CN1298236C - 小肽与有益微生物合生元饲料添加剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种小肽与有益微生物合生元饲料添加剂，包括小肽干粉和芽孢杆菌干粉；还可包括酵母菌干粉或/和乳酸菌干粉。该小肽干粉是将植物蛋白或/和动物蛋白经微生物发酵降解，且其水解度在25～40%的发酵液干燥后而得。该芽孢杆菌干粉、酵母菌干粉和乳酸菌干粉均是经平板培养复壮、制作摇瓶种子、生产一级种子液、二级发酵和载体吸附制得。该饲料添加剂可用作抗生素替代品，消除药物残留，提高肉蛋奶等产品品质，可用于防治各种动物拉稀腹泻，提高动物生产性能、提高免疫力、抗病力和饲料转化效率、降低动物死淘率，还可用于制作青贮、黄贮饲料和生物饲料等。其为一种绿色饲料添加剂，有利于人类的健康和畜禽产品品质的提高。

Description

小肽与有益微生物合生元饲料添加剂及其用途

发明领域

本发明涉及一种由有益微生物和小肽组成的合生元或合生素(Synbiotics)饲料添加剂及其用途，具体地说是涉及一种利用动植物蛋白制造的小肽(Small Peptide，SP)和包括芽孢杆菌和/或酵母菌或/和乳酸菌等有益微生物(Benefit Microorganism，BM)组成的合生元或合生素饲料添加剂及其用途。

背景技术

自人类发现抗生素以来，在动物饲养和饲料中广泛和长期使用抗生素、化学合成药物、激素、β-***、镇静剂等促生长保健剂，导致了如下的问题：畜禽和水产产品中药物残留严重，直接危害人体健康；畜禽产品品质下降，缺乏市场竞争力和信任感；细菌耐药性增强、耐药菌株增多，威胁人类安全；破坏生态环境等。由于食品安全的迫切需要，各个国家都在加速开发、推广新型安全高效的饲料添加剂，以替代抗生素等添加剂。近些年的研究成果表明，微生态调节剂在动物的生长、发育、产品形成和产品品质改善方面发挥着重要的作用。

微生态调节剂包括益生菌、益生元和合生元三类，是指利用动物体正常的有益的微生物菌群成员及其代谢产物和刺激动物内源益生菌生长增殖的一些物质制成的制剂，其可促进失调菌群的恢复，保持微生态平衡，提高宿主健康水平或增进健康状态。其中，益生菌或益生素(Probiotics)是指含活菌和(或)死菌，包括其组分和产物的细菌制品，经口或经由其它粘膜途径投入，旨在改善粘膜表面微生物或酶的平衡，或者刺激特异性或非特异性免疫机制。1989年，美国食品和药物管理局(FDA)以及美国饲料监察协会(AAFCO)公布了41种可用于饲料的安全菌种。我国农业部于1994年公布的可用于动物的益生菌菌种有：乳酸菌、粪链球菌、双歧杆菌等乳酸细菌和芽孢杆菌、酵母菌等。益生元(Prebiotics)是指在胃肠道的上部(前段)不被宿主消化的食物成分或制剂，它能选择性地刺激一种或几种结肠内常驻菌的活性或生长繁殖，增进宿主健康的作用。它包括低聚糖类(如低聚果糖、低聚木糖等)、天然植物类(包括中草药、蔬菜和野生植物等)、小肽类等。合生元或合生素(Synbiotics)是益生菌与益生元合并使用的制剂，既可以发挥益生菌的生理性细菌活性，又可选择性的增加这种菌的数量使益生作用更持久。自70年代以来，国外逐步将微生态调节剂应用于畜禽和水产养殖，一般应用于保健、疾病防治、饲料添加剂和水质调节剂等方面。20世纪80年代中后期，我国开始将微生态制品用于饲料添加剂。

在畜禽养殖中或饲料中大量使用抗生素的主要目的，一是为了防止畜禽疾病，二是为了促生长或提高畜禽的生产效率(即多产肉、蛋、奶等产品)。为了消除药物残留，克服此类问题，目前在饲料加工和畜禽养殖业中通常使用微生调节剂，如微生物添加剂所用乳酸菌、酵母菌或真菌或芽孢杆菌，或益生元类的寡聚糖(如低聚果糖、低聚木糖等)，但微生物添加剂所用的菌株中除了芽孢杆菌外，其它菌株均易受到温度、压力、偏酸、偏碱、金属离子(如Cu²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺)或饲料中胆碱等因素的破坏而失活，而寡聚糖类添加剂的作用效果比较微弱，不能有效替代抗生素，严重影响了其实用价值。

发明内容

本发明的目的在于：(1)克服现有技术中单纯使用微生物添加剂容易受到饲料中含有的微量元素金属离子(如Cu²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺)、氯化胆碱、抗生素、温度、压力、偏酸、偏碱等多种有害因素的损伤，不能耐受饲料制粒过程中的高温的缺陷；(2)克服单一使用微生物添加剂仅能补充或接种微生物，不能调动和发挥内源性有益微生物的作用；(3)克服使用益生元小肽添加剂功效单一，仅能激活畜禽内源性有益菌群，而不能补充具有产酶促消化、刺激免疫和防病功能的有益微生物。从而，提供一种小肽和有益微生物优势互补(发挥内外因作用)、活性高、耐贮存、稳定性高、成本低的小肽与有益微生物合生元或合生素饲料添加剂。

本发明的另一目的在于提供所述的小肽与有益微生物合生元(素)饲料添加剂的用途。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂，包括小肽干粉A和芽孢杆菌干粉B；还可包括酵母菌干粉C或/和乳酸菌干粉D。其质量标准为：小肽干粉A100mg/g，芽孢杆菌活菌≥60亿/g，酵母菌活菌≥4亿/g，乳酸菌活菌≥4亿/g，水份≤9％，灰份≤8％，砷≤0.5mg/kg，铅≤1.0mg/kg。

小肽与有益微生物合生元饲料添加剂S-1型，由小肽干粉A和芽孢杆菌干粉B组成，其中，小肽干粉占40～60wt％；芽孢杆菌干粉占40～60wt％。

小肽与有益微生物合生元饲料添加剂S-2型，由小肽干粉A、芽孢杆菌干粉B和酵母菌干粉C组成，其中，小肽干粉占35～45wt％；芽孢杆菌干粉占20～30wt％；酵母菌干粉占30～40wt％。

小肽与有益微生物合生元饲料添加剂S-3型，由小肽干粉A、芽孢杆菌干粉B和乳酸菌干粉D组成，其中，小肽干粉占30～50wt％；芽孢杆菌干粉占20～40wt％；乳酸菌干粉占30～50wt％。

小肽与有益微生物合生元饲料添加剂S-4型，由小肽干粉A、芽孢杆菌干粉B、酵母菌干粉C和乳酸菌干粉D组成，其中，小肽干粉占30～40wt％；芽孢杆菌干粉占20～30wt％；酵母菌干粉占10～20wt％；乳酸菌干粉占20～30wt％。

所述的小肽干粉A，是将植物蛋白或/和动物蛋白经微生物发酵降解，且其水解度(DH％)控制在25～40％的发酵液干燥后得到的，具体制备方法包括如下步骤：

1)发酵种子液制备：将选自黑曲霉、米曲霉、栖土曲霉菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、短小芽孢杆菌中的一种或几种的混合物，接入121℃灭菌30分钟并冷却到28～37℃后的液体培养基中，28～37℃培养24～48小时，得到种子液；所述的液体培养基为按下述比例配制的混合液：蛋白胨1.3～2.5g，葡萄糖3～5g，糖蜜3～5g，马铃薯浸液50～100ml，可溶性淀粉10～20g，蔗糖10～30g，牛肉膏2～3g，酵母浸粉3.5～5g，豆粕1.5～2g，生长因子1～2ml，水1000ml；其中的生长因子为含有MgSO₄.7H₂O 20.00～30.00mg/ml，CaCl₂.2H₂O 2.20～3.50mg/ml，ZnSO₄.7H₂O 0.81～1.10mg/ml，FeSO₄.7H₂O 0.44～0.60mg/ml，MnSO₄.H₂O 0.13～0.20mg/ml，CuSO₄.5H₂O 0.02～0.04mg/ml的混合物；

2)发酵降解：将植物蛋白或动物蛋白中的一种或几种的混合物粉碎到60～120目，按蛋白量计算，依物料∶液体比＝5～18∶100的比例放入发酵罐中，再依C/N比＝1/2～1/35的比例放入碳源，并加入消泡剂0.03～0.1％，混匀，得到的培养液于121～125℃高压灭菌10～30分钟，冷却到28～37℃，以种子液和培养液的体积比为0.3～1∶10的比例接入步骤1)得到的种子液，在28～42℃发酵，通气量为0.5～2.5vols/vol/min(以下简称：vvm)，搅拌速度150～300rpm，期间用常规的茚三酮法显色法测定水解度(Degree ofHydrolysis，DH％)，24小时前每6小时检测一次水解度，24～48小时之间，每4小时检测一次水解度，48小时后每2小时检测一次水解度，直到水解度达到25～40％，然后于140～145℃灭菌2～8秒，得到含小肽的蛋白水解液；

3)离心除渣：将步骤2)得到的含小肽的蛋白水解液于5000～7000rpm离心10～30分钟，除去渣质，得到的上清液再通过膜截留分子量为1000Da的超滤器除去大分子蛋白等杂质，得到分子量≤1000Da的滤液；将此滤液经负压真空浓缩到原体积的50％，得到的浓缩液加到预先混合好的载体中，按浓缩液∶载体＝0.5～0.8∶1的体积重量比混合，搅拌均匀后在45～80℃干燥，然后粉碎到80目以上，得到小肽干粉A。

所述步骤2)的植物蛋白包括大豆蛋白(豆粕、豆饼)、大豆蛋白、豆粕、豆饼、碗豆蛋白、玉米蛋白、红豆蛋白、小麦蛋白、大麦蛋白、棉籽粕或菜籽粕。

所述步骤2)的动物蛋白包括鱼粉、血粉、羽毛粉、乳蛋白、筋肉、酪蛋白、动物废弃脏器、蚯蚓蛋白粉、鱿鱼蛋白、鱼皮或其它水产动物蛋白。

所述步骤2)的碳源为选自玉米面、玉米糖浆(蜜)、淀粉、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、食用糖(白糖或红糖)中的一种或几种的混合物。

所述步骤3)的载体由2～5重量份有机载体和3～5重量份无机载体组成；其中，所述的有机载体包括糠麸类和饼粕类有机载体；所述糠麸类有机载体为麦麸、玉米芯粉、脱脂稻壳粉和脱脂米糠中的一种或几种的混合物；所述饼粕类有机载体为豆粕粉、豆饼粉和玉米蛋白粉中的一种或几种的混合物；所述无机载体为轻质碳酸钙、石粉、麦饭石和沸石粉中的一种或几种的混合物。

所述的芽孢杆菌干粉B是由如下的方法制得的：

1)平板培养复壮：将芽孢杆菌菌种采用划线接种的方法在芽孢杆菌平板培养基上划线接种，于25～35℃培养12～24小时，使芽孢杆菌复壮，并形成单菌落；所述的芽孢杆菌平板培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合物：蛋白胨0.5～1％、葡萄糖0.5～2％、牛肉膏0.5～1.5％、磷酸二氢钾0.3～0.6％、琼脂3～4％，pH＝7.5～7.6，121℃灭菌30分钟，备用；所述的芽孢杆菌包括：凝结芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、丁酸梭菌、纳豆芽孢杆菌、蜡状(样)芽孢杆菌；

2)制作摇瓶种子：从步骤1)培养的芽孢杆菌菌落中挑单菌落，接种到芽孢杆菌液体培养基中，于28～37℃培养20～30小时，得到芽孢杆菌摇瓶种子液；所述的芽孢杆菌液体培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：蛋白胨0.5～1％、葡萄糖0.5～2％、牛肉膏0.5～1.5％、磷酸二氢钾0.3～0.6％、3.08％硫酸锰溶液0.5～1.5％，pH＝7.5～7.6，121℃灭菌30分钟，备用；

3)生产一级种子液：将步骤2)得到的芽孢杆菌摇瓶种子液以2～5v％的接种量，接种于生产所用的一级种子罐的一级种子液体培养基中，于28～37℃培养18～24h，搅拌速度150～200rpm，通气量为1～2vvm，得到芽孢杆菌的一级种子液；所述的一级种子液体培养基配方为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：120目豆粕粉0.5～2.0％、120目鱼粉0.2～1.5％、120目玉米面0.5～1.0％、葡萄糖1.0～4.5％、NaCl 0.1～0.3％、NaOH 0.05～0.10％、Na₂HPO₄ 0.1～0.5％、增效剂0.05～0.2％，消泡剂0.05～0.1％，pH＝7.5～7.6，经121℃灭菌30～45分钟，冷却到32～37℃；所述的增效剂为由MgSO₄ 0.1～0.5g/L，CaCl₂1.0～4.0g/L，ZnSO₄ 0.2～1.5g/L，FeSO₄ 0.1～0.8g/L，CuSO₄ 0.01～0.05g/L，Co(NO₃)₂ 0.02～0.06g/L，MnSO₄ 0.3～1.5g/L组成的水溶液；

4)二级发酵(生产发酵)：将步骤3)得到的芽孢杆菌一级种子液，以5～10％的体积比接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同于步骤3)的一级种子液体培养基，发酵16～24小时后，通过显微镜观察，有大量芽孢形成时停止发酵；

