CN102329787A - 提高安普霉素菌种产抗能力的选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高安普霉素菌种产抗能力的选育方法。先选取自然系列菌种，对单孢子进行不同剂量的N^＋离子注入并复合紫外线诱变，得到单菌落，经摇瓶发酵和遗传稳定性筛选得到二次出发菌种，对二次出发菌种进行亚硝基胍诱变，诱变后稀释，平皿涂布，培养，得到二次复合诱变单菌落，再次进行摇瓶发酵和遗传稳定性筛选得到三次出发菌种；对三次出发菌种进行摇瓶发酵配方的优化和筛选，采用正交试验或者均匀设计试验得到优化的培养基配方。本发明通过多次摇瓶发酵，多次初筛、复筛，从中挑选产抗能力水平较高且稳定的菌种，可以使诱变菌种的优良性状得以长久稳定并保持下来，解决了诱变菌种回复突变快、生产意义低的难题，同时采用改进的摇瓶发酵培养基配方，促使菌种产抗能力的提升。

Description

提高安普霉素菌种产抗能力的选育方法

技术领域

本发明涉及一种菌种选育方法，特别是涉及一种提高安普霉素菌种产抗能力的选育方法。

背景技术

安普霉素是由黑暗链霉菌产生的一种氨基糖苷类抗生素，为国家2000年批准的二类新兽药。该药物对畜禽革兰氏阴性菌和大多数革兰氏阳性菌有较强的抗菌活性，特别是对耐庆大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素等抗生素的细菌仍有较强的抗菌作用，而且不易产生耐药性，是允许用于食品动物但不需要制定残留限量的药物中的唯一一种抗生素。安普霉素可用于鸡大肠杆菌、沙门氏杆菌和支原体引起的感染，作为药物型饲料添加剂，能促进增重和提高饲料转化率，在畜禽养殖领域得到广泛应用。

针对该药物产生菌产抗性能的提高，目前主要采用物理和化学诱变剂诱变方法。已发表的关于安普霉素菌种诱变文献中，指出诱变剂进行诱变可使安普霉素菌种产抗能力得到一定程度提高，或者推论安普霉素生物合成的途径，但是未涉及运用复合诱变剂来提高菌种产抗能力的方法，也未涉及保持诱变菌种产抗性能长期稳定的选育方法。

鉴于诱变菌种极易产生回复性突变的特性，通过诱变途径得到的产抗性能较高的菌种，产抗性能衰退快，正突变性能不易稳定保持。同时，诱变后的菌种其遗传性状发生改变，原有的营养基质已经不能使其最大发挥产抗能力，还应通过营养基质的调整，优化和筛选来使其产抗性能和潜力得到进一步发挥。        

发明内容

本发明要解决的技术问题：在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种提高安普霉素菌种产抗能力的选育方法，该方法能使安普菌种产抗性能得到大幅度的提升和长久保持。

本发明技术方案：

提高安普霉素菌种产抗能力的选育方法，包括以下步骤：

（1）选取性能稳定、一致的自然系列安普霉素菌种；

（2）收集原始出发菌种孢子，打碎过滤得到单孢子，分别取0.1ml的单孢子在2×10¹⁴～6×10¹⁴N^＋/cm²的范围内进行不同剂量的N^＋离子注入；然后在15～20W紫外灯下照射30～90S，照射距离25～30cm，进行10³～10⁸倍的稀释，平皿涂布，33-36℃培养5-8天，得到首次复合诱变的单菌落；

（3）将各剂量下首次复合诱变的单菌落挑选50～200个，进行摇瓶发酵；经过一次初筛，1～3次复筛，选出产抗能力提高5%以上的正突变菌种；对选出的正突变菌种进行2～3轮纯化，进行遗传稳定性筛选后得到二次出发菌种；

（4）将二次出发菌种孢子打碎，过滤得到单孢子，然后进行亚硝基胍诱变，诱变剂为pH6.0、浓度为1000-2000μg/ml亚硝基胍溶液，诱变后稀释10³-10⁸倍，平皿涂布，在33-36℃下培养5-8天，得到二次复合诱变单菌落；

（5）将二次复合诱变单菌落80～150个再次进行摇瓶发酵，经过一次初筛，1～4次复筛，选出产抗能力提高5%以上的正突变菌种；对选出的正突变菌种进行2～3轮纯化，进行遗传稳定性筛选后得到三次出发菌种； 

（6）对三次出发菌种进行摇瓶发酵配方的优化和筛选，采用正交试验或者均匀设计试验得到优化的培养基成分为：以重量百分比计，豆饼粉3.0-5.0%，玉米淀粉2.0-2.5%，花生饼粉1.0-2.5%，葡萄糖2.0-5.0%，氯化铵0.1-0.5%，硫酸镁0.2-0.8%，碳酸钙0.3-1.0%，蛋白胨0.5-2.0%，豆油0.5-1.5%，淀粉酶为玉米淀粉量的0.1%，用水定容，消前pH7.2～7.6。

