CN1231585C

CN1231585C - 重组鸭白介素2蛋白的制备方法及其用途

Info

Publication number: CN1231585C
Application number: CN 200310108658
Authority: CN
Inventors: 周继勇; 王金勇; 吴建祥; 陈吉刚
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2003-11-12
Filing date: 2003-11-12
Publication date: 2005-12-14
Anticipated expiration: 2023-11-12
Also published as: CN1544630A

Abstract

本发明公开了一种重组鸭白介素2蛋白制备方法及其用途。RT-PCR扩增的不同品种鸭的鸭白介素-2cDNA片段与原核表达载体pBAD/his B载体和真核表达载体pMETαA构建高效表达质粒，重组表达载体分别转化大肠杆菌LMG194和酵母菌株PMAD11和PMAD16后诱导表达。大肠杆菌诱导后经超声波裂解、离心去沉淀即可得到鸭白介素-2粗制品，用蛋白纯化***得到鸭白介素2纯品。鸭白介素-2粗制品或纯品加保护剂后可以作为免疫佐剂、抗病添加剂和疾病治疗药物。鸭白介素-2单克隆抗体和多克隆抗体的制备过程简单经济，可以作为良好的免疫抑制剂。本发明应用基因工程技术制备的重组鸭白介素-2蛋白，具有工艺流程简单，生产成本低，稳定性好，生物学活性高等特点。

Description

重组鸭白介素2蛋白的制备方法及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种鸭白介素2蛋白的制备方法及其用途。

背景技术

1997年Sundick等用构建cDNA文库的方法首次从鸡脾脏中获得鸡IL-2基因，1998年Choi等把含信号序列长430个核苷酸的鸡IL-2基因克隆入PUC18载体和真核表达载体pcDNA3，分别在大肠杆菌和CHO-K1细胞中进行表达，得到的两种蛋白都具有鸡T淋巴细胞增殖的生物学活性。1999年Stepaniak等对鸡IL-2体外表达进行了比较深入的研究，将去除前导肽的鸡IL-2基因在大肠杆菌Pgex-2t***中进行了表达，得到的蛋白具有鸡IL-2蛋白的生物学活性，但表达效率较低仅为63μg/L，且多为非可溶性蛋白，不利于蛋白的回收和纯化。为解决此问题，他们采用了pET32a⁺高效表达***，将IL-2与硫氧还原蛋白在缺失硫代还原酶的大肠杆菌菌株中进行融合表达，结果发现蛋白表达量提高到4mg/L，而且绝大部分为可溶性蛋白，该学者同时将含前导肽的完整鸡IL-2基因克隆入真核表达载体pCR3.1⁺中，在肾成纤维细胞系中进行表达，结果发现该***不但能稳定表达鸡IL-2蛋白，而且上清和经纯化的蛋白都具有完整的生物学活性，这说明鸡IL-2和哺乳动物IL-2相似，其活性并不依赖于前导序列。

成熟的鸡IL-2蛋白是由121个氨基酸组成。它和人IL-2具有相类似的生物学活性，如促进B淋巴细胞和T淋巴细胞的增殖，增强NK细胞的杀伤活性等功能，在机体免疫中发挥重要作用。家禽中一些造成重大经济损失的疾病如传染性法氏囊病毒、马立克氏病毒、新城疫病毒、传染性贫血病病毒、禽骨髓成红细胞增多症病毒、禽流感病病毒以及球虫感染后大多伴有IL-2分泌异常，因此鸡IL-2可能在抗感染免疫中发挥重要作用。并且，研究发现，鸡IL-2在抗沙门氏菌和寄生虫的实验中效果明显。

我们利用RT-PCR技术从鸭脾淋巴细胞中扩增了2个不同品系鸭IL-2的cDNA片段，并实现了在原核和真核细胞中的高效表达，表达产物具有明显的生物学活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组鸭白介素2蛋白制备方法及其用途。

