kg实施例1的提高禽蛋品质的肽类饲料添加剂；
C组，添加肽类饲料添加剂组，除饲喂蛋鸭基础日粮外，每吨饲料添加1.92kg实施例55的提高禽蛋品质的肽类饲料添加剂；
D组，添加肽类饲料添加剂组，除饲喂蛋鸭基础日粮外，每吨饲料添加3.8kg实施例56的提高禽蛋品质的肽类饲料添加剂；
E组，添加肽类饲料添加剂组，除饲喂蛋鸭基础日粮外，每吨饲料添加2.6kg实施例57的提高禽蛋品质的肽类饲料添加剂；
试验期30天，并按上述分组重复试验4次，记录各组的产蛋率、蛋重、蛋黄色度、蛋壳厚度、浓蛋白高度等性质的4次平均值，列于表6。
蛋鸭基础日粮，配方(重量百分比)为玉米59.0，豆粕20.0，菜粕6.0，麦麸2.72，石粉8.46，氢钙1.5，食盐0.32，植物油1.0，1％蛋鸭预混料1.0。
表5、各组鸭蛋品质的比较
| 性能 | A组 | B组 | C组 | D组 | E组 |
| 平均蛋重(g) | 64.32 | 67.28 | 67.78 | 68.34 | 68.11 |
| 浓蛋白高度(mm) | 5.41 | 5.72 | 5.70 | 5.78 | 5.76 |
| 蛋黄色度* | 6.55 | 10.97 | 11.28 | 11.48 | 11.45 |
| 蛋壳强度(kg/mm2) | 3.02 | 3.58 | 3.43 | 3.75 | 3.64 |
| 蛋壳厚度(um) | 360.22 | 380.31 | 380.56 | 381.45 | 381.23 |
| 产蛋率(％) | 80.5 | 85.3 | 85.6 | 86.9 | 85.7 |
| 料蛋比** | 2.57 | 2.30 | 2.24 | 2.11 | 2.13 |
*蛋黄色度为罗氏比色扇比色值。
**料蛋比为每产1kg蛋所耗饲料量(kg)。
从表5可以看出，饲喂本发明提供的提高禽蛋品质的肽类饲料添加剂，鸭蛋的各项指标均明显好于普通配合饲料(A组)，这说明该种肽类添加剂在提高蛋鸭的生产性能和蛋品质中起了明显的促进作用。特别是提高蛋黄色度方面，可以提高近5个色度，说明该肽类饲料添加剂有非常好的增色功能。这种增色的机能主要是活性肽饲料添加剂促进了饲料中的类胡萝卜素向蛋黄中的转运到，类胡萝卜素是桔红色，因此蛋黄的颜色增加了。蛋黄颜色是禽蛋品质的一个重要指标，在食物感觉中也有着重要的作用，消费者经常将金黄色的蛋黄和健康联系在一起，因而饲喂本发明提供的提高禽蛋品质的肽类饲料添加剂使鸭蛋更具有市场前景和价值。
Claims (4)
1、一种可高产蛋白酶的芽孢杆菌，其特征在于，该可高产蛋白酶的芽孢杆菌的分类命名为：芽孢杆菌Bacillus sp，于2004年6月28日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，其保藏号为CGMCC No.1180。
2、一种权利要求1所述可高产蛋白酶的芽孢杆菌的诱变选育方法，包括如下的诱变选育步骤：
1)以选购于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》，保藏号为CGMCCNo1.769的枯草芽孢杆菌CAU208作为出发菌株；
2)诱变选育
(1)制备出发菌株CAU208单细胞悬浮液
将出发菌株芽孢杆菌CAU208接种于灭菌后的液体培养基A中，28～32℃摇瓶培养36～48h，离心，用无菌生理盐水洗涤，置于无菌的装有玻璃珠的三角瓶内，振荡，使其分散成单细胞悬液，用无菌玻璃棉过滤，得到出发菌株CAU208单细胞菌悬液；
