CN1635890A - 神经保护性2－吡啶胺组合物和相关方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含2－吡啶胺的神经保护性药用组合物。本发明也提供使用这些组合物预防局部缺血性细胞死亡、特别是神经元细胞死亡、以及降低受治疗者体内由于创伤事件所致的神经元细胞死亡的可能性的方法。最后，本发明提供用于给予受治疗者本发明药用组合物的装置。

Description

神经保护性2-吡啶胺组合物和相关方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2000年8月8日申请的顺序号为60/223,795的美国临时申请的优先权，该临时申请通过引用结合到本文中。
发明领域
本发明涉及神经保护性2-吡啶胺组合物以及使用所述组合物预防局部缺血事件后细胞死亡的方法。本发明组合物在预防神经元细胞死亡及其所引起的疾病方面具有特殊的重要性。
发明背景
谷氨酸是哺乳动物中枢神经***中主要的快速兴奋性神经递质。它通过打开三类配体门控离子通道：AMPA、红藻氨酸和NMDA受体，而使神经元去极化。在正常兴奋性传递期间，发生突触谷氨酸水平的瞬时增加。然而，突触谷氨酸水平的过度增加对神经元有毒性，触发通常被称为谷氨酸兴奋毒性的神经元细胞死亡过程(Meldrum和Garthwaite 1990)。谷氨酸兴奋毒性造成局部缺血诱导的脑损害、癫痫和各种慢性神经退行性疾病(Meldrum和Garthwaite 1990)。
在所述三类谷氨酸门控通道中，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的特异性过度活化是触发各种各样神经元类型中兴奋毒性神经元死亡的主要原因(Meldrum和Garthwaite 1990)。在动物中风模型中，通过用特异性NMDA受体拮抗剂-MK-801预处理，可以大大减轻局部缺血诱导的脑损害(Park等1988)。在许多类型的神经元中，谷氨酸兴奋毒性被认为主要是由于NMDA受体对钙的高通透性所致的钙离子过多流入引起的(Schneggenburger等1993)。高胞内钙水平可能导致钙调节的酶例如氧化氮合酶、磷脂酶、蛋白酶和激酶的过度活化。此外，高胞内钙水平还可能介导兴奋毒性。
通过NMDA受体的谷氨酸信号在原代神经元培养物中诱导促***原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化和活化(Bading和Greenberg 1991；Xia等1995)。局部缺血性脑损伤的动物模型提示，MAPK家族成员的活性增强可能介导神经元损害(Alessandrini等1999；Yang等1997)。主要在脑中表达的MAP激酶JNK家族一员-Jnk3的缺乏，在体内保护海马神经元免受红藻氨酸诱导的兴奋毒性的损害，尽管尚不清楚NMDA受体在这种形式的毒性中的作用(Yang等1998)。对ERK1/2的上游活化激酶(p44/42)MAP激酶的特异性抑制，防止局灶性脑缺血所致的神经元损害(Alessandrini等1999)。在培养的原代海马神经元中，抑制ERK1/2(p44/42 MAPK)信号途径，防止由于犬尿喹啉酸(一种广谱谷氨酸受体拮抗剂)的除去诱导的神经元死亡(Murray等1998)。非受体介导的谷氨酸诱导的氧化性毒性也由于ERK1/2信号途径的抑制而被阻断(Stanciu等2000)。综合而论，这些报道清楚地表明了ERK1/2MAPK信号在谷氨酸诱导神经元毒性中的重要作用。然而，仍不清楚何种种类的谷氨酸受体可以触发如此关键性地涉及ERK1/2 MAPK途径的兴奋毒性信号级联。
来自文献的实质性证据提示，MEK(MAP激酶或ERK激酶，ERK1和ERK2的一种苏氨酸-酪氨酸激酶活化剂)抑制在体内是一种有效的神经保护策略(Alessandrini等1999；Hu和Wieloch 1994；Kindy 1993)。这些报道指出，一过性脑缺血在啮齿动物脑中诱导p42 MAP激酶磷酸化。一种MEK1/2的选择性抑制剂-PD 098059，可以阻断这种磷酸化的诱导，并且可以降低神经元损害的程度(Alessandrini等1999)。原代神经元培养物文献也提示，MAP激酶途径在体外与兴奋毒性损害相关(Bading和Greenberg 1991；Fiore等1993；Kurino等1995；Murray等1998；Rosen等1994；Xia等1996)。这些报道表明，通过其各种离子化(ionotropic)和/或代谢向性(metabotropic)受体的谷氨酸信号，导致p42/44 MAP激酶活化。p44/42 MAP激酶活化的增加，诱导立即早期基因的转录(Xia等1996)，并且与培养的海马神经元的癫痫发作活性诱导的细胞死亡有关(Murray等1998)。
尚不十分了解连接NMDA受体与p42/44 MAP激酶活化的信号途径、或者连接p42/44 MAP激酶与延迟型神经毒性的下游途径。p42/44MAP激酶的上游活化剂是MEK1和MEK2(Anderson等1990；Crews，Alessandrini和Erikson 1992；Zheng和Guan 1993)。MEK1/2由激酶的Raf家族磷酸化(Jaiswal等1994；Moodie等1993)，而所述家族被小GTP结合蛋白的Ras家族活化(Papin等1995)。
可以将NMDA受体活化与Ras/Raf/MEK/p42/44 MAPK信号级联偶联的一种候选中间体分子是钙依赖性酪氨酸激酶PYK2(Lev等1995)。胞内钙水平增加可以活化PYK2，而PYK2可以进而激活MAP激酶信号。
可以连接离子通道活化与MAP激酶信号的第二种候选中间体是钙调蛋白激酶(CaM-K)。两种类型的CaM-K在神经元中高表达-CaM-KII和CaM-KIV(Sakagami和Kondo 1993；Sola，Tusell和Serratosa1999)。这些蛋白激酶在结合钙和钙调蛋白时被活化，并且它们可以调节p38、JNK和p42/44 MAP激酶的活性(Enslen等1996)。
第三种候选中间体分子可能是氧化氮(NO)。在皮质神经元中，NMDA受体触发的神经毒性，需要NMDA受体通过PSD-95与NO产生偶联(Sattler等1999)。NO产生增加，也可以增强p42/44 MAP激酶的活性(Lander等1996)。
p42/44 MAP激酶下游的分子包括转录因子，例如CREB、Elk-1、c-Jun和c-Fos(Vanhoutte等1999)。p42/44 MAP激酶途径也可以诱导细胞骨架组分例如神经丝的磷酸化(Li等1999a)，调节突触蛋白I-肌动蛋白的相互作用(Jovanovic等1996)，使髓鞘碱性蛋白磷酸化(Ahn等1991)，以及调节淀粉状蛋白前体蛋白的分泌(Desdouits-Magnen等1998)。因此，有许多潜在的p42/44 MAP激酶活化下游的神经毒性的介质。
对于在谷氨酸受体刺激下游被激活的信号途径的详细了解，对于确定预防低氧/局部缺血诱导的神经元损害的有效方法可能是有用的。研究这些途径的许多工作已经接近尾声。Lipton的美国专利5,506,231描述了一种通过给予拮抗NMDA受体的化合物在感染人免疫缺陷病毒的患者中减轻对CNS神经元损害的方法。该专利并未提示给予调节NMDA受体下游的信号转导途径组分的化合物所引起的神经保护效应。Maiese的美国专利5,519,035描述了作为防止给予氧化氮诱发的脑缺血的神经保护剂的蛋白激酶C抑制剂。描述了一种利用海马神经元培养物的模型。Mahanthappa的WO 99/00117描述了多种化合物，包括H89，该化合物模拟对Patched介导信号的Hedgehog效应，特别是作为神经保护剂的蛋白激酶A(PKA)的抑制剂。Liu的WO99/58982描述了用于鉴定拮抗神经元细胞、特别是HN33海马神经元细胞中c-Jun N-termina激酶(JNK)或混合谱系激酶(MLK)的神经保护性化合物的方法。最后，Alessandrini的WO 99/34792描述了一种中风的小鼠模型，在所述模型中，诱发局灶性脑缺血，并且给予MEK1抑制剂，以监测神经保护效应。
不管关于谷氨酸受体介导的兴奋毒性有何了解，关于其作用机制和可以选择性抑制其引起的神经元细胞死亡的化合物仍有许多尚待了解。
发明概述
本发明提供一种药用组合物，所述药用组合物包含药学上可接受的载体和具有下式的化合物或其药学上可接受的盐，
Figure A0181669100091
其中
(a)R1为H或在环的5位或6位连接的选自以下的取代基：烷基、链烯基、链炔基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、苯基、嘧啶基、取代的嘧啶基、吡啶基、取代的吡啶基、苯基链烯基、取代的苯基链烯基、苯并[b]噻吩-2-基、2-苯并呋喃基和取代的苯基，所述取代的苯基具有下式
Figure A0181669100101
其中(i)R6选自H、OH、卤素、烷基氨基、二烷基氨基、羟基取代的二烷基氨基、低级烷基、酸性低级烷基、烷氧基、卤取代的低级烷氧基、苯基和吗啉基，而(ii)R7代表1-4个取代基，所述取代基可以相同或不同，选自H、卤素、氨基、烷基、低级烷基、卤取代的低级烷基、烷基氨基、二烷基氨基、酸性低级烷氧基、烷氧基、卤取代的低级烷氧基、烷氧基和苯基烷氧基，条件是R6和R7可以稠合形成2-萘基或1，3，苯并间二氧杂环戊烯；
(b)每个R2独立地为H或低级烷基；
