CZ20001680A3

CZ20001680A3 - Molekuly nukleové kyseliny kódující enzymy, které mají fruktosyltransferázovou aktivitu, a způsoby přípravy inulinu s dlouhým řetězcem

Info

Publication number: CZ20001680A3
Application number: CZ20001680A
Authority: CZ
Inventors: Arnd G. Heyer; Elke W. Hellwege; Dominique Gritscher
Original assignee: Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V.
Priority date: 1997-11-06
Filing date: 1998-11-06
Publication date: 2000-10-11
Also published as: PL194854B1; US20040014092A1; US6559356B1; HU226813B1; DE69840704D1; BRPI9816319B1; WO1999024593A1; PL340364A1; DK1029067T3; HUP0100111A3; DE19749122A1; AU753390B2; ES2324188T3; CN1280624A; JP4287046B2; US7083963B2; CZ299825B6; ZA9810110B; AU1667499A; AR017767A1

Description

Molekuly nukleové kyseliny kódující enzymy, které mají fruktosyltransferázovou aktivitu, a způsoby přípravy inulinu s dlouhým řetězcem

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká molekul nukleové kyseliny kódujících proteiny, které mají enzymatickou fruktosyltransferázovou (FFT) aktivitu. Dále se tento vynález týká vektorů obsahujících takové molekuly nukleové kyseliny, jakož i hostitelských buněk transformovaných popsanými molekulami nukleové kyseliny, zejména rostlinných buněk, rostlinných pletiv a rostlin. Kromě toho jsou ve vynálezu popsány způsoby produkce transgenních rostlin, které syntetizují inulin s dlouhým řetězcem díky zavedení molekul DNA kódujícím FFT. Předkládaný vynález se také týká způsobů přípravy FFT a produkce inulinu s dlouhým řetězcem v různých hostitelských organismech, zejména rostlinách, a také způsobů in vitro produkce inulinu s dlouhým řetězcem pomocí FFT podle vynálezu. Předkládaný vynález se dále týká hostitelských buněk a také inulinu, který lze připravit způsobem podle vynálezu.

Dosavadní stav techniky

Lineární, ve vodě rozpustné polymery mají velmi široké spektrum aplikací, například jich lze užít ke zvýšení viskozity vodných systémů, jako detergentů, jako suspendačních činidel nebo pro urychlení sedimentačního procesu a pro komplexování, ale také pro vázání vody. Polymery na bázi sacharidů, například fruktosylové polysacharidy, jsou obzvláště zajímavé materiály, protože jsou biologicky odbouratelné (biodegradovatelné).

Kromě jejich využití jako obnovitelné suroviny pro průmyslovou produkci a zpracování, jsou fruktosylové polymery také zajímavé jako potravinová aditiva, například jako umělá sladidla. Pro různé aplikace jsou potřeba polymery s různou délkou řetězce. Zatímco polymery s krátkým nebo středně dlouhým řetězcem jsou výhodné v potravinářském průmyslu, polymery s vysokým stupněm polymerizace (DP) jsou užitečné pro technické účely, jako je např. výroba surfaktantů.

Doposud byly popsány pouze způsoby produkce fruktanových polysacharidů s dlouhým řetězcem v rostlinách pomocí exprese enzymu fruktosyltransferáz bakteriálního původů. Většina bakteriálních fruktosyltransferáz syntetizuje levan, fruktosylový polymer vázaný β-2,6 vazbou, který má četné β-2,1 větvení. Toto větvení představuje z technického hlediska značnou nevýhodu a proto je levan jakožto technický materiál podstatně méně významný než inulin.

Dosud je znám pouze jeden bakteriální gen, jehož produkt se účastní syntézy inulinu, a sice gen ftf ze Streptococcus mutans. V principu je možné exprimovat gen v rostlinách, pokud by byl získán a upraven metodami genového inženýrství. Avšak výtěžek inulinu z transgenních rostlin je tak nízký, že ekonomicky výhodné využití takových transgenních rostlin nepřipadá v úvahu.

Dále je také znám způsob přípravy transgenních rostlin exprimujících fruktosyltransferázy z Helianthus tuberosus. Exprese těchto genů v transgenních rostlinách vede k tvorbě inulinu s průměrným stupněm polymerizace DP = 6 až DP = 10. Polymery s tímto stupněm polymerizace nelze považovat za inulin s dlouhým řetězcem. Inulin s průměrným stupněm polymerizace DP = 6 až DP - 10 však není vhodný pro většinu technických aplikací.

Způsoby produkce inulinu s dlouhým řetězcem v rostlinách nebo způsoby přípravy vhodných enzymů pro syntézu inulinu nejsou dosud známy.

Patentová přihláška PCT/US89/02729 popisuje možnost tvořit cukerné polymery, zejména dextran nebo polyfruktózu, v transgenních rostlinách, obzvláště v plodech transgennich rostlin. Pro přípravu takových modifikovaných rostlin se navrhovalo použití levansacharózy z mikroorganismů, konkrétně z Aerobacter levanicum, Streptococcus salivarius a Bacillus subtilis, nebo dextransacharózy z Leuconostoc mesenteroides. Avšak ani produkce aktivních enzymů, ani levanu či dextranu a ani příprava transgenních rostlin nebyly popsány. Patentová přihláška PCT/EP93/02110 popisuje způsob produkce transgenních rostlin exprimujících gen lsc levansacharázy z gram-negativní bakterie Erwinia amylovora. V patentové přihlášce PCT/NL93/00279 je popsána transformace rostlin majících chimérické geny, které obsahují gen sacB z Bacillus subtilis nebo gen ftf ze Streptococcus mutans. Transgenní rostliny exprimující gen SacB tvoří rozvětvený levan. Transgenní rostliny exprimující gen ftf syntetizují vysokomolekulární inulin, avšak výnos je tak nízký, že ekonomické využití nepřichází v úvahu.

Patentová přihláška PCT/NL96/00012 popisuje sekvence DNA kódující enzymy syntetizující cukerné polymery a produkci transgenních rostlin s pomocí těchto sekvencí DNA. Popisované sekvence pocházejí z Helianthus tuberosus. Podle dokumentu PCT/NL96/00012 jsou popsané sekvence vhodné nejenom k modifikaci fruktanového profilu například petúnie a brambory, ale také samotné Helianthus tuberosus. Když se v transgenní rostlině exprimuje gen SST a FFT, může se tvořit inulin. průměrný stupeň polymerizace inulinu je však v rozmezí PD = 6 až PD = 10. produkce vysokomolekulárního inulinu není možná způsoby, které byly popsány v PCT/NL96/00012. Přihláška

PCT/EP97/02195 popisuje způsob přípravy transgenních rostlin tvořících inulin pomocí genu f tf ze Streptococcus mutans. Výtěžek vysokomolekulárního inulinu je však nízký, jak tomu bylo i u rostlin popsaných v přihlášce PCT/NL93/00279. Přihláška DE 197 08 744.4 popisuje produkci inulinu s krátkými řetězcem pomocí enzymu, který vykazuje fruktosylpolymerázovou aktivitu. Inulin s krátkým řetězcem lze připravit v transgenních rostlinách. Výtěžek inulinu s krátkým řetězcem je velký a u brambor odpovídá buněčnému obsahu sacharózy. Produkce inulinu s dlouhým řetězcem však nebyla popsána.