重组鸭白介素2蛋白的制备方法的步骤如下：

1)自中国的绍兴麻鸭和外来品种美洲鸭的脾淋巴细胞中克隆出鸭白介素-2的cDNA与含有P_BAD启动子的原核表达载体pBAD/his B组建成高效表达载体pBAD/His B/dkIL-2；或者与含有P_AUG1启动子的真核表达载体pMETαA组建成高效表达载体pMETαA/dkIL-2；

2)用RM作为基础培养基，通过发酵扩增大肠杆菌工程菌LMG194；

3)用BMDY作为基础培养基，通过发酵扩增酵母工程菌PMAD11和PMAD16，在表达不同时间加氮源、碳源营养素；

4)大肠杆菌LMG194诱导后经超声波裂解、离心去沉淀即可得到鸭白介素2粗制品，PMAD11和PMAD16表达的鸭白介素2主要以分泌形式存在于培养基中，经过离心取上清即可得到鸭白介素2粗制品；用Ni-NTA Argarose蛋白纯化***可得到鸭白介素2纯品；

5)制备的重组鸭白介素2纯品或非纯品加入甘氨酸等稳定剂和助溶剂后，无菌过滤、分装和冻干后制成的成品，保存于-20℃的冷藏环境中；

6)鸭白介素2单克隆抗体的制备：用重组鸭白介素2纯品抗原免疫小鼠，经细胞融合，杂交瘤细胞及阳性孔的筛选，阳性孔的特异性检测及特异性阳性孔的克隆，液氮保存。获得的单克隆抗体腹水纯化后，液氮保存；

7)鸭白介素2多克隆抗体的制备：用鸭白介素2纯品抗原0.3-0.5mg，加等体积弗氏完全佐剂初次背部皮下注射免疫健康兔子，3周后加等体积弗氏不完全佐剂以同样抗原剂量二次免疫，3周后不加佐剂其它同与前面操作进行三次免疫；7-10天后采血清，试血测其效价再次加强免疫，7天以后采血清测效价，琼扩效价达1∶32-64，离心取上清低温保存。

它用于免疫佐剂、抗病添加剂和疾病治疗药物。

本发明的优点：(1)大肠杆菌表达的鸭白介素-2蛋白主要以融合蛋白的形式存在基因工程菌内，经超声波就可以使目的蛋白释放出来，不需要其他的处理就可以得到鸭白介素-2粗蛋白，且其稳定性好、生物学活性较高；(2)选用分泌型酵母表达载体pMETαA，所表达的鸭白介素-2蛋白大部分被分泌到培养基中，不但不需要任何的处理就可以得到鸭白介素-2粗制品，且目的蛋白具有良好的稳定性和生物学活性；(3)所用的Ni-NTA Agarose蛋白纯化***操作简单，得到的蛋白纯度高；(4)重组鸭白介素-2作为免疫佐剂用于提高疫苗免疫效力；作为家禽治疗药物具有抗病毒、抗菌和抗寄生虫活性；作为饲料添加剂具有激活和提高机体免疫***功能的作用以及促生产作用，dkIL-2蛋白单抗、多抗具有良好的免疫抑制性能；(5)5株鸭白介素-2单抗杂交瘤细胞株稳定性好，抗体分泌能力强，单克隆抗体的效价高和亲合力强。

附图说明

图1是BSA制定的标准曲线图；

图2是重组鸭白介素2原核表达产物的活性检测结果。

具体实施方式

重组鸭白介素2蛋白的制备方法的步骤如下：

1)设计PCR引物，自绍兴麻鸭和美洲鸭的脾淋巴细胞中克隆出鸭白介素-2的cDNA片段SEQ ID No.1、SEQ ID No.3；

2)上述鸭白介素-2cDNA与含有P_BAD启动子的原核表达载体pBAD/His B组建成表达载体pBAD/His B/dkIL-2；或者上述鸭白介素-2cDNA与含有P_AUG1启动子的真核表达载体pMETαA组建成分泌型表达载体pMETαA/dkIL-2；

