CN1202255C

CN1202255C - 编码具有果糖基转移酶活性的蛋白质的核酸分子及制备长链菊粉的方法

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Publication number: CN1202255C
Application number: CNB988116901A
Authority: CN
Inventors: A·G·黑尔; E·W·海尔维格; D·格里茨切尔
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1997-11-06
Filing date: 1998-11-06
Publication date: 2005-05-18
Anticipated expiration: 2018-11-06
Also published as: CZ20001680A3; PL340364A1; ATE427357T1; DK1029067T3; DE19749122A1; AU1667499A; DE69840704D1; US20040014092A1; BR9813968A; AR017767A1; EP1029067B1; US6559356B1; AU753390B2; ZA9810110B; US7083963B2; CN1280624A; PL194854B1; JP4287046B2; CA2309133C; ES2324188T3

Abstract

描述了编码具有果糖基转移酶的酶活性的蛋白质的核酸分子。这些酶是果糖基转移酶(FFT)。并且描述了含有本发明所述核酸分子的载体和宿主细胞，尤其是转化的植物细胞，植物组织和由此再生的表达所述FFT的植物。另外，描述了利用所述蛋白质、宿主，尤其是植物细胞来制备长链菊粉的方法和/或由它们制备的FFT。

Description

编码具有果糖基转移酶活性的蛋白质的核酸分子及制备长链菊粉的方法

本发明涉及编码具有果糖基转移酶(fructosyl transferase，FFT)的酶活性的蛋白质的核酸分子。本发明还涉及含有所述核酸分子的载体和用该核酸分子转化的宿主细胞(尤其是植物细胞)、植物组织和植物。另外，本发明描述了转基因植物的制备方法，所述植物由于导入了编码FFT的核酸分子能够合成长链菊粉。本发明还涉及制备FFT的方法以及在各种宿主生物，尤其是植物中制备长链菊粉，还涉及利用本发明所述FFT体外制备长链菊粉的方法。本发明进一步涉及发明所述宿主细胞和通过本发明所述过程得到的菊粉。

水溶性的线性聚合物具备多种应用，例如用于提高含水***的粘度，作为洗涤剂、作为悬浮剂或用于加速沉降、用于复合水，也可以用于结合水。由于其生物可降解性，基于糖类(比如果糖基多糖)的聚合物是特别有价值的原料。

除了作为工业生产和加工过程中的可再生原料之外，果糖基聚合物还被当作食品添加剂，例如作为甜味剂。对于不同的用途，需要链长各异的聚合物。在食品加工工业中，特别优选短链和中链聚合物，而在技术性应用中，比如生产表面活性剂时，需要高聚合度(DP)的聚合物。

到目前为止，只对在植物中生产长链果聚糖多糖的方法有描述，这种方法中要表达细菌来源的果糖基转移酶。多数细菌果糖基转移酶合成果聚糖，即一种β-2，6连接的有众多β-2，1-分支的果糖基聚合物。由于其众多的分支，就技术加工而言，果聚糖有明显的缺陷，因此被认为是没有菊粉重要的技术原料。至今，只知道一种细菌基因，其基因产物参与菊粉的合成，即来自变异链球菌(Streptococcus mutans)的 ftf基因。如果先将一个基因基因工程化，原则上就可以在植物中表达该基因。但是，得自转基因植物的菊粉产量如此之低，以致不可能将转基因植物做商业应用。

另外，已知一种制备能表达得自菊芋(Helianthus tuberosus)的果糖基转移酶的转基因植物的方法。在转基因植物中表达这些基因从而产生的菊粉，其平均聚合度在DP＝6到DP＝10。不能把这种聚合度的聚合物称做长链菊粉。平均DP＝6到DP＝10的菊粉不适合多数技术性应用。

在植物中商业生产长链菊粉的方法或者合成用于生产长链菊粉的酶的方法均是未知的。

PCT/US89/02729描述了在转基因植物细胞，具体说是在转基因植物的果实中合成糖类聚合物，尤其是葡聚糖或多果糖的可能性。为了制备以这种方式进行了修饰的植物，该文建议使用来自微生物，尤其是来自产果聚糖气杆菌、唾液链球菌和枯草芽孢杆菌的果聚糖蔗糖酶，或者是来自肠膜明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶。但它既没有描述活性酶形成方法也没有描述果聚糖或葡聚糖的形成方法，或者转基因植物的制备方法。PCT/EP93/02110公开了一种制备转基因植物的方法，该植物表达来自革兰氏阴性细菌解淀粉欧文氏菌的果聚糖蔗糖酶的 Isc基因。所述植物产生一种高分子、强分支的果聚糖。PCT/NL93/00279描述了用嵌合基因转化植物，该嵌合基因含有来自枯草芽孢杆菌的sacB基因或者来自变异链球菌的 ftf基因。表达 sacB基因的转基因植物产生一种分支的果聚糖。表达 ftf基因的植物能合成高分子菊粉；但是产量极低不可能在商业上使用。PCT/NL96/00012公开了编码合成糖类聚合物的酶的DNA序列以及借助这些DNA序列来制备转基因植物的方法。该公开序列来源于菊芋。根据PCT/NL96/00012，可以使用该公开序列以便修饰矮牵牛和马铃薯的果聚糖特性，但也会修饰菊芋自身的果聚糖特性。在转基因植物中表达SST和FFT基因时，可能产生菊粉。但菊粉的平均聚合度在DP＝6到DP＝10之间。利用PCT/NL96/00012描述的方法不可能生产高分子菊粉。PCT/EP97/02195描述了一种利用来自变异链球菌的 ftf基因来制备产菊粉的转基因植物的方法。与PCT/NL93/00279的情况一样，高分子菊粉的产量低。DE 197 08 774.4描述了利用显示出果糖基聚合酶活性的酶来生产短链菊粉的方法。可以在转基因植物中制备短链菊粉。短链菊粉的产量高，并且在马铃著中它与细胞中的蔗糖含量一致。但该文没有描述制备长链菊粉。

在植物中合成菊粉已经得到彻底的研究(Pollock & Chatterton，果聚糖，植物生物化学14卷(1988)，Academic Press，109-140页)。但是，植物中的天然菊粉是短链果聚糖，其最高聚合度大约为DP＝35(Pollock &Chatterton，1988，出处同前)。在植物中果聚糖的合成和代谢基于至少三种酶的活性：形成三糖-蔗果三糖的蔗糖依赖性的蔗糖-果糖基转移酶(SST)、从最小聚合度DP＝3(蔗果三糖)的果聚糖分子将果糖基残基转移到蔗糖和更高的果聚糖的果聚糖依赖性果聚糖-果糖基转移酶(FFT)，以及从果聚糖分子移去果糖残基的果聚糖外切水解酶(FEH)。还不知道的是不同植物种类中菊粉的平均分子量差别(例如，在洋葱中大约是2×10³，在菊芋中是5×10³)是否基于它们的SST、FFT或FEH的不同性质。

因此，就目前有关植物中菊粉合成的知识来说，不可能鉴定到合适的DNA序列，利用它可以在植物中合成有商业价值量的高分子菊粉。

因此，本发明的基本技术问题是提供一些核酸分子和方法，能用它们来制备可形成长链菊粉的基因修饰生物，特别是植物。

借助权利要求书所体现的实施方案能够解决这一问题。

因此，本发明涉及编码具有FFT酶活性的蛋白质的核酸分子，所述核酸分子选自：

(a)编码包含SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的蛋白质的核酸分子；

(b)包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示核苷酸序列或相应核糖核苷酸序列的核酸分子；

(c)与(a)或(b)所述核酸分子的互补链在严格条件下杂交的核酸分子；以及

(d)包含(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的一个片段的核酸分子。

在本发明文中，果糖基转移酶(FFT)是一种能够催化果糖单位间形成β-2，1-糖苷键和/或β-2，6-糖苷键的蛋白质。因此，要被转移的果糖残基可以来源于1-蔗果三糖或果聚糖聚合物。结合本发明来说，高分子果聚糖是一种聚合物，其分子含有平均数在20以上，优选在25以上，更优选至少32个果糖残基。并且，高分子果聚糖优选是一种聚合物，其分子含有平均数低于3000，更优选低于300，尤其优选是低于100个果糖残基。所述果糖残基可以是经β-2，1键或经β-2，6键糖苷连接的。对于菊粉，残基通常是经β-2，1糖苷键连接的。也可以有少量β-2，6键，具体说是低于5％，优选低于3％，更优选低于1.5％，最优选低于0.5％。果糖基聚合物可以在末端携带一个葡萄糖残基，后者通过葡萄糖的C-1OH-基团和果糖残基的C-2 OH-基团连接在一起。在这种情况下，果糖基聚合物中还含有蔗糖分子。

令人惊奇的是，在转化植物中表达本发明的核酸分子时形成了大量高分子菊粉。在植物中形成的菊粉平均聚合度明显超过DP＝20。这是出乎意料的，因为一个类似的来自菊芋的酶参与在转基因植物中合成菊粉，平均聚合度低于DP＝20(PCT/NL96/00012)。

本发明的核酸分子可以是DNA或RNA分子。相应的DNA分子是例如基因组DNA或cDNA分子。本发明的核酸分子可以分离自天然来源，优选来自洋蓟，或者它们可以根据已知方法来合成。借助常规的分子生物学技术，即有可能(参见例如，Sambrook等，1989，分子克隆，实验手册，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)将各种突变导入本发明的核酸分子，所述突变导致合成生物性状可能改变的蛋白质。就这点来说，即有可能一方面制备缺失突变，其中通过在编码DNA序列的5′或3′端渐进地缺失来制备所述核酸分子。这些核酸分子导致合成相应的变短的蛋白质。利用这些核苷酸序列5′端缺失，例如有可能鉴定到负责将酶转运到液泡中的氨基酸序列(转运肽)。这样可以有目的地生产这样一些酶，所述酶由于被删除了相关序列，不再定位于液泡中，但仍在细胞质中，或者由于添加了其他信号序列而定位在其他区室中。

