CN1340101A - 新型红球菌属细菌、源自于红球菌属细菌的腈水解酶基因、腈水合酶基因和酰胺酶基因,以及利用它们生产羧酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型红球菌属细菌,以及用新型红球菌属细菌水解腈化合物之氰基来生产相应羧酸的方法。本发明还涉及用含红球菌属细菌之腈水解酶基因、腈水合酶基因和酰胺酶基因的质粒转化的转化体生产羧酸的方法,所述红球菌属细菌对芳香聚腈化合物的氰基能够显示出特别强的选择性,还涉及所述转化体,所述质粒,所述基因,用所述转化体生产所述酶的方法,和由所述方法获得的酶。由本发明获得的羧酸,特别是氰基羧酸被用作合成药物、农业化学剂、染料和其它化学品的起始物。

Description

新型红球菌属细菌、源自于红球菌属细菌的 腈水解酶基因、腈水合酶基因和酰胺酶 基因，以及利用它们生产羧酸的方法
相关申请的交叉参考
本申请基于35 U.S.C.第111(a)款的规定要求享有在2000年2月22日申请的且序号为60/183，754的美国临时申请的申请日的权利以及按照35U.S.C.第111(e)(i)款的规定，在35 U.S.C.第111(b)款规定的基础上要求享有在2000年2月22日申请的且序号为60/183，821的美国临时申请的申请日的权利。
技术领域
本申请涉及一种新型红球菌属细菌和利用新型红球菌属细菌水解腈化合物的氰基来生产相应羧酸的方法。本申请还涉及一种生产羧酸的方法，特别涉及利用由含有源自于对芳香聚腈化合物的氰基具有特别强的位置选择性的红球菌属细菌的腈水解酶基因、腈水合酶基因和酰胺酶基因的质粒转化的转化体生产氰基羧酸的方法，还涉及所述转化体，所述质粒，所述基因，利用所述转化体生产酶的方法和通过该方法获得的酶。通过本发明获得的羧酸，特别是氰基羧酸被用作合成药物、农用化学品、染料和其它化学品的起始物。
背景技术
针对水解腈化合物的氰基来获得相应羧酸的反应进行了大量研究，因为这是获得羧酸的简单易行的方法。
关于只水解一个分子具有多个氰基的聚腈化合物的部分氰基来获得相应氰基羧酸的生物反应，特别是，关于通过选择性水解芳香聚腈化合物的一个特定氰基来获得芳香氰基羧酸的方法，已有许多有关利用微生物反应特异性的报道。例如，US4629700公开了一种利用红球菌属细菌由邻苯二甲腈生产氰基苯甲酸的方法。又例如，EP178106公开了一种利用革兰氏阳性菌的四个属其包括红球菌属、通过选择性水解聚腈化合物的氰基来生产氰基羧酸和氰基羧酸酰胺的方法。
为了进行反应，必需一个复杂的过程如特定氰基的保护，所以化学合成中的氰基选择性水解反应通常不适合于实际应用。
生物反应通常被公认为具有高选择性。然而，严格检测后发现，许多情况下，由于副反应的发生伴随有杂质的产生。例如，按照上述利用红球菌由邻苯二甲腈生产氰基苯甲酸的方法，选择性不是100％，而反应伴随有在邻苯二甲腈中产生1.0％至百分之几的副产物。从起始物转化的角度来看，这可以被认为是一个很好的方法。然而，在合成药物或优质化学品时，少量副产品严重地影响了利用含有该副产品的起始物合成的物质的性能或安全性。因此，上述选择性对于这一领域的起始物不够高。
为了检测产物的纯度，可以考虑用一种获得产物并继而进一步纯化它的方法。然而，例如，在由芳香聚腈生产氰基羧酸的生物学方法中产生的各种副产物在物理性质如沸点和疏水性方面彼此非常相近，因而通过一般使用的纯化方法如蒸馏、萃取和盐析不能获得完全的分离。
因此，在利用微生物通过腈化合物的水解反应生产羧酸的常规方法中，水解反应本身的选择性不高并且副产物的产量没有被充分地降低。
通过水解腈化合物生产羧酸的替代方法包括利用腈水解酶或腈水合酶和酰胺酶的酶反应方法。
腈水解酶是一种催化由腈化合物转化为羧酸的反应的酶并且这是用于获得作为医药和农业化学品制剂的原料的羧酸的有效手段。产生这种酶的微生物实例包括茄病镰孢(Fusarium solani)(见，生物化学杂志，167，685-692(1977))，诺卡氏菌属的菌(Nocardia sp.)(见，国际生物化学杂志(Int.J.Biochem.)，17，677-683(1985))，节杆菌属的菌(Arthrobacter sp.)(见，应用环境微生物学，51，302-306(1986))，玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)JI(见，欧洲生物学杂志，182，349-356(1989))，玫瑰色红球菌K-22(见，细菌学杂志，172，4807-4815(1990))，玫瑰色红球菌PA-34(见，应用微生物生物技术，37，184-190(1992))和红球菌ATCC39484(见，生物技术应用生物化学，15，283-302 sp.(1992))。
可从这些微生物产生腈水解酶、腈水合酶或酰胺酶。为了在遗传工程中使用这些酶，已分离这些酶中的一些酶基因并且测定它们的一级结构。有关腈水解酶的基因，从红球菌属细菌中的基因，例如，在JP-A-7-99980(本文使用的术语“JP-A”表示未审日本专利申请，首次公开)和JP-A-9-28382中。
近年来，进行了利用这些微生物具有的转化腈化合物的活性的尝试。尤其是，为了生产具有高增加值的化合物，需要具有高的空间选择性或位置选择性的酶。例如，JP-A-2-84198公开了用于生产光学活性的α-取代型有机酸的微生物，JP-A-4-341185公开了用于生产光学活性的2-羟基羧酸的微生物和EPO433117公开了用于生产光学活性的酮洛芬(ketoprofen)的微生物。
在这些微生物中，据报道红球菌属的ATCC39484菌株具有很高位置选择性地水解含有多个氰基的芳香聚腈化合物(见美国专利556,625)。通过这种选择性腈降解酶***生产的分子中含有一个氰基和一个羧基的化合物作为一种生产医药或农业化学品制剂的合成物料(block)是非常有效的。然而，这种微生物的腈水解酶对芳香聚腈化合物的活性较低并且为了在工业中应用这一特性，有必要改善催化该反应的酶的产率。然而，在所需修饰中必需的这种微生物的腈水解酶的基因还不明确。
腈水合酶和酰胺酶分别是催化腈化合物向酰胺转化的反应和酰胺向羧酸转化的反应的酶。通过利用腈水合酶和酰胺酶，用作医药、农业化学品等的起始物的酰胺和酸酸可由腈化合物获得。通过利用生物催化剂研究出了将腈化合物转化成相应的酰胺或羧酸的方法，并且报道了许多具有这种催化活性的微生物(见JP-B-56-17918(本文使用的术语“JP-B”表示审查过的日本专利申请，第二次公开)、JP-B-59-037951、JP-B-61-162193、JP-B-61-021519、JP-B-64-086889、JP-B-4-197189、JP-B-2-000470、EP0444640等)。
从这些微生物中纯化出腈水合酶和酰胺酶或腈水解酶，并且为了进一步在遗传工程中使用这些基因，分离出基因并测定它们的一级结构。有关腈水合酶基因，例如，源自于红球菌属细菌的基因在US2840253和EP0445646(JP-A-40211379)中被公开，源自于假单胞菌属(Pseudomonas)细菌的基因在JP-A-30251184中被公开，源自于根瘤菌属(Phizobium)细菌的基因在JP-A-6-025296和JP-A-6-303971中被公开。另外，有关酰胺酶基因，例如，源自于短杆菌属(Brevibacterium)细菌的基因和源自于红球菌的基因在EP0433117中被公开。而且欧洲生物化学杂志，217(1)，327-336(1993)报道了源自于红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)的基因和FEBS Lett，367，275-279(1995)报道了源自于假单胞菌属细菌的基因。
而且，JP-A-5-068566公开了一个涉及含有源自于红球菌属细菌的腈水合酶基因和酰胺酶基因的重组质粒的发明。
近年来，进行了利用这些微生物具有地转化腈化合物能力的尝试。尤其是，为了生产具有高增加值的化合物，需要具有高的空间选择性或位置选择性的酶。例如，JP-A-2-84198公开了用于生产光学活性的α-取代型有机酸的微生物，JP-A-4-341185公开了用于生产光学活性的2-羟基羧酸的微生物和EPO433117公开了用于生产光学活性的酮洛芬的微生物。
在这些微生物中，据报道红球菌ATCC39484菌株能以极高的位置选择性水解含有多个氰基的芳香聚腈化合物(见美国专利556,625)。通过这种选择性腈降解酶***生产的分子中含有一个氰基和一个酰胺基的化合物或分子中含有一个氰基和一个羧基的化合物作为生产医药或农业化学品制剂的合成物料是非常有效的。然而，这种微生物的腈水解酶对于芳香聚腈化合物的活性较低并且为了在工业中应用这一特性，有必要改善催化该反应的酶的产率。然而，在所需修饰中必需的这种微生物的有关腈水合酶和酰胺酶的基因还不明确。
发明内容
考虑到上述问题，本发明的目的是提供一种生产羧酸的方法，其中水解反应比常规的方法享有较高的产率并降低了副产品的量，本发明还提供了一种生产氰基羧酸的方法，包括选择性地只水解聚腈化合物的一个特定氰基来生产相应的氰基羧酸，其中水解反应比常规的方法享有较高的产率并降低了副产品的量，本发明还提供一种催化上述反应的微生物变体。
本发明的另一个目的是提供源自于红球菌属细菌的一种新型腈水解酶基因、腈水合酶基因和酰胺酶基因。本发明的另外一个目的是提供一种由腈化合物生产羧酸的方法，其中通过遗传工程技术将所述基因***质粒，然后用这些质粒转化的转化体来生产。另外本发明的另一个目的是提供所述转化体，所述质粒，所述基因，利用所述转化体生产酶的方法，和通过该方法获得的酶。
为了充分降低通过微生物进行的氰基常规水解反应过程中发生副反应所产生的副产物，本发明人进行了广泛的研究。尤其是，对在多种由邻苯二甲腈生产氰基苯甲酸的已知技术中产生的副产物进行了精确的分析，结果发现这种反应中产生的副产物主要是氰基苯甲酰胺和进一步由氰基苯甲酰胺水解生成的苯二甲酸单酰胺。还发现当反应中使用了将腈转化为酰胺的功能缺陷或降低的微生物时，能够很大程度地减少副产物。
例如，从Kobayashi等(Nippon Nogeikagaku Kaishi(日本生物科学，生物技术和农业化学协会)，71卷，12期(1997))等的报告中得知通过微生物水解腈化合物的氰基来生成羧酸的反应中存在两条途径，(1)由腈水解酶催化的一步反应途径和(2)由腈水合酶和酰胺酶两种酶催化的途经酰胺形式的两步反应途径。
本发明人特别研究了用于通过红球菌ATCC39484菌株由聚腈化合物向氰基羧酸转化过程中的反应途径，所述红球菌ATCC39484菌株是已知的腈转化细菌。这个菌株被证明在细胞悬浮液中引起反应因而由邻苯二甲腈产生主要产物氰基苯甲酸并且同时产生副产物氰基苯甲酰胺和苯二甲酸单酰胺。对此进行了进一步的研究，分析结果是上述两种途径在通过该微生物水解邻苯二甲腈的过程中竞争性地发挥作用。由此，本发明人得出结论尽管认为酰胺途径的功能对于通过腈水解生产羧酸是有用的，但是通过进一步使得该功能缺陷或降低，所述副产物，尤其是由氰基苯甲酰胺和由氰基苯甲酰胺水解生成的苯二甲酸单酰胺能被同时除去或减少。
用常规方法中的NTG(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)，由母本菌株ATCC39484形成变异菌株群。基于上述途经酰胺形式的两步途径是处于一系列的调控之下的假设，对这些变异群进行筛选，筛选的目标是在以苯甲酰胺作为唯一碳/氮源时不能生长。结果，获得了许多非-生长菌株并且进行上述反应。然后，得到了能够大大降低邻苯二甲腈反应中氰基苯甲酰胺和苯二甲酸单酰胺的产生的微生物并被命名为SD826菌株。这一收获导致了本发明的完成。
