CN1105777C - 由氧化葡糖杆菌t－100得到的l－山梨糖脱氢酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

两者均由氧化葡糖杆菌T-100得到的一种新的L-山梨糖脱氢酶(SDH)和一种新的L-山梨酮脱氢酶，一种编码SDH和/或SNDH的DNA，一种含有该DNA的表达载体，一种由该表达载体转化的宿主细胞以及一种制备SDH和/或SNDH的方法，该方法包括在一种培养基中培养宿主细胞并由得到的培养物中回收SDH和/或SNDH。本发明的SDH和SNDH是具有较佳性能用于制备2-酮基-L-古洛糖酸，以及L-抗坏血酸的酶。按照本发明的制备方法，可通过遗传工程大量生产具有这些优良性能的SDH和SNDH。

Description

由氧化葡糖杆菌T-100得到的L- 山梨糖脱氢酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及两者都由氧化葡糖杆菌(Gluconobacter Oxydans)T-100得到的一种新的L-山梨糖脱氢酶(在下文中称为SDH)和一种新的L-山梨酮(sorbosone)脱氢酶(在下文中称为SNDH)。更确切地，本发明涉及一种新的SDH、一种新的SNDH、一种将它们编码的DNA、一种含所述DNA的表达载体、一种用所述表达载体转化的(转染的)宿主细胞、以及通过培育宿主细胞制备SDH和SNDH。

本发明的SDH和SNDH为用于制备2-酮基-L-古洛糖酸的酶。

                 背景技术

2-酮基-L-古洛糖酸(下文中称为2KLGA)是一种在合成L-抗坏血酸中的关键中间体。为了工业生产，2KLGA是按照Reichstein’s法通过氧化反应由L-山梨糖化学合成的。

另一方面，公知的是，许多微生物具有通过由SDH和SNDH两步酶氧化将L-山梨糖转化成2KLGA的能力。就是，SDH催化将L-山梨糖转化成L-山梨酮的氧化作用，而SNDH催化将L-山梨酮转化成2KLGA的氧化作用。然而，由于通过使用这些微生物达到的2KLGA生产率低，它们迄今尚末被应用于工业生产。

因此需要提供有效而简单的制备2KLGA的方法。

                    本发明公开内容

在为完成上述目的的一种尝试中，本发明的发明人进行了充分研究以发现一种具有较佳性能的SDH和SNDH，并成功地制得具有为制备2KLGA所需性能的一种新SDH和一种新的SNDH并开发了这些研究，导致完成了本发明。

因此，本发明涉及一种由氧化葡糖杆菌T-100(FERM  BP-4188)得到的新的SDH，其特征在于：(1)一种催化L-山梨糖转化成L-山梨酮的能力，(2)分子量58000道尔顿(SDS-PAGE)，以及(3)N-末端氨基酸顺序为：

Thr-Ser-Gly-Phe-Asp-Tyr-Ile-Val-Val-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala此外，本发明涉及一种具有示于在下文中述及的顺序目录，顺序No.1中的氨基酸顺序的SDH。

本发明也涉及一种由氧化葡糖杆菌T-100得到的新的SNDH，其特征在于：(1)催化L-山梨酮转化成2KLGA的能力，(2)分子量为50000道尔顿(SDS-PAGE)，以及(3)N-末端氨基酸顺序为：Asn-Val-Val-Ser-Lys-Thr-Val-Xaa-Leu(Xaa为未鉴别的氨基酸)。本发明另外还涉及一种具有示于顺序目录，顺序No.2中氨基酸顺序的SNDH。

本发明也涉及一种编码上述SDH和/或SNDH的DNA，一种含有所述DNA的表达载体，由所述表达载体转化的(转染的)宿主细胞以及制备该SDH和/或SNDH的方法，该方法包括在培养基中培养所述宿主细胞(转化体)并从得到的培养物中回收SDH和/或SNDH。

在本发明中所用的氧化葡糖杆菌T-100是以常规方法通过N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)诱变由氧化葡糖杆菌G716(野生株)得到的2KLGA高产突变体。

氧化葡糖杆菌G716由柿中分离得到并具有如下的形态和生理性能。Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Vol.1(1984)中所述的方法和Manual for Identification to MedicalBacteria(S.T.Cowan，2nd.Edition，1985)中所述的方法基本上被用于分类学研究。1.形态性能

氧化葡糖杆菌G716是一种革兰氏阴性，游动的细菌。细胞形为杆状，单独或成对两种形式存在，很少成链状。氧化葡糖杆菌  G716的形态特征

    革兰氏染色剂                       阴性

    菌落颜色                           淡白色

    孢子                               阴性

    细胞形状                           杆状

    游动性                             阳性

    鞭毛                            3-8极生鞭毛2.生理特征

氧化葡糖杆菌  G716的生理特征归纳在下表中。

     氧化葡糖杆菌  G716的生理特征

条件                       特  征生长在空气中                      +

在4℃                         -

在22℃                        +

在30℃                        +

在40℃                        -过氧化氢酶                        +氧化酶                            -明胶液化                          -硝酸还原作用                      -七叶苷(aesuclin)水解              -酸形成

L-阿糖                        +

D-纤维素二糖                  +

卫矛醇                        +

D-半乳糖                      +

D-葡萄糖                      +

丙三醇                        +

D-甘露糖醇                    +

D-甘露糖                      +

D-木糖                        +

        D-乳糖                          -

        麦芽糖                          -

        D-棉子糖                        -

        鼠李糖                          -

        D-山梨醇                        -

        蔗糖                            -

        D-海藻糖                        -

    DNA mol％ G+C                      60.0

    泛醌                                Q10

该有机体是需氧的，在厌氧条件下不能生长。最佳温度为22-30℃，在40℃和4℃下不能生长。生长的最佳培养基是SY培养基，该培养基由2.5％山梨醇和0.5％酵母浸膏(pH6.4)组成。由葡萄糖和丙三醇发生强烈的生酮作用。

本发明所用的氧化葡糖杆菌T-100具有与氧化葡糖杆菌  G716相同的那些形态和生理特征。

本发明新的SDH和新的SNDH可通过重组体DNA技术、多肽合成等制得。

在应用重组体DNA技术的场合下，新的SDH和/或新的SNDH可通过在营养培养基中培养用含有编码新SDH和/或新SNDH氨基酸顺序的DNA的表达载体转化的(转染的)宿主细胞并从所得培养物中回收SDH和/或SNDH而制得。

以下详尽地说明这一方法的特征。

宿主细胞包括，例如微生物，如细菌(例如，大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、氧化葡糖杆菌和枯草杆菌(Bacillussubtilis))、酵母(例如，啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、动物细胞系和培养的植物细胞。微生物的较佳实例包括细菌，特别是属于大肠杆菌属(例如，E.coli JM109 ATCC53323，E.coli NM538ATCC35638，E.coli HB101 ATCC33694，E.coli HB101-16 FERMBP-1872和E.coli 294 ATCC31446)和杆菌属(例如Bacillussubtilis  ISW1214)的菌株、酵母，特别是属于酵母属(例如，Saccharomyces  cerevisiae  AH22)的菌株，以及动物细胞系[例如，小鼠L929细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞]。

当使用细菌，特别是E.coli或Bacillus  subtilis作为宿主细胞时，表达载体通常的组成至少为：启动子、起始密码子、编码新SDH和/或新SNDH氨基酸顺序的DNA、终止密码子、终止区、以及可复制单元。