另一方面，还可以想到在某些位点导入点突变，所述位点的氨基酸序列的修饰例如影响酶活性或者酶的调节。这样，例如可以制备K_m值改变的突变体或不再受控于细胞内的调节机制(比如别构调节或共价修饰)的突变体。

另外，可以制备这样的突变体，这些突变体底物改变或者产物特异性改变。此外，可以制备活性-温度图形改变的突变体。

为了在原核细胞中进行重组DNA操作，可以将本发明的核酸分子或者这些分子的某些部分***质粒，这些质粒通过DNA序列的重组可以进行诱变或序列修饰。利用常规技术(参见Sambrook等，1989，分子克隆：实验手册，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，USA)，可以进行碱基交换或者可以添加天然或合成序列。为了将DNA片段彼此连接在一起，可以将衔接子或接头与这些片段连接。另外，可以采用那些能提供合适的限制位点或者能删除多余的DNA或限制位点的操作。如果可以采用***、缺失或取代，在体外诱变时，可以利用引物修复、限制或连接。至于分析方法，通常可以使用序列分析、限制分析或进一步的生物化学-分子-生物学方法。

在本发明文中，术语“杂交”意味着在常规条件下的杂交，优选是在严格条件下的杂交，例如Sambrook等，1989，分子克隆，实验手册，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY中所描述的。严格杂交的一个例子是于42℃在50％甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt’s溶液、40mM磷酸钠(pH6.8)；0.5％(w/v)BSA，1％(w/v)SDS，0.1mg/ml鲱精DNA中进行的杂交。常规的非严格杂交的一个例子是在上述条件下，但用30％甲酰胺代替50％甲酰胺进行的杂交。严格条件下的洗涤条件优选于60℃，0.5×SSC/0.5％SDS；对于非严格条件，洗涤条件优选于56℃，2×SSC/0.5％SDS。

与本发明的分子杂交的核酸分子可以例如分离自由相应生物，比如洋蓟制备到的基因组文库或cDNA文库。

可以利用本发明的分子或这些分子的某些部分，或者根据情况，可能是这些分子的逆转录互补链，例如按照标准技术(参见例如Sambrook等，1989，分子克隆，实验手册，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY)通过杂交来鉴定和分离上述核酸分子。可以用例如具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示的全部或基本核苷酸序列或者其部分核酸分子作为杂交探针。作为杂交探针的片段还可以是借助普通的合成技术制备的合成片段，其序列与本发明的核酸分子基本上类似。

与本发明的核酸分子杂交的分子还包含上述编码本发明蛋白质的核酸分子的片段、衍生体以及等位基因变体。将“片段”认为是核酸分子的部分，它具有足够的长度以编码本发明的蛋白质。在本文中，术语“衍生体”意味这些分子的序列与上述核酸分子在1个或多个位点不同。但是，它们显示出与这些分子的高度同源性。同源意味着至少40％的序列相同性，尤其是至少60％相同，优选80％以上相同，最优选90％以上。由这些核酸分子编码的蛋白质显示出与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少80％的序列相同，优选85％，尤其优选90％以上，更优选95％以上，还要优选的是97％以上，最优选99％以上序列相同。例如缺失、取代、***和/或重组可能造成与上述核酸分子的差别。

与上述分子同源并代表这些分子的衍生体的核酸分子通常是这些分子的变异体，它们代表有相同生物学功能的修饰。所述核酸分子可以是天然变异，例如来自其他生物的序列，或者是突变，而这些突变可以是自然发生的或者是通过定向突变而导入的。另外，变体可以是合成制备的序列。等位基因变体可以是天然变体或者合成或重组制备的变体。

本发明的核酸分子的各种变体所编码的蛋白质显示出某些共同特性，比如酶活性、分子量、免疫活性或者构型或物理特性，比如在凝胶电泳中的迁移率，层析特性、沉降系数、溶解度、分光特性、稳定性、最佳pH、最佳温度等。

在一个优选实施方案中，本发明的核酸序列来源于洋蓟(Cynarascolymus)。

本发明还涉及含有发明所述核酸分子的载体。这些载体优选是质粒、粘粒、病毒、噬菌体和其他基因技术中常用的载体。

在本发明的载体中，优选将本发明所述核酸分子可操纵性地连接到调控元件上，后者保证在原核和/或真核细胞中进行转录并合成可翻译的RNA。

利用本发明的表达载体，可以在各种宿主生物中制备长链菊粉，特别是在原核或真核细胞中，比如细菌、真菌、藻类、动物细胞以及优选的植物细胞和植物。优选的宿主生物特别是酵母，比如酿酒酵母；乳酸细菌，比如嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、乳链球菌、酪链球菌、嗜酸乳杆菌和乳脂明串珠菌。也可能在宿主生物体外使用所编码的酶来生产长链菊粉。尤其优选植物细胞。

有关各种表达***的综述可见于酶学方法153(1987)：385-516；Bitter等，酶学方法153(1987)：516-544；Sawers等，应用微生物学和生物技术46(1996)：1-9；Billmann-Jacobe，生物技术评论(CurrentOpinion in Biotechnology)7(1996)：500-504；Hockney，生物技术进展(Trends in Biotechnology)12(1994)：456-463以及Griffiths等，分子生物学方法75(1997)：427-440。用于酵母的表达***在下列文中有描述：Hensing等，Antonie van Leuwenhoek 67(1995)：261-279；Bussineau等，生物学标准的发展83(1994)：13-19；Gellissen等，Antonie van Leuwenhoek 62(1992)：79-93；Fleer，生物技术评论(Current Opinion in Biotechnology)3(1992)：486-496；Vedvick，生物技术评论(Current Opinion in Biotechnology)2(1991)：742-745以及Buckholz，生物/技术学9(1991)：1067-1072。现有技术对表达载体已有大量的描述。除了选择标记基因和保证在所选宿主中进行复制的复制起点之外，它们通常含有细菌或病毒启动子并且在多数情况下，含有转录的终止信号。在启动子和终止信号之间至少有1个限制位点或者一个多接头以便能***编码DNA序列。如果天然控制相关基因进行转录的DNA序列在所选宿主生物中有活性，可以用它作为启动子序列。还可以用其他启动子序列替换该序列。也可以利用能使基因组成性表达的启动子以及能靶向调控下游基因表达的诱导型启动子。现有技术已对具备这些特性的细菌和病毒启动子序列进行了详尽的描述。用于在微生物(比如大肠杆菌、酿酒酵母)中表达的调控序列在现有技术中也已有足够的描述。能够特别强地表达下游基因的启动子是例如，T7启动子(Studier等，酶学方法185(1990)：60-89)、lac uv5、trp、trp-lacUV5(DeBoer等，Rodriguez和Chamberlin(编)，《启动子、结构和功能》；Praeger，NewYork(1982)：462-481；DeBoer等，美国科学院学报(1983)：21-25)、λp1、rac(Boros等，基因42(1986)：97-100)。通常，在微生物生长周期的对数期中间到结尾蛋白质含量最高。因此，优选用诱导型启动子来合成蛋白质。它们常常能得到比组成型启动子高的蛋白质产量。使用强组成型启动子经常通过永久转录和翻译克隆基因导致丢失为其他必要细胞功能所需的能量，因此减慢了细胞的生长(Bernard R.Glick，JackJ.Pasternak，分子生物技术学(1995)，Spektrum Akademischer VerlagGmbH，Heidelberg Berlin Oxford，342页)。因此，为了得到最佳产量的蛋白质，经常使用两步生长法。首先在最适条件下培养宿主细胞至达到较高的细胞密度。在第2阶段，根据所用启动子的类型诱导转录。在本文中，可用乳糖或IPTG(＝异丙基-β-D-硫代半乳糖-吡喃糖苷)诱导的tac-启动子尤其合适(deBoer等，美国科学院学报80(1983)：21-25)。现有技术对转录终止信号也已有描述。

可以通过标准技术(比如Sambrook等描述过的，分子克隆：实验教程手册，第2版(1989)，Cold Spring Harbor Press，New York)用相关的蛋白质编码DNA转化宿主细胞。在与所用宿主细胞的各项要求一致的营养基质中培养宿主细胞，尤其要考虑pH值、温度、盐浓度、通气、抗生素、维生素、痕量元素等。

可以通过常规纯化技术来提纯宿主细胞所产生的酶，比如沉淀、离子交换层析、亲合层析、凝胶过滤、HPLC反相层析等。

通过改变在宿主细胞中进行表达的DNA，可以在宿主细胞中制备那些由于某些特性而容易从培养基中分离出来的多肽。因此就有可能将待表达的蛋白质表达为与另一多肽序列形成的融合蛋白，另一多肽序列的特异结合性能使得可以通过亲合层析来分离融合蛋白(例如Hopp等，生物/技术学6(1988)：1204-1210；Sassenfeld，生物技术进展8(1990)：88-93)。

为了在植物细胞中进行表达，优选马铃薯糖蛋白(patatin)B33启动子的调控元件。其他的优选启动子是35S CaMV启动子和来自酿酒酵母乙醇脱氢酶基因的启动子。

本发明的载体可以具有其他能使载体在宿主生物中稳定存在的功能单位，例如细菌复制起点或者用于在酿酒酵母中稳定化的2μDNA。此外，它们可以含有农杆菌T-DNA的左侧和右侧序列，从而使其能稳定地整合入植物基因组。

本发明的载体还可含有功能性终止子，比如来自农杆菌章鱼碱合酶的终止子。

在另一个实施方案中，在发明所述载体中将本发明的核酸分子与一个核酸分子连接在一起，该核酸分子编码一个功能信号序列以便引导酶进入不同细胞小室。这一修饰可能例如是附加的氨基端信号序列以便使酶分泌到高等植物的质外体中；但是任何其他能使信号序列与编码FFT融合在一起的修饰也是本发明的主题。本发明的载体所包含的核酸分子可以尤其含有一个编码能引起分泌的氨基酸序列的序列。在本文中，优选使用来自产酸克雷伯氏菌M5A1(Fiedler等，分子生物学杂志256(1996)：279-291)的α-CGTase的信号肽或者是基因库中编号X 86014序列的11529-11618位核苷酸所编码的信号肽。