3)用RM作为基础培养基，通过发酵扩增大肠杆菌工程菌LMG194；

4)用BMDY作为基础培养基，通过发酵扩增酵母工程菌PMAD11和PMAD16，在表达不同时间加氮源、碳源等营养素；

5)大肠杆菌LMG194和酵母菌PMAD11和PMAD16诱导后经超声波裂解、离心去沉淀即可得到鸭白介素-2粗制品，PMAD11和PMAD16表达的鸭白介素-2主要以分泌形式存在于培养基中，经过离心取上清即可得到鸭白介素-2粗制品。用Ni-NTA Argarose蛋白纯化***可得到鸭白介素-2纯品；

6)粗制品或纯品加入甘氨酸等稳定剂和助溶剂后，无菌过滤、分装和冻干后制成成品，保存于-20℃的冷藏环境中。

7)用鸭白介素-2纯品免疫小鼠，获5F6、2B3、1H4、5H6、4G12等5株单克隆抗体杂交瘤细胞株。

8)用鸭白介素-2纯品免疫家兔，获得效价达1∶32-64的鸭白介素-2多抗血清。

本发明中，1鸭白介素-2基因克隆用刀豆素(ConA)刺激鸡脾细胞，提取总RNA，通过RT-PCR方法分别扩增和克隆了绍兴麻鸭和美洲鸭鸭白介素-2cDNA，将其连接到测序载体pGEM-T Easy Vector，测定鸭白介素-2cDNA序列。

2重组表达鸭白介素-2基因工程大肠杆菌的构建绍兴麻鸭鸭白介素-2的PCR扩增产物亚克隆到一新型高效表达载体pBAD/His B中，构建成鸭白介素-2原核表达质粒pBAD/His B/dkIL-2，它能在大肠杆菌LMG194中高效表达，使鸭白介素-2占菌体总蛋白的7～9％，表达率经100次以上传代不降低。

3重组表达鸭白介素-2基因工程酵母菌的构建将绍兴麻鸭鸭白介素-2的PCR扩增产物亚克隆到一新型高效真核表达载体pMETαA中，分别构建成鸭白介素-2表达质粒pMETαA/dkIL-2中，用BMDY作为基础培养基，用甲醇作为诱导剂，通过优化溶氧、震荡速度、发酵pH值等工艺参数，可以使鸭白介素-2基因在P.methanolica表达菌株PMAD11和PMAD16中得到高效表达，表达量分别占菌体总蛋白的15～20％和10～12％。，表达率经100次以上传代不降低。

4重组鸭白介素-2粗制品的制备及纯化工艺。

所建立的粗制品的制备及纯化工艺流程简单、稳定性好、活性高。本工艺具有以下特点：(1)大肠杆菌表达的鸭白介素-2蛋白主要以融合蛋白的形式存在工程菌内，经超声波就可以使目的蛋白释放出来，不需要其他的处理就可以得到鸭白介素-2粗蛋白，且其生物学活性较高；(2)选用分泌型酵母表达载体pMETαA，所表达的鸭白介素-2蛋白大部分被分泌到培养基中，不需要任何的处理就可以得到鸭白介素-2粗产品，并目的蛋白具有良好的生物学活性；(3)所用的Ni-NTA Agarose蛋白纯化***操作简单，得到的蛋白纯度高。

5粗制品或纯品加入磷酸缓冲液等助溶剂，用微空滤膜过滤除菌，可以作为免疫佐剂、抗病添加剂和疾病治疗药物。

鸭白介素-2的-个重要生物功能就是促进T淋巴细胞的增殖，我们用经有丝***原刺激的鸡脾T淋巴细胞作为靶细胞，用MTT法对鸭白介素-2的活性进行了检测，证实表达产物具有较高的生物学活性。

