CN118127153A - 检测头颈鳞状细胞癌的试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测头颈鳞状细胞癌的试剂及其应用。以GRCh38.p14为参考,目标区域为Chr6:137493196‑137494301或者其部分区域。通过检测OLIG3基因CpG岛及其临近区域DNA的甲基化水平的变化,即以Chr6:137493196‑137494301为目标区域进行甲基化水平检测,能够有效区分头颈鳞状细胞癌患者和健康人,灵敏度高,特异性强,为头颈鳞状细胞癌的诊断提供了新的思路。
Description
本申请要求2022年12月02日提交中国专利局的申请号为202211535786.8、名称为“检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备头颈鳞状细胞癌诊断产品中的应用”的中国专利申请的优先权,其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,具体而言,涉及一种检测头颈鳞状细胞癌的试剂及其应用。
背景技术
头颈癌是指一组起源于上呼吸道和部分上消化道器官的恶性肿瘤,其发生部位包括口腔、口咽、下咽、喉等。据统计,在2018年,全球有705781例新发头颈癌病例,并有358144例患者死于头颈癌。在头颈部肿瘤中,超过90%的癌症属于头颈鳞状细胞癌(head andneck squamous cell carcinoma,HNSCC)。头颈鳞状细胞癌多发生于口腔、咽喉部的黏膜,发病部位较隐匿,临床上早期症状不典型,又缺少能够早期发现病变的生物标记物,因此不易被早期发现,超过半数以上的患者都是在病变中晚期的时候才确诊,这时多数患者已出现***和/或远处转移,给该病的临床治疗带来较大困难。目前,尽管头颈鳞状细胞癌的诊疗技术已经显著提高,但该病预后仍然较差,5年生存率低于50%。
头颈鳞状细胞癌患者的生存率和生活质量与确诊时原发部位的肿瘤大小直接相关,且一旦患者的口咽部出现无法愈合的肿块或疼痛、吞咽困难、呼吸困难等与癌症相关的症状,则成功治疗的可能性就大大降低。因此,在尚无症状的高危人群中进行早期筛查和诊断是十分必要的。
近年来,体液活检技术已成为检测和监控疾病各个阶段发展状态的最有前景的工具,为精准医疗提供了有力支持。体液中的循环标志物如循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA和外泌体等可以反映肿瘤原发部位的信息。因此,筛选高灵敏度、高特异性的分子标记物,采用体液活检的方式对头颈鳞状细胞癌患者进行早期诊断或辅助诊断具有积极的意义。
有鉴于此,特提出本申请。
发明内容
本申请实施例的目的之一包括将检测Chr6:137493196-137494301或者其部分区域的甲基化水平的试剂用于制备头颈鳞状细胞癌诊断产品,采用该诊断产品进行头颈鳞状细胞癌的诊断,灵敏度高,特异性强。
在本申请的第一方面,提供检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备头颈鳞状细胞癌诊断产品中的应用;
以GRCh38.p14为参考,所述目标区域为Chr6:137493196-137494301或者其部分区域。
在本申请的一些实施方式中,所述部分区域包括如下定义的区域1至区域11中的一个或者多个:
区域1为Chr6:137493196-137493305,正链;
区域2为Chr6:137493358-137493519,正链;
区域3为Chr6:137493512-137493649,正链;
区域4为Chr6:137493664-137493803,正链;
区域5为Chr6:137493804-137493898,正链;
区域6为Chr6:137493921-137494067,正链;
区域7为Chr6:137494135-137494301,正链;
区域8为Chr6:137493920-137494054,负链;
区域9为Chr6:137493817-137493919,负链;
区域10为Chr6:137493573-137493687,负链;和
区域11为Chr6:137493200-137493308,负链。
在本申请的一些实施方式中,所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区域的甲基化水平的检测:甲基化特异性PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组亚硫酸氢盐测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和甲基化特异性荧光定量PCR法。
在本申请的一些实施方式中,所述试剂包括检测所述目标区域甲基化水平的检测引物对以及检测探针。
在本申请的一些实施方式中,所述试剂具有如下技术特征中的一个或者多个:
(1)检测所述区域1的检测引物对如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示,检测探针如SEQ ID No.9所示;
(2)检测所述区域2的检测引物对如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示,检测探针如SEQ ID No.12所示;
(3)检测所述区域3的检测引物对如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示,检测探针如SEQ ID No.15所示;
(4)检测所述区域4的检测引物对如SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示,检测探针如SEQ ID No.18所示;
(5)检测所述区域5的检测引物对如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示,检测探针如SEQ ID No.21所示;和,
(6)检测所述区域6的检测引物对如SEQ ID No.22和SEQ ID No.23所示,检测探针如SEQ ID No.24所示;
(7)检测所述区域7的检测引物对如SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示,检测探针如SEQ ID No.27所示;
(8)检测所述区域8的检测引物对如SEQ ID No.28和SEQ ID No.29所示,检测探针如SEQ ID No.30所示;
(9)检测所述区域9的检测引物对如SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示,检测探针如SEQ ID No.33所示;
(10)检测所述区域10的检测引物对如SEQ ID No.34和SEQ ID No.35所示,检测探针如SEQ ID No.36所示;和,