(c)每个R3独立地选自H、低级烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基和低级烷氧基；
(d)R4为H、烷氧基或吗啉基，条件是R4可以与R3稠合形成2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯基或9-烷基9H咔唑基；且
(e)R5为H或低级烷基。
本发明也提供一种减少细胞群体中局部缺血性死亡的方法，所述方法包括使所述细胞与预防有效量的本发明药用组合物中所含有的化合物接触。
本发明还提供一种减少对创伤事件应答的神经元细胞死亡的方法，所述方法包括在所述创伤事件之前、期间或在所述创伤事件之后的适当时间内，使所述神经元细胞与预防有效量的本发明药用组合物中所含有的化合物接触。
本发明另外提供一种减少受治疗者体内对创伤事件应答的神经元细胞死亡的方法，所述方法包括在所述创伤事件之前、期间或在所述创伤事件之后的适当时间内，给予所述受治疗者预防有效量的本发明药用组合物。
最后，本发明提供一种用于给予受治疗者本发明药用组合物的设备，所述设备包括一个容器和容器中的药用组合物，其中所述容器有一个用于给予所述受治疗者预防剂量的所述药用组合物的装置。
附图简述
图1.A：NMDA受体介导的功能性胞内钙应答。实心方块符号代表对照，实心三角符号代表100μM MK-80-1；B：分化P19神经元中的[3H]-MK-801结合。
图2.A：利用Alamar Blue荧光测定的P19神经元活力实验。B：随Alamar Blue读数而变的死亡的谷氨酸剂量反应。数据以对照的百分比表示。C：MK-801剂量依赖性阻断。
图3.A：化合物A，一种p38抑制剂，预处理剂量反应。B：U0126，一种MEK1/2抑制剂，预处理剂量反应。
图4.A：U0126不阻断谷氨酸诱导的钙应答。B：U0126不阻断P19神经元中的[3H]-MK-801结合。
图5.A：U0126处理后的功效时程。B：化合物A处理后的功效时程。
图6.A：U0126不抑制星形孢菌素诱导的毒性。实心方块符号代表无化合物；实心三角符号代表10μM U0126。B：U0126不阻断A23187诱导的毒性。C：U0126不影响基础P19神经元活力。
图7.2-吡啶胺和4-嘧啶胺化合物(以化合物编号列出)表现出处理后的延迟型神经保护作用。在谷氨酸处理后2小时达到的功效等于当P19神经元用这些化合物预处理时达到的功效。这种时序分布型与MEK抑制剂U0126的时序分布型匹配。空心虚线条带代表预处理的神经保护(NP)百分率；实心条带代表处理后2小时的NP百分率。
发明详述
本发明提供一种药用组合物，所述药用组合物包含药学上可接受的载体和具有下式的化合物或其药学上可接受的盐，
其中
(a)R1为H或在环的5位或6位连接的选自以下的取代基：烷基、链烯基、链炔基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、苯基、嘧啶基、取代的嘧啶基、吡啶基、取代的吡啶基、苯基链烯基、取代的苯基链烯基、苯并[b]噻吩-2-基、2-苯并呋喃基和取代的苯基，所述取代的苯基具有下式
Figure A0181669100122
其中(i)R6选自H、OH、卤素、烷基氨基、二烷基氨基、羟基取代的二烷基氨基、低级烷基、酸性低级烷基、烷氧基、卤取代的低级烷氧基、苯基和吗啉基，而(ii)R7代表1-4个取代基，所述取代基可以相同或不同，选自H、卤素、氨基、烷基、低级烷基、卤取代的低级烷基、烷基氨基、二烷基氨基、酸性低级烷氧基、烷氧基、卤取代的低级烷氧基、烷氧基和苯基烷氧基，条件是R6和R7可以稠合形成2-萘基或1，3，苯并间二氧杂环戊烯；
(b)每个R2独立地为H或低级烷基；
(c)每个R3独立地选自H、低级烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基和低级烷氧基；
(d)R4为H、烷氧基或吗啉基，条件是R4可以与R3稠合形成2，3-
二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯基或9-烷基9H咔唑基；且
(e)R5为H或低级烷基。
在本发明药用组合物的一个实施方案中，R1为位于环的5位的取代的苯基，而每个R2为H。在另一个实施方案中，R4为吗啉基。在再一个实施方案中，每个R3为低级烷氧基，而R4为低级烷氧基。在又一个实施方案中，R1位于环的6位，每个R2为H，最好每个R3和R4为低级烷氧基。
在本发明药用组合物的优选实施方案中，其中含有的化合物选自下述组，其结构在实验细节中叙述：
5-(3-乙氧基苯基)-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-吡啶胺；
N-[4-(4-吗啉基)苯基]-5-(2-萘基)-2-吡啶胺；
5-苯并[b]噻吩-2-基-N-[4-(4-吗啉基)苯基]-2-吡啶胺；
5-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-N-[4-(4-吗啉基)苯基]-2-吡啶胺；
5-[4-(4-吗啉基)苯基]-N-[4-(戊氧基)苯基]-2-吡啶胺；
5-[4-(二甲氨基)苯基]-N-[4-(戊氧基)苯基]-2-吡啶胺；
5-[4-(二甲氨基)苯基]-N-(4-甲氧基苯基)-2-吡啶胺；
5-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-[4-(戊氧基)苯基]-2-吡啶胺；
4-[6-[[4-(戊氧基)苯基]氨基]-3-吡啶基]-苯丙酸；
5-(2-甲氧基苯基)-N-[4-(戊氧基)苯基]-2-吡啶胺；
N-(2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯-6-基)-5-[(E))-2-苯基乙烯基]-2-吡啶胺；
N-[6-[3-(二甲氨基)苯基]-2-吡啶基]-9-乙基-9H-咔唑-3-胺；
6-(3-乙氧基苯基)-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-吡啶胺；
6-[3-(三氟甲氧基)苯基]-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-吡啶胺；
6-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-吡啶胺；
6-苯基-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-吡啶胺；
6-(3，4-二甲氧基苯基)-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-吡啶胺；
6-(3，4-二甲基苯基)-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-吡啶胺；
N-(4，5-二甲氧基-2-甲基苯基)-6-(3，4-二甲基苯基)-2-吡啶胺；
6-(2-萘基)-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-吡啶胺；
6-(2-苯氧基苯基)-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-吡啶胺；和
6-[(E)-2-苯基乙烯基]-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-吡啶胺。
除非另有说明，本文所用的术语“烷基”是指仅由碳和氢构成的饱和直链、支链或环状取代基。低级烷基是指含有1-4个碳原子的烷基。术语“链烯基”是指仅由碳和氢构成的、含有至少一个双键的不饱和直链、支链或环状取代基。术语“链炔基”是指仅由碳和氢构成的、含有至少一个叁键的不饱和直链、支链或环状取代基。
术语“烷氧基”是指O-烷基，其中烷基如上所限定。术语“烷硫基”是指S-烷基，其中烷基如上所限定。酸性烷基是具有一个末端COOH基团的碳链。
本文所用的术语“烷基氨基”是指烷基取代的氨基。同样，术语“二烷基氨基”是指被两个独立选择的烷基取代的氨基。术语“羟基取代的二烷基氨基”是指其中所述烷基中的一个或两个独立地被一个羟基取代的二烷基氨基，其中羟基独立地位于所述烷基的任何碳原子上。
术语“卤”是指氟、氯、溴和碘。符号“Ph”或“PH”是指苯基。
当一个具体基团被“取代”(例如芳基、杂环烷基、杂芳基等)时，该基团可以具有一个或多个取代基，优选具有1-5个取代基，更优选具有1-3个取代基，最优选具有1-2个取代基，所述取代基独立地选自所列的取代基。
涉及取代基时，术语“独立地”意指当不止一个这种取代基是可能时，这样的取代基相互之间可以相同或不同。
对于本发明的目的，吡啶环系将具有下述编号。
本发明药用组合物中所含有的化合物在以下实验细节部分举例说明。这些化合物是市售的，得自BioFocus PCC(UK)，作为化学文库的部分。或者，以下例举的化合物可以用已知方法制备。
本文所用的短语“药学上可接受的盐”是指具有所述游离碱所需药理学活性并且是非生物的也不是不想要的所述游离碱的盐。这些盐可以衍生自无机酸或有机酸。无机酸的实例是盐酸、硝酸、氢溴酸、硫酸和磷酸。有机酸的实例是乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、水杨酸等。
