CN1498273A - 取代乙酰苯的立体选择还原 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过微生物还原相应的含酮基化合物制备(S)-1-芳基乙醇的新型立体选择方法。在治疗阿尔茨海默病中可用的γ-分泌酶抑制剂化合物的合成中,(S)-1-芳基乙醇用作中间体。
Description
发明领域
本发明涉及通过微生物还原相应的含酮基化合物制备(S)-1-芳基乙醇的新型立体选择方法。本发明涉及通过相应酮的微生物还原制备手性醇的新型方法。
发明背景
Bing-nan Zhou等
J.Am.Chem.Soc.,Vol.105,5926-5928页,1983描述了L-肉碱的化学微生物合成,L-肉碱在人类的新陈代谢和长链脂肪酸的输送中起重要作用。特别地,该论文教导了通过面包酵母,即酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)将4-氯乙酰乙酸乙酯还原成(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯。
Kazutoshi Ushio等
Tetrahedron Letters,Vol.27,No.23,2657-2660页,1986披露了通过甲醇生长酵母还原β-酮酯。该论文教导了该反应引起所得产物中的过量对映体向D-异构体方向显著偏移。由于在这种培养基内生长的酵母的酶特征导致当采用在甲醇中生长的酵母进行反应时产生这一现象。
Markus Christen等
J.Chem.Soc.,Chem.Commun.,264-266页,1988披露了甲基-6-(对氯苯硫基)-3,4-二氢己酸酯的四种立体异构体的合成,其中通过合适的酵母还原引起手性的关键引入。其中述及尽管已深入研究了采用酵母还原β-酮酯,但仍难以预计产物的绝对构型或特别地难以可能实现对映体过量。
Antonio Trincone等
Biotechnology and Bioengineering,Vol.35,559-564页,1990描述了采用硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)的残余细胞不对称还原酮。它述及这一生物体的残余细胞的还原能力强烈地取决于细胞生长的阶段。
Ramesh Patel等
Enzyme Microb.Technol.,Vol.13,906-912页,1991描述了4,5-二氢-4-(4-甲氧基苯基)-6-(三氟甲基-1H-1)-苯并氮杂-2-酮的立体特异性微生物还原。特别地,它披露了通过立体选择还原母体酮制造关键的中间体(3R-顺)-1,3,4,5-四氢-3-羟基-4-(4-甲氧基苯基)-6-(三氟甲基)-2H-1-苯并氮杂-2-酮。它述及可能通过特定条件的选择从四种已知的可能异构体中获得单一的异构体。
Ramesh Patel等,
Enzyme Microb.Technol.,Vol.15,1014-1021页,1993描述了将二酮化合物3,5-二氧-6-(苄氧基)己酸甲酯立体选择还原成所得二羟基化合物的单一对映体。
Ramesh Patel等,Enzyme
Microb.Techno l.,Vol.14,731-738页,1992描述了热处理白地霉(Geotrichum candidum)的方法,从而改进由β-酮酯还原获得的羟基产物的光学纯度。
Kometani等,
Journal of Fermentation and Bioengineering,Vol.80,No.2,208-210页,1995教导了采用醇作为能源,酵母-介导的生物还原。检测在面包酵母中乙醇的消耗速率与前手性酮的还原速率之间的关系,并得出结论乙醇可用于由前手性酮大规模地生产手性醇。
1995年2月21日授予Ramesh Patel等的美国专利No.5391495披露了采用能催化还原的微生物或酶,立体选择还原某些含酮的氨磺酰化合物,形成相应的含羟基化合物。所使用的酶是氧化-还原酶或脱氢酶,微生物优选选自汉逊酵母属(Hansenula)、红球菌属(Rhodococcus)和诺卡氏菌属(Nocardia)。
发明概述
本发明涉及通过微生物还原相应的含酮基化合物制备(S)-1-芳基乙醇的新型立体选择方法。本发明涉及通过相应酮的微生物还原制备手性醇的新型方法,以便合成4-[2-((1R)-1-{[(4-氯苯基)磺酰基]-2,5-二氟苯胺基}乙基-5-氟苯基)丁酸等,它是一种治疗阿尔茨海默病的新型γ-分泌酶抑制剂。
因此本发明第一方面提供一种通过立体选择还原式(II)的化合物而制备式(I)的化合物的方法,
其中X和Y各自独立地选自H,Cl,Br,I和R1;
R1是取代或未取代的烷基、链烯基或(CH2)nCOR2;
n是1-10的整数;
R2是OH,OR3或NH2;并且
R3是取代或未取代的烷基、链烯基、C3-7环烷基或取代或未取代的芳基;
其中X和Y各自独立地选自H,Cl,Br,I和R1;
R1是取代或未取代的烷基、链烯基或(CH2)nCoR2;
n是1-10的整数;
R2是OH,OR3或NH2;并且
R3是取代或未取代的烷基、链烯基、C3-7环烷基或取代或未取代的芳基;
该立体选择还原是通过与能催化式(II)表示的酮的酶促还原的氧化还原酶反应而完成的。
本发明第二方面提供一种通过立体选择还原式(II)的化合物而制备式(I)的化合物的方法,
其中X和Y各自独立地选自H,Cl,Br,I和R1;
R1是取代或未取代的烷基、链烯基或(CH2)nCOR2;
n是1-10的整数;
R2是OH,OR3或NH2;并且
R3是取代或未取代的烷基、链烯基、C3-7环烷基或取代或未取代的芳基;
其中X和Y各自独立地选自H,Cl,Br,I和R1;
R1是取代或未取代的烷基、链烯基或(CH2)nCOR2;
n是1-10的整数;
R2是OH,OR3或NH2;并且
R3是取代或未取代的烷基、链烯基、C3-7环烷基或取代或未取代的芳基;
该立体选择还原是通过与供给能催化式(II)表示的酮的酶促还原的氧化还原酶的微生物反应而完成的。
下文提供本发明的其它方面和实施方案。
发明详述
根据本发明,通过与氧化还原酶或优选供给氧化还原酶的微生物反应,该氧化还原酶能催化式(II)表示的酮的酶促还原,进行以上式II表示的化合物的立体选择还原,形成式(I)表示的化合物。微生物细胞可以是完整的湿细胞或干细胞形式,如冻干、喷雾-干燥或加热-干燥的细胞,或者是处理过的细胞物质形式如破裂细胞或细胞的提取物。尽管已知大量和各种微生物供给某种形式的氧化还原酶,但根据本发明已发现仅仅选择的红球菌属、短杆菌属(Brevibacterium)、酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、地霉属(Geotrichum)、红酵母属(Rhodotorula)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属、诺卡氏菌属、Mucor Spingomonas、面包酵母的物种催化还原式II表示的化合物,形成式I的所需化合物,其数量和对映体产率高。