在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及质粒p35-csFFT和p33-csFFT，其构建在实施例中有描述(图2和4)。

在另外一个实施方案中，本发明涉及宿主细胞，这些宿主细胞暂时或稳定地包含本发明所述核酸分子或载体或者是由这类细胞衍生的。在本文中，宿主细胞是这样的生物，它们能体外摄取重组DNA并且，如果可行的话，能合成本发明所述核酸分子所编码的蛋白质。宿主细胞可以是原核和真核细胞。尤其可以是微生物。在本发明文中，宿主细胞全部是如Schlegel“Allgemeine Mikrobiologie”(Georg ThiemeVerlag(1985)：1-2)中定义的细菌和原生生物(比如真菌，尤其是酵母和藻类)。关于原核宿主生物，应当提及的是菊粉已经成功地显示对某些微生物(比如对人类肠道中的Bifido细菌)的生长有积极影响。Bifido细菌已被认为具有有益健康的效果(参见例如，Gibson等，国际糖类杂志(Int.Sugar J).96(1994)：381-386；Roberfroid等，营养杂志128(1998)：11-19)，还讨论过它的肿瘤抑制作用(参见例如Reddy等，癌发生18(1997)：1371-1374；Singh等，癌发生18(1997)：833-841)。因此，本发明的宿主细胞比如酵母(面包)或乳酸细菌(酸奶、酪乳等)适用于食品加工工业。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的宿主细胞附带含有编码蔗糖依赖性蔗糖果糖基转移酶(SST)的基因。该序列，例如，分离自洋蓟(德国专利申请DE-A1 197 08 774)、菊苣(de Halleux等，植物生理学113(1997)：1003-1013)、菊芋(WO 96/21023)和洋葱(Vijn等，植物生理学117(1998)：1507-1513)。

本发明尤其涉及转基因植物细胞，这些细胞是用本发明的核酸分子转化的或者含有本发明所述载体***或者载体的衍生体或某些部分。由于导入了发明所述的载体***、载体***的衍生体或某些部分，这些细胞能合成制备长链菊粉的酶。优选本发明所述细胞的特性在于所导入的本发明所述核酸分子与转化细胞是异源的(即它不是天然存在于这些细胞)或者与其天然序列在基因组中的位置不同。并且，优选本发明的这类转基因植物细胞含有编码SST的DNA序列。

本发明还涉及本发明的核酸分子所编码的蛋白质，以及制备这些蛋白质的方法，所述方法中在能合成蛋白质的条件下培养本发明的宿主细胞。随后从培养细胞和/或培养基中分离蛋白质。本发明还涉及可由本发明所述宿主细胞或者本发明所述方法得到的FFT。

本发明进一步涉及能与本发明的核酸分子特异杂交的核酸分子，涉及与这些分子或这些分子的一部分互补的分子。优选它们是长度至少10个，尤其是至少15个，特别优选至少50个核苷酸的寡核苷酸。本发明的寡核苷酸可以例如用做PCR反应的引物。它们还可以作为反义构建体的组成部分或者作为编码合适的核酶的DNA分子的组成部分。

本发明还涉及制备转基因植物细胞、植物组织以及植物的方法，所述方法包括将本发明的核酸分子或载体导入植物细胞、植物组织和植物中。

通过提供本发明的核酸分子，即有可能借助重组DNA技术来在各种生物，尤其是植物中生产长链菊粉，而这一点在目前通过常规手段，例如育种方法是不可能的。通过提高本发明FFT的活性，例如通过过量表达本发明的核酸分子，或者通过提供不再受控于细胞特异调控机制和/或相对其活性显示迥异的温度依赖性的突变体，即有可能提高利用重组DNA技术而相应改变的植物的产率。

因此，可能在植物细胞中表达本发明的核酸分子以便提高相应FFT的活性，或者将其导入正常情况不表达该酶的细胞。此外，还可能按照本领域技术人员已知的方法来修饰本发明的核酸分子以便得到发明所述FFTs，但该FFT不再受控于细胞特异的调控机制或者该FFT显示出温度依赖性、底物或产物特异性发生改变。

为了这一目的，本领域技术人员可以利用各种植物转化***。EP-A-120 516；Hoekema：二元植物载体***，Offsetdrukkerij KantersB.V.，Alblasserdam(1985)，Chapter V；Fraley，植物学评述(Crit.Rev.Plant.Sci.)，4：1-46以及An，EMBO杂志4(1985)：277-287中已彻底地研究和描述了用T-DNA来转化植物细胞。

为了将DNA转入植物细胞，可以将植物外植体与根癌农杆菌或发根农杆菌适当地共培养。然后可以由被感染的植物材料(例如叶片、茎节、根，也可以是原生质体或悬浮培养的细胞)在合适的培养基中再生出完整的植株，培养基中可以含有抗生素或杀生物剂(biozides)以便挑选转化细胞。然后可以检测以这种方式获得的植株中是否存在导入的DNA。其他利用基因枪法(biolistic method)或通过转化原生质体来导入外源DNA的可能方法是本领域技术人员已知的(参见例如，Willmitzer，L.，1993转基因植物，《生物技术，多卷论文集》(H.J.Rehm，G.Reed，A.Pühler，P.Stadler，编)第2卷：627-659，VCH Weinheim-NewYork-Basel-Cambridge)。

替代的转化单子叶植物的***是利用基因枪法进行的转化、电学或化学诱导DNA摄入原生质体、部分通透性细胞的电穿孔、通过溶胀将DNA大量注射到花序中、DNA显微注射到小孢子和原胚中(参见例如Lusardi，植物杂志5(1994)，571-582；Paszkowski，生物技术24(1992)：387-392)。利用根癌农杆菌经Ti-质粒载体***转化双子叶植物已是很完善的方法，但最近的研究表明利用基于农杆菌的载体所进行的转化也可以用于单子叶植物(Chan等，植物分子生物学22(1993)：491-506；Hiei等，植物杂志6(1994)：271-282；Bytebier等，美国科学院学报84(1987)：5345-5349；Raineri等，生物/技术学8(1990)：33-38；Gould等，植物生理学95(1991)：426-434；Mooney等，植物细胞组织&器官培养25(1991)：209-218；Li等，植物分子生物学20(1992)：1037-1048)。

上面提及的转化***中的三种，即植物组织电穿孔、原生质体转化以及通过颗粒轰击进行的DNA转移到再生组织和细胞中(Jhne等，Euphytica85(1995)：35-44给出一篇综述)在过去已用于多种谷类。相应的文献中描述了多种转化小麦的方法(综述见Maheshwari等，植物学评述14(2)(1995)：149-178)。

在植物中表达本发明的核酸分子时，原则上来说，合成的蛋白质可能定位于任何预期的植物细胞小室内。为了使其定位到特定小室，必须将保证定位到液泡的序列缺失，而其余编码区域任选连接到保证定位到各小室的DNA序列上。这类序列是本领域已知的(参见例如Braun，EMBO杂志11(1992)：3219-3227；Wolter，美国科学院学报85(1988)：846-850；Sonnewald，植物杂志1(1991)：95-106；Rocha-Sosa，EMBO杂志8(1989)：23-29)。

本发明还涉及用本发明的1个或几个核酸分子转化的转基因植物细胞、植物组织和植物，还涉及这样转化的细胞所衍生的转基因植物细胞。这些细胞含有1个或几个本发明的核酸分子，而这个/这些分子优选连接到保证在植物细胞内进行转录的调控DNA元件上，尤其是启动子。这些细胞与天然植物细胞的不同在于它们含有至少一个本发明的核酸分子，后者不是天然存在于这些细胞中或者在于该分子整合到细胞基因组的非天然位置中，即另一个基因组环境。由于1-蔗果三糖是FFT的天然底物，其自身形成于蔗糖依赖性蔗糖果糖基转移酶(SST)与蔗糖的反应中，因此除了本发明的核酸分子、载体或FFT之外，提供一个SST就是尤其有益或者可能是必须的。因此，在一个优选实施方案中，本发明涉及另外含有编码蔗糖依赖性蔗糖果糖基转移酶(SST)的基因的转基因植物细胞、植物组织或植物。它们可能是例如已经天然表达SST的植物或植物细胞，比如菊苣、菊芋、大丽花或者利用重组DNA技术导入了SST编码DNA序列的植物。所述序列与本发明的核酸分子或载体可以独自或同时导入。

可以利用本领域技术人员已知的技术将所述转基因植物细胞和植物组织再生为完整植株。能够由本发明的转基因植物细胞再生得到的植物也是本发明的主题。本发明另一个主题是含有上述转基因植物细胞的植物。所述转基因植物细胞原则上可以是任何所需类型的植物种类，即单子叶和双子叶植物均可。优选它们是有用的植物，尤其是含有蔗糖的植物，比如大米、玉米、甜菜、甘蔗或马铃薯、蔬菜(例如西红柿、胡萝卜、韭菜、菊苣等)、饲料或牧草、甘薯、小麦、大麦、油菜或大豆。