所述选取性能稳定、一致的自然系列安普霉素菌种是指：对未经诱变的自然系列菌种进行2～3轮纯化，从中挑选摇瓶产抗能力对单菌落进行斜面传代试验，对3～4代斜面产抗能力稳定的菌种进行收集和保藏，作为原始出发菌种。

所述离子注入时所用的离子注入机能量为30Kev，脉冲频率为25Hz，真空度为0.3Pa。

所述遗传稳定性筛选时的具体方法：对各菌种进行3～4代斜面传代，斜面培养条件为33-36℃培养5-8天，对其中摇瓶产抗能力相对稳定的菌种进行保留。

所述摇瓶发酵的培养条件是发酵摇瓶转速为200r/min，在36℃～38℃培养4～6天。

所述三次出发菌种经发酵配方筛选后菌种的产抗能力提高8 %以上。

所述培养基成分优选为：豆饼粉4.0-5.0%，玉米淀粉2.0-2.5%，花生饼粉1.0-2.5%，葡萄糖4.0-5.0%，氯化铵0.1-0.5%，硫酸镁0.2-0.5%，碳酸钙0.3-1.0%，蛋白胨0.5-1.0%，豆油0.5-1.5%，淀粉酶为玉米淀粉量的0.1%。

本发明的积极有益效果：

1.本发明通过使用N^＋注入、紫外线照射、亚硝基胍三种复合诱变方法提高安普菌种的产抗能力，有效提高了安普霉素的发酵水平，整体产抗能力水平较原始出发菌种提高20%～30%，从而使该抗生素生产成本降低20～30%，经济效益明显。

2.本发明提供了一种新型的选育模式，通过多次摇瓶发酵，多次初筛、复筛，进行3～4代斜面传代考察试验，从中挑选产抗能力水平高且稳定的菌种，可以使诱变菌种的优良性状得以长久稳定并保持下来，解决了诱变菌种回复突变快、生产意义低的难题。

3.本发明采用改进的摇瓶发酵培养基配方，对其中影响菌种产抗能力较显著的碳氮源物质进行调整，使其更符合诱变菌种发生的变异特性，促使菌种产抗能力的提升。这种选育模式打破了过去“只重视菌种诱变、忽视营养基质配合菌种”的传统育种观念，对微生物的育种模式进行了进一步地发掘和开发。

4、本发明的选育模式可以借鉴到其它抗生素的筛选，如硫酸庆大霉素菌种等产孢放线菌或细菌的菌种诱变中，应用范围较广。

5、本发明得到的发酵液经薄层层析法鉴定，斑点位置同于安普霉素标准品斑点位置，无妥布霉素组分，符合国家药典规定。

6、本发明得到的发酵液，经提取得到硫酸安普霉素成品样品，核算收率为75%～80%，对成品含量、干燥失重等指标进行检测，符合国家药典要求标准，说明本发明方法得到的高产抗菌种，能够在工业化大生产中运用。

附图说明

图1：本发明的安普霉素菌种选育方法的工艺流程图。

具体实施方式

以下实施例仅为了进一步说明本发明，并不限制本发明的内容。

实例1：提高安普霉素菌种产抗能力的选育方法，工艺流程参见图1。

（1）性能稳定、一致的自然系列菌种制备

对未经诱变的自然系列菌种进行2～3轮纯化，从中挑选产抗能力稳定的单菌落进行斜面传代试验，对3～4代斜面产抗能力稳定的菌种进行收集和保藏，作为备用的原始出发菌种。

（2）收集原始出发菌种孢子，打碎过滤得到单孢子，分别取三份0.1ml的单孢子进行2×10¹⁴N^＋/cm²、3×10¹⁴N^＋/cm²、4×10¹⁴N^＋/cm²剂量的N^＋离子注入（注入设备：俄罗斯TITAN离子注入机，能量：30Kev；脉冲频率：25Hz；真空度：3×10^-1 Pa）。再用20W紫外线灯照射，照射距离25cm，照射时间50S，然后进行10³～10⁸倍的稀释，平皿涂布分离，36℃培养5-8天，得到首次复合诱变单菌落。

（3）诱变前后，对安普霉素孢子进行活性计数，两种诱变剂复合诱变后，其致死率为99.94%～99.99%。最佳的稀释倍数分别为10⁴～10⁶、10³～10⁶、10³～10⁵倍。

对得到的首次复合诱变单菌落的三个剂量共挑选150株，每剂量梯度里各挑50株。最后，通过摇瓶发酵水平考察，摇瓶发酵6天，培养温度38℃；经过一次初筛、3次复筛，挑选出产抗能力水平平均提高8%的正突变菌种3株。