本发明的药用组合物可以按照常规制药技术来制备。其中的药学上可接受的载体可以采用多种多样的形式，这取决于给药所需的制剂形式，例如***给药，包括但不限于静脉给药、口服给药、经鼻给药或胃肠外给药。在制备口服给药形式的组合物时，可以使用任何常用的药用载体，例如就口服液体制剂(例如混悬剂、酏剂和溶液剂)而言为水、二醇类、油、醇类、矫味剂、防腐剂、着色剂、糖浆等；或者使用任何常规的载体，例如就口服固体制剂(例如散剂、胶囊剂和片剂)而言为淀粉、糖、稀释剂、制粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。
因为片剂和胶囊剂易于给药，所以片剂和胶囊剂为优选的口服剂量单位形式，其中使用固体药用载体。如果需要，可以采用标准技术给片剂包糖衣或包肠衣。对于胃肠外制剂，载体通常包含无菌水，尽管也可以包括用于溶解或防腐的其它成分。也可以制备注射用混悬剂，其中可以使用适当的液体载体、悬浮剂等。所述化合物也可以以气雾剂的形式给予。
本发明也提供一种降低细胞经历局部缺血性死亡的可能性的方法，所述方法包括使所述细胞与预防有效量的本发明药用组合物所包含的化合物接触。
本文所用的术语“局部缺血性死亡”当涉及细胞时，意指由于缺乏氧引起的死亡。局部缺血性细胞死亡可以由于例如低氧性病症而引起。体内或离体的细胞或完整的组织的局部缺血其中可以由于血管梗塞、破坏或狭窄引起的血液供应受阻碍所致的局部贫血而引起。局部缺血性死亡及其形态学特征是众所周知的，并且是本领域技术人员可辨别的。
本文所用的本发明药用组合物或其中的化合物的“预防有效量”系指降低细胞群体中细胞死亡发生率的量。本发明的药用组合物一般每剂量单位(例如一片、一粒胶囊、一包散剂、一个注射剂、一茶匙等)含有约0.001至约100mg/kg。在一个实施方案中，本发明的药用组合物每剂量单位含有约0.01至约50mg/kg化合物，优选含有约0.05至约20mg/kg。用于确定本发明药用组合物的预防有效量的方法是本领域众所周知的。例如将所述药用组合物给予人类的有效量可以根据动物研究的结果在数学上确定。
本文所用的“细胞群体”是指：体外的细胞，例如培养容器中的细胞；或者体内细胞，例如作为体液的部分或作为完整组织或器官的细胞。所述细胞群体可以是均一的(由一种细胞类型构成)或不均一的(包含混合的细胞类型的群体)。优选的细胞群体是不均一的细胞群体，包含至少一种已经被鉴定为在本发明化合物存在时防止局部缺血性死亡的细胞类型。
在所述本发明方法的一个实施方案中，构成所述细胞群体的细胞优选为哺乳动物细胞，更优选为人类细胞。构成证明对创伤事件应答局部缺血性损害减少的细胞群体的细胞，包括但不限于包含至少一种选自以下的细胞的细胞群体：神经元细胞、神经胶质细胞、心肌细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和成纤维细胞。在优选实施方案中，所述细胞是神经元细胞。
本发明还提供一种减少对创伤事件应答的神经元细胞死亡的方法，所述方法包括在所述创伤事件之前、期间或在所述创伤事件之后的适当时间内，使所述神经元细胞与预防有效量的本发明药用组合物中所含有的化合物接触。
这两种本发明方法都可以在体外、离体或体内进行。本文所用的使细胞与一种药物“在体外”接触，包括例如使这种药物与单一细胞培养物、混合细胞培养物或原代细胞组织培养物中的细胞接触。使细胞与一种药物“离体”接触，包括例如使这种药物与作为在所来源的受治疗者体外维持的组构化组织或器官部分的细胞接触。使细胞与一种药物“体内”接触，意指使这种药物与存在于受治疗者体内的细胞接触。
本发明还提供一种减少受治疗者体内对创伤事件应答的神经元细胞死亡的方法，所述方法包括在所述创伤事件之前、期间或在所述创伤事件之后的适当时间内，给予所述受治疗者预防有效量的本发明药用组合物。术语“受治疗者”包括但不限于任何动物或人工修饰的动物。在优选实施方案中，所述受治疗者是人类。
将本发明的药用组合物给予受治疗者的途径优选***给药，包括例如静脉给药(iv)、皮下给药(sc)和口服给药。在一个实施方案中，将本发明的组合物直接给予神经***。这种给药途径包括但不限于脑内、室内、脑室内、鞘内、脑池内、脊髓内和/或脊髓周给药途径，可以使用颅内针、脊柱内针和带有或不带有泵装置的导管。输注剂量可以范围在数分钟至数天的时间内，范围例如为约1.0-1.0×104μg/kg/min的本发明化合物。对于局部给药，本发明的化合物可以与药用载体以浓度例如约0.1％至约10％药物与载体之比进行混合。
在所述本发明方法中，引起神经元细胞死亡的创伤事件包括例如疾病、物理创伤、化学创伤和生物学创伤。
引起神经元细胞死亡的疾病的实例包括围产期低氧-局部缺血性损伤、心博停止、中风/局部缺血发作、低血糖诱发的神经病、心脏手术诱发的脑缺血、创伤后应激性疾病、应激诱发的记忆力减退、慢性癫痫、多发性硬化、帕金森病、糖尿病性周围神经病、神经病性痛、Bell麻痹、病窦综合征、早老性痴呆、Pick病、弥漫性Lewy体病、Cruzfeld′s Jacobs病和蛋白聚集的其它疾病、进行性核上性麻痹(Steel-Richardson综合征)、多***变性(Shy-Drager综合征)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、退行性共济失调、皮质基底变性、Guam氏ALS-Parkinson′s-Dementia综合征、亚急性硬化性全脑炎、亨廷顿舞蹈病、synucleinopathies(包括多***萎缩)、原发性进行性失语症、纹状体黑质变性、Machado-Joseph病、3型脊髓小脑性共济失调、橄榄体脑桥小脑变性、Gilles De La Tourette病、延髓性假延髓性麻痹、脊髓性脊髓延髓性肌萎缩(Kennedy病)、原发性侧索硬化、家族性痉挛性下身麻痹、Werdnig-Hoffmann病、Kugelberg-Welander病、Tay-Sach病、Sandhoff病、家族性痉挛性疾病、抗精神病药恶性综合征，Wohlfart-Kugelberg-Welander病、痉挛性下肢轻瘫、进行性多病灶性脑白质病、AIDS相关性痴呆、病窦综合征、疱疹后神经病、病毒性脑膜炎、细菌性脑膜炎、朊病毒病和家族性自主神经机能异常(Riley-Day综合征)。
引起神经元细胞死亡的物理创伤包括例如局灶性脑创伤、弥漫性脑创伤、脊髓损伤、脑梗塞、栓塞性闭塞、血栓性闭塞、再灌注、颅内出血、鞭子式损伤、婴儿惊吓综合征(shaken infant syndrome)和辐射诱发的周围神经损伤。
引起神经元细胞死亡的化学创伤包括例如暴露于乙醇、化疗药、军用毒气、铅、氰基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺和毒性吸入剂。最后，引起神经元细胞死亡的生物学创伤包括例如接触HIV、疱疹病毒以及引起脑膜炎的细菌和病毒。
在实施本发明方法时，可以将所述药用组合物在创伤事件之前、期间或之后给予所述受治疗者。本文所用的术语“之后(随后)”是指始于创伤事件并且持续至所述创伤事件引起的细胞死亡的潜力已经减弱的任何时间点。
最后，本发明提供一种用于给予受治疗者任何本发明药用组合物的设备，所述设备包括一个容器和容器中的药用组合物，其中所述容器有一个用于给予所述受治疗者预防剂量的所述药用组合物的装置。在优选实施方案中，所述用于给予所述药用组合物的装置是一个注射器。理想的是，本发明装置是一种单一用途的、含有本发明组合物的预装药的自我注射用装置。这样一种装置例如在可移动的非固定设备中或者对于给予有神经毒性事件危险的人而言可能是有用的。机械自我注射用设备是本领域众所周知的，例如EpiPen装置(MeridianMedical Technologies Inc.)，该装置是一种供患有过敏性休克的个体用的、含有肾上腺素的自我注射用装置。
通过参考以下的实验细节，将可更好地理解本发明，但本领域技术人员容易认识到，这些仅仅说明本发明，因为本发明将在下面的权利要求书中有更加全面地描述。另外，在本申请中，引用了各种出版物。这些出版物的公开内容通过引用结合到本申请中，以更全面地描述本发明所属领域的现有技术。
实验细节
实施例1
市售的2-吡啶胺
Figure A0181669100191
Figure A0181669100211
实施例2
分化P19细胞的表征
P19细胞的分化
P19细胞是一种可以在高剂量视黄酸存在下被诱导而相对快速地分化为有丝***后神经元的多能胚性癌系(Jones-Velleneuve等1982；Jones-Villeneuve等1983；McBurney和Rogers 1982)。它们是人NT-2N神经元的鼠等同物，人NT-2N神经元也来源于畸胎癌前体细胞的视黄酸分化。分化的NT-2N神经元也许是这两种畸胎癌源神经元系中了解得更多的，表达各种各样的神经元标记，并且经历NMDA受体介导、低氧诱导的兴奋毒性细胞死亡(Pleasure和Lee 1993；Pleasure，Page和Lee 1992；Rootwelt等1998)。同NT-2Ns一样，分化的P19神经元也表达各种各样的神经元标记，表现出对激动剂的NMDA受体介导的胞内钙应答，并且经历兴奋毒性(Canzoniero等1996；Grobin等1999；Morley等1995；Ray和Gottlieb 1993；Turetsky等1993)。
