CN1236391A

CN1236391A - 制备疟疾完全抗原gp190/MSP1的重组方法

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Publication number: CN1236391A
Application number: CN97199498A
Authority: CN
Inventors: H·布亚德; R·托勒; W·潘
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-10-02
Filing date: 1997-10-02
Publication date: 1999-11-24
Anticipated expiration: 2017-10-02
Also published as: CN1148448C; ATE299939T1; JP2000516477A; WO1998014583A2; EP1637602A1; ID22037A; AU4864997A; DK0929677T3; DE19640817A1; US20050095256A1; EP0929677B1; EP0929677A2; US6933130B1; DE59712370D1; AU727864B2; ES2244993T3

Abstract

本发明涉及一种疟原虫、尤其是恶性疟原虫的完整gp190/MSP1表面蛋白的重组制备方法,以及该蛋白质的完整DNA序列和可用于表达该序列的适宜宿主生物体,由此可在寄生虫外完整地合成该蛋白质。而且,本发明使得有可能以足够量制备gp190/MSP1表面蛋白并将其制成疫苗。最后,本发明公开了一种稳定富含AT的基因的方法。

Description

制备疟疾完全抗原gp190/MSP1的重组方法

本发明涉及通过表达合成的DNA序列来重组制备疟疾完全抗原gp190/MSP1以及其独立的天然区域和部分的方法。此外，本发明还涉及由该方法制备的DNA序列和用于表达所述DNA序列的宿主生物体。另外，本发明还涉及疟疾完全抗原及其部分作为抗疟疾免疫疫苗的用途。

最后，研究中的本发明涉及富含AT的基因的稳定方法以及特征在于AT含量降低的稳定化基因。

疟疾是全世界最显著具有传染性的疾病之一。根据WHO的报道，在1990年，99个国家中占世界人口的40％处于患疟疾的危险之中。同时，其分布在大大扩展。这很有可能是由于将原本用于治疗的药物推荐和用作预防剂而引起的致疟疾寄生虫的抗性大大增加之故。由于世界上疟疾流行地区的人们确实成功地获得了某些免疫性，因此，除研究新的有效的化疗剂以外，目前人们希望的是开发疫苗。与对疟疾的天然抗性(如在镰刀细胞基因的杂合体和患有地中海贫血症和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的病人中发现的)一样，在人感染疟疾的过程中，免疫机制受到刺激，从而以更高水平表达而抗疟原虫。因此，暴露于严重流行病的人群的患病通常比不经常暴露于感染或首次感染的人的患病威胁更小。

疫苗开发中的主要问题是确定可诱导保护性免疫的抗原，因为不容易获得影响人的四种寄生虫的非常明确的动物模型。引起疟疾的生物属于疟原虫属，被四种寄生虫间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、恶性疟原虫之一感染是由于被按蚊Anophelesmosquitoes叮咬所致。其中寄生虫恶性疟原虫最危险且分布最广。

为疟疾寄生虫恶性疟原虫和其它疟疾寄生虫(如间日疟原虫)的血液期侵染形式的裂殖子的主要表面蛋白是一种190-220kD糖蛋白。在该寄生虫的发育后期，该前体被加工成仍可以单一复合物的形式从裂殖子中分离出来的较小的蛋白质。通过糖基磷脂酰肌醇键，该复合物与裂殖子膜偶联。各种恶性疟原虫株系的gp190蛋白的序列分为两类，其中经常发生基因内重组。通常，该蛋白质包含许多高度保守的区域，两个等位基因之一分属的二态区和N-末端区内相对较小的两个多态区(Tanabe,K.,Mackay,M.,Goman,M.和Scaife,J.G.(1987)，疟疾寄生虫恶性疟原虫的表面抗原基因中的等位基因二态现象，分子生物学杂志，195,273-287；Miller,L.H.,Roberts,T.,Shahabuddin,M.McCutchan,T.F.(1993)，恶性疟原虫裂殖子表面蛋白-1(MSP-1)序列多样性分析，分子生物化学与寄生虫学(Mol.Biochem.Parasitol.)59,1-14)。

早期已认为gp190/MSP1有可能用作疫苗。在啮齿类动物模型中，在用类似蛋白质免疫后获得了抗啮齿类寄生虫感染的积极保护。用抗这种蛋白质的抗体可完成被动保护(还参见Holder,A.A.和Freeman,R.R.(1981)，使用纯化的寄生虫抗原进行抗血液期啮齿类疟疾的免疫，自然294,361-364；Marjarian,W.R.,Daly,T.M.,Weidanz,W.P.和Long,C.A.(1984)，使用1gG3单克隆抗体的抗鼠疟疾的被动免疫，免疫学杂志，132,3131-3137)。然而，能够支持这种假设的数据在细节方面却无统计学显著性。

此外，还有许多在体外抑制恶性疟原虫侵染红细胞并且针对gp190/MSP1的单克隆抗体(Pirson,P.J.和Perkins,M.E.(1985)，恶性疟原虫裂殖子表面抗原的单克隆抗体的鉴定，免疫学杂志134，1946-1951；Blackman,M.J.,Heidrich,H.-G.,Donachie,S.,McBride,J.S.和Holder,A.A.(1990)，在侵染红细胞期间，疟疾裂殖子表面蛋白的一个片段仍存在于寄生虫中，并且是抑制侵染的抗体的靶，实验医学杂志172,379-382)。