Syntéza inulinu u rostlin byla důkladně zkoumána (Pollock a Chatteron, Fructans, The biochemistry of Plants, Vol. 14, 1988, Academie Press, str. 109-140. Avšak přirozeně se v rostlinách vyskytující inulin je inulin s krátkým řetězcem s maximálním stupněm polymerizace přibližně DP = 35 (viz Pollock a Chatteron, výše). Syntéza a metabolismus fruktanú v rostlinách vyžadují aktivitu alespoň třech enzymů: sacharózofruktosyltransferázy závislé na sacharóze (SST), která tvoří trisacharidovou kestózu, fruktanfruktosyltrnasferázy závislé na fruktanu (FFT), která přenáší fruktosylový zbytek z fruktanových molekul s nejmenším stupněm polymerizace DP = 3 (kestóza) na sacharózu a vyšší řruktany, a fruktanexohydrolázy (FEH), která odstraňuje fruktózové zbytky z fruktanových molekul. Není známo, zda rozdíly v průměrné molekulové hmotnosti inulinu z různých rostlinných druhu, např. 2 x 10^J v případě Allium cepa a 5 x 10' v případě Helium tuberosum, vycházejí z rozdílných vlastností jejich SST, FFT a FEH.

Z tohoto důvodu není možné vzhledem k současným znalostem týkajících se syntézy inulinu u rostlin identifikovat vhodné DNA. sekvence, jejichž pomocí by mohl být syntetizován vysokomolekulární inulin v rostlinách v ekonomicky zajímavých množstvích.

Proto je cílem předkládaného vynálezu poskytnout molekulu nukleové kyseliny a způsoby, které umožní připravit geneticky modifikované organismy, zejména rostliny, schopné tvořit inulin s dlouhým řetězcem.

Výše zmíněný problém je řešen předkládaným vynálezem, který je popsán pomocí následujících příkladů provedení a definován patentovými nároky.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká molekul nukleové kyseliny kódujících proteiny, které mají enzymatickou aktivitu FFT a jsou vybrány ze skupiny obsahující

a) molekuly nukleové kyseliny kódující protein, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence identifikačního čísla (i. č.) 2 a v sekvenci i. č. 4,

b) molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence i. č. 1 nebo i. č. 3 nebo odpovídající ribonukleotidovou sekvenci,

c) molekuly nukleové kyseliny hybridi zující za stringentních podmínek s komplemetárním řetězcem molekul nukleové kyseliny uvedených v a) nebo b) , a

d) molekuly nukleové kyseliny obsahující fragment nukleotidové sekvence uvedené v a) , b) nebo c) .

Ve smyslu předkládaného vynálezu se rozumí, že enzym mající fruktosyltransferázovou aktivitu (FFT) je protein, který je schopný katalyzovat vznik β-2,1-glykosidické a/nebo β-2,6-glykosidické vazby mezi fruktózovými jednotkami. Fruktosylový zbytek, který má být přenesen, může pocházet z 1-kestózy nebo fruktanového polymeru.

Vysokomolekulárním fruktosylovým polymerem se ve smyslu předkládaného vynálezu rozumí molekula obsahující v průměru více než dvacet, výhodně více než 25 a ještě výhodněji nejméně fruktosylových zbytků. Navíc se ve smyslu předkládaného vynálezu vysokomolekulárním fruktosylovým polymerem rozumí molekula obsahující v průměru méně než 3000, výhodněji méně než 300 a zvláště výhodně méně než 100 fruktosylových zbytků. Fruktosylové zbytky jsou spojeny buď β-2,1- nebo β-2,6glykosidickou vazbou. V případě inulinu jsou zbytky obecně navázány β-2,1-glykosidickými vazbami. V malé míře se vyskytují také β-2, 6-glykosidické vazby, v méně než 5 %, výhodně méně než ve 3 %, výhodněji méně než v 1,5 i a nej výhodněji méně než v 0,5 i. Fruktosylový polymer může nést na svém konci glukózový zbytek, který je spojen prostřednictvím OH skupiny na atomu C-l glukózy a OH skupiny atomu C-2 fruktosylového zbytku. V takovém případě fruktosylový polymer obsahuje také molekulu sacharózy.

Překvapivě bylo zjištěno, že během exprese molekul nukleové kyseliny podle vynálezu v transgenních rostlinách se tvořila velká množství inulinu. Inulin tvořený v rostlinách měl průměrný stupeň polymerizace zřetelně vyšší než DP = 20. To bylo neočekávané, neboť podobný enzym z Helianthus tuberosus se podílí na syntéze inulinu s průměrným stupněm polymerizace nižším než DP = 20 v transgenních rostlinách (viz PCT/NL96/00012).

Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být jak DNA, tak RNA molekuly. Vhodné molekuly DNA jsou například molekuly genomové DNA nebo cDNA. Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být izolovány z přírodních zdrojů, výhodně artyčoku, nebo mohou být syntetizovány pomocí známých metod.

Prostřednictvím obvyklých molekulárně biologických metod je možné (viz např. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) zavést do molekul nukleové kyseliny vynálezu odlišné mutace, což vede k tomu, že takto je možné syntetizovat proteiny s modifikovanými biologickými vlastnostmi. Na jedné straně je tu možnost vytvářet deleční mutanty, kdy se tvoří molekuly nukleové kyseliny postupujícími delecemi od 5'- nebo 3'-konce kódující sekvence DNA. Tyto nukleové kyseliny pak poskytují syntézu proteinů, které jsou adekvátně zkráceny. Takovými delecemi na 5'-konci nukleotidové sekvence je například možné identifikovat aminokyselinové sekvence, které jsou odpovědné za translokaci enzymu v plastidech (transitní peptidy). To umožňuje specifickou produkci enzymů, které díky odstranění příslušných sekvencí nejsou již nadále lokalizovány ve vakuolách, ale v cytosolu, nebo které jsou díky připojení dalších signálních sekvencí lokalizovány v jiných kompartmentech.

Na druhé straně další možností je zavedení bodové mutace na pozice, kde modifikace aminokyselinové sekvence ovlivňuje např. enzymovou aktivitu nebo regulaci enzymu. Tímto způsobem mohou být například tvořeny mutanty, které mají změněnou hodnotu K_m nebo které již nadále nepodléhají regulačním mechanismům, které normálně v buňce existují, jako jsou např. alosterické regulace nebo kovalentní modifikace.

Kromě toho mohou být tvořeny mutanty, které vykazují změněnou substrátovou specificitu nebo specificitu pro produkt. Mohou být také tvořeny mutanty, které vykazují změněný profil aktivita-teplota.

Pro manipulaci v prokaryotických buňkách metodami genetického inženýrství mohou být molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu nebo části těchto molekul zavedeny do plazmidů umožňujících mutagenezi nebo modifikaci sekvence rekombinací sekvence DNA. Prostřednictvím standardních metod (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) se mohou zaměňovat báze a mohou být přidávány přirozené nebo syntetické sekvence. Aby se fragmenty DNA navzájem spojily, mohou k nim být přidány speciální adaptační nebo spojovací sekvence - adaptéry nebo spojky (linkery). Mimoto se mohou provádět manipulace, které poskytují vhodná štěpná místa nebo které odstraňují přebytečnou DNA nebo nadbytečná štěpná místa. Jsou-li možné inzerce, delece nebo substituce, může se provádět in vitro mutageneze, náhrada pomocí primeru, restrikce nebo ligace. Jako metody analýzy se obvykle používají sekvenční analýza, restrikční analýza a další biochemické nebo molekulárně biologické metody.

Termín „hybridizace má ve smyslu tohoto vynálezu význam hybridizace za obvyklých hvbridizačních podmínek, výhodně za stringentních podmínek, jak je například popsáno v Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Příkladem hybridizace ve stringentních podmínkách je hybridizace v podmínkách definovaných takto: 50% formamid, 5x SSC, 5x Denhardtův roztok, 40mM fosforečnan sodný pH 6,8, 0,5% (hmot./objem) BSA, 1% (hmot./objem) SDS, 0,1 mg/ml DNA ze spermatu sleďů, a to při 42 °C. Příkladem obvyklé hybridizace v non-stringentních podmínkách je hybridizace v podmínkách definovaných stejně jako předchozí, kromě toho, že místo 50% je užit 30% formamid. Promývací podmínky jsou v případě stringentních podmínek výhodně 0,5x SSC/0,5% SDS při 60 °C a v případě non-stringentních podmínek výhodně 2x SSC/0,5% SDS při 56 °C.

