CN106434685A - 制备重组红鳍东方鲀白介素2蛋白的基因及方法 - Google Patents

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孙鹤
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Abstract

本发明公开一种可高效表达且表达产物具有明显生物学活性的制备重组红鳍东方鲀白介素2的基因及制备方法，方法依次按照如下步骤进行：将SEQ ID NO:1所示的基因克隆入原核表达载体pET‑32a上，构建原核表达质粒；将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选阳性克隆，构建重组大肠杆菌BL21(DE3)；用LB作为基础培养基，扩大培养重组大肠杆菌BL21(DE3)；向扩大培养物中加入IPTG诱导剂诱导培养，离心收集菌体；超声破碎所收集菌体，离心后取上清液，即得重组红鳍东方鲀白介素2蛋白粗品。

Description

制备重组红鳍东方鲀白介素2蛋白的基因及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种可高效表达且表达产物具有明显生物学活性的制备重组红鳍东方鲀白介素2蛋白的基因及方法。
背景技术
红鳍东方鲀是国内主要养殖鱼类品种，但是养殖中经常会有一些病毒性疾病和细菌性疾病，例如：白嘴病，真鲷虹彩病毒病，弧菌病，链球菌病等等。对于这些疾病，往往想到的应对方案就是使用化学类药物或是抗生素，但是这种方法问题较多，近年来，天然免疫类产品在此方面发挥着重要的作用，它能够代替抗生素作为一种安全的药品应用于实践中。
白细胞介素简称白介素（interleukins,IL），是能够在免疫细胞和白细胞之间相互作用的一类细胞因子家族，其中白介素-2（IL-2）是该家族中的重要成员。研究发现，白介素-2在免疫***中扮演重要角色，是影响机体免疫反应的重要调节因子。对白介素2的广泛研究是从1983年首次克隆并测序了人类IL-2基因之后， 1998年Choi等将含有信号肽的鸡白介素2基因克隆入PUC18载体，在大肠杆菌中进行表达，得到的蛋白具有促进鸡T淋巴细胞增值的生物学活性；1999年Stepaniak等对鸡白介素2基因的体外表达进行了比较深入的研究，他将去除前导肽的鸡白介素2基因序列在大肠杆菌Pgex-2t***中进行表达，所得表达产物虽具有生物学活性，但是表达量低，且多为非可溶性表达，不利于产物的回收及纯化。为解决此问题Stepaniak等人将上述表达***换为pET-32a+高表达***，将IL-2基因与硫氧还蛋白在缺失硫代还原酶的大肠杆菌菌株中进行融合表达，结果发现蛋白表达量有显著提高，且产物多为可溶性蛋白。但是由于鱼类细胞因子含量低等原因，一直以来对鱼类白介素2基因的研究相对滞后。
2001年开始，鱼类白介素2的研究广泛展开，徐炳森等从草鱼头肾淋巴细胞中提取RNA并反转录为cDNA，以高等动物和牙鲆的IL-2基因两端的保守序列为依据设计合成引物，以cDNA为模板进行PCR扩增，并将其克隆入PET-28载体后在大肠杆菌中进行表达。但是，迄今为止，还没有关于原核表达和真核表达获得重组红鳍东方鲀白介素2蛋白的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的技术问题，提供一种可高效表达且表达产物具有明显生物学活性的重组红鳍东方鲀白介素2蛋白的制备方法。
本发明的技术解决方案是：一种制备重组红鳍东方鲀白介素2蛋白的基因，其特征在于所述基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。
一种制备重组红鳍东方鲀白介素2蛋白的方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：
a. 将DNA序列如SEQ ID NO:1所示的基因克隆入原核表达载体pET-32a上，构建原核表达质粒；
b. 将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选阳性克隆，构建重组大肠杆菌BL21(DE3)；
c. 用LB作为基础培养基，扩大培养重组大肠杆菌BL21(DE3)；
d. 向扩大培养物中加入IPTG诱导剂诱导培养，离心收集菌体；
e. 超声破碎所收集菌体，离心后取上清液，即得重组红鳍东方鲀白介素2蛋白粗品。
将e步骤所得上清液经过Ni柱蛋白纯化***进行纯化，即得重组红鳍东方鲀白介素2蛋白纯品。