当使用酵母或动物细胞作为宿主细胞时，表达载体较佳组成至少为：启动子、起始密码子、编码信号肽和新SDH和/或新SNDH氨基酸顺序的DNA、以及终止密码子，并且可以还***强化因子顺序、新SDH的5′-和3′-末编码区、新SNDH的5′-和3′-末编码区、粘接点、多腺苷酸化位点以及可复制单元。

在细菌中表达新SDH和/或新SNDH的启动子包括：例如，启动子和Shine-Dalgarno(SD)顺序(例如AAGG)。较佳的启动子包括例如，常规所用的启动子(例如，E.coli的P L-启动子和trp-启动子)和SNDH染色体基因的启动子。

在酵母中表达新SDH和/或新SNDH的启动子包括：例如，TRP1基因、ADHI或ADHII基因、以及S.cerevisiae的酸性磷酸酶(PHO5)基因的启动子。

在哺乳动物细胞中表达新SDH和/或新SNDH的启动子包括：例如，SV40早期或晚期启动子、HTLV-LTR启动子、小鼠金属硫因I(MMT)启动子和牛痘启动子。

较佳的起始密码子包括：例如，甲硫氨酸密码子(ATG)。

信号肽包括：例如，常规使用的其他酶的信号肽(例如，天然t-PA的信号肽和天然血纤维蛋白溶酶原的信号肽)。

编码信号肽或新SDH和/或新SNDH的DNA可用常规方法制得，这些方法如像使用DNA合成器的部分或全部DNA合成和包括用常规方法，如在Molecular Cloning中(主要在11和14章中，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989，USA)所述PCR操作或DNA探针操作由氧化葡糖杆菌基因组DNA制备的方法。

终止密码子包括：例如，常规所用的终止密码子(例如，TAG和TGA)。

终止区包括例如，天然或合成终止区(例如，新SDH染色体基因终止区和合成fd噬菌体终止区)。

可复制单元是能复制属于宿主细胞中的整个DNA顺序的DNA化合物，并可以包括天然质粒、人工修饰的质粒(例如，由天然质粒制得的DNA片段)和合成质粒。在本发明中，可复制单元可根据用作宿主细胞的微生物适当地选择。质粒的较佳实例包括E.coli的质粒pBR322及其人工修饰的质粒(由合适的限制性内切酶处理pBR322得到的DNA片段)、酵母的酵母2μ质粒和酵母染色体DNA、哺乳动物细胞的质粒pRSVneoATCC37198、质粒pSV2dhfr ATCC37145、质粒pdBPV-MMTneoATCC37224和质粒pSV2neo ATCC37149。

强化因子顺序包括：例如，SV40的强化因子顺序(72b.p.)。

多腺苷酸化位点包括：例如，SV40的多腺苷酸化位点。

粘接点包括：例如，SV40的粘接点。

启动子、起始密码子、编码新SDH和/或新SNDH氨基酸顺序的DNA、终止密码子和终止区，如有必要可以常规方式使用合适的DNA片段(例如，用限制性内切酶消化，使用T4 DNA连接酶连接)与一种合适的可复制单元(质粒)连续和环形地连接，以得到本发明的表达载体。

当使用哺乳动物细胞作为宿主细胞时，则可以用上述方法使强化因子顺序、启动子、新SDH和/或新SNDH的cDNA的5′-末编码区、起始密码子、编码信号肽的DNA、编码新SDH和/或新SNDH氨基酸顺序的DNA、终止密码子、新SDH和/或新SNDH的cDNA的3′-末编码区，粘接点和多腺苷酸化位点与一种合适的可复制单元连续和环形地连接，以得到一种表达载体。

本发明的转化体可通过将上述得到的表达载体引种入宿主细胞而制得。将表达载体引种入宿主细胞(转化，在下文中也用来指转染)可用常规方法进行(例如，E.coli的Kushner法，哺乳动物细胞的磷酸钙法和显微注射)。

为通过本发明方法制备新SDH和/或新SNDH，将含有该表达载体的所得到的转化体在水营养培养基中培养。

使用的营养培养基可含有碳源(例如，葡萄糖、甘油、甘露糖醇、果糖和乳糖)和无机或有机氮源(例如，硫酸铵、氯化铵、酪蛋白水解产物、酵母浸膏、多胨、细菌胰蛋白胨(Bactotrypton)和牛肉膏)。如有需要，可将其他营养源，如无机盐类(例如，磷酸二氢钠或钾、磷酸氢二钾、氯化镁、硫酸镁和氯化钙)、维生素(例如，维生素B1)以及抗生素(例如，氨苄青霉素、卡那霉素)加入培养基中。为培养哺乳动物细胞，经常使用的是补充有胎牛犊血清和抗生素的Dulbecco’s Modified Eagle’s Minimum Essential Medium(DMEM)。

转化体的培养通常在pH5.5-8.5(较佳为pH7-7.5)以及18-40℃(较佳为20-30℃)下进行5-50小时。

当在培养溶液中存在所产生的新SDH和/或新SNDH时，通过将培养物过滤或离心得到培养物滤液(上清液)。通过通常用于提纯和分离天然或合成蛋白质的方法(例如，透析、凝胶过滤、使用抗SDH单克隆抗体或抗SNDH单克隆抗体的亲和柱色谱法、在合适吸附剂上的柱色谱法和高性能液相色谱法)可由培养物滤液中提纯新SDH和/或新SNDH。

当在培养的转化体周质和细胞质中存在所产生的新SDH和/或新SNDH时，则通过过滤和离心收集细胞，并通过例如，用超声波和/或溶菌酶处理使其细胞壁和/或细胞膜破坏，以得到碎片。这些碎片可溶于合适的水溶液(例如，8M含水尿素和6M含水胍(guanidium)盐)中。可用上述举例说明的常规方法由该溶液中提纯新SDH和/或新SNDH。

如果必需重新折叠通过本发明方法在E.coli中产生的新SDH和/或新SNDH，则重新折叠可用常规方法进行。

当在转化体中存在SDH活性和/或新SNDH活性时，则以下可作为由处理培养物得到的物料例子(下文中该物料被称作处理后的物料)。

(1)原细胞：用常规方法，如过滤和离心由培养物中分离的；

(2)干细胞：用常规方法，如冷冻干燥和真空干燥通过将以上(1)的所述原细胞干燥得到的；

(3)无细胞提取液：用常规方法(例如，使用有机溶剂自溶细胞、用氧化铝、海砂等研磨细胞，以及用超声波处理细胞)通过将上述(1)的所述原细胞或上述(2)的干燥细胞破坏而得到的；

(4)酶溶液：用常规方法(例如，柱色谱法)通过将上述(3)的所述无细胞提取液提纯或部分提纯而得到的；以及

(5)固定化细胞或酶：用常规方法(例如，使用丙烯酰胺、玻璃珠、离子交换树脂等的方法)通过将上述(1)的所述原细胞或上述(2)的干燥细胞或上述(4)的酶固定而制得的。

