CN1544629A - 重组鹅白细胞介素-2蛋白的制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组鹅白细胞介素－2(gsIL－2)蛋白的制备方法及其用途。RT－PCR扩增的浙东白鹅白细胞介素－2的DNA片段与原核表达载体pBAD/HisB、真核表达载体pMETαB和pMETB构建表达质粒pBAD/HisB/gsIL－2、pMETαB/gsIL－2和pMETA/gsIL－2，分别转化大肠杆菌LMG194、酵母菌PMAD11和PMAD16后诱导表达。表达量分别占菌体总蛋白的9～10％、20～25％和10～12％。大肠杆菌和酵母菌PMAD16诱导后经超声波裂解、离心去沉淀即为gsIL－2蛋白粗制品，PMAD11表达的gsIL－2主要分泌于培养基中，离心取上清即为gsIL－2蛋白粗制品。用Ni－NTAArgarose蛋白纯化***可以较快的得到gsIL－2纯品，粗制品或纯品可以作为免疫佐剂和疾病治疗药物。本发明应用基因工程技术制备的重组gsIL－2蛋白，具有工艺流程简单，生产成本低，稳定性好，生物学活性高等特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种重组鹅白细胞介素-2蛋白的制备方法及其用途。
背景技术
1.Schauenstein等(1982)首先发现了鸡脾淋巴细胞分泌一种具有类似于哺乳动物白细胞介素-2样活性的细胞因子，随后，Schnetlzler等(1983)应用硫酸铵沉淀，碳酸氢铵重悬浮，Sephadex G-100凝胶过滤得到两类具有活性的分离物，其分子量分别位于9～11.5KDa和19.5～21.5Kda之间。Vainio等此后用同样方法得到了分子量为13KDa的分子，而且他们用等电聚焦估计鸡IL-2的PI为5.9。Frederickson等(1987)应用Phenyl-sepharose、阴离子交换及superose-12过柱等方法，分离出两类具有活性的物质，其一分子量为14KDa，其二分子量约为26～30KDa，后者比前者活性更强，两者均具有低亲水性。Myers(1992)报道了一种从ConA刺激的鸡脾淋巴细胞培养液中纯化鸡IL-2的“五步法”，即(1)凝胶过滤初步浓缩ConA刺激的鸡脾淋巴细胞悬液；(2)硫酸铵沉淀；(3)用Sephadex G-100层析；(4)反向高压液相层析(high performanceliquid chromatography，HPLC)和(5)Phenyl-sepharose层析。所纯化的IL-2蛋白在还原条件下进行SDS-PAGE电泳，得到的蛋白有两个峰值，分子量约为36～39KDa和17.5～25KDa，将高峰的蛋白烷化还原，再用Sephadex G-100层析，可产生低分子量的峰。
Sundick等(1997)通过构建cDNA文库的方法首次从鸡脾脏中获得鸡IL-2基因，Choi等(1998)把含信号序列长430个核苷酸的鸡IL-2基因分别克隆入原核表达载体PUC18和真核表达载体pcDNA3，分别在大肠杆菌和CHO-K1细胞中进行表达，得到的两种蛋白都具有促进鸡T淋巴细胞增殖的生物学活性。Stepaniak等(1999)对鸡IL-2体外表达进行了比较深入的研究，将去除前导肽的鸡IL-2基因在大肠杆菌Pgex-2t***中进行了表达，得到的蛋白具有天然鸡IL-2蛋白的生物学活性，但表达效率较低仅为63μg/L，且多为非可溶性蛋白，不利于蛋白的回收和纯化。为解决此问题，他们采用了pET32a+高效表达***，将蛋白表达量提高到4mg/L，且绝大部分为可溶性蛋白。同时，该学者将含前导鸡IL-2基因的完整编码框克隆入真核表达载体pCR3.1+中，在肾成纤维细胞系中进行表达，结果发现该***不但能稳定表达鸡IL-2蛋白，而且上清和经纯化的蛋白都具有良好的生物学活性，从而证明了鸡IL-2和哺乳动物IL-2相似，其活性并不依赖于前导序列。