(11)检测所述区域10的检测引物对如SEQ ID No.37和SEQ ID No.38所示,检测探针如SEQ ID No.39所示。
在本申请的一些实施方式中,所述试剂还包含检测内参基因的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针;所述内参基因包含ACTB基因。
在本申请的一些实施方式中,检测所述ACTB基因的检测引物对如SEQ ID NO.62和SEQ ID NO.63所示,以及检测探针如SEQ ID NO.64所示。
在本申请的一些实施方式中,检测的样本类型包括血浆样本、细胞样本或者组织样本。
在本申请的第二方面,提供一种头颈鳞状细胞癌诊断试剂盒,包括第一方面中所定义的试剂。
在本申请的一些实施方式中,所述诊断试剂盒还包括测序试剂、扩增试剂、将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂、DNA提取试剂纯化试剂中的一种或者多种。
在本申请的一些实施方式中,所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或者多种。
本申请的有益效果包括:
本申请发现,通过检测OLIG3基因CpG岛及其临近区域DNA的甲基化水平的变化,即以Chr6:137493196-137494301为目标区域进行甲基化水平检测,能够有效区分头颈鳞状细胞癌患者和健康人,灵敏度高,特异性强,为头颈鳞状细胞癌的诊断提供了新的思路。
具体实施方式
下面结合实施方式和实施例,对本发明作进一步详细的说明。应理解,这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围,提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施方式和实施例,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改,得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外,在下文的描述中,给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解,应理解,本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
除非另外说明或存在矛盾之处,本文中使用的术语或短语具有以下含义:
本申请所使用的术语“和/或”、“或/和”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目,也包括相关所列项目的任意的和所有的组合,所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是,当用至少两个选自“和/或”、“或/和”的连词组合连接至少三个项目时,应当理解,在本申请中,该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案,还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如,“A和/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如,“A,B,C,及/或,D”的技术方案,包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案),也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合,即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合,还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等,如无特别限定,指在数量上大于2或等于2。例如,“一种或多种”表示一种或大于等于两种。“以上”包括本数,比如“两种以上”包括两种、三种或更多种。
本申请中,“至少一者”、“至少一种”是指可以是所列项目中的任一项,或者是其中任意两种以上的组合。
本申请中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本申请中,“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”,以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。
本申请中,“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例,应当理解,并不构成对本申请保护范围的限制。
本申请中,“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中,术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的,不能理解为指示或暗示相对重要性或数量,也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的,应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本申请中,以开放式描述的技术特征中,包括所列举特征组成的封闭式技术方案,也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请中,术语“诊断”包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。
本申请中,“头颈鳞状细胞癌”与“头颈癌”具有相同含义,是指颈部和头部发生的癌症或肿瘤,但不包括除了大脑和眼睛的病变。一般包括口腔癌、鼻窦及鼻癌、唇癌、咽癌、喉癌、头部肿瘤、耳癌、鼻咽癌、口咽癌或下咽癌,或唾液腺癌。头颈癌可能始于鳞状细胞,这些鳞状细胞排列在头颈部内(例如口腔、鼻和喉咙内部)潮湿的黏膜表面。这些鳞状细胞癌可称为头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子,优选多于三个,并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素,而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生,包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式,能够在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数,既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中,可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下,可根据样本检测的Ct值进行比较;在一些情况下,可计算样本中基因甲基化的比例,即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100,然后再进行比较;在一些情况下,还需要对各个指标进行统计学上的分析整合,得出最终的判定指标。