本发明是在天然红鳍东方鲀白介素2基因的基础上针对大肠杆菌密码子的偏爱性进行密码子优化，并在序列两端加入酶切位点及标签序列等，继而以改造的基因制备重组红鳍东方鲀白介素2蛋白，与现有技术相比，具有如下优点：（1）能够在大肠杆菌中更高效表达，表达量占菌体总蛋白的50%左右，表达率经百次传代不降低；（2）所表达的重组红鳍东方鲀白介素-2蛋白主要以可溶蛋白的形式存在于基因工程菌中，超声波细胞破碎即可以将目的蛋白释放出来，不需要处理包涵体等繁琐操作就可以得到重组红鳍东方鲀白介素-2蛋白的粗品，且其稳定性好，实验可重复性高；用Ni-NTA Agarose蛋白纯化***即可得到纯度更高的重组红鳍东方鲀白介素-2蛋白，操作简单方便，适用于大规模工业化生产。
附图说明
图1是本发明实施例重组质粒的双酶切电泳鉴定图。
图2是本发明实施例重组蛋白Western Blot验证图。
图3是 CTLL-2细胞在红鳍东方鲀白介素2标准品作用下的增值曲线图。
图4是CTLL-2细胞在本发明实施例重组蛋白作用下的增值曲线图。
具体实施方式
本发明是在天然红鳍东方鲀白介素2基因的基础上针对大肠杆菌密码子的偏爱性进行密码子优化，并在序列两端加入酶切位点及标签序列等，优化的基因DNA序列如SEQ IDNO:1所示，用于制备重组红鳍东方鲀白介素2蛋白。
本发明的重组红鳍东方鲀白介素2蛋白的制备方法，依次按照如下步骤进行：
a. 合成SEQ ID NO:1所示的基因并将SEQ ID NO:1所示的基因克隆入原核表达载体pET-32a上，活化TOP10/pET-32a/IL-2菌体，提取原核表达质粒pET-32a/IL-2；
b. 将原核表达质粒pET-32a/IL-2转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选阳性克隆，进行PCR鉴定后，经XhoI、NcoI双酶切（图1）进一步鉴定，构建重组大肠杆菌BL21(DE3)；
c. 挑取单克隆接种到含有氨苄的LB培养基中，37℃培养过夜，按照1:100的比例将培养物接种到含氨苄的LB培养基中，200rmp振荡培养4小时左右，使得OD600约为0.6左右；
d. 向该培养物中加入IPTG诱导剂至终浓度1mmol/L，28℃，200rmp诱导过夜后，离心收集菌体；将菌体用5xSDS上样缓冲液，用SDS-PAGE鉴定，产物表达量可达占菌体总蛋白的50%左右；
e. 超声破碎所收集的重组大肠杆菌BL21(DE3)菌体，离心后取上清液，即得重组红鳍东方鲀白介素2蛋白粗品；
f. 进一步用北京全式金公司的Ni柱蛋白纯化***即可得到重组红鳍东方鲀白介素2蛋白纯品：用PBS透析融合蛋白纯品，透析后每mg融合蛋白质中加入10U肠激酶，37℃酶切24h，用Ni柱纯化酶切产物即可得到重组蛋白纯品。
经测序，所得重组蛋白纯品的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，经Western Blot验证（图2），鉴定为重组红鳍东方鲀白介素2蛋白。用微孔滤膜过滤除菌，可以作为抗病添加剂，免疫佐剂等。
用Bradford法对蛋白纯化产物进行定量分析，经测定每100ml大肠杆菌可以得到约40mg有活性的红鳍东方鲀白介素2，纯化后的重组红鳍东方鲀白介素2蛋白经SDS-PAGE鉴定纯度均在98%以上。
用MTT法测定所得重组红鳍东方鲀白介素2蛋白的生物活性：
将CTLL-2细胞用完全培养液于37℃、5%CO2条件下培养24～48小时至足够量，离心收集CTLL-2细胞，用RPMI 1640培养液洗涤3次，然后重悬于基础培养液中配制成每lml含6.0×105个细胞的细胞悬液，将该悬液置于37℃、5%CO2条件下备用。在加有标准品溶液（红鳍东方鲀白介素2标准品）和供试品溶液（样品1：本发明所得重组蛋白粗品；样品2：本发明所得重组蛋白纯品）的96孔细胞培养板中，每孔加入细胞悬液50µl，于37℃、5%CO2条件下培养18～24小时。向上述96孔板中每孔加入MTT溶液20µl，于37℃，5%CO2条件下培养4～6小时后，每孔加入裂解液150µl，于37℃、5%CO2条件下保温18～24小时。以上操作均在无菌条件下进行。混匀上述96孔细胞板中的液体，并将其放入酶标仪，以630nm为参比波长，于波长570nm测定吸光度。用公式：
供试品生物学活性（IU/ml）=Pr*
计算各样品生物学活性。
结果如图3、图4所示，表明本发明实施例所得的重组蛋白粗品、纯品均具有明显的生物学活性，其效价分别为163100.44 IU/ml、187846.39 IU/ml 。