Molekuly nukleové kyseliny, které hybridizují s molekulami podle vynálezu, mohou být izolovány např. z genomových nebo cDNA knihoven, které byly připraveny z odpovídajících organismů, např. z artyčoku.

Aby se identifikovaly a izolovaly takové molekuly nukleové kyseliny, mohou být použity molekuly vynálezu nebo části těchto molekul nebo reverzní komplementy těchto molekul, » · %, 95 %, 97 % a 99 % například prostřednictvím hybridizace pomocí obvyklých metod (viz např. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Jako hybridizační sonda mohou být například použity molekuly nukleové kyseliny, jejichž nukleotidová sekvence je zcela shodná nebo v podstatě podobná sekvenci uvedené zde jako sekvence i. č. 1 nebo sekvence i. č. 3, nebo části těchto sekvencí. Fragmenty použité jako hybridizační sondy mohou být syntetické fragmenty, které byly vytvořeny prostřednictvím obvyklých způsobů syntézy, a jejichž sekvence jsou v podstatě podobné sekvencím molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu.

Molekuly hybridi zující s molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu také zahrnují fragmenty, deriváty a alelické varianty molekul nukleové kyseliny popsaných výše kódujících protein podle vynálezu. Termínem „fragmenty se rozumí části molekul nukleové kyseliny, které jsou dostatečně dlouhé, aby kódovaly jeden z proteinů podle vynálezu. Termín „derivát v tomto smyslu znamená, že se sekvence těchto molekul liší od sekvencí molekul nukleové kyseliny popsaných výše v jedné nebo několika pozicích, avšak s těmito sekvencemi mají vysoký stupeň homologie. Homologie znamená sekvenční identitu alespoň 40 i, zejména alespoň v 60 š, výhodně více než 80 i a nejvýhodněji více než 90 %. Proteiny kódované takovými molekulami nukleové kyseliny mají sekvenci identickou s aminokyselinovou sekvencí uvedenou jako sekvenci i. č. 2 alespoň v 80 %, výhodně v 85 % a zejména výhodně ve více než Odchylky od výše popsaných molekul být tvořeny deleci, substitucí, nukleové kyseliny mohou inzercí nebo rekombinací.

Molekuly nukleové kyseliny, které jsou homologní s výše popsanými molekulami, a které představují deriváty těchto molekul, jsou obvykle varianty těchto molekul, které představují modifikace mající tutéž biologickou funkci. Mohou to být přirozeně se vyskytující varianty, například sekvence z jiných organismů nebo mutace, které mohou vzniknout buď přirozeně nebo které byly vneseny specifickou mutagenezí. Kromě toho mohou být tyto varianty synteticky vytvořené sekvence. Alelické varianty mohou být buď přirozeně se vyskytující varianty nebo synteticky vytvořené varianty nebo varianty vytvořené metodami rekombinantní DNA.

Proteiny kódované různými variantami molekul nukleové kyseliny podle vynálezu vykazují určité společné vlastnosti, jako je enzymová aktivita, molekulová hmotnost, imunologická reaktivita nebo konformace, či fyzikální vlastnosti, jako je elektroforetická pohyblivost, chování při chromatografii, sedimentační koeficienty, rozpustnost, spektroskopické vlastnosti, stabilita, optimum pH, teplotní optimum.

Ve výhodném provedení vynálezu nukleové kyseliny podle vynálezu byly získány z artyčoku (Cynara scolymus) .

Vynález se dále týká vektorů obsahujících molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu. Výhodně jsou to plazmidy, kosmidy, viry, bakteriofágy a další vektory obvykle používané v oboru genového inženýrství.

Ve vektoru podle vynálezu je sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu výhodně operativně spojena s regulačními prvky, což zaručuje transkripci a syntézu RNA v prokaryotických a/nebo eukaryotických buňkách, která může být translatována.

Expresní vektory podle vynálezu umožňují produkci inulinu s dlouhým řetězcem v různých hostitelských organismech, zejména v prokaryotických nebo eukaryotických buňkách jako jsou bakterie, houby, řasy, buňky živočichů a výhodně rostlinné buňky a rostliny. Výhodné hostitelské organismy jsou zvláště kvasinky jako např. S. cerevisiae, bakterie mléčného kvašení jako Streptococcus thermophilus, Lactobacilus ♦ » bulgaricus, Streptococcus lactis, S. cremoris., Lactobacillus acidophilus a Leuconostoc cremoris.

Kódované enzymy mohou být použity pro produkci inulinu s dlouhým řetězcem také mimo hostitelské organismy. Zvláště výhodné jsou rostlinné buňky.

Přehled týkající se různých expresních systémů lze najít např. v publikacích Methods in Enzymology 153, 1987, 385-516,

Bitter et	al.,	Methods	in	Enzymology 153, 1987, 516-	544,
Sawers et	al. ,	Applied	Microbiology and Biotechnology	465,
1996, 1-9,	Billman-Jacobe,	Current Opinion in Biotrechnology

7, 1996, 500-504, Hockeny, Trends in Biotechnology 12, 1994,

456-463, a Griffiths et al., Methods in Molecular Biology 75, 1997, 427-440. Expresní systémy pro kvasinky byly popsány v publikacích Hensinng et al., Antonie van Leuwenhoek 67, 1995, 261-279, Bussineu et al., Developments in Biological

Standard!zation 83, 1994, 13-198, Gellissen et al., Antonie van Leuwenhoek 62, 1992, 79-93, Fleer, Current Opinion in

Biotechnology 3, 1992, 486-496, Vedvick, Current Opinion in

Biotechnology 2, 1991, 742-745, a Buckholz, Bio/Technology 9,

1991, 1067-1072. V dosavadním stavu techniky byly expresní vektory popsány ve značném rozsahu. Kromě genu selekčního markéru a replikačního počátku, který zajišťuje replikaci ve vybraném hostiteli, obvykle expresní vektory obsahují bakteriální nebo virový promotor, a ve většině případů také terminační signál transkripce. Obvykle je alespoň jedno restrikční místo nebo polylinker (vícečetné klonovací místo) mezi promotorem a terminačním signálem, což dovoluje vložit kódující sekvenci DNA. Jestliže je aktivní ve vybraném hostitelském organismu, může se jako promotorové sekvence užít DNA přirozeně kontrolující transkripci odpovídajícího genu. Tuto sekvenci je možné zaměnit jinou promotorovou sekvencí. Je také možné užít promotor, který umožňuje konstitutivní expresi genu a nebo indukovatelný promotor, který umožňuje cílenou regulaci exprese genu ležícího po směru transkripce (downstream). Bakteriální a virové promotorové sekvence těchto vlastností jsou známy a byly ve stavu techniky popsány. Regulační sekvence pro expresi v mikroorganismech (jako je E. coli nebo S. ceřevisise) byly ve stavu techniky dostatečně popsány. Promotory, které dovolují zvláště silnou expresi downstream ležícího genu jsou např. T7 promotor (Studier et al., Methods in Enzymology 185, 1990, 60-89), lacuv5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer et al., in Rodriguez and Chemberlain, Promotors, Structutre and Function, Praeger, New York, 1982, 462-481, DeBoer et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1983, 21-25, λρΐ, rac (Boros et al., gene 42, 1986, 97-100. Obvykle je množství proteinu nejvyšší v úseku od středu ke konci logaritmické fáze růstového cyklu mikroorganismu. Z tohoto důvodu se výhodně užívají indukovatelné promotory při syntéze proteinů. To často umožňuje vyšší produkci než užití konstitutivního promotoru. Použití silného konstitutivního promotoru často vede, prostřednictvím permanentní transkripce a translace klonovaného genu, ke ztrátě energie na jiné nezbytné buněčné funkce, což pak zpomaluje růst buněk (Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak, Molekulare Biotechnologie, 1995, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, Berlin, Oxford, str. 342). Takže aby bylo dosaženo optimálního množství proteinu, často se užívá dvoufázový proces. Nejdříve se hostitelské buňky kultivují v optimálních podmínkách, dokud se nedosáhne relativně vysoké hustoty buněk. Ve druhé fázi je indukována transkripce v závislosti na tom, jaký byl použit promotor. Zvláště vhodný je v takovém případě promotor tac indukovatelný laktózou nebo IPTG (=isopropyl-p-D-thiogalaktopyranosid) (DeBoer et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80, 1983, 21-25). Terminační signály transkripce byly v dosavadním stavu techniky také^dostatečně popsány.