可以理解,本文中被检测基因的目标区域是包括至少一个CpG二核苷酸(CG)的DNA序列。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中,基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常,用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素,包括温度、引物来源以及所用方法等。例如,对于诊断和预后应用,根据靶序列的复杂度,寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸,但是也可以含有更少的核苷酸。在本公开内容中,术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时,因为荧光基团附近存在淬灭基团,探针不会发出荧光。在扩增过程中,如果探针与被扩增的链结合,DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针,荧光基团远离淬灭基团,其能量不被吸收,即产生荧光信号。每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步的指数增长的过程。
DNA甲基化是在DNA甲基转移酶的作用下,将一个甲基基团转移到胞嘧啶碱基的第5位碳原子上。肿瘤抑制基因启动子区域DNA的甲基化是癌变过程中的重要事件,异常的DNA甲基化通常发生在癌症的早期且稳定存在。DNA的异常甲基化通常导致抑癌基因失活和癌基因的激活。鉴于此,发生甲基化改变的基因可以作为诊断癌变或癌前病变的分子标记物,具有一定的诊断价值。在进行癌症阴、阳性的判定过程中,筛选到合适的分子标记物并对其进行甲基化检测是非常关键的。
本申请的第一方面
本申请提供检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备头颈鳞状细胞癌诊断产品中的应用;
以GRCh38.p14为参考,所述目标区域为Chr6:137493196-137494301或者其部分区域。
可选地,所述部分区域包括如下定义的区域1至区域11中的一个或者多个:
区域1为Chr6:137493196-137493305,正链;
区域2为Chr6:137493358-137493519,正链;
区域3为Chr6:137493512-137493649,正链;
区域4为Chr6:137493664-137493803,正链;
区域5为Chr6:137493804-137493898,正链;
区域6为Chr6:137493921-137494067,正链;
区域7为Chr6:137494135-137494301,正链;
区域8为Chr6:137493920-137494054,负链;
区域9为Chr6:137493817-137493919,负链;
区域10为Chr6:137493573-137493687,负链;和
区域11为Chr6:137493200-137493308,负链。
可选地,所述目标区域选自区域1至区域11中的一个或者多个。
可选地,所述目标区域选自区域1、区域3、区域5、区域7、区域9和区域10中的一个或者多个。可选地,所述目标区域选自区域1、区域3、区域6、区域7、区域8和区域10中的一个或者多个。进一步地,所述目标区域选自区域1、区域3、区域7和区域10中的一个或者多个。
可选地,所述目标区域选自区域1、区域3、区域5、区域7、区域9、区域10和区域11中的一个或者多个。可选地,所述目标区域选自区域1、区域2、区域3、区域5、区域6、区域7、区域9、区域10和区域11中的一个或者多个。进一步地,所述目标区域选自区域1、区域3、区域5、区域7、区域9、区域10和区域11中的一个或者多个。
可选地,所述目标区域为区域3。
可选地,所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区域的甲基化水平的检测:甲基化特异性PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组亚硫酸氢盐测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和甲基化特异性荧光定量PCR法。在本申请的示例性方案中,采用甲基化特异性PCR检测甲基化水平。
可选地,所述试剂包括检测所述目标区域甲基化水平的检测引物对以及检测探针。
可选地,所述试剂具有如下技术特征中的一个或者多个:
(1)检测所述区域1的检测引物对如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示,检测探针如SEQ ID No.9所示;
(2)检测所述区域2的检测引物对如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示,检测探针如SEQ ID No.12所示;
(3)检测所述区域3的检测引物对如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示,检测探针如SEQ ID No.15所示;
(4)检测所述区域4的检测引物对如SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示,检测探针如SEQ ID No.18所示;
(5)检测所述区域5的检测引物对如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示,检测探针如SEQ ID No.21所示;和,
(6)检测所述区域6的检测引物对如SEQ ID No.22和SEQ ID No.23所示,检测探针如SEQ ID No.24所示;
(7)检测所述区域7的检测引物对如SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示,检测探针如SEQ ID No.27所示;
(8)检测所述区域8的检测引物对如SEQ ID No.28和SEQ ID No.29所示,检测探针如SEQ ID No.30所示;
(9)检测所述区域9的检测引物对如SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示,检测探针如SEQ ID No.33所示;