最后，在灵长类，尤其是夜猴(Aotus)和松鼠猴(Saimiri)中用来自恶性疟原虫的gp190/MSP1进行了一系列疫苗研究(参见Perrin,L.H.,Merkli,B.,Loche,M.,chizzolini,C.,Smart,J.和Richle,R.(1984)，松鼠猴中的抗疟疾免疫性，用无性血液期表面成分进行免疫，实验医学杂志160,441-451；Hall,R.,Hyde,J.E.,Goman,M.,Simmons,D.L.,Hope,I.A.,Mackay,M.和Scaife,J.G.(1984),在细菌中克隆和表达人疟疾寄生虫的主要表面抗原基因，自然311,379-382；Siddiqui,W.A.,Tam,L.Q.,Kramer,K.J.,Hui,G.S.N.,Case,S.E.,Yamaga,K.M.,Chang,S.P.,Chan,E.B.T.和Kan,S.-C.(1987)，裂殖子表面外壳前体蛋白完全保护夜猴免于恶性疟原虫疟疾，美国国家科学院院报84,3014-3018；Ettlinger,H.M.,Caspers,P.,Materile,H.,Schoenfeld H.-J.,Stueber,D.和Takacs,B.(1991)，重组或天然蛋白质保护猴子抗恶性疟原虫异种攻击的能力，感染免疫学59,3498-3503；Holder,A.A.,Freeman,R.R.和Nicholls,S.C.(1988)，使用大肠杆菌中产生的重组多肽进行的抗恶性疟原虫的免疫，寄生虫免疫学10,607-617；Herrera,S.,Herrera,M.A.,Perlaza,B.L.,Burki,Y.,Caspers,P.,Doebeli,H.,Rotmann D.和Certa,U.(1990)，用恶性疟原虫血液期重组蛋白质对夜猴进行免疫，美国国家科学院院报87,4017-4021；Herrera,M.A.,Rosero,F.,Herrera,S.,Caspers,P.,Rotmann,D.,Sinigaglia,F.和Certa,U.(1992)，用与通用的T细胞表位融合的重组血液期抗原免疫的夜猴中的抗疟疾保护；血清γ干扰素水平与保护的相互关系，感染免疫学60,154-158；Patarroyo,M.E.,Romero,P.,Torres,M.L.,Clavijo,P.,Moreno,A.,Martinez A.,Rodriquez,R.,Guzmann,F,和Cabezas,E.(1987)，使用合成肽诱导抗疟疾实验性感染的保护性免疫，自然328,629-632)。在这些疫苗研究中，可区分两个前提：

-使用从寄生虫中分离的物质，

-施用异源表达体系中获得的物质。

后者通常由整个蛋白质的相对小的片段组成。虽然主要在猴子中进行的接种的结果表明gp190/MSP1可产生保护，但在灵长类中进行的所有实验具有下述两个问题而使得这样一个结论不太令人信服：

(a)进行实验的动物组太小

(b)结果不重复。

因此，实验结果以及从中导出的结论在统计学上均不太使人信服。除了很困难获得适宜的猴子之外，还存在主要的基本问题，即至今不可能以适宜量生产良好的接种物。

另一方面，在对来自恶性疟原虫的K1和MAD20株系的gp190基因进行测序后，重叠片段可在大肠杆菌中表达。使用该物质，西非的流行病学研究表明，在青年人中，抗gp190/MSP1片段的抗体效价与免受寄生虫感染的保护之间存在相关性。此外，甚至在低水平时效价看来仍与控制寄生虫血症的能力相关(Tolle等(1993)：对恶性疟原虫血液期抗原gp190的人激素免疫效应与疟疾感染的控制之间的联系的未来研究，感染免疫学61,40-47)。这些结果通过本发明中新的对夜猴的研究而得以补充。由于来自恶性疟原虫的主要由未加工gp190/MSP1组成的蛋白质制剂已被用作疫苗，抗寄生虫感染的保护物反应在这里得到了加强。具有抗gp190/MSP1的最高抗体效价的猴子受到最好的保护。这些结果最终表明gp190最有希望能被用作抗热带疟疾的疫苗。

一些组的研究人员确定，gp190(p19或p42)的C末端结构域在由gp190介导的免疫性中起特殊作用(还参见Chang,S.P.,Case,S.E.,Gosnell,W.L.,Hashimoto,A.,Kramer,K.J.,Tam,L.Q.,Hashiro,C.Q.,Nikaido,C.M.,Gibson,H.L.,LeeNg,C.T.,Barr,P.J.,Yokota,B.T.和Hui,G.S.N.(1996)，恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1的重组杆状病毒42Kd C-末端片段可保护夜猴抗疟疾，感染免疫学64,253-261；Burghaus,P.A.,Wellde,B.T.,Hall,T.,Richards,R.L.,Egan,A.F.,Riley,E.M.,Ripley-Ballou,W.和Holder A.A.(1996)，用脂质体中的恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1重组C-末端和明矾佐剂免疫夜猴(Aotusnancymai)未诱导抗攻击感染的保护，感染免疫学，出版中)。

然而，目前还不可能合理地排除与保护性免疫效应无关的gp190其它部分。因而仍需要使用整个基因或完整gp190来进行疫苗研究。尽管各种研究小组已进行了许多研究，然而，在克隆和表达整个gp190/MSP1基因方面仍未有任何成功。

目前也不可能排除与保护性免疫效应无关的gp190序列的任何推测部分，因此仍需要使用整个基因或基因产物来进行疫苗研究。然而，尽管各种研究小组进行了许多研究，但是，在克隆整个gp190/MSP1基因方面仍未取得任何成功。

