CN117144012A - 一种用于肺腺癌检测的甲基化分子标志物、试剂盒及应用 - Google Patents
一种用于肺腺癌检测的甲基化分子标志物、试剂盒及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117144012A CN117144012A CN202311241298.0A CN202311241298A CN117144012A CN 117144012 A CN117144012 A CN 117144012A CN 202311241298 A CN202311241298 A CN 202311241298A CN 117144012 A CN117144012 A CN 117144012A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- methylation
- lung adenocarcinoma
- primer pair
- detection
- kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000011987 methylation Effects 0.000 title claims abstract description 158
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 158
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 title claims abstract description 117
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 title claims abstract description 115
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 109
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 121
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 36
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 24
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 24
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 13
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 10
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 10
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 9
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 8
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 24
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 10
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 6
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 95
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 49
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 description 30
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 25
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 17
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 15
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 14
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 11
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 10
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 7
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 6
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 6
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 6
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000007855 methylation-specific PCR Methods 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 5
- 101150087690 ACTB gene Proteins 0.000 description 4
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 3
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 3
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012549 training Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- JTNCEQNHURODLX-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethanimidamide Chemical compound NC(=N)CC1=CC=CC=C1 JTNCEQNHURODLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 2
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013276 bronchoscopy Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000006607 hypermethylation Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229910000343 potassium bisulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- AOSFMYBATFLTAQ-UHFFFAOYSA-N 1-amino-3-(benzimidazol-1-yl)propan-2-ol Chemical compound C1=CC=C2N(CC(O)CN)C=NC2=C1 AOSFMYBATFLTAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003170 Bronchiolo-Alveolar Adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 108010076804 DNA Restriction Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- -1 MGB Chemical compound 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical class OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- BIGPRXCJEDHCLP-UHFFFAOYSA-N ammonium bisulfate Chemical compound [NH4+].OS([O-])(=O)=O BIGPRXCJEDHCLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000003150 biochemical marker Substances 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- JXRVKYBCWUJJBP-UHFFFAOYSA-L calcium;hydrogen sulfate Chemical compound [Ca+2].OS([O-])(=O)=O.OS([O-])(=O)=O JXRVKYBCWUJJBP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- MEAHOQPOZNHISZ-UHFFFAOYSA-M cesium;hydrogen sulfate Chemical compound [Cs+].OS([O-])(=O)=O MEAHOQPOZNHISZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 150000002429 hydrazines Chemical class 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M hydrogensulfate Chemical compound OS([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 201000004933 in situ carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 208000003849 large cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000007854 ligation-mediated PCR Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 208000024191 minimally invasive lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-O pyridinium Chemical compound C1=CC=[NH+]C=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M sodium bisulfate Chemical compound [Na+].OS([O-])(=O)=O WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000342 sodium bisulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物医药领域,更具体地,涉及一种用于肺腺癌检测的甲基化分子标志物、试剂盒及应用。本发明通过检测样本中目标区域(Chr1:63319871‑63320048负链和/或Chr2:468298‑468435正链)的甲基化水平能够对肺腺癌进行检测,提供了能够用于肺腺癌检测的甲基化分子标志物。本发明提供的试剂盒对肺腺癌血液样本具有优异的检测效果,检测准确度高,为肺腺癌的无创或微创检测以及早期筛查提供了一种新的思路。此外,该试剂盒对不同病理分期的肺腺癌均具有较高的检测灵敏度和特异性,有利于肺腺癌的早期检出。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,更具体地,涉及一种用于肺腺癌检测的甲基化分子标志物、试剂盒及应用。
背景技术
非小细胞型肺癌包括鳞状细胞癌(鳞癌)、腺癌、大细胞癌。其中肺腺癌占肺癌总数的40%~50%,为最常见的肺癌类型。肺腺癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势,且5年生存率很低。其主要原因是早期肺腺癌缺少典型的临床症状,当患者在被确诊时都处于中晚期,或已经出现转移,因此肺腺癌早筛早诊是减少死亡及改善预后的关键因素。目前肺癌诊断常用的方法有影像学检查、痰脱落细胞学和支气管镜检,这些方法容易造成漏诊和误诊,且仪器设备昂贵。
DNA甲基化对于癌基因和抑癌基因的转录、表达有着深远影响,异常的DNA甲基化导致癌基因和抑癌基因功能紊乱,且其通常发生在癌症的早期;另外,癌变的细胞由于其细胞间黏附分子的表达降低,往往更易脱落或转移,且发生癌变的细胞可通过凋亡、坏死或主动分泌的方式将基因组DNA以片段化的方式释放到体液中,可通过检测体液样本中循环的肿瘤DNA的甲基化水平来诊断肺腺癌。因此,探索能够用于肺腺癌早期诊断的甲基化分子标志物具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的缺陷,本发明的目的在于提供一种用于肺腺癌检测的甲基化分子标志物、试剂盒及应用,以改善现有技术对肺腺癌的检测准确度低、缺少对不同病理分期的肺腺癌均具有优异检测效果的甲基化分子标志物等的技术问题。
为实现上述目的,本发明提供了一种用于肺腺癌检测的甲基化分子标志物,以GRCh38.p14为参考基因组,所述甲基化分子标志物选自Chr1:63319871-63320048负链的全长区域或部分区域,和/或,Chr2:468298-468435正链的全长区域或部分区域。
本发明还提供了一种用于肺腺癌检测的试剂盒,其包括用于检测权利要求1所述的甲基化分子标志物的甲基化水平的引物对,和/或检测探针。
优选地,所述引物对包括用于检测Chr1:63319871-63320048负链和/或Chr2:468298-468435正链的甲基化水平的甲基化引物对。
优选地,所述甲基化引物对包括用于检测Chr1:63319871-63320048负链的甲基化水平的第一甲基化引物对,和/或,用于检测Chr2:468298-468435正链的甲基化水平的第二甲基化引物对。
进一步优选地,所述第一甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7~8所示,所述第二甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11~12所示。
优选地,所述引物对还包括用于检测Chr1:63319871-63320048负链和/或Chr2:468298-468435正链的甲基化水平的非甲基化引物对。
进一步优选地,所述引物对包括如下组合中的至少一组:
SEQ ID NO.7~8所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.9~10所示的第一非甲基化引物对;
SEQ ID NO.11~12所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.13~14所示的第二非甲基化引物对。
优选地,所述试剂盒包括用于检测Chr1:63319871-63320048负链的甲基化水平的第一甲基化引物对和第一检测探针,和/或,用于检测Chr2:468298-468435正链的甲基化水平的第二甲基化引物对和第二检测探针。
进一步优选地,所述试剂盒包括如下组合中的至少一组:
SEQ ID NO.7~8所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.18所示的第一检测探针;
SEQ ID NO.11~12所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.19所示的第二检测探针。
优选地,所述试剂盒还包括内参基因的检测引物对及检测探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
优选地,所述检测探针和所述内参基因的检测探针的5’端包含有荧光报告基团,3’端包含有荧光淬灭基团。
本发明还提供了所述甲基化分子标志物或所述试剂盒在制备肺腺癌检测产品中的应用。
优选地,所述肺腺癌包括Ⅰ期肺腺癌、Ⅱ期肺腺癌、Ⅲ期肺腺癌和Ⅳ期肺腺癌中的至少一种。
优选地,所述肺腺癌检测产品包括试剂盒、芯片和测序文库中的一种或多种。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,具有以下有益效果:
本发明提供的一种用于肺腺癌检测的甲基化分子标志物、试剂盒,通过检测样本中目标区域(Chr1:63319871-63320048负链和/或Chr2:468298-468435正链)的甲基化水平能够对肺腺癌进行检测,提供了能够用于肺腺癌检测的甲基化分子标志物。本发明提供的试剂盒对肺腺癌血液样本具有优异的检测效果,检测准确度高,为肺腺癌的无创或微创检测以及早期筛查提供了一种新的思路。此外,该试剂盒对不同病理分期的肺腺癌均具有较高的检测灵敏度和特异性,其检测Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期肺腺癌血浆样本的灵敏度分别可达80.6%、82.8%、88.9%、100%,有利于肺腺癌的早期检出。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
术语“诊断”是指确定受试者的健康状态,涵盖检测疾病的存在与否、对治疗手段的反应、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。在一些情况下,术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态。一些实施例中,“检测”肺腺癌是指检测疾病的存在与否,即判断受试者是否患有肺腺癌。
术语“患者”或“受试者”是指接受观察、检测或实验的对象。一些实施例中,受试者可以是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于灵长类(包括人和非人灵长类)以及啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)。一些实施例中,哺乳动物可以是人。
术语“样本”或“样品”是指从对象获得的生物材料并且包含来自全部染色体的基因组DNA,优选覆盖整个基因组的基因组DNA。如果对象患有癌症,则样品包含癌细胞或来自癌细胞的游离基因组DNA(包括靶DNA),优选来自癌细胞的循环基因组DNA。样品可以来自于任何合适的组织或生物流体,例如血液、唾液、血浆、血清、尿液、脑脊液(CSF)、粪便、颊或颊-咽拭子、外科手术样本、从活检获得的样本、或者包埋在石蜡中的组织样品。从对象获得样品的方法是本领域技术人员公知的。优选地,所述样品是肿瘤活组织或液体样品。液体样品优选为血液、血清、血浆。在癌症是肺腺癌的情况下,还考虑样品包含来自支气管镜检查(包括支气管灌洗、支气管肺泡灌洗、支气管刷检或支气管磨损)或者来自痰液或唾液的物质。通常来说,在包含来自肺腺癌细胞的靶DNA,尤其是细胞外靶DNA的样品中,还存在来自非癌细胞的与来自癌细胞的靶DNA相反未高甲基化的靶DNA。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子,优选多于三个,并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素,而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以通过任何方式产生,包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式,能够在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而调控基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数,既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中,可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下,可根据样本检测的Ct值进行比较;在一些情况下,可计算样本中基因甲基化的比例,即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100,然后再进行比较;在一些情况下,还需要对各个指标进行统计学上的分析整合,得出最终的判定指标。
术语“分子标志物”是指可以标记***、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标,如蛋白质、DNA或RNA等。分子标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。筛选可用于疾病筛查、早期诊断的分子标志物可大大提高患者的临床治疗效果。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应,PCR)中,基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常,用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素,包括温度、引物来源以及所用方法等。例如,对于诊断和预后应用,根据靶序列的复杂度,寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸,但是也可以含有更少的核苷酸。在本发明公开内容中,术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指上游引物和下游引物组成的组。