本发明的一个实施方案提供了一种生产羧酸的方法，包括利用微生物将腈化合物的至少一个氰基转化为羧基，其中使用了转化氰基为酰胺基的活性缺陷或降低的微生物变体。
微生物变体可以是属于红球菌属的细菌的变异菌株。而且，红球菌属细菌的变异菌株可以是母本菌株红球菌ATCC39484菌株的变异菌株。而且，在一个优选的实施方案中，母本菌株红球菌ATCC39484菌株的变异菌株可以是红球菌SD826菌株(FERM BP-7305)。
在上述方法中，腈化合物可以是分子中具有多个氰基的聚腈化合物，羧酸可以是一种氰基羧酸。在一个优选的实施方案中，聚腈化合物是一种芳香聚腈化合物，氰基羧酸是一种芳香氰基羧酸。更优选地是，芳香聚腈化合物是邻苯二甲腈、间苯二氰或对苯二腈，芳香氰基羧酸是邻氰基苯甲酸、间氰基苯甲酸或对氰基苯甲酸。
本发明的另一个实施方案提供了一种具有将氰基转化为羧基的活性并且将氰基转化为酰胺基的活性缺陷或降低的微生物变体。该变异菌株可以是属于红球菌属的变异菌株。在一个优选的实施方案中，微生物变体是红球菌ATCC39383菌株的变异菌株。
本发明的另一个实施方案提供红球菌SD826(FERM BP-7305)菌株。红球菌SD826于1999年10月12日被保藏在日本通商产业省，工业技术院，生命科学和人类—技术国立研究所(1-3，Higashi 1-chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken，日本)(保藏登记号：FERM BP-7305)。
本发明的另一个实施方案提供了一种生产羧酸的方法，包括利用被含有源自于红球菌属细菌的腈水解酶基因的质粒转化了的转化体将腈化合物的氰基转化为羧基，所述腈水解酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的DNA序列组成。
本发明的另一个实施方案提供了一种生产羧酸的方法，包括利用被含有源自于红球菌属细菌的腈水解酶基因的质粒转化了的转化体将腈化合物的氰基转化为羧基，所述腈水解酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的DNA序列组成。
本发明的另一个实施方案提供了一种生产氰基羧酸的方法，包括利用上述转化体将聚腈化合物的至少一个氰基转化为羧基。
在这些生产方法中，聚腈化合物可以是一种芳香聚腈化合物。优选地，芳香聚腈化合物可以是邻苯二甲腈、间苯二氰或对苯二腈，并且氰基羧酸可以是邻-氰基苯甲酸、间-氰基苯甲酸或对-氰基苯甲酸。
本发明的另一个实施方案提供了一种被含有源自于红球菌属细菌的腈水解酶基因的质粒转化了的转化体，所述腈水解酶基因由编码序列表中SEQID NO 2所示氨基酸序列的DNA序列组成，该转化体被用于上述方法中。
本发明的另一个实施方案提供了一种被含有源自于红球菌属细菌的腈水解酶基因的质粒转化了的转化体，所述腈水解酶基因由序列表中SEQ IDNO 1所示DNA序列组成，该转化体被用于上述生产方法中。
本发明的另一个实施方案提供了一种含有源自于红球菌属细菌的腈水解酶基因的质粒，所述腈水解酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的DNA序列组成，该质粒被用于制备上述转化体。
本发明的另一个实施方案提供了一种含有源自于红球菌属细菌的腈水解酶基因的质粒，所述腈水解酶基因由序列表中SEQ ID NO 1所示DNA序列组成，该质粒被用于制备上述转化体。
本发明的另一个实施方案提供了一种源自于红球菌属细菌的腈水解酶基因，所述腈水解酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的DNA序列组成。
本发明的另一个实施方案提供了一种源自于红球菌属细菌的腈水解酶基因，所述腈水解酶基因由序列表中SEQ ID NO 1所示DNA序列组成。
红球菌属细菌可以是红球菌ATCC39484菌株。
本发明的另一个实施方案提供了一种生产腈水解酶的方法，包括在培养基中培养上述转化体并从培养物中收集腈水解酶。
本发明的另一个实施方案提供了一种通过上述方法制备的腈水解酶。
本发明的另一个实施方案提供了一种生产酰胺化合物的方法，包括利用被含有源自于红球菌属细菌的腈水合酶基因的质粒转化了的转化体将腈化合物的氰基转化为酰胺基，所述腈水合酶基因由编码序列表中SEQ ID NO4和5所示氨基酸序列的DNA序列组成。
本发明的另一个实施方案提供了一种生产酰胺化合物的方法，包括利用被含有源自于红球菌属细菌的腈水合酶基因的质粒转化了的转化体将腈化合物的氰基转化为酰胺基，所述腈水合酶基因由序列表中SEQ ID NO 3所示DNA序列组成。
本发明的另一个实施方案提供了一种生产羧酸的方法，包括利用被含有源自于红球菌属细菌的酰胺酶基因的质粒转化了的转化体将酰胺化合物的酰胺基转化为羧基，所述酰胺酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 7所示氨基酸序列的DNA序列组成。
本发明的另一个实施方案提供了一种生产羧酸的方法，包括利用被含有源自于红球菌属细菌的酰胺酶基因的质粒转化了的转化体将酰胺化合物的酰胺基转化为羧基，所述酰胺酶基因由序列表中SEQ ID NO 6所示DNA序列组成。
本发明的另一个实施方案提供了一种生产羧酸的方法，包括利用被含有源自于红球菌属细菌的腈水合酶基因和源自于红球菌属细菌的酰胺酶基因的质粒转化了的转化体将腈化合物的氰基转化为羧基，所述腈水合酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 4和/或5所示氨基酸序列的DNA序列组成，所述酰胺酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 7所示氨基酸序列的DNA序列组成。
本发明的另一个实施方案提供了一种生产羧酸的方法，包括利用被含有源自于红球菌属细菌的腈水合酶基因和源自于红球菌属细菌的酰胺酶基因的质粒转化了的转化体将腈化合物的氰基转化为羧基，所述腈水合酶基因由序列表中SEQ ID NO 3所示DNA序列组成，所述酰胺酶基因由序列表中SEQ ID NO 6所示DNA序列组成。
本发明的另一个实施方案提供了一种生产酰胺化合物的方法，其中腈是邻苯二甲腈、间苯二氰或对苯二腈，并且酰胺化合物是邻-氰基苯甲酰胺、间-氰基苯甲酰胺或对-氰基苯甲酰胺。
上述生产方法中，酰胺化合物可以是邻-氰基苯甲酰胺、间-氰基苯甲酰胺或对-氰基苯甲酰胺，并且羧酸可以是邻-、间-或对-氰基苯甲酸。腈可以是邻苯二甲腈、间苯二氰或对苯二腈，并且羧酸可以是邻-、间-或对-氰基苯甲酸。
本发明的另一个实施方案提供了一种被含有源自于红球菌属细菌的腈水合酶基因的质粒转化了的转化体，所述腈水合酶基因由编码序列表中SEQID NO 4和/或5所示氨基酸序列的DNA序列组成，该转化体被用于上述方法中。
本发明的另一个实施方案提供了一种被含有源自于红球菌属细菌的腈水合酶基因的质粒转化了的转化体，所述腈水合酶基因由序列表中SEQ IDNO 3所示DNA序列组成，该转化体被用于上述方法中。
本发明的另一个实施方案提供了一种被含有源自于红球菌属细菌的酰胺酶基因的质粒转化了的转化体，所述酰胺酶基因由编码序列表中SEQ IDNO 7所示氨基酸序列的DNA序列组成，该转化体被用于上述方法中。
本发明的另一个实施方案提供了一种被含有源自于红球菌属细菌的酰胺酶基因的质粒转化了的转化体，所述酰胺酶基因由序列表中SEQ ID NO 6所示DNA序列组成，该转化体被用于上述方法中。
本发明的另一个实施方案提供了一种被含有源自于红球菌属细菌的腈水合酶基因和源自于红球菌属细菌的酰胺酶基因的质粒转化了的转化体，所述腈水合酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 4和5所示氨基酸序列的DNA序列组成，所述酰胺酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 7所示氨基酸序列的DNA序列组成，该转化体被用于上述方法中。
本发明的另一个实施方案提供了一种被含有源自于红球菌属细菌的腈水合酶基因和源自于红球菌属细菌的酰胺酶基因的质粒转化了的转化体，所述腈水合酶基因由序列表中SEQ ID NO 3所示DNA序列组成，所述酰胺酶基因由序列表中SEQ ID NO 6所示DNA序列组成，该转化体被用于上述方法中。
本发明的另一个实施方案提供了一种含有源自于红球菌属细菌的腈水合酶基因的质粒，所述腈水合酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 4和5所示氨基酸序列的DNA序列组成，该质粒被用于制备上述转化体。
本发明的另一个实施方案提供了一种含有源自于红球菌属细菌的腈水合酶基因的质粒，所述腈水合酶基因由序列表中SEQ ID NO 3所示DNA序列组成，该质粒被用于制备上述转化体。
本发明的另一个实施方案提供了一种含有源自于红球菌属细菌的酰胺酶基因的质粒，所述酰胺酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 7所示氨基酸序列的DNA序列组成，该质粒被用于制备上述转化体。
本发明的另一个实施方案提供了一种含有源自于红球菌属细菌的酰胺酶基因的质粒，所述酰胺酶基因由序列表中SEQ ID NO 6所示DNA序列组成，该质粒被用于制备上述转化体。
本发明的另一个实施方案提供了一种含有源自于红球菌属细菌的腈水合酶基因和源自于红球菌属细菌的酰胺酶基因的质粒，所述腈水合酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 4和/或5所示氨基酸序列的DNA序列组成，所述酰胺酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 7所示氨基酸序列的DNA序列组成，该质粒被用于制备上述转化体。
本发明的另一个实施方案提供了一种含有源自于红球菌属细菌的腈水合酶基因和源自于红球菌属细菌的酰胺酶基因的质粒，所述腈水合酶基因由序列表中SEQ ID NO 3所示DNA序列组成，所述酰胺酶基因由序列表中SEQ ID NO 6所示DNA序列组成，该质粒被用于制备上述转化体。
本发明的另一个实施方案提供了一种源自于红球菌属细菌的腈水合酶基因，所述腈水合酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 4和5所示氨基酸序列的DNA序列组成。
本发明的另一个实施方案提供了一种源自于红球菌属细菌的腈水合酶基因，所述腈水合酶基因由序列表中SEQ ID NO 3所示DNA序列组成。
红球菌属细菌可以是红球菌ATCC39484菌株。
本发明的另一个实施方案提供了一种源自于红球菌属细菌的酰胺酶基因，所述酰胺酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 7所示氨基酸序列的DNA序列组成。
本发明的另一个实施方案提供了一种源自于红球菌属细菌的酰胺酶基因，所述酰胺酶基因由序列表中SEQ ID NO 6所示DNA序列组成。
红球菌属细菌可以是红球菌ATCC39484菌株。
本发明的另一个实施方案提供了一种生产腈水合酶的方法，包括在培养基中培养上述转化体并从培养物中收集腈水合酶。
本发明的另一个实施方案提供了一种生产酰胺酶的方法，包括在培养基中培养上述转化体并从培养物中收集酰胺酶。
