CN107502616B - 一种可溶性重组蛋白cta-cd154及其制备方法和应用 - Google Patents

一种可溶性重组蛋白cta-cd154及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可溶性重组蛋白CTA‑CD154，其核苷酸序列及氨基酸序列。本发明还公开了可溶性重组蛋白CTA‑CD154的制备方法。本发明还公开了该可溶性重组蛋白CTA‑CD154的应用。该可溶性重组蛋白CTA‑CD154能够作为一种新型的免疫增强剂，且能够特异性的靶向DC细胞，显著增强机体的免疫应答反应，而且融合后的免疫增强CTA‑CD154作用显著高于单独成分的免疫增强作用。

Description

一种可溶性重组蛋白CTA-CD154及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种可溶性重组蛋白CTA-CD154及其制备方法和应用。
背景技术
黏膜免疫是机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线，增强黏膜免疫效力是提高机体抵抗力的有效方式之一。所以越来越多的研究学者探索如何提高机体粘膜免疫效力，有学者发现霍乱毒素(cholera toxin,CT)具有较好的黏膜佐剂活性，它是由1个A和5个相同的B亚单位组成的多亚单位大分子。经大量研究证实霍乱毒素A亚单位(CTA)能使少量的抗原诱导机体产生早期、高效、持久的免疫应答；其作为黏膜免疫增强剂能够有效增强机体的黏膜免疫反应，能够显著提高相关抗原刺激产生的IgG抗体水平。但CTA作为免疫增强剂不具有特异性靶向DC细胞的功能，因此，其发挥免疫增强作用受到一定的限制。
树突状细胞(Dendritic Cells,DC)是近年来倍受人们关注的专职抗原呈递细胞(Antigen presentingCells,APC)，能摄取、加工及呈递抗原，启动T细胞介导的免疫反应。T淋巴细胞在免疫***的激活过程中发挥了重要的作用，其表面受体CD40与CD154相互作用通过树突状细胞的活化及天然杀伤细胞的产生来促进细胞介导的免疫。CD154又被称为CD40L，是CD40的配体，也是一种II型跨膜糖蛋白。作为关键刺激分子表达于CD4+T细胞表面，活化后，也能在CD8T细胞、B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、树突状细胞表面表达。CD154作为一种配体与其受体结合后能够促进T、B细胞的分化、促进巨噬细胞活化，并且具有特异性地靶向DC细胞的功能，在体液和细胞免疫应答中具有重要的作用。因此，设计一种靶向DC免疫增强剂，为后续试验研究提供新的思路。
发明内容
技术问题：本发明所要解决的技术问题是提供了一种用于编码可溶性重组蛋白CTA-CD154的DNA分子。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种可溶性重组蛋白CTA-CD154。
本发明还要解决的技术问题是提供了含有所述的可溶性重组蛋白CTA-CD154的DNA分子的重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种免疫增强剂。
本发明最后要解决的技术问题是提供了所述的免疫增强剂在制备疫苗方面的应用。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明公开了一种用于编码可溶性重组蛋白CTA-CD154的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明内容还包括一种可溶性重组蛋白CTA-CD154，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明内容还包括含有所述的可溶性重组蛋白CTA-CD154的DNA分子的重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。
其中，所述的重组表达载体是将所述的DNA分子***到大肠杆菌表达载体中得到含有可溶性重组蛋白CTA-CD154的DNA分子的重组表达载体。
本发明内容还包括一种转基因重组菌，所述重组菌是将所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。
本发明内容还包括可溶性重组蛋白CTA-CD154的制备方法，包括以下步骤：
1)根据大肠杆菌密码子偏嗜性优化合成CTA-CD154基因序列，并与载体相连，构建重组质粒，所述CTA-CD154基因序列如SEQ ID NO：1所示；
2)将重组质粒转化，诱导以及纯化后获得可溶性重组表达蛋白CTA-CD154。