因此，本发明的一个目的是获得足够量的完整gp190/MSP1形式的疫苗材料。本发明的另一个目的是提供一种可回收该疫苗材料的方法。

此外，本发明的另一个目的是提供可在宿主生物体中表达的gp190/MSP1的全部DNA序列。

本发明的另一个目的是提供含有整个gp190/MSP1基因的宿主生物体。

最后，本发明的另一个目的是提供一种稳定富含AT的基因的方法，以及适宜于表达的、特征在于减少了AT含量的稳定化基因。

这些目的通过权利要求书所述的主题得以解决。

下面将详细解释一些概念以明确在本文中应如何理解它们。

“重组制备方法”指由适宜宿主生物体表达DNA序列得到蛋白质，其中DNA序列来自各个DNA片段的克隆和融合。

“完整gp190/MSP1蛋白”这里指可从上述疟原虫属，尤其是恶性疟原虫中分离的完整gp190/PSM1表面蛋白，其代表上述寄生虫的主要表面蛋白以及来自其它疟原虫种类(如间日疟原虫)的具有类似功能的蛋白质。因此，在每种情况下，该术语包括危害人类的上述四种疟疾寄生虫的裂殖子的主要表面蛋白。“完整的gp190/MSP1基因”指编码该蛋白质的基因。在本文中，“完整的”指存在天然蛋白质的全部氨基酸序列或该基因序列编码天然蛋白质的全部氨基酸序列。然而，突变和/或缩短形式的gp190/MSP1也包括在其中，只要它们显示与完整gp190/MSP1相同的免疫能力(疫苗保护)。最后，该术语还包括特征在于在一个分子中含有各种等位基因的蛋白质片段的gp190/MSP1的变体。

“FCB-1”为恶性疟原虫的一个株系，如Heidrich,H.-G.,Miettinen-Baumann,A.,Eckerskorn,C.和Lottspeich,F.(1989)中，来自185-195Kd前体的42和36Kd的恶性疟原虫(FCB1)裂殖子表面抗原的N末端氨基酸序列，分子生物化学与寄生虫学34,147-154。

“附着信号”这里指由本发明基因3’或5’末端的DNA序列编码的蛋白质结构。附着信号为能促使多肽附着于其它结构(例如膜)的结构。

“信号肽”这里指由本发明基因DNA序列编码的N末端蛋白质结构。信号肽为能促使多肽穿透至膜中的结构。

在本发明的上下文中，“AT含量”指与鸟嘌呤-胞嘧啶碱基对相比的腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对的百分含量。

“克隆”这里应理解为可在此使用的所有现有技术已知的克隆方法，由于它们属于本领域技术人员常用的方法，因此没有详细全部描述。

“在适宜表达体系中的表达”这里应包括可在此使用的所有现有技术描述的已知的在已知表达体系中的表达，由于它们属于本领域技术人员常用的方法，因此没有全部详细描述。

本发明的一个主要的目的是提供一种可以足够量制备蛋白pg190/MSP1和其基因而不花费过度成本的方法。

该目的通过权利要求1所述的重组制备方法而得以解决，通过它可以足够量获得完整gp190/MSP1基因和由其编码的蛋白质。

通过该方法首次可在寄生虫外合成整个蛋白质。如对可识别构象表位的单克隆抗体的分析表明，由此合成的蛋白质至少可在宽范围内以天然折叠形式重复合成。通过重组制备方法，在每种情况下均可从宿主生物体中回收数毫克的完整gp190/MSP1，而由于技术和经济的原因，该数量从未能从寄生虫中回收到。现正可以任何所需量制备该蛋白质，这为将其用作抗疟疾的实验性疫苗开辟了新的前景。而且，这也为开发活疫苗以及基于核酸的疫苗铺平了道路。

编码蛋白质gp190/MSP1的基因序列的合成优选依据恶性疟原虫FCB-1株系的序列。恶性疟原虫为热带疟疾的诱因，因此在疟疾的诸类型中最为危险。基本基因是“K1等位基因”的代表，其中K1代表特定的恶性疟原虫株系。其编码序列长达4917个碱基对，包括N末端的信号序列以及C末端的附着序列。

而且，根据本发明，重组制备方法优选其特征在于作为该蛋白质基础的DNA序列的AT含量相对于野生型的AT含量有所降低，优选从原始基因的74％降至约55％，例如，在保持FCB-1蛋白的氨基酸序列的同时，制备具有人基因组中常见密码子频率的DNA序列。使AT含量降低的其它密码子频率也是可能的。

作为由重组制备方法生产的蛋白质的基础的基因最好编码包括信号肽和GPI附着信号肽在内的全部氨基酸序列，其被进一步描述为gp190^s。

在另一个优选实施方案中，作为由重组制备方法生产的蛋白质之基础的基因编码除GPI附着信号外的全部氨基酸序列。该实施方案被描述为gp190^s1。

在另一个优选实施方案中，作为由重组制备方法生产的蛋白质之基础的基因编码除GPI附着信号和信号肽外的全部氨基酸序列。该实施方案被描述为gp190^s2。

在另一个优选实施类型中，作为由重组制备方法生产的蛋白质之基础的基因编码全部氨基酸序列和跨膜附着序列。

在一个尤其优选的实施方案中，该重组制备方法包括下述步骤：

首先根据来自恶性疟原虫FCB-1的基因设计将要合成的DNA序列，其中在保留FCB-1蛋白氨基酸序列的前提下制备具有比如人基因组中常见密码子频率的DNA序列。

该基因的AT含量应有所降低，优选降至55％。在该方法中，还将设计的序列分成例如5个重叠区，其同时对应于来自FCB-1的gp190/MSP1的天然加工产物的结构域：p83、p31、p36、p30和p19。

合成寡脱氧核苷酸，它们均覆盖一个区域的全长。

如此合成的寡脱氧核苷酸尤其优选其中其序列以反向互补的方式对应于DNA“上”(5’-3’)或“下”(3’-5’)链。这些寡核苷酸的长度优选平均为120个核苷酸，在每种情况下它们与邻近序列重叠约20个碱基。