本发明的另一个实施方案提供了一种生产腈水合酶和/或酰胺酶的方法，包括在培养基中培养上述转化体并从培养物中收集腈水合酶和/或酰胺酶。
本发明的另一个实施方案提供了通过上述生产方法制备的腈水合酶。
本发明的另一个实施方案提供了通过上述方法制备的酰胺酶。
本发明的另一个实施方案提供了通过上述方法制备的腈水合酶和/或酰胺酶。
根据本发明，可以用属于红球菌属的新型变体从作为起始物的腈化合物中简单并容易地获得高纯度的羧酸。还能从作为起始物的聚腈化合物，尤其是芳香聚腈化合物中简单并容易地获得高纯度的氰基羧酸。
而且，本发明提供了源自于红球菌属细菌的腈水解酶基因、腈水合酶基因和酰胺酶基因，该红球菌属细菌对芳香聚腈化合物的氰基能够显示出特别高的位置选择性。源自于红球菌属细菌的这些基因DNA序列是利用基因工程技术有效生产腈水合酶和酰胺酶和利用蛋白质工程技术改进酶所必需的。如所期望的，如此获得的酶适用于有用化合物的工业化生产。
附图说明
图1图示用菌落杂交所获阳性克隆所制备的质粒的结构(实施例4)。
图2图示腈水解酶基因表达质粒的构建。
图3图示对苯二腈向对氰基苯二甲酸转化的反应中，对氰基苯二甲酸积累曲线的比较。
图4图示由一个克隆株制备的质粒的结构。
图5图示表达质粒的构建(1)。
图6图示表达质粒的构建(2)。
本发明的优选实施方案
1.用于制备羧酸的微生物变体
作为用于本发明制备将氰基水解为酰胺基的功能缺陷或降低的微生物变体的母本菌株，可以使用多种具有水解腈化合物氰基的功能的公知微生物。尤其是，可以使用具有腈水解酶活性并能通过水合反应使得腈化合物发生产生羧酸的反应而副产物是酰胺形式的微生物。已知具有水解腈活性的微生物实例包括属于以下属的微生物如红球菌属、红酵母属(Rhodotorulla)、镰孢属、甲单胞菌属、不动杆菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、克雷伯氏杆菌属、微球菌属、伯克氏菌属(Burkholderia)、棒状杆菌属、诺卡氏菌属、气单胞菌属、土壤杆菌属、无色杆菌属、曲霉属和根瘤菌属。
例如，红球菌ATCC39484菌株通过公知的培养微生物的方法进行培养，并且提供一种公知的变异诱导化合物或紫外线作用于所获得的细胞来制备一组变异的微生物。变异诱导化合物的实例包括烷化剂如NTG(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)和EMS(甲基磺酸乙酯)，碱基类似物如5-溴尿嘧啶，和嵌入剂如重氮丝氨酸和吖啶橙。
从所制备的微生物变体中筛选由腈化合物生产酰胺化合物的活性降低或缺陷的变异菌株。菌株生产酰胺化合物的活性降低或缺陷的事实如下证实。微生物变体菌株的培养细胞被用来作用于腈化合物，通过分析方法如HPLC对获得的产物进行分析，观察随着腈化合物的降解如何产生相应的羧酸酰胺形式的情形。
此时，为了从大量的微生物变异群中有效精选目的变异菌株，在途经酰胺形式的两步途径处于一系列调控的假设基础上，本发明人认为利用通过同化能够滋养和培育母本菌株微生物的酰胺化合物例如以ATCC39484为母本菌株时的苯甲酰胺等而导致生长能力的缺失或降低来作为一系列由酰胺到羧酸的反应途径的缺失或减少的指标。通过利用这一指标的不同方法，能够从微生物群中有效精选到目的微生物变体。
本发明所使用的术语“通过同化酰胺化合物而导致生长能力的缺失或降低”的含义是在以相同的酰胺化合物作为营养源的培养物中，微生物的倍增时间几乎比母本菌株的倍增时间长出两倍多，或者微生物根本不能生长。例如，微生物变体组被平铺在普通营养琼脂培养基，例如LB培养基上，然后将形成的菌落分别移植到含有作为唯一碳/氮源的苯甲酰胺的琼脂培养基上，通过肉眼观察有或无生长，能够检测到同化苯甲酰胺的能力发生改变的变异菌株。再者，通过用称作青霉素筛选方法的技术，能够精选出利用苯甲酰胺的生长能力缺失或降低的微生物变体。更特别地是，一种作用于微生物的***和生长过程并杀死微生物的药物，例如青霉素，被加入以苯甲酰胺作为唯一碳/氮源的培养基中，将一组微生物变体接种到其中并进行培养，其中能够利用苯甲酰胺生长良好的菌株被杀死，而同化苯甲酰胺并生长的能力缺失或降低的菌株被精选出来。因此，获得了微生物变体的精选组。
每种微生物变体的培养细胞被用来作用于一种腈化合物，例如当母本菌株是ATCC39484时的邻苯二甲腈，然后通过一种分析方法如HPLC分析所得到的产品来寻找羧酸酰胺形式的积累降低的菌株。在如此精选出的微生物变体种群中，发现羧酸酰胺形式的积累降低的菌株与羧酸酰胺形式的积累增加的菌株共存。
如此创建的变异菌株的实例是红球菌SD826。红球菌SD826是一株由苯发明人从已知微生物红球菌ATC39484(来源于美国典型培养物保藏中心的菌株，并且这株新的变异菌株已被保藏在日本通商产业省，工业技术院，生命科学和人类—技术国立研究所，保藏登记号为FERM BP-7305。
例如，用于本发明的产生酰胺化物的能力缺失或降低的微生物变体可以利用遗传工程技术通过破坏或删除能对涉及酰胺化合物产生的酶进行调节的酶或因子和编码这些酶的基因区域来获得。更特别地是，按照以下方法实现。分离和分析了对所述反应起作用的酶的有关基因，引进已结合在其中的基因片段，将与该碱基序列具有同源性的序列引进微生物中，诱导染色体上的酶-有关基因间的同源重组来引起碱基序列的***或缺失。
用于本发明的微生物是那些产生酰胺化合物的能力降低或缺失的微生物。修饰操作可影响微生物的其它性能，尤其是产生羧酸的能力，所述性能被认为是相互密切相关的。然而，根据本发明的目的，可以充分肯定酰胺化合物的产量与产生的羧酸相比相对减少了。尽管希望与修饰前的母本菌株相比，这样的修饰不会引起变异菌株产生羧酸的能力的降低，但是产生羧酸的能力可能在酰胺化合物的产量相对降低的一定范围内有所变化。
本发明的反应使用了如此创建的微生物变体并能通过具有水解氰基能力的微生物以与在产生羧酸的常规反应中用的普通微生物的转化反应相同的方式进行。例如，于20至40℃，优选地25至30℃下在含1％蛋白胨等的营养培养基中培养SD826菌株约24小时。以从1ppm至50％，优选地10ppm至10％量将一种腈化合物加到所得到的培养物中，然后，在上述温度下连续搅拌该溶液1至200小时，因而完成反应。加入的全部腈化合物而被溶解。然而，也可加入能改善在反应液中的溶解性或分散性的溶剂、表面活性剂等。按照与反应进行过程中的腈化合物消耗量成比例的量，可以连续或间断地加入腈化合物。这时，反应液中的腈化合物浓度不受上述范围的限制。
作为用于培养微生物的培养基中的碳源实例包括糖类如葡萄糖、蔗糖、果糖和糖蜜，有机物质如乙醇、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸、苯甲酸和脂肪酸，及其碱金属盐，脂肪烃如n-链烷烃、芳香烃，以及天然有机物质如蛋白胨、肉浸出物、鱼浸出物、大豆粉和麸。这些物质通常以0.01至30％，优选地0.1至10％浓度单独或结合使用。
作为用于培养微生物的培养基中的氮源实例包括无机氮化合物如硫酸铵、磷酸铵、硝酸钠和硝酸钾，含氮有机物质如尿素和尿酸，以及天然的有机物质如蛋白胨、肉浸出物、鱼浸出物、大豆粉。这些物质通常以0.01至30％，优选地0.1至10％浓度单独或结合使用。优选地在培养过程中，预先加入这些用于使氰基被菌株水解为羧酸的反应的起始物质，结果随着反应的进行，通过水解分离出的铵离子能用作微生物的氮源。
而且，为了改善细胞的生长状况，如果需要，可以加入磷酸盐如磷酸二氢钾或金属盐如硫酸镁、硫酸亚铁、醋酸钙、氯化锰、硫酸铜、硫酸锌、硫酸钴和硫酸镍。加入浓度随培养条件而变化。然而，通常磷酸盐的浓度是0.01至5％，镁盐的浓度是10ppm至1％，其它化合物的浓度是约是0.1至1000ppm。另外，根据所选择的培养基，可以以约1至100ppm的量加入提供维生素、氨基酸、核酸等的营养源，如酵母浸出物、酪蛋白氨基酸和酵母核酸，因而细胞的生长状况得到了改善。
为了改进细胞与氰基的反应性，在培养过程中以10ppm至1％量优选地加入一种腈化合物如苄腈作为氰基水解酶的诱导源。而且，在培养过程中优选地加入既可作为反应起始物又可作为诱导源的腈化合物。
在用任何组分时，培养基的pH优选地被调节到5至9，更优选地6至8。其次，优选先通过离心或膜过滤从所述培养溶液中收集培养的微生物并将它们重悬于含有一种作为反应起始物的腈化合物的水、生理盐水或一种pH调到与所述培养基pH相同并含有磷酸、乙酸、硼酸、三(羟甲基)氨基甲烷，或其盐的缓冲液中，然后进行反应，因为反应液中的杂质能被减少，然后能够容易地收集产物。如果使用了浓度足够高的缓冲液，通常能够维持反应过程中的pH值。然而，随着反应的进行，在pH偏离了上述范围的情况下，优选地利用氢氧化钠、氨水等适当地调节pH值。
通过常规使用的方法如离心、膜过滤、减压条件下地干燥、蒸馏、用溶剂萃取、盐析、离子交换和各种色谱法收集反应液中产生的氰基羧酸。根据反应液中的氰基羧酸的状态选择收集方法。最简单易行地，通过将反应液调到酸性使氰基羧酸沉淀，并离心或过滤沉淀来回收氰基羧酸。在反应产物是以水溶液的形式获得的情况下，优选地在产物处于溶解状态的条件下通过离心、膜过滤等除去微生物细胞。在反应产物是以固体的形式获得的情况下并且当晶体充分大的时候，可以用由不锈钢、尼龙等制作的网筛收集产物。当晶体小且不能与微生物分开时，优选地用通过设置成能够溶解固体的条件，例如碱性条件，而使水溶液中一旦形成反应产物，就通过离心、膜过滤等除去细胞，恢复所述条件，重新沉淀所述固体和收集反应产物。然而，如果能以常规技术如直接蒸馏反应液除去微生物，则这不是唯一的方法。
根据反应产物的特性，产物在反应液中积累而降低反应速率。在这种情况下，根据产物的浓度向反应液中加入水、生理盐水或反应缓冲液并连续稀释反应液的方法被适当地用。其次，当反应速率降低时通过收集细胞，回收作为产物溶液的上清和将收集到的细胞返回到含有反应起始物的所述溶液或悬浮液中使得反应速率能够得到恢复。只要微生物保持水解腈的能力，这些方法中的每一种方法可以进行任何次数的重复。
即使用不含细胞的用于本发明的微生物提取物或用催化上述反应并且是从不含细胞的提取物中浓缩或提取的成分，本发明也能以类似的方式进行。并且，通过固定化加载在微溶性载体上的一种用于本发明的微生物或其提取物溶液或提取组分并使这种固定化物质与起始物溶液接触也能够实现本发明。用于固定化的载体的实例包括能形成微溶于水的含有所述微生物或其提取成分的固体的化合物，如聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚-N-乙烯基甲酰胺、聚烯丙胺、聚乙烯亚胺、甲基纤维素、葡甘露聚糖、藻酸盐、角叉菜胶和其聚合物或交联产物。这些化合物可以被单独使用或结合使用。另外，可以用通过将微生物或其提取物溶液或提取成分支承在先前就是固体形式的物质如活性炭、多孔陶瓷、玻璃纤维、多孔密质聚合物和硝酸纤维膜上而获得的那些产物。
根据本发明的方法，用于氰基水解反应的底物特异性很宽，目标包括各种公知的腈化合物如脂族腈、芳香腈和杂环腈，并且可以获得具有高度选择性的相应羧酸。
脂族腈的实例包括乙腈、丙腈、正-丁腈、异丁腈、正戊腈、异戊腈、己腈、丙二腈、葡糖酸腈、己二腈、琥珀腈、丙烯腈和2-甲基丙烯腈。
芳香腈的实例包括苄腈、对苯二腈、邻苯二甲腈、苄基氰、间苯二氰以及这些芳香腈化合物的取代产物如氯化产物、氟化产物、硝化产物和胺化产物。
杂环腈的实例包括3-氰基吡啶、4-氰基吡啶和氰基吲哆。
另外，根据本发明，所述目标优选地是在上述缺失的或降低的化合物之中的那些分子中具有多个氰基的聚腈化合物，并且可以获得相应的具有高度选择性的氰基羧酸。聚腈化合物的实例包括脂族腈如丙二腈、琥珀腈、己二腈和葡糖酸腈，芳香腈如邻苯二甲腈、对苯二腈和间苯二氰以及这些芳香腈化合物的取代产物如氯化产物、氟化产物、硝化产物和胺化产物。