术语“亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite Sequencing PCR,BSP)”是通过对基因组DNA进行重亚硫酸盐处理,非甲基化的胞嘧啶被脱氨基而转变成尿嘧啶,在随后的PCR反应中尿嘧啶转变成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不能被脱氨基,在反应完成时被保留;然后在非甲基化区域设计引物进行PCR扩增,将扩增得到的PCR产物进行克隆测序,将测得的序列与原始序列比对,统计甲基化位点及数量,并分析甲基化程度。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一,能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后,所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶,而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变,因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物,通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。在本公开内容中,进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物,若Ct值满足所述要求(例如在组织样本中Ct≤38),则表明目标序列是甲基化的。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对,从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来,qMSP最终的检测指标为荧光信号,因此,在qMSP反应***中,除加入甲基化引物对以外,还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比,qMSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高,更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段,且该技术不需要凝胶电泳检测,操作更加简便。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光报告基团和3’荧光淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时,因为荧光报告基团附近存在荧光淬灭基团,探针不会发出荧光。在扩增过程中,如果探针与被扩增的链结合,DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针,荧光基团远离淬灭基团,其能量不被吸收,即产生荧光信号。每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步指数增长的过程。
术语“AUC”是“曲线下面积”的缩写。具体地,其是指接受者操作特征(ROC)曲线下面积。ROC曲线是诊断测试的不同可能切割点的真阳性率相比于假阳性率的图。其取决于所选择切割点的灵敏度与特异性之间的权衡(灵敏度的任何增加将伴随着特异性的降低)。ROC曲线下面积(AUC)是诊断测试准确度的度量(面积越大越好;最佳值是1;随机测试将具有位于对角线上的ROC曲线,面积为0.5)。
DNA甲基化(DNA methylation)是表型修饰的一种,与癌症的发生密切相关。尤其是CpG岛区的启动子超甲基化可能会导致抑癌基因转录沉默,从而影响肿瘤发生的进程。由于DNA甲基化几乎在所有癌症中均有发现,并且多发生在癌前或者癌症早期阶段,因而有望成为癌症早期诊断的理想标志物。通过对特定区域的甲基化情况进行检测,可有效提高肺腺癌的诊断效能,相关的甲基化检测也渐渐从科研走向临床应用。
本发明提供了一种用于肺腺癌检测的甲基化分子标志物,以GRCh38.p14为参考基因组,上述甲基化分子标志物选自Chr1:63319871-63320048负链的全长区域或部分区域,和/或,Chr2:468298-468435正链的全长区域或部分区域。
本申请的发明人发现,上述区域在肺腺癌组织样本中的甲基化水平显著高于正常样本,用上述区域作为用于检测肺腺癌的甲基化分子标志物,通过检测样本中上述区域的全长或部分区域的甲基化水平,可以有效区分肺腺癌患者和健康人,可帮助评估受试者(对象)是否存在肺腺癌或者是否存在肺腺癌的风险,为肺腺癌的检测提供参考。
本发明还提供了一种用于肺腺癌检测的试剂盒,其包括用于检测上述甲基化分子标志物的甲基化水平的引物对,和/或检测探针。
可以理解的是,在检测上述甲基化分子标志物的甲基化水平时,可以针对上述任一甲基化分子标志物的全长区域进行检测,还可以针对上述任一甲基化分子标志物的部分区域进行检测。
一些实施例中,上述引物对包括用于检测Chr1:63319871-63320048负链和/或Chr2:468298-468435正链的甲基化水平的甲基化引物对。
一些实施例中,上述甲基化引物对包括用于检测Chr1:63319871-63320048负链的甲基化水平的第一甲基化引物对,和/或,用于检测Chr2:468298-468435正链的甲基化水平的第二甲基化引物对。
较佳实施例中,上述第一甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7~8所示,上述第二甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11~12所示。
一些实施例中,上述引物对还包括用于检测Chr1:63319871-63320048负链和/或Chr2:468298-468435正链的甲基化水平的非甲基化引物对。
一些实施例中,上述非甲基化引物对包括用于检测Chr1:63319871-63320048负链的甲基化水平的第一非甲基化引物对,和/或,用于检测Chr2:468298-468435正链的甲基化水平的第二非甲基化引物对。
较佳实施例中,上述第一非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.9~10所示,上述第二非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.13~14所示。
更佳实施例中,上述引物对包括如下组合中的至少一组:
SEQ ID NO.7~8所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.9~10所示的第一非甲基化引物对;
SEQ ID NO.11~12所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.13~14所示的第二非甲基化引物对。
需要说明的是,若一种引物对与上述第一甲基化引物对、第一非甲基化引物对、第二甲基化引物对、第二非甲基化引物对所示的核苷酸序列具有至少具有85%(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%等)以上的序列一致性,且该引物对同样具有一定的肺腺癌诊断功能(特异性或灵敏度与本申请引物对相比,相当或略有下降或略有提高或大幅提高等),也在本发明保护范围内。
一些实施例中,上述试剂盒包括用于检测Chr1:63319871-63320048负链的甲基化水平的第一甲基化引物对和第一检测探针,和/或,用于检测Chr2:468298-468435正链的甲基化水平的第二甲基化引物对和第二检测探针。
较佳实施例中,上述试剂盒包括如下组合中的至少一组:
SEQ ID NO.7~8所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.18所示的第一检测探针;
SEQ ID NO.11~12所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.19所示的第二检测探针。