这些物种是红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)ATCC 4277、红串红球菌DSM 6971和红球菌种(Rhodococcus sp.)ATCC21227、红串红球菌ATCC 27854、Candida sonorensis ATCC56511、Candida boidinii ATCC26175和ATCC56507、高里氏念珠菌(Candida guillieromondii)ATCC 9058、Candidautilis ATCC 9950、***滑假丝酵母(Candida parapsilosis)ATCC52820、白地霉(Geotrichum candidum)34614和ATCC 34014、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)ATCC 26207和ATCC201718、Hansenulafabianii ATCC 58045、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)ATCC58401、ATCC34438和ATCC26012、Hansenula saturnus ATCC 16762、鲑色诺卡氏菌(Nocardia salmonicolor)ATCC19149、Pichia anomalaATCC 66094、Pichia capsulata ATCC 29204、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)ATCC 56510、ATCC 56508和ATCC 58403、Pichia pinusATCC 28780、Pichia silvicola ATCC 16764、Pichia stipitis ATCC59785、少动鞘氨醇单胞菌(Spingomonas paucimobilis)ATCC 202027、酿酒酵母ATCC12341和ATCC44953、Nocardiodes albus ATCC 55425、鲁氏毛霉菌(Mucor rouxii)ATCC 24905、Mucor hiemalis ATCC 16636和短杆菌种(Brevibacterium sp.)ATCC19653。此处所使用的术语“ATCC”是指特定生物体的保藏号,即美国典型培养物保藏中心,12301Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852。术语“DSM”是指德意志微生物保藏中心,Branschweig,德国。也认为可使用基因工程生物。宿主细胞可以是任何细胞,例如大肠埃希氏菌(Eschericia coli),它被修饰成含有表达一种或更多种能具有此处所述催化作用的酶的基因。
此处所使用的下述术语具有以下给出的定义。术语“烷基”是指任选地取代的直链或支链饱和烃基,它具有1-10个碳原子,优选1-4个碳原子。
术语“链烯基”是指任选地取代的直链或支链不饱和烃基,它具有1-10个碳原子,优选1-4个碳原子。
术语“取代烷基”是指例如被1-4个取代基取代的烷基,所述取代基例如卤素、三氟甲基、三氟甲氧基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、氧、烷酰基、芳基、芳氧基、芳烷基、烷酰氧基、氨基、烷氨基、芳氨基、芳烷氨基、环烷氨基、杂环氨基和二取代氨基。
术语“取代链烯基”是指例如被1-4个取代基取代的链烯基,所述取代基例如卤素、三氟甲基、三氟甲氧基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、氧、烷酰基、芳基、芳氧基、芳烷基、烷酰氧基、氨基、烷氨基、芳氨基、芳烷氨基、环烷氨基、杂环氨基和二取代氨基。
术语“芳基”是指在环部分具有6-12个碳原子的单环或双环芳烃基,例如苯基、萘基、联苯基和二苯基,它们中的每一种可被取代。
术语“取代芳基”是指例如被1-4个取代基取代的芳基,所述取代基例如烷基、取代烷基、卤素、三氟甲基、三氟甲氧基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、烷酰基、烷酰氧基、氨基、烷氨基、二烷基氨基、芳烷氨基、环烷氨基、杂环氨基、烷酰基氨基、硫醇、烷硫基、环烷基硫基、杂环硫基、脲基、硝基、氰基、羧基、羧烷基、氨基甲酰基、烷氧基羰基、烷基硫羰基、芳基硫羰基、烷磺基、磺基酰氨基、芳氧基等。该取代基可进一步被一个或更多个选自卤素、氰基、烷基、烷氧基、芳基、取代烷基、取代芳基和芳烷基的基团取代。
关于使用微生物,可在所使用的微生物的发酵之后,即以两步发酵和还原的方式,或同时,即以一步或原位发酵和还原的方式进行本发明的酶还原方法。在后者中,微生物可在合适的培养基中生长,特别地含有氮和碳源的培养基中生长,直到实现充分的生长,然后向其中加入选自式II表示的那些化合物中的化合物。之后持续酶还原,直到实现式II的化合物的基本上完全转化。
在两步法中,最初在如上所述的合适培养基中生长微生物,直到它显示出预定水平的酶活性,此时通过常规的分离技术收集细胞,并由其制备含合适缓冲剂等的微生物细胞悬浮液。合适的缓冲剂包括磷酸盐缓冲液,特别是磷酸钠或磷酸钾缓冲液、Tris-HCl、乙酸钠等。可使用水制备微生物细胞悬浮液。然后向其中加入式II表示的化合物,并持续酶还原直到基本上完全转化。在任一情况下,合适的生长培养基包括如前所述的氮和碳源以及痕量元素。同样可包括诱导剂。本领域的技术人员公知术语诱导剂是指引发或提高细胞内所需酶活性,即氧化还原酶活性的任何化合物,以生产所需产物。认为式II表示的化合物是一种诱导剂,特别地当在微生物的生长过程中小量添加时。
合适的培养基用碳源可包括糖如麦芽糖、乳糖、葡萄糖、果糖、甘油、山梨醇、蔗糖、淀粉、甘露糖醇、丙二醇等、有机酸及其盐如乙酸钠、柠檬酸钠等、氨基酸及其盐如谷氨酸钠等、和醇如乙醇、丙醇等。合适的氮源可包括N-Z胺A、玉米浸渍液、大豆粉、牛肉提取物、酵母提取物、糖蜜、面包酵母、胰胨、nutrisoy、胨、yeastamin、硝酸钠、硫酸铵等。合适的痕量元素可包括磷酸盐和镁、锰、钙、钴、镍、铁、钠和钾的盐。本发明所使用的合适培养基可包括选自任何这些这类中的多种成分。代表性优选培养基在没有打算限制的情况下包括以重量百分数计含下述的含水培养基:
成分 重量百分数
No.1 麦芽提取物 1%
PH7.0 酵母提取物 1%
胨 1%
葡萄糖 2%
No.2 麦芽提取物 1%
PH7.0 酵母提取物 1%
胨 0.3%
甘油 4%
No.3 麦芽提取物 1%
PH7.0 酵母提取物 1%
胨 0.3%
葡萄糖 2%
No.4 麦芽提取物 1%
PH7.0 酵母提取物 1%
胨 0.3%
琥珀酸钠 2%
No.5 Nzamine A 1.0%
PH7.0 Yeastamin 2.0%
甘油 2.0%
Na2HPO4 0.6%
KH2PO4 0.3%
(NH4)2SO4 0.125%
MgSO4*7H2O 0.0246%
在高压灭菌No.5培养基之后,添加过滤的新霉素(在水中)和氯霉素(在200标准乙醇)的无菌溶液,使最终浓度分别为10mg/l和33mg/l。
在灭菌之前,优选调节pH到约6-8,最优选约pH6.8。然后例如通过在约121℃下加热30分钟使培养基灭菌。紧跟在灭菌之后,调节培养基的pH至6.5-7.5,最优选约pH7.0。在微生物生长和还原过程中,维持pH在约4.0至9.0,优选约pH6.0至8.0。可方便地使用以上所述的成分当中的合适的碱或酸性盐调节pH。