具体地，可溶性重组蛋白CTA-CD154的制备方法包括以下步骤：
(1)根据大肠杆菌密码子偏嗜性优化合成CTA-CD154基因序列，并与载体pET32a相连，构建重组质粒。
(2)将重组质粒转化BL21感受态细胞，鉴定后获得重组表达质粒pET32a-CTA-CD154/BL21，经IPTG诱导后获得重组表达蛋白，表达后菌体经超声破碎后进行SDS-PAGE分析，发现重组蛋白主要以可溶形式存在，蛋白分子量约为46kDa；Western-blot显示，在46kDa处出现能够与His单抗结合的特异性条带。
本发明内容还包括所述的DNA分子、所述的可溶性重组蛋白CTA-CD154、所述的重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌在制备免疫增强剂方面的应用。
本发明内容还包括一种免疫增强剂，所述免疫增强剂包含所述的可溶性重组蛋白CTA-CD154。
本发明的免疫增强剂，是一种靶向DC细胞的免疫增强剂能够靶向DC细胞，提高DC细胞的活化效率，增强机体对抗原的免疫应答反应，进而提高疫苗免疫效力。
本发明内容还包括所述的免疫增强剂在制备疫苗方面的应用。
本发明的疫苗包括但不仅限于***灭活疫苗、圆环疫苗或伪狂犬疫苗。本发明的疫苗还可以包括其他灭活疫苗，优选猪用灭活疫苗。
有益效果：本发明相对于现有技术，具备以下优点：本发明将CTA与CD154基因进行融合后，利用大肠杆菌可溶性表达***对其进行表达。研究结果证实可溶性重组蛋白CTA-CD154能够作为一种新型的免疫增强剂，且能够特异性的靶向DC细胞，显著增强机体的免疫应答反应，而且融合后的免疫增强CTA-CD154作用显著高于单独成分的免疫增强作用。
附图说明
图1、重组质粒的酶切鉴定图；1-分子量10000bp的标准Marker，2-pET32a-CTA-CD154的酶切产物，3-pET32a-CTA的酶切产物，4-pET32a-CD154的酶切产物；
图2、可溶性重组蛋白的SDS-PAGE分析图；1-蛋白标准Marker，2-BL21空菌，3-CTA-CD154全菌，4-CTA-CD154诱导表达后的包涵体，5-CTA-CD154诱导表达后的上清，6-纯化后的CTA-CD154蛋白，7-纯化后的CTA蛋白，8-纯化后的CD154蛋白；
图3、可溶性重组蛋白的Western-blot鉴定图；1-蛋白标准Marker，2-CTA-CD154全菌，3-CTA-CD154诱导表达后的包涵体，4-CTA-CD154诱导表达后的上清，5-纯化后的CTA-CD154蛋白，6-纯化后的CTA蛋白，7-纯化后的CD154蛋白；
图4、***疫苗免疫后液相阻断ELISA抗体水平检测结果；
图5、***疫苗免疫后CD11C占DC细胞的比例图；
图6、***疫苗免疫后CD11C+CTA-CD154占DC细胞的比例图；
图7、圆环疫苗免疫后ELISA抗体检测结果；
图8、圆环疫苗免疫后CD11C占DC细胞的比例图；
图9、圆环疫苗免疫后CD11C+CTA-CD154占DC细胞的比例图；
图10、伪狂犬疫苗免疫后ELISA抗体检测结果；
图11、伪狂犬疫苗免疫后CD11C占DC细胞的比例图；
图12、伪狂犬疫苗免疫后CD11C+CTA-CD154占DC细胞的比例图。
具体实施方式
为进一步说明本发明的详细情况，下面列举若干实施例，但本发明不应受此限制。
本发明中所用到的试剂：DNA marker、限制性内切酶Nde I、Xho I购自大连宝生物公司；DH5α、BL21感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；蛋白质分子量Marker、BCA试剂盒为Thermo Fisher Scientific公司产品；PVDF膜为Millipore公司产品；DAB显色液、HIS单抗购自南京生兴生物科技有限公司。
实施例1免疫增强剂CTA-CD154的制备方法
1、CTA-CD154目的基因的克隆
根据GenBank登录的CTA(登录号D30053.1)、CD154(登录号HQ110108.1)基因序列，设计目的基因序列，分别将其命名为CTA、CD154、CTA-CD154，并根据大肠杆菌密码子偏嗜性优化后，在序列两端添加Nde I和Xho I酶切位点，委托南京金斯瑞生物科技有限公司克隆至pUC57载体，形成重组克隆载体pUC57-CTA、pUC57-CD154、pUC57-CTA-CD154。
2、重组质粒的构建