5)将芽孢杆菌的发酵液，按照发酵液与载体的重量比为0.5～0.8∶1的比例混合均匀，呈湿粉状，然后在流化干燥床上于80～100℃干燥后粉碎到80目以上，得到芽孢杆菌干粉B，最后按照芽孢杆菌平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用载体将活菌含量分别稀释到≥60亿/g；所述的载体(吸附剂)配比为：轻质CaCO₃ 30～60wt％、次粉20～40wt％、玉米蛋白粉20～30wt％。

所述的酵母菌干粉C是由如下的方法制得的：

1)平板培养复壮：将酵母斜面种子采用划线接种的方法在酵母平板培养基上划线接种，于24～30℃培养20～24小时，使酵母复壮，并形成单菌落；所述的酵母平板培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合物：大豆蛋白胨0.2～0.7％、葡萄糖0.5～1.5％、酵母浸粉0.1～0.5％、麦芽膏0.2～1％、琼脂粉2～3％，pH＝5.8～6.0，121℃灭菌15分钟，备用；所述的酵母包括：酿酒酵母或啤酒酵母、深红酵母、红法夫酵母、白球拟酵母、毕赤酵母、中国红酵母、产朊假丝酵母；

2)制作摇瓶种子：从步骤1)培养的酵母培养平板中挑单菌落，接种到三角瓶液体培养液中，于28～32℃培养24～37小时，得到酵母摇瓶种子液；所述的培养液为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：大豆蛋白胨0.2～0.7％、葡萄糖0.5～1.5％、酵母浸粉0.1～0.5％、麦芽膏0.2～1％，pH＝5.8～6.0，121℃灭菌15分钟，备用；

3)生产一级种子液：将步骤2)得到的酵母摇瓶种子按5～12v％的接种量，接种于一级种子罐的一级种子培养液中，于28～37℃培养24～37小时，搅拌速度160～220rpm，通气量为1.0～3.0vvm，得到酵母的一级种子液；所述的酵母一级种子培养液为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：120目豆粕粉0.5～1.5％、120目鱼粉0.2～0.8％、120目玉米面0.5～1.0％、葡萄糖0.3～1.0％、NaCl 0.1～0.3％、Na₂HPO₄ 0.2～0.5％、增效剂0.05～0.2％，消泡剂0.03～0.1％，pH＝5.8～6.0，经121℃灭菌30～45分钟，冷却到28～37℃；所述的增效剂为由MgSO₄ 0.05～0.3g/L，CaCl₂ 2.5～4g/L，ZnSO₄ 0.6～1.5g/L，FeSO₄0.1～1.0g/L，MnSO₄ 0.4～0.8g/L，CuSO₄ 0.02～0.08g/L组成的水溶液；

4)二级发酵(生产发酵)：将步骤3)得到的酵母一级种子，以4～10％体积比接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同于步骤3)的一级种子培养液，发酵24～60小时后，用步骤1)的培养基，用平板计法或血球计数法检测酵母菌数达到10亿/ml时停止发酵；

5)将上述酵母菌的发酵液加入预先混合好的载体中，发酵液与载体的重量比为0.6～0.9∶1，流化床干燥，干燥温度45～60℃，得到酵母菌干粉C，然后按照酵母平板培养复壮所用的培养基和条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用上述载体将活菌含量稀释到≥4亿/g，备用；所述载体配比为：轻质CaCO₃ 30～60wt％、次粉20～40wt％、玉米蛋白粉20～30wt％。

所述的乳酸菌干粉D是由如下的方法制得的：

1)平板培养复壮：将乳酸菌斜面种子采用划线接种的方法在乳酸菌平板培养基上划线接种，于33～38℃培养24～48小时，使乳酸菌复壮，并形成单菌落；所述的乳酸菌平板培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合物：大豆蛋白胨0.5～1％、葡萄糖1～2％、酵母浸粉0.3～0.7％、磷酸二氢钾0.3～0.5％、牛肉膏0.5～1.5％、柠檬酸三铵1.5～2.3％、Tween-80 0.5～1.4％、乙酸钠0.2～0.6％、琼脂粉2～2.5％，pH＝5.5～5.8，121℃灭菌15分钟，备用；所述的乳酸菌包括：嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、德氏乳杆菌、发酵乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳脂链球菌、粪链球菌、乳酸链球菌、嗜热链球菌、乳酸片球菌、啤酒片球菌、屎链球菌、芽孢乳杆菌、嗜热乳杆菌；

2)制作摇瓶种子：将步骤1)培养的乳酸菌菌落中挑单菌落，接种到乳酸菌液体培养基中，采用常规方法在三角瓶液体培养基上于35～40℃培养24～48小时，得到乳酸菌摇瓶种子；所述的培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：大豆蛋白胨0.5～1％、葡萄糖1～2％、酵母浸粉0.3～0.7％、磷酸二氢钾0.3～0.5％、牛肉膏0.5～1.5％、柠檬酸三铵1.5～2.3％、Tween-80 0.5～1.4％、乙酸钠0.2～0.6％，pH＝5.5～5.8，121℃灭菌15分钟，备用；

3)生产一级种子液：将步骤2)得到的乳酸菌摇瓶种子以6～12v％的接种量，接种于一级种子罐中的液体培养基中，于35～38℃培养17～60h，搅拌速度150～200rpm，间隔1小时通气5～10分钟，通气量为1～2.5vvm，直至乳酸菌数达到10亿，得到乳酸菌的一级种子液；所述的一级种子液体培养基配方为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：120目豆粕粉0.5～2.0％、120目鱼粉0.5～1.0％、鱼蛋白胨0.5～2％，乳糖0.2～1.5％，120目玉米面0.5～1.0％、葡萄糖1～2.5％、NaCl 0.1～0.3％、Na₂HPO₄ 0.15～0.3％、增效剂0.05～0.3％，消泡剂0.03～0.1％，pH＝5.5～5.8，经121℃灭菌30～45分钟，冷却到32～37℃；所述的增效剂为由CaCl₂ 2～4g/L，ZnSO₄ 0.5～1.5g/L，FeSO₄ 0.2～1.0g/L，CuSO₄0.01～0.08g/L，Co(NO₃)₂ 0.02～0.06g/L，MgSO₄ 0.1～0.5g/L组成的水溶液；

4)二级发酵(生产发酵)：将步骤3)得到的乳酸菌一级种子，以5～10％体积比接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同于步骤3)的一级种子液体培养基，发酵17～60小时后，检测pH值下降到5.0左右时(此时，多次试验的结果表明，乳酸菌量已达到大于10⁹CFU/ml发酵液)停止发酵；

5)将乳酸菌发酵液加入预先混合好的载体中，浓缩液与载体的重量比为0.4～0.9∶1，然后经流化床45～60℃干燥，粉碎到80目以上，得到乳酸菌干粉D；最后，按照乳酸菌平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用所述的载体将活菌含量分别稀释到≥4亿/g，备用；所述载体配比为：轻质CaCO₃ 30～60wt％、次粉20～40wt％、玉米蛋白粉20～30wt％。

本发明提供一种所述的小肽与有益微生物合生元(素)饲料添加剂的用途。该添加剂用作抗生素替代品，消除药物残留，提高肉蛋奶等产品品质，可用于防治各种动物拉稀腹泻，提高动物生产性能(增加肉、蛋、奶产量)、提高免疫力、抗病力和饲料转化效率、降低动物死淘率，还可用于制作青贮、黄贮饲料和生物饲料，棉粕(饼)和菜粕(饼)脱毒，净化厩舍环境(除臭降氨)和净化鱼虾池水质等。

本发明提供的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂充分利用了益生型芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌和小肽的优点：(1)益生型芽孢杆菌不易失活、稳定性高，到达动物肠道内能有效调节肠道微生态平衡；(2)益生型芽孢杆菌进入消化道后能迅速发育、生长，产生很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，促进蛋白质、脂肪和淀粉的消化利用；同时，对木聚糖、***聚糖、半乳聚糖、果胶等也有降解能力；有的芽孢杆菌还能产生维生素B和维生素K。因此，芽孢具有很好的助消化、促生长作用。(3)益生型芽孢杆菌在代谢过程中此类菌通过降低消化道内氧化还原电位，以及产生少量抗菌物质，对有害微生物起到抑制和杀灭作用。(4)益生型芽孢杆菌的孢子对热、压、酸、碱、酶及某些药物、X射线等不良环境具有很强的耐受性，在饲料加工、贮存及消化道中稳定性好，无需特殊保护性处理，故应用较为广泛；(5)乳酸菌是动物消化道内正常微生物区系中的优势菌群，与动物“终生为伴，终生为益”，发挥着拮抗病原微生物(如大肠杆菌和沙门氏菌等)、启动特异和非特异性免疫***(增强免疫力和抗病力)、降低胆固醇、中和肠毒素、合成营养物质、产生消化酶类并调节畜禽营养代谢等功能。(6)酵母菌不仅能帮助动物消化，还能促进消化道内源有益微生物的活力，补充B族维生素，其细胞壁多糖还具有刺激动物免疫力，提高抗病力的功效。(7)本发明的小肽具有显著促进胃肠道中如芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌等微生物的生长增殖和活跃其代谢作用，且活性高，如可使瘤胃细菌的生长速度提高70％，每升瘤胃液的小肽浓度达到10mg即可足以使有益菌的生长达到最理想的程度，因此，将小肽与芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌组合后所发挥的作用或功效远远超过单独使用的效果，是替代抗生素等促生长保健剂的主力军；(8)本发明产品还可以刺激动物免疫器官发育，增强免疫力，减少发病率，替代抗生素，降低药物残留，可广泛用于禽、牛、羊、猪、水产和经济动物，实现绿色化养殖，这具有重大的经济效益、社会效益和生态效益；(9)本发明提供的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂是一种绿色饲料添加剂，其推广和应用有利于人类的健康和畜禽产品品质的提高。

具体实施方式

实施例1、利用豆粕和枯草芽孢杆菌制备小肽干粉A-1

1)将枯草芽孢杆菌接入121℃灭菌30分钟并冷却到28℃后的液体培养基中，28℃培养24小时，得到种子液；所述的液体培养基为按下述比例配制的混合液：蛋白胨1.3g，葡萄糖3g，糖蜜3g，马铃薯浸液50ml，可溶性淀粉10g，蔗糖10g，牛肉膏2g，酵母浸粉3.5g，豆粕粉(60目)1.5g，生长因子1ml，水1000ml；其中的生长因子为含有MgSO₄.7H₂O20.00mg/ml，CaCl₂.2H₂O 2.20mg/ml，ZnSO₄.7H₂O 0.81mg/ml，FeSO₄.7H₂O 0.44mg/ml，MnSO₄.H₂O 0.13mg/ml，CuSO₄.5H₂O 0.02mg/ml的混合物。

2)将发酵底物——大豆蛋白粉粉碎到60目后放入发酵罐中，依次加入水和碳源——玉米面和甘蔗糖蜜(重量比为1∶1)，所加入水的重量与发酵底物所含蛋白质的重量比为100∶5，所加入碳源的含碳量与发酵底物的含氮量的重量比为1∶2，再加入消泡剂0.03％，混匀，将混合物(培养液)在0.1MPa，121℃灭菌30分钟，冷却到28℃，加入步骤1)得到的种子液，种子液和培养液的体积比为0.3∶10，混合均匀后在28℃，以0.5vvm的速度通入无菌空气，以150rpm速度搅拌发酵，期间用常规的茚三酮法显色法测定水解度(Degreeof Hydrolysis，DH％)，24小时前每6小时检测一次水解度，24～48小时之间，每4小时检测一次水解度，48小时后每2小时检测一次水解度，直到蛋白水解液的水解度达到25％，然后经超高温瞬时灭菌机于140℃灭菌8秒，得到含小肽的蛋白水解液剂。

3)离心除渣：将步骤2)得到的含小肽的蛋白水解液5000rpm离心30分钟，除去渣质，得到的上清液再通过膜截留分子量为1000Da的超滤器除去大分子蛋白等杂质，得到分子量≤1000Da的滤液；将此滤液经负压真空浓缩到原体积的50％，得到的浓缩液加到预先混合好的载体中，按浓缩液∶载体＝0.5∶1的体积重量比混合，所述载体为5重量份有机载体(2重量份麦麸，2重量份豆粕粉，1重量份玉米蛋白粉)和5重量份无机载体(轻质碳酸钙)组成，搅拌均匀后在45℃干燥，然后粉碎到80目以上，得到小肽干粉A-1。

实施例2、利用豆粕和黑曲霉菌制备小肽干粉A-2

1)将黑曲霉菌接入121℃灭菌30分钟并冷却到35℃后的液体培养基中，35℃培养24小时，得到种子液；所述的液体培养基为按下述比例配制的混合液：蛋白胨2.5g，葡萄糖5g，糖蜜5g，马铃薯浸液100ml，可溶性淀粉20g，蔗糖30g，牛肉膏3g，酵母浸粉5g，豆粕2g，生长因子2ml，水1000ml；其中的生长因子为含有MgSO₄.7H₂O 30.00mg/ml，CaCl₂.2H₂O 3.50mg/ml，ZnSO₄.7H₂O 1.10mg/ml，FeSO₄.7H₂O 0.60mg/ml，MnSO₄.H₂O0.20mg/ml，CuSO₄.5H₂O 0.04mg/ml的混合物。