本发明还涉及本发明所述植物的繁殖材料和收获产品，比如果实、种子、块茎、根状茎、幼苗、插条、愈伤组织、细胞培养物等。

本发明的另一个主题是可从本发明所述宿主细胞获得的长链菊粉，尤其是由转基因植物细胞、植物组织、植物以及由繁殖材料和收获产品获得的长链菊粉。

在另一个实施方案中，本发明涉及制备长链菊粉的方法，该方法包括：

(a)在允许产生FFT和将1-蔗果三糖(任选是由外界提供的)或者等价底物转化为长链菊粉的条件下，培养本发明的宿主细胞、尤其是植物细胞、植物组织或植物；以及

(b)从所培养的宿主细胞、尤其是植物细胞、组织或植物中，或者从培养基中回收这样产生的菊粉。

(a)在允许1-蔗果三糖转化为长链菊粉的条件下，使该糖或等价底物与本发明的FFT进行接触；以及

(b)回收这样产生的菊粉。

从各种来源，尤其是植物组织中回收菊粉在例如Gibson等，国际糖杂志96(1994)：381-386；Baxa，Czech食品科学杂志16(1998)：72-76；EP-A-787 745；De Leenheer糖类有机原材料III，Workshop(1996)，Meeting Date 1994：67-92，Verlag VCH Weinheim，Germany以及俄罗斯专利RU 2001621C1中已有描述。

本发明还涉及一种利用底物蔗糖以及SST与本发明所述FFT形成的组合酶来体外制备长链菊粉的方法。在另一个实施方案中，本发明涉及利用含有果糖基寡聚物和本发明所述FFT的混合物来体外制备菊粉的方法。在本文中，果糖基寡聚物是由DP大约为2到7的果糖单位组成的寡聚物，其末端可能显示一个葡萄糖残基。实施本发明的方法时，优选使用重组制备的蛋白质。在本发明文中，它们是通过将相应蛋白质编码DNA序列导入宿主细胞并在其中进行表达而产生的蛋白质。随后可以从宿主细胞和/或培养基中回收这些蛋白质。所述宿主细胞优选是如前面定义的本发明的宿主细胞。在本发明方法的一个优选实施方案中，使用重组制备并由宿主细胞分泌到培养基中的酶，因此不必破碎细胞或进一步纯化蛋白质，因为可以从上清液中得到分泌出来的蛋白质。为了除去培养基中的残渣，可以使用常规加工技术，比如透析、反渗透、层析方法等。这同样适用于浓缩分泌于培养基中的蛋白质。微生物分泌蛋白质通常是由氨基端的信号肽(信号序列、前导序列)介导。带有信号序列的蛋白质可以穿过微生物的细胞膜。通过将编码该信号肽的DNA序列与相应酶编码区连接在一起可以实现蛋白质的分泌。优选使用来自产酸克雷伯氏菌M5A1的α-CGTase(Fiedler等，分子生物学杂志256(1996)：279-291)的信号肽或者由基因库中保藏号为X86014的序列的11529-11618位核苷酸编码的信号肽。

用于本发明所述方法的酶可以选择不是由微生物产生，而是利用导致蛋白质表达的体外转录和翻译***产生。在本发明一个特别优选的实施方案中，FFT由植物叶组织的原生质体产生。

本发明还涉及由本发明的宿主细胞(尤其是植物细胞)、植物组织或植物形成的菊粉，或者由本发明的植物和植物细胞的繁殖材料或收获产品形成的菊粉，或者是可以由上述本发明方法之一得到的菊粉。可以优选使用所述菊粉以生产用于提高含水***的粘度的表面活性剂、作为洗涤剂、作为悬浮剂、用于加速沉降、用于复合水或者用于结合水。

以上已公开了这些或其他实施方案，对本领域技术人员是显而易见的。它们包括本发明的说明书和实施例。可以从现有技术，例如从公共图书馆或利用电子手段获得另外的涉及上述任何方法、手段或用途，并可以根据本发明来应用的文献。公共数据库可以实现这一目的，例如可以通过Internet在例如http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html这个地址下连接的“Medline”。其他数据库和网址是本领域技术人员已知的，也可以从Internet上在例如http：//www.lycos.com.这个地址下获得。在Berks，TIBTECH 12(1994)：352-364中可以找到涉及生物技术专利或专利申请的资源和信息的综述。

附图显示了：

图1显示完全原生质体提取物的HPLC分析结果。所述原生质体是用不同载体转化的：A：使用载体pA7进行转化，该载体不含与CaMV 35S启动子融合在一起的编码区。B：使用载体pA7-csFFT进行转化，该载体含有与CaMV 35S启动子融合在一起的得自洋蓟的果聚糖：果聚糖-果糖基转移酶编码区。C：使用载体pA7-htFFT进行转化，该载体含有与CaMV 35S启动子融合在一起的菊芋果聚糖：果聚糖果糖基转移酶编码区。分析前，每份完全原生质体提取物在果糖基寡聚物混合物中温育12小时。如实施例1所述进行分析。

图2显示质粒p35-csFFT的构建过程。

图3显示用构建体p35-csFFT转化的转基因植物的HPLC分析结果。分析表明在表达SST和来自洋蓟的FFT(35S-SST/FFT 22/19)的转基因植物中形成了长链菊粉分子。

图4显示质粒p33-csFFT的构建过程。

图5显示用构建体p33-csFFT转化的转基因植物的HPLC分析结果。分析表明在表达SST和来自洋蓟的FFT(B33-SST/FFT47)的转基因植物中形成了长链菊粉分子。

以下实施例用于阐述本发明。

实施例1：识别、分离和鉴定编码洋蓟(Cynara scolymus)果糖基转移酶的cDNA

从洋蓟的花托中分离总RNA(Sambrook等，1989，分子克隆，实验手册，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，USA)。利用mRNA分离***PolyATract(Promega Corporation，Madi son，WI，USA)分离Poly(A)+mRNA。依照厂商的说明利用Stratagene(Heidelberg)的ZAP-cDNA合成试剂盒由5μg该RNA制备互补DNA(cDNA)，并获得2×10⁶个独立重组噬菌体克隆。根据标准方法，在低度严格条件下利用对应洋蓟SST cDNA(DE 197 08 774.4中描述的质粒pCy21中的NotI-片段)的³²P-标记的DNA片段来筛选扩增到的cDNA文库。洋蓟SST的序列在DE 197 08 774.4中已有描述。利用SST探针在高度严格条件下筛选阳性克隆。舍弃在筛选过程中反应阳性的克隆，因为这些显然是SST cDNA。利用限制酶NotI切割由常规途径分离到的质粒DNA从而从剩余的克隆中分离到cDNA***片段，并将其克隆至载体pA7中。利用T4聚合酶将NotI片段的粘末端补平。随后，将片段连接到pA7的Smal位点。载体pA7是pUC18(Yanish-Perron，基因33(1985)：103-119)的衍生物，在多接头的EcoRI和SacI位点之间含有一个花椰菜花叶病毒35S启动子的***片段(Gardner，核酸研究9(1981)：2871-2888所述的7146到7464位核苷酸)。除了35S启动子之外，pA7还含有Ti质粒pTi ACH5(Gielen，EMBO杂志3(1984)：835-846)的T-DNA中的基因3的多腺苷酸化信号，即11749到11939位核苷酸，它是分离自质粒pAGV40(Herrera-Estrella，自然303(1983)：209-213)的Pvu II-Hind III片段，并在向Pvu II位点添加Sph I接头后克隆到多接头的Sph I和HindIII位点之间。

根据Negrutiu(植物分子生物学8(1987)：363-373)的方法，利用含有洋蓟cDNA的pA7衍生物转化烟草原生质体。于25℃暗处将转化后的原生质体在K3培养基(Nagy和Maliga Z.，Pflanzenphysiologie 78(1976)：453-455)中培养2天。随后，通过反复冻融获得细胞提取物。于28℃用寡果聚糖(67.5％1-蔗果三糖、28.4％nystose、3.6％果糖基nystose、0.5％蔗糖)将提取物温育12小时，然后通过HPLC分析。HPLC分析使用CarboPac PA 100阴离子交换柱进行，该柱连接了Dionex DX-300梯度层析***(Dionex，Sunnyvale，CA，USA)。利用pulsamperometric检测来检测糖单体、寡聚物和聚合物。用于该目的检测仪的参数为：T₁＝0.48s；T₂＝0.12s；T₃＝0.12s；E₁＝0.05V；E₂＝0.65V；E₃＝-0.95V；敏感度＝0.1μC；积分＝0.28-0.48s；流动介质A＝0.15M NaOH；流动介质B＝1MNaAc/0.15M NaOH；梯度：10分钟100％ A；2分钟由0％B线性增加到100％B；2分钟100％B；2分钟由＝0％A线性增加到100％A；5分钟A。用前将样品脱盐并过滤(microcon 10，amicon，Beverly，USA)。流速是1ml/min。在少数提取物中，能够发现高分子菊粉(参见图1)。

实施例2：质粒pCy3的cDNA***片段的序列分析

利用双脱氧核苷酸技术(Sanger，美国科学院学报74(1977)：5463-5467)对来自原生质体分析法中介导合成高分子菊粉的pA7衍生体(pCy3)的cDNA***片段进行测序。克隆pCy3的***片段是一个长度为2073 bp的DNA。该核苷酸序列示于SEQ ID NO.1。相应的氨基酸序列示于SEQ ID NO.2。SEQ ID NO.3是SEQ ID NO.1的变体，编码的蛋白质与SEQ ID NO.1所编码的蛋白质相同。

序列分析以及与已公开序列进行的比较表明SEQ ID NO.1所示序列是新的，并包含与来自其他生物的FFTs同源的编码区。

实施例3：质粒p35-csFFT的合成以及质粒整合到马铃薯基因组

质粒p35-csFFT(图2)含有二元载体pBin19内的3个片段A、B和C(Bevan，核酸研究12(1984)：8711，根据Becker，核酸研究18(1990)：203进行了修饰)。

片段A含有花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子。它含有7146到7464位核苷酸(Gardner，核酸研究9(1981)：2871-2888)，是pBin19-Hyg的多接头中EcoRI和SacI位点间的***片段。