P19细胞可从ATCC(Manassas，VA)购买。让它们于37℃、5％CO2环境下，在150cm2组织培养瓶中的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Gibco BRL)中生长，所述培养基中补充有10％胎牛血清、谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸钠(1mM)、碳酸氢钠(0.15％w/v)和青霉素/链霉素(50单位/mL)。
在所述分化方案的第1天，将融合的P19细胞在生长培养基中分瓶至50-70％融合。在所述方案的第2天，向生长培养基中加入10μM全反式视黄酸(ATRA，Sigma)和10μM MK-801。在该阶段包含10μMMK-801，以防止开始表达NMDA受体的分化中的神经元细胞死亡。第4天，在细胞上放上新鲜的生长培养基，具有新鲜的ATRA和MK-801。第5天，通过用无钙镁的磷酸缓冲盐溶液洗涤4次，并加入4ml非酶细胞分离溶液(Sigma)，使细胞从组织培养瓶上分离。
一旦分离出，则将细胞置于40ml分化培养基中。分化培养基由补充下述成分的神经基础培养基(Neurobasal medium)(Gibco BRL)构成：1％ N-2补充物(Gibco BRL)、0.1％微量元素B(Mediatech)、1mM硫酸镉(Sigma)、2mM谷氨酰胺、丙酮酸钠(1mM)、碳酸氢钠(0.15％ w/v)和1％抗生素/抗真菌剂(Gibco BRL)。加入10μM胞嘧啶-D-***呋喃糖苷至分化培养基中，以防止未分化细胞生长。从此时起，不存在MK-801。将细胞研磨20次，然后将其以1∶4分配到96孔板中，或以1∶3分配到100mm组织培养皿中。重新接种后4天，细胞最适于化合物的加入，24小时后进行分析。
RT-PCR
用QIAGEN RNeasy Mini试剂盒，按照生产商的方案，从分化P19神经元或未分化P19细胞的100mm组织培养皿中分离总RNA。由250ng从未分化P19细胞、视黄酸(ATRA)诱导后4天的细胞和ATRA诱导9天后的细胞分离的总RNA模板，获得鼠NMDA受体亚基RT-PCR扩增产物。用LightCyclerTM-RNA扩增试剂盒SYBR Green I试剂盒(Boehringer Mannheim)，按照生产商的方案，建立一步RT-PCR反应。用LightCyclerTM仪器和250ng模板RNA(Boehringer Mannheim)，在LightCyclerTM玻璃毛细管中进行实时RT-PCR反应。于55℃进行逆转录酶反应10分钟。进行30个循环的PCR：退火温度为50℃，延伸温度为72℃，而解链温度为80℃。将反应与每种引物组的水阴性对照相比较。取出5μl反应产物，在1×TBE琼脂糖凝胶上电泳。所用的各种小鼠NMDA受体亚基的引物组包括ζ1和ε1-4。
通过电泳分离得自视黄酸处理后4天和9天的RNA样品、未分化的样品和对照样品，并用ζ1、ε1和ε2内部引物探测。
得自总RNA样品的NMDA受体亚基的RT-PCR揭示，分化的视黄酸诱导也诱导了ζ1、ε1和ε2mRNA的mRNA表达。用3个单独的实验总结数据。
蛋白质印迹
从在100mm组织培养皿中接种的细胞中吸取培养基。将细胞收获到RIPA裂解缓冲液(100mM Tris HCl pH 7.5，150mM NaCl，1mMEDTA，1％ Triton X-100，10％脱氧胆酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠)中。将每个样品超声处理20秒，加入Laemmli样品缓冲液(BioRad)至1×的终浓度，然后将样品于95℃保温10分钟。欲用NMDA受体抗体(抗大鼠NR1、NR2A和NR2B的多克隆抗体，得自Chemicon)探测的样品在6％ tris-甘氨酸预制凝胶(NOVEX)上电泳。欲用p42/44 MAP激酶抗体(New England BioLabs)探测的样品在12％ tris-甘氨酸预制凝胶(NOVEX)上电泳。电泳在NOVEX仪中于200伏下进行1.5小时。用BioRad湿转移装置于100伏1小时，将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF，NOVEX)上。在转移之前，将PVDF膜在100％甲醇中浸渍1分钟，然后在转移缓冲液中浸泡5分钟。转移之后，取出膜，在封闭溶液(5％奶粉，0.05％ tween-20，在磷酸缓冲盐溶液中)中于4℃缓慢振荡过夜。然后膜用PBS-tween洗涤1次，与含有5％奶粉的第一抗体在PBS-tween中的1∶1000稀释液于室温保温1小时。于室温洗涤膜4次，每次15分钟。在含有5％奶粉的PBS-tween中，与偶联于辣根过氧化物酶的第二抗体于室温保温约45分钟。然后于室温洗涤膜4次，每次15分钟。用ECL plus(Amersham)使印迹显色，并对胶片曝光。
对在暴露于视黄酸4天或9天后收获的P19细胞裂解液中的NMDA受体亚基蛋白，进行蛋白质印迹分析。从终末分化的P19神经元裂解液中可检测到正确大小的条带(ζ1＝～120kDa，ε1和ε2＝～180kDa)，但从未分化的细胞裂解液中检测不到。所述数据代表得到相似结果的3个单独的实验。
蛋白质印迹分析表明，终末分化的P19神经元表达可检测水平的ζ1、ε1和ε2蛋白。在这些细胞中，在任何时候都检测不到ε3和ε4mRNA或蛋白。
这些数据表明，这样的使P19细胞成功分化为神经元的方法导致mRNA、蛋白质水平的NMDA受体的功能表达、MK-801敏感性激动剂诱导的胞内钙应答和MK-801敏感性谷氨酸毒性。这些数据与文献非常一致。然而，有趣的是，除ζ1和ε2表达之外，也达到NMDA受体的ε1亚基的可靠的表达，用其它已报道的P19细胞分化方法未曾达到这种表达(Ray和Gottlieb 1993)。所有三种亚基的存在更加类似在成年啮齿动物前脑区(包括皮质和海马)中观测的表达模式(Ishii等1993；Laurie等1995；Monyer等1994；Monyer等1992；Standaert等1994)。
                      实施例3
                分化P19兴奋毒性的测定
于37℃给细胞加载5μM Fura-2-AM(Molecular Probes)达1小时。细胞用Hank平衡盐溶液(HBSS，Gibco BRL)洗涤1次，然后在HBSS缓冲液中进行分析。将细胞置于改良ATTOFLUORTM成像仪(AttoInstruments，Rockville Pike，MD)的载物台上。用RATIOARCTM High-Speed Excitor(Atto Instruments)进行fura-2的高速双重兴奋。使汞灯灯光通过334nm或380nm的带通滤波器(10nm带宽)，然后以2.5Hz的速率通过20×物镜(Zeiss，Plan Apochromat，NA＝0.75)。让发射光通过400nm二色分光镜发射，集光至一个ATTOFLUORTM加强CCD摄像机上。获得比例图象(ratio-image)，用ATTOFLUOR RATIOVISIONTM软件(Atto Instruments，Rockville，MD)，分析于334nm和380nm下激发时的图象的平均光强度。
当ATRA处理9天后的P19神经元在100μM MK-801存在或不存在下用3mM谷氨酸、1mM甘氨酸处理时，将Fura-2330nm/380nm强度比的变化作图。在分析之前24小时给予MK-801。记录仪上的图录为每种条件的三个独立实验的平均值±标准误差。通过利用fura-2成像检测加入NMDA受体激动剂时胞内钙水平的增加而阐明，终末分化的P19神经元表达构成功能性NMDA受体的NMDA受体亚基(图1A)。选择性NMDA受体通道阻断剂MK-801显著抑制这种应答(图1A)。另外，P19神经元表达NMDA受体的特异性结合部位。分析P19膜中[3H]-MK-801结合的MK-801抑制。MK-801浓度以10-x摩尔浓度表示。数据点代表8个实验的平均值±标准误差。％对照＝((CPM-CPM底部)/(CPM顶部-CPM底部))×100(图1B)。MK-801抑制是浓度依赖性的，达到100％抑制。
对照P19神经元胞体和突起被活细胞胞质染料羧基荧光素二乙酸(CFDA)亮染色。ATRA诱导后9天的P19神经元用CFDA标记，然后用Attofluor成像仪以共聚焦模式成像。对照细胞用溶媒处理24小时，谷氨酸细胞在1mM甘氨酸存在下接受3mM谷氨酸达24小时，而谷氨酸+U0126细胞接受10μM U0126，同时接受3mM谷氨酸和1mM甘氨酸达24小时。在3个独立实验中，从用荧光素二乙酸染色的对照活细胞、谷氨酸处理的细胞、死细胞和U0126保护的细胞获取图象。当接种到普通组织培养塑料板上时，P19神经元胞体特征性地聚集在一起成为紧密的聚集体。广泛的突起网络连接神经元胞体簇。用毒性浓度的谷氨酸和甘氨酸处理P19神经元24小时，在分离的胞体中显示出荧光染色，检测不到突起，明显有广泛的细胞碎片。用活细胞荧光染料alamar blue，在平板读数仪上快速地定量测量细胞死亡的相对水平(图2B)。
Alamar Blue荧光是一种细胞活力的指示，用来测定NMDA诱导的细胞毒性损害后的细胞活力。得自一块96孔板的计数示于图2A中，其中32个孔接受溶媒对照，32个孔接受3mM谷氨酸和1mM甘氨酸达24小时，32个孔接受5μM A23187达24小时。通过运用GRAPHPADTM软件进行的单因素ANOVA与Tukey post-hoc分析测定，谷氨酸和A23187条件与对照有显著差异。这些数据表明，当细胞用谷氨酸和甘氨酸处理时，Alamar blue荧光通常降低60％。然而，由于大致的荧光计数在实验之间有变化，因此图2A、2B和2C以对照的百分率来表示。