2)将发酵底物——豆粕粉碎到120目后放入发酵罐中，依次加入水和碳源——玉米糖蜜和白砂糖(重量比＝3∶2)，所加入水的重量与发酵底物所含蛋白质的重量比为100∶18，所加入碳源的含碳量与发酵底物的含氮量的重量比为1∶35，再加入消泡剂0.1％，混匀，将混合物(即培养液)在0.1MPa，125℃灭菌10分钟，冷却到20℃，加入步骤1)得到的种子液，种子液和培养液的体积比为1∶10，混合均匀后在42℃，以2.5vvm的速度通入无菌空气，以300rpm速度搅拌发酵，期间用常规的茚三酮法显色法测定水解度(DH％)，24小时前每6小时检测一次水解度，24～48小时之间，每4小时检测一次水解度，48小时后每2小时检测一次水解度，直到蛋白水解液的水解度(DH％)达到40％，然后经超高温瞬时灭菌机于145℃灭菌2秒，得到含小肽的蛋白水解液剂。

3)离心除渣：将步骤2)得到的含小肽的蛋白水解液于7000rpm离心10分钟，除去渣质，得到的上清液再通过膜截留分子量为1000Da的超滤器除去大分子蛋白等杂质，得到分子量≤1000Da的滤液；将此滤液经负压真空浓缩到原体积的50％，得到的浓缩液加到预先混合好的载体中，按浓缩液∶载体＝0.8∶1的体积重量比混合，所述载体为2重量份有机载体(玉米芯粉)和3重量份无机载体(石粉)组成，搅拌均匀后在80℃干燥，然后粉碎到80目以上，得到小肽干粉A-2。

实施例3、利用豆饼粉和米曲霉菌制备小肽干粉A-3

1)将米曲霉菌接入121℃灭菌30分钟并冷却到32℃后的液体培养基中，32℃培养36小时，得到种子液；所述的液体培养基为按下述比例配制的混合液：蛋白胨1.8g，葡萄糖4g，糖蜜4g，马铃薯浸液70ml，可溶性淀粉15g，蔗糖20g，牛肉膏2.5g，酵母浸粉4g，豆粕粉(80目)1.8g，生长因子1.5ml，水1000ml；其中的生长因子为含有MgSO₄.7H₂O25.00mg/ml，CaCl₂.2H₂O 3.00mg/ml，ZnSO₄.7H₂O 1.00mg/ml，FeSO₄.7H₂O 0.50mg/ml，MnSO₄.H₂O 0.17mg/ml，CuSO₄.5H₂O 0.03mg/ml的混合液。

2)将发酵底物——豆饼粉碎到80目后放入发酵罐中，依次加入水和碳源——淀粉，所加入水的重量与发酵底物所含蛋白质的重量比为100∶10，所加入碳源的含碳量与发酵底物的含氮量的重量比为1∶10，再加入消泡剂0.06％，混匀，将混合物(即培养液)在0.11MPa，123℃灭菌20分钟，冷却到32℃，加入步骤1)得到的种子液，种子液和培养液的体积比为0.5∶10，混合均匀后在28℃，以1.5vvm的速度通入无菌空气，以180rpm速度搅拌发酵，期间用常规的茚三酮法显色法测定水解度(DH％)，24小时前每6小时检测一次水解度，24～48小时之间，每4小时检测一次水解度，48小时后每2小时检测一次水解度，直到蛋白水解液的水解度(DH％)达到30％，然后经超高温瞬时灭菌机于142℃灭菌6秒，得到含小肽的蛋白水解液剂。

3)离心除渣：将步骤2)得到的含小肽的蛋白水解液于6000rpm离心15分钟，除去渣质，得到的上清液再通过膜截留分子量为1000Da的超滤器除去大分子蛋白等杂质，得到分子量≤1000Da的滤液；将此滤液经负压真空浓缩到原体积的50％，得到的浓缩液加到预先混合好的载体中，按浓缩液∶载体＝0.7∶1的体积重量比混合，所述载体为3重量份有机载体(脱脂稻壳粉)和4重量份无机载体(麦饭石)组成，搅拌均匀后在60℃干燥，然后粉碎到80目以上，得到小肽干粉A-3。

实施例4、利用鱼粉和纳豆芽孢杆菌制备小肽干粉A-4

1)将纳豆芽孢杆菌接入121℃灭菌30分钟并冷却到30℃后的液体培养基中，30℃培养24小时，得到种子液；所述的液体培养基为按下述比例配制的混合液：蛋白胨2.0g，葡萄糖4g，糖蜜4g，马铃薯浸液80ml，可溶性淀粉15g，蔗糖17g，牛肉膏2.2g，酵母浸粉4.5g，豆粕粉(80目)1.7g，生长因子1.7ml，水1000ml；其中的生长因子为含有MgSO₄.7H₂O 25.00mg/ml，CaCl₂.2H₂O 3.00mg/ml，ZnSO₄.7H₂O 0.90mg/ml，FeSO₄.7H₂O0.50mg/ml，MnSO₄.H₂O 0.18mg/ml，CuSO₄.5H₂O 0.033mg/ml的混合液。

2)将发酵底物——鱼粉粉碎到80目后放入发酵罐中，依次加入水和碳源——甜菜糖蜜，所加入水的重量与发酵底物所含蛋白质的重量比为100∶15，所加入碳源的含碳量与发酵底物的含氮量的重量比为1∶20，再加入消泡剂0.08％，混匀，将混合物(即培养液)在0.11MPa，121℃灭菌30分钟，冷却到36℃，加入步骤1)得到的种子液，种子液和培养液的体积比为0.5∶10，混合均匀后在32℃，以0.8vvm的速度通入无菌空气，以260rpm速度搅拌发酵，期间用常规的茚三酮法显色法测定水解度(DH％)，24小时前每6小时检测一次水解度，24～48小时之间，每4小时检测一次水解度，48小时后每2小时检测一次水解度，直到蛋白水解液的水解度(DH％)达到35％，然后经超高温瞬时灭菌机于143℃灭菌5秒，得到含小肽的蛋白水解液剂。

3)离心除渣：将步骤2)得到的含小肽的蛋白水解液于6500rpm离心13分钟，除去渣质，得到的上清液再通过膜截留分子量为1000Da的超滤器除去大分子蛋白等杂质，得到分子量≤1000Da的滤液；将此滤液经负压真空浓缩到原体积的50％，得到的浓缩液加到预先混合好的载体中，按浓缩液∶载体＝0.6∶1的体积重量比混合，所述载体为2重量份有机载体(麦麸)和3重量份无机载体(轻质碳酸钙)组成，搅拌均匀后在70℃干燥，然后粉碎到80目以上，得到小肽干粉A-4。实施例5～24、制备小肽干粉A-5～A-24

按照实施例1～4的方法制备小肽干粉A-5～A-24，制备条件列于表1。

                                     表1、小肽干粉A-5～A-24的制备

实施例	小肽干粉	制备法(同实施例X)	制备种子液所用菌种	发酵底物	碳源	蛋白水解度	有机载体(重量份)	无机载体(重量份)
									5	A-5	1	栖土曲霉菌	碗豆蛋白玉米蛋白	玉米面	25	玉米芯粉3	石粉4
6	A-6	2	米曲霉	红豆蛋白小麦蛋白血粉	食用红糖	27	脱脂稻壳粉4	麦饭石5
									7	A-7	3	纳豆芽孢杆菌	大麦蛋白棉籽粕鱼粉	食用白糖	34	脱脂米糠5	沸石粉5
8	A-8	4	黑曲霉	棉籽粕菜籽粕羽毛粉	玉米糖浆	32	豆粕粉2	轻质碳酸钙2石粉2
									9	A-9	1	枯草芽孢杆菌	乳蛋白筋肉酪蛋白	甘蔗糖蜜	35	豆饼粉3	石粉1麦饭石1沸石粉1
10	A-10	2	短小芽孢杆菌	动物废弃脏器蚯蚓蛋白粉	甜菜糖蜜	40	玉米蛋白粉4	麦饭石2沸石粉1
									11	A-11	3	短小芽孢杆菌黑曲霉	鱿鱼蛋白角皮	玉米面红糖	40	麦麸2玉米芯粉3	石粉2麦饭石2
12	A-12	4	短小芽孢杆菌枯草芽孢杆菌	玉米蛋白	红糖食用白糖	35	麦麸1脱脂稻壳粉1	轻质碳酸钙2石粉1麦饭石2
									13	A-13	1	栖土曲霉菌枯草芽孢杆菌	筋肉	食用白糖玉米糖浆	33	麦麸2脱脂米糠1	轻质碳酸钙2石粉2
14	A-14	2	米曲霉菌栖土曲霉菌	蚯蚓蛋白粉	玉米糖浆淀粉	40	麦麸1豆粕粉3	石粉2麦饭石1
									15	A-15	3	枯草芽孢杆菌纳豆芽孢杆菌	鱿鱼蛋白	淀粉甘蔗糖蜜	38	麦麸2豆饼粉3	轻质碳酸钙3
16	A-16	4	米曲霉菌栖土曲霉菌	鱼皮	淀粉甜菜糖蜜	33	玉米芯粉1脱脂稻壳粉1	石粉4
									17	A-17	1	米曲霉菌栖土曲霉菌黑曲霉	红豆蛋白	淀粉甘蔗糖蜜甜菜糖蜜	36	玉米芯粉1豆粕粉2	麦饭石5
18	A-18	2	枯草芽孢杆菌纳豆芽孢杆菌	小麦蛋白	玉米面	30	脱脂稻壳粉1豆粕粉2玉米蛋白粉1	沸石粉5
									19	A-19	3	米曲霉菌栖土曲霉菌	大麦蛋白	食用红糖	35	脱脂米糠1豆粕粉2豆饼粉2	轻质碳酸钙4
20	A-20	4	栖土曲霉菌	棉籽粕	食用白糖	33	玉米芯粉1豆粕粉1	石粉3
									21	A-21	1	米曲霉	菜籽粕	玉米糖浆	26	麦麸3	麦饭石3
22	A-22	2	纳豆芽孢杆菌	羽毛粉	淀粉	29	玉米芯粉4	沸石粉4
									23	A-23	3	黑曲霉	乳蛋白	甘蔗糖蜜	33	脱脂稻壳粉5	轻质碳酸钙5
24	A-24	4	枯草芽孢杆菌	酪蛋白	甜菜糖蜜	31	脱脂米糠2	石粉5

实施例25、制备枯草芽孢杆菌干粉B-1

1)平板培养复壮：将枯草芽孢杆菌菌种采用划线接种的方法在芽孢杆菌平板培养基上划线接种，于25℃培养12小时，使枯草芽孢杆菌复壮，并形成单菌落；所述的枯草芽孢杆菌培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合物：蛋白胨0.5％、葡萄糖0.5％、牛肉膏0.5％、磷酸二氢钾0.3％、琼脂3％，pH＝7.5～7.6，121℃灭菌30分钟，备用；

2)制作摇瓶(三角瓶)种子：从步骤1)培养的枯草芽孢杆菌菌落中挑选典型的单菌落，接种到芽孢杆菌液体培养基中，于28℃培养20小时，得到枯草芽孢杆菌摇瓶种子液；所述的芽孢杆菌液体培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：蛋白胨0.5％、葡萄糖0.5％、牛肉膏0.5％、磷酸二氢钾0.3％、3.08％硫酸锰溶液0.5％，pH＝7.5～7.6，121℃灭菌30分钟，冷却到28℃，备用；

3)生产一级种子液：先按照下述重量体积比(W/V)配制一级种子液体培养基：120目豆粕粉0.5％、120目鱼粉0.2％、120目玉米面0.5％、葡萄糖1.0％、NaCl 0.1％、NaOH0.05％、Na₂HPO₄ 0.1％、增效剂0.05％，消泡剂0.08％；其中的增效剂为由MgSO₄ 0.1g/L，CaCl₂ 1.0g/L，ZnSO₄ 0.2g/L，FeSO₄ 0.1g/L，CuSO₄ 0.01g/L，Co(NO₃)₂ 0.02g/L，MnSO₄ 0.3g/L组成的水溶液；该一级种子液体培养基的pH＝7.5～7.6，经121℃灭菌45分钟，冷却到32℃，然后将步骤2)得到的枯草芽孢杆菌摇瓶种子液以2v％的接种量，接种于生产所用的一级种子罐的一级种子液体培养基中，于32℃培养18h，搅拌速度150rpm，通气量为1vvm，得到枯草芽孢杆菌的一级种子液；

4)二级发酵(生产发酵)：将步骤3)得到的枯草芽孢杆菌一级种子液，以5％体积的比例接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同步骤3)，发酵16小时后，通过显微镜观察，有大量芽孢形成时，停机，得到枯草芽孢杆菌的发酵液。

5)将枯草芽孢杆菌的发酵液，按照发酵液与载体的重量比为0.5∶1的比例混合均匀，呈湿粉状，所述的载体(吸附剂)配比为：轻质CaCO₃ 60wt％、次粉20wt％、玉米蛋白粉20wt％，然后在流化干燥床上于80℃干燥后粉碎到80目以上，得到芽孢杆菌干粉B-1，最后按照芽孢杆菌平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用载体将活菌含量分别稀释到≥60亿/g。

实施例26、制备枯草芽孢杆菌干粉B-2

1)平板培养复壮：将枯草芽孢杆菌菌种采用划线接种的方法在芽孢杆菌平板培养基上划线接种，于30℃培养18小时，使枯草芽孢杆菌复壮，并形成单菌落；所述的枯草芽孢杆菌培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合物：蛋白胨0.8％、葡萄糖1.3％、牛肉膏1.0％、磷酸二氢钾0.5％、琼脂3.5％，pH＝7.5～7.6，121℃灭菌30分钟，备用；