将pUC57-CTA、pUC57-CD154、pUC57-CTA-CD154以及重组原核表达载体pET32a分别用Nde I和Xho I进行双酶切和连接转化。从转化菌中提取质粒做酶切鉴定，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，CTA目的条带大约为774bp，CD154目的条带大约为474bp，CTA-CD154目的条带大小约为1248bp。将鉴定正确的重组表达质粒分别命名为pET32a-CTA、pET32a-CD154、pET32a-CTA-CD154。该酶切鉴定图参见图1。
3、目的蛋白的表达
将重组质粒pET32a-CTA、pET32a-CD154、pET32a-CTA-CD154分别转化大肠杆菌BL21，涂布含氨苄青霉素的LB平板，挑取单菌落，得到重组菌pET32a-CTA/BL21、pET32a-CD154/BL21、pET32a-CTA-CD154/BL21。将空质粒pET32a按照相同的方法转化感受态大肠杆菌BL21，得到对照菌株pET32a/BL21。
挑取重组菌pET32a-CTA/BL21、pET32a-CD154/BL21、pET32a-CTA-CD154/BL21与pET32a/BL21的单菌落，分别接种5mL的LB液体培养基中(含氨苄青霉素、氯霉素)，37℃振荡培养过夜。次日将该母液按1:100比例转接到新的的LB液体培养基(含氨苄青霉素和氯霉素)，37℃，220r/min，振荡培养1.5-2h(OD600达0.5-1)，加入终浓度为0.4mmol/LIPTG，于15℃诱导24h，离心收获细菌。收集细菌沉淀并分别用1mL PBS缓冲液对其进行重悬，在冰水浴中进行超声裂解。分别取完整的诱导菌体以及超声波裂解后的上清、沉淀样品进行SDS-PAGE电泳。分别在28KDa、18KDa、46kDa处出现与预期目标大小一致的条带(参见图2)。
用Western-blot对上述处理好的样品进行检测，样品进行SDS-PAGE后将分离胶上的蛋白转移至PVDF膜。取出转好的膜放入含有5％的脱脂奶粉的TBST的封闭液中，4℃过夜。加入1:2000稀释的His单抗，37℃孵育1h后，TBST洗涤5次，5min/次，加入1:3000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG，37℃孵育1h，TBST洗涤5次，5min/次，DAB显色。Western-blot证实，分别在46kDa、28KDa、18KDa处出现能够与His单抗结合的特异性条带(参见图3)。
4、蛋白纯化
按上述方法大量表达重组蛋白pET32a-CTA/BL21、pET32a-CD154/BL21、pET32a-CTA-CD154/BL21，离心收集菌体沉淀。经反复冻融和超声处理后获得可溶性蛋白，并将蛋白使用Ni-Charged Resin亲和层析柱进行纯化，具体操作步骤按说明书进行。纯化后蛋白经超滤浓缩管浓缩除盐3次后，用SDS-PAGE电泳和Western-blot进行验证。用BCA试剂盒对其浓度进行测定，测得纯化后的CTA-CD154重组蛋白浓度为1.2mg/mL(参见图2中第6个泳道、图3中的第5个泳道)，纯化后的CTA蛋白浓度为1.35mg/mL(参见图2中第7个泳道、图3中的第6个泳道)，纯化后的CD154蛋白浓度为1.25mg/mL(参见图2中第8个泳道、图3中的第7个泳道)。该蛋白即可作为免疫增强剂直接使用。
实施例2免疫增强剂CTA-CD154对***灭活疫苗免疫效力的影响
1、实验材料
灭活的猪O型***病毒液(FMDV)，146s含量为6μg/mL，内蒙古金宇集团惠赠。
4-5周龄的ICR小鼠购自扬州大学比较医学中心，液相阻断ELISA抗体滴度≤1:4。
O型***液相阻断ELISA抗体检测试剂盒购自兰州兽医研究所。
GM-CSF，IL-4购自Gibco公司。
FITC标记的抗小鼠CD11C单抗购南京自生兴生物技术有限公司。
FITC-CTA-CD154由本实验室制备标记。
CD154蛋白、CTA蛋白由本实验室提供(制苗时调整浓度和免疫增强剂CTA-CD154浓度一致)。
佐剂ISA206购买于法国赛比克公司。
2、疫苗配制
将免疫增强剂CTA、CD154、CTA-CD154分别按50μg/头份的剂量与灭活的FMDV混合，得到水相溶液，再将水相溶液与佐剂ISA 206按照体积比1:1的比例混合，用乳化仪进行乳化后得到含免疫增强剂CTA、CD154、CTA-CD154的***灭活疫苗。
3、分组、免疫和免疫后相关检测
3.1试验鼠分组及免疫
从扬州大学比较医学中心购入5周龄的ICR小鼠50只，随机划分为5组，每组10只，分别标记为G1、G2、G3、G4、G5组。G1组为FMDV+CTA-CD154组；G2组为FMDV+CTA组；G3组为FMDV+CD154组；G4组为FMDV对照组；G5组为PBS对照组。每只小鼠的免疫剂量为0.25mL/只，21d后加强免疫一次，分别于14d、21d、35d、49d、56d、63d采集血清用于ELISA抗体检测。具体见表1。