在一个可能的实施方案中，通过不对称PCR制备约为现存终产物双倍长度的DNA序列，这样在每种情况下附近多余的DNA序列代表反义链。这在第二个PCR扩增循环中导致相当于除重叠区外的四个初始***寡核苷酸长度的第二种产物。用末端寡核苷酸通过不对称PCR将这些产物转移至主要由单链DNA组成的制备物中使得能在仅25个PCR循环中经进一步的扩增步骤制备800bp长的双链DNA片段。

以这种方式直接合成编码p19、p30、p36和p31的区域并将其分子克隆在大肠杆菌中。直接或通过连接无误序列片段而保存具有无误序列的克隆。通过融合包含约1200bp的两个序列构建编码p83的区。

在制备的另一个过程中，克隆单链序列。作为表达载体，可优选质粒pDS56、RBS11(“Hochuli,E.,Bannwarth,W.,Doebeli,H.,Gentz,R.和Stueber,D.(1988)通过使用新的金属螯合吸附剂简化重组蛋白质纯化的遗传方法，生物技术6,1321-1325”),pBi-5(“Baron,U.,freundlib,S.,Gossen,M.和Bujard,H.(1995)，通过四环素借助于双向启动子对两种基因活性进行共调节，核酸研究23,3605-3606”)和ppTMCS。然而也可使用其它的表达载体。

优选用于表达的宿主生物体为大肠杆菌，尤其优选DH5αZ1菌株(R.Rutz,Dissertation 1996,Heidelberg大学)、Hela细胞、CHO细胞、Toxoplasma gondii(Pfefferkorn,E.R.和Pfefferkorn,C.C.1976,Toxoplasma gondii：温度敏感突变体的分离和初步鉴定。实验寄生虫学39,365-376)或利什曼原虫。另外的宿主体系可为例如酵母、杆状病毒或腺病毒，这样本发明的主题应不限于所提到的宿主体系。

本发明的另一个目的是提供适宜于表达的恶性疟原虫gp190/MSP1表面蛋白的完整DNA序列。

该目的通过权利要求17所述的发明而得以解决，其中通过上述重组制备方法可获得所述序列。

在本发明一个优选的实施方案中，适宜于表达的序列编码整个氨基酸序列。

在本发明另一个优选的实施方案中，适宜于表达的序列编码除去附着信号外的整个氨基酸序列。

在本发明另一个优选的实施方案中，适宜于表达的DNA序列编码除去附着信号和肽信号外的整个氨基酸序列。因此，gp190/MSP1的实施方案可以是特征在于在N末端包括另外11个氨基酸，其中6个为组氨酸。

适宜于表达的尤其优选的DNA序列不含有可识别的“剪接供体”和“剪接受体”位点，并优选其特征在于不含有任何可能在RNA水平导致稳定发夹结构的较大的富含GC的序列。

优选应避免识别6个或更多个碱基对序列的限制性酶的识别信号。

在一个优选的实施方案中，在区域内导入仅在该基因中出现一次的限制性核酸内切酶特异切割位点以在蛋白质加工后分离存在的结构域。

尤其优选的是在基因的两端存在基因中未出现的限制性核酸内切酶识别序列。

另外，本发明提供含有gp190/MSP1表面蛋白整个序列的宿主生物体。

这种宿主生物体优选为大肠杆菌，尤其优选DH5αZ1菌株、Hela细胞、CHO细胞、Toxoplasma gondii或利什曼原虫。Hela细胞、CHO细胞最好是组成性地合成tTA。

最后，本发明使得有可能利用根据重组制备方法生产的gp190/MSP1表面蛋白或其部分进行抗疟疾的活性免疫。

本文提供的合成方案还能制备gp190/MSP1基因的第二个等位基因，由此也将该蛋白质的二态现象考虑进去。然而，该蛋白质的主要可变性取决于多态性的两个相对短的区-区Ⅱ和Ⅳ(参考1)的序列。本序列数据使得有可能公开具有这些区的6-8种序列组合的所有已知gp190/MSP1序列的95％以上。通过这里提出的方法可毫无问题地进行这些序列变体的合成，这样可在K1和MAD20等位基因上建立变体。来自由此产生的序列族的疫苗可在需要的位置提供抗广谱的具有gp190/MSP1变体的寄生虫的保护。

可制备不同类型的疫苗：

-在蛋白质制剂水平上，在每种情况下均可获得两个家族(具有Ⅱ区和Ⅳ区不同变体的K1型和MAD20型)的混合物以供使用。可加入各种载体或佐剂物质：氧化铝、脂质体、IscomsQSz1等。

-在活疫苗水平上：(a)病毒载体，尤其是牛痘和腺病毒；(b)寄生虫作为载体，尤其是无毒形式的弓形虫和利什曼原虫；(c)细菌载体，例如沙门氏菌。

-在核酸水平上，其中例如适宜于基因治疗的载体可用来将基因导入宿主中；除此之外，还可用于导入编码所需蛋白质的核酸。

接种疫苗的另一种可能性在于使用根据本发明提出的重组制备方法生产的gp190/MSP1蛋白来制备可用于抗疟疾的被动免疫的单克隆抗体。

类似地，可使用在重组制备方法过程中产生的作为该蛋白质基础的中间体阶段DNA序列来构建基于核酸的疫苗。

最后，本发明还涉及一种稳定基因序列、尤其是在表达体系中未显示足够稳定性的序列的方法。

根据本发明，由于序列的AT含量降低，因而实现了这种稳定化。

而且，本发明提供了特征在于AT含量降低的已被稳定的基因。这种稳定化基因的实例为本发明gp190/MSP1表面蛋白的基因。

下面将借助于附图和表以及各个实施方案中的一些实例描述本发明。

它们显示：图1：图示来自恶性疟原虫(FCB-1)的gp190/MSP1前体蛋白。图2：用来自恶性疟原虫(FCB-1)的天然gp190/MSP1在夜猴中进行的两个疫苗实验。图2A：使用3×60μg gp190/MSP1。图2B：使用3×40μg gp190/MSP1。图3A：gp190/MSP1基因的合成方法。图3B：基于PCR的总合成原理。图3C：gp190^s的全部序列测定。图3D：gp190^s1变体的N和C末端。图4A：含有gp190^s2序列的表达载体pDS56。图4B：gp190^s2的凝胶电泳。图5A：含有gp190^s1序列的表达载体pBi-5。图5B：Hela细胞的免疫荧光。图5C：从Hela细胞纯化的gp190^s1的电泳鉴定。图6A：含有gp190序列的表达载体ppT190。图6B：在T.gondii中表达的gp190^s的免疫荧光。图6C：来自T.gondii的gp190的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