2)制作摇瓶(三角瓶)种子：从步骤1)培养的枯草芽孢杆菌菌落中挑选典型的单菌落，接种到芽孢杆菌液体培养基中，于32℃培养24小时，得到枯草芽孢杆菌摇瓶种子液；所述的芽孢杆菌液体培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：蛋白胨0.8％、葡萄糖1.3％、牛肉膏1.0％、磷酸二氢钾0.5％、琼脂3.5％、3.08％硫酸锰溶液1.0％，pH＝7.5～7.6，121℃灭菌30分钟，冷却到32℃，备用；

3)生产一级种子液：先按照下述重量体积比(W/V)配制一级种子液体培养基：120目豆粕粉1.0％、120目鱼粉1.0％、120目玉米面0.7％、葡萄糖2.5％、NaCl 0.2％、NaOH0.08％、Na₂HPO₄ 0.3％、增效剂0.1％，消泡剂0.08％；其中的增效剂为由MgSO₄ 0.5g/L，CaCl₂ 4.0g/L，ZnSO₄ 1.5g/L，FeSO₄ 0.8g/L，CuSO₄ 0.05g/L，Co(NO₃)₂ 0.06g/L，MnSO₄ 1.5g/L组成的水溶液；该一级种子液体培养基的pH＝7.5～7.6，经121℃灭菌35分钟，冷却到35℃，然后将步骤2)得到的枯草芽孢杆菌摇瓶种子液以3v％的接种量，接种于生产所用的一级种子罐的一级种子液体培养基中，于35℃培养20h，搅拌速度180rpm，通气量为1.5vvm，得到枯草芽孢杆菌的一级种子液；

4)二级发酵(生产发酵)：将步骤3)得到的枯草芽孢杆菌一级种子液，以10％体积的比例接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同步骤3)，发酵20小时后，通过显微镜观察，有大量芽孢形成时停机，得到枯草芽孢杆菌的发酵液。

5)将枯草芽孢杆菌的发酵液，按照发酵液与载体的重量比为0.7∶1的比例混合均匀，呈湿粉状，所述的载体(吸附剂)配比为：轻质CaCO₃ 45wt％、次粉30wt％、玉米蛋白粉25wt％，然后在流化干燥床上于90℃干燥后粉碎到80目以上，得到芽孢杆菌干粉B-2，最后按照芽孢杆菌平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用载体将活菌含量分别稀释到≥60亿/g。

实施例27、制备枯草芽孢杆菌干粉B-3

1)平板培养复壮：将枯草芽孢杆菌菌种采用划线接种的方法在芽孢杆菌平板培养基上划线接种，于35℃培养24小时，使枯草芽孢杆菌复壮，并形成单菌落；所述的枯草芽孢杆菌培养基为按下述重量体积比配制的混合物：蛋白胨1％、葡萄糖2％、牛肉膏1.5％、磷酸二氢钾0.6％、琼脂4％，pH＝7.5～7.6，121℃灭菌30分钟，冷却到35℃，备用；

2)制作摇瓶(三角瓶)种子：从步骤1)培养的枯草芽孢杆菌菌落中挑选典型的单菌落，接种到芽孢杆菌液体培养基中，于37℃培养30小时，得到枯草芽孢杆菌摇瓶种子液；所述的芽孢杆菌液体培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：蛋白胨1.0％、葡萄糖2％、牛肉膏1.5％、磷酸二氢钾0.6％、琼脂4％，3.08％硫酸锰溶液1.5％，pH＝7.5～7.6，121℃灭菌30分钟，冷却到37℃，备用；

3)生产一级种子液：先按照下述重量体积比(W/V)配制一级种子液体培养基：120目豆粕粉2.0％、120目鱼粉1.5％、120目玉米面1.0％、葡萄糖4.5％、NaCl 0.3％、NaOH0.1％、Na₂HPO₄ 0.5％、增效剂0.2％，消泡剂0.1％；其中的增效剂为由MgSO₄ 0.3g/L，CaCl₂3.0g/L，ZnSO₄ 0.8g/L，FeSO₄ 0.4g/L，CuSO₄ 0.03g/L，Co(NO₃)₂0.04g/L，MnSO₄ 1.0g/L组成的水溶液；该一级种子液体培养基的pH＝7.5～7.6，经121℃灭菌30分钟，冷却到37℃，然后将步骤2)得到的枯草芽孢杆菌摇瓶种子液以5v％的接种量，接种于生产所用的一级种子罐的一级种子液体培养基中，于37℃培养24h，搅拌速度200rpm，通气量为2.0vvm，得到枯草芽孢杆菌的一级种子液；

4)二级发酵(生产发酵)：将步骤3)得到的枯草芽孢杆菌一级种子液，以7％体积的比例接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同步骤3)，发酵24小时后，通过显微镜观察，有大量芽孢形成时，停机，得到枯草芽孢杆菌的发酵液。

5)将枯草芽孢杆菌的发酵液，按照发酵液与载体的重量比为0.8∶1的比例混合均匀，呈湿粉状，所述的载体(吸附剂)配比为：轻质CaCO₃ 30wt％、次粉40wt％、玉米蛋白粉30wt％，然后在流化干燥床上于100℃干燥后粉碎到80目以上，得到芽孢杆菌干粉B-3，最后按照芽孢杆菌平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用载体将活菌含量分别稀释到≥60亿/g。

实施例28～40、制备芽孢杆菌干粉B-4～B-16

按照实施例25～27的方法制备芽孢杆菌干粉B-4～B-16，制备条件列于表2。

                     表2、芽孢杆菌干粉B-4～B-16的制备

实施例	芽孢杆菌干粉	制备法(同实施例X)	制备种子液所用菌种	载体及后处理条件(同实施例X)
					28	B-4	25	凝结芽孢杆菌	27
29	B-5	26	缓慢芽孢杆菌	26
					30	B-6	27	地衣芽孢杆菌	25
31	B-7	25	短小芽孢杆菌	27
					32	B-8	26	环状芽孢杆菌	26
33	B-9	27	坚强芽孢杆菌	25
					34	B-10	25	巨大芽孢杆菌	27
35	B-11	26	丁酸梭菌	26
					36	B-12	27	纳豆芽孢杆菌	25
37	B-13	26	蜡状芽孢杆菌	27
					38	B-14	26	纳豆芽孢杆菌枯草芽孢杆菌	26
39	B-15	25	丁酸梭菌凝结芽孢杆菌	25
					40	B-16	27	地衣芽孢杆菌环状芽孢杆菌	26

实施例41、制备深红酵母菌干粉C-1

1)平板培养复壮：将深红酵母斜面种子采用划线接种的方法在酵母平板培养基上划线接种，于24℃培养20小时，使酵母复壮，并形成单菌落；所述的酵母平板培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合物：大豆蛋白胨0.2％、葡萄糖0.5％、酵母浸粉0.1％、麦芽膏0.2％、琼脂粉2％，pH＝5.8～6.0，121℃灭菌15分钟，冷却到24℃备用；

2)制作摇瓶种子：从步骤1)培养的深红酵母培养平板中挑单菌落，接种到三角瓶液体培养液中，于28℃培养24小时，得到酵母摇瓶种子液；所述的培养液为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：大豆蛋白胨0.2％、葡萄糖0.5％、酵母浸粉0.1％、麦芽膏0.2％，pH＝5.8～6.0，121℃灭菌15分钟，冷却到28℃，备用；

3)生产一级种子液：将步骤2)得到的酵母摇瓶种子按5v％的接种量，接种于一级种子罐的一级种子培养液中，于28℃培养24小时，搅拌速度160rpm，通气量为1.0vvm，得到酵母的一级种子液；所述的酵母一级种子培养液为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：120目豆粕粉0.5％、120目鱼粉0.2％、120目玉米面0.5％、葡萄糖0.3％、NaCl 0.1％、Na₂HPO₄ 0.2％、增效剂0.05％，消泡剂0.03％，pH＝5.8～6.0，经121℃灭菌30分钟，冷却到28℃；所述的增效剂为由MgSO₄ 0.05g/L，CaCl₂ 2.5g/L，ZnSO₄ 0.6g/L，FeSO₄ 0.1g/L，MnSO₄ 0.4g/L，CuSO₄ 0.02g/L组成的水溶液；

4)二级发酵(生产发酵)：将步骤3)得到的酵母一级种子，以4％体积比接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同于步骤3)的一级种子培养液，发酵24小时后，用步骤1)的培养基，用平板计数法或血球计数法检测酵母菌数达到10亿/ml时停止发酵；

5)将上述酵母菌的发酵液加入预先混合好的载体中，所述载体包括：轻质CaCO₃60wt％、次粉20wt％、玉米蛋白粉20wt％，发酵液与载体的重量比为0.6∶1，流化床干燥，干燥温度45℃，得到酵母菌干粉C-1，然后按照酵母平板培养复壮所用的培养基和条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用上述载体将活菌含量稀释到≥4亿/g，备用。

实施例42、制备深红酵母菌干粉C-2

1)平板培养复壮：将深红酵母斜面种子采用划线接种的方法在酵母平板培养基上划线接种，于28℃培养22小时，使酵母复壮，并形成单菌落；所述的酵母平板培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合物：大豆蛋白胨0.5％、葡萄糖1.0％、酵母浸粉0.3％、麦芽膏0.6％、琼脂粉2.5％，pH＝5.8～6.0，121℃灭菌15分钟，冷却到28℃备用；

2)制作摇瓶种子：从步骤1)培养的酵母培养平板中挑单菌落，接种到三角瓶液体培养液中，于30℃培养30小时，得到酵母摇瓶种子液；所述的培养液为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：大豆蛋白胨0.5％、葡萄糖1.0％、酵母浸粉0.3％、麦芽膏0.6％，pH＝5.8～6.0，121℃灭菌15分钟，冷却到30℃，备用；

3)生产一级种子液：将步骤2)得到的酵母摇瓶种子按9v％的接种量，接种于一级种子罐的一级种子培养液中，于33℃培养30小时，搅拌速度200rpm，通气量为2.0vvm，得到酵母的一级种子液；所述的酵母一级种子培养液为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：120目豆粕粉1.0％、120目鱼粉0.7％、120目玉米面0.7％、葡萄糖0.6％、NaCl 0.2％、Na₂HPO₄ 0.35％、增效剂0.13～0.2％，消泡剂0.06％，pH＝5.8～6.0，经121℃灭菌40分钟，冷却到33℃；所述的增效剂为由MgSO₄ 0.1g/L，CaCl₂ 3.0g/L，ZnSO₄ 0.9g/L，FeSO₄ 0.5g/L，MnSO₄ 0.6g/L，CuSO₄ 0.05g/L组成的水溶液；

4)二级发酵(生产发酵)：将步骤3)得到的酵母一级种子，以7％体积比接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同于步骤3)的一级种子培养液，发酵48小时后，用步骤1)的培养基，用平板计数法或血球计数法检测酵母菌数达到10亿/ml时停止发酵；

5)将上述酵母菌的发酵液加入预先混合好的载体中，所述载体包括：轻质CaCO₃45wt％、次粉30wt％、玉米蛋白粉25wt％，发酵液与载体的重量比为0.8∶1，流化床干燥，干燥温度50℃，得到酵母菌干粉C-2，然后按照酵母平板培养复壮所用的培养基和条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用上述载体将活菌含量稀释到≥4亿/g，备用。

实施例43、制备深红酵母菌干粉C-3

1)平板培养复壮：将深红酵母斜面种子采用划线接种的方法在酵母平板培养基上划线接种，于30℃培养24小时，使酵母复壮，并形成单菌落；所述的酵母平板培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合物：大豆蛋白胨0.7％、葡萄糖1.5％、酵母浸粉0.5％、麦芽膏1％、琼脂粉3％，pH＝5.8～6.0，121℃灭菌15分钟，冷却到30℃备用；

2)制作摇瓶种子：从步骤1)培养的酵母培养平板中挑单菌落，接种到三角瓶液体培养液中，于32℃培养37小时，得到酵母摇瓶种子液；所述的培养液为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：大豆蛋白胨0.7％、葡萄糖1.5％、酵母浸粉0.5％、麦芽膏1％，pH＝5.8～6.0，121℃灭菌15分钟，备用；

3)生产一级种子液：将步骤2)得到的酵母摇瓶种子按12v％的接种量，接种于一级种子罐的一级种子培养液中，于37℃培养37小时，搅拌速度220rpm，通气量为3vvm，得到酵母的一级种子液；所述的酵母一级种子培养液为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：120目豆粕粉1.5％、120目鱼粉0.8％、120目玉米面1.0％、葡萄糖1.0％、NaCl 0.3％、Na₂HPO₄ 0.5％、增效剂0.2％，消泡剂0.1％，pH＝5.8～6.0，经121℃灭菌45分钟，冷却到37℃备用；所述的增效剂为由MgSO₄ 0.3g/L，CaCl₂ 4g/L，ZnSO₄ 1.5g/L，FeSO₄ 1.0g/L，MnSO₄ 0.8g/L，CuSO₄ 0.08g/L组成的水溶液；

4)二级发酵(生产发酵)：将步骤3)得到的酵母一级种子，以10％体积比接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同于步骤3)的一级种子培养液，发酵60小时后，用步骤1)的培养基，用平板计数法或血球计数法检测酵母菌数达到10亿/ml时停止发酵；