当在转化体的培养物滤液中存在SDH活性和/或新SNDH活性时，则培养物滤液(上清液)、提纯的酶溶液和固定酶可作为培养物处理后物料的例子。

通常可按照T.SUGISAWA et al.(Agric.Biol.Chem.，55，363-370，1991)使用L-山梨糖作为基质，并使用2，6-二氯靛酚(在下文中称作DCIP)作为一种电子受体，在磷酸盐缓冲剂(pH7.0)中，在粗混合物，如声处理的细胞溶胞产物或在每次提纯步骤中得到的其处理后的物料中进行新SDH活性的试验。将酶活性作为DCIP的还原率测量，该还原率由在600nm处吸光度的降低而测定。一个酶单位被规定为每分钟催化还原1μmol DCIP的酶量。反应混合物的较佳pH、L-山梨糖和DCIP的浓度、反应时间和反应温度可随培养基或其所用的处理后物料变化。通常反应在pH7-10，较佳为pH8-9，于5-50℃，较佳为20-45℃进行0.5-24小时。

也可使用具有荧光检测(Ex.315nm；Em.405nm)的后柱高性能液相色谱法(HPLC)通过测定用盐酸苄脒标记的反应产物，L-山梨酮的量测定新SDH酶的活性。

也可通过SUGISAWA等人(Agric.Biol.Chem.，55，363-370，1991)的一般方法测定在粗混合物，如超声波处理的细胞溶胞产物和在分别提纯步骤中得到的处理过的物质中存在的新SNDH活性。在该场合下，通过在磷酸盐缓冲剂(pH7.0)中使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(在下文中称作NAD)作为一种电子受体并用L-山梨酮作为基质测量所产生的NADH量(该测量由在340nm处的吸光度所测定)来测定SNDH活性。一个酶单位被规定为每分钟产生1μmol NADH的酶量。反应混合物的较佳pH、所用L-山梨酮和NAD的浓度、反应时间和反应温度可随所用的培养基和处理后的物料变化。通常反应是在pH7-10，较佳为pH8-9，于5-50℃，较佳为20-45℃进行0.5-24小时。

本发明的新SDH和新SNDH是用于制备2KLGA，从而制备L-抗坏血酸的具有较佳性能的酶。按照本发明，可通过遗传工程大量生产具有这些较佳性能的新SDH和新SNDH。

                    附图的简要描述

图1是pUC18SD180的限制性内切酶图。

图2是含有编码本发明新SDH的DNA和编码本发明新SNDH的DNA的质粒pUC19SD5的限制性内切酶图。

图3示出了质粒pUC19SD5的结构。

以下将更详细地说明本发明。在以下实施例中，质粒、酶如限制性内切酶、T4 DNA连接酶、以及其他物料均得自商业来源并按供应商的指示使用。用于克隆DNA、转化宿主细胞、培养转化体、由所得培养物中回收新SDH和/或新SNDH等的操作在现有技术中为公知的或可采用文献方法。

不用说，本发明不限于这些实施例。

实施例1由氧化葡糖杆菌T-100提纯SDH(1)微生物

通过亚硝基胍诱变选择氧化葡糖杆菌T-100作为由氧化葡糖杆菌  G716(野生株)得到的2KLGA-高产突变体。(2)培养氧化葡糖杆菌T-100

将氧化葡糖杆菌T-100单菌落转移入在500ml锥形烧瓶中的6份独立由2.5％葡萄糖、1.0％多胨、0.5％酵母浸膏(Difco Labs.，USA)和2.0％CaCO₃组成的培养基(各为100ml)中。在旋转振荡器(25Orpm)上于30℃进行培养18小时。在30升罐中将培养后的培养基(总共600ml)接种到20升含有5％D-山梨醇、0.5％甘油、0.5％酵母浸膏和1.0％CaCO₃的发酵培养基中。在以20升/分钟的通气和以300rpm搅动下于30℃进行培养42小时。在4℃下以6000rpm将培养后的液体培养基(20L)离心分离10分钟。用冷盐水洗涤细胞一次并在相同条件下再次离心分离。将细胞贮存在-20℃下直至使用。(3)制备膜部分

将(2)中所得的细胞(17.7g，湿重)悬浮在50ml 10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，通过声波处理破裂，并在4℃下以8000rpm离心分离10分钟，得到上清液。另一方面，将得到的沉淀悬浮在40ml 10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，声波处理使破裂并在上述相同条件下离心分离。将上清液汇集并在4℃下以32000rpm进行超离心分离1小时。用磷酸盐缓冲液(50ml)将得到的沉淀洗涤一次并在上述相同条件下使其经受超离心分离，得到粗膜蛋白质(膜部分)。(4)由膜部分溶解SDH

将(3)中所得的膜部分悬浮在50ml 10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中。向该悬浮液加入0.75ml 20％Triton X-100(Nacalai Tesque，Japan)和1.8g  L-山梨糖，并将该混合物在冰上搅拌3.5小时。在4℃下以32000rpm将得到的悬浮液进行超离心分离1小时，得到上清液(约48ml)，被称作溶解的SDH部分。(5)离子交换色谱法

将(4)中所得的溶解部分(16ml)在用含有0.3％TritonX-100和200mM L-山梨糖的10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)平衡的TSKgel DEAE-5PW柱(7.5mm内径×75mm，Toso  Co.Ltd.，Japan)上经受离子交换色谱分离。在一种平衡缓冲剂中以氯化钠线性梯度0-0.5M洗脱该柱。按照T.SUGISAWA等人的方法(Agric.Biol.Chem.，Vol.55，363-370，1991)，使用L-山梨糖作为基质并使用0.1mM 2，6-二氯靛酚(DCIP)作为电子受体，在0.28M磷酸盐缓冲剂(pH7.0)中测定活性。一个酶单位被规定为每分钟催化1μmole  DCIP还原反应的酶量。通过用分光光度计(Model  UV-160，Shimadzu，Japan)在600nm处吸光度的减少测定DCIP的还原率。将活性部分汇集，用10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释3倍，并施加到用10mM磷酸盐缓冲剂(pH7.0)平衡的DEAE-TOYOPEARL650M柱(7.0mm内径×17mm，Toso Co.Ltd.，Japan)上。用0.2M在平衡缓冲液中的氯化钠洗脱该柱。将得到的洗脱液用于进一步提纯步骤。(6)凝胶-过滤色谱法

将一部分(300μl)浓缩的活性部分在用含有0.3％Triton X-100，200mM  L-山梨糖和0.2M氯化钠的10mM磷酸盐缓冲剂(pH7.0)平衡的Superose 12 HR10/30柱(10mm内径×30cm，Pharmacia，Sweden)上经受凝胶-过滤色谱分离。使用相同的缓冲剂进行洗脱。通过在有十二烷基硫酸钠存在时的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE 12.5％凝胶)并通过实施例1(5)所述的酶测定法分析各个馏分(0.4ml)。由SDS-PAGE分析发现，SDH活性相应于58kd蛋白质，可以认为该58kd蛋白质就是所希望的SDH分子。

实施例2SDH的氨基酸顺序分析

将浓缩的活性部分(15μl)经受SDS-PAGE(12.5％凝胶)并在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上对分离的蛋白质进行印迹分析。切开含有被ponceauS所染色的58kd蛋白质的膜并用蒸馏水洗涤。直接用自动蛋白质定序机Model 470A(Applied Biosystems Inc.，USA)将膜片定序以进行N-末端氨基酸顺序分析。

为测定内氨基酸顺序，在该膜表面进行用无色杆菌属蛋白酶I(Wako Chemical，Japan)的碎裂。用50mM含有8％乙腈的Tris-HCl(pH9.0)洗脱所得到的片段，并通过使用Cosmosil 5C4-300(4.6mm内径×50mm，Nacalai Tesque，Japan)在0.05％三氟乙酸中以8-83％的乙腈线性梯度洗脱(75分钟)的反相色谱分离。分离出两种肽(肽1和肽2)，并用自动蛋白质定序机Model470A定序以进行氨基酸顺序鉴别。得到的数据示于表1。