反应混合物的温度是还原过程可得到热能的量度,为此应当维持合适的温度,以确保过程进行完全可得到的充足能量。本发明的方法的合适温度范围在约5℃-约60℃,优选约25℃-约40℃。对于本发明方法的实践来说已知压力不是关键,和为了方便起见,典型地维持接近大气压力。
优选在有氧条件下进行本发明的方法。反应混合物的搅拌和充气对于本发明方法也是有利的,因为它影响生物转化可得到的氧气量。在如上所述的一步或两步法中,在微生物的生长过程中,有利地例如在摇瓶培养物或发酵器罐中进行该方法。优选在约10-1000RPM搅拌,其中最优选约50-500RPM。优选约0.1-10体积充气/体积培养基/分钟(v/Vt.)的充气,特别优选约5体积充气/体积培养基/分钟(v/Vt.)的充气。
式II表示的化合物的完全转化可要求例如约1-72小时,典型地约4-48小时,这是从式II表示的化合物添加到培养基中时开始测量的。优选培养基是水基培养基,但同样可使用有机液体或混溶或互不混溶,即两相的有机/含水液体混合物。
可通过添加辅因子如还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或烟酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸(NADPH),进行本发明的立体选择酶促还原方法,特别当使用分离酶时。然后例如再生并重新使用NADH或NADPH。可使用原位再生NADH或NADPH的进一步的酶,例如甲酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶或葡萄糖脱氢酶。合适的氢供体包括分子氢、甲酸盐(例如甲酸的碱金属或铵盐)、葡萄糖、次磷酸盐或在Viologen,例如甲基Viologen存在下的电化学还原。也可能在没有进一步的酶的情况下,使用例如乙醇或甲酸盐再生NADH或NADPH。
进一步优选将式II的化合物加入到反应培养基中,以便基于起始化合物和培养基的组合重量,式II的化合物占约0.2%-约5wt%。相对于起始材料用量,微生物的接种物足以提供以上数次所述的式II表示的化合物的酶促还原,它通常为约5wt%-约30wt%的细胞浓度。采用给定的微生物,使用如上所述的优选反应参数将提供大于70%,最佳地超过90%的反应产率,和式I表示的化合物的所需对映体的大于93%,最佳地超过99%的对映体过量。可通过分离和/或纯化方法中的任何合适方法如提取、树脂吸附/解吸、蒸馏、结晶、柱色谱等,回收本发明还原方法的产物,即式I表示的化合物。
应当理解本发明实践中的各种其它实施方案和改进对本领域的技术人员来说是显而易见的且可容易作出,而没有脱离如上所述的本发明的精神和范围。因此,不打算将所附的权利要求的范围限制到以上所述的确切描述,而权利要求应当解释为包括本发明具有的可授予专利的新颖性方面的所有特征,其中包括相关领域的那些技术人员认为等同的所有特征和实施方案。参考下述实验工作进一步描述本发明。
实施例1
2-溴-4-氟乙酰苯(III)的立体选择酶还原:使用整细胞-两步法
在500ml烧瓶内,将各种微生物培养物(1ml)接种到100ml的培养基1内,并在摇动器上,在28℃和200RPM下温育48小时。通过离心收集细胞并使细胞悬浮在10ml 100mM的pH7.0磷酸钾缓冲液中,将葡萄糖加入到细胞悬浮液内,其浓度为25mg/ml,并向其中加入15mg 2-溴-4-氟乙酰苯(底物,见式III)。
在摇动器上,在28℃和200RPM下进行生物转化(还原)24-48小时。在预定的时间处,用4体积的乙腈猝灭反应混合物,在旋涡混合器上混合,通过0.2微米的滤膜过滤并收集,和通过HPLC方法1分析1ml样品,确定底物和产物浓度。在氮气流下蒸发干残留溶液,并用1ml乙醇溶解残渣、根据并通过HPLC方法2分析,确定产物的对映体过量。下表1概述了结果。该实施例的产物如式IV所示。
方法1
开发该方法监测式(III)表示的酮还原成式(IV)表示的醇。
柱子:获自Phenomenex的Phenylhexyl(0.46×15cm,5μ)
流动相:乙腈∶水(1∶1)
流速:1ml/min
柱温:50℃
检测器:在210nm处的UV
注射体积:5μl
在约6.3分钟处洗脱出2-溴-4-氟乙酰苯(III),在约5.4分钟处洗脱出S-1-(2’-溴-4-氟苯基)-乙醇(IV)或其对映体。
方法2
开发该方法监测式(IV)表示的醇的对映体纯度。
柱子:Chiralpak AD(0.46×25cm,10μm,Daicel ChemicalIndustries Ltd.)
流动相:0.249%V/V在己烷中的无水乙醇
流速:1ml/min
柱温:室温
检测器:在210nm处的UV
注射体积:2和5μl
在约48(R)和54(S)分钟处洗脱出((R/S)S-1-(2-溴-4-氟苯基)-乙醇)的对映体。在约15分钟处洗脱出底物2-溴-4-氟乙酰苯。
表1:2-溴-4-氟乙酰苯微生物还原成所需的相应手性醇
微生物 | ATCC | 醇 | EES-醇 |
% | % | ||
对照 | 0% | ||
Candida sonorensis | 56511 | 100% | 99.2 |
Candida boidini | 26175 | 100% | 97.4 |
吉利蒙假丝酵母(Candidaguilliermondii) | 9058 | 100% | 99.0 |
Candida utilis | 9950 | 99% | 99.6 |
Candida maltosa | 20184 | 81% | 98.6 |
Candida kefir | 14244 | 86% | 96.8 |
***滑假丝酵母 | 52820 | 98% | 97.6 |
白地霉 | 34614 | 98% | 97.9 |
白地霉 | 34014 | 100% | 99.4 |
粘红酵母 | 26207 | 100% | 99.0 |
粘红酵母 | 201718 | 100% | 99.9 |
Hansenula fabianii | 58045 | 94% | 99.0 |
多形汉逊酵母 | 34438 | 100% | 99.8 |
多形汉逊酵母 | 58401 | 100% | 99.0 |
多形汉逊酵母 | 26012 | 100% | 99.0 |
Hansenula saturnus | 16762 | 100% | 99.0 |
鲑色诺卡氏菌 | 19149 | 100% | 99.3 |
Pichia anomala | 66094 | 100% | 99.0 |
Pichia capsulata | 29204 | 100% | 99.0 |
Pichia membranafaciens | 20101 | 95% | 99.0 |
甲醇毕赤酵母 | 56510 | 100% | 99.0 |
Pichia pinus | 28780 | 100% | 99.0 |
Pichia silvicola | 16764 | 99% | 99.0 |
Pichia stipitis | 5978 | 100% | 99.0 |
少动鞘氨醇单胞菌 | 202027 | 100% | 99.0 |
酿酒酵母 | 12341 | 93% | 99.9 |
酿酒酵母 | 44953 | 72% | 99.3 |
活性干酵母,Red Star | 78% | 99.9 | |
实施例2
使用面包酵母