5)将上述酵母菌的发酵液加入预先混好的载体中，所述载体包括：轻质CaCO₃ 30wt％、次粉40wt％、玉米蛋白粉30wt％，发酵液与载体的重量比为0.9∶1，流化床干燥，干燥温度60℃，得到酵母菌干粉C-3，然后按照酵母平板培养复壮所用的培养基和条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用上述载体将活菌含量稀释到≥4亿/g，备用。

实施例44～51、制备酵母菌干粉C-4～C-11

按照实施例41～43的方法制备酵母菌干粉C-4～C-11，制备条件列于表3。

                      表3、酵母菌干粉C-4～C-11的制备

实施例	酵母菌干粉	制备法(同实施例X)	制备种子液所用菌种	载体及后处理条件(同实施例X)
					44	C-4	41	啤酒酵母	43
45	C-5	42	红法夫酵母	42
					46	C-6	43	白球拟酵母	41
47	C-7	41	毕赤酵母	43
					48	C-8	42	中国红酵母	41
49	C-9	43	产朊假丝酵母	42
					50	C-10	41	啤酒酵母毕赤酵母	43
51	C-11	42	白球拟酵母产朊假丝酵母	41

实施例52、制备嗜酸乳杆菌干粉D-1

1)平板培养复壮：将嗜酸乳酸菌斜面种子采用划线接种的方法在乳酸菌平板培养基上划线接种，于33℃培养24小时，使乳酸菌复壮，并形成单菌落；所述的乳酸菌平板培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合物：大豆蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、酵母浸粉0.3％、磷酸二氢钾0.3％、牛肉膏0.5％、柠檬酸三铵1.5％、Tween-80 0.5％、乙酸钠0.2％、琼脂粉2％，pH＝5.5～5.8，121℃灭菌15分钟，冷却到33℃备用；

2)制作摇瓶种子：将步骤1)培养的嗜酸乳酸菌菌落中挑单菌落，接种到乳酸菌液体培养基中，采用常规方法在三角瓶液体培养基上于35℃培养24小时，得到乳酸菌摇瓶种子；所述的培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：大豆蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、酵母浸粉0.3％、磷酸二氢钾0.3％、牛肉膏0.5％、柠檬酸三铵1.5％、Tween-800.5％、乙酸钠0.2％，pH＝5.5～5.8，121℃灭菌15分钟，冷却到35℃备用；

3)生产一级种子液：将步骤2)得到的乳酸菌摇瓶种子以6v％的接种量，接种于生产所用的一级种子罐的一级种子液体培养基中，于35℃培养17h，搅拌速度150rpm，间隔1小时通气5分钟，通气量为1vvm，直至乳酸菌数达到10亿，得到乳酸菌的一级种子液；所述的一级种子液体培养基配方为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：120目豆粕粉0.5％、120目鱼粉0.5％、鱼蛋白胨0.5％，乳糖0.2％，120目玉米面0.5％、葡萄糖1％、NaCl 0.1％、Na₂HPO₄ 0.15％、增效剂0.05％，消泡剂0.03％，pH＝5.5～5.8，经121℃灭菌30分钟，冷却到35℃；所述的增效剂为由CaCl₂ 2g/L，ZnSO₄ 0.5g/L，FeSO₄ 0.2g/L，CuSO₄ 0.01g/L，Co(NO₃)₂ 0.02g/L，MgSO₄ 0.1g/L组成的水溶液；

4)二级发酵(生产发酵)：将步骤3)得到的乳酸菌一级种子，以5％体积比接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同于步骤3)的一级种子液体培养基，发酵17小时后，检测pH值下降到5.0左右时(此时，多次试验的结果表明，乳酸菌量已达到大于10⁹CFU/ml发酵液)停止发酵；

5)将乳酸菌发酵液加入预先混合好的载体中，发酵液与载体的重量比为0.4∶1，所述载体包括：轻质CaCO₃ 30wt％、次粉40wt％、玉米蛋白粉30wt％，然后经流化床45℃干燥，粉碎到80目以上，得到乳酸菌干粉D-1，最后，按照乳酸菌平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用所述的载体将活菌含量分别稀释到≥4亿/g，备用。

实施例53、制备嗜酸乳杆菌干粉D-2

1)平板培养复壮：将嗜酸乳酸菌斜面种子采用划线接种的方法在乳酸菌平板培养基上划线接种，于35℃培养36小时，使乳酸菌复壮，并形成单菌落；所述的乳酸菌平板培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合物：大豆蛋白胨0.8％、葡萄糖1.5％、酵母浸粉0.5％、磷酸二氢钾0.4％、牛肉膏1％、柠檬酸三铵2％、Tween-80 1％、乙酸钠0.4％、琼脂粉2.2％，pH＝5.5～5.8，121℃灭菌15分钟，冷却到35℃备用；

2)制作摇瓶种子：将步骤1)培养的嗜酸乳酸菌菌落中挑单菌落，接种到乳酸菌液体培养基中，采用常规方法在三角瓶液体培养基上于37℃培养36小时，得到乳酸菌摇瓶种子；所述的培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：大豆蛋白胨0.8％、葡萄糖1.5％、酵母浸粉0.5％、磷酸二氢钾0.4％、牛肉膏1％、柠檬酸三铵2％、Tween-80 1％、乙酸钠0.4％，pH＝5.5～5.8，121℃灭菌15分钟，备用；

3)生产一级种子液：将步骤2)得到的嗜酸乳酸菌摇瓶种子以10v％的接种量，接种于生产所用的一级种子罐的一级种子液体培养基中，于37℃培养36h，搅拌速度180rpm，间隔1小时通气8分钟，通气量为2vvm，直至乳酸菌数达到10亿，得到嗜酸乳酸菌的一级种子液；所述的一级种子液体培养基配方为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：120目豆粕粉1.5％、120目鱼粉0.8％、鱼蛋白胨1.5％，乳糖1％，120目玉米面0.8％、葡萄糖2％、NaCl 0.2％、Na₂HPO₄ 0.25％、增效剂0.2％，消泡剂0.06％，pH＝5.5～5.8，经121℃灭菌40分钟，冷却到35℃；所述的增效剂为由CaCl₂ 4g/L，ZnSO₄ 1.5g/L，FeSO₄1.0g/L，CuSO₄ 0.08g/L，Co(NO₃)₂ 0.06g/L，MgSO₄ 0.5g/L组成的水溶液；

4)二级发酵(生产发酵)：将步骤3)得到的乳酸菌一级种子，以8％体积比接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同于步骤3)的一级种子液体培养基，发酵48小时后，检测pH值下降到5.0左右时(此时，多次试验的结果表明，乳酸菌量已达到大于10⁹CFU/ml发酵液)停止发酵；

5)将乳酸菌发酵液加入预先混合好的载体中，发酵液与载体的重量比为0.7∶1，所述载体包括：轻质CaCO₃ 60wt％、次粉20wt％、玉米蛋白粉20wt％，然后经流化床50℃干燥，粉碎到80目以上，得到乳酸菌干粉D-2，最后，按照乳酸菌平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用所述的载体将活菌含量分别稀释到≥4亿/g，备用。

实施例54、制备嗜酸乳杆菌干粉D-3

1)平板培养复壮：将嗜酸乳酸菌斜面种子采用划线接种的方法在乳酸菌平板培养基上划线接种，于38℃培养48小时，使乳酸菌复壮，并形成单菌落；所述的乳酸菌平板培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合物：大豆蛋白胨1％、葡萄糖2％、酵母浸粉0.7％、磷酸二氢钾0.5％、牛肉膏1.5％、柠檬酸三铵2.3％、Tween-80 1.4％、乙酸钠0.6％、琼脂粉2.5％，pH＝5.5～5.8，121℃灭菌15分钟，冷却到38℃备用；

2)制作摇瓶种子：将步骤1)培养的乳酸菌菌落中挑单菌落，接种到乳酸菌液体培养基中，采用常规方法在三角瓶液体培养基上于40℃培养48小时，得到乳酸菌摇瓶种子；所述的培养基为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：大豆蛋白胨1％、葡萄糖2％、酵母浸粉0.7％、磷酸二氢钾0.5％、牛肉膏1.5％、柠檬酸三铵2.3％、Tween-80 1.4％、乙酸钠0.6％，pH＝5.5～5.8，121℃灭菌15分钟，冷却到40℃备用；

3)生产一级种子液：将步骤2)得到的乳酸菌摇瓶种子以12v％的接种量，接种于生产所用的一级种子罐的一级种子液体培养基中，于38℃培养60h，搅拌速度200rpm，间隔1小时通气10分钟，通气量为2.5vvm，直至乳酸菌数达到10亿，得到乳酸菌的一级种子液；所述的一级种子液体培养基配方为按下述重量体积比(W/V)配制的混合液：120目豆粕粉2.0％、120目鱼粉1.0％、鱼蛋白胨2％，乳糖1.5％，120目玉米面1.0％、葡萄糖2.5％、NaCl 0.3％、Na₂HPO₄ 0.3％、增效剂0.3％，消泡剂0.1％，pH＝5.5～5.8，经121℃灭菌45分钟，冷却到38℃；所述的增效剂为由CaCl₂ 3g/L，ZnSO₄ 1.0g/L，FeSO₄ 0.7g/L，CuSO₄ 0.04g/L，Co(NO₃)₂ 0.04g/L，MgSO₄ 0.4g/L组成的水溶液；

4)二级发酵(生产发酵)：将步骤3)得到的乳酸菌一级种子，以10％体积比接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同于步骤3)的一级种子液体培养基，发酵60小时后，检测pH值下降到5.0左右时(此时，多次试验的结果表明，乳酸菌量已达到大于10⁹CFU/ml发酵液)停止发酵；

5)将乳酸菌发酵液加入预先混合好的载体中，发酵液与载体的重量比为0.9∶1，所述载体包括：轻质CaCO₃ 45wt％、次粉30wt％、玉米蛋白粉25wt％，然后经流化床60℃干燥，粉碎到80目以上，得到乳酸菌干粉D-3，最后，按照乳酸菌平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用所述的载体将活菌含量分别稀释到≥4亿/g，备用。

实施例55～75、制备嗜酸乳杆菌干粉D-4～D-24

按照实施例52～54的方法制备乳酸菌干粉D-4～D-24，制备条件列于表4。

                          表4、乳酸菌干粉D-4～D-24的制备

实施例号	乳酸菌干粉	制备法(同实施例X)	制备种子液所用菌种	载体及后处理条件(同实施例X)
					55	D-4	53	保加利亚乳杆菌	55
56	D-5	54	干酪乳杆菌	53
					57	D-6	55	纤维二糖乳杆菌	54

58	D-7	53	德氏乳杆菌	55
					59	D-8	54	发酵乳杆菌	53
60	D-9	55	乳酸乳杆菌	54
					61	D-10	53	植物乳杆菌	55
62	D-11	54	乳脂链球菌	53
					63	D-12	55	粪链球菌	54
64	D-13	53	乳酸链球菌	55
					65	D-14	54	嗜热链球菌	53
66	D-15	55	乳酸片球菌	54
					67	D-16	53	啤酒片球菌	55
68	D-17	54	屎链球菌	53
					69	D-18	55	芽孢乳杆菌	54
70	D-19	53	嗜热乳杆菌	55
					71	D-20	54	芽孢乳杆菌乳酸片球菌	53
72	D-21	55	嗜热乳杆菌嗜热链球菌	54
					73	D-22	53	芽孢乳杆菌粪链球菌	55
74	D-23	54	嗜热乳杆菌乳脂链球菌	53
					75	D-24	55	干酪乳杆菌啤酒片球菌	54

实施例76～91、制备本发明的S-1型小肽与有益微生物合生元饲料添加剂S-1-1～S-1-16

将40～60wt％的小肽干粉和40～60wt％的芽孢杆菌干粉混合均匀，得到本发明的S-1型小肽与有益微生物合生元饲料添加剂S-1-1～S-1-16，其组成如表5所示。

得到的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂的质量标准为：小肽100mg/g，芽孢杆菌活菌≥60亿/g，为淡黄白色粉沫，水份≤9％，灰份≤8％，砷≤0.5mg/kg，铅≤1.0mg/kg。

                        表5、S-1型小肽与有益微生物合生元饲料添加剂的组成

实施例	小肽干粉A		芽孢杆菌干粉B			饲料添加剂S-1
							种类	所占重量百分比(％)	种类	所用菌种	所占重量百分比(％)
	76	A-1	40	B-1	枯草芽孢杆菌							60	S-1-1
77						A-2	50	B-2	枯草芽孢杆菌	50	S-1-2
	78	A-3	60	B-3	枯草芽孢杆菌							40	S-1-3
79						A-4	40	B-4	凝结芽孢杆菌	60	S-1-4
	80	A-5   A-24	50	B-5	缓慢芽孢杆菌							50	S-1-5
81						A-6	60	B-6	地衣芽孢杆菌	40	S-1-6
	82	A-7	40	B-7	短小芽孢杆菌							60	S-1-7
83						A-8	50	B-8	环状芽孢杆菌	50	S-1-8
	84	A-9   A-23	60	B-9	坚强芽孢杆菌							40	S-1-9
85						A-10  A-22	40	B-10	巨大芽孢杆菌	60	S-1-10
	86	A-11  A-19	50	B-11	丁酸梭菌							50	S-1-11
87						A-12  A-18	60	B-12	纳豆芽孢杆菌	40	S-1-12