2.鸡IL-2前体蛋白由143个氨基酸组成，成熟的蛋白由121个氨基酸组成。它和哺乳动物IL-2具有相类似的生物学活性，如促进B淋巴细胞和T淋巴细胞的增殖，增强NK细胞的杀伤活性等功能，在机体免疫中发挥重要作用。基于鸡IL-2的研究，我们利用RT-PCR技术从脾淋巴细胞中扩增了浙东白鹅IL-2的DNA片段，并实现了在原核和真核细胞中的高效表达，表达产物具有刺激鹅脾淋巴细胞增殖的生物学活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组鹅白细胞介素-2蛋白的制备方法及其用途。
重组鹅白细胞介素-2蛋白制备方法的步骤如下：
1)自浙东白鹅单核淋巴细胞中克隆出鹅白细胞介素-2(gsIL-2)的DNA片段与含有PBAD启动子的原核表达载体pBAD/His B组建成表达载体pBAD/HisB/gsIL-2；或者上述gsIL-2DNA片段与含有PADGI启动子的真核表达载体pMETαB组建成分泌型表达载体pMETαB/gsIL-2；或者上述gsIL-2 DNA片段与含有PADGI启动子的真核表达载体pMETB组建成胞内型表达载体pMET B/gsIL-2；
2)用RM作为基础培养基，通过发酵扩增大肠杆菌工程菌LMG194；
3)用BMDY作为基础培养基，通过发酵扩增酵母工程菌PMAD11和PMAD16，在表达不同时间加氮源、碳源等营养素；
4)大肠杆菌LMG194和酵母菌PMAD16诱导后经超声波裂解、离心去沉淀即为gsIL-2粗制品，PMAD11表达的gsIL-2主要分泌于培养基中，经过离心取上清即为gsIL-2粗制品。用Ni-NTA Argarose蛋白纯化***可得到gsIL-2纯品；
5)粗制品或纯品加入甘氨酸等稳定剂和助溶剂后，无菌过滤、分装和冻干后制成成品，保存于-20℃的冷藏环境中。
重组gsIL-2蛋白用于提高机体免疫功能和免疫佐剂；用于治疗水禽类疾病；
本发明的优点：(1)大肠杆菌表达的gsIL-2蛋白主要以融合蛋白的形式存在基因工程菌内，经超声波就可以使目的蛋白释放出来，不需要其他的处理就可以得到gsIL-2粗蛋白，且蛋白稳定性好、生物学活性较高；(2)选用分泌型酵母表达载体pMETαB，所表达的gsIL-2蛋白大部分被分泌到培养基中，不但不需要任何的处理就可以得到gsIL-2粗制品，且目的蛋白具有良好的稳定性和生物学活性；(3)选用非分泌型酵母表达载体pMET B，表达的gsIL-2蛋白主要以融合蛋白的形式存在工程菌内，经超声波处理就可以得到gsIL-2粗蛋白，粗蛋白具有比较高的稳定性和生物学活性；(4)所用的Ni-NTA Agarose蛋白纯化***操作简单，得到的蛋白纯度高。(5)重组gsIL-2作为免疫佐剂和疾病治疗药物效果显著。
具体实施方式
1鹅白细胞介素-2基因克隆 用刀豆素(ConA)刺激鹅脾单核细胞，Trizol一步法提取总RNA，通过RT-PCR方法扩增和克隆了浙东白鹅白细胞介素-2 cDNA片段，将其连接到测序载体pGEM-T Easy Vector，测定gsIL-2 DNA序列。
2重组表达鹅白细胞介素-2基因工程大肠杆菌的构建 鹅白细胞介素-2的PCR扩增产物亚克隆到一新型表达载体pBAD/His B中，构建成gsIL-2原核表达载体pBAD/His B/gsIL-2，它能在大肠杆菌LMG194中表达，使gsIL-2蛋白占菌体总蛋白的9～10％，表达率经100次以上传代不降低。
3重组表达鹅白细胞介素-2基因工程酵母菌的构建 将鹅白细胞介素-2的PCR扩增产物亚克隆到新型真核表达载体pMETαB和pMET B中，分别构建成gsIL-2表达载体pMETαB/gsIL-2和pMET B/gsIL-2，用BMDY作为基础培养基，用甲醇作为诱导剂，通过优化溶氧、震荡速度、发酵pH值等工艺参数，可以使gsIL-2基因在P.methanolica表达菌株PMAD11和PMAD16中得到表达，表达量分别占菌体总蛋白的20～25％和10～12％。，表达率经100次以上传代不降低。
4重组鹅白细胞介素-2蛋白粗制品的制备及纯化工艺。