根据本发明的方法，可获得副产物含量已减少的羧酸，尤其是，使羧酸产物中含有的由起始物腈化合物产生的副产物的总含量为0.5(mol)％或更低。近年来，对于痕量化学物质对人体的影响非常关注，因而本发明是基于充分降低化学反应中的副反应的概念作出的并且通过这种反应获得的高纯度化学品能够在工业上创造新的可能性。
在本发明的方法中，通过胺产生羧酸的途径已基本缺失或降低，因此不产生由于腈及其衍生物的部分水解而产生的胺-形式的杂质。通过本发明所获得的羧酸适于作为用于特别需要高纯度的领域如医药或精细化学品领域的合成反应的起始物。
2.源自于红球菌属细菌的腈水解酶基因
以下描述了测定红球菌属细菌的腈水解酶基因DNA序列的方法。例如红球菌ATCC39484菌株染色体DNA能够通过用Saito等的方法(见Biochem.BiopHys.Acta.，72，619(1963))来制备。克隆基因所使用的染色体DNA文库能够通过用，例如质粒载体pUC18来制备。腈水解酶基因的克隆能够用例如Saiki等的聚合酶链反应(PCR)(见科学230，1350(1985))来进行。在这种情况下，通用的引物(正向或反向)被用作PCR的一种引物，并且从编码酶N端序列DNA序列中选择可作为另一引物的合适序列。通过联合这些引物，以染色体DNA文库作为模板进行锚式PCR而获得目的酶的编码序列片段。通过以腈水解酶的编码序列的部分片段作为探针筛选全长基因区域，能够从红球菌ATCC39484菌株的染色体文库中获得含有腈水解酶基因的重组DNA。用已知方法如Sanger等描述的双脱氧方法(见美国国家科学院学报，74，5463(1997))能够测定腈水解酶编码序列片段DNA序列。
为了用如此获得的酶结构基因来生产腈水解酶，所述酶结构基因被连接在合适的表达载体上，例如pUC18的lac启动子的下游。用如此获得的质粒转化宿主如大肠杆菌JM101。通过培养获得的转化体，在宿主细胞中产生了大量的目的腈水解酶。完整的腈水解酶细胞可被用于转化反应，但也可使用不含细胞的提取物或从提取物中获得的纯化酶。
为了使源自于不同微生物的酶基因在宿主微生物中以一种其实际上在其中发挥作用的方式进行表达，已知必须满足各种条件，例如，基因能够保留在宿主微生物中并能够在其中***，通过宿主的转录功能基因能够被转录，转录信息能够被翻译成蛋白质，通过翻译产生的多肽能被折迭成较高级的空间结构从而具有功能，酶能以与供体微生物相同的方式被分泌因而能与反应底物接触，或者如果酶是胞内酶，宿主微生物具有类似于供体微生物的渗透/运输***等。并且，为了使表达达到适用于工业应用的某种程度，必须严格满足每一种条件。为了解决这些问题，通常必需分析和修饰调节区如启动子，通过构建一种复杂的穿梭载体和将克隆基因返回到供体微生物来使转录/表达***和各种辅因子适应于靶基因结构体。这些方法中存在的问题是难以获得目标分析的信息，也难以修改调节机制的修饰方法，它们依赖一种繁琐和错误的方法，这些方法受到供体接受返回的克隆基因而进行表达的能力的限制。正如本发明人所认识的，尽管有些情况下证实可由另一种微生物表达腈水解酶，但不知何种情况下能获得催化聚腈的选择性水解的腈水解酶基因，以及何种情况下能通过将该基因引入已知的大肠杆菌载体***以便转化大肠杆菌从而简单易行地展示远远超过供体微生物能力的高活性。此外，亦不知何种情况下能由利用这类腈水解酶基因的重组体针对腈化合物，特别是芳香聚腈化合物进行选择性和高水平反应。
在本发明中用作起始物的腈化合物是具有一个氰基的脂族或芳香化合物，或具有多个氰基的脂族或芳香聚腈化合物。当使用的起始物是邻苯二甲腈、间苯二氰或对苯二腈时，能够优选以高纯度获得相应的邻-、间-、或对氰基苯甲酸。
在本发明中，转化反应可以通过将起始物和细胞、不含细胞的提取物或具有转化活性的酶加入到稀释的水溶液如磷酸盐缓冲液中，在pH为5至10，优选地为6至8，温度为15至45℃，优选地30至42℃的条件下进行。
收集产生于反应液中的产物的方法没有特别的限制，但可以，例如，分离和回收反应液的上清液，根据产物的性质用沉淀、提取、蒸馏等方法或联合使用这些方法来获得产物。此外，通过用柱层析等进行分离和纯化可以获得高纯度的产物。
3.源自于红球菌属细菌的腈水合酶基因和酰胺酶基因
红球菌ATCC39484菌株的染色体DNA能够通过用Saito等的方法(见Biochem.BiopHys.Acta.，72，619(1963))来制备。克隆基因所使用的染色体DNA文库能够通过用，例如质粒载体pUC18来制备。腈水合酶基因和酰胺酶基因的克隆能够通过以例如Saiki等的聚合酶链反应(PCR)(见科学230，1350(1985))制备的部分片段作为探针经菌落杂交来完成。在这种情况下，通用的引物(正向或反向)被用作PCR的一种引物，并且从进行分析的编码目的酶蛋白N端序列DNA序列中选择用于另一引物的合适序列。通过结合这些引物，以染色体DNA文库作为模板进行锚式PCR而获得目的酶的编码序列片段。通过以腈水合酶的编码序列的DNA片段或酰胺酶酶的编码序列的DNA片段作为探针筛选全长基因区域，能够从红球菌ATCC39484菌株的染色体文库中获得含有腈水合酶基因和/或酰胺酶基因的重组DNA。用已知方法如Sanger等描述的双脱氧方法(见美国国家科学院学报，74，5463(1997))能够测定腈水合酶编码序列片段和酰胺酶编码序列片段DNA序列。
为了用如此获得的酶结构基因来生产酶，所述酶结构基因被连接在合适的表达载体上，例如pUC18的lac启动子的下游。用如此获得的质粒转化宿主如大肠杆菌JM101。通过培养获得的转化体，在宿主细胞中产生了大量的目的腈水合酶和/或酰胺酶。酶可以以完整的细胞形式被用于转化反应，但也可使用不含细胞的提取物或从提取物种获得的纯化酶。
为了使源自于不同微生物的酶基因在宿主微生物中以一种其实际上在其中发挥作用的方式进行表达，已知必须满足各种条件，例如，基因能够保留在宿主微生物中并能够在其中***，通过宿主的转录功能基因能够被转录，转录信息能够被翻译成蛋白质，通过翻译产生的多肽能被折迭成较高级的空间结构而具有功能，酶能以与供体微生物相同的方式被分泌因而能与反应底物接触，或者如果酶是胞内酶，宿主微生物具有类似于供体微生物的渗透/运输***等。并且，为了使表达达到适用于工业应用的某种程度，必须严格满足每一种条件。为了解决这些问题，通常必需分析和修饰调节区如启动子，或通过构建一种复杂的穿梭载体并将克隆基因返回到供体微生物来使转录/表达***和各种辅因子适应于靶基因结构体。这些方法中存在的问题是难以获得目标分析的信息和修改调节机制的修饰方法，它们依赖一种繁琐和错误的方法，这些方法受到供体接受返回的克隆基因并进行表达的能力的限制。正如本发明人所认识的，尽管有些情况下证实可由另一种微生物表达腈水解酶，但不知何种情况下能获得催化聚腈的选择性水解的腈水解酶基因，以及何种情况下能通过将该基因引入已知的大肠杆菌载体***以便转化大肠杆菌从而简单易行地展示远远超过供体微生物能力的高活性。此外，亦不知何种情况下能由利用这类腈水解酶基因的重组体针对腈化合物，特别是芳香聚腈化合物进行选择性和高水平反应。
本发明用于生产羧酸的方法或用于酰胺转化反应的方法可以通过将起始物和细胞、不含细胞的提取物或具有转化活性的酶加入到稀释的水溶液如磷酸盐缓冲液中，在pH为5至10，优选地为6至8，温度为15至45℃，优选地30至42℃的条件下进行。根据产物的性质，可以用沉淀或柱层析来获得反应液中产生的产物。
在本发明中用作起始物的腈是分子中至少具有一个氰基的脂族或芳香化合物，优选的实例包括芳香聚腈化合物如邻苯二甲腈、间苯二氰或对苯二腈。
根据本发明，用作羧酸生产方法的起始物的酰胺是一种具有一个酰胺基团的脂族或芳香化合物，优选的实例包括具有一个氰基的芳香酰胺化合物如邻-、间-，或对-氰基苯甲酰胺。
以下将通过实施例更详细地描述本发明。然而，本发明并不由此受到限制。
实施例1微生物变体的获得
将红球菌菌株ATCC39484(来源于美国典型培养物保藏中心)划线接种到LB琼脂培养基上并在30℃下以恒定的温浴方式培养24小时。从长出的菌落中取出一接种环的细胞并接种到5ml的LB液体培养中，在30℃下用摇床振荡培养6小时。通过10,000g的离心回收细胞，用等体积的50mM钾/钠磷酸盐缓冲液(pH：7.0)洗涤三次，并且再次悬浮在同样的等体积缓冲液中。
将2000ppm的NTG(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)溶液加到所述细胞悬浮液中并使终浓度达到100ppm。充分搅拌后，将溶液保持室温30分钟。然后，通过10000g的离心回收细胞，用同样的缓冲液洗涤一次并再次悬浮在少量的相同缓冲液中。然后，将全部量的细胞接种到5ml的含有0.1％苯甲酰胺的无机盐液体培养基中。无机盐培养基的组成如下所示。
(无机盐培养基)
KH2PO4       1.5g/l
Na2HPO4      1.5g/l
MgSO47aq.     0.2g/l
CaSO42aq.     10mg/l
FeSO47aq.     5mg/l
酵母浸出物     20mg/l
在30℃下振荡培养15小时后，加入氨苄青霉素并使浓度达到1mg/l，在30℃下进一步振荡培养12小时。将获得的培养液稀释500倍并将稀释溶液以每只平板0.1的量平铺在300个LB固体培养基平板(直径90mm)。然后细胞在30℃下培养48小时，并且当菌落产生后，将该菌落影印到已高压灭菌的绒布上，每一平皿作为一个整体被转移到具有上述组成和含有0.1％苯甲酰胺和1.5％琼脂的无机盐固体培养基(直径：90mm)中，并且细胞在30℃下培养48小时。
在作为转移源的固体培养基和作为转移目标的无机盐培养基之间比较菌落的形成，选择出约400株在LB培养基生长良好而在无机盐培养基中不生长的菌株。用灭菌牙签将这些选出的菌株从转移源LB转接在新的LB固体培养基中并在30℃下培养24小时。产生的所有菌落被接种到5ml的上述无机盐培养基中并加入0.1％间苯二氰，在30℃下反应48小时。母本菌株ATCC39484也以同样的方式进行培养、接种和反应。将用每一菌株获得的反应液的上清液稀释100倍并进行反相HPLC(柱：Shodex DS-613，洗脱剂：50％乙腈/5mM磷酸钾缓冲液，pH：3.0，流速：1mL/分钟，检测：UV210nm)。证实在一株菌(SD826菌株)中，检测到与母本菌株相似的大量的3-氰基苯甲酸，而在母本菌株ATCC30484中可检测到的3-氰基苯甲酰胺和苯二甲酸单酰胺大大减少。所获得的菌株被认为是缺失副反应途径的目的菌株。
下表1描述了新型红球菌属细菌，红球菌SD826(FERM BP-3705)的真菌特性。
表1
 红球菌SD826的真菌特性
项目 特性
    真菌学     多形性杆状
    革兰氏染色     +
    孢子     -
    运动能力     -
    氧适应性     需氧
    氧化酶     -
    过氧化氢酶     +
    抗酸性     -
    菌落颜色     桔黄
    杆-球环     +
    腺嘌呤分解     +
    酪氨酸分解     +
    尿素分解     -
    可同化性     -
    肌醇     -
    麦芽糖     -
    甘露糖醇     +
    鼠李糖     -
    山梨糖醇     +
    对甲酚     -
    间-羟基苯甲酸     +
    庚二酸     +
    己二酸钠     +
    苯甲酸钠     +