本发明运用重组DNA技术，采用反转录PCR方法得到了一种重组的鸭白介素-2。经过下游纯化，中试规模下的产品达到了临床用药的质量要求。

实施例1.寡核苷酸引物的设计与合成

根据Sundick等报道的鸡IL-2核苷酸序列设计了5’端和3’端一对引物。5’端引物和3’端引物引入Hind III酶切位点。合成以下两条引物：

5’端引物：5’-GC GGATCCAACACTGACAAGATGTGC-3’

3’端引物：5’-GC GGATCCGTAGGTTACTGAAATTTA-3’

实施例2.脾淋巴细胞的分离

饲养至12日龄的两个不同品系的雏鸭经颈动脉放血后无菌采集脾脏、剪碎置于无Ca²⁺、Mg²⁺离子的PBS中(717mmol/L K₂HPO₄，283mmol/L KH₂PO₄，PH7.2)中，300×g 4℃离心10min，上清液移至含有等体积淋巴细胞分离液的离心管中，500×g 4℃离心30min，毛细管伸至单核细胞层中，沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用PBS洗两次，再以RPMI1640培养液(不含犊牛血清)洗涤1次，台盼蓝(0.1％)染色活细胞计数后，用RPMI1640生长培养液(含10％的犊牛血清、100IU/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素)将细胞分别配成2×10⁶/ml的细胞悬液。细胞悬液中加入10μg/ml终浓度ConA，分装细胞培养板，5％二氧化碳培养箱40℃培养20小时，收集单个核淋巴细胞。

实施例3.RT-PCR扩增目的基因片断

采用Trizol reagent(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)提取单个核淋巴细胞mRNA，以收集的单个核淋巴细胞mRNA为模板，5’端和3’端合成引物，用ReverseTranscription System kit反转录合成dkIL-2cDNA第一链；反转录产物在95℃1min、56℃45s、72℃2min环境下30个循环进行PCR，最后延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析。

实施例4.测序载体的构建和序列测定

用PCR产物纯化试剂盒回收目的片段，利用T-A克隆策略直接连接于pGEM-T easy vector，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选。挑取阳性克隆，分别进行PCR鉴定和酶切鉴定。DNA自动测序仪测定每个品种鸭dkIL-2基因核苷酸序列。每个品种鸭白介素-2基因核苷酸及推导氨基酸序列见表1、表2。

1 AACACTGACAAGATGTGCAAAGTACTCATCTTCAGCTGCCTTTCAGTACTAATGCTTATGACTACAGCT 69

2 M C K V L I F S C L S V L M L M T T A 69

1 TATGGAGCACCTCTATCAGAGAAAGACAACACTCTTAAAACTTTAATAAAAGATTTAGAAAACCTGGGA 138

2 Y G A P L S E K D N T L K T L I K D L E N L G 138

1 ACAAGCATGAATGGGATTGATCTTGAGCTCTACACACCAAATGACACAAAGGAGTGCAGCTGGCAAACT 207

2 T S M N G I D L E L Y T P N D T K E C S W Q T 207

1 CTGCAATGTTACTTGAAAGAAATAGTCACCTTGGAGGAAGAAATTGAAGATGAGGATGAAATTGAAGAT 276

2 L Q C Y L K E I V T L E E E I E D E D E I E D 276

1 GAGAAGGTATCTAGTGTTCGGAATATCAAAATGAATCTCCAAAAACTTATGGACCTAATTCCCCCAGGA 345

2 E K V S S V R N I K M N L Q K L M D L I P P G 345

1 ACGGGATGCAATATCTGTGAAGCTAATGCCAACAACTTCCCTGAATTTCGCCAAGAGCTGACCAACTTC 414

2 T G C N I C E A N A N N F P E F R Q E L T N F 414

1 CTGAGATCTATGCTAAAATAAGCAGATGACCATTTCTATTTTTACTGCTATGTTATTTATTTAACTATT 483

2 L R S M L K

1 TAATTACAAATAATTTATATATTTTACCCTGGGGCTACCTAACTTGCTGTCCGCTTTGGGACCACTGTA 552

1 TGCTCTTAGTGTGGGCGATAACGTGTCTGTTCTAAGATCACATTTGATCCTTTTATGTAAGCCCTACGG 621

1 GCTCAAAATGTATGTTGGAAAACTAATTTGTTCTCGCTTTGTCAATAAACTTAAAATGACAACTATTTA 690

1 TTGAAAGAATTGTTAAAAGTTACTTGTAGATGATATTTAATAAATTTCAGTAACCTAC 748

表1.绍兴麻鸭dkIL-2核苷酸及氨基酸序列(SEQ ID No.1)