这一实施例的底物(式III)和产物(式IV)如实施例1所示。
工艺细节
将3L生物反应器(Braun Biostat B)配备pH电极。设定500RPM的叶轮搅拌速度和设定28℃的温度。将800ml 10mM的磷酸盐缓冲液(pH7.0)加入到生物反应器中。在整个实验中,以300-500RPM搅拌生物反应器的内容物并维持28℃的温度。开启泵控制10%的氢氧化钠溶液的自动添加,以保持pH恒定在6.0。在30分钟内缓慢加入150g活性干酵母(获自Red Star)。添加5g 2-溴-4-氟乙酰苯。使用最小体积的去离子水(5ml)洗涤反应器中任何残留的酮。视需要,添加0.5ml SAG消泡剂以控制泡沫。为了控制泡沫,可视需要现在或随后添加额外的0.5ml SAG消泡剂。以8-10ml/小时的速率开始添加25%的葡萄糖溶液。在20-24小时内添加全部葡萄糖溶液(200ml)。在4、8、12、20、22、24小时处,和视需要在2小时的间隔处取出1ml样品。根据实施例1所讨论的分析,确定底物和产物浓度以及产物的对映体过量。20-28小时的反应时间通常足以完成反应。在该方法中,产物的反应产率为90%,所需异构体的对映体过量为99.5%。
实施例3
将式(V)表示的酮甲酯还原成式(VI)表示的相应的醇
在500ml烧瓶内,将各种微生物培养物(1ml)接种到100ml如上所述的培养基1或培养基3内,并在摇动器上,在28℃和200RPM下温育48小时。通过离心收集细胞并使细胞悬浮在10ml 100mM的pH7.0磷酸钾缓冲液中,将葡萄糖加入到细胞悬浮液内,其浓度为25mg/ml,并向其中加入10mg酮甲酯(见式V表示的底物)。
在摇动器上,在28℃和200RPM下进行生物转化(还原)24-48小时。用2体积乙酸乙酯提取反应混合物,并在氮气流下蒸发至干。将部分乙酸乙酯提取物溶解在乙腈中,并通过HPLC方法3分析,确定底物和产物浓度。将另一部分溶解在己烷∶异丙醇(1∶1)的混合物中,并通过HPLC方法4分析,确定产物的对映体过量。
下表2概述了结果。该实施例的产物如式VI所示。
方法3:
柱子:Kromasil C-8(0.46×15cm,5微米,Waters)
流动相:从100%的溶剂A(0.2%H3PO4)和0%溶剂B(乙腈∶0.2%H3PO490∶10)到20分钟处70%溶剂B,然后到25分钟处100%的溶剂B并以100%的溶剂B持续到30分钟的梯度洗脱。
流速:1ml/min,检测:在210nm处的UV
保留时间:酮甲酯(V)20.3分钟和羟基甲酯(VI)18分钟。
方法4:
柱子:Chiral pak AD(0.46×15cm,10μm,Daicel)
流动相:己烷∶乙醇∶异丙醇(98.32∶1.43∶0.25)
流速:1ml/min,检测:在210nm处的UV
(R/S)羟基甲酯的对映体在约23.6(R)和31.1(S)分钟处洗脱出。
表2:酮甲酯(式(V))微生物还原成相应的(S)-羟基甲酯(式(VI)):
微生物 ATCC# 羟基酯 S-羟基甲
(产率) 酯的EE
甲醇毕赤酵母 58403 40% >99%
甲醇毕赤酵母 56510 41% 99%
甲醇毕赤酵母 56508 33% >96%
白地霉 34614 6% >99%
Mortierella 34194 5% ND
ramanniana
Apiotrichum humicola 2669 3% ND
Candida boidinii 56507 11% >99%
Nocardiodes albus 55425 4% ND
Nocardiodes luteus 55426 1% ND
Streptomyces rimosus 10970 4% ND
ND=未确定
实施例4
将酮乙酯(VII)还原成相应的醇(VIII)
在500ml烧瓶内,将各种微生物培养物(1ml)接种到100ml如上所述的培养基1或培养基3内,并在摇动器上,在28℃和200RPM下温育48小时。通过离心收集细胞并使细胞悬浮在10ml 100mM的pH7.0磷酸钾缓冲液中,将葡萄糖加入到细胞悬浮液内,其浓度为25mg/ml,并向其中加入10mg酮乙酯(底物,见式VII)。
在摇动器上,在28℃和200RPM下进行生物转化(还原)。用2体积乙酸乙酯提取反应混合物,并在氮气流下蒸发至干。将部分乙酸乙酯提取物溶解在乙腈中,并通过HPLC方法5分析,确定底物和产物浓度。将另一部分溶解在己烷∶异丙醇(1∶1)的混合物中,并通过HPLC方法6分析,确定产物的对映体过量。下表3概述了结果。该实施例的产物如式VIII所示。
方法5:
柱子:Phenylhexyl(0.46×15cm,5微米,Phenomenex)
流动相:乙腈∶水(1∶1)
流速:1ml/min,检测:在210nm处的UV
保留时间:酮乙酯(VII)12.4分钟,羟基乙酯(VIII)8.9分钟。
方法6:
柱子:Chiral pak AD(0.46×15cm,10μm,Daicel)
流动相:己烷∶乙醇∶异丙醇(96.9∶2.85∶0.25)
流速:1ml/min,检测:在210nm处的UV
(R/S)羟基乙酯的对映体在约15(R)和19(S)分钟处洗脱出。
表3:酮乙酯微生物还原成相应的(S)-羟基乙酯:
名称 ATCC# 羟基乙酯 S-羟基乙
酯的EE
甲醇毕赤酵母 56508 18% 93.0%
甲醇毕赤酵母 58403 51% >99.9%
白地霉 34614 33% 98.5%
实施例5
将酮叔丁酯(IX)还原成相应的醇(X)
在500ml烧瓶内,将各种微生物培养物(1ml)接种到100ml如上所述的培养基1或培养基3内,并在摇动器上,在28℃和200RPM下温育48小时。通过离心收集细胞并使细胞悬浮在10ml 100mM的pH7.0磷酸钾缓冲液中,将葡萄糖加入到细胞悬浮液内,其浓度为25mg/ml,并向其中加入10mg酮叔丁酯(底物,见式IX)。
在摇动器上,在28℃和200RPM下进行生物转化(还原)。用2体积乙酸乙酯提取反应混合物,并在氮气流下蒸发至干。将部分乙酸乙酯提取物溶解在乙腈中,并通过以上实施例4中所述的HPLC方法5分析,确定底物和产物浓度。保留时间为酮叔丁酯(IX)28.3分钟和羟基叔丁酯(X)19.2分钟。
将另一部分溶解在己烷∶异丙醇(1∶1)的混合物中,并通过HPLC方法7分析,确定产物的对映体过量。
方法7:
柱子:Chiral pak AD(0.46×15cm,10μm,Daicel)
流动相:己烷∶异丙醇(90∶10)
流速:1ml/min,检测:在210nm处的UV
(R/S)羟基叔丁酯的对映体在约23.6(R)和32.8(S)分钟处洗脱出。
下表4概述了结果。该实施例的产物如式(X)所示。
表4:酮叔丁酯微生物还原成相应的(S)-羟基叔丁酯:
名称 ATCC# 羟基叔丁酯 (S)-叔丁酯羟基酯
的EE
鲁氏毛霉菌 24905 9% >99%
Mucor hiemalis 16636 22% 93%
甲醇毕赤酵母 58403 4% 92.6%
实施例6
由纯化的酮-还原酶还原酮甲酯
酮-还原酶的纯化