在图1所示的来自恶性疟原虫的gp190/MSP1前体蛋白中，黑色区段代表在所有株系中高度保守的区。画交叉阴影线的区段代表二态区，其在FCB-1分离物情况下来自K1等位基因。01和02代表多态区。S代表含有19个氨基酸的肽信号序列，GA为C末端区，它包括该蛋白质与膜进行GPI附着的信号。箭头代表产生蛋白质p53、p31、p36、p30和p19的加工位点。gp190基因总共编码1639个氨基酸。

在下面实施例的上下文中将更方便地解释其它附图。实施例实施例1：编码gp190/MSP1的DNA序列之一的总合成(参见图3)A．gp190/MSP1基因(gp190^s)的合成方法(参见图3A)

将序列分成对应于主要加工产物：p83、p31、p36、p30和p19的诸片段。以不改变氨基酸序列的方式，在转换区***限制性核酸内切酶的切割位点(图3中的箭头)。所有特定的切割位点仅在序列中出现一次。

合成的诸片段互相重叠，这样在相应末端的切割位点使得能通过与邻近片段连接而结合在一起。所有各个片段另外在其5’末端均含有用于***到表达载体中的BamHⅠ切割位点。借助于MluⅠ和ClaⅠ可克隆整个序列。这里指出的方法另外产生了由于C末端缺少18个氨基酸而不能形成GP1附着的序列。在PCR后，相应寡核苷酸以及延伸覆盖SphⅠ切割位点的“引物”的合成产生可被SphⅠ和ClaⅠ切割的GA片段，由此产生的总序列即为gp190^s。在除去编码肽信号的序列时，产生了“PCR引物”，根据它合成片段ΔS。可借助于BamHⅠ和HindⅢ切割位点改变N末端，使得蛋白质从第20位氨基酸开始。编码没有信号序列和GP附着信号的gp190/MSP1的核酸序列被称为gp190S2。单独缺失GPI附着信号产生gp190^s1。B．PCR支持的总合成原理(参见图3B)

以在每种情况下与邻近片段重叠约20个碱基的方式，从编码或非编码链以变化的方式合成约120个核苷酸的诸寡脱氧核苷酸。该方案举例说明了从寡核苷酸合成比如约800bp长的片段。在第一阶段，在4个反应容器的每一个中“不对称”扩增2种寡核苷酸。这产生4群主要由单链(A,B,C,D)组成的长度为约220bp的DNA。A与B及C与D联合扩增5个循环以上生成了2个约400bp长的双链产物。这些DNA片段的不对称扩增(阶段Ⅲ)产生单链群，这些单链群在联合并扩增(阶段Ⅳ)10个循环后产生约800bp长的终产物G。这种合成可在不分离中间产物以及不更新缓冲液或酶时进行，并在3个小时内完成。将终产物电泳纯化，用适宜的限制性核酸内切酶切割，并在大肠杆菌中克隆至已加入了多接头MluⅠ和ClaⅠ切割位点的pBluescript(Stratagene)中。C．gp190^s的总序列(参见图3C)

在所有部分序列(图3A)融合于pBluescript中后，用双脱氧法检查基因的序列。gp190^s的阅读框具有4917bp(加上2个终止密码子)的长度，编码对应于来自FCB-1的gp190/MSP1序列的氨基酸序列(1639个氨基酸)。D．gp190^s1变体的N末端和C末端(参见图3D)

从BamHⅠ切割位点开始的N末端序列表明在氨基酸20位处具有转换，由此可推测在裂解信号肽后它确定N末端。在C末端所编码的序列在氨基酸1621位结束。终止密码子接在ClaⅠ切割位点之后。实施例2：gp190^s2在大肠杆菌中的表达A．表达载体(参见图4A)

借助于BamH1和ClaⅠ切割位点，将gp190^s2序列***到pDS56RBSⅡ中，由此使得6个组氨酸以及来源于载体的一些氨基酸被融合到N末端。这产生了具有下述阅读框的N末端序列：Met ArgGly Ser(His)₆Gly Ser。通过启动子P_N251ac0-1，在lacR/O/IPTG的控制下进行转录。B．gp190^s2的表达和纯化(参见图4D)

通过将载体pDS56RBSⅡ gp190^s2导入大肠杆菌DH5αZ1中并通过IPTG诱导合成后，电泳分离来自培养物的总蛋白质提取物得到清晰可见的预期大小的条带(箭头)。通过IMAC和亲合层析(具有mAK5.2的抗体柱)纯化该物质，产生约190kD的均一产物。图中M代表分子量标准；1=用IPTG诱导之前的大肠杆菌；2=用IPTG诱导2小时后；3,4,5=从mAK柱洗脱下来的级分。实施例3：在Hela细胞和CHO细胞中由四环素控制的gp190^s1的表达和产物的分离(还参见图5和6c)。A．借助于BamHⅠ/ClaⅠ切割位点将gp190序列***到表达载体pBi-5中。这样，基因的转录处于双向“tTA效应性”启动子的控制下，可通过Tc调节。该双向启动子同时启动指示物基因荧光素酶的转录。从而可很容易地跟踪表达的调节(也参见图5A)。B．在Tc控制下表达荧光素酶和gp190^s1的Hela细胞的免疫荧光