片段B含有序列SEQ ID NO.1中的1到2073位核苷酸。该片段B是从载体pBK-CMV中获得的一个NotI片段，它借助EcoRI/NotI接头序列***到所述载体的EcoRI位点。片段C含有Ti质粒pTi ACH 5(Gielen，EMBO杂志3(1984)：835-846)的T-DNA中的基因3的多腺苷酸化信号，即11749到11939位核苷酸，它是分离自质粒pAGV 40(Herrera-Estrella，自然303(1983)：209-213)的Pvu II-Hind III片段，并在给Pvu II位点添加Sph I接头后克隆到pBin19-Hyg多接头的SphI和HindIII位点之间。

将质粒p35-csSST导入农杆菌(Hfgen和Willmitzer，核酸研究16(1988)：9877)，然后依照上述标准技术经农杆菌介导的基因转移导入马铃薯植株。所述马铃薯植株用编码洋蓟SST的DNA序列(参见德国专利申请DE-A1 197 08 774)进行转化，并在35S启动子的调控下表达这些序列。由转化细胞再生完整植株。从再生植株的叶子中获取提取物，检测其中是否含有果糖基聚合物。如实施例1所述进行分析。对来自各种用该载体***转化了的植物的叶子进行的分析明确证明产生了高分子菊粉，它是由p35-csFFT所含的洋蓟FFT基因表达产生的(参见图3)。

表1

表达洋蓟SST和FFT基因的转基因马铃薯块茎中菊粉含量的分析结果

植物编号	果聚糖含量μmol果糖/g鲜重	平均聚合度(果糖/葡萄糖比率)
植物编号	果聚糖含量μmol果糖/g鲜重	平均聚合度(果糖/葡萄糖比率)	35-SST/FFT22/2635-SST/FFT36/17	30.8127.34	21(20/1)20(19/1)

实施例4：质粒p33-csFFT的制备及质粒整合到马铃薯基因组

质粒p33-csFFT(图4)与质粒p35-csFFT相同，但片段A含有的是马铃薯的马铃薯糖蛋白基因 b33的B33启动子，而非CaMV的35S启动子。它含有马铃薯糖蛋白基因 b33(Rocha-Sosa，EMBO杂志8(1989)：23-29)的一个Dral片段(-1512到+14位点)，该片段插在pBin19-Hyg的多接头中的EcoR I和Sac I位点之间。质粒p33-csFFT大小约为14kb。如实施例3所述将质粒p33-csSST经农杆菌介导的基因转移导入马铃薯植株。所述马铃薯植株用编码洋蓟SST的DNA序列(参见德国专利申请E-A1 19708 774)进行转化，并在B33启动子的调控下表达这些序列。由转化细胞再生完整植株。对来自各种用该载体***转化了的植物的块茎进行的分析明确证明产生了高分子菊粉，它是由p33-csFFT所含的洋蓟FFT基因表达产生的(参见图5)。

序列表

(1)一般资料：

(i)申请人：

(A)名称：Max-Planck-Gesellschaft zur Frderung der

Wissenschaften，e.V.

(B)街道：无

(C)城市：柏林

(D)州：无

(E)国家：德国

(F)邮政编码：无

(ii)发明题目：编码具有果糖基转移酶活性的蛋白质的核酸

分子及制备长链菊粉的方法

(iii)序列数：4

(v)计算机可读形式：

(A)资料载体：软盘

(B)计算机：IBM PC可兼容机

(C)操作***：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release #1.0，版本#1.30(EPA)

(2)SEQ ID NO：1的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：2073个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)推测：非

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：21..1872

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

TTACCTCATT TCCATCAACC ATG AGA ACG ACT GAA CCC CAA ACT GAC CTT 50

Met Arg Thr Thr Glu Pro Gln Thr Asp Leu

1 5 10

GAG CAT GCA CCC AAC CAC ACT CCA CTA CTG GAC CAC CCC GAA CCA CCA 98

Glu His Ala Pro Asn His Thr Pro Leu Leu Asp His Pro Glu Pro Pro

15 20 25

CCG GCC GCC GTG AGA AAC CGG TTG TTG ATT AGG GTT TCG TCC AGT ATC 146

Pro Ala Ala Val Arg Asn Arg Leu Leu Ile Arg Val Ser Ser Ser Ile

30 35 40

ACA TTG GTC TCT CTG TTT TTT GTT TCA GCA TTC CTA CTC ATT CTC CTG 194

Thr Leu Val Ser Leu Phe Phe Val Ser Ala Phe Leu Leu Ile Leu Leu

45 50 55

TAC CAA CAC GAT TCC ACT TAC ACC GAT GAT AAT TCA GCA CCG TCG GAA 242

Tyr Gln His Asp Ser Thr Tyr Thr Asp Asp Asn Ser Ala Pro Ser Glu

60 65 70

AGT TCT TCC CAG CAG CCC TCC GCT GCC GAT CGC CTG AGA TGG GAG AGA 290

Ser Ser Ser Gln Gln Pro Ser Ala Ala Asp Arg Leu Arg Trp Glu Arg

75 80 85 90

ACA GCT TTT CAT TTC CAG CCC GCC AAA AAT TTC ATT TAT GAT CCC AAC 338

Thr Ala Phe His Phe Gln Pro Ala Lys Asn Phe Ile Tyr Asp Pro Asn

95 100 105

GGT CCA TTG TTC CAT ATG GGT TGG TAC CAT CTT TTC TAC CAA TAC AAC 386

Gly Pro Leu Phe His Met Gly Trp Tyr His Leu Phe Tyr Gln Tyr Asn

110 115 120

CCG TAC GCA CCG TTT TGG GGC AAC ATG ACA TGG GGT CAC GCC GTG TCC 434

Pro Tyr Ala Pro Phe Trp Gly Asn Met Thr Trp Gly His Ala Val Ser

125 130 135

AAA GAC ATG ATC AAC TGG TTC GAG CTT CCG ATC GCC TTG GCC CCA ACC 482

Lys Asp Met Ile Asn Trp Phe Glu Leu Pro Ile Ala Leu Ala Pro Thr

140 145 150

GAA TGG TAC GAT ATC GAG GGT GTT TTA TCA GGC TCA ACC ACG ATC CTC 530

Glu Trp Tyr Asp Ile Glu Gly Val Leu Ser Gly Ser Thr Thr Ile Leu

155 160 165 170

CCT GAT GGT CGA ATC TTT GCT CTC TAT ACC GGA AAC ACA AAC GAT CTC 578

Pro Asp Gly Arg Ile Phe Ala Leu Tyr Thr Gly Asn Thr Asn Asp Leu

175 180 185

GAG CAA CTT CAA TGC AAA GCC GTG CCA GTT AAT GCA TCC GAC CCA CTT 626

Glu Gln Leu Gln Cys Lys Ala Val Pro Val Asn Ala Ser Asp Pro Leu

190 195 200

CTT GTT GAA TGG GTC AGG TAC GAT GCT AAC CCG ATC CTG TAT GCT CCA 674

Leu Val Glu Trp Val Arg Tyr Asp Ala Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Pro