Transformaci hostitelské buňky odpovídající DNA, která kóduje protein, lze provést standardním postupem, jaký je např. popsán v příručce Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Kultivace hostitelských buněk se provádí v živném médiu,které odpovídá nutričním požadavkům použitých hostitelských buněk, zejména pokud jde o pH, teplotu, koncentrace solí, provzdušňování média, přítomnost antibiotik, vitaminů, stopových prvků apod.

Purifikace enzymu produkovaného hostitelskými buňkami se provádí obvyklými purifikačními technikami jako je precipitace, iontová výměnná chromatografie, afinitní chromatografie, gelová filtrace, HPLC s reverzní fází apod.

Modifikací DNA, která je exprimována v hostitelských buňkách, je možné v hostitelských buňkách exprimovat takový polypeptid, který se snáze izoluje z kultivačního média díky určitým vlastnostem, takže je např. možné exprimovat protein jako fúzní protein s další polypeptidovou sekvencí, jejíž specifické vazebné vlastnosti dovolují izolovat fúzní protein pomocí afinitní chromatografie /viz např. Hopp et al., Bio/technology 6, 1988, 1204-1210, Sassenfeld, Trend in Biotechnol. 8, 1990, 88-93.

Pro expresi v rostlinných buňkách jsou výhodné regulační prvky promotoru B33 patatinového genu. dalším výhodným promotorem je promotor 35S CaMV a promotor genu pro alkoholdehydrogenázu ze Saccharomyces cerevisiae.

Vektory podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat další funkční jednotky,které stabilizují vektor v hostitelském organismu, např. bakteriální replikační počátek nebo 2-mikronDNA pro stabilizaci v S. cerevisiae. Kromě toho mohou obsahovat levou a pravou hraniční sekvenci T-DNA z Agrobacterium, což rostlin.

umožňuje stabilní integraci do genomu

Vektory podle vynálezu mohou dále obsahovat funkční terminátory, jako je např. terminátor z genu oktopinsyntázy z Agrobacterium.

V jiném provedení je nukleová kyselina podle vynálezu spojena s molekulou nukleové kyseliny vektoru podle vynálezu, kdy nukleová kyselina kóduje funkční signální sekvence, aby bylo možné směrovat produkt do různých buněčných kompartmentů. taková modifikace může např. spočívat v tom, že se přidá N-koncová sekvence pro sekreci do apoplastu vyšších rostlin, avšak také jakákoliv další modifikace vedoucí k fúzi signálního peptidů se sekvencí kódující FFT je předmětem vynálezu. Molekula nukleové kyseliny obsažená ve vektoru podle vynálezu může aminokyselinové souvislosti je zejména obsahovat sekvence kódující sekvence způsobující sekreci. v této výhodné užití signálního peptidů ct-CGTázy z Klebsiela oxytoca M5A1 (Fiedler et al. , J. Mol. Biol. 256,

1996, 279-291 ) nebo signálního peptidů, který je kódován nukleotidy 11529 až 11618 sekvence vedené v GeneBank pod číslem X86014.

Zvláště výhodné provedení vynálezu se týká plazmidů p35-csFFT a p33-csFFT a jejich konstrukce, která je popsána v příkladech.

V dalším provedení se vynález týká hostitelských buněk, které přechodně nebo stabilně obsahují molekuly nukleové kyseliny nebo vektory podle vynálezu nebo pocházejí z takových buněk. Hostitelskou buňkou se rozumí organismus, který je schopný vnesení in vitro rekombinantní DNA a pak je případně schopen syntetizovat proteiny kódované molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu. Hostitelské buňky jsou prokaryotické nebo eukaryotické buňky. Výhodně jsou to mikroorganismy. Výhodně podle vynálezu jde o bakterie a protista (jako jsou houby, zejména kvasinky a řasy), jak jsou definovány např. v Schlegelově Allgemaine Mikrobiologie (Georg Thieme Verlag, • »

1985, 1-2). V souvislosti s prokaryotickými hostitelskými organismy je třeba poznamenat, že byl ukázán pozitivní účinek inulínu na růst určitých mikroorganismů, jako jsou např.

bifidobakterie Bifidobakteriím z lidského se přisuzuje intestinálniho zdravotní účinek traktu. (viz např.

navíc obsahuje (SST) závislou

Gibson et al., Int. Sugar J. 96, 1994, 381-386; Roberfroid et al., J. of Nutrition 128, 1998, 11-19). Byl také diskutován inhibiční účinek na nádory (viz např. Reddy et al, Carcinogenesis 18, 1987, 1371-1374; Singh et al. , Carcinogenesis 18, 1997, 833-841. Z tohoto důvodu hostitelské buňky podle vynálezu jako jsou kvasinky (pekařské) nebo bakterie mléčného kvašení (jogurt, podmáslí) jsou vhodné pro použití v potravinářském průmyslu.

Ve zvláště výhodném provedení vynálezu hostitelská buňky gen kódující sacharózafruktosyltransferázu na sacharóze. Takové sekvence byly např..

izolovány z artyčoku (německá patentová přihláška DE-A1 197 08 774), Cíchorium intibus (de Halleux et al., Plant Physiol. 113, 1997, 1003 -1013), Helíanthus tuberosus (WO 96/21023 a Allium cepa (Vijn et al., Plant Phsiol. 117, 1998, 15071513 .

Vynález se zejména týká transgenních rostlinných buněk transformovaných nukleovými kyselinami podle vynálezu nebo jejich deriváty nebo částmi. Transgenní rostlinné buňky jsou výhodně schopné syntetizovat enzymy vhodné pro produkci inulinu s dlouhým řetězcem díky faktu, že do nich byly vneseny vektorové systémy podle vynálezu, jejich deriváty nebo části. Buňky podle vynálezu jsou výhodně charakterizovány tím, že do nich zavedená molekula nukleové kyseliny podle vynálezu je buď heterologní vzhledem k transformované buňce, tj . v těchto přirozeně nevyskytuje, nebo na jiném buňkách se lokalizována je v genomu místě, než příslušná přirozeně se vyskytující sekvence. Navíc transgenní buňky podle vynálezu výhodně obsahují sekvenci DNA kódující SST.

Předkládaný vynález se v dalším provedení týká proteinů kódovaných molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu, a také způsobů jejich produkce, kdy se hostitelské buňky podle vynálezu kultivují za podmínek umožňujících syntézu proteinu. Protein se pak izoluje z pěstovaných buněk a/nebo kultivačního média. Kromě toho se vynález týká FFT, připravítelné z hostitelských buněk podle vynálezu nebo způsobem podle vynálezu.