在含有(A)的双向转录单元的HtTA93-9细胞中证实了在无Tc时荧光素酶(左泳道)和gp190^s1(中间泳道)的产生。在加入Tc后，未显示出gp190S1的明显合成(如图5B右泳道所代表)。C．从Hela细胞纯化的gp190^s1的电泳鉴定

在有或无Tc的情况下培养Hela细胞克隆HtTA93-9以及CHO细胞克隆CHO27-29。通过“Western印迹”用mAK5.2分析电泳分离的细胞提取物(图5C)；对CHO细胞系的分析示于左边，Hela细胞在右边。(1)=不含Tc的培养物，(2)=含Tc的培养物，(3)=未转染的HtTA-1细胞系。每种情况下分子量标准均示于左边。D．由Hela细胞克隆HtTA93-9合成的gp190^s1的纯化

HtTA系的制备性培养以及通过抑制Tc而对gp190^s1的表达进行诱导使得可通过亲合层析(mAK5.2柱)分离基因产物。

电泳后用考马氏兰对聚丙烯酰胺凝胶进行染色(图6C)，结果显示了由gp190^s1组成的产物以及约50kD的另一种蛋白质。后者不来自于gp190^s1，因此来源于Hela细胞。然而，其预定的除去过程原则上应不存在任何困难。实施例4：Toxoplasma gondii中gp190^s1的表达和产物的纯化(还参见图6)A．借助于MluⅠ/PstⅠ将gp190^s序列***到载体ppT中。这使得该基因处于T.gondii微管蛋白启动子(P_tub-1)的控制之下。3’未翻译区(VTR)来源于T.gondii的主要表面蛋白(SAG-1)。B．在T.gondii中表达gp190^s

用pTT190转染T.gondii可分离出组成型表达gp190^s的寄生虫系。使用mAK5.2的免疫荧光(中图)不仅显示表达了该基因，而且显示表达产物与寄生虫表面的紧密结合，因为该表达产物如SAG-1一样具有相同的免疫荧光图谱(图6B的右侧部分)。图6B左侧显示中图的相差照片。C．从T.gondii分离gp190S

通过亲合层析(mAK5.2柱)，从制备量的T.gondii(5×10⁹个寄生虫)纯化gp190^s。高度纯化的蛋白质具有预期的分子量，正如电泳后考马氏兰染色的聚丙烯酰胺凝胶所示(图6C中的2-3)。在图6C(1)号中，来自CHO细胞的已纯化gp190^s1由左侧标明的分子量表示。实施例5：使用单克隆抗体对gp190^s的鉴定

通过对恶性疟原虫和T.gondii的免疫荧光或对纯化蛋白质的“Western印迹”观察16个单克隆抗体与来自各种异源表达体系的gp190^s之间的相互作用。当比较这两种寄生虫时，发现完全相同(+号的数目表明荧光的相对强度)。在Western印迹中，12种mAK与来自大肠杆菌和T.gondii的gp190^s发生反应。另一方面，3种抗体不与从CHO细胞分离的物质结合。识别来自多态区或另一等位基因(MAD20)的表位的抗体15和16不发生反应。结果总结在表1中，其中ND指“未进行”。实施例6：gp190^s在异源体系中的表达1．在大肠杆菌中的表达

将gp190^s2***表达载体pDS56,RBSⅡ中，使其处于启动子PN_251ac0-1的控制之下，该启动子可通过lac操纵子/阻抑物/IPTG体系而受到控制(图4A)。将质粒转移至产生阻抑物的大肠杆菌细胞(如大肠杆菌DH5αZ1中)，这使得gp190^s2的表达受IPTG的控制。通过镍螯合柱，可借助于由载体引入的N末端(His)₆序列分离粗产物。随后在抗体柱中的亲合层析产生相当纯的制备物。由于使用的单克隆抗体(mAK5.2)识别C末端区的构象表位，此两步纯化法选择出了至少在C末端具有正确折叠的全长完整蛋白质(图4B)。

与天然物质相比，该终产物在N末端具有11个额外氨基酸，其中6个为组氨酸。它不含有N末端信号也不含有C末端附着序列。恶性疟原虫特异性序列从第20位氨基酸开始，在1621位氨基酸处结束。2．Hela细胞和CHO细胞培养物中gp190^s1的受控表达

将gp190^s1***载体pBi-5中，从而将其置于可由四环素(Tc)调节的启动子的控制之下。选择受Tc控制的体系是基于2个理由：

一它属于在哺乳动物中可获得最高产率的表达体系。

一高浓度的未分泌的外源蛋白质会负面地干扰细胞代谢。因此目的产物的合成仅在培养物成熟后开始。

在pBi5-gp190^s1构建体中，由Tc控制的转录活化子活化双向启动子，并启动gp190^s1和荧光素酶指示剂基因的转录。存在Tc时，启动子无活性。将该转录单位转移至组成性地合成tTA的Hela和CHO细胞中(HtTA细胞系：Gossen,M.和Bujard,H.(1992)，通过四环素效应启动子对哺乳动物中的基因表达进行紧密控制，美国国家科学院院报，89,5547-5551；CHO-tTA细胞系，未公开)。通过与诱导潮霉素抗性的标记基因的共转染，选择成功地发生了染色体整合的克隆。接着研究潮霉素抗性克隆中Tc表达的可调节性，其中使用荧光素酶活性作为指示物。在可被很好调节的克隆中检测gp190的合成(调节因子，Tc1000)。通过免疫荧光分析(图5B)以及“Western印迹”(图5C)的研究能鉴定在严格可调条件下合成gp190的两种细胞类型的克隆。在每种情况下，对受到最好调节的20个克隆进行亚克隆。亚克隆HtTA93-9和CH027-29以10∶1的比例用于培养物中。可通过亲合层析(mAK5.2)从这些培养物的细胞提取物中分离完整的gp190^s1。该物质是均一的，只是其中有并非来自gp190^s1的占制备物25％的单细胞成分(图6C)。这种细胞成分必须在进一步的纯化步骤中除去。3．在Toxoplasma gondii中表达gp190s