在细胞破坏之前,用10%甘油、1mM的DTT、0.5mM的PMSF和10mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)均化甲醇毕赤酵母ATCC 58403的20%的细胞悬浮液。通过使细胞悬浮液数次流过微型流化床破坏细胞。在18000rpm下离心破坏的细胞悬浮液至少20分钟,除去细胞碎片。滗析不含细胞的提取物并用于蛋白质纯化。在4℃下进行所有的纯化步骤。使用三种不同条件进行纯化,用于从Hi-Trap Blue-Sepharose亲和柱中洗脱酶。将蛋白质装载到用缓冲液A(10%甘油、2mM的DTT和10mM的磷酸钾缓冲液pH6.5)平衡的亲和柱上。通过三种方法从亲和柱中洗脱蛋白质:(1)pH梯度(在pH6.5处装载并在pH8.5处洗脱),(2)在缓冲液A中的NaCl梯度(0-0.8M)和(3)在缓冲液A中的NADP梯度(0.1-0.5mM)。
酶纯化流程不含细胞的提取物↓HiTap B1ue亲和柱↓用含NaCl梯度(0-0.8M)的10mM的磷酸钾pH6.5、2mM的DTT和10%的甘油洗脱或用10mM的磷酸钾pH6.5-8.5、2mM的DTT和10%的甘油洗脱HiTap Blue亲和柱↓用含NADP梯度(0.1-0.5mM)的10mM的磷酸钾pH6.5洗脱纯化的酮还原酶 |
纯化酶至均匀。测定醇化酶的分子量为约40Kd。该酶是NADPH-依赖性蛋白质。测定蛋白质的N-端和内部肽序列,它们有助于克隆和过量表达。
N-端序列NH2-x-x-Tyr-Arg-Leu-Val-Arg-Arg-Gln-Arg-Ser-Ala-Asp-Glu-Gln-COOH |
备注:x=没有确认的氨基酸。
内部肽序列肽1:NH2-Lys-Val-Phe-Phe-Pro-Ala-Pro-Glu-Glu-Tyr-Glu-x-Phe-Val-Val(Leu)-Phe-Asn-x-x-Phe-Pro-COOH肽2:N2-Lys-Val-Pro-Gln-Glu-Leu-Tyr-Thr-Asn-Leu-Gly-Ser-Ser-Gly-Leu-Gln-Ile-Ser-Lys-COOH肽3:N2-Lys-Val-Asp-Asp-Ala-Leu-Asp-Gly-COOH |
测试纯化酶将酮甲酯(底物V)还原成相应的(S)-羟基甲酯(产物VI)。5ml磷酸钾缓冲液(pH7.0)的反应混合物含有3单位的纯化酮还原酶、5mg底物V、0.1mM的NADP、25mg葡萄糖和15单位的葡萄糖脱氢酶(再生NADPH)。如实施例3所述进行反应。如实施例3所述测量底物V和产物VI浓度以及产物的对映体过量。获得90%的反应产率和99.9%的对映体过量。
实施例7
从甲醇毕赤酵母中分离编码酮还原酶的基因
A.由甲醇毕赤酵母制备染色体DNA
使甲醇毕赤酵母ATCC 13825的储存培养物在F7培养基(10.0g麦芽提取物、10.0g酵母提取物、1.0g胨、20.0g右旋糖[pH7.0]/升)中生长,并在液氮下储存于1ml等分试样的小瓶内。在室温下解冻小瓶并接种到250ml烧瓶内的20ml YPD培养基中。每升YPD由10.0g酵母提取物、20.0g胨和20.0g右旋糖组成。在30℃下,以250rpm的摇动温育烧瓶20小时。如制备甲醇毕赤酵母DNA中所述(Ausubel等,CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,NewYork,1990),使用快速分离酿酒酵母染色体DNA用的方法。用70%乙醇洗涤沉淀的DNA、空气干燥,并在TE缓冲液(0.01M的Tris-HCl,0.001M的EDTA,pH8.0)中再次悬浮成1.0mg/ml的最终浓度,这可通过在260nm处的分光光度分析来测量。
B.甲醇毕赤酵母的部分Sau3Al文库的构建
在37℃下,在0.25ml由25μm DNA、5单位酶(Promega,Madison,WI)、0.006M的Tris-HCl、0.006M的MgCl2、0.10M的NaCl和0.001M的二硫苏糖醇(pH7.5)组成的反应体积中,采用限制内切核酸酶Sau3Al部***解如1A.部分所述制备的甲醇毕赤酵母染色体DNA 5分钟。用等体积的1∶1苯酚∶氯仿提取反应混合物1次。离心之后,保留上层水相,向其中加入0.1体积的3M乙酸钠和0.6体积的异丙醇。在microfuge中,以16000x g离心分钟,使DNA沉淀,并用0.5mL 70%乙醇洗涤1次。在SpeedVac(Savant Instruments,Farmingdale,NY)中干燥5分钟之后,将沉淀物再次悬浮在0.06ml的TE缓冲液中。在15v下,在含0.5μg/ml溴化乙锭的TAE缓冲液(0.04M的Trizma碱、0.02M的乙酸和0.001M的EDTA,pH8.3)中,通过0.8%的琼脂糖凝胶电泳DNA 20小时。通过与1Kb的DNA序列梯进行比较(Life Technologies,Gaithersburg,MD),鉴定含约5-10Kb的DNA片段区域并从凝胶中切除。使用QIAquick凝胶纯化试剂盒(Qiagen Inc.,Valencia,CA),按照推荐的程序提取DNA。在15v下,在0.8%的TAE琼脂糖凝胶上电泳等分试样20小时,以证明获得所需的片段大小范围并通过与DNA质量(Life Technologies)序列梯进行比较,确定片段浓度。
在0.05μl由2μgDNA、0.006M的Tris-HCl、0.006M的MgCl2,0.1M的NaCl和0.001M的DTT(pH7.5)组成的反应体积内,用
BamHI(Promega)消化质粒pZerol(Invitrogen,Carlsbad,CA)。加入10单位的限制内切核酸酶,并在37℃下温育混合物20分钟。通过添加等体积的1∶1苯酚∶氯仿终止反应。在13000xg下离心5分钟之后,除去上层(含水)相并放置在新鲜的microfuge管内。将5μl3M的乙酸钠(pH7.5)和110μl冰冷的100%乙醇(Shelton Scientific,Shelton,CT)与水相混合,并在13000xg下沉淀DNA 10分钟。通过吸气除去任何液体,并用70%的冰冷乙醇洗涤沉淀物1次。吸去乙醇,在SpeedVac中干燥沉淀物5分钟。消化的质粒DNA再次悬浮在无菌蒸馏水中,得到0.01mg/ml的最终浓度。
在由0.1μg染色体DNA、0.03μg质粒DNA、0.03M的Tris-HCl(pH7.8)、0.01M的MgCl2、0.01M的二硫苏糖醇和0.0005M的腺苷-5’-三磷酸和3Weiss单位的T4 DNA连接酶(Promega)组成的0.02ml反应体积中,将富集的甲醇毕赤酵母的DNA片段(5-10Kb)连接到BamHI-裂解的pZero2上。在16℃下进行反应18小时。浓缩DNA,并用15μl无菌蒸馏水和250μl 1-丁醇提取以除去盐。以13000xg离心混合物10分钟,并吸去所有液体。在SpeedVac中干燥沉淀物5分钟,并再次悬浮在5μl无菌蒸馏水中。根据销售商的建议,将连接的DNA转化到电感受态DHl0B细胞(Life technologies)内。在转化之后,添加0.96ml LB培养基,并在37℃下使细胞生长1小时。将137mm的Hybond-N+环(Amersham-Pharmacia,Piscataway,NJ)放置在含75ml LB-琼脂+卡那霉素的150mm培养皿上。将足以得到5000菌落形成单位的等分的部分Sau3A1文库稀释到1ml LB培养基内,并在滤膜上均匀铺开。在37℃下温育平板24小时。菌落在两个新鲜的滤膜上复制并在37℃下温育6小时,而该滤膜放置在LB+卡那霉素的琼脂培养基上。根据滤膜所提供的指示,进行细胞的裂解和所释放的DNA的中和。使用UV Stratalinker2400单位(Stratagene,Inc.,La Jolla,CA),以“自动交联”模式,使DNA交联到滤膜上。通过将滤膜放置在含3×SSC(20×SSC每升含有173.5gNaCl、88.2g柠檬酸钠,使用10N氢氧化钠调节pH到7.0)、0.1%SDS的容器内,并用湿的Kimwipe擦拭裂解的菌落,除去细胞碎片。然后在65℃下,温育滤膜至少3小时,使用相同的洗涤溶液至少3小时。