(1.核苷酸序列2.氨基酸序列)

1 AAGACTGACAAGATGTGCAAAGTACTCATCTTCAGCTGCCTTTCAGTACTAATGCTTATGACTACAGCT 69

2 M C K V L I F S C L S V L M L M T T A 69

1 TATGGAGCACCTCTATCAGAGAAAGACAACACTCTTACAACTTTAATAAAAGATTTAGAAAACCTGGGA 138

2 Y G A P L S E K D N T L T T L I K D L E N L G 138

1 ACAAGCATGAATGGGATTGATCTTGAGCTCTACACACCAAATGACACAAAGGAGTGCAGCTGGCAAACT 207

2 T S M N G I D L E L Y T P N D T K E C S W Q T 207

1 CTGCAATGTTACTTGAAAGAAATAGTCACCTTGGAGAAAGAAATTGAAGATGAAGATGAAATTGAAGAT 276

2 L Q C Y L K E I V T L E K E I E D E D E I E D 276

1 GAGAACGTATCTAGTGTTCGGAATATCAAAATGAATCTCCAAAAACTTATGGACCTAATTCCCCCAAGA 345

2 E N V S S V R N I K M N L Q K L M D L I P P R 345

1 ACGGGATGCAATATCTGTGAAGCTAATGCCAAGAACTTCCCTGAATTTCGCCGAGAGCTGACCAACTTC 414

2 T G C N I C E A N A K N F P E F R R E L T N F 414

1 CTGAGATCTATGCTAAAATAAGCAGATGACCATTTCTATTTTTACTGCTATGTTATTTATTTAACTATT 483

2 L R S M L K

1 TAATAACAAATAATTTATATATTTTACCCTGGGGCTACCTAACTTGCTGTCCACTTTGGGACCACTGTA 552

1 TGCTCTTAGTGTGGGTGATAACGTGTCTGTTCTAAGATCACATTTGATCCTTTTATGTAAGCCCTACGG 621

1 GCTCAAAACATATGTTGGAAAACTAACTTGTTCTCGCTTTGTCAATAAACTTAAAATGACAACTATTTA 690

1 TTGAAAGAATTGTTAAAAGTTACTTGTAGATTATATTTAATAAATTTCAGTAACCTAC 748

表2.美洲鸭核苷酸及氨基酸序列(SEQ ID No.3)

(1.核苷酸序列 2.氨基酸序列)

实施例5.pBAD/His B/dkIL-2表达载体构建、筛选及鉴定

根据绍兴麻鸭白介素-2序列，在成熟蛋白序列两端合成上下游引物：UP1(5’-CGAATTCGCACCTCTATCAGAGAAA-3’)，5’端含EcoRI酶切位点；DOWN1(5’CAAGCTTTTATTTTAGCATAGATCT 3’)，5’端含Hind III酶切位点；以pGEM-T-Easy/dkIL-2为模板在95℃1min、56℃45s、72℃2min环境下30个循环进行PCR，最后延伸10min。PCR产物电泳回收后，经EcoRI、Hind III双酶切后，回收目的片段并克隆于表达质粒pBAD/His B的EcoRI+Hind III酶切窗口中，构建重组表达质粒pBAD/His B/dkIL-2，转化宿主菌TOP10，提取重组质粒进行PCR、双酶切鉴定和序列测定。

实施例6.重组鸭白介素-2的发酵生产(大肠杆菌)