表1小鼠分组及免疫
Figure BDA0001437284460000061
3.2免疫后液相阻断抗体检测
分别于免疫后的14d、21d、35d、49d、56d、63d采集血液，分离血清，进行液相阻断抗体检测。
各免疫组液相阻断抗体检测结果如图4，各免疫组的液相阻断抗体在免后35d都处于上升的趋势，PBS空白对照组除外。FMDV对照组的液相阻断抗体虽然有所上升，但免后35d出现了明显的下降趋势。FMDV+CTA组与FMDV+CD154组的抗体水平与FMDV对照组相比提高了一个滴度，并且整个持续期的抗体水平下降缓慢。该结果说明，单独的CTA、CD154能够提高试验鼠对抗原的免疫应答反应，具有免疫增强作用。FMDV+CTA-CD154组的抗体水平显著高于FMDV对照组，在免后35天两组的抗体滴度相差23。与FMDV+CTA组和FMDV+CD154组相比，抗体滴度相差22。该结果说明，免疫增强剂CTA-CD154能够显著提高试验鼠的抗体水平，具有较好的免疫增强作用，并且其免疫增强作用显著高于FMDV+CTA、FMDV+CD154免疫组。
3.3靶向DC细胞的检测
无菌采集小鼠骨髓细胞，经GM-CSF、IL-4刺激，培养7天后获得富集的小鼠骨髓来源的树突状细胞，调整细胞密度为1×106个/mL。加入终浓度为5μg/mLFITC标记的抗小鼠CD11C单抗及FITC-CTA-CD154孵育三个小时后，PBS洗涤3次，加入300μL1％(w/v)多聚甲醛，转移至流式上样管中，进行FACS检测各管DC细胞的阳性比例。检测结果如图5、图6所示，FMDV+CTA-CD154免疫组的CD11C DC细胞的比例为34.7％，FMDV+CD154免疫组的CD11C DC细胞的比例为15.3％，但是FMDV+CTA-CD154免疫组的CD11C+CTA-CD154DC细胞的比例为21.5％，而FMDV+CD154免疫组的CD11C+CTA-CD154DC细胞的比例为4％，两组相比，差异极为显著(P<0.05)。该结果表明免疫增强剂CTA-CD154能够特异性地靶向DC细胞，而单独的CD154也具有靶向DC细胞的功能，但靶向能力较弱。
本实施例中，免疫增强剂的使用体积也可依据实际需要调整，在此不一一列举。
实施例3免疫增强剂CTA-CD154对商品化猪圆环病毒2型(PCV2)疫苗免疫效力的影响1、实验材料
猪圆环病毒2型灭活疫苗(DBN-SX07株)购自成都天邦。
4-5周龄的ICR小鼠购自扬州大学比较医学中心。
猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒购自武汉科前生物股份有限公司。
2、疫苗配制
将免疫增强剂CTA、CD154、CTA-CD154分别按50μg/头份的剂量与商品化的猪圆环病毒2型灭活疫苗(DBN-SX07株)进行混合，得到含免疫增强剂CTA、CD154、CTA-CD154的圆环疫苗。
3、分组、免疫和免疫后相关检测
3.1试验鼠分组及免疫
从扬州大学比较医学中心购入5周龄的ICR小鼠50只，随机划分为5组，每组10只，分别标记为Z1、Z2、Z3、Z4、Z5组。Z1组为PCV2+CTA-CD154组；Z2组为PCV2+CTA组；Z3组为PCV2+CD154组；Z4组为PCV2对照组；Z5组为PBS对照组。每只小鼠的免疫剂量为0.2mL/只，14d后加强免疫一次，分别于14d、35d采集血清用于ELISA抗体检测。具体见表2。
表2小鼠分组及免疫
Figure BDA0001437284460000071
3.2免疫后圆环特异性抗体检测
分别于免疫后的14d、35d采集血液，分离血清，进行PCV2特异性抗体检测。具体操作按照试剂盒说明书进行。
各免疫组血清400倍稀释后，抗体检测结果如图7，首免14d采集血清检测PCV2特异性抗体，PCV2+CTA-CD154免疫组抗体水平高于其他免疫组，但差异不显著，加强免疫后，小鼠PCV2特异性抗体显著升高，PCV2+CTA-CD154免疫组抗体水平明显高于PCV2+CTA免疫组、PCV2+CD154免疫组和PCV2商品苗对照组，且差异显著(p<0.05)。试验中PBS阴性对照PCV2特异性抗体检测均为阴性。试验表明，免疫增强剂CTA+CD154能够显著提高PCV2灭活疫苗的的免疫效力，具有很好的免疫增强作用。
3.3靶向DC细胞的检测