Předkládaný vynález se dále týká molekul nukleových kyselin, které specificky hybridizují s molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu, s molekulou k ní komplementární nebo s její částí. Výhodně se jedná o oligonukleotidy s délkou nejméně 10, zejména nejméně 15 a výhodně nejméně 50 nukleotidů. Oligonukleotidy podle vynálezu se mohou využít jako primery v PCR reakci. Mohou sloužit také jako složky antisense konstruktů nebo DNA molekul, které kódují vhodné ribozymy.

Předkládaný vynález se také týká způsobu přípravy transgenních rostlinných buněk, rostlinných pletiv a rostlin, kterýžto způsob obsahuje vnesení molekuly nukleové kyseliny nebo vektoru podle vynálezu do rostlinné buňky, rostlinného pletiva nebo rostliny.

Tím, že předkládaný vynález poskytuje nukleové kyseliny podle vynálezu, dovoluje pomocí metod rekombinantní DNA produkovat inulin s dlouhým řetězcem v různých organismech, zejména v rostlinách, což dosud klasickými šlechtitelskými metodami nebylo možné. Zvýšením aktivity FFT, například nadměrnou expresí (overexpresí) vhodných molekul nukleové kyseliny podle vynálezu nebo poskytnutím mutant, které již nadále nepodléhají buněčně specifickým regulačním mechanismům a/nebo které mají změněné teplotní závislosti vzhledem k jejich aktivitě, je možné zvýšit výtěžek v rostlinách modifikovaných genetickým inženýrstvím.

Je tudíž také možná exprese molekul nukleové kyseliny podle vynálezu v rostlinných buňkách proto, aby se zvýšila aktivita příslušné FFT nebo proto, aby se FFT vnesla do buněk, které normálně tento enzym neexprimují. Nadto je možné modifikovat molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu metodami odborníkovi známými, aby se získala FFT podle vynálezu, která již nadále nepodléhá buněčně specifickým regulačním mechanismům nebo která má modifikovanou teplotní závislost nebo specifičnost k substrátu či produktu.

Pro tento účel odborník užije řadu různých rostlinných transformačních systému. Tak např. použiti T-DNA pro transformaci rostlinných buněk bylo extenzivně zkoumáno a je popsáno např. v patentové přihlášce EP-A-120 516 a dále v publikaci Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., A-lblasserdam (1985), Chapter V, Fraley, Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 and An, EMBO J. 4 (1985), 277-287.

Pro přenos DNA do rostlinných buněk se rostlinné explantáty společně kultivují (kokultivují) s Agrobacterium tumefaciens nebo Agrobacterium rhizogenes. Z infikovaného rostlinného materiálu (např. segmentů listu, stonku nebo kořenu, ale také z protoplastů nebo suspenzní buněčné kultury) lze regenerovat celou rostlinu ve vhodném médiu, které obsahuje antibiotika nebo biocidní látky vhodné pro selekci transformovaných buněk. Rostliny připravené takovým způsobem se pak musí testovat, aby se zjistilo, zda je přítomna vnesená DNA. Jinou možností je vnesení DNA do rostlinných buněk biolistickou metodou nebo transformací protoplastů, což je odborníkovi známo (viz např. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Piihler, P. Stadler, editors), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-BaselCambridge).

Alternativním systémem pro transformaci jednoděložných rostlin je transformace biolistickou metodou, elektricky nebo chemicky indukovaným příjmem DNA do protoplastu, elektroporací částečně permeabilizovaných buněk, makroinjekcí DNA do květú, mikroinjekcí DNA do mikrospor nebo proembrya metodou bobtnání (viz např. Lusardi, Plant J. 5, 1994, 571-582; Paszkowski,

Biotechnology 24, 1992, 387-392). Zatímco transformace dvouděložných rostlin vektorovým systémem založeným na Ti-plazmidu prostřednictvím Agrobacterium tumefaciens je již dávno zavedenou technikou, novější studie ukazují, že transformace vektory založenými na Agrobacterium tumefaciens muže být úspěšně použita i v případě jednoděložných rostlin (Chán et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282; Bytebier et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84 (1987), 5345-5349; Raineri et al . ,

Bio/Technology 8 (1990), 3338; Gould et al., Plant Physiol. 95 (1991 ), 426-434; Mooney et al., Plant, Cell Tiss. & Org. Cult. 25 (1991 ), 209-218; Li et al . , Plant Mol. Biol. 20 (1992), 1037-1048).

Tři z výše jmenovaných systému pro transformaci byly úspěšně zavedeny také pro různé druhy obilovin: elekroporace rostlinného pletiva, transformace protoplastú a přenos DNA ostřelováním regenerovatelné tkáně a buněk (přehled viz Jahne et al. , Euphytica 85 (1995), 3544) . V odborné literatuře bylo popsáno několik způsobu transformace pšenice (přehledy viz. Maheshwari et al., Critical Reviews in Plant Science 14 (2) (1995), 149-178).

Když jsou molekuly nukleové kyseliny exprimovány v rostlinách, může být syntetizovaný protein lokalizován v principu v jakémkoliv kompartmentu rostlinné buňky. Tiby se dosáhlo lokalizace ve specifickém kompartmentu, musí být odstraněna sekvence zaručující lokalizaci ve vakuole, a je-li nutné, zbylá kódující oblast musí být spojena se sekvencemi DNA zaručujícími lokalizaci ve specifickém kompartmentu. Takové sekvence jsou odborníkovi známy (viz např. Braun et al., EMBO J., 11, 1992, 3219-3227; Wolter et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 1988, 846-850; Sonnewald et al. , Plant J., 1, 1991, 95-106, Rocha-Sosa, EMBO J. 8, 1989,

23-29).

která se že tato

Předkládaný vynález se tudíž také týká transgenních rostlinných buněk, rostlinných pletiv a rostlin, které byly transformovány jednou nebo několika molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu, a také transgenních rostlinných buněk pocházejících z takových transformovaných buněk. Takové buňky obsahují jednu nebo několik molekul nukleové kyseliny podle vynálezu, které jsou výhodně spojeny s regulačními DNA prvky zaručujícími transkripci v rostlinných buňkách, zejména s promotorem. Takové rostlinné buňky se odlišují od přirozeně se vyskytujících rostlinných buněk tím, že obsahují alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny podle vynálezu, v těchto buňkách přirozeně nevyskytuje, nebo tín molekula je vložena do genomu buňky na místo, kde se přirozeně nevyskytuje, tj . do jiné genomově oblasti. Jelikož 1-kestóza je přirozeným substrátem FFT a sama je tvořena v reakci fruktosyltransferázy (SST) závislé na sacharóze se scharózou, je zvláště výhodné a pravděpodobně dokonce nutné poskytnout, kromě molekul nukleové kyseliny, vektoru a FFT podle vynálezu, také SST. Takže výhodné provedení vynálezu se týká transgenních rostlinných buněk, rostlinných pletiv a rostlin, které navíc obsahují gen kódující fruktosyltransferázu (SST) závislou na sacharóze. To mohou být např. rostliny nebo rostlinné buňky, které již přirozeně exprimují SST jako např. čekanka, Helianthus tuberosus nebo jiřina, a nebo rostliny, do kterých byla sekvence DNA kódující SST vnesena metodami genového inženýrství. Tyto sekvence je možné vnést navzájem nezávisle nebo současně s molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu.