所建立的粗制品的制备及纯化工艺流程简单、稳定性好、活性高。本工艺具有以下特点：(1)大肠杆菌表达的gsIL-2蛋白主要以融合蛋白的形式存在工程菌内，经超声波就可以使目的蛋白释放出来，不需要其他的处理就可以得到gsIL-2粗蛋白，且其生物学活性较高；(2)选用分泌型酵母表达载体pMETαB，所表达的gsIL-2蛋白大部分被分泌到培养基中，不但不需要任何的处理就可以得到gsIL-2蛋白粗产品，且目的蛋白具有良好的生物学活性；(3)选用非分泌型酵母表达载体PMET B，表达的gsIL-2蛋白主要以融合蛋白的形式存在工程菌内，经超声波处理就可以得到gsIL-2粗蛋白，且粗蛋白具有比较高的生物学活性；(4)所用的Ni-NTA Agarose蛋白纯化***操作简单，得到的蛋白纯度高。
5粗制品或纯品加入磷酸缓冲液等助溶剂，用微空滤膜过滤除菌，可以作为免疫佐剂和疾病治疗药物。
IL-2的一个重要生物学功能就是促进T淋巴细胞的增殖，我们用经ConA刺激的鹅脾T淋巴细胞作为靶细胞，用MTT法对重组gsIL-2蛋白的活性进行了检测，证实表达产物具有较高的生物学活性。
本发明运用重组DNA技术，采用反转录PCR方法得到了一种重组gsIL-2蛋白。经过下游纯化，中试规模下的产品达到了临床应用的质量要求。
实施例1.寡核苷酸引物的设计与合成
根据GenBank中注册的鸭(AF294323)、鸡(AF017645)和火鸡(AJ007463)IL-2核苷酸序列，设计1对RT-PCR引物：
上游引物，5’-AATACTAGCACAGAGACAACCAG-3’
下游引物，5’-TTACTGAAATTTATTAAATATCATCTA-3’
实施例2.脾单核淋巴细胞的分离
无菌采集1月龄浙东白鹅脾脏、剪碎置于无Ca2+、Mg2+离子的PBS中(717mmol/L K2HPO4，283mmol/L KH2PO4，PH7.2)，300×g 4℃离心10min，取上清500×g 4℃离心30min收集淋巴细胞，然后用PBS洗2次，再以RPMI1640培养液(不含犊牛血清)洗涤1次，台盼蓝(0.1％)染色活细胞计数后，用RPMI1640生长培养液(含10％的犊牛血清、100IU/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素)将细胞配成1×107/ml的细胞悬液。细胞悬液中加入10mg/L终浓度ConA，分装细胞培养板，5％二氧化碳培养箱40℃培养16h收集淋巴细胞培养物用Trizol试剂一步法提取细胞总RNA。
实施例3.RT-PCR扩增目的基因片段
First Strand cDNA Synthesis Kit反转录合成鹅IL-2 cDNA第一链；转录产物在95℃1min、47℃45s、72℃2min环境下30个循环进行PCR，最后72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析。
实施例4.测序载体的构建和序列测定
用PCR Purification试剂盒纯化回收目的PCR产物片段，利用T-A克隆策略直接连接于pGEM-T Easy载体，连接产物转化E.coli TOP10感受态细胞，在含氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB平板上进行筛选。PCR和酶切鉴定阳性克隆。选择5个阳性克隆进行测序。浙东白鹅白细胞介素-2基因核苷酸及推导氨基酸序列见表1。
1 AATACTAGCACAGAGACAACCAGAACACTGACAAGATGTGCAAAGTACTGATCTTCAGCTGCCTTTCGG 69
2 M C K V L I F S C L S 69
1 TAGTAATGCTTATGACTACAGCTTATGGAGCACCTCTATCAGAGAAAAATGACACTCTTACAACTTTAA 138
2 V V M L M T T A Y G A P L S E K N D T L T T L 138