类似于恶性疟原虫，Toxoplasma gondii属于Apicomplexa，因此具有明显类似于恶性疟原虫的蛋白质修饰体系。T.gondii可被外源DNA转染，该DNA有效整合至基因组中，还使得T.gondii在细胞培养物中没有问题地增殖。为了获得最类似于天然gp190的产物，以这样一种方式表达gp190S2，使得该蛋白质分泌到寄生虫表面，并如在恶性疟原虫中一样经由GPI类似物而与膜结合。已将gp190S2(图3A)以这种方式***到(图6A)质粒ppTMCS中(D.Soldati，未公开)，从而将其置于T.gondii微管蛋白启动子的控制下。

将该表达构建体转染到T.gondii中。用氯霉素进行选择，得到可合成gp190的抗性克隆，这种克隆可通过免疫荧光检测到(图6B)。

通过针对作为T.gondii主要表面蛋白的SAG1的抗体难于将抗gp190抗体的免疫荧光与寄生虫中的相应色素形成区分开来。由此可推论，gp190与T.gondii表面结合。已鉴定了一些T.gondii克隆(3.1-3.4号)，将它们保存以用于制备gp190。使用亲合层析(mAK5.2)，从以制备规模培养的T.gondii培养物(克隆3.4)中分离gp190。电泳分析显示得到了具有与完整蛋白质类似迁移速率的均一产物(图6C)。实施例7：通过单克隆抗体对来自各种表达体系的gp190蛋白进行鉴定

将一系列gp190特异性单克隆抗体(其中许多识别构象表位)用来借助于免疫荧光比较抗体与恶性疟原虫和T.gondii寄生虫的反应性。表1表明16种抗体与这两种寄生虫的反应性相同。这强有力地说明在T.gondii中主要产生“天然”gp190。比较抗体与来自大肠杆菌、Hela或CHO细胞以及T.gondii的蛋白质的反应性也表明大多数抗体与4种制备物均发生反应。尤其是来自大肠杆菌的蛋白质比在哺乳动物细胞中产生的蛋白质识别更多的抗体。这显然是由于哺乳动物细胞中发生糖基化的结果。实施例8：用来自恶性疟原虫(FCB-1)的gp190/MSP对夜猴(Aotuslemurinus griseimembra)进行免疫

进行两个独立的免疫实验(A,B)。其中在(A)和(B)中从约2×10¹¹个寄生虫中分别提取了1.0mg和0.6mg非常纯的gp190/MSP1。

与弗氏佐剂(FCA)一起施用该蛋白质。对照组仅获得FCA。以4周的间隔用蛋白质混合物或佐剂同等地免疫三次。在最后一次免疫之后的两周后，将各动物用来自供体动物的10⁵个寄生虫(FVO株系)感染。每天测定寄生虫血症。结果总结在图2中。符号指：T：用雷索欣处理的动物D：死亡动物图2A：接种组中各获得3×60μg gp190/MSP1的个体图2B：接种组中各获得3×40μg gp190/MSP1的个体

虽然在对照组中仅1/11的动物未发展成寄生虫血症，但在接种组中这一结果是6/10。与对照组相比，接种组中确实发展成明显寄生虫血症的四只动物平均推迟4天患病(超过寄生虫血症极限的2％)。

这些实验首次表明在猴子模型中gp190/MSP1抗恶性疟原虫感染的极显著保护。因此，根据本发明的方法使得能首次提供切实可行的抗疟疾疫苗。

表1：gp190^s与单克隆抗体的相互作用

IFA Western印迹编号 mAb 表位的类型变异性恶性疟原虫FCB 弓形虫大肠杆菌弓形虫 CHO1 5.2 构象保守 ++++ ++++ + + +2 12.10 构象保守 ++++ ++++ + + +3 7.5 构象保守 ++++ ++++ + + +4 12.8 构象保守 ++ ++ + + +5 7.3 构象二态(K1) ++++ +++ + + +6 2.2 构象保守 ++++ ++++ + + +7 7.6 构象二态(K1) ++++ ++++ + + +8 9.8 构象保守 ++++ ++ + + -9 13.2 序列保守 ++++ ++++ + + +10 13.1 序列二态(K1) ++++ +++ + + -11 6.1 序列二态(K1) ++++ ++++ + + ND12 A5Z 未知未知 +++ +++ + + +13 17.2 未知未知 ++++ +++ ND ND ND14 15.2 未知未知 ++++ +++ ND ND ND15 9.7 构象二态(MAD20) - - - - -16 12.1 序列多态 - - - - -