           表    1

NH2-末端顺序：TSGFDYIVVGGGSA
	肽  1  ：        MTTGPHTWDLLTEPQK
肽  2  ：        LMMLSGVGPA

实施例3制备DNA探针(1)合成DNA低聚物

通过使用DNA合成器型号392(Applied Biosystems Inc.，USA)的二氧磷基酰氨脒(amidite)法合成以下表2中列出的各个低核苷酸。合成的低核苷酸由含28％氨水的CPG聚合物载体(CPG：受控的多孔玻璃)释放出，随后在60℃下加热9小时以除去所有保护基团。在真空中蒸发反应混合物，并将残渣溶于200μl TE[10mMTris-HCl(pH7.4)-1mM EDTA]中。用醚将得到的溶液洗涤一次并用乙醇沉淀。将得到的低核苷酸不经进一步提纯用作聚合酶链反应的引物。

                         表    2

编码NH2-末端顺序的低核苷酸(正向引物)5′>ACC (TA)(GC)C GGC TT(TC) GA(TC) TA(TC) AT(TCA) GT<3′
	编码内顺序的低核苷酸(反向引物)5′>TC CCA (ATCG)GT (AG)TG (ATCG)GG (ATCG)CC <3′

(2)制备染色体DNA

将氧化葡糖杆菌  T-100的单菌落在由2％葡萄糖、1％多胨和0.5％酵母浸膏组成的培养基(100ml)中于37℃培养24小时。通过离心(4600rpm，10分钟)收集细胞并悬浮在TE缓冲剂(2.5ml)中。用20ml STE缓冲剂[20％蔗糖-50mM Tris-HCl(pH8)-1mM EDTA]稀释一部分(2.0ml)悬浮液，与5ml溶菌酶溶液(5mg/ml)混合，并在37℃下培育30分钟。加入肌氨酸(Sarcosil)溶液[1％月桂酰肌氨酸酯(Sarcosilate)-100mMEDTA(pH9.0)](50ml)和蛋白酶K(40mg)，并将该混合物在50℃下培育1.5小时。将氯化铯(93.8g)和6ml溴化乙锭(5mg/ml)溶于75ml所述混合物中，将该氯化铯溶液在20℃下以50000rpm超离心分离14小时。分离含有染色体DNA的部分，用生理盐水饱和的异丙醇洗涤二次，并对TE缓冲液(2L)透析4小时。用酚(20ml)萃取透析液，并对TE缓冲液(2L)透析二次，得到所需的染色体DNA溶液(14ml，91.5μg/ml)。(3)聚合酶链反应

利用Hybaid热反应器Model HB-TR1(Hybaid Limited，UK)用180ng氧化葡糖杆菌T-100染色体DNA和2.5pmol表2的各个引物进行聚合酶链反应(PCR)。将该反应混合物[在PCR缓冲剂(PerkinElmer-Cetus，USA)中各为200μM dNTPs和2.5单位Taq DNA聚合酶]经受50次PCR循环，每次由在95℃下变性0.5分钟，在42℃下退火1分钟以及在72℃下聚合2分钟组成。由PCR得到单个片段。通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分离大概编码一部分SDH基因的DNA片段(180bp)并充填DNA聚合酶Klenow片段(Takara Shuzo，Japan)，得到钝圆-端接的DNA。在有T4 DNA连接酶(Takara Shuzo，Japan)存在下将得到的DNA和事先用SmaI(Nippon Gene，Japan)消化的pUC18绑扎。按照SHIGESADA等人的方法(Saibo-kogaku 2，616-626，1983)将该绑扎的混合物用于转化E.coli JM109(Nippon Gene，Japan)。由一种该转化体得到所希望的质粒pUC18SD180(见图1)并由限制性图所表征。(4)制备³²P-标记的探针

通过用BamHI和EcoRI(Nippon Gene，Japan)消化pUC18SD180分离***物DNA(约200bp)。通过0.5％琼脂糖凝胶电泳提纯该约200bpDNA。按照所附的程序用切口转译器Kit(Takara Shuzo，Japan)将提纯的DNA³²P-标记。用³²P标记的DNA的比活性约为3.7×10⁷cpm/μg。

实施例4

由氧化葡糖杆菌T-100 DNA库分离SDH基因(1)制备染色体DNA库

用MboI(Nippon Gene，Japan)部分消化实施例3(2)中所得的染色体组DNA并在蔗糖梯度上分离片段，在克隆入λ噬菌体载体EMBL-3(Clonetech)的BamHI位点之前产生尺寸范围为8-22kbp的片段。将该λ噬菌体载体引种入E.coli NM538(Clonetech)以构成葡糖杆菌T-100染色体DNA库。(2)噬菌斑杂交

按照Molecular Cloning vol.1，Chapter 2，page 108，1989，USA中所述的程序，进行制备具有E.coli NM 538(Clonetech)为平板细菌的λ噬菌体噬菌斑和制动硝化纤维素滤器上的噬菌斑。在杂交缓冲剂(50％甲酰胺-1％牛血清清蛋白-0.1％聚乙烯吡咯烷酮-0.1％ ficoll-5×SSPE(见Molecular Cloning)-0.1％SDS-100μg/ml鲑***DNA)中于42℃将含有λDNA的滤器培育4小时，在相同缓冲剂中，但含有³²P-标记的探针(约200bp，约1×10⁷cpm/ml)于42℃培育18小时并在含有0.05％SDS的2×SSC(见Molecular Cloning)中于42℃陆续除去过量探针。将滤器在-80℃下暴露于X射线胶片HR-H(Fuji Film，Japan)达18小时。首次筛选λ噬菌体库的结果，由72000噬菌斑得到约30阳性噬菌体。(3)Southern印迹

用EcoRI和SalI(Nippon Gene，Japan)消化一种阳性噬菌体DNA并使其经受0.8％琼脂糖凝胶电泳。通过电印迹将在凝胶上分离的DNA片段转移到硝化纤维素滤器上。被鉴定出约6kbp DNA片段使³²P-标记的探针杂交。将其克隆入pUC19(Nippon Gene，Japan)的EcoRI位点和SalI位点之间，得到pUC19SD5(图2)。

实施例5SDH基因的DNA顺序分析(1)供DNA定序的质粒构成质粒pSD5RRV的构成

用EcoRV(Toyobo，Japan)消化pUC19SD5。由通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分离的三条带中分离出使³²P-标记的探针杂交的1.1kbpDNA并将其克隆入pUC18的SmaI位点，得到质粒pSD5RRV。(2)质粒pSD5RVS的构成

用EcoRV和Eco47III(Toyobo，Japan)消化pUC19SD5。分离大的DNA(约5700bp)并与T4 DNA连接酶(Takara Shuzo，Japan)自身连接，得到质粒pSD5RVS。(3)DNA顺序分析

按照所附程序通过用370A DNA定序器的二脱氧终止法(AppliedBiosystems，USA)进行模板DNA(pSD5RRV和pSD5RVS)的DNA顺序分析。将M13定序引物，一般和反向引物(New England Biolabs，USA)用于首次定序。根据首次顺序分析所测得的DNA顺序，合成如下的引物并用于进一步DNA顺序分析。所用的合成引物如下：