测量在分化的P19神经元中，在存在恒定的1mM甘氨酸浓度时谷氨酸毒性的剂量反应。通过所述数据点产生的曲线是6个独立剂量反应曲线的平均值。数据点以对照细胞的百分率±标准误差表示。％对照＝(([谷氨酸]实验-[谷氨酸]最大)/(对照溶媒-[谷氨酸]最大))×100。计算谷氨酸毒性EC50为8.1μM[下限95％置信区间＝3.5μM；上限95％置信区间＝19μM]。这些数据证明，谷氨酸处理24小时，在恒定剂量的甘氨酸存在下剂量依赖性地杀伤P19神经元(图2A、2B)。仅甘氨酸并不影响P19神经元活力。
NMDA受体阻断剂MK-801剂量依赖性地保护P19神经元抵抗谷氨酸毒性(图2D)。MK-801剂量依赖性地抑制3mM谷氨酸和1mM甘氨酸诱导的P19神经元死亡。％神经保护＝((在谷氨酸最大存在下的抑制剂-[谷氨酸]最大)/(对照溶媒-[谷氨酸]最大))×100。数据点为3个单独实验的平均值±标准误差。所达到的最大MK-801保护接近对照水平。
这些数据证明，在P19神经元中谷氨酸的毒性需要NMDA受体活化，因为所述毒性在特异性NMDA受体拮抗剂MK-801存在下被完全阻断。然而，该数据并未排除AMPA受体或红藻氨酸受体也可能被谷氨酸活化并引起兴奋毒性的可能性。这种可能性可能与得自原代神经元培养物的数据一致，得自原代神经元培养物的数据报告了对谷氨酸激动剂的胞内钙应答涉及多种组分(Courtney，Lambert和Nicholls1990)。这类组分包括AMPA/红藻氨酸受体活化、膜去极化、电压门控钙通道活化、NMDA受体镁阻断的缓解和NMDA受体活化。然而，即使有这样一种高水平的复杂性，但在许多原代神经元模型中，谷氨酸兴奋毒性通过NMDA受体发送信号，并且需要其活化以引起神经元死亡(Tymianski等1993)，P19神经元模型***的情况正是如此。
用这些细胞测量各种已知激酶抑制剂(表I中的化合物标识(ID)栏)对NMDA诱导的细胞毒性的效应。首先，如实施例2中所述，使P19细胞分化。然后，将细胞在1mM甘氨酸存在下暴露于3mM谷氨酸。
测定细胞活力。通过测量与未表现出毒性损伤的分化P19细胞相比活细胞的百分率，确定防止兴奋毒性的化合物(表I)。
用两种方法测定细胞活力。第一种方法是一种基于共聚焦单细胞荧光成像的方法，使用活细胞染料羧基荧光素二乙酸(CFDA)。CFDA标记活细胞的胞体和突起。因此，活细胞表现出广泛的CFDA标记，而死细胞表现出CFDA染色少得多。CFDA荧光用改良的Attofluor成像装置(Atto Instruments，Rockville Pike，MD)测量。细胞在培养基中用1μM CFDA标记15分钟，然后置于Attofluor显微镜的载物台上。染料用来自汞灯源的光激发，所述光通过一个10nm带宽的488nm带通滤波器，通过一个CARV实时共聚焦旋转盘组件(confocal spinning diskmodule)(Atto Instruments，Rockville，MD)，然后通过一个40倍油浸物镜(Zeiss Fluar，NA＝1.3)。发射光穿过一个495nm二色分光镜，集光于Attofluor加强CCD摄像机上，用Attofluor RatioVision软件(AttoInstruments，Rockville，MD)显现图象。
用于测量细胞活力的第二种方法是一种平板读数仪方法。给接种于黑色96孔板(Packard viewplates)的细胞加载5％ Alamar Blue染料(Biosource International)。Alamar Blue是一种利用线粒体还原酶将无荧光的刃天青转化为发荧光的试卤灵的染料(激发波长535nm，发射波长580nm)。在加入Alamar blue后，立即于室温下在Wallac平板读数仪中，读出基线荧光计数。在于37℃孵育1小时后，以同样方式读取细胞活力的荧光计数。荧光以扣除背景荧光之后对照即未处理细胞的百分率表示。用光学显微镜目测证实活/死细胞。
正如在以下表I中所用的，化合物A将指具有下式的化合物
Figure A0181669100291
                                       表I 激酶抑制剂活性与神经保护活性的比较
    化合物ID   酶目标     活性     效力 神经保护的IC50[下限-上限95％ C.I.]   神经保护的最大功效
    化合物A   p38激酶     抑制剂 IC50～10nM 9.7μM[5.8-16.3]   ＞80％
    U0126   MEK1/2     抑制剂 IC50～0.5μM 1.1μM[0.74-1.7]   ＞80％
    SB202474   p38激酶     无活性 不适用 ＞10μM   ＞50％
    SB203580   p38激酶     抑制剂 IC50～600nM 无效   ＜10％
    锂   IP3转换     抑制剂 Ki～0.5μM 无效   ＜10％
    KN62   CAMKII     抑制剂 Ki～900nM 无效   ＜10％
Calphostin C   PKCPKAPKGp60c-src     抑制剂抑制剂抑制剂抑制剂 IC50～50nMIC50＞50μMIC50＞25μMIC50＞50μM ＞1μM ～50％
    LavendustinA   EGF受体p60c-src     抑制剂抑制剂 IC50～11nMIC50～500nM ＞10μM ＜25％
H-89   PKACAMKII酪蛋白激酶IPKC     抑制剂抑制剂抑制剂抑制剂 Ki～48 nMKi～30μMKi～38μMKi～31.7μM ＞10μM ＜25％
激酶抑制活性和效力得自文献(Chijiwa等1990；Favata等1998；Henry等1998；Inhorn和Majerus 1987；Kobayashi等1989；Lee等1994；Onoda等1989；Tokumitsu等1990)。神经保护的IC50是具有所示95％置信区间(C.I.)上限和下限的三个独立曲线的平均值。使曲线拟合，用GraphPad Prism软件确定置信区间。
                     实施例4
           在分化P19测定中MEK1/2抑制剂的评价
据报告U0126(双[氨基[(2-氨基苯基)硫代]亚甲基]丁二腈)对于MEK1/2具有高度选择性(Favata等1998)，这一结果在此得到证实。被发现U0126所抑制的唯一的其它激酶是PKC-γ，但抑制该酶的IC50是已发表的其对野生型MEK1/2的IC50的60倍(以下表II和III)。
用于激酶活性测定的通用方法如下：在50mM Tris-HCl pH＝8、10mM MgCl2、0.1mM Na3VO4、1mM DTT、10μM ATP、0.25-1μM生物素化肽底物、0.2-0.8μCi/孔的33P-γ-ATP[2000-3000Ci/mmol]中制备激酶反应混合物。测定条件对于每种蛋白激酶略有变化，例如，胰岛素受体激酶的活性需要10mM MnCl2，而钙调蛋白依赖性蛋白激酶需要钙调蛋白和10mM CaCl2。将反应混合物分配到链霉抗生物素蛋白包被的Flashplate中，加入1μl 100％ DMSO中的药物母液至100μl反应体积，达到反应物中1％ DMSO的终浓度。酶用50mM Tris-HClpH＝8.0、0.1％ BSA稀释，加入至各孔中。将反应物在化合物存在下于30℃保温1小时。1小时后，从所述板中吸取反应混合物，然后所述板用含有100mM EDTA的PBS洗涤。所述板在闪烁计数器中读数，以测定掺入到固定化肽中的33P-γ-ATP。试验化合物在范围为100μM-10pM的8种浓度下，以一种顺序的多个步骤，以双份重复进行测定。测定每个板上的所述测定的最大信号和最小信号。通过将抑制百分率对试验化合物的log浓度作图，根据所述测定中最大信号的抑制百分率的剂量反应曲线，按照公式[最大信号-背景/试验化合物信号-背景×(100)]＝％抑制，计算出IC50。在每块板上，也包括适用于被测激酶的已知抑制剂化合物。在图3中提供结果。
激酶的定义和来源
VEGF-R(血管内皮生长因子受体-2)是一种融合蛋白，在N末端含有一个聚组氨酸标志，后接大鼠VEGF-R2激酶结构域的氨基酸786-1343。CDK1(细胞周期蛋白依赖性激酶1)分离于表达人CDK1催化亚基及其正调节亚基细胞周期蛋白B的昆虫细胞。胰岛素受体激酶由人胰岛素受体β亚基胞质结构域的残基941-1313构成。蛋白激酶A是从牛心纯化的cAMP依赖性蛋白激酶A的催化亚基。PKC(蛋白激酶C)是在昆虫细胞中生产的人蛋白的γ或β同种型。酪蛋白激酶1是一种在在大肠杆菌中生产的大鼠CK1δ同种型C末端部分的氨基酸318截短的截短物。酪蛋白激酶2包括在大肠杆菌中生产的人CK2蛋白的α亚基和β亚基。钙调蛋白激酶(钙调蛋白依赖性蛋白激酶2)是一种在昆虫细胞中生产的大鼠蛋白α亚基的截短形式。糖原合酶激酶3是在大肠杆菌中生产的兔酶的β同种型。MAP激酶是在大肠杆菌中生产的、在N末端含有一个聚组氨酸标记的大鼠ERK-2同种型，并且在纯化之前通过用MEK1磷酸化而被活化。EGFR(表皮生长因子受体)纯化自人A431细胞膜。以下图表显示所选的激酶及其对照抑制剂。