序列表
<110>大连海洋大学
<120>制备重组红鳍东方鲀白介素2蛋白的基因及方法
<130>
<160>2
<210>1
<211>405
<212>DNA。
<213>人工序列
<220>
<221>allele
<222>(1)..(405)
<223>TkIL-2/A
<400> 1
atggcgttcc cgctgcatct ggaggatagc aacattgacg tgattcgcga ggacgtgaag 60
tgcgagccgg atagcaaatt ctacaccccg gccaatgtgc gcgatgatca ccactgcatt 120
atcgtggccc tggaatgcgt ggccgccgaa ctgaaaaccg tgcgccgcga atgtgaagat 180
ccggaagatg tgatcggcgt ggccgaagaa tttctgaccc acaccatcca gaaactgaaa 240
aacggcgtga aaattgaaaa aagcaatagc accgaatgca gcacctgcga aagctggccg 300
gaaaaaccgc tgaccaattt tctggacgcc acagaaagcc tgctgcagca ggtgcagagc 360
ggtgcaattc ctagcgccga gggtagccat catcaccacc atcac 405
<210>2
<211>135
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>SIMILER
<222>(1)..(135)
<223>TkIL-2/A的氨基酸序列
<400> 2
Met Ala Phe Pro Leu His Leu Glu Asp Ser Asn Ile Asp Val Ile Arg
1 5 10 15
Glu Asp Val Lys Cys Glu Pro Asp Ser Lys Phe Tyr Thr Pro Ala Asn
20 25 30
Val Arg Asp Asp His His Cys Ile Ile Val Ala Leu Glu Cys Val Ala
35 40 45
Ala Glu Leu Lys Thr Val Arg Arg Glu Cys Glu Asp Pro Glu Asp Val
50 55 60
Ile Gly Val Ala Glu Glu Phe Leu Thr His Thr Ile Gln Lys Leu Lys
65 70 75 80
Asn Gly Val Lys Ile Glu Lys Ser Asn Ser Thr Glu Cys Ser Thr Cys
85 90 95
Glu Ser Trp Pro Glu Lys Pro Leu Thr Asn Phe Leu Asp Ala Thr Glu
100 105 110
Ser Leu Leu Gln Gln Val Gln Ser Gly Ala Ile Pro Ser Ala Glu Gly
115 120 125
Ser His His His His His His
130 135

Claims (3)

1.一种制备重组红鳍东方鲀白介素2蛋白的基因，其特征在于所述基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种制备重组红鳍东方鲀白介素2蛋白的方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：
a. 将DNA序列如SEQ ID NO:1所示的基因克隆入原核表达载体pET-32a上，构建原核表达质粒；
b. 将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选阳性克隆，构建重组大肠杆菌BL21(DE3)；
c. 用LB作为基础培养基，扩大培养重组大肠杆菌BL21(DE3)；
d. 向扩大培养物中加入IPTG诱导剂诱导培养，离心收集菌体；
e. 超声破碎所收集菌体，离心后取上清液，即得重组红鳍东方鲀白介素2蛋白粗品。
3.根据权利要求2所述制备重组红鳍东方鲀白介素2蛋白的方法，其特征在于将e步骤所得上清液经过Ni柱蛋白纯化***进行纯化，即得重组红鳍东方鲀白介素2蛋白纯品。
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