Z transgenních rostlinných buněk mohou být regenerovány celé rostliny použitím metod odborníkům známých. Rostliny připravitelné regenerací transgenních rostlinných buněk podle vynálezu jsou také předmětem předkládaného vynálezu. Dalším předmětem vynálezu jsou rostliny obsahující transgenní rostlinné buňky popsané výše. Transgenní rostliny mohou být v podstatě rostliny jakéhokoli rostlinného druhu, tj. jak jednoděložné, tak dvouděložné. Výhodně jsou to plodiny, zejména rostliny, které obsahují sacharózu, jako jsou rýže, kukuřice, cukrová řepa, cukrová třtina, brambory a zelenina (rajčata, karotka, pór, čekanka apod.), krmné nebo luční trávy, sladké brambory, pšenice, ječmen, řepka a sója.

Vynález se také týká množitelského materiálu a produktů sklizně rostlin podle vynálezu, například ovoce, semen, hlíz, podnoží, sadby, řízků, kalusů, buněčných kultur apod.

Dalším předmětem vynálezu je inulin s dlouhým řetězcem, který lze získat z hostitelských buněk podle vynálezu, zejména z transgenních rostlinných buněk, rostlinných pletiv nebo rostlin, a také z jejich množitelského materiálu nebo sklizňových produktu.

V dalším provedení se vynález týká způsobů produkce inulinu s dlouhým řetězcem, který obsahuje kroky, kdy se:

a) kultivují hostitelské buňky, zejména rostlinné buňky, rostlinné pletivo nebo rostlina podle předkládaného vynálezu v podmínkách, které dovolují produkci FFT a konverzi 1-kestózy, případně doplňované zvenčí, nebo ekvivalentního substrátu na inulin s dlouhým řetězcem,

b) takto produkovaný inulin se izoluje z kultivovaných rostlinných buněk, zejména rostlinných buněk, rostlinného pletivo nebo rostliny podle vynálezu nebo z kultivačního média.

. Další provedení vynálezu se týká způsobu produkce inulinu s dlouhým řetězcem, kterýžto způsob obsahuje kroky, kdy se

a) přivede do kontaktu 1-kestóza nebo ekvivalentní substrát s FFT podle vynálezu za podmínek umožňujících konverzi na inulin s dlouhým řetězcem, a

b) izoluje se takto produkovaný inulin

Izolace inulinu z různých zdrojů, zejména rostlinných pletiv, byla např. popsána v Gibson et al., Int. Sugar J. 96, 1994, 381-386, Baxa, Czech J. Food Sci. 16, 1998, 72-76, a dále v EP-A-787 745, DeLeenheer, Cyrbohydr. Org. Raw Matter III, Workshop, 1996, Meeting dáte 1994, 67-92, Verlag VCH

Weinheim, Germany, a Ruský patent RU 20011621 Cl.

Předkládaný vynález se dále týká způsobu in vitro produkce inulinu s dlouhým řetězcem využitím sacharózy a kombinace enzymu SST a enzymu FFT podle vynálezu. Dále se vynález týká způsobu in vitro produkce inulinu užitím směsi obsahující fruktosylové oligomery a FFT podle vynálezu. V této souvislosti fruktosylový oligomer je oligomer složený z fruktózových jednotek s DP přibližně 2 až 7, který může mít na koncích glukózové zbytky. Když se provádí způsob podle vynálezu, užívají se , výhodně rekombinantně produkované proteiny, které jsou tvořeny tak, že se vloží DNA kódující příslušný protein do hostitelské buňky a tam se exprimuje. Protein je pak izolován buďto z hostitelských buněk nebo buňky jsou výhodně definované v předchozím z kultivačního média. Hostitelské hostitelské buňky podle vynálezu textu. Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu se užijí enzymy, které byly připraveny rekombinantní technologií a secernovány z hostitelských buněk do kultivačního média, nebo dále purifikovat lze snadno získat ze takže není nutné narušovat buňky protein, neboť secernovaný protein supernatantu. Aby se odstranila rezidua kultivačního média, užijí se obvyklé způsoby jako je dialýza, reverzní osmóza, chromatografické metody apod. To samé platí pro koncentrování proteinu vylučovaného do média. Sekrece proteinu mikroorganismy je normálně zprostředkována N-koncovým sekvence, vedoucí peptid).

procházet membránou dosáhnout spoj enim signálním peptidem (signální Proteiny se signální sekvencí mohou mikroorgansmu. Sekrece proteinů lze sekvence DNA kódující signální peptid s odpovídajícím úsekem kódujícím enzym. Zvláště výhodné je použití signálního peptidu α-CGTázy z Klebsiela oxytoca M5A.1 (Fielder et al., J. Mol. Biol. 256, 1996, 279-291) nebo signálního peptidu, který je kódován nukleotidy 11529 až 11618 sekvence uložené v GeneBank pod č. X86014.

Enzymy použité ve způsobu podle vynálezu mohou být alternativně připraveny nikoliv využitím mikroorganismů, ale užitím in vitro transkripčních a translačních systémů, které umožňují exprimovat protein. Ve zvláště výhodném provedení vynálezu je FFT produkována v protoplastěch z listovém pletiva rostlin.

Dále se vynález týká inulinu, produkovaného hostitelskou buňkou, zejména rostlinnou buňkou, pletivem nebo rostlinou podle vynálezu, nebo získaného z rozmnožovacího materiálu nebo produktu sklizně rostlin nebo rostlinných buněk podle vynálezu nebo získaných výše popsaným způsobem podle vynálezu. Takový inulin se může výhodně použít pro přípravu surfaktantů ke zvýšení viskozity ve vodných systémech, jako detergent, jako suspendující činidlo nebo pro urychlení sedimentačního procesu a komplexování a pro vázání vody.

Tato a ještě jiná provedení vynálezu byla popsána, jak je odborníkovi zřejmé. Jsou obsažena v popisu příkladů provedení vynálezu. Další odborná literatura týkající se výše popsaných způsobů, prostředků nebo použití, který lze využít ve smyslu předkládaného vynálezu, je obsažena ve stavu techniky, např. ve veřejných knihovnách nebo v elektronické podobě. Veřejnou databází je např. databáze Medline, na kterou je přístup prostřednictvím Internetu na adrese:

http://www.nebi.nim. nih.gov/PubMed/medline.html.

Další obdobné databáze jsou odborníkům známy a jejich adresy lze získat pomocí Internetu např. na adrese: http://www.lycos.com.

Přehled informačních zdrojů týkajících se biotechnologických patentů a patentových přihlášek lze nalézt v publikaci Berks, Tibtech 12, 1994, 352-364.

Přehled obrázků

Obrázek 1: ukazuje analýzu celkového extraktu z protoplastu pomocí HPLC. protoplasty byly transformovány různými vektory: A: Transformace byla provedena vektorem pA7, který neobsahuje kódující úsek fúzovaný s promotorem cAMV 35S. B: Transformace byla provedena vektorem pA7-csFFT, který obsahuje kódující úsek fruktan:fruktosyltransferázy z artyčoku fúzovaný s promotorem cAMV 35S. C: Transformace byla provedena vektorem pA7-htFFT, který obsahuje .kódující úsek fruktan:fruktosyltransferázy z Helianthus tuberosus fúzovaný s promotorem cAMV 35S. Před analýzou byly úplné extrakty z protoplastů inkubovány ve směsi fruktosylových oligomerů po dobu 12 hodin. Analýza byla provedena jak je popsáno v příkladu 1.

Obrázek 2: ukazuje konstrukci plazmidu p35-csFFT.

• v

Obrázek 3: ukazuje HPLC analýzu transgenních rostlin, které byly připraveny transformací konstruktem p35-csFFT. Analýza ukázala, že se tvořily molekuly inulinu s dlouhým řetězcem v transgenních rostlinách, které exprimovaly SST a také FFT z artyčoku (35S-SST/FFT 22/19).

Obrázek 4: ukazuje konstrukci plazmidu p33-csFFT.