正如以下表III中所用的，化合物A(Cmpd A)将指具有下式的化合物
Figure A0181669100311
                      表II
            所选激酶及其对照抑制剂
激酶 对照抑制剂
CDK1 丁内酯
EGFR AG-1478
蛋白激酶A H89
PKC 星形孢菌素
酪蛋白激酶1 H89
酪蛋白激酶2
钙调蛋白激酶 星形孢菌素
胰岛素激酶 星形孢菌素
                               表III 化合物A和U0126的激酶选择性
化合物ID   CDK1(μM)   EGF-R(μM)   PKA(μM)    PKC-γ(μM)
Cmpd A   ＞100   ＞100   ＞100    8.35
U0126   ＞100   ＞100   ＞100    29.5
化合物ID   酪蛋白激酶1(μM)   酪蛋白激酶2(μM)   钙调蛋白激酶(μM)    胰岛素受体激酶(μM)
Cmpd A   0.116   ＞100   ＞100    ＞100
U0126   ＞100   ＞100   ＞100     ND
激酶抑制的IC50值是至少两个独立曲线的平均值，运用GraphPad曲线拟合软件测定。
为了确定U0126是否在P19神经元中抑制MEK1/2酶，测试了其阻断谷氨酸诱导的MEK1/2底物p42 MAPK(ERK2)磷酸化的能力。首先用以p42/44(ERK.1/2)磷酸化形式的特异性抗体处理后9天的ATRAP19神经元裂解液来探测蛋白质印迹，将其解吸(stripped)，然后用识别总p42/44(ERK.1/2)的抗体再探测。数据表明，用来在P19神经元中诱导毒性的浓度下的谷氨酸和甘氨酸，在这些细胞中也诱导快速的可再现的p42 MAPK磷酸化增加。在U0126存在下，磷酸-p42 MAPK被还原，尽管总p42 MAPK量的变化不明显。在另一蛋白质印迹实验中，在p42/44(ERK 1/2)磷酸化形式的特异性抗体处理后9天，探测ATRAP19神经元裂解液。将同一印迹解吸，然后用识别总p42/44(ERK I/2)的抗体再探测。谷氨酸诱导的p42 MAPK磷酸化持续增高，因为在24小时时相对于对照而言，增加仍很明显。这些印迹代表具有相似结果的3个独立的实验。U0126在这一时间点也阻断了增高的磷酸化水平。总p42 MAPK的变化不明显。
为了确定U0126并不直接阻断NMDA受体，在10μM U0126存在下测试了对谷氨酸和甘氨酸的P19神经元的胞内钙应答。Fura-2成像图录，ATRA后9天的P19神经元在10μM U0126存在下用3mM谷氨酸、1mM甘氨酸处理24小时。U0126与谷氨酸和甘氨酸同时给予。图录是得自每种条件的4个独立实验的平均值±标准误差。
数据表明，U0126并不阻断这种胞内钙应答(图4A)。也表明，U0126不抑制P19神经元中的[3H]-MK-801结合。在任何浓度的U0126下，都没有观察到显著的抑制。数据点代表8个实验的平均值±标准误差。对照百分率的定义如图1B中所述(图4B)。总之，这些数据进一步表明，U0126作用于NMDA受体活化下游的信号途径。
p42/44 MAPK抑制剂-U0126表现出延迟型神经保护
功效的时程是潜在神经保护治疗药的一种极其重要的参数，因为可能需要在局部缺血事件后数小时至数天给予所述治疗药而仍可保持功效。下一组实验检查MEK1/2抑制剂-U0126当在谷氨酸攻击后各种时间点加入时是否保持神经保护功效。测定基本上如上所述进行，尽管给予U0126的时间相对于最初的兴奋毒性而言延迟。数据表明，U0126直至谷氨酸攻击后6小时时，有最大神经保护作用(图5A)。然而，p38抑制剂在谷氨酸攻击后15分钟时即丧失功效(图5B)。U0126甚至在谷氨酸攻击开始后数小时后加入时，仍有最大神经保护作用。这可能是因为谷氨酸介导P19神经元中p42 MAPK磷酸化的持续增加，甚至在加入谷氨酸后24小时仍可检测到。在谷氨酸攻击后数小时U0126对上游活化酶MEK的抑制，可能有利于p42 MAPK的磷酸酶去磷酸化，并且在足够的时间内再稳定p42/44 MAPK信号途径，以防止细胞死亡。
因此，p42/44 MAP激酶途径的活化在分化P19神经元中是谷氨酸诱导的毒性所必不可少的。谷氨酸诱导的细胞死亡在24小时内发生，是剂量依赖性的，并且是NMDA受体介导的。谷氨酸诱导p42 MAP激酶的磷酸化，而这种磷酸化被其上游激酶MEK的抑制剂U0126所阻断。U0126也以剂量依赖性方式阻断谷氨酸的毒性。当在谷氨酸攻击开始之前、或甚至在攻击开始之后数小时，它仍是有效的。
能够甚至当在局部缺血事件后加入时仍能够发挥延迟型神经保护的化合物，是一种具有非常需要的特性的潜在中风治疗药。据报道，具有多样化机制的许多化合物表现出治疗后的延迟型神经保护作用。其中有谷氨酸受体拮抗剂(Li等1999b；Takahashi等1998；Turski等1998)、抗氧化剂(Callaway等1999；Pazos等1999；Sakakibara等2000)、抗惊厥药(Schwartz-Bloom等1998；Wasterlain等1996；Yang等1998)、蛋白酶抑制剂(Cheng等1998)、激酶抑制剂(Tatlisumak等1998)和镁(Heath和Vink 1999)。然而，这是在NMDA受体介导的兴奋毒性的细胞培养物模型中的首次证明，其中p42/44 MAP激酶途径的特异性抑制剂表现出延迟型神经保护作用，并且其中功效的时间窗在毒性攻击开始后很好地延长。
U0126神经保护对于谷氨酸诱导的毒性是选择性的
为了确定U0126是否防止各种各样的非特异性毒性损伤，或者这种化合物的功效对于谷氨酸诱导的毒性是否是选择性的，测试了其对各种各样的P19神经元死亡的其它诱导物的效应。
图6A显示了用各种浓度的A23187在10μM U0126存在或不存在下处理24小时的P19神经元。然后分析细胞的Alamar blue荧光。通过数据点产生的曲线是3个独立剂量反应曲线的平均值。数据点代表对照细胞的百分率±标准误差。在无U0126时A23187毒性的EC50计算为520nM[340nM-784nM]。在10μM U0126存在下A23187毒性的EC50计算为833nM[440nM-1.6μM]。
图6B表明，通过加入后24小时的Alamar blue荧光测定，10μMU0126不能防止1μM星形孢菌素诱导的P19神经元毒性。未接受星形孢菌素而接受溶媒的细胞，表现出Alamar blue荧光的对照水平。然而各种浓度的U0126在星形孢菌素处理的细胞中都不能使荧光回到对照水平。
图6C表明用以溶媒或在无任何毒性诱导物存在时以10μMU0126处理的P19神经元分析的Alamar blue荧光。仅U0126并不影响这些荧光对照水平。数据表明，U0126不能防止星形孢菌素诱导的或A23187诱导的死亡(图6A、6B)。另外，U0126不影响P19神经元的基础活力(图6C)。
                       实施例5
               运用分化P19细胞测定的药物筛选
用本文描述的方法筛选了市售的化学文库(BioFocus PLC，UK)。所述化合物的母液浓度为在DMSO中约400μM。初次筛选中所用的化合物的浓度为1μM。阳性化合物指定为表现出70％或更高神经保护作用的化合物。在96孔板中进行剂量反应测试，其中第1列为溶媒对照，第2列接受3mM谷氨酸和1mM甘氨酸，而第3列接受3mM谷氨酸、1mM甘氨酸和10μM U0126。第4-11列接受以下终浓度(μM)的化合物：3、1.2、0.48、0.192、0.077、0.031、0.012和0.005。每行含有一种不同的化合物供证实用。仅B-G行接受化合物，而A行和H行保持不处理。数据以％神经保护＝((化合物-谷氨酸平均值)/(U0126-谷氨酸平均值)×100)表示。
发现两类化合物-4-嘧啶胺和2-吡啶胺表现出神经保护特性，如本文的数据所示。仅所述2-吡啶胺是本发明的主题，尽管也提供了4-嘧啶胺的有限的数据。在以下表中总结了这种生物测试的结果。“％抑制”表示24小时后存活的对照细胞的百分率，代表在1微摩尔浓度下筛选的所述化合物的神经保护效应。IC50与得自剂量反应实验的数据相关。当所列的IC50值＞1时，表示在所测试的最高剂量(3μM)内没有观察到最大值，但仍表明有生物活性。ND是指在剂量反应实验中未测试的化合物。
Figure A0181669100361
  74     H   3-N(CH3)2   甲氧基     3，5-二甲氧基   ND   95
  75     H   3-N(CH3)2   戊氧基     H   ND   88
  76     H   3-N(CH3)2   稠合形成2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯基   ND   95
  77     吗啉基   H   稠合形成9乙基9H-咔唑   ND   82
  78     苯基   H   吗啉基     H   0.47   109
  79     甲氧基   3-甲氧基   吗啉基     H   0.46   110
  80     CH3   3-CH3   吗啉基     H   0.75   94
  81     稠合形成2-萘基   稠合形成2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯基   0.47   107