    柠檬酸钠     +
    乳酸钠     +
    睾酮     -
    L-酪氨酸     +
    乳糖     -
    甘露糖     +
    2，3-丁二醇     +
    葡萄糖     +
    在有0.02％叠氮钠存在的情况下生长     -
    于10℃生长     -
    于40℃生长     +
    于45℃生长     -
实施例2
将红球菌SD826划线接种于LB琼脂培养基，于30℃恒温水浴中培养24小时。从产生的菌落中挑取整整一接种环的细胞，将它们悬浮于500ml挡板烧瓶中的100ml LB液体培养基中。将烧瓶置于30℃的恒温摇床中，以每分钟120转的速度培养24小时。通过在10,000g离心回收所得微生物细胞并悬浮于与培养液等体积的50mM钠/钾磷酸盐缓冲液(pH7)中。向该细胞悬浮液中加入5％(质量/体积)间苯二氰，将悬浮液置于30℃的恒温摇床中，以120转每分钟的速度反应72小时。
用2mol/l盐酸将所得反应液调整为pH2，向该反应液中加入等体积的乙酸乙酯，对所得溶液进行搅拌和萃取。所得乙酸乙酯层经适当稀释，用反相HPLC(柱：Shodex DS-613，洗脱剂：50％乙腈/5mM磷酸钾缓冲液，pH：3.0，流速：1mL/分钟，检测：UV210nm)进行分析。在该反应液中发现的主要成分具有滞留时间与3-氰基苯甲酸样品一致的峰。收集峰值成分并进行GC-质谱分析。结果发现每种成分展示的片段模式提示与所述样品具有相同结构。
在对比实施例中，以如上相同的方式进行反应、萃取、和分析，不同的是使用母本ATCC39484。对母本菌株的反应液中的主要成分进行LC-MS分析和鉴定。
母本菌株反应液与SD826反应液中每种主要成分浓度的比较，预计由反应起始物质间苯二氰发生的转化率，以及应用SD826产生的副产物相对于ATCC39484的减少率，均示于下表2。
表2
菌株名称 m-氰基苯甲酸 m-氰基苯甲酰胺 间苯二甲酸单酰胺
 浓度(％)  转化率(mol％)   浓度(％)    转化率(mol％)   浓度(％)    转化率(mol％)
 ATCC39484  5.638   98.22   0.023     0.40   0.087     1.34
   SD826  5.721   99.67   0.003     0.06   0.016     0.24
    副产物/成分的减少率(％)              85             82
    副产物/总体的减少率(％)                               83
实施例3
将红球菌菌株SD826划线接种到LB琼脂培养基上并在30℃下以恒定的温浴方式培养24小时。从长出的菌落中取出一接种环的细胞并接种到500ml挡板摇瓶中的100ml LB液体培养中。摇瓶被置于30℃恒温摇床中并以120转/分钟的转速培养24小时。通过10,000g的离心回收微生物细胞并悬浮在与培养溶液等体积的50mM钾/钠磷酸盐缓冲液(pH：7.0)中。
将间苯二氰以相当于1％(质量/体积)和0.1％(质量/体积)苄腈的量作为诱导底物加到所述细胞悬浮液中。然后，悬浮液被置于30℃的恒温摇床中，并且以120转/分钟的转速反应72小时。用2mol/l的盐酸将获得的反应液的pH调到2，向反应液中加入等体积的乙酸乙酯，搅拌，然后萃取。所获得的乙酸乙酯层被进行适当的稀释并通过反相HPLC(柱：Shodex DS-613，洗脱剂：50％乙腈/5mM磷酸钾缓冲液，pH：3.0，流速：1mL/分钟，检测：UV240nm)进行分析。在反应液中，发现的主要成分具有滞留时间与4-氰基苯甲酸样品一致的峰。收集所述峰的成分并进行GC-质谱分析。结果，检测到每一成分展示一种暗示与样品相同结构的片段模式。
在对比实施例中，以如上相同的方式进行反应、萃取、和分析，不同的是使用母本ATCC39484。对母本菌株的反应液中的主要成分在上述HPLC条件下进行LC-MS分析，然后鉴定并定量。
母本菌株反应液与SD826反应液中每种主要成分浓度的比较，预计由反应起始物质间苯二氰发生的转化率，以及应用SD826产生的副产物相对于ATCC39484的减少率，均示于下表3。
表3
菌株名称 对氰基苯甲酸 对氰基苯甲酰胺 对苯二甲酸单酰胺
    浓度(％)    转化率(mol％)     浓度(％)    转化率(mol％)     浓度(％)    转化率(mol％)
 ATCC39484     1.129    98.31     0.006     0.53     0.012     0.97
   SD826     1.145    99.68     n.d.     -     0.002     0.26
    副产物/成分的减少率(％)            100              83
    副产物/总体的减少率(％)                             89
n.d.：未检测
实施例4用于制备腈水解酶基因的染色体DNA的制备
将红球菌菌株ATCC39484(本文称作“R.Sp.”)在加2％琼脂至L肉汤(聚胨：1％，NaCl：0.5％，酵母浸出物：0.5％，pH：7.0)而制成的琼脂平板培养基上培养一昼夜，将所得细胞取一接种环于30℃、在添加有5g/l葡萄糖和2g/l尿素的基础培养基(KH2SO4：1.5g/l Na2HPO4·2H2O：0.75g/l，MgSO4·7H2O：0.2g/l，CaSO4·2H2O：10mg/l，FeSO4·7H2O：5m/l，酵母浸出物：20m/l)300ml中培养24小时。收集培养细胞并用100ml 5mM EDTA溶液洗涤。所得细胞悬浮在30ml缓冲液(20mM Tris盐酸缓冲液(pH：7.1))中，然后加入60mg溶菌酶，37℃保温2小时。离心该悬浮液(5000rpm，7分钟)以回收细胞。回收的细胞被重悬于11.34 mLTE缓冲液中，加入0.6ml 10％SDS，加入蛋白酶R(由Merk生产)，混合物55℃轻轻振荡1小时。该溶液用酚提取并用乙醇沉淀以制备染色体DNA。
实施例5 DNA文库的构建
20μg实施例4所获染色体DNA用限制酶Sau 3 AI部分消化。更具体为，将所述染色体DNA以每管4μg的量分装到5支试管中，每管中分别加入限制酶Sau 3 AI(由Takara Shuzo有限公司生产，4-12 U/μl)，37℃下以100μl的反应体积进行反应。每10秒钟取一支试管，加入EDTA至终浓度20mM以终止反应。使所得染色体DNA的部分消化片段溶液进行琼脂糖凝胶电泳，通过电泳提取和乙醇沉淀来回收1-2 kb的DNA片段。将回收的DNA片段溶于30ml TE溶液中。用T4 DNA连接酶(由Tkara Shuzo有限公司制备的连接试剂盒第2代)将9μl该样品与经BamHI消化和BAP处理的pUC18(由Takara Shuzo有限公司制备)连接而制备成20μl，然后转化大肠杆菌JM101。为了从所得文库制备扩增文库，将每20个菌落的大肠杆菌转化体接种到含有50ppm氨苄青霉素的L肉汤中，培养一整昼夜。通过碱性SDS方法从这些细胞中提取质粒。
实施例6锚式PCR
克隆前，进行锚式PCR来获得用作探针的酶基因部分片段。通过从这种酶的已知N-端序列中选择具有合适Tm的序列来制备该酶序列的引物。即，
5’-gct gcg gtg cag gca-3’
(及其互补链)
Tm：52℃
在下列反应条件下进行PCR。
反应液的组成：
红球菌ATCC39484染色体DNA
文库                      1μg
通用引物                  100pmol
酶N-端引物                100pmol
每种dNTP溶液              1mM
10x反应缓冲液             10μl
EXTaqDNA聚合酶(由         2.5 U
Takara Shuzo有限公司制备)
                          总量50ul
反应条件：
变性：94℃，45秒钟
退火：37至55℃，60秒钟
延伸：72℃，60至90秒钟
循环次数：24次
在上述反应中，对含特异性扩增片段的溶液进行2％琼脂糖凝胶电泳，切出含该片段的区域，用EASYTRAP第2版(由Takara Shuzo有限公司制备)进行纯化。通过双脱氧方法测定所得每一种DNA片段的DNA序列。找出所翻译的氨基酸序列同源于红球菌ATCC39484菌株腈水解酶之N-端序列的那些。结果，在所得片段中发现了含有编码腈水解酶287个氨基酸的DNA序列的约900bp片段。
实施例7菌落杂交
以实施例3所得含部分腈水解酶基因的PCR片段作为探针，通过菌落杂交法克隆所有基因。使根据实施例6的方法经Sau 3AI降解的染色体DNA之部分消化片段溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳，通过电泳提取和乙醇沉淀回收一种4至8kb的DNA片段。将这一片段干燥并溶于30μlTE溶液中。用T4 DNA连接酶(由Takara Shuzo有限公司制备的连接试剂盒第2代)将9μl该样品和经1μl BamHI消化并经BAP处理的pUC18(由Takara Shuzo有限公司制备)连接，然后转化大肠杆菌JM101。将转化体平铺在琼脂平板培养基上，37℃培养一整昼夜，所述琼脂平板培养基是通过将2％琼脂加至含0.1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，0.004％5-溴-4-氯-3-吲哆基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)和50ppm氨苄青霉素的L肉汤中而制备成的。
挑出白色菌落接种到琼脂平板培养基上，37℃培养一整昼夜，所述琼脂平板培养基是通过将2％琼脂加至含50ppm氨苄青霉素的L肉汤中而制备成的。充分生长后，将琼脂平板培养基置于4℃保持约2小时，使之冷却。在一张干燥的尼龙膜(Hybond-N+，由Amersham pHarmacia生物技术公司制备)的上下左右端做标记，然后小心放在琼脂表面，使之与菌落接触。膜全部湿润后，以单向连续移动的方式将该膜从琼脂表面移开以便将平板上的菌落转移到该膜上。当转移的细胞数量很小时，将膜放置在通过将2％琼脂加入到含有50ppm氨苄青霉素的L肉汤中而制成的琼脂平板培养基上，37℃培养一整昼夜。
将含有转移细胞的膜浮在3ml碱性溶液(0.5M NaOH)中以溶解细胞。膜用5×SSC冲洗2次，每次20分钟，以便冲洗掉未溶解的残余细胞。用随机引物DNA标记及检测***(由Amersham pHarmacia生物技术公司生产)对该膜进行菌落杂交。通过杂交进行的检测在试剂盒所附说明书所规定的标准条件下进行。杂交结果从约4000个菌落中获得两株阳性克隆菌株。
通过碱性-SDS方法从这些阳性克隆中提取质粒。将用作探针的部分片段中的限制酶切位点与每一种质粒的限制消化模式进行比较，从而估测出基因在***片段中的位置和方向。结果发现，从两个克隆菌株制备的质粒pNL06和pNL09含有全部腈水解酶基因(见图1)。用具有较长***片段的P09菌株质粒(pNL09)，测定约2.6kb的***片段DNA序列。寻找与用作探针的部分***片段同源的部分，结果发现腈水解酶基因以相对于lac启动子正向的方向存在于距***片段端部约300bp的下游处。如此发现的方向和位置与由限制酶切割的位点估测出的基因位置和方向一致。由该腈水解酶基因序列翻译的氨基酸序列是新的并且与已知腈水解酶的氨基酸序列不同。