引物1(12 mer)：  5′>CTG TGT TCT CGC<3′

引物2(15 mer)：  5′>TCG GTT TCG CGA AGA<3′

引物3(16 mer)：  5′>CGT CTT CAA CGG AAC G<3′

引物4(16 mer)：  5′>GGA GTG ACG TCC GTT C<3′

引物5(16 mer)：  5′>GAG ATG TTC TCC CAG C<3′

由分析结果，发现了一个由1596碱基对组成的开放阅读框(ORF)。被由ORF起始密码子(ATG)开始的核苷酸顺序编码的氨基酸顺序与实施例2中所得的SDH的氨基酸顺序相符，而被ORF编码的蛋白，58kd的理论分子量与被SDS-PAGE编码的SDH，58kd的表观分子量完全相符。从而，测得ORF就是SDH基因。

SDH基因的核苷酸顺序示于后面将述及的顺序目录，顺序No.3中，而由该核苷酸顺序推导出的氨基酸顺序示于顺序No.1。

实施例6在E.coli中表达SDH基因(1)培养转化的(转染的)E.coli

在500ml烧瓶中将用pUC19SD5转化的E.coli JM109单菌落(E.coliJM109-pUC19SD5)接种入100ml含有1％Bactotrypton(Difco Labs.，USA)，0.5％酵母浸膏、0.5％氯化钠和0.1％葡萄糖(pH7.2)的培养基中并在30℃下培养18小时。在500ml锥瓶中将一部分培养后的液体培养基(各为3ml)转移入两份含有1％ Bactotrypton、0.5％酵母浸膏、0.5％氯化钠、1％甘油、0.3％KH₂PO₄、0.8％Na₂PO₄·12H₂O(pH6.8)、1％L-山梨糖和100μg/ml氨苄青霉素中的培养基中。将得到的混合物在25℃下培养3天。通过在4℃下以6000rpm离心10分钟采集回收培养过的液体培养基(总量200ml)，用盐水将细胞洗涤两次，悬浮在5ml盐水中，并在冰冷下通过在2分钟总声波处理时间中以30秒间隔进行声波处理而使细胞破裂。将所得的细胞溶胞产物在-20℃贮存直至用于酶测定。(2)测定SDH活性

通过使用高性能液相色谱法(HPLC)测定反应产物，L-山梨酮的量试验SDH表达活性。将由1％L-山梨糖，1mM甲基硫酸(methosulfate)吩嗪、0.1M磷酸盐缓冲剂(pH8.0)和声波处理的细胞溶胞产物组成的反应混合物于30℃在振荡下培育5小时。通过用6N硫酸将pH调节到2使反应停止。将该反应混合物在4℃下以6000rpm离心10分钟并通过具有#3011N柱(4.6mm内径×300mm，Hitachi，Japan)的HPLC直接分析一部分上清液。流动相是以每分钟0.8ml流速的，含有用于后柱(post column)标记法的0.02M盐酸苄脒和0.25M硫酸钾的1M硼酸盐缓冲液(pH9.5)。该后柱标记反应是于80℃在Tefron管(0.5mm内径×10m)中进行的。通过监控荧光(Ex.315nm，Em.405nm)进行标记化合物的检测。如下表3中所示，声波处理的含有质粒pUC19SD5的细胞具有一种将L-山梨糖转化成L-山梨酮的能力。然而，在100℃下处理的细胞溶胞产物或在没有质粒的细胞中未发现任何活性。这些结果表明，重组体质粒pUC19SD5含有在E coli JM109中表达的编码L-山梨糖脱氢酶的基因。

               表    3

菌株            处理         L-山梨酮(μg/ml)
	JM109(pUC19SD5)    声波处理        2310JM109(pUC19SD5)    声波处理，沸腾  24JM109              声波处理        21基底                  —                      33

实施例7由氧化葡糖杆菌T-100提纯SNDH(1)制备粗酶溶液

在冰冷却下将实施例1(2)中所得的细胞(约10g，湿重)悬浮在40ml 10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，通过声波处理破裂，并在4℃下以8000rpm离心分离10分钟。将上清液在4℃下以32000rpm超离心分离1小时。将得到的上清液作为SNDH粗酶溶液用于进一步测定。(2)离子交换色谱法

使SNDH粗酶溶液(45ml)通过事先用10mM磷酸盐缓冲剂(pH7.0)平衡的QAE-TOYOPEARL 550C柱(1.6cm内径×30cm，Toso Co.Ltd.，Japan)。用相同缓冲剂洗涤该柱并在相同缓冲剂中以0-0.4M的氯化钠线性梯度洗脱。用SUGISAWA等人的方法(Agric.Biol.Chem.，55，665-670，1991)，通过测量由在340nm处的吸光度所测定的，在50mM磷酸盐缓冲液中有13.7μML-山梨酮和0.73μM NAD存在时反应所产生的NADH量，进行酶活性测定。将活性部分(约15ml)汇集并用磷酸盐缓冲剂稀释5倍以用于随后的提纯步骤。(3)Blue Sepharose色谱法

使(2)中所得的酶溶液(约75ml)通过事先用磷酸盐缓冲剂平衡的Blue Sepharose柱(1.0cm内径×7cm，Pharmacia Sweden)。用相同缓冲剂洗涤该柱并在相同缓冲剂中以0-0.6M的氯化钠线性梯度洗脱。通过在有十二烷基硫酸钠存在时的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并通过实施例7(2)的酶测定分析各个馏分。结果发现，具有由SDS-PAGE得到的50kd分子量的蛋白质与酶活性一致，认为所述的50kd蛋白质就是所希望的SNDH分子。

实施例8SNDH氨基酸顺序分析

使实施例7(3)中所得的活性馏分(75μl)经受SDS-PAGE并将分离的蛋白质在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上进行印迹分析。切开被Coomassie Brilliant Blue染色的含50kd蛋白质的膜并用蒸馏水洗涤。用自动蛋白质***Model 470A(Applied BiosystemsInc.，USA)将膜片定序以进行N-末端氨基酸顺序分析。结果示于下面，其中Xaa为一种未鉴别的氨基酸。N-末端氨基酸顺序：

Asn-Val-Val-Ser-Lys-Thr-Val-Xaa-Leu-

实施例9SNDH基因的DNA顺序分析(1)供DNA顺序分析的质粒构成

用SalI(Nippon Gene，Japan)和EcoRV(Toyobo，Japan)消化实施例4(3)中所得的质粒pUC19SD5(图2)并使其经受0.8％琼脂糖凝胶电泳。由凝胶中分离出分离的DNA片段中的约600bp和4300bp的片段。将前者***pUC18的SmaI位点，构成pSD6RRV。将后者充填DNA聚合物Klenow片段(Takara Shuzo，Japan)，得到钝圆封端的SalI***位点，随后自身绑扎，构成环状质粒pSD5RIRV。用EcoRI和MluI消化该质粒pSD5RIRV，并分离约3400bp片段。用上述相同方法钝化和圆化，得到pSD5MRV。(2)DNA顺序分析

通过用370A DNA***的二脱氧终止法(Applied Biosystems，USA)进行模板DNA(用于SDH核苷酸顺序分析的pSD5MRV、pSD6RRV和pSD5RRV)的DNA顺序分析。将M13定序引物，普通和反向引物(NewEngland Biolab，USA)用于首次定序。根据由首次定序测得的DNA顺序，合成如下引物并用于进一步DNA顺序分析。所用的合成引物如下：