(10)检测所述区域10的检测引物对如SEQ ID No.34和SEQ ID No.35所示,检测探针如SEQ ID No.36所示;和,
(11)检测所述区域10的检测引物对如SEQ ID No.37和SEQ ID No.38所示,检测探针如SEQ ID No.39所示。
可选地,所述试剂还包含检测内参基因的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针;所述内参基因包含ACTB基因。
可选地,检测所述ACTB基因的检测引物对如SEQ ID NO.62和SEQ ID NO.63所示,以及检测探针如SEQ ID NO.64所示。
可以理解的是,本申请的检测探针含有荧光基团。
可选地,本申请的检测探针为TaqMan探针,其5’端为荧光基团,如FAM、ROX、VIC、CY5等,其3’端为荧光淬灭基团,如BHQ、BHQ1、MGB等。
可选地,检测的样本包括血浆样本、细胞样本或者组织样本。所述样本为来源于对象的离体生物样本。本申请中,“对象”或“患者”或“受试者”包括人类患者和其它哺乳类动物,还包括患有或患有过食管癌的任何个体,或者希望使用本发明方法进行分析或治疗的任何个体。落入本发明范围内的合适的哺乳类动物包括但不限于:灵长类、家畜(例如绵羊、牛、马、猴、猪)、实验室试验动物(例如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、宠物(例如猫、狗)和圈养野生动物(例如狐狸、鹿、澳洲野狗)。优选地,患者为人类患者。
本申请的第二方面
本申请提供一种头颈鳞状细胞癌诊断试剂盒,包括第一方面中所定义的试剂。
可选地,所述诊断试剂盒还包括测序试剂、扩增试剂、将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂、DNA提取试剂和纯化试剂中的一种或者多种。
可选地,所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或者多种。
具体实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,优先参考本发明中给出的指引,还可以按照本领域的实验手册或常规条件,还可以按照制造厂商所建议的条件,或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中,涉及原料组分的量度参数,如无特别说明,可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数,允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
DNA甲基化是在DNA甲基转移酶的作用下,将一个甲基基团转移到胞嘧啶碱基的第5位碳原子上。肿瘤抑制基因启动子区域DNA的甲基化是癌变过程中的重要事件,异常的DNA甲基化通常发生在癌症的早期且稳定存在。DNA的异常甲基化通常导致抑癌基因失活和癌基因的激活。OLIG3(Oligodendrocyte transcription factor 3)基因位于人类基因组6号染色体负链上,其Gene ID为167826。该基因编码的蛋白具有双链DNA结合活性,可作为转录因子参与基因的转录和转录调节过程。该基因的CpG岛位置为:137493219-137494065,本申请发现,通过荧光定量PCR法检测血液样本中OLIG3基因CpG岛及其临近区域DNA的甲基化水平的变化,可以有效区分头颈鳞状细胞癌患者和健康人。本申请提供了用于检测目标区域(Chr6:137493196-137494301)DNA甲基化水平的试剂、试剂盒,并提供了这些试剂和试剂盒在诊断头颈鳞状细胞癌中的应用方法,为头颈鳞状细胞癌的诊断和辅助诊断提供了新的思路,为该癌症患者带来福音。
实施例1、检测引物对和检测探针的设计
以OLIG3基因Chr6:137493196-137494301的核酸片段为目标区域,以该区域转化后的DNA序列为模板,设计多对甲基化检测引物对并人工合成,用于甲基化特异性荧光定量PCR反应。然后将OLIG3基因Chr6:137493196-137494301区域完全甲基化的正链DNA和负链DNA经转化后的片段(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5)、以及完全未甲基化的正链DNA和负链DNA经转化后的片段(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6)分别人工合成,并将其分别连接在pUC18载体上,构建含有目标区域的人工质粒。随后以所述含目标区域的质粒为模板,使用SYBR荧光定量PCR体系分析每对甲基化检测引物对的性能,要求扩增曲线具有明显的指数增长期,扩增效率在95%~105%的范围内,且无非特异性扩增。为了满足扩增效率,以及便于检测血浆样本,扩增子的长度均小于170bp,因此将目标区域分为连续的若干各子目标区域进行扩增。非特异性扩增是指在一个PCR扩增体系中,在同时加入甲基化的质粒模板和非甲基化的质粒模板的条件下,要求甲基化检测引物对仅扩增甲基化的质粒,而不扩增非甲基化的质粒,也没有其它非特异性扩增。
得到满足上述所有要求的针对各个子目标区域的甲基化检测引物对以后,对每对检测引物对设计相应的检测探针,检测探针均为TaqMan探针,探针5’端为荧光基团,探针3’端为荧光淬灭基团,要求检测引物对与检测探针之间、检测探针与目标区域之间无非特异性结合。最后在荧光定量PCR体系中验证甲基化检测引物对和检测探针联用的效果,保留具有指数扩增期的检测引物对和检测探针作为最终的检测产品。通过上述方法,最终筛选得到可检测目标区域的正链的甲基化检测引物对和检测探针7对,得到可检测目标区域负链的甲基化检测引物对和检测探针4对。针对目标区域的甲基化检测引物对和检测探针的序列如表1所示,每对甲基化检测检测引物对和检测探针可识别的甲基化的胞嘧啶位点如表2所示,每对甲基化检测引物对的扩增子片段及其对应的未转化的片段的序列(即子目标区域)如表3所示。