实施例8腈水解酶活性的测定
腈水解酶如下检测。将细胞加至悬浮有1-10质量％底物对苯二腈(TPN)的10ml 20mM磷酸盐缓冲液(pH：7.0)中，于30℃振荡反应，在固定的时间间隔点通过HPLC定量分析产生于反应液中的对氰基苯甲酸。反应液通过离心除去固体物质，上清液用洗脱剂稀释100倍，作为HPLC样品。定量分析对氰基苯甲酸的装置和条件如下所示。
装置
泵：    DS-2(Shodex)
检测器：SPD-6AV UV-VIS分光光度计(Shimadzu)
加样：  带有20ml样品管的自动进样器23型(SIC)
记录仪：Chromatocoder 12(SIC)
柱：    ODSpakF-411(Shodex)，4.6×150mm，40℃
分离条件：
AcCN/H2O＝50∶50，0.1％TFA，1ml/分钟
用1小时内1L反应液中产生1g细胞千重时对氰基苯甲酸的质量表示活性(单位：g/L/小时/g干细胞)。
实施例9高表达菌株的制备
在含50ppm氨苄青霉素的L肉汤中培养实施例4所获阳性克隆菌株P09，结果证明腈水解酶的活性与异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的存在与否无关。然而，该活性低至仅为供体红球菌属微生物的十分之几。在P06菌株中，根本就没有发现腈水解酶的活性。
为了增加酶的产量，通过PCR制备了两种片段，其中一种仅含酶结构基因部分而另一种含酶结构基因及其下游约1.3kb的区域。用这两个片段制备了紧接pUC18中lac启动子的质粒pUNLE1和质粒pUNLE 2。以下显示了用于制备PCR片段的引物和反应条件。
pUNLE1
(正向)
5’-aac atg gtc gaa tac aca aac-3’
(反向)
5’-cc aag ctt tca gag ggt ggc tgt-3’
HindIII位点
pUNLE2
(正向)同于pUNLE1
(反向)M13引物M4
反应液的组成：
质粒DNA                0.8至1μg
引物                   各100pmol
dNTP溶液               各1mM
10x反应缓冲液          10μl
EXTaqDNA聚合酶(由      2.5U
Takara Shuzo有限公司制备)
                       总量50μl
反应条件：
变性：94℃，60秒钟
退火：55℃，60秒钟
延伸：72℃，120秒钟
循环次数：24次
所得片段进行琼脂糖凝胶电泳并通过提取来回收。每一片段在HindIII和NcoI位点切割，用EcoRINcoI接头连接，然后与在EcoRI和HindIII位点切割的pUC18连接(见图2)。用这些质粒转化大肠杆菌JM109。将所得每一转化体在含50ppm氨苄青霉素的L肉汤中培养一整昼夜，培养溶液中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至0.1mM，继续培养2小时。通过实施例5所述方法测定所得转化体的腈转化活性。结果，用任何质粒转化的转化体被证实具有相当于pUNL09转化体的约500倍和相当于供体红球菌的约80倍的腈水解酶活性(见表4)。
表4
    菌株     未诱导时的活性     诱导时的活性
    红球菌ATCC39484     -     0.14
    pUNL09转化体     0.029     0.022
    pUNLE1转化体     0.51     11.1
    pUNLE2转化体     0.46     10.6
活性单位：g/L/小时/g干细胞
实施例10用高活性菌株制备对氰基苯甲酸
向含50ppm氨苄青霉素的L肉汤中加入2％琼脂制成琼脂平板培养基，将实施例9所得pUNLE1转化体加入其中培养一整昼夜，用接种环将长出的细胞接种到100ml含100ppm氨苄青霉素的L肉汤，37℃振荡培养。将该培养液在装有2L含100ppm氨苄青霉素之L肉汤的5L广口发酵罐中，于37℃，800rpm搅拌和1L/分钟的通气速率的条件下再进行一整昼夜的通气搅拌培养。在稳定期初期或对数生长期末期，向细胞培养液中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.1mM，继续培养4小时。
离心培养液并将所获细胞再次悬浮在1L 20mM磷酸盐缓冲液(pH：7.0)中。向其中加入100g的对苯二腈(TPN)，35℃下搅拌反应。每隔一小时取一份反应液样品，经实施例5所述方法定量其中产生的对氰基苯甲酸。在约3小时内所述转化体迅速产生对氰基苯甲酸并以3％比率在反应液中积累(见图3)。完成反应后，向反应液中加入浓盐酸将pH调到1以沉淀对氰基苯甲酸。沉淀用滤纸过滤，用稀盐酸(0.1mol/L)洗涤，然后真空干燥。所得样品的纯度为99.9％或更高。检测的杂质是起始物质对苯二腈。
实施例11用于制备腈水合酶基因和酰胺酶基因的染色体DNA的制备
将红球菌菌株ATCC39484在营养(L肉汤)琼脂平板培养基上培养一整昼夜，所得细胞取一环于30℃、在300ml通过往基础培养基(KH2SO4：1.5g/l，Na2HPO4·2H2O：0.75g/l，MgSO4·7H2O：0.2g/l，CaSO4·2H2O：10mg/l，FeSO4·7H2O：5m/l，酵母浸出物：20m/l)中加入5g/l葡萄糖和2g/l尿素所制成的培养基中培养24小时。收集培养细胞并用100ml 5mM EDTA溶液洗涤。将所得细胞悬浮在30ml缓冲液(20mM Tris盐酸缓冲液(pH：7.1))中，然后加入60mg溶菌酶，37℃保温2小时。离心该悬浮液(5000rpm，7分钟)以回收细胞。将回收的细胞重悬于11.34mL TE缓冲液中，加入0.6ml 10％SDS，加入蛋白酶R(由Merk生产)至100μg/ml，混合物55℃下轻轻振荡1小时。该溶液用酚提取并用乙醇沉淀以制备染色体DNA。
实施例12 DNA文库的构建
20μg所获染色体DNA用限制酶Sau 3 AI部分消化。更具体为，将所述染色体DNA以每管4μg的量分装到5支试管中，每管中分别加入限制酶Sau 3 AI(由Takara Shuzo有限公司生产，4-12U/μl)，37℃下以100μl的反应体积进行反应。每10秒钟取一支试管，加入EDTA至终浓度20mM以终止反应。使所得染色体DNA的部分消化片段溶液进行琼脂糖凝胶电泳，通过电泳提取和乙醇沉淀来回收5-10kb的DNA片段。将回收的DNA片段溶于30ml TE溶液中。用T4 DNA连接酶(由Takara Shuzo有限公司制备的连接试剂盒第2代)将9μl该样品与经BamHI消化和BAP处理的pUC18(由Takara Shuzo有限公司制备)连接而制备成20μl，然后转化大肠杆菌JM101。为了从所得文库制备扩增文库，将每20个菌落的大肠杆菌转化体接种到含有50ppm氨苄青霉素的L肉汤中，培养一整昼夜。通过碱性SDS方法从这些细胞中提取质粒。
实施例13腈水合酶和酰胺酶的纯化
通过选择使得引物具有合适Tm的序列由如下制备的酶多肽的N-端序列来制备源自该酶序列并为锚式PCR所需的一种引物。
通过使得1ml的反应混合物在25℃下反应30分钟和然后利用HPLC(HPLC分离条件如上文实施例8所述)检测产生的苯甲酰胺或苯甲酸来定性分析腈水合酶活性或酰胺酶活性，所述反应混合物含有10mM苄腈或10mM苯甲酰胺、30mM磷酸钾缓冲液(pH：7.0)和预定量的细胞提取物。
红球菌ATCC39484菌株被接种到600ml腈分解酶诱导培养基中并在30℃下振荡培养，所述腈分解酶诱导培养基由实施例1的基础培养基和1g/L诱导底物的苄腈组成。离心培养了一整昼夜的培养溶液(8000rpm，15分钟)来回收细胞，得到的3.2g净重细胞用50ml 100mM磷酸钾缓冲液(pH：7.0，含1mM EDTA和2mM DTT)洗涤，然后悬浮在200ml的相同缓冲液中。对其进行超声波处理来裂解细胞，然后通过离心(12000rpm，20分钟)来获得180ml的上清液(粗制酶提取溶液)。
向该不含细胞的提取溶液中加入硫酸铵至45％饱和浓度，在4℃下搅拌混合物1小时，然后通过离心去除所产生的沉淀。进一步向分离的上清液中加入硫酸铵来达到60％饱和浓度，在4℃下搅拌混合物1小时，然后通过离心回收沉淀。所产生的沉淀被证明具有腈水合酶活性和酰胺酶活性。所产生的沉淀被溶解在10ml 100mM磷酸钾缓冲液(pH：7.0，含1mM EDTA和2mMDTT)中并以相同的缓冲液进行透析。
将透析的粗制酶溶液上样到用100mM磷酸钾缓冲液(pH：7.0，含1mMEDTA和2mM DTT)平衡的DEAE-SepHarose柱(2cm×20cm)上，并用平衡缓冲液洗柱直到洗脱液在280nm下的紫外光吸收降低为止。接着，进一步用补充了0.1M KCl的相同缓冲液洗柱直到洗脱液在280nm下的紫外光吸收降低为止。然后，用KCl浓度增加到0.3M 100mM的磷酸钾缓冲液(pH：7.0，含1mM EDTA和2mM DTT)洗脱腈水合酶和酰胺酶。收集显示活性的级分并用超滤膜(截留分子量30000)浓缩酶蛋白。
将浓缩的活性级分的混合物和10％饱和浓度的硫酸铵上样到用100mM磷酸钾缓冲液(pH：7.0，含10％饱和浓度的硫酸铵)平衡的pHenylSepHarose CL-4B柱(2cm × 40cm)上而使得所述酶吸附在柱上。然后，用平衡缓冲液冲洗柱直到洗脱液在280nm下的紫外光吸收降低为止。然后，用洗脱缓冲液(100mM的磷酸钾缓冲液(pH：7.0)洗脱腈水合酶和酰胺酶。收集活性级分并用超滤膜(截留分子量30000)浓缩酶蛋白。
将浓缩的腈水合酶活性级分上样到用100mM的磷酸钾缓冲液(pH：7.0，含0.5M NaCl)平衡的SepHarcryl S-300 Superfine柱(2cm×60cm)上，用同样的缓冲液进行分离，由此将洗脱液分级分离成约0.5ml的级分。在这一阶段，不同的级分分别显示出最高的腈水合酶活性和酰胺酶活性，因此回收每一种酶的显示最高酶活性的级分极其邻近级分。用超滤膜(截留分子量30000)对约1.5ml的每一级分进行浓缩。
实施例14多肽末端序列的测定
试图测定所获得的腈水合酶和酰胺酶的N-端序列，但是两种酶在Edman降解中都显示出低信号强度以致于序列的测定没有成功。因此，通过溴化氰(BrCN)水解酶蛋白，所得多肽在下列液相色谱条件下分离。
主体：  LC 9A(Shimadzu Seisakusho)
柱：    Asahipak ODP 50 6D(Shodex)
柱温度：25℃
洗脱剂：乙腈0-80％(线性浓度梯度，60分钟)0.1％三氟乙酸
流速：  0.5ml/min
检测：  SPD-6AV UV VIS分光光度计
        (Shimadzu  Seisakusho)
        215nm
从腈水合酶活性级分中获得多种多肽样品，从中选出显示较好分离效果的样品，再次通过Edman降解进行N-端序列的分析。结果证实下列序列与现有腈水合酶序列高度同源。
Glu(E)Tyr(Y)Arg(R)Ser(S)Arg(R)Val(V)Val(V)
考虑到该序列及红球菌属细菌的密码子应用特点，制备了腈水合酶的引物。
5’-GAG TAC CGG TCC CGA-3’(及其互补链)
类似地，从酰胺酶活性级分中获得多种多肽，从中选出那些显示较好分离效果的样品，再次通过Edman降解进行N-端序列的分析。结果证实下列序列与现有酰胺酶序列高度同源。
Ala(A)Val(V)Gly(G)Gly(G)Asp(D)Gln(Q)Gly(G)