经鉴定的重组质粒转入LMG194宿主菌，挑取单克隆接种到含有氨卞青霉素和葡萄糖的RM培养基中，37℃培养过夜，按1∶100的比例将培养物接种于RM培养基中，250rpm震荡培养2小时左右，使OD600≈0.5，按1∶100的比例加入20％浓度的L(+)-***糖诱导培养3小时，离心收集菌体。将菌体加入适量的1×SDS上样缓冲液，采用15％的SDS-PAGE鉴定，产物表达量可达7～9％。

实施例7.pMETαA/dkIL-2表达载体构建、筛选及鉴定

根据绍兴麻鸭dkIL-2序列在其成熟蛋白序列合成上下游引物：上游引物同实例5中UP1；下游引物DOWN2(5’-C GGATCCTTTTAGCATAGATCTCAG-3’)，5’端含BamHI酶切位点。以pGEM-T-Easy/dkIL-2为模板进行PCR，扩增条件同实例5。PCR产物电泳回收后，经EcoRI、BamHI双酶切后，回收目的片段克隆于表达质粒pMETαA强启动子下游的EcoRI+BamHI酶切窗口中，构建重组表达质粒，转化宿主菌TOP10，提取重组质粒进行PCR、双酶切鉴定和序列测定。

采用Choi等报道的方法制备PMAD11和PMAD16感受态细胞，分别取100μlPMAD11和PMAD16酵母感受态细胞与2μg经APAI酶切完全的pMETαA/dkIL-2和混合，使用Bio-Rad Gene Pluser在375V/cm，25μF、250Ω的条件下进行转化，然后加入1ml室温的YPAD，28～30℃孵育1h，1500×g室温离心3min收集菌体，重新悬于100μl 1×YNB，将菌液涂布于MD选择平板上，28～30□培养3～4天，观察转化子的生长情况。随机筛选MD平板上白色菌落，用Genomic DNAmini-prepkit提取酵母基因组DNA进行PCR扩增鉴定。

实施例8.重组鸭白介素-2的发酵生产(酵母)

分别挑取PCR鉴定为阳性的PMAD11和PMAD16克隆接种于20mL BMDY培养基中，28～30℃，250r/min震荡培养16～18h至OD₆₀₀＝2～10。室温，1500×g离心5min，收集菌体重悬于10mL BMMY培养基中。28～30℃，250r/min继续震荡培养4天，每24小时补加5％的甲醇使甲醇终浓度为0.5％，离心收集上清，SDS-PAGE电泳鉴定dkIL-2表达水平，凝胶成像***扫描显示dkIL-2占菌体总蛋白的15％。

实施例9.基因工程菌的保存与稳定性(酵母)

工程菌加30％甘油，-70℃保存。短期保存菌种可用YPAD平板。为检查工程菌的稳定性，将原始菌种、50代和100代菌分别抽提质粒进行序列测定。结果三者相同。同时三代菌种扩增培养物表达水平相当，证明本发明中的工程菌是十分稳定的。

实施例10.基因工程菌的保存与稳定性(大肠杆菌)

工程菌加30％甘油，-70℃保存。短期保存菌种可用LB平板。为检查工程菌的稳定性，将原始菌种、50代和100代菌分别抽提质粒进行序列测定。结果三者相同。同时三代菌种扩增培养物表达水平相当，证明本发明中的工程菌是十分稳定的。

实施例11.重组鸭白介素-2粗蛋白的制备及分离纯化

经大肠杆菌菌株LMG194表达的鸭白介素-2主要以融合蛋白的形式存在，菌体经超声波破碎后，可以得到鸭白介素-2粗制品，进一步用QIAGEN公司的Ni-NTA蛋白纯化***可以较快的得到鸭白介素-2纯品。

含有pMETαA/dkIL-2重组载体的P.methanolica表达菌株PMAD11和PMAD16表达的鸭白介素-2主要以分泌形式存在于培养基中，经过离心取上清即可得到鸭白介素-2粗制品，用QIAGEN公司的Ni-NTA Agarose蛋白纯化***可以较快的得到鸭白介素-2纯品；