  82     H   H   甲氧基     H   ND   72
  83     吗啉基   H   甲氧基     H   ND   71
  84     CH3   3-CH3   甲氧基     3，5-二甲氧基   0.49   85
  85     CH3   3-CH3   稠合形成2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯基   ＞1   86
  86     CH3   3-CH3   甲氧基     H   ＞1   80
  87     CH3   3-CH3   H     N(CH3)2   ＞1   84
  94     COOH   H   戊氧基     H   0.78   104
  95     H   3-N(CH3)2   吗啉基     H   ＞1   101
  96     H   3-COOH   戊氧基     H   0.5   106
Figure A0181669100391
Figure A0181669100401
Figure A0181669100411
                      实施例6
2-吡啶胺和4-嘧啶胺衍生物在P19神经元中不抑制MEK活性
此中测试的市售2-吡啶胺和4-嘧啶胺化合物在P19神经元中不抑制MEK1/2激酶活性，因为它们在这些细胞中不抑制谷氨酸诱导的p44/42 MAP激酶磷酸化。然而，U0126的确如所预料的，抑制这种活性(图8)。通过加入3mM谷氨酸和1mM甘氨酸，诱导P19神经元中的MEK活性，并且通过分析MEK底物p44/42 MAP激酶的磷酸化进行测量。细胞用本文所述的化合物处理，或在有或无谷氨酸/甘氨酸情况下用U0126处理，在处理后5分钟收获，以供随后进行蛋白质印迹分析。数据表明，正如所预期的，U0126有效地抑制MEK底物的磷酸化，但是所述2-吡啶胺和4-嘧啶胺化合物不抑制MEK底物的磷酸化。因此，所述所述2-吡啶胺和4-嘧啶胺不是MEK抑制剂。
所述2-吡啶胺和4-嘧啶胺在兴奋毒性开始后至少2小时仍有最大神经保护作用。或者在谷氨酸/甘氨酸加入之前15分钟或者在加入之后2小时，以1μM的浓度给予化合物。U0126作为阳性对照测试。与U0126相似，所述2-吡啶胺和4-嘧啶胺化合物在这两个时间点保持最大神经保护功效，尽管对于一种不同的靶有活性。
                   实施例7
神经保护的体内模型：中脑动脉闭塞方案
给大约90-100日龄的自发性高血压(SHR)雄性大鼠(～250-300g)称重，然后用***(100mg/ml)/赛拉嗪(20mg/ml)混合剂(1.2ml/kg；i.p.)麻醉，然后皮下给予一种长效抗生素(例如combiotic)。根据角膜反射(向眼睛吹气)和对尾或爪夹痛反应的腿痉挛，评价麻醉剂的水平。一旦大鼠被麻醉，则将其放置在小的动物手术板上，并且在手术期间将其束缚。用直肠探测器监视大鼠体温，用稳态加热垫(homeostatic heating pad)将体温保持在37℃。剔去切口区的毛，并用betadine擦拭。手术区是无菌的。所有手术仪器都在高压灭菌器和/或玻璃珠干燥设备灭菌器中灭菌，然后在使用前用无菌盐水或乙醇冲洗。
(1)股动脉导管.将一个留置导管置于股动脉中，以供定期取血样和测量动脉血压。在股动脉区上作一个切口。钝性解剖组织，以分离动脉。动脉的远端用无菌缝线结扎，在近端周围进行松散的结扎，以保证导管处于适当位置。在动脉中作一个小切口，以供***导管。将PE50管的倾斜端***动脉中5mm，然后用无菌缝线固定在适当的位置。将PE管连接至装有肝素化盐水的1cc注射器，用来最低限度地保持动脉开放。取3次动脉血样品：局部缺血前10分钟、局部缺血开始后2小时和再灌注后15分钟。所有血样的体积为100-300μl，以测定pH、PaO2、PaCO2、血细胞比容和葡萄糖。在整个实验中的最大取血量每只动物不超过1ml。当不取血样时，将血压传感器连接于导管，以测量平均动脉压。手术结束时，除去导管，松开动脉，将切口区缝合。
(2)局灶性脑缺血的串连CCA-MCA闭塞模型。准备雄性自发高血压Wistar大鼠(SHR)，以便采用Brint及其同事所述技术(J.CerebBlood Flow Metab 8：474-485，1988)的改良技术，通过单侧闭塞颈总动脉(CCA)和脑中动脉(MCA)，使其可逆性局灶性脑缺血。通过颈部腹侧面的一个切口，分离左CCA。为了分离同侧MCA，在左眼的外眦和对应的外耳道之间作第二个切口以裸露出下面的头颅。所述MCA通过在Zeiss手术显微镜直接观察下在颧弓和鳞骨融合部位嘴侧2-3mm钻5mm的孔来暴露。用无菌26g针打开硬膜，将一根铂金属丝(直径0.1mm)***到所述MCA下面刚刚高于下面的皮质静脉。如Aronowski及其同事所述(Stroke，25：2235-2240，1994)，所述MCA通过抬高和压迫穿过所述铂金属丝(across the platinum wire)的血管来暂时闭合。同时，所述CCA用动脉瘤夹闭合。所述CCA和所述MCA的闭合持续时间是2小时。在这个时期结束时，将所述金属丝和所述瘤夹小心除去，使得所述血管再灌注，并缝合所述切口区。所述大鼠在返回到其原来的笼内之前将它放入一个分离笼内让其苏醒。手术后密切监视所述大鼠2-4小时，以保证其平静地从麻醉和手术中苏醒。大鼠在从麻醉中苏醒后，按照LAM指南的已建立的方案进行关养，直至需要进行实验分析。
(3)通过任一种合适的途径给予试验化合物：静脉内、皮下或腹膜内给药途径。给予化合物的剂量和时间基于体外测定结果或参考文献。
(4)使用两种结果测定来评价化合物的功效：(a)对诸如以下的几种CNS式样(paradigm)的行为表现：Morris水迷宫、自发运动活力(spontaneous motor activity)、放射状臂形迷宫和CNS的一般行为轮廓(general behavior profile)；和(b)脑皮质梗塞大小的组织学检查。局部缺血后24小时，以一种行为式样测试大鼠，然后使其安乐死，以便进行脑组织学检查。大鼠通过腹膜内注射戊巴比妥钠(100mg/kg，i.p)深度麻醉。根据缺乏角膜反射和尾夹痛，检查麻醉的深度。通过穿心灌注约50ml肝素化生理盐水使大鼠安乐死。灌注后，取脑，做成冷冻块并切成1mm的厚切片。将每个厚切片置于TTC(一种细胞活力染料)溶液中达15分钟。染色的厚切片用Nikon SMZ-U解剖显微镜目测检查，用ImagePro 2.1软件对受影响脑区的图象分析进行定量。梗塞体积以对侧半球的百分率表示。在治疗组之间进行统计学比较(单因素ANOVA)。
                          实施例8
                体内研究：脑缺血的一过性模型
在实验之前，将重250-300g的雄性Wistar大鼠(Iffa Crédo，France)以每笼2只，于12hr-12hr光暗周期(于7:00a.m.开灯，于7:00p.m.关灯)、21±2℃的室温和50±15％湿度下关养至少5天。在此期间，大鼠可自由得到市售的大鼠食物(Trouw Nutrition France，Vigny，France，ref.811002)和自来水。
用空气中5％氟烷诱导，然后在手术期间使用1-2％氟烷，使动物麻醉。用加热垫使大鼠体温保持在37℃。在颈部中心作一个2cm切口，在手术显微镜下暴露颈右总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。进一步解剖ICA，以辨别翼突腭动脉(PA)分支和颅内ICA分支。结扎CCA。在ECA起点系上3-0丝线并进行结扎。将导管(id＝0.58mm)通过小穿刺导入CCA中，并前进至ICA的颅内分支。将一个4-0尼龙手术缝线导入导管中。使长约19mm的尼龙线轻轻地从CCA前进至ICA腔中，直至缝线阻塞MCA起点。通过加热将缝线封在导管中，留下1cm导管伸出，因此可以抽出缝线以允许再灌注。用皮肤夹闭合切口。然后终止麻醉，将动物置于加热灯下直至从麻醉中苏醒。此后让大鼠清醒10-15分钟。局部缺血2小时后，通过抽出缝线直至尖端离开ICA腔，进行再灌注。在局部缺血开始后1小时，腹膜内(i.p.)给予溶媒或试验化合物。
闭塞开始后24小时，通过断头术处死大鼠。立即取脑，在异戊烷中冷冻，并贮存于-20℃。然后将脑在冷冻切片机上切成20μm厚的切片。每个第20个薄切片用来测量梗塞面积。切片用甲酚紫(cresyl violet)染色，用图象分析软件(Image，NIH)，在将切片图象数字化后，根据平面几何测定纹状体和皮质中的梗塞面积。结果以从额皮质至枕皮质的皮质和纹状体的体积(mm3)表示。数据通过方差分析(单因素ANOVA)，然后通过Dunnett氏t检验进行分析。
尽管以上说明书指出了本发明的原理，并且提供了实施例用于说明，但人们会理解，本发明的实施包括在以下权利要求书及其等同物范围内的所有通常的变化、改变和/或修改。
参考文献
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Claims (45)

1.一种药用组合物，所述药用组合物包含药学上可接受的载体和具有下式的化合物或其药学上可接受的盐
其中