OLIG3基因Chr6:137493196-137494301区域的正链DNA的序列(SEQ ID NO.1):GGAGTCTGAGATCTCTCAGACAGCGTGGGAGGCTGCGGGCCCCGGAGCCTGCCCTCCCGTGGGCCGAGCGTGCAGCCTCCCTCTTCCCTCCCGGCCCGGCACCGCGGCCCCTCCCGCCGCTCTCCCTCCTCCTTGGCAGCCGGGCCCGCCCGCTGCTCACTTGAGCAAGTCCTTGGACTCGGCCGACAGCCGGGCCATGTTGGCTGTGGAGAGAGCGGACAGGTGCGGCGGCGGCGGCATCTGGCAGATGGTGCAGGGGCAGGGCAGACCAGCCCAGTGCTGGAAGCCGCTGCCCAGCTGCAGCGCGGGCGGCGTGGAGGGCGCCTTGAGTAGCGAGTGGGGAGGCCGGATGGTGCCGATGGCGGGAAGTGAGGCGGCGGACAGCGGTGACGAGGCGTTGCCAGATGAGAGCGCGCCGCCCAAGATGGGGTGCACCGGGTGCACGGAGTTGGCCGCGTGCGCGGGGTGGCCGGCCGAGTGGCCCACGGTCCCGCAGTGAAAGGCCGAGTGGTGGCCCCCATAGATCTCGCCAACCAGCCTCTTCATCTCCTCCAGGGAGCTGGTGAGCATGAGGATGTAGTTTCTGGCGAGCAGGAGTGTGGCGATCTTGGAGAGCTTGCGCACCGACGGCCCATGCGCGTAGGGCATGACTTCGCGCAGCCCGTCCATGGCTAGGTTCAGGTCGTGCATCCGCTTGCGTTCGCGTCCGTTGATCTTCAGCCTCAACTGCTGTAGGTCCTGCTCCGACAGCTGCTTCTTGATTTTGTACTTGCTGCTCTCTCCCGCGGCCTTGGCGCCAGCCCGCGAGAGGCTTTCCCCGGGCATCTTCTGCATCATATCGCCCTGCGTGGACGAGACCGAGTTGAGACGGCTCTCCTGGTGGTGGTGGTGGCGGTGGTGGTGGTCCCTCAGGTACATCTCATCCATGTCCGGAGATGAAGCTCTGCTGGAGACAGAGCTCGAATCAGAATTCATTTTATTACAGGGGATGCGGCCCTACCGTGGGGAGGCTTTAGGCGGGAAATTAAAGAAAATCTTGAATTAAAAAAAAAAAATCTGCACTGCCCAGGAACCCACTTCTCCGCGGCAAGACGTGAGAAGAAAAG
OLIG3基因Chr6:137493196-137494301区域完全甲基化的正链DNA经转化后的序列(SEQ ID NO.2):GGAGTTTGAGATTTTTTAGATAGCGTGGGAGGTTGCGGGTTTCGGAGTTTGTTTTTTCGTGGGTCGAGCGTGTAGTTTTTTTTTTTTTTTTCGGTTCGGTATCGCGGTTTTTTTCGTCGTTTTTTTTTTTTTTTGGTAGTCGGGTTCGTTCGTTGTTTATTTGAGTAAGTTTTTGGATTCGGTCGATAGTCGGGTTATGTTGGTTGTGGAGAGAGCGGATAGGTGCGGCGGCGGCGGTATTTGGTAGATGGTGTAGGGGTAGGGTAGATTAGTTTAGTGTTGGAAGTCGTTGTTTAGTTGTAGCGCGGGCGGCGTGGAGGGCGTTTTGAGTAGCGAGTGGGGAGGTCGGATGGTGTCGATGGCGGGAAGTGAGGCGGCGGATAGCGGTGACGAGGCGTTGTTAGATGAGAGCGCGTCGTTTAAGATGGGGTGTATCGGGTGTACGGAGTTGGTCGCGTGCGCGGGGTGGTCGGTCGAGTGGTTTACGGTTTCGTAGTGAAAGGTCGAGTGGTGGTTTTTATAGATTTCGTTAATTAGTTTTTTTATTTTTTTTAGGGAGTTGGTGAGTATGAGGATGTAGTTTTTGGCGAGTAGGAGTGTGGCGATTTTGGAGA GTTTGCGTATCGACGGTTTATGCGCGTAGGGTATGATTTCGCGTAGTTCGTTTATGGTTAGGTTTAGGTCGTGTATTCGTTTGCGTTCGCGTTCGTTGATTTTTAGTTTTAATTGTTGTAGGTTTTGTTTCGATAGTTGTTTTTTGATTTTGTATTTGTTGTTTTTTTTCGCGGTTTTGGCGTTAGTTCGCGAGAGGTTTTTTTCGGGTATTTTTTGTATTATATCGTTTTGCGTGGACGAGATCGAGTTGAGACGGTTTTTTTGGTGGTGGTGGTGGCGGTGGTGGTGGTTTTTTAGGTATATTTTATTTATGTTCGGAGATGAAGTTTTGTTGGAGATAGAGTTCGAATTAGAATTTATTTTATTATAGGGGATGCGGTTTTATCGTGGGGAGGTTTTAGGCGGGAAATTAAAGAAAATTTTGAATTAAAAAAAAAAAATTTGTATTGTTTAGGAATTTATTTTTTCGCGGTAAGACGTGAGAAGAAAAG
OLIG3基因Chr6:137493196-137494301区域完全未甲基化的正链DNA经转化后的序列(SEQ ID NO.3):
GGAGTTTGAGATTTTTTAGATAGTGTGGGAGGTTGTGGGTTTTGGAGTTTGTTTTTTTGTGGGTTGAGT
GTGTAGTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTTGGTATTGTGGTTTTTTTTGTTGTTTTTTTTTTTTTTTGGTAGTT
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OLIG3基因Chr6:137493196-137494301区域的负链DNA序列(SEQ ID NO.4):CTTTTCTTCTCACGTCTTGCCGCGGAGAAGTGGGTTCCTGGGCAGTGCAGATTTTTTTTTTTTAATTCAAGATTTTCTTTAATTTCCCGCCTAAAGCCTCCCCACGGTAGGGCCGCATCCCCTGTAATAAAATGAATTCTGATTCGAGCTCTGTCTCCAGCAGAGCTTCATCTCCGGACATGGATGAGATGTACCTGAGGGACCACCACCACCGCCACCACCACCACCAGGAGAGCCGTCTCAACTCGGTCTCGTCCACGCAGGGCGATATGATGCAGAAGATGCCCGGGGAAAGCCTCTCGCGGGCTGGCGCCAAGGCCGCGGGAGAGAGCAGCAAGTACAAAATCAAGAAGCAGCTGTCGGAGCAGGACCTACAGCAGTTGAGGCTGAAGATCAACGGACGCGAACGCAAGCGGATGCACGACCTGAACCTAGCCATGGACGGGCTGCGCGAAGTCATGCCCTACGCGCATGGGCCGTCGGTGCGCAAGCTCTCCAAGATCGCCACACTCCTGCTCGCCAGAAACTACATCCTCATGCTCACCAGCTCCCTGGAGGAGATGAAGAGGCTGGTTGGCGAGATCTATGGGGGCCACCACTCGGCCTTTCACTGCGGGACCGTGGGCCACTCGGCCGGCCACCCCGCGCACGCGGCCAACTCCGTGCACCCGGTGCACCCCATCTTGGGCGGCGCGCTCTCATCTGGCAACGCCTCGTCACCGCTGTCCGCCGCCTCACTTCCCGCCATCGGCACCATCCGGCCTCCCCACTCGCTACTCAAGGCGCCCTCCACGCCGCCCGCGCTGCAGCTGGGCAGCGGCTTCCAGCACTGGGCTGGTCTGCCCTGCCCCTGCACCATCTGCCAGATGCCGCCGCCGCCGCACCTGTCCGCTCTCTCCACAGCCAACATGGCCCGGCTGTCGGCCGAGTCCAAGGACTTGCTCAAGTGAGCAGCGGGCGGGCCCGGCTGCCAAGGAGGAGGGAGAGCGGCGGGAGGGGCCGCGGTGCCGGGCCGGGAGGGAAGAGGGAGGCTGCACGCTCGGCCCACGGGAGGGCAGGCTCCGGGGCCCGCAGCCTCCCACGCTGTCTGAGAGATCTCAGACTCC
OLIG3基因Chr6:137493196-137494301区域完全甲基化的负链DNA经转化后的序列(SEQ ID NO.5):TTTTTTTTTTTACGTTTTGTCGCGGAGAAGTGGGTTTTTGGGTAGTGTAGATTTTTTTTTTTTAATTTAA GATTTTTTTTAATTTTTCGTTTAAAGTTTTTTTACGGTAGGGTCGTATTTTTTGTAATAAAATGAATTTTGATTCGAGTTTTGTTTTTAGTAGAGTTTTATTTTCGGATATGGATGAGATGTATTTGAGGGATTATTATTATCGTTATTATTATTATTAGGAGAGTCGTTTTAATTCGGTTTCGTTTACGTAGGGCGATATGATGTAGAAGATGTTCGGGGAAAGTTTTTCGCGGGTTGGCGTTAAGGTCGCGGGAGAGAGTAGTAAGTATAAAATTAAGAAGTAGTTGTCGGAGTAGGATTTATAGTAGTTGAGGTTGAAGATTAACGGACGCGAACGTAAGCGGATGTACGATTTGAATTTAGTTATGGACGGGTTGCGCGAAGTTATGTTTTACGCGTATGGGTCGTCGGTGCGTAAGTTTTTTAAGATCGTTATATTTTTGTTCGTTAGAAATTATATTTTTATGTTTATTAGTTTTTTGGAGGAGATGAAGAGGTTGGTTGGCGAGATTTATGGGGGTTATTATTCGGTTTTTTATTGCGGGATCGTGGGTTATTCGGTCGGTTATTTCGCGTACGCGGTTAATTTCGTGTATTCGGTGTATTTTATTTTGGGCGGCGCGTTTTTATTTGGTAACGTTTCGTTATCGTTGTTCGTCGTTTTATTTTTCGTTATCGGTATTATTCGGTTTTTTTATTCGTTATTTAAGGCGTTTTTTACGTCGTTCGCGTTGTAGTTGGGTAGCGGTTTTTAGTATTGGGTTGGTTTGTTTTGTTTTTGTATTATTTGTTAGATGTCGTCGTCGTCGTATTTGTTCGTTTTTTTTATAGTTAATATGGTTCGGTTGTCGGTCGAGTTTAAGGATTTGTTTAAGTGAGTAGCGGGCGGGTTCGGTTGTTAAGGAGGAGGGAGAGCGGCGGGAGGGGTCGCGGTGTCGGGTCGGGAGGGAAGAGGGAGGTTGTACGTTCGGTTTACGGGAGGGTAGGTTTCGGGGTTCGTAGTTTTTTACGTTGTTTGAGAGATTTTAGATTTT
OLIG3基因Chr6:137493196-137494301区域完全未甲基化的负链DNA经转化后的序列(SEQ ID NO.6):
TTTTTTTTTTTATGTTTTGTTGTGGAGAAGTGGGTTTTTGGGTAGTGTAGATTTTTTTTTTTTAATTTAAG
ATTTTTTTTAATTTTTTGTTTAAAGTTTTTTTATGGTAGGGTTGTATTTTTTGTAATAAAATGAATTTTGAT
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表1、甲基化检测引物对和检测探针
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表2、甲基化检测引物对和检测探针可识别的甲基化的胞嘧啶位点
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表3、子目标区域的核苷酸序列
/>
实施例2、采用目标区域的甲基化水平检测组织样本的性能
1.组织样本收集
本实施例收集了经病理活检确诊为头颈鳞状细胞癌患者(即口腔、咽部或喉部出现癌变的患者)的癌组织样本和对应的癌旁正常组织样本各96例。所有的组织样本为***浸泡、石蜡包埋的组织样本。所有组织样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者签署了知情同意书,所有组织样本采用匿名化处理。
2.组织样本DNA提取
对于组织样本,使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(56404)提取DNA,具体操作按照试剂盒说明书进行。
3.组织样本DNA转化和纯化
将提取好的样本基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化和转化后的纯化,所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843),具体实验操作参见试剂盒说明书。
4.甲基化特异性荧光定量PCR反应