Claims

1．一种制备疟原虫、尤其是恶性疟原虫的完整gp190/MSP1蛋白的方法，其特征在于在适宜体系、优选宿主生物体中表达gp190/MSP1的完整基因。

2．根据权利要求1的重组制备方法，其特征在于作为该蛋白质基础的DNA序列的合成来自恶性疟原虫FCB-1株系的DNA序列。

3．根据权利要求2的重组方法，其特征在于与天然序列相比，所表达的DNA序列的AT含量降低，优选从74％降低至55％。

4．根据权利要求1-3中一项或多项的重组方法，其特征在于作为所产生的蛋白质之基础的基因编码包括信号肽和附着信号在内的整个氨基酸序列。

5．根据权利要求1-3中一项或多项的重组方法，其特征在于作为所产生的蛋白质之基础的基因编码除去附着信号外的整个氨基酸序列。

6．根据权利要求1-3中一项或多项的重组方法，其特征在于作为所产生的蛋白质之基础的基因编码除去信号肽和附着信号外的整个氨基酸序列。

7．根据权利要求1-6中一项或多项的重组方法，其特征在于它包括下述步骤：

(a)设计将要合成的来自恶性疟原虫FCB-1的DNA序列，由此制备具有在人基因组中常见密码子频率并保持FCB-1蛋白的氨基酸序列的DNA序列，

(b)将设计的序列分成重叠区，优选p83、p31、p36、gp30和gp19区，

(c)合成寡脱氧核苷酸，其中每一个覆盖一个区的全长，

(d)通过PCR合成编码gp19、gp30、p36和p31的各区，通过融合含有约1200bp的两个序列合成编码p83的区，

(e)分别克隆诸编码序列，

(f)融合整个基因，和

(g)在适宜表达体系中表达。

8．根据权利要求7的重组方法，其特征在于在步骤(c)中合成的寡脱氧核苷酸应平均为120个核苷酸长，在每种情况下均与邻近序列重叠约20个碱基。

9．根据权利要求1-8中一项或多项的重组方法，其特征在于将dPS56、RBSII用作表达载体。

10．根据权利要求1-8中一项或多项的重组方法，其特征在于将pBi-5用作表达载体。

11．根据权利要求1-8中一项或多项的重组方法，其特征在于将ppTMCS用作表达载体。

12．根据权利要求1-11中一项或多项的重组方法，其特征在于在大肠杆菌中表达作为该蛋白质基础的DNA序列。

13．根据权利要求12的重组方法，其特征在于所采用的大肠杆菌菌株是可产生阻抑物的菌株大肠杆菌DH5αZ1。

14．根据权利要求1-11中一项或多项的重组方法，其特征在于在Hela细胞中表达作为该蛋白质基础的DNA序列。

15．根据权利要求1-11中一项或多项的重组方法，其特征在于在CHO细胞中表达作为该蛋白质基础的DNA序列。

16．根据权利要求1-11中一项或多项的重组方法，其特征在于在Toxoplasma gondii或利什曼原虫中表达作为该蛋白质基础的DNA序列。

17．适宜于表达的疟原虫、尤其是恶性疟原虫的gp190/MSP1表面蛋白的完整DNA序列，其优选可通过权利要求1-16中一项或多项的重组方法获得。

18．根据权利要求17的适宜于表达的DNA序列，其特征在于它不编码附着信号。

19．根据权利要求18的适宜于表达的DNA序列，其特征在于它不编码附着信号和信号肽。

20．根据权利要求19的适宜于表达的DNA序列，其特征在于它包括编码存在于N末端的11个额外氨基酸的序列，所述额外氨基酸中6个为组氨酸。

21．根据权利要求17-20中一项或多项的适宜于表达的DNA序列，其特征在于该序列不包括可识别的“剪接供体”和“剪接受体”信号。

22．根据权利要求17-21中一项或多项的适宜于表达的DNA序列，其特征在于该序列不包括大的富含GC的序列。

23．根据权利要求17-22中一项或多项的适宜于表达的DNA序列，其特征在于该序列不包括识别6个或更多个碱基对序列的限制性酶的识别信号。

24．根据权利要求17-23中一项或多项的适宜于表达的DNA序列，其特征在于存在于蛋白质加工后分隔现存结构域的区域中的特定限制性核酸酶识别信号的序列含有限制性核酸内切酶单一切割位点。

25．根据权利要求17-24中一项或多项的适宜于表达的DNA序列，其特征在于该序列在其两个末端含有在剩余序列和所使用的载体中不存在的核酸内切酶切割位点。

26．包含gp190/MSP1表面蛋白和/或完整蛋白质的整个核酸序列的宿主生物体。

27．根据权利要求26的宿主生物体，其特征在于该生物体为大肠杆菌。

28．根据权利要求27的宿主生物体，其特征在于该大肠杆菌菌株为可产生阻抑物的大肠杆菌DH5αZ1菌株。

29．根据权利要求26的宿主生物体，其特征在于该宿主生物体为Hela细胞。

30．根据权利要求26的宿主生物体，其特征在于该宿主生物体为CHO细胞。

31．根据权利要求29或30的宿主生物体，其特征在于该宿主细胞组成性地合成tTA。

32．根据权利要求26的宿主生物体，其特征在于所提供的宿主生物体为Toxoplasma gondii、利什曼原虫、杆状病毒、腺病毒或酵母。

33．根据权利要求1-16制备的gp190/MSP1蛋白在用于抗疟疾活性免疫中的用途。

34．根据权利要求1-16制备的gp190/MSP1蛋白在制备适宜于被动免疫的单克隆抗体中的用途。

35．根据权利要求1-16制备的DNA序列在制备基于核酸的疫苗中的用途。

36．一种稳定基因序列的方法，其特征在于该序列的AT含量降低。

36．一种稳定的基因，其特征在于它的AT含量比未稳定的基因有所降低。

37．含有根据权利要求17-25之一的和/或36的DNA序列的载体。

38．含有根据权利要求37的载体的宿主细胞。

39．含有根据权利要求1-16中任一项的方法制备的蛋白质和/或根据权利要求17-25中任一项的DNA序列和/或根据权利要求26-32中任一项的宿主和/或根据权利要求37的载体的疫苗。

40．根据权利要求39的疫苗，其特征在于它还含有来自疟原虫，尤其是恶性疟原虫的促进免疫性的产物。