所述的液体培养基A所含组分及配比为：蛋白胨1.3～2.5g，葡萄糖3～5g，糖蜜3～5g，可溶性淀粉10～20g，蔗糖10～30g，牛肉膏2～3g，酵母浸粉3.5～5g，水1000ml；
(2)紫外线诱变
调节步骤(1)所得出发菌株CAU208菌悬液的活菌数为106～108个/ml之间，液层厚度0.2～0.4cm；进行紫外线诱变，紫外线诱变所用紫外灯功率15～18W，照射时间2～5min，照射距离25～30cm；照射后立即稀释涂布在初筛分离培养基B上，27～32℃培养30～36h，挑选50～70个单菌落，进行摇瓶发酵复筛，用茚三酮法显色法测定水解度，选择2～4株水解能力最高的菌株，再分别作摇瓶发酵复筛，选出一株水解能力最高且稳定性好的菌株CAU208-N，并制成菌悬液用于下一步亚硝基胍诱变；
所述的初筛分离培养基B所含组分及配比为：蛋白胨1～3g，酵母浸粉2～4g，葡萄糖4～6g，脱脂奶粉5～8g，琼脂10～13g，水1000ml；
所述的摇瓶发酵复筛的步骤是：
制备发酵液：将氮源、碳源和水按重量份配比均匀混合后，在0.1～0.15mpa压力下，120～122℃灭菌，再冷却至30～37℃，制成发酵液；其中，氮源与碳源的重量份之和与水的重量份的配比为3～6∶100，氮源与碳源重量份配比为2～4∶1；所述氮源为豆粕粉、大豆分离蛋白粉；所述碳源为玉米面或玉米面和糖蜜；
将得到的50～70个单菌落种子液接种于容量为250ml装有100ml发酵液的三角瓶中，种子液和发酵液按体积比0.5～1.0∶10的比例均匀混合，以110～140rpm的速度在摇床上进行发酵；发酵温度为30℃～35℃，发酵结束时用茚三酮法显色法测定水解度；
(3)亚硝基胍诱变
将步骤(2)所得CAU208-N菌悬液的活菌数调至105～108个/ml，菌悬液中加入终浓度为800～1000ug/ml的亚硝基胍，30～35℃水浴处理20～30min，间歇震荡；诱变后立即涂于初筛分离培养基B上，27～32℃培养30～36h，挑选50～70个单菌落，进行摇瓶发酵复筛，得到水解能力最高的一株菌株CAU208-N1，并制成菌悬液用于下一步紫外线与亚硝基胍复合诱变；所述摇瓶发酵复筛的方法同步骤(2)；
(4)紫外线与亚硝基胍复合诱变
将步骤(3)所得CAU208-N1菌悬液的活菌数调至107～109个/ml，菌悬液中加入终浓度为900～1300ug/ml的亚硝基胍液，30～35℃水浴处理20～30min，间歇震荡，取亚硝基胍处理后的液层厚度0.2～0.4cm；进行紫外线诱变，所用紫外灯功率15～18W，照射时间6～9min，距离25～30cm；紫外照射诱变后立即涂于初筛分离培养基B上，27～32℃培养30～36h，挑选50～70个单菌落，进行摇瓶发酵复筛，得到水解能力最高的一株菌株CAU208-N5；所述的摇瓶发酵复筛方法同步骤(2)；
(5)循环重复紫外线诱变→亚硝基胍诱变→紫外线与亚硝基胍复合诱变2次，最后得到高产菌株CAU208-1。
3、按权利要求2所述可高产蛋白酶的芽孢杆菌的诱变选育方法，其特征在于，还包括将得到的高产菌株CAU208-1保存在固体斜面培养基C上，4℃保藏，每3个月转接一次；
所述的固体斜面培养基C组成为：蛋白胨1.3～2.5g，葡萄糖3～5g，糖蜜3～5g，可溶性淀粉10～20g，蔗糖10～30g，牛肉膏2～3g，酵母浸粉3.5～5g，琼脂10～13g水1000ml。
4、一种权利要求1所述可高产蛋白酶的芽孢杆菌的用途，其特征在于，该可高产蛋白酶的芽孢杆菌用于液体发酵制备大豆生物活性肽饲料添加剂或用于制备益生素、酶制剂饲料添加剂。
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