免后21d无菌采集小鼠骨髓细胞，经GM-CSF、IL-4刺激，培养7天后获得富集的小鼠骨髓来源的树突状细胞，调整细胞密度为1×106个/mL。加入终浓度为5μg/mLFITC标记的抗小鼠CD11C单抗及FITC-CTA-CD154孵育三个小时后，PBS洗涤3次，加入300μL1％多聚甲醛，转移至流式上样管中，进行FACS检测各管DC细胞的阳性比例。检测结果如图8、图9所示，PCV2+CTA-CD154免疫组的CD11C DC细胞的比例为18.5％，与其他免疫组比较差异极为显著(P<0.05)。PCV2+CTA-CD154免疫组的CD11C+CTA-CD154DC细胞的比例为10.98％，与其他免疫组相比差异极为显著(P<0.05)。该结果表明免疫增强剂CTA-CD154与圆环疫苗免疫后能够特异性地靶向DC细胞。
本实施例中，免疫增强剂的使用体积也可依据实际需要调整，在此不一一列举。
实施例4免疫增强剂CTA-CD154对猪伪狂犬(PRV)疫苗免疫效力的影响
1、实验材料
伪狂净疫苗(伪狂犬基因缺失疫苗)购自大北农集团。
4-5周龄的ICR小鼠购自扬州大学比较医学中心。
PRV gB ELISA试剂盒购自荷兰Biochek。
2、疫苗配制
将免疫增强剂CTA、CD154、CTA-CD154分别按50μg/头份的剂量与商品化的伪狂净疫苗进行混合，得到含免疫增强剂CTA、CD154、CTA-CD154的伪狂犬疫苗。
3、分组、免疫和免疫后相关检测
3.1试验鼠分组及免疫
从扬州大学比较医学中心购入5周龄的ICR小鼠50只，随机划分为5组，每组10只，分别标记为P1、P2、P3、P4、P5组。P1组为PRV+CTA-CD154组；P2组为PRV+CTA组；P3组为PRV+CD154组；P4组为PRV对照组；P5组为PBS对照组。每只小鼠的免疫剂量为0.2mL/只，于21d采集血清用于ELISA抗体检测。具体见表3。
表3小鼠分组及免疫
Figure BDA0001437284460000091
3.2免疫后伪狂犬特异性抗体检测
免疫后的21d采集血液，分离血清，进行PRV特异性抗体检测。具体操作按照试剂盒说明书进行。
各免疫组血清按1：10倍稀释后进行检测，抗体检测结果如图10，免疫后3周采集血清进行PRV特异性抗体检测，PRV+CTA免疫组和PRV+CD154免疫组抗体水平高于PRV商品苗对照组，差异不显著。而PRV+CTA-CD154免疫组相比较其他三个免疫组，抗体水平明显更高，差异显著，且抗体检测均一性更好。试验中PBS对照组检测结果为阴性。试验表明，免疫增强剂CTA-CD154能够显著提高PRV弱毒疫苗的免疫效力，具有很好的免疫增强作用。
3.3靶向DC细胞的检测
免后21d无菌采集小鼠骨髓细胞，经GM-CSF、IL-4刺激，培养7天后获得富集的小鼠骨髓来源的树突状细胞，调整细胞密度为1×106个/mL。加入终浓度为5μg/mLFITC标记的抗小鼠CD11C单抗及FITC-CTA-CD154孵育三个小时后，PBS洗涤3次，加入300μL1％多聚甲醛，转移至流式上样管中，进行FACS检测各管DC细胞的阳性比例。检测结果如图11、图12所示，PRV+CTA-CD154免疫组的CD11C DC细胞的比例为13.54％，PRV+CD154免疫组的CD11C DC细胞的比例为4.05％，但是PRV+CTA-CD154免疫组的CD11C+CTA-CD154DC细胞的比例为8.54％，PRV+CD154免疫组的CD11C+CTA-CD154DC细胞的比例为2.05％，与其他免疫组相比差异显著。该结果表明伪狂犬疫苗中添加免疫增强剂CTA-CD154后能够特异性地靶向DC细胞。
本实施例中，免疫增强剂的使用体积也可依据实际需要调整，在此不一一列举。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种可溶性重组蛋白CTA-CD154及其制备方法和应用
<130> 17NJ1V0310082
<141> 2017-10-18
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1185
<212> DNA
<213> 重组蛋白CTA-CD154(人工序列)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1185)
<400> 1
aacgacgata agctgtaccg tgcggacagc cgtccgccgg atgagatcaa acaaagcggt 60
ggcctgatgc cgcgtggtca gagcgaatac tttgaccgtg gcacccaaat gaacattaac 120
ctgtatgatc acgcgcgtgg tacccagacc ggtttcgtgc gtcacgacga tggttacgtt 180
agcaccagca tcagcctgcg tagcgcgcac ctggtgggtc aaaccattct gagcggccac 240
agcacctact atctgtatgt tctggcgacc gcgccgaaca tgtttaacgt gaacgacgtt 300