引物1  (15mer)；  5′>TGATGGAGAATGGCG<3′

引物2  (15mer)；  5′>GTAATCAGACCGACG<3′

引物3  (15mer)；  5′>TTCATTCTCGCATCC<3′

引物4  (15mer)；  5′>GATCTCACCTTTCGC<3′

引物5  (15mer)；  5′>CACGGATGTGAAGCC<3′

引物6  (15mer)；  5′>GATCCTGTGTGAGCG<3′

引物7  (15mer)；  5′>GCGATGTCATCACGG<3′

上述分析的结果，在SDH基因5′一侧上游发现一个由1497bp组成的开放阅读框(ORF)。被由ORF的起始密码子(ATG)开始的核苷酸顺序编码的氨基酸顺序与在实施例8中所得的SNDH的N-末端氨基酸顺序一致，而被ORF编码的，53kd蛋白质的理论分子量与由SDS-PAGE得到的SNDH，50kd的分子量完全一致。从而，ORF被认为就是SNDH基因。SNDH的核苷酸顺序示于后面将述及的顺序目录，顺序No.4中，由核苷酸顺序推导出的氨基酸顺序示于顺序No.2。

实施例10在E.coli中表达SNDH基因(1)培养转化的的E.coli

以实施例6中的相同方式得到E.coliJM109-pUC19SD5的细胞溶胞产物并在-20℃下贮存直至用于酶测定。(2)SNDH活性测定

通过使用HPLC测定反应产物，2KLGA的量进行SNDH表达活性试验。将由1％L-山梨酮、0.5mM NAD、0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.0)和声波处理的细胞溶胞产物组成的反应混合物于30℃在振荡下培育5小时。通过用6N硫酸将pH调节到2使该反应停止。在4℃以6000rpm将该反应混合物离心10分钟并通过HPLC(柱Capcellpak NH₂；4.6mm内径×250mm，Shiseido，Japan)分析一部分上清液。流动相为以每分钟1.2ml流速的20mM含有30％乙腈的磷酸钠缓冲剂(pH3.0)。通过测量在210nm处的紫外吸收进行检测。

结果，含有用质粒pUC19SD5转化的E.coli JM109-pUC19SD5的声波处理细胞溶胞产物的混合物产生显示出将L-山梨酮转化成2KLGA能力的5690μg/ml 2KLGA。尽管转化体宿主，E.coli JM109本身具有将同样化合物转化成2KLGA的能力，但其能力为转化体所具有能力的约1/2(2170μg/ml)，因此认为明显的增强了转化体将同样化合物转化成2KLGA的能力，这就是SNDH活性。由此使得明显的是，重组体质粒pUC19SD5具有编码SNDH的基因，而由在实施例9中发现的SDH基因的5′一侧上游处1497bp组成的ORF是一种SNDH基因。

工业实用性

本发明的SDH和SNDH是在制备2-酮基-L-古洛糖酸，以及L-抗坏血酸中具有较佳性能的有用的酶。按照本发明的制备方法，可通过遗传工程大量生产具有这些优良性能的SDH和SNDH。微生物的保藏

本发明所用的细胞株，氧化葡糖杆菌T-100，自1993年2月15日起已保藏在National Institute of Bioscience andHuman-Technology，Agency of Industrial Science andTechnology，Japan(保藏号：FERM BP-4188)。