考虑到该序列及红球菌属细菌的密码子应用特点，制备了酰胺酶的引物。
5’-GCA GTC GGC GGC GAC-3’(及其互补链)
实施例15  锚式PCR方法
在下列反应条件下进行PCR方法。
反应液的组成：
红球菌ATCC39484染色体DNA
文库                        1μg
通用引物                    100pmol
酶多肽N-端引物              100pmol
每种dNTP溶液                1mM
10x反应缓冲液               10μl
EXTaqDNA聚合酶(由           2.5U
Takara Shuzo有限公司制备)
                            总量50μl
反应条件：
变性：94℃，45秒钟
退火：37至60℃，60秒钟
延伸：72℃，60至90秒钟
循环次数：24次
在上述反应中，对含特异性扩增片段的溶液进行2％琼脂糖凝胶电泳，切出含该片段的区域，用EASYTRAP第2版(由Takara Shuzo有限公司制备)进行纯化。通过双脱氧方法测定所得每一种DNA片段的DNA序列来证实翻译的氨基酸序列与已知腈水合酶或酰胺酶具有同源性。结果显示获得的片段4和14分别含有同源于已知腈水合酶和酰胺酶的序列。片段4含有一个约500bp的腈水合酶同源序列，片段14含有一个约900bp的酰胺酶同源序列。两者都具有足以用于以下菌落杂交的探针的长度。
实施例16菌落杂交
以实施例15所得含腈水合酶基因一部分的PCR片段和含酰胺酶基因一部分的PCR片段作为探针，通过菌落杂交法克隆所有基因。使根据实施例1的方法经Sau 3AI降解的染色体DNA之部分消化片段溶液进行1％琼脂糖凝胶电泳，通过电泳提取和乙醇沉淀回收一种4至8kb的DNA片段。将这一片段干燥并溶于30μlTE溶液中。用T4 DNA连接酶(由Takara Shuzo有限公司制备的连接试剂盒第2代)将9μl该样品和经1μl BamHI消化并经BAP处理的pUC18(由Takara Shuzo有限公司制备)连接，然后转化大肠杆菌JM101。将转化体平铺在琼脂平板培养基上，37℃培养一整昼夜，所述琼脂平板培养基是通过将2％琼脂加至含0.1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，0.004％5-溴-4-氯-3-吲哆基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)和50ppm氨苄青霉素的L肉汤中而制备成的。
挑出白色菌落接种到琼脂平板培养基上，37℃培养一整昼夜，所述琼脂平板培养基是通过将2％琼脂加至含50ppm氨苄青霉素的L肉汤中而制备成的。充分生长后，将琼脂平板培养基置于4℃保持约2小时，使之冷却。
在一张干燥的尼龙膜(Hybond-N+，由Amersham pHarmacia生物技术公司制备)上用铅笔在上下左右端做标记，然后小心放在琼脂表面，使之与菌落接触。膜全部湿润后，以单向连续移动的方式将该膜从琼脂表面轻轻移开以便将平板上的菌落转移到该膜上。当转移的细胞数量很小时，将膜放置在通过将2％琼脂加入到含有50ppm氨苄青霉素的L肉汤中而制成的琼脂平板培养基上，37℃培养一整昼夜。
将含有转移细胞的膜浮在3ml碱性溶液(0.5M NaOH)中以溶解细胞。膜用5×SSC冲洗2次，每次20分钟，以便冲洗掉未溶解的残余细胞。用随机引物DNA标记及检测***(由Amersham pHarmacia生物技术公司生产)对该膜进行菌落杂交。通过杂交进行的检测在试剂盒所附说明书所规定的标准条件下进行。杂交结果从约8000个菌落中每个基因均获得一株阳性克隆菌株。
通过碱性-SDS方法从这些阳性克隆中提取质粒。将用作探针的部分片段中的限制酶切位点与每一种质粒的限制消化模式进行比较，从而估测出基因在***片段中的位置和方向。结果发现，从腈水合酶克隆菌株P11制备的质粒Punh11含有全部腈水合酶基因(见图4)。而从酰胺酶克隆菌株P12制备的质粒pUAMD12显示了复合型限制酶处理模式，并且也未检测到该基因的位置和方向。因此，进一步用限制酶处理pUAMD12，对所得片段进行Southern杂交。从这些结果推测出其也含有全长结构基因区(图4)。
实施例17缺失突变体的制备和碱基序列的测定
pUNH11和pUAMD12是分别含有3kb至4kb***片段的质粒，它们的碱基序列难以测定。因此，尝试用核酸外切酶III从端部删除***片段来制备缺失突变体。用Detection Kilo-序列试剂盒(Takara Shuzo有限公司)制备所述突变体。即，用Sse837I和XbaI充分消化25μl(约16μg，0.4mg/ml)pUNH11或pUAMD12溶液(37℃，24小时)，通过酚提取纯化，通过加入1/10体积的3 M乙酸钠和2.5体积的乙醇来沉淀。对沉淀物离心并回收，用70％冷乙醇洗涤。然后，真空干燥沉淀物。将其溶于100μl ExoIII缓冲液中。将1μl核酸外切酶III加入DNA溶液中，用涡旋器搅拌混合物，然后在37℃保温。10秒钟和30秒钟后，分别取样50μl的反应混合物(与终止反应前所制备的50μl MB核酸酶缓冲液混合)。
将2μl MB核酸酶加到反应混合物中，37℃保温20分钟。反应完成后，用酚提取反应混合物来纯化，加入1/10体积的3M乙酸钠和2.5体积的乙醇来形成沉淀。沉淀物通过离心回收，用70％冷乙醇洗涤，然后真空干燥。将所得沉淀物溶于50μl Klenow缓冲液中并往其中加入1μl Klenow片段，然后37℃保温15分钟。反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳而分离成三条长带(将每一条从胶上切下，提取并回收)。
10μl的切割片段回收液与100μl连接液A混合，加入12μl连接液B，混合物用涡旋器16℃搅拌24小时以产生自身连接。用所得质粒转化大肠杆菌JM109菌株。
通过以上操作可获得20个或更多个pUNH11突变体。从中选出7个含有合适长度***片段的突变体用于测序。但不能获得合适的pUAMD12突变体，因为它产生大于原始质粒或小于所用载体的质粒。因此，pUAMD12用基因步行法测序，此法在引物连续合成的同时测序。
用对应于pUNH11之完整***片段的约2.8kb DNA序列和对应于pUAMD12之***片段约2/3的约2.8kb DNA序列，根据双脱氧方法测定碱基序列。寻找与用作探针的部分片段序列相同的部分，结果显示，在pUNH11和pUAMD12的EcoRI位点***片段的下游约0.2kb和1.1kb处，腈水合酶基因以与lac启动子相反的方向存在，酰胺酶以与其正向的方向存在。碱基序列的分析结果如SEQ ID NO 3和6所示。对于pUNH11，如此发现的方向和位置与由限制酶切割模式估测出的该基因的位置和方向一致，对于pUAMD12，如此发现的方向和位置与Southern杂交结果，以及由限制酶切割模式估测出的该基因的位置和方向一致。由这些基因序列翻译的氨基酸序列(SEQ ID No 4，5和7)是新的，且与已知腈水合酶和酰胺酶的氨基酸序列不同。
实施例18腈水合酶和酰胺酶活性的测定
腈水合酶如下检测。将细胞(约1g湿重)加至悬浮有1-10质量％底物对苯二腈(TPN)的10ml 20mM磷酸盐缓冲液(pH：7.0)中，于30℃振荡反应，在固定的时间间隔点通过HPLC定量分析产生于反应液中的对氰基苯甲酸酰胺。反应液通过离心除去固体物质，上清液用洗脱剂稀释100倍，作为HPLC样品。用对氰基苯甲酰胺或苯甲酰胺作为底物来测定酰胺酶的活性，在上述同样的条件下进行反应，并通过HPLC测定产生的对氰基苯甲酸或苯甲酸。
用以下装置和条件测定产物。
装置
泵：    DS-2(Shodex)
检测器：SPD-6AV UV-VIS分光光度计(Shimadzu)
加样：  带有20ml样品管的自动进样器23型(SIC)
记录仪：Chromatocoder 12(SIC)
柱：    ODSpakF-411(Shodex)，4.6×150mm，40℃
分离条件：
AcCN/H2O＝50∶50，0.1％TFA，1ml/分钟
用1小时内1L反应液中产生1g干重细胞时，对氰基苯甲酸酰胺、对氰基苯甲酸或苯甲酸的质量表示活性(单位：g/L/小时/g干细胞)。
实施例19  高表达菌株的制备
在含50ppm氨苄青霉索的L肉汤中培养实施例16所获阳性克隆菌株P11或P12，结果证明腈水合酶的活性与异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的存在与否无关。然而，该活性低至仅为供体红球菌属微生物的十分之几。在P12菌株中，根本就没有发现酰胺酶的活性。
为了增加酶产量，通过PCR制备了仅含所述酶结构基因部分的片段，并将它们连接至紧接pUC18的lac启动子来制备质粒pUNHE1和质粒pUAMDE1。此外，还制备了在同一质粒上具有两种片段的质粒pUNHAMDE1。
以下显示了用于制备PCR片段的引物和反应条件。
pUNLE1
(正向)
5’-aac atg gat get atc cac gac-3’
(β亚单位起始密码子)(NcoI位点)
(反向)
5’-cc aag ctt tca tac gat cac ttc-3’
(α亚单位终止密码子)(HindIII位点)
pUAMDE1
(正向)
5’-acc atg gct tcg ttg act cc-3’
(NcoI位点，氨基酸3由Ser→Ala的突变)
(反向)
5’-cc aag ctt tca gga cgg cac cga-3’
(HindIII位点)
反应液的组成：
质粒DNA              0.8至1μg
引物                 各100pmol
dNTP溶液             各1mM
10x反应缓冲液        10μl
EXTaqDNA聚合酶(由    2.5 U
Takara Shuzo有限公司制备)
                     总量50μl
反应条件：
变性：94℃，60秒钟
退火：55℃，60秒钟
延伸：72℃，120秒钟
循环次数：24次
对于腈水合酶基因和酰胺酶基因，使所得片段进行琼脂糖凝胶电泳并通过提取来回收。每一片段在HindIII和NcoI位点切割，用EcoRINcoI接头连接，然后与在EcoRI和HindIII位点切割的pUC18连接(见图5)。
同时含有着腈水合酶基因和酰胺酶基因的质粒首先用NcoI和HindIII消化以切割腈水合酶片段，将该片段依次与EcoRINcoI接头、HindIIINcoI接头连接，然后与用NcoI和HindIII切割的酰胺酶片段连接，最后将所得片段与用EcoIR-HindIII切割的pUC18连接(见图6)。
用这些质粒转化大肠杆菌JM109。将所得每一转化体在含50ppm氨苄青霉素的L肉汤中培养24小时，培养液中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至0.1mM，继续培养2小时。通过实施例8所述方法测定所得转化体的腈转化活性。结果，用任何质粒转化的转化体被证实具有高于供体红球菌的腈水解酶活性。只有被同时含有两种基因的质粒转化的转化体显示出与供体等同的活性。结果见下表5。
表5
    菌株     未诱导时的活性     诱导时的活性
    红球菌ATCC39484     -     0.171)
    pUNH11转化体     0.009     0.007
    pUAMD12转化体     n.d.     n.d.