Obrázek 5: ukazuje HPLC analýzu transgenních rostlin, které byly připraveny transformací konstruktem p33-csFFT. Analýza ukázala, že se tvořily molekuly inulinu s dlouhým řetězcem v transgenních rostlinách, které exprimovaly SST a také FFT z artyčoku (B33-SST/FFT 47) .

Předkládaný vynález je dále podrobněji ilustrován pomocí následujících příkladů.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Identifikace, izolace a charakterizace cDNA kódující fruktosyltransferázu z artyčoku (Cynare scolymus}

Celková RNA byla izolována z češule (receptaculum) artyčoku (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . Póly(A)⁺ mRNA se izolovala za použití mRNA izolačního systému PolyATtract (Promega Corporation, Madison, Wl, USA). Komplementární DNA (cDNA) se syntetizovala z 5 μς této RNA pomocí soupravy pro syntézu ZAp-cDNA synthesis kit od firmy Stratagene podle instrukcí výrobce. Získalo se 2xl0'^: nezávislých rekombinantních fágú. Amplifikovaná cDNA knihovna se testovala obvyklými metodami pomocí fragmentu DNA značeného '~P a odpovídajícího cDNA pro SST z artyčoku (Notl fragment z plazmidu pCy21 podle DE 197 08 774.4) . Sekvence SST z artyčoku byla popsána v patentové přihlášce DE 197 08 774.4. Pozitivní klony byly screenovány pomocí sondy SST v silně stringentních podmínkách. Klony reagující pozitivně ve screeningu byly vynechány, neboť se evidentně jednalo o SST cDNA. Ze zbývajících klonů byly izolovány inzerty cDNA tak, že se plazmidová DNA izolovaná standardním postupem vyštěpila restrikčním enzymem Notl a pak byla klonována do vektoru pA7. Kohezní konce Notl fragmentu byly zaplněny užitím T4 polymerázy. Poté byl fragment ligován do míst Smál v pA7. vektor pA7 je derivátem pUC18 (Yanish-Perron, gene 33, 1985,

103-119), který obsahuje vložený promotor 35 S z viru mozaiky květáku, CaMV (nukleotidy 7146 až 7464, dle Gardner, Nucl. Acids Res. 9, 1981, 2871-2888) mezi místa EcoRI a Sací v polylinkeru. Kromě promotoru 35S obsahuje vektor pA7 polyadenylační signál genu 3 z T-DNA Ti plazmidu pTiACH5 (Gielen, EMBO J. 3, 1984, 835-846), tj . nukleotidy 11749 až 11939, který byl izolován jako fragment PvuII-HindlII z plazmidu pAGV40 (Kerrera-Strella, Nátuře 303, 1983, 209-213) a klonován mezi místa Spnl a HindlII polylinkeru po adici linkeru Sphl k místu PvuII.

Protoplasty tabáku byly transformovány užitím derivátů pA7 obsahujících cDNA z artyčoku, a sice metodou, kterou popsal Negrutiu, Plant Mol. Biol. 8, 1987, 363-373. Transformované protoplasty byly kultivovány v médiu K3 (Nagy a Maliga, Z. Pflanezenphysiologie 78, 1976, 453-455) při 25 °C po dva dny ve tmě. Pak byly získány buněčné extrakty opakovaným zmrazením a roztátím. Extrakty byly inkubovány 12 hodin s oligofruktany (67,5 1 1-kestóza, 28,4 i nystóza, 3,6 * fruktosylnystóza, 0,5 i sacharóza) při 28 °C a pak analyzovány užitím HPLC. Analýzy HPLC byly provedeny na aniontové výměnné koloně CarboPAc PA 100, napojené na gradientový chromatografický systém Dionex DX-300 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) . Monomery, oligomery a polymery cukrů byly stanoveny pomocí pulzampérometrické detekce. Nastavení detektoru pro tento účel bylo následující: Ti - 0,48 s, T₂ - 0,12 s, T₃ = 0,12 s, Ei = 0,05 V, E₂ = 0,65 V, E₃ = -0,95 V, citlivost = 0,1 μθ, integrace = 0,28 až 0,48 s, průtokové médium A = 0,15M NaOH, průtokové médium Β = 1M NaAc v 0, 15M NaOH, gradient: 10 minut 100% A, 2 minuty lineární zvýšení z 0% B na 100% B, 2 minuty 100% B, 2 minuty lineární zvýšení z 0% A na 100% A, 5 minut A. Vzorky byly před aplikací odsoleny a filtrovány (Microcon 10, Amicon, Beverly, USA) . Průtoková rychlost byla 1 ml min-1. V několika extraktech (viz obr. 1) byl nalezen vysokomolekulární inulin.

Příklad 2

Sekvenční analýza inzertu cDNA plazmidu pCy3

Inzert cDNA z derivátu pA7 (pCy3), který byl zodpovědný za syntézu vysokomolekulárního inulinu v testu s protoplasty, byl sekvencován obvyklou dideoxynukleotidovou metodou (Sanger et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74, 1977, 5463-5467).

Inzert klonu pCy21 je DNA velikosti 2073 bp. Nukleotidová sekvence je zde uvedena jako sekvence id. č. 1. Odpovídající aminokyselinová sekvence je uvedena jako sekvence id. č. 2. Sekvence id. č. 3 je varianta sekvence id. č. 1, která kóduje stejný protein jako sekvence id. č. 1.

Sekvenční analýza a srovnání s již publikovanými sekvencemi ukázaly, že sekvence uvedená jako sekvence id. č. 1

Γ Γ ř r je nová a obsahuje kódující úsek vykazující homologii s FFT jiných organismů.

Příklad 3

Syntéza plazmidu p35-csFFT a vložení plazmidu do genomu bramboru

Plazmid p35-csFFT (obr. 2) obsahuje tři fragmenty A, B a C v binárním vektoru pBinl9 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res., 12: 8711, modifikováno podle Becker, 1990, Nucl. Acids Res., 18: 203) .

Fragment A obsahuje promotor 35S z viru mozaiky květáku (CaMV) . Obsahuje úsek nukleotidů 7146 až 7464 (Gardner, Nucl. Acids Res. 9, 1981, 2871-2888), který je vložen mezi štěpná místa EcoRI a Sací polylinkeru z pBinl9-Hyg.

Fragment B obsahuje nukleotidy 1 až 2073 sekvence id. č. 1. Fragment B byl získán jako fragment Notl z vektoru pBK-CMV, ve kterém byl vložen do štěpného místa EcoRI prostřednictvím linkerové sekvence EcoRI/Notl.

Fragment C obsahuje polyadenylační signál genu 3 z T-DNA Ti plazmidu pTi ACH 5 (Gielen et al., 1984 ; EMBO J., 3, 835846), nukleotidy 11749 .až 11939, který byl izolován jako fragment PvuII - HindlII z plazmidu pAGV 40 (Herrera-Estrella et al., 1983, Nátuře, 303, 209-213) a klonován mezi štěpná místa Sphl a Hind III polylinkeru z pBinl9-Hyg po přidání linkerů Sphl ke štěpnému místu PvuII.

Plazmid p35-csSST byl vnesen do Agrobacterium (Hófgen a Willmitzer, Nucleic Acids Res., 16, 1988, 9877) a pak byl zaveden do rostlin bramboru prostřednictvím genového přenosu zprostředkovaného Agrobacterium užitím výše popsaných v oboru známých metod. Tyto rostliny bramboru byly transformovány e r sekvencí DNA kódující SST z artyčoku (viz německá patentová přihláška DE Al 197 08 774) a exprimují sekvenci pod kontrolou promotoru 35S. Celé rostliny byly regenerovány z transformovaných buněk. Z listů regenerovaných rostlin byly získány extrakty a ty byly testovány na přítomnost fruktosylových polymerů. Analýzy se prováděly postupem popsaným v příkladu 1. Analýzy listů velkého počtu rostlin transformovaných tímto vektorem nepochybně prokázaly výskyt vysokomolekulárního inulinu, který je důsledkem exprese genu FFT artyčkou obsaženém v plazmidu p35-csFFT (srov. obr. 3) .