                    顺序目录顺序：No：1顺序长度：530顺序类型：氨基酸拓扑学：线形顺序种类：肽起源

微生物：氧化葡糖杆菌

菌株：  T-100顺序特征

测定特征的方法：E顺序  Thr Ser Gly Phe Asp Tyr Ile Val Val Gly Gly Gly Ser Ala Gly

    1               5                  10                  l5

  Cys Val Leu Ala Ala Arg Leu Ser Glu Asn Pro Ser Val Arg Val

                   20                  25                  30

  Cys Leu Ile Glu Ala Gly Arg Arg Asp Thr His Pro Leu Ile His

                   35                  40                  45

  Met Pro Val Gly Phe Ala Lys Met Thr Thr Gly Pro His Thr Trp

                   50                  55                  60

  Asp Leu Leu Thr Glu Pro Gln Lys His Ala Asn Asn Arg Gln Ile

                   65                  70                  75

  Pro Tyr Val Gln Gly Arg Ile Leu Gly Gly Gly Ser Ser Ile Asn

                   80                  85                  90

  Ala Glu Val Phe Thr Arg Gly His Pro Ser Asp Phe Asp Arg Trp

                   95                 100                 105

  Ala Ala Glu Gly Ala Asp Gly Trp Ser Phe Arg Asp Val Gln Lys

                  110                 115                 120

  Tyr Phe Ile Arg Ser Glu Gly Asn Ala Val Phe Ser Gly Thr Trp

                  125                 130                 135

  His Gly Thr Asn Gly Pro Leu Gly Val Ser Asn Leu Ala Glu Pro

                  140                 145                 150

  Asn Pro Thr Ser Arg Ala Phe Val Gln Ser Cys Gln Glu Met Gly

                  155                 160                 165

  Leu Pro Tyr Asn Pro Asp Phe Asn Gly Ala Ser Gln Glu Gly Ala

                  170                 175                 180

  Gly Ile Tyr Gln Met Thr Ile Arg Asn Asn Arg Arg Cys Ser Thr

                  185                 190                 195

  Ala Val Gly Tyr Leu Arg Pro Ala Leu Gly Arg Lys Asn Leu Tnr

                  200                  205                210

  Val Val Thr Arg Ala Leu Val Leu Lys Ile Val Phe Asn Gly Thr

                  215                  220                225

  Arg Alg Thr Gly Val Gln Tyr Ile Ala Asn Gly Thr Leu Asn Thr

                  230                  235                240

  Ala Glu Ala Ser Gln Glu Ile Val Val Thr Ala Gly Ala Ile Gly

                  245                  250                255

  Thr Pro Lys Leu Met Met Leu Ser Gly Val Gly Pro Ala Ala His

                  260                 265                 270

  Leu Arg Glu Asn Gly Ile Pro Val Val Gln Asp Leu Pro Gly Val

                  275                 280                 285

  Gly Glu Asn Leu Gln Asp His Phe Gly Val Asp Ile Val Ala Glu

                  290                 295                 300

  Leu Lys Thr Asp Glu Ser Phe Asp Lys Tyr Arg Lys Leu His Trp

                  305                 310                 315

  Met Leu Trp Ala Gly Leu Glu Tyr Thr Met Phe Arg Ser Gly Pro

                  320                 325                 330

  Val Ala Ser Asn Val Val Glu Gly Gly Ala Phe Trp Tyr Ser Asp

                  335                 340                 345

  Pro Ser Ser Gly Val Pro Asp Leu Gln Phe His Phe Leu Ala Glu

                  350                 355                 360

  Ala Gly Ala Glu Ala Gly Val Thr Ser Val Pro Lys Gly Ala Ser

                  365                 370                 375

  Gly Ile Thr Leu Asn Ser Tyr Val Leu Arg Pro Lys Ser Arg Gly

                  380                 385                 390

  Thr Val Arg Leu Arg Ser Ala Asp Pro Arg Val Asn Pro Met Val

                  395                 400                 405

  Asp Pro Asn Phe Leu Gly Asp Pro Ala Asp Leu Glu Thr Ser Ala

                  410                 415                 420

  Glu Gly Val Arg Leu Ser Tyr Glu Met Phe Ser Gln Pro Ser Leu

                  425                 430                 435

  Glu Lys His Ile Arg Lys Thr Cys Phe Phe Ser Gly Lys Gln Pro

                  440                 445                 450

  Thr Met Gln Met Tyr Arg Asp Tyr Ala Arg Glu His Gly Arg Thr

                  455                 460                 465

  Ser Tyr His Pro Thr Cys Thr Cys Lys Met Gly Arg Asp Asp Met

                  470                 475                 480

  Ser Val Val Asp Pro Arg Leu Lys Val His Gly Leu Glu Gly Ile

                  485                 490                 495

  Arg Ile Cys Asp Ser Ser Val Met Pro Ser Leu Leu Gly Ser Asn

                  500                 505                 510

  Thr Asn Ala Ala Thr Ile Met Ile Ser Glu Arg Ala Ala Asp Phe

                  515                 520                 525

  Ile Gln Gly Asn Ala

                  530顺序：No：2顺序长度：497顺序类型：氨基酸拓扑学：线形顺序种类：肽起源

微生物：氧化葡糖杆菌

菌株：  T-100顺序特征

测定特征的方法：E顺序

  Asn Val Val Ser Lys Thr Val Ser Leu Pro Leu Lys Pro Arg Glu

    1               5                  10                  15

  Phe Gly Phe Phe lle Asp Gly Glu Trp Arg Ala Gly Lys Asp Phe

                   20                  25                  30

  Phe Asp Arg Ser Ser Pro Ala His Asp Val Pro Val Thr Arg Ile

                   35                  40                  45Pro Arg Cys Thr Arg Glu Asp Leu Asp Glu Ala Val Ala Ala Ala

             50                  55                  60Arg Arg Ala Phe Glu Asn Gly Ser Trp Ala Gly Leu Ala Ala Ala

             65                  70                  75Asp Arg Ala Ala Val Leu Leu Lys Ala Ala Gly Leu Leu Arg Glu

             80                  85                  90Arg Arg Asp Asp Ile Ala Tyr Trp Glu Val Leu Glu Asn Gly Lys

             95                 100                 105Pro Ile Ser Gln Ala Lys Gly Glu Ile Asp His Cys IIe Ala Cys

            110                 115                 120Phe Glu Met Ala Ala Gly Ala Ala Arg Met Leu His Gly Asp Thr

            125                 130                 135Phe Asn Asn Leu Gly Glu Gly Leu Phe Gly Met Val Leu Arg Glu

            145                 145                 150Pro Ile Gly Val Val Gly Leu Ile Thr Pro Trp Asn Phe Pro Phe

            155                 160                 165Met Ile Leu Cys Glu Arg Ala Pro Phe Ile Leu Ala Ser Gly Cys

            170                 175                 180Thr Leu Val Val Lys Pro Ala Glu Val Thr Ser Ala Thr Thr Leu

            185                 190                 195Leu Leu Ala Glu Ile Leu Ala Asp Ala Gly Leu Pro Lys Gly Val

            200                 205                 210Phe Asn Val Val Thr Gly Thr Gly Arg Thr Val Gly Gln Ala Met

            215                 220                 225Thr Glu His Gln Asp Ile Asp Met Leu Ser Phe Thr Gly Ser Thr

            230                 235                 240Gly Val Gly Lys Ser Cys Ile His Ala Ala Ala Asp Ser Asn Leu

            245                 250                 255Lys Lys Leu Gly Leu Glu Leu Gly Gly Lys Asn Pro Ile Val Val

            260                 265                 270Phe Ala Asp Ser Asn Leu Glu Asp Ala Ala Asp Ala Val Ala Phe

            275                 280                 285Gly Ile Ser Phe Asn Thr Gly Gln Cys Cys Val Ser Ser Ser Arg

            290                 295                 300Leu Ile Val Glu Arg Ser Val Ala Glu Lys Phe Glu Arg Leu Val

            305                 310                 315Val Pro Lys Met Glu Lys Ile Arg Val Gly Asp Pro Phe Asp Pro

            320                 325                 330Glu Thr Gln Ile Gly Ala Ile Thr Thr Glu Ala Gln Asn Lys Thr

            335                 340                 345Ile Leu Asp Tyr Ile Ala Lys Gly Lys Ala Glu Gly Ala Lys Leu

            350                 355                 360Leu Cys Gly Gly Gly Ile Val Asp Phe Gly Lys Gly Gln Tyr Ile

            365                 370                 375Gln Pro Thr Leu Phe Thr Asp Val Lys Pro Ser Met Gly Ile Ala

            380                 385                 390Arg Asp Glu Ile Phe Gly Pro Val Leu Ala Ser Phe His Phe Asp

            395                 400                 405Thr Val Asp Glu Ala Ile Ala Ile Ala Asn Asp Thr Val Tyr Gly

            410                 415                 420Leu Ala Ala Ser Val Trp Ser Lys Asp Ile Asp Lys Ala Leu Ala