C.含酮还原酶基因的菌落的选择
制备基于纯化甲醇毕赤酵母酮还原酶的部分氨基酸序列的混合寡糖核酸引物(参见图1)。在聚合酶链反应(PCR)中采用有义和反义引物的所有可能组合。反应由0.05M的Tris-HCl(pH8.3)、250μg/ml牛血清白蛋白、2%(w/v)蔗糖、0.1mM甲酚红、0.2mM每种dATP、dCTP、dGTP、dTTP、4mM的MgCl2、0.0005mM的每种引物、0.25μl(0.625U)的TakaraZ-Taq DNA聚合酶(PanVera,Madison,WI)和0.1μg的甲醇毕赤酵母染色体DNA组成,其总体积为0.05ml。在下述条件下,在Perkin-Elmer 480型号的热循环仪中进行扩增:在94℃下变性4分钟,接着94℃1分钟、50℃1分钟、72℃1.5分钟,和在72℃下最后延伸5分钟,共30次循环。在各反应的样品在1.0%的TAE琼脂糖凝胶上电泳之后,使用寡核苷酸对183+186和185+188,分别观察到650-和850-bp片段的强烈扩增。
从琼脂糖凝胶中分离片段,并使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。根据制造商的程序,将DNA连接到载体pCR2.1(Invitrogen,Carlsbad,CA)上,并通过电穿孔转化到大肠埃希氏菌DHl0B内。在含50μg/ml的卡那霉素和Bluo-gal(Life technologies;75μl在二甲基甲酰胺中的2%[w/v]溶液)的LB琼脂培养基上铺展细胞,并在37℃下温育20小时。从每次连接/转化中随机选择的5个白色菌落接种到LB+卡那霉素液体培养基中,并在37℃、250rpm下生长20小时。使用QIAprepSpin Miniplasmid试剂盒(Qiagen),由各样品制备质粒DNA。通过PCR,使用如上所述的条件,证明存在预期的***。使用ALFexpress AutoRead试剂盒(Amersham-Phamacia)测序一种代表性的质粒,并在ALFexpress自动DNA测序装置上分析。在这两种情况下,还发现由纯化酶获得的但不用于合成寡核苷酸的部分氨基酸序列在PCR片段内被编码。
基于这些结果,根据制造商的说明,使用如上所述的两套引物和PCRDIG探针合成试剂盒(Roche Biochemicals,Indianapolis,IN)制备洋地黄毒苷标记的试样。如上所述的约10ng分离的PCR片段引入作为模板DNA。扩增条件是:在94℃下变性4分钟,接着30次循环94℃1分钟、50℃1分钟、72℃1分钟。在1.0%的TAE琼脂糖凝胶上,使5μl的反应等分试样与未标记的片段一起进行电泳。通过标记片段分子量的显著增加可证明洋地黄毒苷-dUTP核苷酸的掺入。使用寡核苷酸183+186获得优异的掺入。
在滚瓶内,用10ml DIG EasyHyb溶液(Roche)和5μl变性、标记的PCR片段温育含获自
甲醇毕赤酵母Sau3A1文库的裂解且变性DNA的双份滤膜。在42℃下杂交18小时。用2XSSC(由20X溶液制备;20XSSC每升含有173.5gNaCl、88.2g柠檬酸钠,用10N氢氧化钠调节pH到7.0)、0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)在室温下经5分钟洗涤滤膜2次,然后在68℃下用0.5%SSC、0.1%SDS经15分钟洗涤2次。使用DIG标记和检测试剂盒试剂和程序(Roche),进行抗-洋地黄毒苷抗体的结合、洗涤和检测。将膜放置在Whatman 3MM纸上,除去过量液体,用Saran Wrap覆盖,并暴露于放射自显影膜(Kodak X-OMAT LS)下。从主滤膜中挑选单杂交菌落,在LB+卡那霉素琼脂培养基上划线,并在37℃下温育24小时。菌落是使用QIAfilter Plasmid Midi试剂盒(Qiagen)分离质粒用的生长的LB+卡那霉素液体培养基。限制酶切作图表明约5.0kb的***片段存在于重组质粒中。使用寡核苷酸183+186和185+188,测试分离的DNA支持扩增的能力,这已得到证明。使用基于分离的PCR片段的DNA序列的寡核苷酸引物,分析在pKR5.0内的***片段。发现1059的开放读框,它编码分子量为39800道尔顿的353个氨基酸的蛋白质(图1)。这与分离的酮还原酶的大小几乎一致(通过凝胶过滤测定为40000道尔顿)。
实施例8
在大肠埃希氏菌(Escherichia coli)中甲醇毕赤酵母酮还原酶基因的亚克隆和表达
使用聚合酶链反应扩增含限制位点的完整酮还原酶基因,该基因适于克隆到表达载体pBMS2000内。以下给出了所使用的引物:
BspHI
a)5’TGCT
CATGAATTGGGAAAAAGTTCCACAAG3’
(粗体的核苷酸表明限制酶BspHI的识别序列;加下划线的核苷酸表明酮还原酶基因的起始Met密码子)
BamHl
b)5’CTCGGATCC
TTATAAAATTACAGAATATAAG3’
(粗体的核苷酸表明限制酶
BamHI的识别序列;加下划线的核苷酸表明在酮还原酶基因的3′端的终止密码子)
PCR条件与1.C部分中给出的那些相同,所不同的是使用pKR5.0DNA作为模板和反应的大小增加到200μl(所有组分的体积成比例地增加)。在1.0%的TAE琼脂糖凝胶上使反应的等分试样电泳,证明预期分子量条带的存在(1077bp)。用1∶1苯酚∶氯仿提取其余反应混合物1次,并以13000x g离心5分钟之后保留水相。通过添加20μl 3M的乙酸钠(pH7.5)和440μl 100%的冰冷乙醇沉淀DNA。在以13000xg离心10分钟之后,吸去液体,并用70%乙醇洗涤沉淀物。吸走乙醇,并在SpeedVac中干燥DNA5分钟。沉淀物在由0.006M的Tris-HCl、0.006M的MgCl2、0.1M的NaCl和0.001M的DTT(pH7.5)组成的0.05ml反应体积内消化之前,再次将它悬浮在0.043ml的无菌蒸馏水中。添加10单位(1μl)的各种限制内切核酸酶,并在37℃下温育混合物1.5小时。通过添加等体积的1∶1苯酚∶氯仿,终止反应。以13000xg离心5分钟之后,除去上层(含水)相并放置在新的microfuge管内。将5μl 3M的乙酸钠(pH7.5)和110μl冰冷的100%乙醇(Shelton Scientific,Shelton,CT)与水相混合,并在13000xg下沉淀DNA10分钟。吸去任何液体,并用70%的冰冷乙醇洗涤沉淀物1次。吸去乙醇和在SpeedVac中干燥沉淀物5分钟。消化的质粒DNA再次悬浮在无菌蒸馏水中,得到0.01mg/ml的最终浓度。
在由0.1μg质粒、0.03μg PCR片段、0.03M的Tris-HCl(pH7.8)、0.01M的MgCl2、0.01M的二硫苏糖醇和0.0005M的腺苷-5’-三磷酸和3Weiss单位的T4 DNA连接酶(Promega)组成的0.02ml反应体积中,将BspHI/
BamHI消化的PCR片段连接到BspHI/