ctgggtgcgt acagcccgca cccggatgag caggaagtga gcgcgctggg tggcatcccg 360
tatagccaaa tttacggttg gtatcgtgtg cactttggcg ttctggacga gcagctgcac 420
cgtaaccgtg gttaccgtga tcgttactat agcaacctgg acatcgcgcc ggcggcggat 480
ggttatggtc tggcgggttt cccgccggaa caccgtgcgt ggcgtgagga accgtggatt 540
caccacgctc cgccgggttg cggtaacgcg ccgcgtagca gcatgagcaa cacctgcgac 600
gagaagaccc agagcctggg tgtgaaattt ctggatgaat accagagcaa ggttaaacgt 660
caaatcttca gcggctatca gagcgacatc gatacccaca accgtattaa ggacgagctg 720
ggatccaagg gtgaccagga cccgcagatc gcggcgcacg ttattagcga ggcgagcagc 780
aagaccgcga gcgtgctgca gtgggcgccg aaaggctact ataccctgag caccaacctg 840
gttaccctgg aaaacggtcg tcagctggcg gtgaaacgtc aaggcatcta ctatatttac 900
gcgcaggtta ccttctgcag caaccgtgac gcggcgggtc aagcgccgtt tatcgcgagc 960
ctgtgcctgc gtagcccgag cggcagcgag cgtattctgc tgcgtgcggc gaacacccac 1020
agcagcagca agccgtgcgg tcagcaaagc atccacctgg gtggcgtttt cgaactgcag 1080
ccgggcgcga gcgtgtttgt taacgtgacc gatccgagcc aagtgagcca cggtaccggc 1140
ttcaccagct ttggtctgct gaaactgcac caccaccacc accac 1185
<210> 2
<211> 395
<212> PRT
<213> 重组蛋白CTA-CD154(人工序列)
<400> 2
Asn Asp Asp Lys Leu Tyr Arg Ala Asp Ser Arg Pro Pro Asp Glu Ile
1 5 10 15
Lys Gln Ser Gly Gly Leu Met Pro Arg Gly Gln Ser Glu Tyr Phe Asp
20 25 30
Arg Gly Thr Gln Met Asn Ile Asn Leu Tyr Asp His Ala Arg Gly Thr
35 40 45
Gln Thr Gly Phe Val Arg His Asp Asp Gly Tyr Val Ser Thr Ser Ile
50 55 60
Ser Leu Arg Ser Ala His Leu Val Gly Gln Thr Ile Leu Ser Gly His
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Tyr Leu Tyr Val Leu Ala Thr Ala Pro Asn Met Phe Asn
85 90 95
Val Asn Asp Val Leu Gly Ala Tyr Ser Pro His Pro Asp Glu Gln Glu
100 105 110
Val Ser Ala Leu Gly Gly Ile Pro Tyr Ser Gln Ile Tyr Gly Trp Tyr
115 120 125
Arg Val His Phe Gly Val Leu Asp Glu Gln Leu His Arg Asn Arg Gly
130 135 140
Tyr Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Asn Leu Asp Ile Ala Pro Ala Ala Asp
145 150 155 160
Gly Tyr Gly Leu Ala Gly Phe Pro Pro Glu His Arg Ala Trp Arg Glu
165 170 175