Tabulka 1

Analýza obsahu inulinu v hlízách transgenních rostlin bramboru exprimujících geny SST a FFT z artyčoku

Rostlina	obsah fruktanu μιηοΐ fruktózy/g čerstvé hmotnosti	průměrný stupeň polymerizace (poměr fruktóza/glukóza)
35-SST/FFT 22/26	30,81	21 (20/1)
35-SST/FFT 36/17	27,34	20 (19/1)

Příklad 4

Příprava plazmidu p33-csFFT a vnesení plazmidu do genomu bramboru

Plazmid p33-csFFT (obr. 4) je shodný s píazmidem p35csFFT, s výjimkou toho, že fragment A A obsahuje promotor B33 patatinového genu b33 z bramboru místo promotoru 35 S CaMV.

Obsahuje fragment Dral (pozice -1512 až pozice +14) patatinového genu B33 (Rocha-Sosa et al. , 1989, EMBO J., 8:2329), který byl vložen mezi štěpná místa EcoRI a Sací polylinkeru z pBinl9-Hyg.

Plazmid p33-csFFT byl vnesen do rostlin bramboru pomocí genového přenosu zprostředkovaného Agrobacterium, jak bylo již popsáno v příkladu 3. Tyto rostliny bramboru byly transformovány sekvencí DNA kódující SST z artyčoku (viz německá patentová přihláška DE Al 197 08 774) a exprimují sekvenci pod kontrolou promotoru 35S. Celé rostliny byly regenerovány z transformovaných buněk.

Analýzy hlíz velkého počtu rostlin transformovaných tímto vektorem nepochybně prokázaly výskyt vysokomolekulárního inulinu, který je výsledkem exprese genu FFT z artyčoku obsaženého v p33-csFFT (srov. obr. 5).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Molekuly nukleové kyseliny kódující protein s enzymatickou aktivitou fruktosyltransferázy (EET) vedoucí k syntéze vysokomolekulárních fruktanových polymerů, jejichž molekuly obsahují v průměru více 20 fruktosylových zbytků, přičemž molekuly nukleové kyseliny jsou vybrány ze skupiny obsahuj ící

a) molekuly nukleové kyseliny kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci id. č.
2 a id. č. 4,

b) molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci id. č. 1 nebo id. č.
3,

c) molekuly nukleové kyseliny hybridizující za stringentních podmínek s komplementárním řetězcem molekul nukleové kyseliny uvedených v bodě a) nebo b) ,

d) molekuly nukleové kyseliny obsahující fragment nukleotidové sekvence z bodu a), b) nebo c).

2. Molekula molekula nukleové DNA. kyseliny podle nároku 1, která je 3 . Molekula molekula nukleové cDNA. kyseliny podle nároku 2, která je 4 . Molekula molekula nukleové RNA. kyseliny podle nároku 1, která je 5. Molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až
4, která pochází z artyčoku.
6. Vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5.
7. Vektor podle nároku 6, kde molekula nukleové kyseliny je operativně spojena s regulačními prvky, které zajišťují transkripci a syntézu translatovatelné RNA v prokaryotických a/nebo eukaryotických buňkách.
8. Vektor podle nároku 7, kde regulační prvky jsou odvozeny z promotoru B33 genu patatinu nebo promotoru 35S CaMV.
9. Hostitelská buňka transformovaná molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 nebo vektorem podle kteréhokoliv z nároků 6 až 8 nebo buňka, která pochází z takové buňky.
10. Hostitelská buňka podle nároku 9, která navíc obsahuje gen kódující sacharózofruktosyltransferázu (SST) závislou na sacharóze.
11. Způsob přípravy FFT vyznačující se tím, že hostitelské buňky podle nároku 9 se kultivují v podmínkách, které umožňují syntézu FFT a pak se FFT izoluje z kultivovaných buněk a/nebo kultivačního média.
12. FFT kódovaná molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 nebo připravená způsobem podle nároku 11.
13. Molekula nukleové kyseliny, která specificky hybridizuje s molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 nebo jejím komplementárním řetězcem.
14. Způsob přípravy transformovaných hostitelských buněk podle nároku 9 nebo 10, zejména transgenních rostlinných buněk, transgenních rostlinných pletiv a transgenních rostlin, vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se vnese molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároku 1 až 5 nebo vektor podle kteréhokoliv z nároků 6 až 8 do hostitelské buňky, rostlinné buňky, rostlinného pletiva nebo rostliny.
15. Transformovaná hostitelská buňka, transgenní rostlinná buňka, rostlinné pletivo nebo rostlina, které obsahují molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 nebo vektor podle kteréhokoliv z nároků 6 až 8 nebo které jsou připravitelné způsobem podle nároku 14 nebo které pocházejí z takových buněk, pletiv nebo rostlin.
16. Transformovaná hostitelská buňka, transgenní rostlinná buňka, rostlinné pletivo nebo rostlina podle nároku 15, které navíc obsahují gen kódující sacharózofruktosyltransferázu (SST) závislou na sacharóze.
17. Rostlina obsahující rostlinné buňky nebo rostlinné tkáně podle nároku 15 nebo 16.
18. Rostlina podle kteréhokoliv z nároků 15 až 17, která je užitková rostlina.
19. Rostlina podle nároku 18, kdy užitková rostlina je rostlina obsahující sacharózu.
20 . Množitelský materiál rostlin podle kteréhokoliv z nároků 15 až 19, obsahující rostlinné buňky podle nárok 15 nebo 16.
21.Sklizňové produkty rostlin podle kteréhokoliv z nároků 15 až 19, obsahující rostlinné buňky podle nárok 15 nebo 16.
22. Způsob výroby vysokomolekulárního inulinu vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy

a) kultivují se transformované hostitelské buňky, transgenní rostlinné buňky nebo rostlinná pletiva podle nároku 15 nebo 16 nebo rostlina podle kteréhokoliv z nároků 15 až 19 v podmínkách, které umožňují tvorbu FFT a přeměnu 1-kestózy, případně dodávané zvenčí, nebo ekvivalentního substrátu, na vysokomolekulární inulin, a

b) takto tvořený inulin se izoluje z kultivovaných buněk, pletiv nebo rostlin nebo z kultivačního média.
23. Způsob výroby vysokomolekulárního inulinu vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy

a) 1-kestóza nebo ekvivalentní substrát se přivede do kontaktu s FFT podle nároku 12 v podmínkách, které umožňují přeměnu na vysokomolekulární inulin, a

b) izoluje se takto tvořený inulin.
24. Způsob in vitro výroby vyznačující se substrát je přeměňována kombinací enzymů obsahující vysokomolekulárního inulinu tím, že sacharóza jakožto na vysokomolekulární inulin

SST a FFT.
25. Vysokomolekulární inulin získatelný z hostitelských buněk, rostlinných buněk nebo rostlinných pletiv podle nároku 15 nebo 16, z rostlin podle kteréhokoliv z nároků 15 až 19, z množitelského materiálu podle nároku 20 nebo ze sklizňových produktů podle nároku 21 a nebo způsobem podle kteréhokoliv z nároků 22 až 24.
26. Použití inulinu podle nároku 25 k výrobě surfaktantů ke zvýšení viskozity vodných systémů, jako detergentů, suspendačního činidla, pro urychlení sedimentace a pro komplexování nebo vázání vody.