BamHI裂解的Pbms2000上。在16℃下进行反应18小时。浓缩DNA,并用15μl无菌蒸馏水和250μl 1-丁醇提取以除去盐。以13000xg离心混合物10分钟,并吸去所有液体。在SpeedVac中干燥沉淀物5分钟,并再次悬浮在5μl无菌蒸馏水中。根据销售商的建议,将连接的DNA转化到电感受态DH10B细胞(Lifetechnologies)内。在转化之后,添加0.96ml LB培养基,并在37℃下使细胞生长1小时。在含10μg/ml硫酸新霉素(Sigma)的LB琼脂培养基上展开细胞的等分试样,并在37℃下温育平板20小时。通过PCR,使用1.C部分所述的条件,所不同的是16种随机选择的菌落中的一部分是模板DNA的来源,从而证明了正确***的存在。16种菌落中的14种扩增正确大小的片段。来自这些分离物中的质粒称为pBMS2000-PMKR(对于甲醇毕赤酵母酮还原酶来说)。
根据制造商的程序,将pBMS2000-PMKR转化到感受态
大肠埃希氏菌株BL21-CodonPlus(DE3)-RIL细胞(Stratagene)内,将细胞在含30μg/ml氯霉素和10μg/ml新霉素的LB琼脂培养基上展开。使用1.C部分所述的条件,随机选择4种菌落,并用作PCR用模板DNA的来源。所有4种反应扩增正确大小的DNA片段,这证明BL21-CodonPlus(DE3)-RlL已被成功地转化。选择这些分离物之一作为表达株并用于所有进一步的实验。通过在15℃下在MT3/新霉素/氯霉素培养液中培养细胞,制备多瓶表达株,直到对数中期(0D600约3.5),添加甘油到10%的最终体积,并在液氮中冷冻。MT3/新霉素/氯霉素培养液的组成是1%NZ-Amine A(Sheffield Products,Norwich,NY)、2%Yeastamin(A.E.Staley,Decataur,1L)、2%甘油、0.6%Na2HPO4、0.3%KH2PO4、0.125%(NH4)2SO4、0.0246%MgSO4.7H2O(EM Science)、10μg/ml硫酸新霉素和30μg/ml氯霉素(EM Science)。
通过在质粒pBMS2000上产生的ptac启动子的IPTG(异丙硫基-β-D半乳糖苷)诱导,控制酮还原酶基因的表达。在250ml烧瓶内,在15℃、225RPM下,表达株在25ml MT3/新霉素/氯霉素中生长,直到它达到OD600nm约0.7。在这一点处,添加IPTG(Life Technolgies)到0.5mM的最终浓度。使培养物生长过夜(约16小时),使得酮还原酶基因完全诱导和酮还原酶蛋白质产生。
将1ml过夜表达的培养物样品转移到微型离心管中,并以14000xg沉淀细胞2分钟。真空吸走上清液,并将细胞沉淀物再次悬浮在蒸馏水中,达到30的OD600。将10μl细胞悬浮液加入到17.5μl蒸馏水、10μl0.5M的二硫苏糖醇(Sigma)和12.5μl 4X的NuPAGE LDS蛋白质样品加样缓冲液(Invitrogen)中。将蛋白质样品在70℃下温育10分钟,并将15μl等分试样加样到NuPAGE 10%Bis-Tris凝胶(Invitrogen)中。在125mA下,使凝胶在1X NuPAGE MOPS SDS流动缓冲液中电泳,直到示踪染料到达凝胶底部。在相邻的泳道中进行蛋白质分子量标准物(Mid-RangeProtein Molecular Weight Weight Markers,Promega Corp.,Madison,WI)的实验。在完成实验时,将凝胶转移到含有蛋白质染色溶液(在40%乙醇/10%乙酸/50%水内的0.1%Coomassie Blue R250[Sigma])的托盘中。在平台式摇动器上放置该溶液并轻轻搅拌1小时。除去染色溶液并用脱色溶液(1x Gel-Clear Destain,Novez)替代。凝胶返回到平台式摇动器中并脱色,直到蛋白质条带清晰可见。由酮还原酶表达株制备的蛋白质样品显示出清晰地过量表达的蛋白质,其分子量为约40000道尔顿。对照的培养物,或者未转化的BL21-CodonPlus(DE3)-RIL或者用pBMS2000转化的BL21-CodonPlus(DE3)-RIL,在IPTG诱导之后没有显示出类似的条带。随后的实验证明发现过量表达的蛋白质主要在可溶的蛋白质级分内。
为了测试异源表达的蛋白质是否拥有酮还原酶活性,如上所述生长并诱导表达株,所不同的是培养物体积增加到1L,和烧瓶尺寸增加到4L。在用IPTG过夜诱导之后,如上所述在蛋白质凝胶上分析样品。结果表明培养物大小的递增对菌株过量表达异源蛋白质的能力没有影响。实施例9中给出了在生物转化方法中使用重组酶的实例。图1给出了酮还原酶的氨基酸和核苷酸序列。
图1
甲醇毕赤酵母酮还原酶的序列
ATG AAT TGG GAA AAA GTT CCA CAA GAA TTA TAC ACT
MET Asn Trp Glu Lys Val Pro Gln Glu Leu Tyr Thr
CGT TTG GGC TCT TCA GGT CTA CAA ATC TCC AAG ATT
Arg Leu Gly Ser Ser Gly Leu Gln Ile Ser Lys Ile
ATT GTT GGG TGT ATG TCA TTC GGT ACC AAA GCA TGG
Ile Val Gly Cys MET Ser Phe Gly Thr Lys Ala Trp
GGA GGT GAT TGG GTT TTG GAG GAT GAG GAT GAG ATC
Gly Gly Asp Trp Val Leu Glu Asp Glu Asp Glu Ile
TTT GCG ATT ATG AAA AAG GCT TAT GAT CAA GGT ATC
Phe Ala Ile MET Lys Lys Ala Tyr Asp Gln Gly Ile
AGA ACT TTT GAC ACT GCT GAC TCT TAT TCT AAT GGT
Arg Thr Phe Asp Thr Ala Asp Ser Tyr Ser Asn Gly
GTT TCT GAA AGA CTC TTA GGT AAA TTC ATT AGA AAG
Val Ser Glu Arg Leu Leu Gly Lys Phe Ile Arg Lys
TAC AAC ATT GAT AGA TCT AAG CTT GTT ATT TTG ACT
Tyr Asn Ile Asp Arg Ser Lys Leu Val Ile Leu Thr
AAG GTT TTT TTC CCA GCT CCT GAA GAA TAT GAG TCG
Lys Val Phe Phe Pro Ala Pro Glu Glu Tyr Glu Ser
TTT AGC TTC TTT AAT CAT AAT TTC CCT GGT CAC GAG
Phe Ser Phe Phe Asn His Asn Phe Pro Gly His Glu
TTG GTC AAC AGA AGT GGC TTA TCG AGA AAA CAT ATT
Leu Val Asn Arg Ser Gly Leu Ser Arg Lys His Ile
TTG GAC TCT GCT GCT GCC TCT GTT GAG AGA TTA GGC
Leu Asp Ser Ala Ala Ala Ser Val Glu Arg Leu Gly