88	A-13  A-17	40	B-13	蜡状芽孢杆菌	60	S-1-13
							89	A-14  A-15A-16	50	B-14	纳豆芽孢杆菌枯草芽孢杆菌	50	S-1-14
90	A-13  A-17A-21	60	B-15	丁酸梭菌凝结芽孢杆菌	40	S-1-15
							91	A-14  A-15A-16  A-20	50	B-16	地衣芽孢杆菌环状芽孢杆菌	50	S-1-16

实施例92～107、制备本发明的S-2型小肽与有益微生物合生元饲料添加剂S-2-1～S-2-16

将35～45wt％的小肽干粉、20～30wt％的芽孢杆菌干粉和30～40wt％的酵母菌干粉混合均匀，得到本发明的S-2型小肽与有益微生物合生元饲料添加剂S-2-1～S-2-16，其组成如表6所示。

得到的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂的质量标准为：小肽100mg/g，芽孢杆菌活菌≥60亿/g，酵母菌活菌≥4亿/g，为淡黄白色粉沫，水份≤9％，灰份≤8％，砷≤0.5mg/kg，铅≤1.0mg/kg。

                         表6、S-2型小肽与有益微生物合生元饲料添加剂的组成

实施例	小肽干粉A	芽孢杆菌干粉B及所用菌种		酵母菌干粉C	A∶B∶C重量比	饲料添加剂S-2
							92	A-1	B-2	凝结芽孢杆菌	C-1	35∶30∶35	S-2-1
93	A-2	B-3	缓慢芽孢杆菌	C-2	40∶20∶40	S-2-2
							94	A-3	B-1	地衣芽孢杆菌	C-3	45∶25∶30	S-2-3
95	A-4	B-4	凝结芽孢杆菌	C-1	35∶30∶35	S-2-4
							96	A-5   A-24	B-5	缓慢芽孢杆菌	C-2	40∶20∶40	S-2-5
97	A-6	B-6	地衣芽孢杆菌	C-3	45∶25∶30	S-2-6
							98	A-7	B-7	短小芽孢杆菌	C-4	35∶30∶35	S-2-7
99	A-8	B-8	环状芽孢杆菌	C-5	40∶20∶40	S-2-8
							100	A-9   A-23	B-9	坚强芽孢杆菌	C-6	45∶25∶30	S-2-9
101	A-10  A-22	B-10	巨大芽孢杆菌	C-7	35∶30∶35	S-2-10
							102	A-11  A-19	B-11	丁酸梭菌	C-8	40∶20∶40	S-2-11
103	A-12  A-18	B-12	纳豆芽孢杆菌	C-9	45∶25∶30	S-2-12
							104	A-13  A-17	B-13	蜡状芽孢杆菌	C-10	35∶30∶35	S-2-13
105	A-14  A-15A-16	B-14	纳豆芽孢杆菌枯草芽孢杆菌	C-11	40∶20∶40	S-2-14
							106	A-13  A-17A-21	B-15	丁酸梭菌凝结芽孢杆菌	C-3	45∶25∶30	S-2-15
107	A-14  A-15A-16  A-20	B-16	地衣芽孢杆菌环状芽孢杆菌	C-4	35∶30∶35	S-2-16

实施例108～123、制备本发明的S-3型小肽与有益微生物合生元饲料添加剂S-3-1～S-3-16

将30～50wt％的小肽干粉、20～40wt％的芽孢杆菌干粉和30～50wt％的乳酸菌干粉混合均匀，得到本发明的S-3型小肽与有益微生物合生元饲料添加剂S-3-1～S-3-16，其组成如表7所示。

得到的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂的质量标准为：小肽100mg/g，芽孢杆菌活菌≥60亿/g，乳酸菌活菌≥4亿/g，为淡黄白色粉沫，水份≤9％，灰份≤8％，砷≤0.5mg/kg，铅≤1.0mg/kg。

                     表7、S-3型小肽与有益微生物合生元饲料添加剂的组成

实施例	小肽干粉A	芽孢杆菌干粉B	乳酸菌干粉D	A∶B∶D重量比	饲料添加剂S-3
						108	A-1	B-1	D-1	30∶20∶50	S-3-1
109	A-2	B-2	D-3	30∶40∶30	S-3-2
						110	A-3	B-3	D-2	50∶20∶30	S-3-3
111	A-4	B-4	D-4	30∶20∶50	S-3-4
						112	A-5   A-24等份	B-5	D-5	30∶40∶30	S-3-5
113	A-6	B-6	D-6	50∶20∶30	S-3-6
						114	A-7	B-7	D-7	30∶20∶50	S-3-7
115	A-8	B-8	D-8	30∶40∶30	S-3-8
						116	A-9   A-23等份	B-9	D-9	50∶20∶30	S-3-9
117	A-10  A-22等份	B-10	D-10	30∶20∶50	S-3-10
						118	A-11  A-19等份	B-11	D-11	30∶40∶30	S-3-11
119	A-12  A-18等份	B-12	D-12	50∶20∶30	S-3-12
						120	A-13  A-17等份	B-13	D-13	30∶20∶50	S-3-13
121	A-14  A-15A-16等份	B-14	D-14	30∶40∶30	S-3-14
						122	A-13  A-17A-21等份	B-15	D-15	50∶20∶30	S-3-15
123	A-14  A-15A-16  A-20等份	B-16	D-16	30∶40∶30	S-3-16

实施例124～139、制备本发明的S-4型小肽与有益微生物合生元饲料添加剂S-4-1～S-4-16

将30～40wt％的小肽干粉、20～30wt％的芽孢杆菌干粉、10～20wt％的酵母菌干粉和20～30wt％的乳酸菌干粉混合均匀，得到本发明的S-4型小肽与有益微生物合生元饲料添加剂S-4-1～S-4-16，其组成如表8所示。

得到的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂的质量标准为：小肽100mg/g，芽孢杆菌活菌≥60亿/g，乳酸菌活菌≥4亿/g，酵母菌活菌≥4亿/g，为淡黄白色粉沫，水份≤9％，灰份≤8％，砷≤0.5mg/kg，铅≤1.0mg/kg。

                           表8、S-4型小肽与有益微生物合生元饲料添加剂的组成

实施例	小肽干粉A	芽孢杆菌干粉B	酵母菌干粉C	乳酸菌干粉D	A∶B∶C∶D重量比	饲料添加剂S-4
							124	A-1	B-1	C-1	D-1	30∶30∶10∶30	S-4-1
125	A-2	B-2	C-3	D-3	35∶25∶20∶20	S-4-2
							126	A-3	B-3	C-2	D-2	40∶20∶15∶25	S-4-3
127	A-4	B-4	C-1	D-4	30∶30∶10∶30	S-4-4
							128	A-5  A-24	B-5	C-2	D-5	35∶25∶20∶20	S-4-5
129	A-6	B-6	C-3	D-6	40∶20∶15∶25	S-4-6
							130	A-7	B-7	C-4	D-7	30∶30∶10∶30	S-4-7
131	A-8	B-8	C-5	D-8	35∶25∶20∶20	S-4-8
							132	A-9   A-23	B-9	C-6	D-9	40∶20∶15∶25	S-4-9
133	A-10  A-22	B-10	C-7	D-10	30∶30∶10∶30	S-4-10

134	A-11  A-19	B-11	C-8	D-11	35∶25∶20∶20	S-4-11
							135	A-12  A-18	B-12	C-9	D-12  D-24	40∶20∶15∶25	S-4-12
136	A-13  A-17	B-13	C-10	D-13  D-23	30∶30∶10∶30	S-4-13
							137	A-14  A-15A-16	B-14	C-11	D-14  D-20D-21	35∶25∶20∶20	S-4-14
138	A-13  A-17A-21	B-15	C-3	D-15  D-18D-22	40∶20∶15∶25	S-4-15
							139	A-14  A-15A-16  A-20	B-16	C-4	D-16  D-17D-19	40∶20∶15∶25	S-4-16

实施例140、本发明提供的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂对蛋鸡生产的影响

选用349～377日龄的海兰灰蛋鸡900羽，分为3个处理组：空白对照组不添加任何成分；试验1组添加0.2％的本发明合生元饲料添加剂S-3-1；试验2组添加0.2％的本发明合生元饲料添加剂S-4-1；每个处理6个重复，每个重复50只鸡。饲养后屠宰，观察分析蛋鸡肠道内不同肠段乳酸菌、大肠杆菌和好氧菌总数的变化情况。试验结果列于表9。

                     表9、蛋鸡肠道菌群分离计数定结果[log₁₀(菌数CFU/g肠内容物)]

分组	测定细菌	空白对照	合生元S-3-1(0.2％)	合生元S-4-1(0.2％)
					嗉囊	乳酸菌	8.3406±0.0560Bb	9.5118±0.0095Aa	9.5966±0.0078Aa
大肠杆菌	8.3277±0.0685Aa	7.2246±0.0276Bb	7.3116±0.0150Bb
				好氧菌总数		9.0396±0.0560A	7.9243±0.0000C	8.0183±0.0187B
空肠	乳酸菌	7.4512±0.0429Bc	8.5450±0.0440Ab						8.8663±0.0042Aa
				大肠杆菌	8.6325±0.0086Aa	7.5269±0.0036Bb	7.4284±0.0057Bc
	好氧菌总数	8.7323±0.0113B	8.0470±0.0035C					7.8370±0.0035A
				盲肠	乳酸菌	7.6430±0.0280Bc	8.7522±0.0053Ab		8.9319±0.0170Aa
大肠杆菌	8.5050±0.0190Aa	7.6284±0.0013Bb	7.5246±0.0276Bc
					好氧菌总数	8.9085±0.0000Aa	7.8892±0.0119Bb	7.8834±0.0201Bb
直肠	乳酸菌	8.0050±0.0192Bc	8.9370±0.0035Ab						8.9823±0.0000Aa
				大肠杆菌	8.1300±0.0228Aa	7.6578±0.0202Bb	7.3710±0.0131Bc
	好氧菌总数	8.8892±0.0119Aa	7.9846±0.0032Bb					7.3314±0.0429Cc

注：同行样品间凡标有不同大写字母者为差异达极显著水平(P＜0.01)；

同行样品间凡标有不同小写字母者为差异达显著水平(P＜0.05)；无标注为在统计上没有差异。

从表9中可以看出：添加本发明提供的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂以后，嗉囊中的乳酸菌数比空白对照组的明显增加了10～12倍，大肠杆菌和总好氧菌数显著下降，差异极其显著(p＜0.01)；空肠中的乳酸菌数比对照组的明显增加10～15倍，大肠杆菌和总好氧菌数显著下降，差异极其显著(p＜0.01)；盲肠中的乳酸菌数比空白对照组明显增加，大肠杆菌和总好氧菌数显著下降10倍以上(p＜0.01)；直肠中的乳酸菌数比对照组的明显增加近10倍，大肠杆菌和总好氧菌数显著下降10倍以上，差异极其显著(p＜0.01)。

该试验结果说明，将本发明提供的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂应用于蛋鸡生产时，能极明显地促进和刺激蛋鸡胃肠道(包括嗉囊、空肠、盲肠和直肠)中常驻有益微生物—乳酸菌的生长，数量提高10～15倍，并能极显著抑制了大肠杆菌和其他一些好氧菌(如沙门氏菌、梭菌等)的生长繁殖，显著下降10倍以上，可以调节畜禽肠道菌群平衡，提高蛋鸡抗病力，有利于维护畜禽健康。此外，在畜禽养殖中，使用本发明提供的合生元饲料添加剂能减少抗生素的用量，对减少药物残留，提高畜禽产品品质也是有利的。

实施例141、本发明的合生元饲料添加剂对肉鸡抗病力的影响

选用1-28日龄公母混养的艾维因肉鸡500只，随机分成5个处理，即空白对照组、抗生素对照组(金霉素100g/t)、添加本发明的合生元S-1-1组(0.5kg/t)、添加本发明的S-2-1组(1kg/t)、添加本发明的S-4-2组(1kg/t)，每个处理100只。育雏1周后，每个处理分成5个重复，每个重复20只。饲养后屠宰，观察分析肉鸡肠道内不同肠段乳酸菌、大肠杆菌、沙门氏菌和好氧菌总数的变化情况(即菌相变化)。试验结果列于表10。

                             表10、肉鸡肠道菌群分离计数定结果[log₁₀(菌数CFU/g肠内容物]