实施例12.鸭白介素-2纯品的定量。

用Bradford法对蛋白纯化产物进行定量。

经测定每升大肠杆菌可以得到4mg有活性的鸭白介素-2，每升酵母培养产物可以得到30mg有活性的鸭白介素-2。

实施例13.重组鸭白介素-2的鉴定

SDS-PAGE和HPLC检定纯度均在98％以上，MTT法测定粗制品及纯品的生物学活性，大肠杆菌和P.methanolica酵母的表达产物不但具有刺激T淋巴细胞生长的活性，且活性明显高于ConA诱导的T淋巴细胞上清液的活性，但dkIL-2在体外不具有刺激T淋巴细胞生长的活性。

实施例14.重组鸭白介素-2理化性质及稳定性

重组鸭白介素-2对热较稳定，56□1小时、37□12小时或70□15分钟处理仍保留活性，4可保存1年以上，其活性在pH2～9范围内保持稳定。重组鸭白介素-2对蛋白酶敏感，对DNA酶、RNA酶不敏感。

实施例15.重组鸭白介素-2的生物学活性检测

从鸭脾脏获得的淋巴细胞悬液用含犊牛血清(10％)和刀豆素A(10ug/ml)的RPMI1640稀释成5*10⁶个/ml的细胞细胞悬液，41℃，5％CO₂培养48h.收集到的细胞重悬于含0.1M的甲基甘露醇的RPMI1640培养液作用半小时。处理后的细胞重悬于含犊牛血清(10％)和刀豆素A(10ug/ml)的RPMI1640培养液，终浓度为5*10⁶个/ml，然后加入到96孔细胞培养板中，用MTT法检测表达产物的生物学活性。将RPMI1640稀释成一系列倍数的鸭白介素-2粗蛋白加入到96孔培养板，空质粒的表达产物及纯RPMI培养液作为阴性对照。41℃，5％CO₂培养48h用MTT(20ul/孔)作用3小时，加10％SDS-0.01mol/LHCl裂解细胞充分融解甲晶体。用紫外分光光度计在OD₄₉₀处读数。结果表明重组鸭白介素-2的原核、真核表达产物均具有明显的生物学活性。图2为重组鸭白介素-2原核表达产物的活性检测结果，其它数据未显示。

a：只含有RPMI培养液的鸭淋巴细胞；

b：培养液中只含有空质粒表达产物的鸭淋巴细胞；

c-g：培养液中含不同浓度梯度重组dkIL-2原核表达产物的鸭淋巴细胞

实例17.鸭白介素-2单克隆抗体的制备

1.抗原免疫

用纯化的鸭白介素-2原核表达产物(50-100μg/只与等体积弗氏完全佐剂混合)作免疫原，经腹腔注射体重18-20g BALB/C雌性小鼠。间隔3周取与一免等量抗原和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后，进行第二次腹腔注射，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。

2.细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5-10∶1的比例，在无血清的RPMI-1640(Gibco)培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50％PEG(Sigma)作为融合剂，在37℃下加入0.5-0.7ml，融合2-3min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后，1500-2000rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。

3.杂交瘤细胞及阳性孔的筛选

细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HAT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10％-50％时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔。阳性率为15％。

4.阳性孔的特异性检测及特异性阳性孔的克隆

阳性孔的特异性鉴定采用间接ELISA方法。用包被液包被抗原(原核表达的鸭白介素-2、His融合表达蛋白、含空质粒表达菌体的裂解液)，37℃过夜；PBST洗涤三次后用5％的脱脂奶粉封闭0.5-2小时；加入阳性孔培养上清100ul/孔，37℃l-2小时；PBST洗涤三次后加入经脱脂奶粉稀释5000倍的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗(Sigma公司)100ul/孔，37℃1-2小时，PBST洗涤三次后，用OPD-H₂O₂底物显色，15分钟后2mol/L H₂SO₄终止反应，用酶标仪读取OD₄₉₀的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。筛选到针对鸭白介素-2的特异性细胞株，筛选出的特异性阳性孔用常规的有限稀释法克隆，获5F6、2B3、1H4、5H6、4G12等5株单抗细胞株。细胞株进一步扩大培养，用于制备单抗腹水和液氮冻存。