Glu Pro Trp Ile His His Ala Pro Pro Gly Cys Gly Asn Ala Pro Arg
180 185 190
Ser Ser Met Ser Asn Thr Cys Asp Glu Lys Thr Gln Ser Leu Gly Val
195 200 205
Lys Phe Leu Asp Glu Tyr Gln Ser Lys Val Lys Arg Gln Ile Phe Ser
210 215 220
Gly Tyr Gln Ser Asp Ile Asp Thr His Asn Arg Ile Lys Asp Glu Leu
225 230 235 240
Gly Ser Lys Gly Asp Gln Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
245 250 255
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Ala Ser Val Leu Gln Trp Ala Pro Lys Gly
260 265 270
Tyr Tyr Thr Leu Ser Thr Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Arg Gln
275 280 285
Leu Ala Val Lys Arg Gln Gly Ile Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
290 295 300
Phe Cys Ser Asn Arg Asp Ala Ala Gly Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
305 310 315 320
Leu Cys Leu Arg Ser Pro Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
325 330 335
Ala Asn Thr His Ser Ser Ser Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His
340 345 350
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
355 360 365
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
370 375 380
Gly Leu Leu Lys Leu His His His His His His
385 390 395

Claims (10)

1.一种用于编码可溶性重组蛋白CTA-CD154的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种可溶性重组蛋白CTA-CD154，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.含有权利要求1所述的编码可溶性重组蛋白CTA-CD154的DNA分子的重组表达载体或转基因重组菌。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，将权利要求1所述的DNA分子***到大肠杆菌表达载体中得到含有编码可溶性重组蛋白CTA-CD154 的DNA分子的重组表达载体。
5.一种转基因重组菌，所述重组菌是将权利要求3或4所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。
6.权利要求2所述的可溶性重组蛋白CTA-CD154的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）根据大肠杆菌密码子偏嗜性优化合成CTA-CD154基因序列，并与载体相连，构建重组质粒，所述CTA-CD154基因序列如权利要求1的SEQ ID NO：1所示；
2）将重组质粒转化，诱导以及纯化后获得可溶性重组表达蛋白CTA-CD154。
7.权利要求1所述的DNA分子、权利要求2所述的可溶性重组蛋白CTA-CD154、权利要求3所述的重组表达载体或转基因重组菌在制备免疫增强剂方面的应用。
8.一种免疫增强剂，其特征在于，所述免疫增强剂包含权利要求2所述的可溶性重组蛋白CTA-CD154。
9.权利要求8所述的免疫增强剂在制备疫苗方面的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疫苗为***灭活疫苗、圆环疫苗或伪狂犬疫苗。
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