组别	测定微生物	回肠	盲肠	直肠	腹泻率％
						空白对照组(不添加任何物质)	大肠杆菌	8.639±0.123Aab	12.719±0.039Aa	10.221±0.111Aa	15.23±0.13A
沙门氏菌	8.794±0.101Aa	12.100±0.062Aa	10.049±0.028Aa
				乳酸菌	8.427±0.243Cc		9.046±0.038Cd	9.087±0.057Cd
好氧菌总数	10.430±0.016Bb	12.712±0.019Aa	11.095±0.082Aa
				抗生素对照组(添加金霉素100g/t饲料)	大肠杆菌		8.599±0.087Ab	11.350±0.042Cc	9.732±0.064Bb	5.87±0.11B
沙门氏菌	8.747±0.103Aa	11.812±0.093Bb	9.453±0.068Cc
					乳酸菌	8.462±0.039Cc	9.129±0.021Ccd	9.548±0.074Bc
好氧菌总数	10.787±0.010Aa	11.753±0.090Bb	10.809±0.075Bb
					S-1-1(添加0.5kg/t饲料)	大肠杆菌	8.079±0.074Bc	12.137±0.054Bb	9.568±0.098Bb		4.91±0.09B
沙门氏菌	8.142±0.085Bb	11.671±0.050Bb	9.775±0.113Bb
				乳酸菌		9.207±0.063Bb	9.266±0.101Cc	9.778±0.103Bb
好氧菌总数	9.697±0.055Cc	11.417±0.102Cc	8.688±0.081Cc
				S-1-1(添加1kg/t饲料)		大肠杆菌	8.902±0.116Aa	11.198±0.068CDd	8.647±0.061Cc	2.88±0.07C
沙门氏菌	8.099±0.043Bb	11.355±0.048Cc	8.340±0.051Dd
					乳酸菌	9.321±0.077Bb	9.758±0.1051Bb	10.312±0.021Aa
好氧菌总数	9.531±0.061CDd	11.417±0.053Cc	8.324±0.066Dd
					S-4-2(添加1kg/t饲料)	大肠杆菌	7.590±0.072Cd	11.117±0.028Dd	7.551±0.037Dd		2.13±0.7C
沙门氏菌	7.767±0.027Cc	10.545±0.022Dd	8.328±0.043Dd
				乳酸菌		10.055±0.058Aa	10.333±0.048Aa	10.378±0.033Aa
好氧菌总数	9.493±0.072Dd	10.388±0.077Dd	8.044±0.035Ee

注：同行样品间凡标有不同大写字母者为差异达极显著水平(P＜0.01)；

同行样品间凡标有不同小写字母者为差异达显著水平(P＜0.05)；无标注为在统计上没有差异。

从表10中可以看出：添加本发明的合生元饲料添加剂可以使回肠中的乳酸菌数比对照组的增加，大肠杆菌数和沙门氏菌数比对照组的降低4～10倍，总好氧菌数较对照组下降5～8倍，差异极其显著(p＜0.01)；盲肠中的乳酸菌数比对照组的增加2～19倍，大肠杆菌数、沙门氏菌数和总好氧菌数较对照组降低，差异极其显著(p＜0.01)；直肠中的乳酸菌数比对照组的显著增加，大肠杆菌数、沙门氏菌数和总好氧菌数较对照组降低，差异极其显著(p＜0.01)。同时，在肉仔鸡饲养中使用本发明的合生元，其腹泻率极显著低于空白对照组和抗生素对照组，差异析显著(p＜0.01)，说明本发明的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂可有效防治肉仔鸡的腹泻，能完全取代抗生素。

试验结果表明，本发明提供的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂应用于肉鸡生产时能极明显地促进和刺激肉鸡胃肠道(包括回肠、盲肠和直肠)中常驻有益微生物—乳酸菌的生长，数量提高20～40倍；并能极显著抑制了大肠杆菌和其他一些好氧菌(如沙门氏菌、梭菌等)的生长繁殖，使有害菌降低10倍以上，调节肉鸡肠道菌群平衡，提高肉鸡抗病力，腹泻率极显著下降，有利于维护畜禽健康，可完全替代抗生素。

实施例142、本发明提供的合生元饲料添加剂对蛋鸡生产性能、蛋品质、死淘率和抗体水平的影响

用日龄相同的产蛋后期海兰蛋鸡18000只，分6组，每幢一组3000只，分3个重复，每个重复1000只。分组情况如下：

A组，空白对照组，饲喂蛋鸡基础日粮；B组，在蛋鸡基础日粮中添加土霉素，80g/t，为抗生素空白对照；C组，在蛋鸡基础日粮中添加本发明的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂S-1-10，1kg/t；D组，在蛋鸡基础日粮中添加本发明的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂S-2-16，1kg/t；E组，在蛋鸡基础日粮中添加本发明的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂S-3-11，1kg/t；F组，在蛋鸡基础日粮中添加本发明的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂S-4-8，1kg/t。

所使用的蛋鸡基础日粮配方(重量百分比)为：玉米57.74％，豆粕25.8％，麦麸3.0％，石粉8.42％，氢钙1.53％，食盐0.33％，植物油2.0％，1％预混料1.0％。

前7天为预试期，后28天为试验期，并按上述分组重复试验3次，测定了舍内NH₃、H₂S浓度、鸡蛋破损率、蛋白质量(哈夫单位)、产蛋率、蛋重、死淘率、蛋壳光洁度、蛋壳色泽、抗体水平等指标。结果列于表11。

                表11、对蛋鸡生产性能、蛋品质、死淘率的影响

后期鸡产蛋率(％)	80.2	83.5	84.6	84.7	84.9	85.7
							哈夫单位	78.0	82.2	85.3	84.5	85.9	86.6
蛋重(g)	65.0	66.0	67.3	67.1	66.9	67.7
							蛋壳光洁度*	++	+++	++++	++++	++++	++++
死淘率％	3.9	1.9	1.5	1.7	1.6	1.2
							**鸡瘟病毒抗体(ELISA，OD值)	0.77	0.75	1.31	1.36	1.48	1.43

^*蛋壳光洁度用+的多少来表示，+越多表示蛋壳光洁度愈好。^**BSA为牛血清白蛋白。

从表11可以看出，饲喂本发明提供的不同小肽与有益微生物合生元饲料添加剂饲料添加剂(S-1-10、S-2-16、S-3-11、S-4-8)各组的蛋鸡的产蛋率、蛋重、哈夫单位、蛋壳光洁度、抗体水平均明显好于对照组和抗生素对照组的各项指标，同时使用小肽与有益微生物合生元饲料添加剂各组的蛋鸡的死淘率、鸡蛋破损率、鸡舍的氨气和硫化氢浓度均明显低于对照组和抗生素组，并可完全取代抗生素。

上述结果说明，本发明提供的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂不仅能显著提高蛋鸡的生产性能、蛋品质、环境质量，而且能明显提高抗体水平和降低死淘率，且明显好于空白对照和抗体素对照组。其原因是小肽与有益微生物合生元饲料添加剂含有小肽和不同的有益微生物，这样不仅能给动物补充或接种有益微生物并发挥外源性有益微生物的作用(如产生消化酶、抗菌物质、多种维生素等有益物质，发挥消化、刺激免疫和防病等功能)，而且还因小肽与有益微生物合生元饲料添加剂含有小肽(是一种益生元)，能激活动物胃肠道中内源性的有益菌群，进而强化产酶促消化、刺激免疫和防病等功能，从而，小肽和有益微生物优势互补，促进微生物消化酶的分泌量、提高消化酶活性，提高饲料营养素的吸收转化和利用效率，并降低禽舍中的氨气和硫化氢含量，产生良好的经济效益、生态效益和、社会效益。

实施例143～146、本发明提供的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂对对仔猪、育肥猪、肉鸡和草鱼的影响，以及替代抗生素的效果

                     表12、对仔猪、生长育肥猪、肉仔鸡和草鱼养殖中的应用效果

实例号	合生元	试验方式	试验规模	试验结果
					实施例143	A组：对照B组：S-1-2C组：S-1-3D组：S-1-14E组：S-1-15F组：S-1-16G组：S-1-12	同实施例144，A组加黄霉素50g/t，金霉素100g/t对照，B、C、D、E、F、G组的添加物如左栏所述，各1kg/t，每组30头猪，3个重复。	仔猪210头	与添加抗生组对比，添加合生元组的各项指标改善如下：日采食量提高9.2％～11.7％日增重提高11.2％～12.3％饲料转化效率改善11.9％～13.8％腹泻率降低59.1％～60.5％

实施例144	A组：对照B组：S-2-1C组：S-2-2D组：S-2-3E组：S-2-4F组：S-2-5	同实例144，A组加金霉素100g/t，磺胺100g/t对照，B、C、D、E、F组添加益-8，10，14，15，16各1.5kg/t，每组60头猪，6个重复。	育成育肥猪(30-90kg)420头	肥育猪各生长阶段采食量、日增重；饲料转化效率提高，腹泻率和死淘率降低，各项生产性能不低于添加抗生素群体；猪舍臭味减少，屠宰率和瘦肉率与添加抗生素群体相似或更高，猪肉肉色红润，肉质鲜嫩。
					实施例145	小鸡：A组：对照B组：S-3-2C组：S-3-3D组：S-3-4E组：S-3-5F组：S-3-6中鸡：A组：对照B组：S-2-6C组：S-2-7D组：S-2-8E组：S-2-9F组：S-2-10	大鸡：A组：对照B组：S-4-3C组：S-4-4D组：S-4-5E组：S-4-6F组：S-4-7对照组土霉素150g/t各合生元添加量为：小鸡1.5kg/t中鸡1.0kg/t大鸡1.0kg/t饲料制粒，每组4000只肉鸡，4个重复，每个重复1000只，共24000只	肉鸡24000只	增加鸡体内蛋白质的沉积和降低腹脂率(P＜0.05)，明显降低十二指肠、空肠和回肠的pH值(p＜0.05，)，显著抑制(减少)空肠和直肠中的E.Coli繁殖，并能提高肠道中乳酸杆菌的含量(p＜0.05)，十分有利于鸡的健康和减少臭味。
实施例146	A组：对照B组：S-4-14C组：S-4-9D组：S-4-10E组：S-4-11F组：S-4-12G组：S-4-13	对照组每吨饲料添加土霉素和磺胺各100g试验组添加合生元量为每吨饲料：1.0kg/t饲料制粒，每组3000条草鱼，3个重复，每个重复1000条，共21000条	育成期草鱼21000条	饲料系数比对照组提高6.9％，日增重比对照组提高12.7％，成活率提高22.6％，且试验组的整齐度好，抗病能力强。水质控制方面，水深3.0米、3亩投放合生元1kg。结果氨态氮(NH3-N)在24小时内由对照组的0.72mg/L降低到试验组的0.21mg/L，降低3倍，同时罗非鱼的白皮病减少66.2％。

从表12可以看出，饲喂本发明提供的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂，仔猪、育成猪、肉仔鸡的不同饲养阶段以及草鱼的各项指标均明显好于不同抗生素对照组，说明本发明提供的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂能有效防治畜禽和水产动物疾病、显著提高生产性能(增重、饲料转化效率等)、改善畜舍环境和水产动物的水质、提高动物产品品质等功效，进一步证明本发明提供的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂可以作为抗生素替代品，并具有良好的经济和生态效益。

实施例147、本发明提供的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂对肉仔鸡的免疫力(包括细胞免疫和体液免疫)或抗病力的影响

为检验本发明提供的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂在肉鸡上的免疫增强效果和在畜牧业上的应用前景，试验选用艾维因肉鸡1日龄900羽，分9组，每组100只肉鸡，分5个重复，每个重复20只鸡，喂以9种不同的日粮，即A组为空白对照组，B组为抗生素组，C、D、E、F、G、H、I组分别添加本发明的不同合生元(如表13所示)饲料添加剂各1kg。分别在7日龄和14日龄注射牛血清白蛋白抗原，以备检测免疫学指标。试期7周，3周龄时检测淋巴细胞增值活力、牛血清白蛋白抗体水平，结果见表13、表14。

                                表13、合生元对鸡血淋巴细胞增殖活力(细胞免疫)的影响

添加物	空白对照(不添加)	抗生素对照(安来霉素，5mg/kg)	S-1-4	S-1-5	S-1-6	S-2-11	S-2-13	S-3-11	S-3-16
										T细胞活力(OD值)	2.362	2.412	2.320	2.654	2.872	2.911	2.865	2.798	3.011

                              表14、合生元对鸡血牛血清白蛋白抗体滴度(体液免疫)的影响

添加物	空白(不添加)	抗生素(安来霉素，5mg/kg)	S-1-4	S-1-5	S-1-6	S-2-11	S-2-13	S-3-11	S-3-16
										抗体滴度(OD值)	1.112	1.235	2.725	3.546	3.595	4.563	4.342	3.329	3.679

由表13可知，本发明提供的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂在饲料中的添加可以明显增强T细胞活力，说明本发明提供的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂可明显提高动物的细胞免疫功能。

由表14可知，在饲料中的添加本发明提供的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂可以明显增强抗体滴度水平，说明本发明提供的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂可明显提高动物的体液免疫功能。

综合表13、表14的试验结果，说明在动物饲料中添加本发明提供的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂可明显提高动物的免疫力(包括细胞免疫和体液免疫)，进而增强动物的抗病力。

综合以上所有实例，说明本发明提供的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂可用作抗生素替代品，消除药物残留，提高肉蛋奶等产品品质，可用于防治各种动物拉稀腹泻，提高动物生产性能、提高免疫力或抗病力和饲料转化效率、降低动物死淘率，还可用于制作青贮、黄贮饲料和生物饲料，棉粕(饼)和菜粕(饼)脱毒，净化厩舍环境(除臭降氨)和净化鱼虾池水质等。

Claims (7)

1、一种小肽与有益微生物合生元饲料添加剂，包括小肽干粉和芽孢杆菌干粉，

所述的小肽干粉，是将植物蛋白或/和动物蛋白经微生物发酵降解，且其水解度控制在25～40％的发酵液干燥后得到的，具体制备方法包括如下步骤：

1)发酵种子液制备：将选自黑曲霉、米曲霉、栖土曲霉菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、短小芽孢杆菌中的一种或几种的混合物，接入经121℃灭菌30分钟并冷却到28～37℃的液体培养基中，28～37℃培养24～48小时，得到种子液；所述的液体培养基为按下述比例配制的混合液：蛋白胨1.3～2.5g，葡萄糖3～5g，糖蜜3～5g，马铃薯浸液50～100ml，可溶性淀粉10～20g，蔗糖10～30g，牛肉膏2～3g，酵母浸粉3.5～5g，豆粕1.5～2g，生长因子1～2ml，水1000ml；其中的生长因子为含有MgSO₄·7H₂O 20.00～30.00mg/ml，CaCl₂.2H₂O 2.20～3.50mg/ml，ZnSO₄.7H₂O 0.81～1.10mg/ml，FeSO₄.7H₂O 0.44～0.60mg/ml，MnSO₄.H₂O 0.13～0.20mg/ml，CuSO₄.5H₂O 0.02～0.04mg/ml的混合物；