205 210 215

TCA GGG ATC GGG TTA ACA GAT TAC CGG GAC CCG TCA ACA GTT TGG ACG 722

Ser Gly Ile Gly Leu Thr Asp Tyr Arg Asp Pro Ser Thr Val Trp Thr

220 225 230

GGT CCC GAT GGA AAA CAT CGG ATG ATC ATA GGG ACT AAA CGA AAT ACT 770

Gly Pro Asp Gly Lys His Arg Met Ile Ile Gly Thr Lys Arg Asn Thr

235 240 245 250

ACA GGA CTC GTA CTT GTA TAC CAT ACC ACC GAT TTC ACA AAC TAC GTA 818

Thr Gly Leu Val Leu Val Tyr His Thr Thr Asp Phe Thr Asn Tyr Val

255 260 265

ATG TTG GAC GAG CCG TTG CAC TCG GTC CCC AAC ACT GAT ATG TGG GAA 866

Met Leu Asp Glu Pro Leu His Ser Val Pro Asn Thr Asp Met Trp Glu

270 275 280

TGT GTC GAC CTT TAC CCT GTG TCA ACG ACC AAC GAT AGT GCA CTT GAT 914

Cys Val Asp Leu Tyr Pro Val Ser Thr Thr Asn Asp Ser Ala Leu Asp

285 290 295

GTT GCG GCC TAT GGT CCG GGT ATC AAG CAT GTG CTT AAA GAA AGT TGG 962

Val Ala Ala Tyr Gly Pro Gly Ile Lys His Val Leu Lys Glu Ser Trp

300 305 310

GAG GGA CAC GCG ATG GAC TTT TAC TCG ATC GGG ACA TAC GAT GCA TTT 1010

Glu Gly His Ala Met Asp Phe Tyr Ser Ile Gly Thr Tyr Asp Ala Phe

315 320 325 330

AAC GAT AAG TGG ACA CCC GAT AAT CCC GAA CTA GAC GTC GGT ATC GGG 1058

Asn Asp Lys Trp Thr Pro Asp Asn Pro Glu Leu Asp Val Gly Ile Gly

335 340 345

TTG CGG TGC GAT TAC GGA AGG TTC TTT GCG TCG AAG AGC CTC TAC GAC 1106

Leu Arg Cys Asp Tyr Gly Arg Phe Phe Ala Ser Lys Ser Leu Tyr Asp

350 355 360

CCG TTG AAG AAA CGA AGA GTC ACT TGG GGT TAT GTT GCG GAA TCC GAC 1154

Pro Leu Lys Lys Arg Arg Val Thr Trp Gly Tyr Val Ala Glu Ser Asp

365 370 375

AGT TAC GAC CAA GAC GTC TCT AGA GGA TGG GCT ACT ATT TAT AAT GTT 1202

Ser Tyr Asp Gln Asp Val Ser Arg Gly Trp Ala Thr Ile Tyr Asn Val

380 385 390

GCA AGG ACC ATT GTA CTC GAT CGG AAG ACT GGA ACC CAT CTA CTT CAA 1250

Ala Arg Thr Ile Val Leu Asp Arg Lys Thr Gly Thr His Leu Leu Gln

395 400 405 410

TGG CCG GTG GAG GAA ATC GAG AGC TTG AGA TCC AAC GGT CAT GAA TTC 1298

Trp Pro Val Glu Glu Ile Glu Ser Leu Arg Ser Asn Gly His Glu Phe

415 420 425

AAA AAT ATA ACA CTT GAG CCG GGC TCG ATC ATT CCC CTC GAC GTA GGC 1346

Lys Asn Ile Thr Leu Glu Pro Gly Ser Ile Ile Pro Leu Asp Val Gly

430 435 440

TCA GCT ACG CAG TTG GAC ATC GTT GCA ACA TTT GAG GTG GAT CAA GAG 1394

Ser Ala Thr Gln Leu Asp Ile Val Ala Thr Phe Glu Val Asp Gln Glu

445 450 455

GCG TTA AAA GCA ACA AGT GAC ACG AAC GAC GAA TAC GGT TGC ACC ACA 1442

Ala Leu Lys Ala Thr Ser Asp Thr Asn Asp Glu Tyr Gly Cys Thr Thr

460 465 470

AGT TCG GGT GCA GCC AAA GGG GAA GTT TTG GAC CAT TCG GGG ATT GCA 1490

Ser Ser Gly Ala Ala Lys Gly Glu Val Leu Asp His Ser Gly Ile Ala

475 480 485 490

GTT CTT GCC CAC GGA ACC CTT TCG GAG TTA ACT CCG GTG TAT TTC TAC 1538

Val Leu Ala His Gly Thr Leu Ser Glu Leu Thr Pro Val Tyr Phe Tyr

495 500 505

ATT GCT AAA AAC ACC AAG GGA GGT GTG GAT ACA CAT TTT TGT ACG GAT 1586

Ile Ala Lys Asn Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr His Phe Cys Thr Asp

510 515 520

AAA CTA AGG TCA TCA TAT GAT TAT GAT GGT GAG AAG GTG GTG TAT GGC 1634

Lys Leu Arg Ser Ser Tyr Asp Tyr Asp Gly Glu Lys Val Val Tyr Gly

525 530 535

AGC ACC GTC CCA GTG CTC GAC GGC GAA GAA TTC ACA ATG AGG ATA TTG 1682

Ser Thr Val Pro Val Leu Asp Gly Glu Glu Phe Thr Met Arg Ile Leu

540 545 550

GTG GAT CAT TCG GTG GTG GAG GGG TTT GCA CAA GGG GGA AGG ACA GTA 1730

Val Asp His Ser Val Val Glu Gly Phe Ala Gln Gly Gly Arg Thr Val

555 560 565 570

ATA ACG TCA AGA GTG TAT CCC ACG AAA GCA ATA TAC GAA GCA GCC AAG 1778

Ile Thr Ser Arg Val Tyr Pro Thr Lys Ala Ile Tyr Glu Ala Ala Lys

575 580 585

CTT TTC GTC TTC AAC AAT GCC ACT ACG ACC AGT GTG AAG GCG ACT CTC 1826

Leu Phe Val Phe Asn Asn Ala Thr Thr Thr Ser Val Lys Ala Thr Leu

590 595 600

AAG GTC TGG CAA ATG TCT CAA GCC TTT GTC AAG GCT TAT CCG TTT T 1872

Lys Val Trp Gln Met Ser Gln Ala Phe Val Lys Ala Tyr Pro Phe

605 610 615

AGTTTTTTAT GCATCTTTTT AAGACATTGT TGTTTCATAT GATTCAAGTT TTATCTGTGT 1932

GTTATGTTAA GACACGCAGC TTAAAATAGC CACATGTGAG ATCATTTGCG TATGGCCGTC 1992

AACTATTTTT TAATATGCAA CTTCAGTAAT GCTATTTACA GTATGTTTTA AGGAAAAAAA 2052

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A 2073

(2)SEQ ID NO：2的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：617个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

Met Arg Thr Thr Glu Pro Gln Thr Asp Leu Glu His Ala Pro Asn His

1 5 10 15

Thr Pro Leu Leu Asp His Pro Glu Pro Pro Pro Ala Ala Val Arg Asn

20 25 30

Arg Leu Leu Ile Arg Val Ser Ser Ser Ile Thr Leu Val Ser Leu Phe

35 40 45

Phe Val Ser Ala Phe Leu Leu Ile Leu Leu Tyr Gln His Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Thr Asp Asp Asn Ser Ala Pro Ser Glu Ser Ser Ser Gln Gln Pro

65 70 75 80

Ser Ala Ala Asp Arg Leu Arg Trp Glu Arg Thr Ala Phe His Phe Gln

85 90 95

pro Ala Lys Asn Phe Ile Tyr Asp Pro Asn Gly Pro Leu Phe His Met

100 105 110

Gly Trp Tyr His Leu Phe Tyr Gln Tyr Asn Pro Tyr Ala Pro Phe Trp

115 120 125

Gly Asn Met Thr Trp Gly His Ala Val Ser Lys Asp Met Ile Asn Trp

130 135 140

Phe Glu Leu Pro Ile Ala Leu Ala Pro Thr Glu Trp Tyr Asp Ile Glu

145 150 155 160

Gly Val Leu Ser Gly Ser Thr Thr Ile Leu Pro Asp Gly Arg Ile Phe

165 170 175

Ala Leu Tyr Thr Gly Asn Thr Asn Asp Leu Glu Gln Leu Gln Cys Lys

180 185 190

Ala Val Pro Val Asn Ala Ser Asp Pro Leu Leu Val Glu Trp Val Arg

195 200 205

Tyr Asp Ala Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Pro Ser Gly Ile Gly Leu Thr