以转化后的样本DNA作为模板,分别使用表1中提供的检测引物对和检测探针进行甲基化荧光定量PCR反应来扩增各个子目标区域。具体地,按照表4提供的配方配置PCR扩增体系,配方中用到的DNA聚合酶及缓冲液等成分均购自Invitrogen(Cat:14966005)。需要说明的是,在进行每一个PCR反应时,需要同时检测内参基因ACTB的量,用于监测样本质量及结果判读。本发明中用到的扩增ACTB基因片段的上游引物序列为:5’-AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG-3’(SEQ ID NO.62),扩增ACTB基因片段的下游引物序列为:5’-AATAACACCCCCACCCTGC-3’(SEQ ID NO.63),与之对应的检测探针序列为:5’-VIC-GGAGTGGTTTTTGGGTTTG-BHQ1-3’(SEQ ID NO.64),该检测探针的5’端荧光基团为VIC,3’端荧光淬灭基团为BHQ1。在每个PCR反应体系中,子目标区域检测探针的5’端荧光基团为FAM,3’端荧光淬灭基团为MGB。此外,在检测生物样本中每一个子目标区域时,需要同时设置质控实验,即需要设置阳性对照PCR管和阴性对照PCR管。对于某一子目标区域,阳性对照PCR管和阴性对照PCR管的配置体系与实验测试PCR管相同,但是阳性对照PCR管的模板为103拷贝/微升的含转化后该子目标区域的质粒和103拷贝/微升的含转化后ACTB基因片段的质粒等体积混合而成,阴性对照PCR管的模板为TE缓冲液。当阳性对照PCR管、实验测试PCR管和阴性对照PCR管的体系配置完成后,按照表5提供的程序在荧光定量PCR仪上进行反应。
表4、PCR反应体系
表5、PCR反应程序
qPCR反应结束后,调整基线,并设置阈值,阈值必须位于指数扩增期内,穿越阈值与X轴平行的直线称为阈值线,阈值线与扩增曲线的交点所对应的循环数即为Ct值。分析qPCR反应的结果,要求:①阴性对照PCR管无扩增(即不起线);②阳性对照PCR管有明显的指数增长期,且阳性对照PCR管目标基因的Ct值在26~30之间;③待测样本的内参基因的Ct值小于等于33。若阳性对照、阴性对照和内参基因均满足上述要求,则可以分析待测样本的检测结果并进行结果判读,否则,当次实验无效,必须重新进行检测。
5.结果判定
对于组织样本,在扩增某一子目标区域的Ct值≤37的条件下,认为该组织样本在此区域为甲基化阳性,则判定该组织样本为头颈鳞状细胞癌阳性样本;在扩增某一目标区域的Ct值>37的条件下,认为该组织样本在此区域为甲基化阴性,则判定该组织样本为头颈鳞状细胞癌阴性样本。
通过甲基化荧光定量PCR法检测OLIG3基因Chr6:137493196-137494301区域各个子区域的甲基化水平,进而判断组织样本是否为头颈鳞状细胞癌阳性样本的性能如表6所示,表中的灵敏度为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例,特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。
表6、采用各个子目标区域检测头颈癌组织样本的性能
子目标区域 | 甲基化阳性(例) | 灵敏度(%) | 甲基化阴性(例) | 特异性(%) |
区域1 | 87 | 90.63 | 90 | 93.75 |
区域2 | 78 | 81.25 | 85 | 88.54 |
区域3 | 92 | 95.83 | 89 | 92.71 |
区域4 | 84 | 87.50 | 81 | 84.38 |
区域5 | 91 | 94.79 | 85 | 88.54 |
区域6 | 81 | 84.38 | 87 | 90.63 |
区域7 | 87 | 90.63 | 91 | 94.79 |
区域8 | 80 | 83.33 | 88 | 91.67 |
区域9 | 90 | 93.75 | 85 | 88.54 |
区域10 | 89 | 92.71 | 89 | 92.71 |
区域11 | 82 | 85.42 | 86 | 89.58 |
由表6可以看出,通过甲基化荧光定量PCR法检测目标区域中各个子区域的甲基化水平,进而诊断头颈鳞状细胞癌组织样本的效果很好。具体地,区域1~区域11诊断头颈鳞状细胞癌组织样本的灵敏度均高于81%;其检测癌旁正常组织样本的特异性均高于84%。区域1、区域3、区域5、区域7、区域9和区域10检测癌组织样本的灵敏度均高于90%;区域1、区域3、区域6、区域7、区域8和区域10检测癌旁正常组织样本的特异性均高于90%。综上,区域1、区域3、区域7和区域10诊断头颈鳞状细胞癌组织样本的性能最佳。
实施例3、采用目标区域的甲基化水平检测血浆样本的性能
1.样本收集
共招募169名志愿者,其中有78名为经病理组织活检确诊为口腔鳞状细胞癌的患者,剩余91名志愿者为健康人,每名志愿者抽取大于8mL静脉血。所有血浆样本收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者签署了知情同意书。
2.样本DNA提取
新鲜的抗凝血样本经离心后,吸取上层血浆层,用于提取血浆游离DNA。使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取,具体操作按照试剂盒说明书进行。
3.样本DNA的转化和纯化
得到cfDNA以后,采用武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)对其进行DNA的转化,随后对转化的DNA进行纯化,用于后续实验,具体操作步骤参见试剂盒说明书。
4.甲基化特异性荧光定量PCR反应
以转化后的样本DNA作为模板,分别使用表1中提供的检测引物对和检测探针进行甲基化荧光定量PCR反应来扩增各个子目标区域,具体的操作步骤同实施例2,PCR反应的阳性对照管、阴性对照管的配置,及Ct值的读取和质量控制同实施例2。
5.结果判定
对于血浆样本,在扩增某一子目标区域的Ct值≤48的条件下,认为该血浆样本在此区域为甲基化阳性,则该血浆样本为口腔鳞状细胞癌阳性样本;在扩增某一目标区域的Ct值>48的条件下,认为该血浆样本在此区域为甲基化阴性,则该血浆样本为口腔鳞状细胞癌阴性样本。
通过甲基化荧光定量PCR法检测OLIG3基因Chr6:137493196-137494301区域各个子区域的甲基化水平,进而判断血浆样本是否为口腔鳞状细胞癌阳性样本的性能如表7所示,表中的灵敏度为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例,特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。
表7、采用各个子目标区域检测口腔鳞状细胞癌血浆样本的性能
子目标区域 | 甲基化阳性(例) | 灵敏度(%) | 甲基化阴性(例) | 特异性(%) |
区域1 | 62 | 79.49 | 88 | 96.70 |
区域2 | 55 | 70.51 | 84 | 92.31 |
区域3 | 67 | 85.90 | 87 | 95.60 |
区域4 | 57 | 73.08 | 80 | 87.91 |
区域5 | 64 | 82.05 | 86 | 94.51 |
区域6 | 56 | 71.79 | 90 | 98.90 |
区域7 | 61 | 78.21 | 85 | 93.41 |
区域8 | 58 | 74.36 | 81 | 89.01 |
区域9 | 63 | 80.77 | 82 | 90.11 |
区域10 | 62 | 79.49 | 87 | 95.60 |