ACC TAT ATC GAT GTA CTA CAA ATT CAT AGA TAT GAT
Thr Tyr Ile Asp Val Leu Gln Ile His Arg Tyr Asp
CCA AAT ACC CCT GCT GAA GAA ACC ATG GAA GCT TTG
Pro Asn Thr Pro Ala Glu Glu Thr MET Glu Ala Leu
AAT GAT TGT ATT AAA CAA GGT TTA ACC AGA TAC ATT
Asn Asp Cys Ile Lys Gln Gly Leu Thr Arg Tyr Ile
GGA GCA TCT ACC ATG AGA GCC TAT CAA TTC ATC AAG
Gly Ala Ser Thr MET Arg Ala Tyr Gln Phe Ile Lys
TAT CAA AAC GTT GCT GAG AAA CAT GGG TGG GCA AAG
Tyr Gln Asn Val Ala Glu Lys His Gly Trp Ala Lys
TTC ATC TCG ATG CAA AGC TAC TAC AGT TTA CTT TAC
Phe Ile Ser MET Gln Ser Tyr Tyr Ser Leu Leu Tyr
CGT GAA GAA GAA GCA GAA CTA ATT GCA TAC TGT AAT
Arg Glu Glu Glu Ala Glu Leu Ile Ala Tyr Cys Asn
GAA ACT GGT GTT GGG TTA ATC CCA TGG TCA CCA AAC
Glu Thr Gly Val Gly Leu Ile Pro Trp Ser Pro Asn
GCT GGT GGA TTC TTA ACC AGA CCA GTA TCC AAG CAA
Ala Gly Gly Phe Leu Thr Arg Pro Val Ser Lys Gln
GAC ACT GCG AGA AGT GCA AGT GGG GCT GCT GCG TTA
Asp Thr Ala Arg Ser Ala Ser Gly Ala Ala Ala Leu
TAT GGT CTA GAA CCT TTC AGT GAG GCT GAT AAG GCT
Tyr Gly Leu Glu Pro Phe Ser Glu Ala Asp Lys Ala
ATT ATT GAC AGG GTT GAA GAG TTA TCA AAG AAA AAG
Ile Ile Asp Arg Val Glu Glu Leu Ser Lys Lys Lys
GGA GTT TCT ATG GCT AGT GTC GCT TTA GCT TGG GTT
Gly Val Ser MET Ala Ser Val Ala Leu Ala Trp Val
ATT AGT AAG AAC AGT TGG CCA ATT ATT GGT TTC AGT
Ile Ser Lys Asn Ser Trp Pro Ile Ile Gly Phe Ser
AAG CCT GGA AGG GTT GAT GAT GCT TTA GAT GGT TTC
Lys Pro Gly Arg Val Asp Asp Ala Leu Asp Gly Phe
AAG TTG AAG CTA ACC GAA GAG GAC ATC AAA TTC TTA
Lys Leu Lys Leu Thr Glu Glu Asp Ile Lys Phe Leu
GAA GAG CCT TAT GTT CCA AAA CCT TTG CCT CGC TTA
Glu Glu Pro Tyr ValP ro Lys Pro Leu Pro Arg Leu
TAT TCT GTA ATT TTA TAA
Tyr Ser Val Ile Leu STP
实施例9
通过重组大肠埃希氏菌表达来自甲醇毕赤酵母的酮还原酶还原酮甲酯(V)
在大肠埃希氏菌中克隆并过量表达来自甲醇毕赤酵母的酮还原酶。在15L和250L发酵器内,使大肠埃希氏菌的细胞(表达酮还原酶)在培养基5中生长。在培养物的光学细胞密度(OD)达到3.0时,通过添加0.25mM作为诱导剂的异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG),进行大肠埃希氏菌的酮还原酶诱导。在添加IPTG之后,在发酵器中生长30小时之后收集细胞。使用细胞,通过细胞悬浮液催化酮甲酯(底物V)生物转化成相应的(S)-羟基甲酯(产物VI)。
该实施例的底物和产物如实施例3所述。将大肠埃希氏菌表达酮还原酶的细胞以10%(W/V)的浓度悬浮在1L 100mM的磷酸盐缓冲液pH7.0中。将该细胞悬浮液补加100μM烟酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸(NADP)、1mM苯甲烷磺酰氯(PMSF)、50g葡萄糖、3400单位葡萄糖脱氢酶和4.5g底物(酮甲酯,式V)。在500RPM和28℃的温度下进行生物转化。如实施例3所述,通过HPLC分析,测定底物V和产物V I浓度和产物VI的对映体过量。在20小时内完成反应,其中产物(羟甲基酯,式VI)的反应产率为95%。对于产物VI来说,获得99.9%的对映体过量。
Claims (4)
1.一种通过立体选择还原式(II)的化合物而制备式(I)的化合物的方法,
其中X和Y各自独立地选自H,Cl,Br,I和R1;
R1是取代或未取代的烷基、链烯基或(CH2)nCOR2;
n是1-10的整数;
R2是OH,OR3或NH2;并且
R3是取代或未取代的烷基、链烯基、C3-7环烷基或取代或未取代的芳基;
其中X和Y各自独立地选自H,Cl,Br,I和R1;
R1是取代或未取代的烷基、链烯基或(CH2)nCOR2;
n是1-10的整数;
R2是OH,OR3或NH2;并且
R3是取代或未取代的烷基、链烯基、C3-7环烷基或取代或未取代的芳基;
该立体选择还原是通过与能催化式(II)表示的酮的酶促还原的氧化还原酶反应而完成的。
2.一种通过立体选择还原式(II)的化合物而制备式(I)的化合物的方法,
其中X和Y各自独立地选自H,Cl,Br,I和R1;
R1是取代或未取代的烷基、链烯基或(CH2)nCOR2;
n是1-10的整数;
R2是OH,OR3或NH2;并且
R3是取代或未取代的烷基、链烯基、C3-7环烷基或取代或未取代的芳基;
其中X和Y各自独立地选自H,Cl,Br,I和R1;
R1是取代或未取代的烷基、链烯基或(CH2)nCOR2;
n是1-10的整数;
R2是OH,OR3或NH2;并且
R3是取代或未取代的烷基、链烯基、C3-7环烷基或取代或未取代的芳基;
该方法包括使所述式(II)的化合物与供给能催化式(II)表示的酮的酶促还原的氧化还原酶的微生物反应。
3.权利要求1的方法,其中所述氧化还原酶是大肠埃希氏菌中表达的图1的甲醇毕赤酵母酮还原酶。
4.权利要求2的方法,其中所述供给氧化还原酶的微生物选自甲醇毕赤酵母ATCC 56510、甲醇毕赤酵母ATCC 56508和甲醇毕赤酵母ATCC 58403,并且其中所述氧化还原酶是酮还原酶。
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