210 215 220

Asp Tyr Arg Asp Pro Ser Thr Val Trp Thr Gly Pro Asp Gly Lys His

225 230 235 240

Arg Met Ile Ile Gly Thr Lys Arg Asn Thr Thr Gly Leu Val Leu Val

245 250 255

Tyr His Thr Thr Asp phe Thr Asn Tyr Val Met Leu Asp Glu Pro Leu

260 265 270

His Ser Val Pro Asn Thr Asp Met Trp Glu Cys Val Asp Leu Tyr Pro

275 280 285

Val Ser Thr Thr Asn Asp Ser Ala Leu Asp Val Ala Ala Tyr Gly Pro

290 295 300

Gly Ile Lys His Val Leu Lys Glu Ser Trp Glu Gly His Ala Met Asp

305 310 315 320

Phe Tyr Ser Ile Gly Thr Tyr Asp Ala Phe Asn Asp Lys Trp Thr Pro

325 330 335

Asp Asn Pro Glu Leu Asp Val Gly Ile Gly Leu Arg Cys Asp Tyr Gly

340 345 350

Arg Phe Phe Ala Ser Lys Ser Leu Tyr Asp Pro Leu Lys Lys Arg Arg

355 360 365

Val Thr Trp Gly Tyr Val Ala Glu Ser Asp Ser Tyr Asp Gln Asp Val

370 375 380

Ser Arg Gly Trp Ala Thr Ile Tyr Asn Val Ala Arg Thr Ile Val Leu

385 390 395 400

Asp Arg Lys Thr Gly Thr His Leu Leu Gln Trp Pro Val Glu Glu Ile

405 410 415

Glu Ser Leu Arg Ser Asn Gly His Glu Phe Lys Asn Ile Thr Leu Glu

420 425 430

Pro Gly Ser Ile Ile Pro Leu Asp Val Gly Ser Ala Thr Gln Leu Asp

435 440 445

Ile Val Ala Thr Phe Glu Val Asp Gln Glu Ala Leu Lys Ala Thr Ser

450 455 460

Asp Thr Asn Asp Glu Tyr Gly Cys Thr Thr Ser Ser Gly Ala Ala Lys

465 470 475 480

Gly Glu Val Leu Asp His Ser Gly Ile Ala Val Leu Ala His Gly Thr

485 490 495

Leu Ser Glu Leu Thr Pro Val Tyr Phe Tyr Ile Ala Lys Asn Thr Lys

500 505 510

Gly Gly Val Asp Thr His Phe Cys Thr Asp Lys Leu Arg Ser Ser Tyr

515 520 525

Asp Tyr Asp Gly Glu Lys Val Val Tyr Gly Ser Thr Val Pro Val Leu

530 535 540

Asp Gly Glu Glu Phe Thr Met Arg Ile Leu Val Asp His Ser Val Val

545 550 555 560

Glu Gly Phe Ala Gln Gly Gly Arg Thr Val Ile Thr Ser Arg Val Tyr

565 570 575

Pro Thr Lys Ala Ile Tyr Glu Ala Ala Lys Leu Phe Val Phe Asn Asn

580 585 590

Ala Thr Thr Thr Ser Val Lys Ala Thr Leu Lys Val Trp Gln Met Ser

595 600 605

Gln Ala Phe Val Lys Ala Tyr Pro Phe

610 615

(2)SEQ ID NO：3的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：2073个碱基对

(B)类型：核苷酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(iii)推测：是

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：211..872

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

TTACCTCATT TCCATCAACC ATG AGA ACG ACT GAA CCC CAA ACT GAC CTT 50

Met Arg Thr Thr Glu Pro Gln Thr Asp Leu

620 625

GAG CAT GCA CCC AAC CAC ACT CCA CTA CTG GAC CAC CCC GAA CCA CCA 98

Glu His Ala Pro Asn His Thr Pro Leu Leu Asp His Pro Glu Pro Pro

630 635 640

CCG GCC GCC GTG AGA AAC CGG TTG TTG ATT AGG GTT TCG TCC AGT ATC 146

Pro Ala Ala Val Arg Asn Arg Leu Leu Ile Arg Val Ser Ser Ser Ile

645 650 655

ACA TTG GTC TCT CTG TTT TTT GTT TCA GCA TTC CTA CTC ATT CTC CTG 194

Thr Leu Val Ser Leu Phe Phe Val Ser Ala Phe Leu Leu Ile Leu Leu

660 665 670 675

TAC CAA CAC GAT TCC ACT TAC ACC GAT GAT AAT TCA GCA CCG TCG GAA 242

Tyr Gln His Asp Ser Thr Tyr Thr Asp Asp Asn Ser Ala Pro Ser Glu

680 685 690

AGT TCT TCC CAG CAG CCC TCC GCT GCC GAT CGC CTG AGA TGG GAG AGA 290

Ser Ser Ser Gln Gln Pro Ser Ala Ala Asp Arg Leu Arg Trp Glu Arg

695 700 705

ACA GCT TTT CAT TTC CAG CCC GCC AAA AAT TTC ATT TAT GAT CCC AAC 338

Thr Ala Phe His Phe Gln Pro Ala Lys Asn Phe Ile Tyr Asp Pro Asn

710 715 720

GGT CCA TTG TTC CAT ATG GGT TGG TAC CAT CTT TTC TAC CAA TAC AAC 386

Gly Pro Leu Phe His Met Gly Trp Tyr His Leu Phe Tyr Gln Tyr Asn

725 730 735

CCG TAC GCT CCC TTT TGG GGA AAC ATG ACT TGG GGA CAT GCC GTC AGT 434

Pro Tyr Ala Pro Phe Trp Gly Asn Met Thr Trp Gly His Ala Val Ser

740 745 750 755

AAG GAT ATG ATA AAT TGG TTT GAA TTA CCG ATA GCC TTA GCG CCA ACT 482

Lys Asp Met Ile Asn Trp Phe Glu Leu Pro Ile Ala Leu Ala Pro Thr

760 765 770

GAG TGG TAC GAC ATA GAA GGT GTT CTG AGT GGC AGT ACT ACC ATT TTA 530

Glu Trp Tyr Asp Ile Glu Gly Val Leu Ser Gly Ser Thr Thr Ile Leu

775 780 785

CCT GAC GGA AGA ATT TTC GCT CTC TAC ACC GGA AAT ACA AAC GAC CTC 578

Pro Asp Gly Arg Ile Phe Ala Leu Tyr Thr Gly Asn Thr Asn Asp Leu

790 795 800

GAG CAG CTC CAG TGT AAG GCC GTG CCA GTT AAT GCT AGT GAT CCA TTA 626

Glu Gln Leu Gln Cys Lys Ala Val Pro Val Asn Ala Ser Asp Pro Leu

805 810 815

TTG GTA GAA TGG GTT CGC TAC GAT GCC AAT CCG ATA TTA TAT GCC CCT 674

Leu Val Glu Trp Val Arg Tyr Asp Ala Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Pro

820 825 830 835

AGT GGC ATC GGC CTC ACA GAT TAC AGA GAT CCT AGT ACT GTG TGG ACG 722

Ser Gly Ile Gly Leu Thr Asp Tyr Arg Asp Pro Ser Thr Val Trp Thr

840 845 850

GGC CCT GAC GGT AAA CAC CGT ATG ATA ATC GGG ACG AAG AGG AAT ACG 770

Gly Pro Asp Gly Lys His Arg Met Ile Ile Gly Thr Lys Arg Asn Thr

855 860 865

ACT GGA CTC GTC TTA GTA TAT CAC ACT ACC GAC TTT ACA AAT TAT GTA 818

Thr Gly Leu Val Leu Val Tyr His Thr Thr Asp Phe Thr Asn Tyr Val

870 875 880

ATG TTG GAC GAG CCG TTG CAC TCG GTC CCC AAC ACT GAT ATG TGG GAA 866

Met Leu Asp Glu Pro Leu His Ser Val Pro Asn Thr Asp Met Trp Glu

885 890 895

TGT GTC GAC CTT TAC CCT GTG TCA ACG ACC AAC GAT AGT GCA CTT GAT 914

Cys Val Asp Leu Tyr Pro Val Ser Thr Thr Asn Asp Ser Ala Leu Asp

900 905 910 915

GTT GCG GCC TAT GGT CCG GGT ATC AAG CAT GTG CTT AAA GAA AGT TGG 962

Val Ala Ala Tyr Gly Pro Gly Ile Lys His Val Leu Lys Glu Ser Trp

920 925 930

GAG GGA CAC GCG ATG GAC TTT TAC TCG ATC GGG ACA TAC GAT GCA TTT 1010

Glu Gly His Ala Met Asp Phe Tyr Ser Ile Gly Thr Tyr Asp Ala Phe

935 940 945

AAC GAT AAG TGG ACA CCC GAT AAT CCC GAA CTA GAC GTC GGT ATC GGG 1058

Asn Asp Lys Trp Thr Pro Asp Asn Pro Glu Leu Asp Val Gly Ile Gly

950 955 960

TTG CGG TGC GAT TAC GGA AGG TTC TTT GCG TCG AAG AGC CTC TAC GAC 1106

Leu Arg Cys Asp Tyr Gly Arg Phe Phe Ala Ser Lys Ser Leu Tyr Asp

965 970 975

CCG TTG AAG AAA CGA AGA GTC ACT TGG GGT TAT GTT GCG GAA TCC GAC 1154

Pro Leu Lys Lys Arg Arg Val Thr Trp Gly Tyr Val Ala Glu Ser Asp

980 985 990 995

AGT TAC GAC CAA GAC GTC TCT AGA GGA TGG GCT ACT ATT TAT AAT GTT 1202

Ser Tyr Asp Gln Asp Val Ser Arg Gly Trp Ala Thr Ile Tyr Asn Val

1000 1005 1010

GCA AGG ACC ATT GTA CTC GAT CGG AAG ACT GGA ACC CAT CTA CTT CAA 1250

Ala Arg Thr Ile Val Leu Asp Arg Lys Thr Gly Thr His Leu Leu Gln

1015 1020 1025

TGG CCG GTG GAG GAA ATC GAG AGC TTG AGA TCC AAC GGT CAT GAA TTC 1298

Trp Pro Val Glu Glu Ile Glu Ser Leu Arg Ser Asn Gly His Glu Phe

1030 1035 1040

AAA AAT ATA ACA CTT GAG CCG GGC TCG ATC ATT CCC CTC GAC GTA GGC 1346

Lys Asn Ile Thr Leu Glu Pro Gly Ser Ile Ile Pro Leu Asp Val Gly

1045 1050 1055

TCA GCT ACG CAG TTG GAC ATC GTT GCA ACA TTT GAG GTG GAT CAA GAG 1394

Ser Ala Thr Gln Leu Asp Ile Val Ala Thr Phe Glu Val Asp Gln Glu

1060 1065 1070 1075

GCG TTA AAA GCA ACA AGT GAC ACG AAC GAC GAA TAC GGT TGC ACC ACA 1442

Ala Leu Lys Ala Thr Ser Asp Thr Asn Asp Glu Tyr Gly Cys Thr Thr

1080 1085 1090

AGT TCG GGT GCA GCC AAA GGG GAA GTT TTG GAC CAT TCG GGG ATT GCA 1490

Ser Ser Gly Ala Ala Lys Gly Glu Val Leu Asp His Ser Gly Ile Ala

1095 1100 1105

GTT CTT GCC CAC GGA ACC CTT TCG GAG TTA ACT CCG GTG TAT TTC TAC 1538

Val Leu Ala His Gly Thr Leu Ser Glu Leu Thr Pro Val Tyr Phe Tyr

1110 1115 1120

ATT GCT AAA AAC ACC AAG GGA GGT GTG GAT ACA CAT TTT TGT ACG GAT 1585

Ile Ala Lys Asn Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr His Phe Cys Thr Asp

1125 1130 1135

AAA CTA AGG TCA TCA TAT GAT TAT GAT GGT GAG AAG GTG GTG TAT GGC 1634

Lys Leu Arg Ser Ser Tyr Asp Tyr Asp Gly Glu Lys Val Val Tyr Gly

1140 1145 1150 1155

AGC ACC GTC CCA GTG CTC GAC GGC GAA GAA TTC ACA ATG AGG ATA TTG 1682

Ser Thr Val Pro Val Leu Asp Gly Glu Glu Phe Thr Met Arg Ile Leu

1160 1165 1170

GTG GAT CAT TCG GTG GTG GAG GGG TTT GCA CAA GGG GGA AGG ACA GTA 1730

Val Asp His Ser Val Val Glu Gly Phe Ala Gln Gly Gly Arg Thr Val

1175 1180 1185

ATA ACG TCA AGA GTG TAT CCC ACG AAA GCA ATA TAC GAA GCA GCC AAG 1778

Ile Thr Ser Arg Val Tyr Pro Thr Lys Ala Ile Tyr Glu Ala Ala Lys

1190 1195 1200

CTT TTC GTC TTC AAC AAT GCC ACT ACG ACC AGT GTG AAG GCG ACT CTC 1826

Leu Phe Val Phe Asn Asn Ala Thr Thr Thr Ser Val Lys Ala Thr Leu

1205 1210 1215

AAG GTC TGG CAA ATG TCT CAA GCC TTT GTC AAG GCT TAT CCG TTT T 1872

Lys Val Trp Gln Met Ser Gln Ala Phe Val Lys Ala Tyr Pro Phe

1220 1225 1230

AGTTTTTTAT GCATCTTTTT AAGACATTGT TGTTTCATAT GATTCAAGTT TTATCTGTGT 1932

GTTATGTTAA GACACGCAGC TTAAAATAGC CACATGTGAG ATCATTTGCG TATGGCCGTC 1992

AACTATTTTT TAATATGCAA CTTCAGTAAT GCTATTTACA GTATGTTTTA AGGAAAAAAA 2052

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A 2073

(2)SEQ ID NO：4的资料：

(i)序列特征：

(A)长度：617个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

Met Arg Thr Thr Glu Pro Gln Thr Asp Leu Glu His Ala Pro Asn His

1 5 10 15

Thr Pro Leu Leu Asp His Pro Glu Pro Pro Pro Ala Ala Val Arg Asn

20 25 30

Arg Leu Leu Ile Arg Val Ser Ser Ser Ile Thr Leu Val Ser Leu Phe

35 40 45

Phe Val Ser Ala Phe Leu Leu Ile Leu Leu Tyr Gln His Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Thr Asp Asp Asn Ser Ala Pro Ser Glu Ser Ser Ser Gln Gln Pro