    pUNHE1转化体     0.35     0.41
    pUAMDE1转化体     0.11     0.27
    pUNHAMDE1转化体     0.112)     0.132)
活性单位：g/L/小时/g干细胞
1)所测供体活性只是酰胺产生速率(由于腈水解酶的影响不可能精确地测定酸产生速率)。
2)对于pUNHAMDE1，测定由腈产生酸的速率。
保藏说明
下列微生物已被保藏在日本通商产业省，工业技术院，生命科学和人类-技术国立研究所(1-3，Higashi1-chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken，日本)。
微生物           保藏号         保藏日期
红球菌SD826    FERMBP-7305    1999年10月12日
被保藏的微生物是根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的规定和基于此的条款来进行保藏的。

Claims (58)

1.一种生产羧酸的方法，包括用微生物将腈化合物的至少一个氰基转化成羧基，其中使用了一种转化氰基为酰胺基之活性缺失或降低的微生物变体。
2.权利要求1的羧酸生产方法，其中所述微生物变体是红球菌属细菌的一个菌株变体。
3.权利要求2的羧酸生产方法，其中所述红球菌属细菌的菌株变体是母本菌株红球菌ATCC39484的菌株变体。
4.权利要求3的羧酸生产方法，其中红球菌菌株ATCC39484的菌株变体是红球菌SD826(FERM BP-7305)。
5.权利要求1的羧酸生产方法，其中腈化合物是分子中具有多个氰基的聚腈化合物，羧酸是氰基羧酸。
6.权利要求5的羧酸生产方法，其中聚腈化合物是芳香聚腈化合物，氰基羧酸是芳香氰基羧酸。
7.权利要求6的羧酸生产方法，其中芳香聚腈化合物选自邻苯二甲腈、间苯二氰和对苯二腈，且芳香氰基羧酸是相应的邻氰基苯甲酸、间氰基苯甲酸或对氰基苯甲酸。
8.一种微生物变体，其具有将氰基转化成羧基的活性并且将氰基转化为酰胺基的活性缺失或降低。
9.权利要求8的微生物变体，其为红球菌属微生物的菌株变体。
10.权利要求9的微生物变体，其为红球菌ATCC39484的菌株变体。
11.一种红球菌SD826菌株(FERM BP-7305)。
12.一种生产羧酸的方法，包括用以含红球菌属细菌之腈水解酶基因的质粒转化的转化体将腈化合物的氰基转化成羧基，所述腈水解酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的DNA序列组成。
13.一种生产羧酸的方法，包括用以含红球菌属细菌之腈水解酶基因的质粒转化的转化体将腈化合物的氰基转化成羧基，所述腈水解酶基因由序列表中SEQ ID NO 1所示DNA序列组成。
14.一种生产羧酸的方法，包括用权利要求12或13的转化体将聚腈化合物的至少一个腈基转化成羧基。
15.权利要求14的羧酸生产方法，其中聚腈化合物是芳香聚腈化合物。
16.权利要求15的羧酸生产方法，其中芳香聚腈化合物选自邻苯二甲腈、间苯二氰和对苯二腈，而氰基羧酸是相应的邻氰基苯甲酸、间氰基苯甲酸或对氰基苯甲酸。
17.一种被含红球菌属细菌之腈水解酶基因的质粒转化的转化体，其用于权利要求12或13的方法，所述腈水解酶基因由编码序列表中SEQ ID NO2所示氨基酸序列的DNA序列组成。
18.一种被含红球菌属细菌之腈水解酶基因的质粒转化的转化体，其用于权利要求12或13的方法，所述腈水解酶基因由序列表中SEQ ID NO 1所示DNA序列组成。
19.一种含红球菌属细菌之腈水解酶基因的质粒，其用于制备权利要求17的转化体，所述腈水解酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的DNA序列组成。
20.一种含红球菌属细菌之腈水解酶基因的质粒，其用于制备权利要求18的转化体，所述腈水解酶基因由序列表中SEQ ID NO 1所示DNA序列组成。
21.一种腈水解酶基因，其源自于红球菌属细菌并由编码序列表中SEQID NO 2所示氨基酸序列的DNA序列组成。
22.一种腈水解酶基因，其源自于红球菌属细菌并由序列表中SEQ IDNO 1所示DNA序列组成。
23.权利要求22的腈水解酶基因，其中红球菌属细菌是红球菌ATCC39484。
24.一种生产腈水解酶的方法，包括培养权利要求17或18的转化体并从培养物中收集腈水解酶。
25.用权利要求24的方法制备的腈水解酶。
26.一种生产酰胺化合物的方法，包括用以含红球菌属细菌之腈水合酶基因的质粒转化的转化体将腈化合物的氰基转化成酰胺基，所述腈水合酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示氨基酸序列的DNA序列组成。
27.一种生产酰胺化合物的方法，包括用以含红球菌属细菌之腈水合酶基因的质粒转化的转化体将腈化合物的氰基转化成酰胺基，所述腈水合酶基因由序列表中SEO ID NO 3所示DNA序列组成。
28.一种生产羧酸的方法，包括用以含红球菌属细菌之酰胺酶基因的质粒转化的转化体将酰胺化合物的酰胺基转化成羧基，所述酰胺酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 7所示氨基酸序列的DNA序列组成。
29.一种生产羧酸的方法，包括用以含红球菌属细菌之酰胺酶基因的质粒转化的转化体将酰胺化合物的酰胺基转化成羧基，所述酰胺酶基因由序列表中SEQ ID NO 6所示DNA序列组成。
30.一种生产羧酸的方法，包括用以含红球菌属细菌之腈水合酶基因和红球菌属细菌之酰胺酶基因的质粒转化的转化体将腈化合物的氰基转化成羧基，所述腈水合酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 4和/或SEQ ID NO 5所示氨基酸序列的DNA序列组成，所述酰胺酶基因由编码序列表中SEQ IDNO 7所示氨基酸序列的DNA序列组成。
31.一种生产羧酸的方法，包括用以含红球菌属细菌之腈水合酶基因和红球菌属细菌之酰胺酶基因的质粒转化的转化体将腈化合物的氰基转化成羧基，所述腈水合酶基因由序列表中SEQ ID NO 3所示DNA序列组成，所述酰胺酶基因由序列表中SEQ ID NO 6所示DNA序列组成。
32.权利要求26或27的生产羧酸的方法，其中腈化合物选自邻苯二甲腈、间苯二氰和对苯二腈，而酰胺化合物是相应的邻氰基苯甲酰胺、间氰基苯甲酰胺或对氰基苯甲酰胺。
33.权利要求28或29的生产羧酸的方法，其中酰胺化合物选自邻氰基苯甲酰胺、间氰基苯甲酰胺或对氰基苯甲酰胺，而羧酸是相应的邻氰基苯甲酸、间氰基苯甲酸或对氰基苯甲酸。
34.权利要求30或31的生产羧酸的方法，其中腈化合物选自邻苯二甲腈、间苯二氰和对苯二腈，而羧酸是相应的邻氰基苯甲酸、间氰基苯甲酸或对氰基苯甲酸。
35.一种被含红球菌属细菌腈水合酶基因的质粒转化的转化体，其用于权利要求26的方法，所述腈水合酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示氨基酸序列的DNA序列组成。
36.一种被含红球菌属细菌腈水合酶基因的质粒转化的转化体，其用于权利要求27的方法，所述腈水合酶基因由序列表中SEQ ID NO 3所示DNA序列组成。
37.一种被含红球菌属细菌酰胺酶基因的质粒转化的转化体，其用于权利要求28的方法，所述酰胺酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 7所示氨基酸序列的DNA序列组成。
38.一种被含红球菌属细菌酰胺酶基因的质粒转化的转化体，其用于权利要求29的方法，所述酰胺酶基因由序列表中SEQ ID NO 6所示DNA序列组成。
39.一种转化体，其被含红球菌属细菌之腈水合酶基因和酰胺酶基因的质粒转化，所述腈水合酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 4和/或SEQ IDNO 5所示氨基酸序列的DNA序列组成，所述酰胺酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 7所示氨基酸序列的DNA序列组成，该转化体用于权利要求30的方法。
40.一种转化体，其被含红球菌属细菌之腈水合酶基因和酰胺酶基因的质粒转化，所述腈水合酶基因由序列表中SEQ ID NO 3所示DNA序列组成，所述酰胺酶基因由序列表中SEQ ID NO 6所示DNA序列组成，该转化体用于权利要求31的方法。
41.一种质粒，其含红球菌属细菌的腈水合酶基因，所述腈水合酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示氨基酸序列的DNA序列组成，该质粒用于制备权利要求35的转化体。
42.一种质粒，其含红球菌属细菌的腈水合酶基因，所述腈水合酶基因由序列表中SEQ ID NO 3所示DNA序列组成，该质粒用于制备 36的转化体。
43.一种质粒，其含红球菌属细菌的酰胺酶基因，所述酰胺酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 7所示氨基酸序列的DNA序列组成，该质粒用于制备权利要求37的转化体。
44.一种质粒，其含红球菌属细菌的酰胺酶基因，所述酰胺酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 6所示DNA序列组成，该质粒用于制备 38的转化体。
45.一种质粒，其含红球菌属细菌的腈水合酶基因和酰胺酶基因，所述腈水合酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 4和/SEQ ID NO 5或所示氨基酸序列的DNA序列组成，所述酰胺酶基因由编码序列表中SEQ ID NO 7所示氨基酸序列的DNA序列组成，该质粒用于制备权利要求39的转化体。
46.一种质粒，其含红球菌属细菌的腈水合酶基因和酰胺酶基因，所述腈水合酶基因由序列表中SEQ ID NO 3所示DNA序列组成，所述酰胺酶基因由序列表中SEQ ID NO 6所示DNA序列组成，该质粒用于制备权利要求40的转化体。
47.一种腈水合酶基因，其源自于红球菌属细菌并由编码序列表中SEQID NO 4和/或SEQ ID NO 5所示氨基酸序列的DNA序列组成。
48.一种腈水合酶基因，其源自于红球菌属细菌并由序列表中SEQ IDNO 3所示DNA序列组成。
49.一种权利要求47的腈水合酶基因，其中红球菌属细菌是红球菌ATCC39484。
50.一种酰胺酶基因，其源自于红球菌属细菌并由编码序列表中SEQ IDNO 7所示氨基酸序列的DNA序列组成。
51.一种酰胺酶基因，其源自于红球菌属细菌并由序列表中SEQ ID NO6所示DNA序列组成。
52.一种权利要求51所述的酰胺酶基因，其中红球菌属细菌是红球菌ATCC39484。
53.一种生产腈水合酶的方法，包括在培养基中培养权利要求35或36的转化体并从培养物中收集腈水合酶。
54.一种生产酰胺酶的方法，包括在培养基中培养权利要求37或38的转化体并从培养物中收集酰胺酶。
55.一种生产腈水合酶和/或酰胺酶的方法，包括在培养基中培养权利要求39或40的转化体并从培养物中收集腈水合酶和/或酰胺酶。
56.由权利要求53的方法制备的腈水合酶。
57.由权利要求54的方法制备的酰胺酶。
58.由权利要求55的方法制备的腈水合酶和/或酰胺酶。
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