区域11 | 59 | 75.64 | 89 | 97.80 |
由表7可以看出,通过甲基化荧光定量PCR法检测目标区域中各个子区域的甲基化水平,进而诊断口腔鳞状细胞癌血浆样本的性能优异。区域1~区域11诊断口腔鳞状细胞癌血浆样本的灵敏度均高于70%,区域3的检测灵敏度最高,可达85.90%;区域1~区域11诊断健康人血浆样本的特异性均高于87%,区域6的检测特异性最高,可达98.90%。区域1、区域3、区域5、区域7、区域9、区域10和区域11检测口腔鳞状细胞癌血浆样本的灵敏度均高于75%;区域1、区域2、区域3、区域5、区域6、区域7、区域9、区域10和区域11检测健康人血浆样本的特异性均高于90%。综上,区域1、区域3、区域5、区域7、区域9、区域10和区域11诊断口腔鳞状细胞癌血浆样本的效果较好,其中区域3诊断效果最佳。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合,为使描述简洁,未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为在本说明书记载的范围中。
Claims (10)
1.检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备头颈鳞状细胞癌诊断产品中的应用;
以GRCh38.p14为参考,所述目标区域为Chr6:137493196-137494301或者其部分区域。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述部分区域包括如下定义的区域1至区域11中的一个或者多个:
区域1为Chr6:137493196-137493305,正链;
区域2为Chr6:137493358-137493519,正链;
区域3为Chr6:137493512-137493649,正链;
区域4为Chr6:137493664-137493803,正链;
区域5为Chr6:137493804-137493898,正链;
区域6为Chr6:137493921-137494067,正链;
区域7为Chr6:137494135-137494301,正链;
区域8为Chr6:137493920-137494054,负链;
区域9为Chr6:137493817-137493919,负链;
区域10为Chr6:137493573-137493687,负链;和
区域11为Chr6:137493200-137493308,负链。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区域的甲基化水平的检测:甲基化特异性PCR法、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组亚硫酸氢盐测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和甲基化特异性荧光定量PCR法。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述试剂包括检测所述目标区域甲基化水平的检测引物对以及检测探针。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述检测引物对以及检测探针选自如下一组或者多组:
(1)检测所述区域1的检测引物对如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示,检测探针如SEQID No.9所示;
(2)检测所述区域2的检测引物对如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示,检测探针如SEQ ID No.12所示;
(3)检测所述区域3的检测引物对如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示,检测探针如SEQ ID No.15所示;
(4)检测所述区域4的检测引物对如SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示,检测探针如SEQ ID No.18所示;
(5)检测所述区域5的检测引物对如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示,检测探针如SEQ ID No.21所示;和,
(6)检测所述区域6的检测引物对如SEQ ID No.22和SEQ ID No.23所示,检测探针如SEQ ID No.24所示;
(7)检测所述区域7的检测引物对如SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示,检测探针如SEQ ID No.27所示;
(8)检测所述区域8的检测引物对如SEQ ID No.28和SEQ ID No.29所示,检测探针如SEQ ID No.30所示;
(9)检测所述区域9的检测引物对如SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示,检测探针如SEQ ID No.33所示;
(10)检测所述区域10的检测引物对如SEQ ID No.34和SEQ ID No.35所示,检测探针如SEQ ID No.36所示;和,
(11)检测所述区域10的检测引物对如SEQ ID No.37和SEQ ID No.38所示,检测探针如SEQ ID No.39所示。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述试剂还包含检测内参基因的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针;所述内参基因包含ACTB基因;
可选地,检测所述ACTB基因的检测引物对如SEQ ID NO.62和SEQ ID NO.63所示,以及检测探针如SEQ ID NO.64所示。
7.根据权利要求1、2、4至6中任一项所述的应用,其特征在于,检测的样本类型包括血浆样本、细胞样本或者组织样本。
8.一种头颈鳞状细胞癌诊断试剂盒,其特征在于,包括权利要求1至7任一项所定义的试剂。
9.根据权利要求8所述的头颈鳞状细胞癌诊断试剂盒,其特征在于,所述诊断试剂盒还包括测序试剂、扩增试剂、将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂、DNA提取试剂和纯化试剂中的一种或者多种。
10.根据权利要求9所述的头颈鳞状细胞癌诊断试剂盒,其特征在于,所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或者多种。
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