            425                 430                 435

  Val Thr Arg Arg Val Arg Ala Gly Arg Phe Trp Val Asn Thr Ile

                  440                 445                 450

  Met Ser Gly Gly Pro Glu Thr Pro Leu Gly Gly Phe Lys Gln Ser

                  455                 460                465

  Gly Trp Gly Arg Glu Ala Gly Leu Tyr Gly Val Glu Glu Tyr Thr

                  470                 475                480

  Gln Ile Lys Ser Val His Ile Glu Thr Gly Lys Arg Ser His Trp

                  485                 490                495

  Ile Ser顺序：No：3顺序长度：1596顺序类型：核酸链型：双链拓扑学：线形顺序种类：基因组DNA起源

微生物：氧化葡糖杆菌

菌株：  T-100顺序特征

表示特征的符号：CDS

位置：4..1593

测定特征的方法：E顺序ATGACGAGCG GTTTTGATTA CATCGTTGTC GGTGGCGGTT CGGCTGGCTG TGTTCTCGCA   60GCCCGCCTTT CCGAAAATCC TTCCGTCCGT GTCTGTCTCA TCGAGGCGGG CCGGCGGGAC  120ACGCATCCCC TGATCCACAT GCCGGTCGGT TTCGCGAAGA TGACCACGGG GCCGCATACC  180TGGGATCTTC  TGACGGAGCC  GCAGAAACAT  GCGAACAACC  GCCAGATCCC  CTATGTGCAG     240GGCCGGATTC  TGGGCGGCGG  ATCGTCCATC  AACGCGGAAG  TCTTCACGCG  GGGACACCCT     300TCCGACTTCG  ACCGCTGGGC  GGCGGAAGGT  GCGGATGGCT  GGAGCTTCCG  GGATGTCCAG     360AAGTACTTCA  TCCGTTCCGA  AGGCAATGCC  GTGTTTTCGG  GCACCTGGCA  TGGCACGAAC     420GGGCCGCTCG  GGGTGTCCAA  CCTCGCGGAG  CCGAACCCGA  CCAGCCGTGC  CTTCGTGCAG     480AGCTGTCAGG  AAATGGGGCT  GCCCTACAAC  CCTGACTTCA  ACGGCGCATC  GCAGGAAGGC     540GCAGGCATCT  ATCAGATGAC  GATCCGCAAC  AACCGGCGCT  GCTCGACGGC  TGTGGGGTAT     600CTGCGTCCGG  CTCTGGGGCG  GAAGAACCTG  ACGGTTGTGA  CGCGGGCGCT  GGTCCTGAAG     660ATCGTCTTCA  ACGGAACGCG  GGCGACGGGC  GTGCAGTATA  TCGCCAACGG  CACCCTGAAT     720ACCGCCGAAG  CGAGCCAGGA  AATCGTTGTG  ACGGCCGGAG  CGATCGGAAC  GCCGAAGCTG     780ATGATGCTGT  CGGGCGTCGG  GCCTGCCGCG  CATCTTCGCG  AAAATGGTAT  CCCGGTCGTG     840CAGGATCTGC  CGGGCGTGGG  CGAGAACCTT  CAGGATCATT  TCGGTGTGGA  TATCGTAGCC     900GAGCTCAAGA  CGGATGAGAG  CTTCGACAAG  TACCGGAAAC  TGCACTGGAT  GCTGTGGGCA     960GGTCTTGAAT  ATACCATGTT  CAGATCCGGT  CCCGTTGCAT  CCAACGTGGT  TGAGGGCGGC    1020GCGTTCTGGT  ACTCGGACCC  GTCATCGGGT  GTTCCTGATC  TCCAGTTCCA  TTTTCTTGCG    1080GAGGCTGGGG  CTGAGGCTGG  AGTGACGTCC  GTTCCCAAGG  GAGCGTCCGG  GATTACGCTG    1140AACAGCTATG  TGCTGCGTCC  GAAGTCTCGT  GGAACTGTCC  GGCTGCGTTC  GGCAGATCCA    1200AGGGTCAATC  CGATGGTCGA  TCCCAATTTC  CTTGGAGACC  CGGCCGACCT  TGAGACGTCT    1260GCGGAAGGTG  TGCGCCTGAG  CTACGAGATG  TTCTCCCAGC  CGTCTTTGGA  GAAGCACATC    1320CGGAAAACCT  GTTTCTTTAG  CGGTAAACAG  CCGACGATGC  AGATGTATCG  GGACTATGCG    1380CGGGAACATG  GCCGGACGTC  CTATCATCCG  ACATGCACCT  GCAAGATGGG  TCGTGATGAC    1440ATGTCCGTCG  TCGATCCGCG  TCTGAAGGTT  CATGGCCTTG  AGGGCATCAG  GATCTGTGAC    1500AGTTCGGTTA  TGCCGTCGCT  GCTCGGTTCC  AACACCAATG  CTGCGACGAT  CATGATCAGT    1560GAGCGGGCAG  CGGATTTCAT  TCAGGGGAAC  GCCTGA                                1596顺序：No：4顺序长度：1497顺序类型：核酸链型：双链拓扑学：线形顺序种类：基因组DNA起源

微生物：氧化葡糖杆菌

菌株：  T-100顺序特征

表示特征的符号：CDS

位置：4..1494

测定特征的方法：E顺序ATGAATGTTG  TCTCAAAGAC  TGTATCTTTA  CCGTTAAAGC  CGCGTGAGTT  CGGATTCTTT     60ATTGATGGAG  AATGGCGCGC  AGGTAAGGAT  TTCTTCGATC  GTTCCTCGCC  GGCTCATGAT    120GTTCCCGTCA  CCCGTATTCC  ACGCTGCACC  CGTGAAGACC  TTGATGAGGC  AGTCGCTGCT    180GCACGTCGTG  CTTTCGAGAA  CGGAAGCTGG  GCGGGTCTGG  CAGCCGCGGA  TCGTGCGGCG    240GTTCTTCTGA  AAGCCGCGGG  CCTTCTGCGC  GAGCGCCGTG  ATGACATCGC  TTACTGGGAA    300GTTCTCGAAA  ACGGGAAGCC  CATCAGCCAG  GCGAAAGGTG  AGATCGATCA  CTGTATCGCC    360TGTTTCGAGA  TGGCGGCCGG  CGCTGCGCGG  ATGCTGCATG  GTGATACGTT  CAACAATCTG    420GGCGAGGGGC  TGTTTGGCAT  GGTCCTGCGG  GAGCCCATCG  GTGTCGTCGG  TCTGATTACG    480CCGTGGAACT  TCCCGTTCAT  GATCCTGTGT  GAGCGGGCGC  CTTTCATTCT  CGCATCCGGC    540TGCACGCTGG  TCGTCAAGCC  TGCCGAAGTC  ACGAGTGCCA  CGACCCTTCT  TCTGGCAGAA    600ATCCTTGCCG  ATGCCGGGCT  GCCGAAGGGT  GTCTTCAATG  TCGTGACAGG  CACGGGGCGC    660ACGGTCGGTC  AGGCCATGAC  CGAGCATCAG  GATATCGACA  TGCTGTCCTT  CACGGGCTCC    720ACGGGCGTCG  GCAAGTCCTG  TATCCACGCG  GCGGCTGACA  GCAACCTGAA  GAAACTTGGC    780CTCGAACTGG  GCGGCAAGAA  CCCGATTGTC  GTGTTCGCTG  ACAGCAACCT  TGAGGATGCG    840GCCGACGCGG  TAGCCTTCGG  GATCAGCTTT  AATACCGGGC  AGTGCTGTGT  GTCGTCGAGC    900CGCGTGATCG  TAGAGCGGTC  CGTGGCGGAG  AAGTTCGAGC  GCCTCGTCGT  GCCAAAAATG    960GAGAAGATCC  GCGTTGGTGA  TCCGTTTGAT  CCCGAAACGC  AGATTGGCGC  CATCACGACG    1020GAAGCGCAGA  ACAAGACCAT  TCTGGACTAT  ATCGCGAAAG  GCAAGGCCGA  GGGCGCCAAG    1080CTGCTCTGTG  GTGGCGGGAT  CGTCGATTTC  GGCAAGGGAC  AGTATATCCA  GCCCACGCTT    1140TTCACGGATG  TGAAGCCCTC  GATGGGCATC  GCGCGTGACG  AGATTTTTGG  GCCGGTTCTG    1200GCGTCCTTCC  ACTTCGATAC  CGTCGATGAG  GCGATCGCGA  TTGCCAATGA  CACGGTTTAC    1260GGCTTGGCCG  CATCGGTCTG  GAGCAAGGAT  ATCGACAAGG  CGCTTGCCGT  GACCCGTCGT    1320GTTCGTGCCG  GCCGCTTCTG  GGTGAACACC  ATCATGAGCG  GTGGTCCCGA  GACGCCGCTG    1380GGTGGTTTCA  AGCAGTCGGG  CTGGGGCCGT  GAGGCCGGTC  TGTACGGCGT  TGAGGAATAT    1440ACGCAGATCA  AATCTGTCCA  TATCGAAACT  GGCAAACGTT  CGCACTGGAT  TTCGTAA       1497

Claims (7)

1.一种L-山梨糖脱氢酶，其所具有的氨基酸顺序示于说明书中顺序目录，顺序No.1。

2.一种编码权利要求1 L-山梨糖脱氢酶的DNA。

3.权利要求2的DNA，其所具有的核苷酸顺序示于说明书中顺序目录，顺序No.3。

4.一种含有至少一种选自权利要求2和权利要求3的DNA的表达载体。

5.一种由权利要求4表达载体所转化的(转染的)宿主细胞。

6.权利要求5的宿主细胞，该细胞为大肠杆菌。

7.一种制备权利要求1的L-山梨糖脱氢酶的方法，该方法包括在一种培养基中培养权利要求5或权利要求6的宿主细胞并从得到的培养物中回收L-山梨糖脱氢酶。

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