1 TAAAAGATTTAGAAAAGCTGGGAACAAGCATGAAGAAGATTAATCTTGAGCTCTACACACCAAATGAGA 207
2 I K D L E K L G T S M K K I N L E L Y T P N N 207
1 AACAGGAGTGCAGCTGGCAAACTCTACAATGTTACTTGAAAGAAATAGTCACCTTGGAGAATGAAATTG 276
2 K Q E C S W Q T L Q C Y L K E I V T L N E N I 276
1 AAGATGAGGATGAAATTGAAGATGAGAACGTATTTAGTGTTAGGAATATTGAAAAGAATCTCCAAAAAC 345
2 E D E D E I E D E N V F S V R N I E K N L Q K 345
1 TTACGGACCTAATTCCCCCAGGAACGGGATGCAAGATCTGTGAAGCTAATGACAAGAAGGAGTTTCCTG 414
2 L T D L I P P G T G C K I C E A N D K K E F P 414
1 AATTTCACCGAGAGCTGACCAACTTTCTGAGATCTATGCTAAAATAAGCAGATGACCATTTATATTTTT 483
2 E F H R E L T N F L R S M L K - 483
1 ACTGCTACGTTATTTATTTAAGTATTTAATTACAAATAATTTATATATTTTACCCTGGGGCTAACTAAC 552
1 TTGCTGTCCATTTTGGGACCACTGTATGCTCTTAGTGTGGGTGATAACGTGTCTGTTCTAAGATCACAT 621
1 TTGATCCTTTCTGTAAGCCCTACGGGCTCAAAATGTATGTTGGAAAACTAATTGGTTCTCACTTTGTCA 690
1 GTAAACTTAAAATGACAACTATTTATTGAAAGAATTGTTAAAAGTTACTTGTAGATGATATTTAATAAA 759
1 TTTCAGTAA 768
表1.浙东白鹅白细胞介素-2基因核苷酸及推导氨基酸序列(SEQ No.1)
实施例5.pBAD/His B/gsIL-2表达载体构建、筛选及鉴定
根据已克隆的浙东白鹅白细胞介素-2序列，在成熟蛋白序列两端合成上下游引物：UP1(5’GC
GAATTCGCACCTCTATCAGAGAA3’)，5’端含EcoRI酶切位点；DOWN1(5’GC
AAGCTTTTATTTTAGCATAGATCT 3’)，5’端含HandIII酶切位点；以pGEM-T-Easy/gsIL-2为模板在95℃1min、47℃45s、72℃2min环境下30个循环进行PCR，最后延伸10min。PCR产物电泳回收后，经EcoRI、HandIII双酶切后，回收目的片段并克隆于表达质粒pBAD/His B的EcoRI+HandIII酶切窗口中，构建重组表达质粒pBAD/His B/gsIL-2，转化宿主菌TOP10，提取重组质粒进行PCR、双酶切鉴定和序列测定。
实施例6.重组gsIL-2的发酵生产(大肠杆菌)
经鉴定的重组质粒转入LMG194宿主菌，挑取单克隆接种到含有氨苄青霉素和葡萄糖的RM培养基中，37℃培养过夜，按1∶100的比例将培养物接种于RM培养基中，250rpm震荡培养2小时左右，使OD600≈0.5，按1∶100的比例加入20％浓度的L(+)-***糖诱导培养3小时，离心收集菌体。将菌体加入适量的1×SDS上样缓冲液，采用15％的SDS-PAGE鉴定，Bradford法测定产物表达量可达9～10％。
实施例7.pMETαB/gsIL-2和pMETB/gsIL-2表达载体构建、筛选及鉴定
根据浙东白鹅白细胞介素-2序列，在其成熟蛋白序列两端合成上下游引物：上游引物同实例5中UP1；下游引物DOWN2(5’GC
GGATCCTATTTTAGCATAGATCT3’)，5’端含BamHI酶切位点。以pGEM-T-Easy/gsIL-2为模板进行PCR，扩增条件同实例5。PCR产物电泳回收后，经EcoRI、BamHI双酶切后，回收目的片段并分别克隆于表达质粒pMETαB和pMETB强启动子下游的EcoRI+BamHI酶切窗口中，构建重组表达质粒，转化宿主菌TOP10，提取重组质粒进行PCR、双酶切鉴定和序列测定。
采用Choi等报道的方法制备PMAD11和PMAD16感受态细胞，分别取100μlPMAD11和PMAD16酵母感受态细胞与2μg经KpnI酶切完全的pMETαB/gsIL-2和pMETB/gsIL-2混合，使用Bio-Rad Gene Pluser在375V/cm，25μF、250Ω的条件下进行转化，然后加入1ml室温的YPAD，28～30℃孵育1h，1500×g室温离心3min收集菌体，重新悬于100μl 1×YNB，将菌液涂布于MD选择平板上，28～30℃培养3～4天，观察转化子的生长情况。随机筛选MD平板上白色菌落，用Genomic DNA mini-prepkit提取酵母基因组DNA进行PCR扩增鉴定。
实施例8.重组gsIL-2蛋白的发酵生产(酵母)
分别挑取PCR鉴定为阳性的PMAD11和PMAD16克隆接种于20mL BMDY培养基中，28～30℃，250r/min震荡培养16～18h至OD600＝2～10。室温，1500×g离心5min，收集菌体重悬于10mL BMMY培养基中。28～30℃，250r/min继续震荡培养4天，每24小时补加5％的甲醇使甲醇终浓度为0.5％，离心分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE电泳进行gsIL-2表达鉴定，Bradford法测定gsIL-2在PMAD11中的表达量为20～25％，在PMAD16中的表达量为10～12％。
实施例9.重组基因工程大肠杆菌的保存与稳定性
工程菌加30％甘油，-70℃保存。短期保存菌种可用LB平板。为检查工程菌的稳定性，将原始菌种、50代和100代菌分别抽提质粒进行序列测定。结果三者相同。同时3代菌种扩增培养物表达水平相当，证明本发明中的工程菌是十分稳定的。
实施例10.重组基因工程酵母菌的保存与稳定性
工程菌加30％甘油，-70℃保存。短期保存菌种可用YPAD平板。为检查工程菌的稳定性，将原始菌种、50代和100代菌分别抽提质粒进行序列测定。结果三者相同。同时3代菌种扩增培养物表达水平相当，证明本发明中的工程菌是十分稳定的。
实施例11.重组gsIL-2粗蛋白的制备及分离纯化
经大肠杆菌LMG194表达的gsIL-2蛋白主要以融合蛋白的形式存在，菌体经超声波破碎后，可以得到gsIL-2蛋白粗制品，进一步用QIAGEN公司的Ni-NTAAgarose蛋白纯化***可以较快的得到gsIL-2蛋白纯品。
含有pMETαB/gsIL-2重组载体的P.methanolica表达菌株PMAD11表达的gsIL-2蛋白主要分泌于培养基中，经过离心取上清即可得到gsIL-2蛋白粗制品，含有pMETB/gsIL-2重组载体的P.methanolica表达菌株PMAD16表达的gsIL-2蛋白主要存在酵母细胞内，经超声波裂解、离心去沉淀即可得到gsIL-2蛋白粗制品，用QIAGEN公司的Ni-NTA Agarose蛋白纯化***可以较快的得到gsIL-2蛋白纯品
实施例12.重组gsIL-2蛋白的鉴定
HPLC检定纯度均98％以上，MTT法测定粗制品及纯品的生物学活性，大肠杆菌和P.methanolica酵母的表达产物不但具有刺激T淋巴细胞生长的活性，且活性明显高于ConA诱导的T淋巴细胞上清液的活性。
实施例13.重组gsIL-2蛋白理化性质及稳定性
重组gsIL-2蛋白对热较稳定，56℃1小时、37℃12小时或70℃15分钟处理仍保留活性，4℃可保存1年以上，其活性在pH2～9范围内保持稳定。重组gsIL-2蛋白对蛋白酶敏感，对DNA酶、RNA酶不敏感。