(a)R1为H或在环的5位或6位连接的选自以下的取代基：烷基、链烯基、链炔基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、苯基、嘧啶基、取代的嘧啶基、吡啶基、取代的吡啶基、苯基链烯基、取代的苯基链烯基、苯并[b]噻吩-2-基、2-苯并呋喃基和取代的苯基，
所述取代的苯基具有下式
Figure A018166910002C2
其中(i)R6选自H、OH、卤素、烷基氨基、二烷基氨基、羟基取代的二烷基氨基、低级烷基、酸性低级烷基、烷氧基、卤取代的低级烷氧基、苯基和吗啉基，而(ii)R7代表1-4个取代基，所述取代基可以相同或不同，选自H、卤素、氨基、烷基、低级烷基、卤取代的低级烷基、烷基氨基、二烷基氨基、酸性低级烷氧基、烷氧基、卤取代的低级烷氧基、烷氧基和苯基烷氧基，条件是R6和R7可以稠合形成2-萘基或1，3，苯并间二氧杂环戊烯基；
(b)每个R2独立地为H或低级烷基；
(c)每个R3独立地选自H、低级烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基和低级烷氧基；
(d)R4为H、烷氧基或吗啉基，条件是R4可以与R3稠合形成2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯基或9-烷基9H咔唑基；且
(e)R5为H或低级烷基。
2.权利要求1的药用组合物，其中R1为位于环的5位的取代的苯基，而每个R2为H。
3.权利要求2的药用组合物，其中R4为吗啉基。
4.权利要求2的药用组合物，其中每个R3为低级烷氧基，而R4为低级烷氧基。
5.权利要求1的药用组合物，其中R1位于环的6位，每个R2为H。
6.权利要求5的药用组合物，其中每个R3和R4为低级烷氧基。
7.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为5-(3-乙氧基苯基)-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-吡啶胺。
8.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为N-[4-(4-吗啉基)苯基]-5-(2-萘基)-2-吡啶胺。
9.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为5-苯并[b]噻吩-2-基-N-[4-(4-吗啉基)苯基]-2-吡啶胺。
10.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为5-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-N-[4-(4-吗啉基)苯基]-2-吡啶胺。
11.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为5-[4-(4-吗啉基)苯基]-N-[4-(戊氧基)苯基]-2-吡啶胺。
12.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为5-[4-(二甲氨基)苯基]-N-[4-(戊氧基)苯基]-2-吡啶胺。
13.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为5-[4-(二甲氨基)苯基]-N-(4-甲氧基苯基)-2-吡啶胺。
14.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为5-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-[4-(戊氧基)苯基]-2-吡啶胺。
15.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为4-[6-[[4-(戊氧基)苯基]氨基]-3-吡啶基]-苯丙酸。
16.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为5-(2-甲氧基苯基)-N-[4-(戊氧基)苯基]-2-吡啶胺。
17.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为N-(2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯-6-基)-5-[(E)-2-苯基乙烯基]-2-吡啶胺。
18.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为N-[6-[3-(二甲氨基)苯基]-2-吡啶基]-9-乙基-9H-咔唑-3-胺。
19.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为6-(3-乙氧基苯基)-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-吡啶胺。
20.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为6-[3-(三氟甲氧基)苯基]-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-吡啶胺。
21.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为6-(1，3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基)-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-吡啶胺。
22.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为6-苯基-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-吡啶胺。
23.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为6-(3，4-二甲氧基苯基)-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-吡啶胺。
24.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为6-(3，4-二甲基苯基)-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-吡啶胺。
25.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为N-(4，5-二甲氧基-2-甲基苯基)-6-(3，4-二甲基苯基)-2-吡啶胺。
26.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为6-(2-萘基)-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-吡啶胺。
27.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为6-(2-苯氧基苯基)-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-吡啶胺。
28.权利要求1的药用组合物，其中所述化合物为6-[(E)-2-苯基乙烯基]-N-(3，4，5-三甲氧基苯基)-2-吡啶胺。
29.一种减少细胞群体中局部缺血性死亡的方法，所述方法包括使所述细胞群体中的细胞与预防有效量的权利要求1的化合物接触。
30.权利要求29的方法，其中所述细胞选自：神经元细胞、神经胶质细胞、心肌细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和成纤维细胞。
31.一种减少对创伤事件应答的神经元细胞死亡的方法，所述方法包括在所述创伤事件之前、期间或在所述创伤事件之后的适当时间内，使所述神经元细胞与预防有效量的权利要求1的化合物接触。
32.权利要求29的方法，其中所述接触在体外进行。
33.权利要求31的方法，其中所述接触在体外进行。
34.权利要求29的方法，其中所述接触离体进行。
35.权利要求31的方法，其中所述接触离体进行。
36.权利要求29的方法，其中所述接触在体内进行。
37.权利要求31的方法，其中所述接触在体内进行。
38.一种减少对创伤事件应答的神经元细胞死亡的方法，所述方法包括在所述创伤事件之前、期间或在所述创伤事件之后的适当时间内，给予所述受治疗者预防有效量的权利要求1的药用组合物。
39.权利要求38的方法，其中所述受治疗者是人类。
40.权利要求38的方法，其中所述创伤事件选自：疾病、物理创伤、化学创伤和生物学创伤。
41.权利要求38的方法，其中所述药用组合物在创伤事件之前给予。
42.权利要求38的方法，其中所述药用组合物在创伤事件期间给予。
43.权利要求38的方法，其中所述药用组合物在创伤事件之后给予。
44.一种用于给予受治疗者权利要求1的药用组合物的设备，所述设备包括一个容器和容器中的药用组合物，其中所述容器有一个用于给予所述受治疗者预防剂量的所述药用组合物的装置。
45.权利要求44的设备，其中所述用于给予所述药用组合物的装置是一个注射器。
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