65 70 75 80

Ser Ala Ala Asp Arg Leu Arg Trp Glu Arg Thr Ala phe His Phe Gln

85 90 95

Pro Ala Lys Asn Phe Ile Tyr Asp Pro Asn Gly Pro Leu Phe His Met

100 105 110

Gly Trp Tyr His Leu Phe Tyr Gln Tyr Asn Pro Tyr Ala Pro Phe Trp

115 120 125

Gly Asn Met Thr Trp Gly His Ala Val Ser Lys Asp Met Ile Asn Trp

130 135 140

Phe Glu Leu Pro Ile Ala Leu Ala Pro Thr Glu Trp Tyr Asp Ile Glu

145 150 155 160

Gly Val Leu Ser Gly Ser Thr Thr Ile Leu Pro Asp Gly Arg Ile Phe

165 170 175

Ala Leu Tyr Thr Gly Asn Thr Asn Asp Leu Glu Gln Leu Gln Cys Lys

180 185 190

Ala Val Pro Val Asn Ala Ser Asp Pro Leu Leu Val Glu Trp Val Arg

195 200 205

Tyr Asp Ala Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Pro Ser Gly Ile Gly Leu Thr

210 215 220

Asp Tyr Arg Asp Pro Ser Thr Val Trp Thr Gly Pro Asp Gly Lys His

225 230 235 240

Arg Met Ile Ile Gly Thr Lys Arg Asn Thr Thr Gly Leu Val Leu Val

245 250 255

Tyr His Thr Thr Asp Phe Thr Asn Tyr Val Met Leu Asp Glu Pro Leu

260 265 270

His Ser Val Pro Asn Thr Asp Met Trp Glu Cys Val Asp Leu Tyr Pro

275 280 285

Val Ser Thr Thr Asn Asp Ser Ala Leu Asp Val Ala Ala Tyr Gly Pro

290 295 300

Gly Ile Lys His Val Leu Lys Glu Ser Trp Glu Gly His Ala Met Asp

305 310 315 320

Phe Tyr Ser Ile Gly Thr Tyr Asp Ala Phe Asn Asp Lys Trp Thr Pro

325 330 335

Asp Asn Pro Glu Leu Asp Val Gly Ile Gly Leu Arg Cys Asp Tyr Gly

340 345 350

Arg Phe Phe Ala Ser Lys Ser Leu Tyr Asp Pro Leu Lys Lys Arg Arg

355 360 365

Val Thr Trp Gly Tyr Val Ala Glu Ser Asp Ser Tyr Asp Gln Asp Val

370 375 380

Ser Arg Gly Trp Ala Thr Ile Tyr Asn Val Ala Arg Thr Ile Val Leu

385 390 395 400

Asp Arg Lys Thr Gly Thr His Leu Leu Gln Trp Pro Val Glu Glu Ile

405 410 415

Glu Ser Leu Arg Ser Asn Gly His Glu Phe Lys Asn Ile Thr Leu Glu

420 425 430

Pro Gly Ser Ile Ile Pro Leu Asp Val Gly ser Ala Thr Gln Leu Asp

435 440 445

Ile Val Ala Thr Phe Glu Val Asp Gln Glu Ala Leu Lys Ala Thr Ser

450 455 460

Asp Thr Asn Asp Glu Tyr Gly Cys Thr Thr Ser Ser Gly Ala Ala Lys

465 470 475 480

Gly Glu Val Leu Asp His Ser Gly Ile Ala Val Leu Ala His Gly Thr

485 490 495

Leu Ser Glu Leu Thr Pro Val Tyr Phe Tyr Ile Ala Lys Asn Thr Lys

500 505 510

Gly Gly Val Asp Thr His Phe Cys Thr Asp Lys Leu Arg Ser Ser Tyr

515 520 525

Asp Tyr Asp Gly Glu Lys Val Val Tyr Gly Ser Thr Val Pro Val Leu

530 535 540

Asp Gly Glu Glu Phe Thr Met Arg Ile Leu Val Asp His Ser Val Val

545 550 555 560

Glu Gly Phe Ala Gln Gly Gly Arg Thr Val Ile Thr Ser Arg Val Tyr

565 570 575

Pro Thr Lys Ala Ile Tyr Glu Ala Ala Lys Leu Phe Val Phe Asn Asn

580 585 590

Ala Thr Thr Thr Ser Val Lys Ala Thr Leu Lys Val Trp Gln Met Ser

595 600 605

Gln Ala Phe Val Lys Ala Tyr Pro Phe

610 615

Claims

1.编码具有果糖基转移酶FFT的酶活性的蛋白质的核酸分子，所述酶导致合成高分子果聚糖聚合物，所述果聚糖聚合物的分子平均含有20个以上果糖残基，该核酸分子选自由下述组成的组中：

(b)包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示核苷酸序列或者相应的核糖核苷酸序列的核酸分子；和

(c)与(a)或(b)所指核酸分子的互补链在如下严格条件下可发生杂交的核酸分子：在50％甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt′s溶液、40mM磷酸钠pH6.8、0.5w/v％BSA、1w/v％SDS和0.1mg/ml鲱精DNA中于42℃杂交，在0.5×SSC/0.5％SDS中于60℃洗涤。

2.权利要求1的核酸分子，它是一个DNA分子。

3.权利要求1的核酸分子，它是一个cDNA分子。

4.权利要求1的核酸分子，它是一个RNA分子。

5.权利要求1到4任何一项的核酸分子，它来源于洋蓟。

6.含有权利要求1到5任何一项的核酸分子的载体。

7.权利要求6的载体，其中所述核酸分子与保证在原核或真核细胞中进行转录以及合成可翻译的RNA的调控元件可操纵地连接在一起。

8.权利要求7的载体，其中所述调控元件来源于马铃薯糖蛋白B33启动子或CaMV 35S启动子。

9.一种宿主细胞，它是用权利要求1到5任何一项所述核酸分子或者用权利要求6到8任何一项所述载体转化的细胞或者是由这样的细胞衍生并瞬时或稳定地包含权利要求1-5任何一项所述核酸分子的细胞。

10.权利要求9的宿主细胞，它另外含有编码蔗糖依赖性蔗糖果糖基转移酶SST的基因。

11.一种制备FFT的方法，其中在允许合成FFT的条件下培养权利要求9所述宿主细胞，并从培养细胞和/或培养基中分离FFT。

12.一种FFT，其由权利要求1到5任何一项的核酸分子编码。

13.一种制备权利要求9或10所述宿主细胞的方法，该方法包括将权利要求1到5任何一项所述核酸分子或者权利要求6到8任何一项所述载体导入宿主细胞。

14.一种制备转基因植物细胞、转基因植物组织或转基因植物的方法，该方法包括将权利要求1到5中任何一项所述核酸分子或者权利要求6到8中任何一项所述载体导入植物细胞、植物组织或植物。

15.一种转化了的植物细胞或非种子类植物组织，它含有权利要求1到5任何一项所述核酸分子或者权利要求6到8任何一项所述载体，或者由这样的细胞或组织衍生并瞬时或稳定地包含权利要求1-5任何一项所述核酸分子的细胞。

16.权利要求15的转化了的植物细胞或非种子类植物组织，它另外含有编码蔗糖依赖性蔗糖果糖基转移酶的基因。

17.权利要求15或16的转基因植物细胞或非种子类植物组织，它来源于含蔗糖的植物。

18.权利要求17的转基因的植物细胞或非种子类植物组织，其中所述植物是水稻、玉米、甜菜、甘蔗、马铃薯、蔬菜、牧场草、甘薯、小麦、大麦或大豆。

19.一种植物的非种子类繁殖材料，其来源于含有权利要求1到5任何一项所述核酸分子或者权利要求6到8任何一项所述载体的植物，或者来源于所述植物衍生并瞬时或稳定地包含权利要求1-5任何一项所述核酸分子的植物，并且含有权利要求15或16所述植物细胞。

20.一种制备高分子菊粉的方法，该方法包括：

(a)在允许产生FFT并能将任选是由外界提供的1-蔗果三糖或者等价底物转化为高分子菊粉的条件下，培养权利要求15-18任何一项所述转化了的植物细胞或植物组织，权利要求9或10所述的宿主细胞或者含有权利要求1到5任何一项所述核酸分子或者权利要求6到8任何一项所述载体的植物，或者来源于所述植物衍生并瞬时或稳定地包含权利要求1-5任何一项所述核酸分子的植物，并且含有权利要求15或16所述转基因植物细胞的植物；以及

(b)从所培养的细胞、组织或植物中，或者从培养基中回收这样产生的菊粉。

21.一种制备高分子菊粉的方法，该方法包括：

(a)使1-蔗果三糖或等价的底物与权利要求12所述FFT在允许转化为高分子菊粉的条件下进行接触；以及

(b)回收这样产生的菊粉。

22.一种体外制备高分子菊粉的方法，其中利用SST和权利要求12所述的FFT组成的酶联合将底物蔗糖转化为高分子菊粉。

23.高分子菊粉，其得自权利要求15或16所述转化了的植物细胞或非种子类植物组织，得自权利要求9或10所述的宿主细胞，得自含有权利要求1到5任何一项所述核酸分子或权利要求6到8任何一项所述载体的植物或者来源于所述植物衍生并瞬时或稳定地包含权利要求1-5任何一项所述核酸分子的植物，得自权利要求19所述非种子类繁殖材料，或利用权利要求20到22中任何一项所述方法得到。