实施例14.重组gsIL-2蛋白作为免疫佐剂和疾病治疗药物。
用重组gsIL-2蛋白可以使鹅伤寒沙门氏菌器官侵入率降低49％～58％，另外，以重组gsIL-2蛋白注入鹅胚，可以显著降低孵化期鹅胚的沙门氏菌器官侵入率。在寄生虫方面，在鹅感染球虫的前一天或感染后的第1天，用重组gsIL-2蛋白皮下注射1周龄鹅后，可以明显降低(p＜0.05)球虫感染后卵囊的排出量。30日龄鹅感染小鹅瘟后，肌肉注射抗小鹅瘟血清的有效保护率为78.2％，肌肉注射重组gsIL-2蛋白加抗小鹅瘟血清的保护率高达91.5％，而单独肌肉注射抗小鹅瘟血清和小鹅瘟疫苗的的保护率为64.8％和2.7％。
Claims (7)
1.一种重组鹅白细胞介素-2蛋白的制备方法，其特征在于它的步骤如下：
1)自浙东白鹅单核淋巴细胞中克隆出鹅白细胞介素-2(gsIL-2)的DNA片段与含有PBAD启动子的原核表达载体pBAD/His B组建成表达载体pBAD/HisB/gsIL-2；或者上述gsIL-2DNA片段与含有PAUG1启动子的真核表达载体pMETαB组建成分泌型表达载体pMETαB/gsIL-2；或者上述gsIL-2 DNA片段与含有PAUG1启动子的真核表达载体pMETB组建成胞内型表达载体pMET B/gsIL-2；
2)用RM作为基础培养基，通过发酵扩增大肠杆菌工程菌LMG194；
3)用BMDY作为基础培养基，通过发酵扩增酵母工程菌PMAD11和PMAD16，在表达不同时间加氮源、碳源等营养素；
4)大肠杆菌LMG194和酵母菌PMAD16诱导后经超声波裂解、离心去沉淀即为gsIL-2粗制品，PMAD11表达的gsIL-2主要分泌于培养基中，经过离心取上清即为gsIL-2粗制品。用Ni-NTA Argarose蛋白纯化***可得到gsIL-2纯品；
5)粗制品或纯品加入甘氨酸等稳定剂和助溶剂后，无菌过滤、分装和冻干后制成成品，保存于-20℃的冷藏环境中。
2.根据权利要求1所述的一种重组鹅白细胞介素-2蛋白的制备方法，，其特征在于所说的gsIL-2 DNA片段与含有PBAD启动子的原核表达载体pBAD/His B组建成表达载体pBAD/His B/gsIL-2，经电转化大肠杆菌LMG194为gsIL-2基因工程大肠杆菌，L(+)-***糖诱导表达后，产物以融合蛋白的形式存在工程菌内。
3.根据权利要求1所述的一种重组鹅白细胞介素-2蛋白的制备方法，其特征在于上述所说的gsIL-2 DNA片段与含有PAUG1启动子的真核表达载体pMETαB组建成分泌型表达载体pMETαB/gsIL-2，经电击转化酵母菌PMAD11为gsIL-2基因工程酵母菌，甲醇诱导表达，产物以分泌物形式存在于工程菌培养基中；pMETαB/gsIL-2电转化酵母菌PMAD16，甲醇诱导表达，产物主要存在于工程菌内。
4.根据权利要求1所述的一种重组鹅白细胞介素-2蛋白的制备方法，，其特征在于所说的通过发酵扩增大肠杆菌工程菌LMG194，用RM作为基础培养基，是通过破碎大肠杆菌菌体，用Ni-NTA Argarose蛋白纯化***纯化产品。
5.根据权利要求1所述的一种重组鹅白细胞介素-2蛋白的制备方法，，其特征在于所说的通过发酵扩增酵母工程菌PMAD16，用BMDY作为基础培养基，在表达不同时间加入氮源、碳源等营养素，是通过破碎酵母工程菌PMAD16菌体，用Ni-NTA Argarose蛋白纯化***进行纯化。
6.根据权利要求1所述的一种重组鹅白细胞介素-2蛋白的制备方法，，其特征在于所说的通过发酵扩增酵母工程菌PMAD11，用BMDY作为基础培养基，在表达不同时间加入氮源、碳源等营养素，酵母工程菌PMAD11分泌物用Ni-NTAArgarose蛋白纯化***进行纯化。
7.一种重组鹅白细胞介素-2蛋白的用途，其特征在于它作为免疫佐剂用于提高疫苗免疫效力；作为水禽治疗药物具有抗病毒、抗菌和抗寄生虫活性。
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