（4）对得到的正突变菌种挑选1个菌种，对其单孢子进行2轮纯化，进行遗传性能稳定性筛选，通过连续3代斜面菌种的摇瓶产抗能力对比，得到2株遗传性状稳定的复合诱变菌种，将该复合诱变菌种作为二次出发菌种。

（5）上述的二次出发菌种选择两株，对其孢子混合打碎过滤，离心，弃去上清液，保留孢子。将pH6.0,浓度为1000μg/ml亚硝基胍溶液加入孢子离心管内，震荡均匀，37℃作用2小时，生理盐水终止反应；然后分别稀释10³～10⁸倍，平皿涂布分离，36℃培养8天。

亚硝基胍的配制：将0.1g亚硝基胍加入10ml甲酰胺内，得到10000μg/ml的亚硝基胍溶液。使用时，用pH6.0的缓冲溶液进行稀释，稀释为1000μg/ml或2000μg/ml。

诱变前后，对安普霉素孢子进行活性计数 ，诱变剂复合诱变后，其致死率为99.97%～99.99%。

（6）挑选单菌落120株进行挑单和摇瓶发酵水平考察试验，摇瓶发酵6天，培养温度38℃；经过一次初筛，3次复筛，得到产抗能力水平较二次出发菌种平均提高10%左右的正突变菌种2株。

（7）对上述正突变菌种进行3轮纯化，挑选产抗能力水平较为稳定的菌种5株，对其进行遗传稳定性筛选，通过1-4代连续4代斜面菌种的摇瓶产抗能力对比，从中挑选3株遗传性状稳定的菌种，作为二次复合诱变菌种，对其孢子进行收集，并使用砂土保藏。

（8）对砂土保藏的二次复合诱变菌种进行发酵配方筛选，使用正交试验模式，最终得到菌种水平进一步提高的优化发酵配方。

优化后的培养基组成为：豆饼粉5.0%，玉米淀粉2.5%，花生饼粉1.0%，葡萄糖4.0%，氯化铵0.1%，硫酸镁0.2%，碳酸钙0.3%，蛋白胨0.5%，豆油1.5%，淀粉酶为淀粉量的0.1%，用水定容，消前pH7.2～7.6。摇瓶培养条件为38℃，6天。

本例中调整前使用的摇瓶发酵培养基配方为：

豆饼粉3.5%，玉米淀粉1.5%，花生饼粉1.5%，葡萄糖5.0%，氯化铵0.4%，硫酸镁0.6%，碳酸钙0.8%，蛋白胨1.5%，豆油1.2%，淀粉酶为玉米淀粉量的0.1%，水定容。消前pH7.2～7.4，摇瓶培养条件为38℃，6天。

通过发酵配方调整，使诱变菌种的产抗能力水平再次提高约11%。该培养基配方对同系列的其它诱变高产菌种进行摇瓶考察试验，产抗能力水平提升水平一致，说明该配方可以用于该诱变的系列菌种。

（9）将得到的发酵液按照薄层层析法进行组分鉴定，其斑点位置同于安普霉素标准斑点位置，其发酵液内不含妥布霉素组分，符合国家药典规定。

（10）对发酵液进行提纯，提纯步骤为：调节发酵液至酸性、加732阳树脂、吸附、分离漂洗树脂、解析、浓缩、成盐、喷雾干燥等，得到硫酸安普霉素成品。

发酵液进行小试提取，提取收率为77.5%，对硫酸安普霉成品按照《中华人民共和国兽药典》2005版第一部标准进行各指标的检测，检测结果如下：

实例2：提高安普霉素菌种产抗能力的选育方法

具体方法与实例1相似，不同处是：N^＋注入采用4×10¹⁴N^＋/cm²剂量，复合用20W紫外线灯照射，照射距离30cm，照射时间90s，对诱变菌种进行初筛、复筛，对得到的5个产抗能力较高的菌号进行斜面传代考察试验，从中选出产抗能力最高并且传代性能最为稳定的1个菌号进行2轮纯化，得到2个菌号，产抗能力水平平均提高约5%；对其进行混合单孢子的亚硝基胍诱变，诱变剂为pH6.0，浓度为2000μg/ml亚硝基胍。对诱变菌种进行初复筛，对得到的6个产抗能力较高的菌号进行斜面传代考察试验，从中选出产抗能力最高并且传代性能最为稳定的3个菌号，产抗能力水平平均提高9.5%。对其分别进行实例1中正交试验优化后的发酵配方的摇瓶产抗能力对比，产抗能力水平再次提高约8.7%。