2)发酵降解：将植物蛋白或动物蛋白中的一种或几种的混合物粉碎到60～120目，按蛋白量计算，依物料∶液体比＝5～18∶100的比例放入发酵罐中，再依C/N比＝1/2～1/35的比例放入碳源，并加入消泡剂0.03～0.1％，混匀，得到的培养液于121～125℃高压灭菌10～30分钟，冷却到28～37℃，以种子液和培养液的体积比为0.3～1∶10的比例接入步骤1)得到的种子液，在28～42℃发酵，通气量为0.5～2.5vvm，搅拌速度150～300rpm，期间用常规的茚三酮法显色法测定水解度，24小时前每6小时检测一次水解度，24～48小时之间，每4小时检测一次水解度，48小时后每2小时检测一次水解度，直到水解度达到25～40％，然后于140～145℃灭菌2～8秒，得到含小肽的蛋白水解液；

3)离心除渣：将步骤2)得到的含小肽的蛋白水解液于5000～7000rpm离心10～30分钟，除去渣质，得到的上清液再通过膜截留分子量为1000Da的超滤器除去大分子蛋白等杂质，得到分子量≤1000Da的滤液；将此滤液经负压真空浓缩到原体积的50％，得到的浓缩液加到预先混合好的载体中，按浓缩液∶载体＝0.5～0.8∶1的体积重量比混合，搅拌均匀后在45～80℃干燥，然后粉碎到80目以上，得到小肽干粉；所述步骤3)的载体由2～5重量份有机载体和3～5重量份无机载体组成；其中，所述的有机载体包括糠麸类和饼粕类有机载体；所述无机载体为轻质碳酸钙、石粉、麦饭石和沸石粉中的一种或几种的混合物；

所述的芽孢杆菌干粉是由如下的方法制得的：

1)平板培养复壮：将芽孢杆菌菌种采用划线接种的方法在芽孢杆菌平板培养基上划线接种，于25～35℃培养12～24小时，使芽孢杆菌复壮，并形成单菌落；所述的芽孢杆菌平板培养基为按下述重量体积比配制的混合物：蛋白胨0.5～1％、葡萄糖0.5～2％、牛肉膏0.5～1.5％、磷酸二氢钾0.3～0.6％、琼脂3～4％，pH＝7.5～7.6，121℃灭菌30分钟，备用；所述的芽孢杆菌包括：凝结芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、丁酸梭菌、纳豆芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌；

2)制作摇瓶种子：从步骤1)培养的芽孢杆菌菌落中挑单菌落，接种到芽孢杆菌液体培养基中，于28～37℃培养20～30小时，得到芽孢杆菌摇瓶种子液；所述的芽孢杆菌液体培养基为按下述重量体积比配制的混合液：蛋白胨0.5～1％、葡萄糖0.5～2％、牛肉膏0.5～1.5％、磷酸二氢钾0.3～0.6％、3.08％硫酸锰溶液0.5～1.5％，pH＝7.5～7.6，121℃灭菌30分钟，备用；

3)生产一级种子液：将步骤2)得到的芽孢杆菌摇瓶种子液以2～5v％的接种量，接种于生产所用的一级种子罐的一级种子液体培养基中，于28～37℃培养18～24h，搅拌速度150～200rpm，通气量为1～2vvm，得到芽孢杆菌的一级种子液；所述的一级种子液体培养基配方为按下述重量体积比配制的混合液：120目豆粕粉0.5～2.0％、120目鱼粉0.2～1.5％、120目玉米面0.5～1.0％、葡萄糖1.0～4.5％、NaCl 0.1～0.3％、NaOH 0.05～0.10％、Na₂HPO₄ 0.1～0.5％、增效剂0.05～0.2％，消泡剂0.05～0.1％，pH＝7.5～7.6，经121℃灭菌30～45分钟，冷却到32～37℃；所述的增效剂为由MgSO₄ 0.1～0.5g/L，CaCl₂ 1.0～4.0g/L，ZnSO₄ 0.2～1.5g/L，FeSO₄ 0.1～0.8g/L，CuSO₄ 0.01～0.05g/L，Co(NO₃)₂ 0.02～0.06g/L，MnSO₄ 0.3～1.5g/L组成的水溶液；

4)二级发酵：将步骤3)得到的芽孢杆菌一级种子液，以5～10％的体积比接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同于步骤3)的一级种子液体培养基，发酵16～24小时后，通过显微镜观察，有大量芽孢形成时停止发酵；

5)将芽孢杆菌的发酵液，按照发酵液与载体的重量比为0.5～0.8∶1的比例混合均匀，呈湿粉状，然后在流化干燥床上于80～100℃干燥后粉碎到80目以上，得到芽孢杆菌干粉，最后按照芽孢杆菌平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用载体将活菌含量分别稀释到≥60亿/g；所述的载体配比为：轻质CaCO₃ 30～60wt％、次粉20～40wt％、玉米蛋白粉20～30wt％。

2、如权利要求1所述的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂，还包括酵母菌干粉或/和乳酸菌干粉，

所述的酵母菌干粉是由如下的方法制得的：

1)平板培养复壮：将酵母斜面种子采用划线接种的方法在酵母平板培养基上划线接种，于24～30℃培养20～24小时，使酵母复壮，并形成单菌落；所述的酵母平板培养基为按下述重量体积比配制的混合物：大豆蛋白胨0.2～0.7％、葡萄糖0.5～1.5％、酵母浸粉0.1～0.5％、麦芽膏0.2～1％、琼脂粉2～3％，pH＝5.8～6.0，121℃灭菌15分钟，冷却到24～30℃备用；所述的酵母包括：酿酒酵母或啤酒酵母、深红酵母、红法夫酵母、白球拟酵母、毕赤酵母、中国红酵母、产朊假丝酵母；

2)制作摇瓶种子：从步骤1)培养的酵母培养平板中挑单菌落，接种到三角瓶液体培养液中，于28～32℃培养24～37小时，得到酵母摇瓶种子液；所述的培养液为按下述重量体积比配制的混合液：大豆蛋白胨0.2～0.7％、葡萄糖0.5～1.5％、酵母浸粉0.1～0.5％、麦芽膏0.2～1％，pH＝5.8～6.0，121℃灭菌15分钟，冷却到28～32℃备用；

3)生产一级种子液：将步骤2)得到的酵母摇瓶种子按5～12v％的接种量，接种于一级种子罐的一级种子培养液中，于28～37℃培养24～37小时，搅拌速度160～220rpm，通气量为1.0～3.0vvm，得到酵母的一级种子液；所述的酵母一级种子培养液为按下述重量体积比配制的混合液：120目豆粕粉0.5～1.5％、120目鱼粉0.2～0.8％、120目玉米面0.5～1.0％、葡萄糖0.3～1.0％、NaCl 0.1～0.3％、Na₂HPO₄ 0.2～0.5％、增效剂0.05～0.2％，消泡剂0.03～0.1％，pH＝5.8～6.0，经121℃灭菌30～45分钟，冷却到28～37℃；所述的增效剂为由MgSO₄ 0.05～0.3g/L，CaCl₂ 2.5～4g/L，ZnSO₄ 0.6～1.5g/L，FeSO₄ 0.1～1.0g/L，MnSO₄ 0.4～0.8g/L，CuSO₄ 0.02～0.08g/L组成的水溶液；

4)二级发酵：将步骤3)得到的酵母一级种子，以4～10％体积比接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同于步骤3)的一级种子培养液，发酵24～60小时后，用步骤1)的培养基，用平板计法或血球计数法检测酵母菌数达到10亿/ml时停止发酵；

5)将上述酵母菌的发酵液加入预先混合好的载体中，发酵液与载体的重量比为0.6～0.9∶1，流化床干燥，干燥温度45～60℃，得到酵母菌干粉，然后按照酵母平板培养复壮所用的培养基和条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用上述载体将活菌含量稀释到≥4亿/g，备用；所述载体配比为：轻质CaCO₃ 30～60wt％、次粉20～40wt％、玉米蛋白粉20～30wt％；

所述的乳酸菌干粉是由如下的方法制得的：

1)平板培养复壮：将乳酸菌斜面种子采用划线接种的方法在乳酸菌平板培养基上划线接种，于33～38℃培养24～48小时，使乳酸菌复壮，并形成单菌落；所述的乳酸菌平板培养基为按下述重量体积比配制的混合物：大豆蛋白胨0.5～1％、葡萄糖1～2％、酵母浸粉0.3～0.7％、磷酸二氢钾0.3～0.5％、牛肉膏0.5～1.5％、柠檬酸三铵1.5～2.3％、Tween-800.5～1.4％、乙酸钠0.2～0.6％、琼脂粉2～2.5％，pH＝5.5～5.8，121℃灭菌15分钟，冷却到33～38℃备用；所述的乳酸菌包括：嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、德氏乳杆菌、发酵乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳脂链球菌、粪链球菌、乳酸链球菌、嗜热链球菌、乳酸片球菌、啤酒片球菌、屎链球菌、芽孢乳杆菌、嗜热乳杆菌；

2)制作摇瓶种子：将步骤1)培养的乳酸菌菌落中挑单菌落，接种到乳酸菌液体培养基中，采用常规方法在三角瓶液体培养基上于35～40℃培养24～48小时，得到乳酸菌摇瓶种子；所述的培养基为按下述重量体积比配制的混合液：大豆蛋白胨0.5～1％、葡萄糖1～2％、酵母浸粉0.3～0.7％、磷酸二氢钾0.3～0.5％、牛肉膏0.5～1.5％、柠檬酸三铵1.5～2.3％、Tween-800.5～1.4％、乙酸钠0.2～0.6％，pH＝5.5～5.8，121℃灭菌15分钟，备用；

3)生产一级种子液：将步骤2)得到的乳酸菌摇瓶种子以6～12v％的接种量，接种于生产所用的一级种子罐的一级种子液体培养基中，于35～38℃培养17～60h，搅拌速度150～200rpm，间隔1小时通气5～10分钟，通气量为1～2.5vvm，直至乳酸菌数达到10亿，得到乳酸菌的一级种子液；所述的一级种子液体培养基配方为按下述重量体积比配制的混合液：120目豆粕粉0.5～2.0％、120目鱼粉0.5～1.0％、鱼蛋白胨0.5～2％，乳糖0.2～1.5％，120目玉米面0.5～1.0％、葡萄糖1～2.5％、NaCl 0.1～0.3％、Na₂HPO₄ 0.15～0.3％、增效剂0.05～0.3％，消泡剂0.03～0.1％，pH＝5.5～5.8，经121℃灭菌30～45分钟，冷却到32～37℃；所述的增效剂为由CaCl₂ 2～4g/L，ZnSO₄ 0.5～1.5g/L，FeSO₄ 0.2～1.0g/L，CuSO₄ 0.01～0.08g/L，Co(NO₃)₂ 0.02～0.06g/L，MgSO₄ 0.1～0.5g/L组成的水溶液；

4)二级发酵：将步骤3)得到的乳酸菌一级种子，以5～10％体积比接种到装有生产发酵培养液的发酵罐中，发酵培养液的配方和控制条件同于步骤3)的一级种子液体培养基，发酵17～60小时后，检测pH值下降到5.0左右时停止发酵；

5)将乳酸菌发酵液加入预先混合好的载体中，浓缩液与载体的重量比为0.4～0.9∶1，然后经流化床45～60℃干燥，粉碎到80目以上，得到乳酸菌干粉；最后，按照乳酸菌平板培养复壮所用的培养基和培养条件，对干粉的活菌含量进行常规平板计数检测，根据计数结果，利用所述的载体将活菌含量分别稀释到≥4亿/g，备用；所述载体配比为：轻质CaCO₃ 30～60wt％、次粉20～40wt％、玉米蛋白粉20～30wt％。

3、如权利要求1所述的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂，由小肽干粉和芽孢杆菌干粉组成，其中，小肽干粉占40～60wt％；芽孢杆菌干粉占40～60wt％。

4、如权利要求2所述的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂，由小肽干粉、芽孢杆菌干粉和酵母菌干粉组成，其中，小肽干粉占35～45wt％；芽孢杆菌干粉占20～30wt％；酵母菌干粉占30～40wt％。

5、如权利要求2所述的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂，由小肽干粉、芽孢杆菌干粉和乳酸菌干粉组成，其中，小肽干粉占30～50wt％；芽孢杆菌干粉占20～40wt％；乳酸菌干粉占30～50wt％。

6、如权利要求2所述的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂，由小肽干粉、芽孢杆菌干粉、酵母菌干粉和乳酸菌干粉组成，其中，小肽干粉占30～40wt％；芽孢杆菌干粉占20～30wt％；酵母菌干粉占10～20wt％；乳酸菌干粉占20～30wt％。

7、一种权利要求1或2所述的小肽与有益微生物合生元饲料添加剂作为饲料添加剂的用途。