5.单克隆抗体腹水制备及纯化

取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷(Sigma)，7-10天后腹腔注入5-10×10⁵个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，2000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。

实例18.多抗的制备

用鸭白介素-2纯品抗原(Ag)0.3-0.5mg，加等体积弗氏完全佐剂初次背部皮下注射免疫健康兔子，3周后加等体积弗氏不完全佐剂以同样抗原剂量二次免疫(背部皮下注射)，3周后不加佐剂其它同与前面操作进行三次免疫。7-10天后采血清，试血测其效价再次加强免疫，7天以后采血清测效价，琼扩效价达1∶32-64，离心取上清低温保存。

实例19.重组鸭白介素-2作为免疫佐剂、抗病添加剂和疾病治疗药物。用重组鸭白介素-2作为鸭病毒性肝炎灭活疫苗的免疫佐剂，在雏鸭出壳1至3天进行免疫，进行鸭病毒性肝炎攻击，可以明显降低雏鸭死亡率(下降40％)，发病症状也明显减轻。并且对未免疫的发病鸭注射高免血清(或卵黄)或康复鸭的血清的同时添加重组鸭白介素-2，与不添加相比也明显减少病死率。重组鸭白介素-2作为饲料添加剂，鸭的食欲增进，增重较对照组明显，抵抗力明显增强。鸭白介素-2的单抗和多抗具有明显的免疫抑制功能，有助于对水禽免疫***机理，肿瘤机制展开深入研究。

Claims

1.一种重组鸭白介素2制备方法，其特征在于它的步骤如下：

1)分别自中国的绍兴麻鸭和外来品种美洲鸭的脾淋巴细胞中克隆出SEQ IDNO：1，3所示序列的鸭白介素-2的cDNAs与含有P_BAD启动子的原核表达载体pBAD/his B组建成高效表达载体pBAD/His B/dkIL-2；或者该cDNAs与含有P_AUG1启动子的真核表达载体pMETαA组建成高效表达载体pMETαA/dkIL-2；

2)重组载体pBAD/His B/dkIL-2转化大肠杆菌LMG194，用RM作为基础培养基，通过发酵扩增大肠杆菌工程菌LMG194；

或3)重组载体pMETαA/dkIL-2分别转化酵母菌PMAD11和PMAD16，用BMDY作为基础培养基，通过发酵扩增酵母工程菌PMAD11和PMAD16，在表达不同时间加氮源、碳源营养素；

4)大肠杆菌工程菌LMG194用***糖诱导后经超声波裂解、离心去沉淀即可得到鸭白介素-2粗制品，酵母工程菌PMAD11和PMAD16用甲醇诱导表达后，表达的鸭白介素-2主要以分泌形式存在于BMDY培养基中，经过离心取上清即可得到鸭白介素-2粗制品；用Ni-NTA Argarose蛋白纯化***可得到鸭白介素-2纯品；

5)制备的重组鸭白介素-2纯品或粗制品加入稳定剂和助溶剂后，将无菌过滤、分装和冻干后制成的成品，保存于-20℃的冷藏环境中。

2.根据权利要求1所述的一种重组鸭白介素-2蛋白的制备方法，其特征在于：步骤4)中的大肠杆菌工程菌LMG194经20％L-***糖诱导表达后，产物以融合蛋白的形式存在工程菌内。

3.根据权利要求1所述的一种重组鸭白介素-2蛋白的制备方法，其特征在于：步骤4)中的酵母工程菌PMAD11和PMAD16，经甲醇诱导表达后，产物以分泌物形式存在于工程菌培养基中。