其余操作及培养、检测条件同实例1。

发酵液进行小试提取，提取收率为76.5%，其它检测标准及样品检测结果如下：

项目

性  状

妥布霉素

干燥失重

炽灼残渣

重金属

硫酸安普霉素含量

标准规定

微黄色至黄褐色粉末，有引湿性

无

≤10.0%

≤1.0%

≤0.002%

按干品计，每1mg效价不得少于550安普霉素单位

检测结果

微黄色粉末

无

7.8%

0.3%

≤0.002%

效价单位555u/mg

实例3：具体方法与实例1相似，不同处是对实例1第（7）步骤中得到的二次复合诱变菌种进行摇瓶培养基筛选时，配比调整使用均匀设计模式。 

优化后的摇瓶发酵的培养基组成：豆饼粉4.0%，玉米淀粉2.5%，花生饼粉2.3%，葡萄糖5.0%，氯化铵0.4%，硫酸镁0.6%，碳酸钙0.5%，蛋白胨1.2%，豆油0.5%，淀粉酶为玉米淀粉量的0.1%，其余为水。消前pH7.2～7.6，摇瓶培养温度38℃，6天。

通过均匀设计，使得二次复合诱变菌种的产抗能力得到进一步提高，平均提高8%左右。

经小试提取收率为77.8%，样品检测结果如下：

以上检测结果均符合国家规定标准。

Claims (7)

1.提高安普霉素菌种产抗能力的选育方法，其特征是，该方法包括以下步骤：

（1）选取性能稳定、一致的自然系列安普霉素菌种；

（2）收集原始出发菌种孢子，打碎过滤得到单孢子，分别取0.1ml的单孢子在2×10¹⁴～6×10¹⁴N^＋/cm²的范围内进行不同剂量的N^＋离子注入；然后在15～20W紫外灯下照射30～90S，照射距离25～30cm，进行10³～10⁸倍的稀释，平皿涂布，33-36℃培养5-8天，得到首次复合诱变的单菌落；

（3）将各剂量下首次复合诱变的单菌落挑选50～200个，进行摇瓶发酵；经过一次初筛，1～3次复筛，选出产抗能力提高5%以上的正突变菌种；对选出的正突变菌种进行2～3轮纯化，进行遗传稳定性筛选后得到二次出发菌种；

（4）将二次出发菌种孢子打碎，过滤得到单孢子，然后进行亚硝基胍诱变，诱变剂为pH6.0、浓度为1000-2000μg/ml亚硝基胍溶液，诱变后稀释10³-10⁸倍，平皿涂布，在33-36℃下培养5-8天，得到二次复合诱变单菌落；

（5）将二次复合诱变单菌落80～150个再次进行摇瓶发酵，经过一次初筛，1～4次复筛，选出产抗能力提高5%以上的正突变菌种；对选出的正突变菌种进行2～3轮纯化，进行遗传稳定性筛选后得到三次出发菌种； 

（6）对三次出发菌种进行摇瓶发酵配方的优化和筛选，采用正交试验或者均匀设计试验得到优化的培养基成分为：以重量百分比计，豆饼粉3.0-5.0%，玉米淀粉2.0-2.5%，花生饼粉1.0-2.5%，葡萄糖2.0-5.0%，氯化铵0.1-0.5%，硫酸镁0.2-0.8%，碳酸钙0.3-1.0%，蛋白胨0.5-2.0%，豆油0.5-1.5%，淀粉酶为玉米淀粉量的0.1%，用水定容，消前pH7.2～7.6。

2.根据权利要求1所述的选育方法，其特征是，所述选取性能稳定、一致的自然系列安普霉素菌种是指：对未经诱变的自然系列菌种进行2～3轮纯化，从中挑选摇瓶产抗能力对单菌落进行斜面传代试验，对3～4代斜面产抗能力稳定的菌种进行收集和保藏，作为原始出发菌种。

3.根据权利要求1所述的选育方法，其特征是，所述离子注入时所用的离子注入机能量为30Kev，脉冲频率为25Hz，真空度为0.3Pa。

4.根据权利要求1所述的选育方法，其特征是，所述遗传稳定性筛选时的具体方法：对各菌种进行3～4代斜面传代，斜面培养条件为33-36℃培养5-8天，对其中摇瓶产抗能力相对稳定的菌种进行保留。

5.根据权利要求1所述的选育方法，其特征是，所述摇瓶发酵的培养条件是发酵摇瓶转速为200r/min，在36℃～38℃培养4～6天。

6.根据权利要求1所述的选育方法，其特征是，所述三次出发菌种经发酵配方筛选后菌种的产抗能力提高8 %以上。

7.根据权利要求1所述的选育方法，其特征是，所述培养基成分为：豆饼粉4.0-5.0%，玉米淀粉2.0-2.5%，花生饼粉1.0-2.5%，葡萄糖4.0-5.0%，氯化铵0.1-0.5%，硫酸镁0.2-0.5%，碳酸钙0.3-1.0%，蛋白胨0.5-1.0%，豆油0.5-1.5%，淀粉酶为玉米淀粉量的0.1%。