一些实施例中,上述引物对和检测探针可以使用DNA自动合成装置来化学合成,本申请并不对DNA自动合成装置进行限定,本领域技术人员可根据情况进行选择。
一些实施例中,上述试剂盒还包括内参基因的检测引物对及检测探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
一些实施例中,上述内参基因可以为但不限于ACTB。在本发明实施例中,上述内参基因ACTB的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15~16所示,上述内参基因ACTB的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。可以理解的是,在其他实施例中,还可以选择其他内参基因,此时,内参基因的检测引物对和检测探针对应设计即可。
一些实施例中,上述检测探针和上述内参基因的检测探针的5’端包含有荧光报告基团,3’端包含有荧光淬灭基团,上述各探针的荧光报告基团独立地选自FAM、VIC、HEX、NED、ROX、TET、JOE、CY3和CY5中的任意一种;上述各探针的荧光淬灭基团独立地选自TAMRA、MGB、BHQ、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的任意一种。在同一个反应体系中有两个以上检测探针时,不同检测探针上连接的荧光基团不同。可以理解的是,各探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团的举例各自独立地包括但不限于上述所列举。
一些实施例中,上述甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。本发明对甲基化转化试剂无特别限制,现有技术中报道的可实现胞嘧啶到尿嘧啶转化的试剂均可以,如肼盐、重硫酸盐(例如重硫酸钠、重硫酸钾、重硫酸铵)和亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)中的一种或多种。
一些实施例中,上述扩增试剂包括但不限于扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。一些实施例中,上述阳性对照是指其中包含甲基化的分子标志物,用于监测试剂盒中试剂的检测性能。上述阴性对照是指其中不包含甲基化的分子标志物,用于监测实验是否受到污染。
基于本发明公开的内容,本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术对上述多核苷酸分子的甲基化水平进行检测,对肺腺癌进行诊断,无论采用何种技术,其都是属于本发明的保护范围。
一些实施例中,上述甲基化分子标志物的甲基化水平通过如下至少一种方法进行检测:甲基化敏感性随机引物聚合酶链反应(MS AP-PCR)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)、甲基化特异性PCR(qMSP)、甲基化敏感性DNA限制酶分析、基于限制酶的测序、基于限制酶的微阵列分析、联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)、甲基化CpG岛扩增(MCA)、甲基化CpG岛扩增和微阵列(MCAM)、通过连接介导PCR进行的HpaII小片段富集(HELP)、亚硫酸氢盐测序(BSP)、亚硫酸氢盐微阵列分析、甲基化特异性焦磷酸测序、HELP测序(HELP-seq)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、Gal水解和连接衔接子依赖性PCR(GLAD-PCR)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-Seq)或甲基化DNA免疫沉淀-微阵列分析(MeDIP-chip)、使用甲基敏感性限制酶的Southern印迹法和基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。
本发明还提供了上述甲基化分子标志物或上述试剂盒在制备肺腺癌检测产品中的应用,上述肺腺癌检测产品包括试剂盒、芯片和测序文库中的一种或多种。需要说明的是,本发明提供的肺腺癌检测产品并不限于上述所列举的产品,只要能满足肺腺癌的诊断或辅助诊断的需求的产品均在本发明的保护范围内。
在本发明中,术语“肺腺癌”包括不同病理分期的肺腺癌,根据TNM分期***,肺腺癌主要包括Ⅰ期肺腺癌、Ⅱ期肺腺癌、Ⅲ期肺腺癌和Ⅳ期肺腺4种病理分期。在本发明具体实施例中,肺腺癌包括Ⅰ期肺腺癌、Ⅱ期肺腺癌、Ⅲ期肺腺癌和Ⅳ期肺腺癌中的至少一种。
本发明还提供了上述试剂盒用在检测肺腺癌或用在检测患有肺腺癌的风险提高、疑似患有肺腺癌或已经患有肺腺癌的受试者的用途。
本发明还提供了一种通过检测样本中甲基化分子标志物的甲基化水平进而检测肺腺癌的方法,包括如下步骤:
S1、提取受试者的血浆样本DNA,采用甲基化转化试剂对其进行转化,然后对转化后的DNA进行纯化;
S2、采用本发明提供的上述试剂盒进行qPCR扩增,通过MSP法检测上述样本中甲基化分子标志物的甲基化水平;
S3、基于S2的结果,进而判断待测的血浆样本为肺腺癌阴性或阳性。
应当理解的是,本申请提供的用于肺腺癌检测的试剂盒所获得的结果仅作为肺腺癌诊断的中间结果或提示受试者患有肺腺癌的可能性或风险,还需结合个体的临床表现及其他生理指标最终得出是否罹患肺腺癌的结论。
任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请中。除非另有说明,以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品,或者可以通过本领域已知方法制备。
以下结合具体实施例,对上述技术方案详细说明。
实施例1基于Sanger测序法分析目标区域检测组织样本及外周血样本的性能
发明人自行收集了48例临床确诊为肺腺癌的癌组织样本、48例癌旁正常组织样本和48例健康人外周血样本作为训练集,以GRCh38.p14为参考基因组,尝试分别以区域1(Chr1:63319871-63320048负链)、区域2(Chr2:468298-468435正链)作为诊断肺腺癌的甲基化分子标志物,采用Sanger测序法验证其在肺腺癌组织样本和癌旁正常组织样本中的甲基化水平,以明确其是否可作为诊断肺腺癌的甲基化分子标志物,并选择组织灵敏度≥80%,组织特异性≥80%,外周血特异性≥95%的区域进行下一步验证。具体步骤如下:
1.样本收集
上述训练集中的组织样本均为经***固定且经石蜡包埋的样本,外周血样本采自健康受试者,所有样本的收集过程已获得伦理委员会的审批,所有志愿者在样本收集前签署了知情同意书。
2.提取样本DNA
对于石蜡包埋的组织样本,使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(56404)提取组织样本基因组DNA,具体操作按照试剂盒说明书进行。外周血使用采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(目录号:DP304)提取各样本的细胞基因组DNA,具体操作参见试剂盒说明书。
3.亚硫酸氢盐转化
采用武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)对提取的DNA进行亚硫酸氢盐转化,随后对转化的DNA进行纯化,用于后续实验,具体操作步骤参见试剂盒说明书。
4.PCR扩增及Sanger测序
用于肺腺癌诊断的甲基化分子标志物在肺腺癌组织样本中需表现为高甲基化,而在癌旁正常组织和外周血样本中表现为低甲基化或未甲基化。因此,本实施例以上述目标区域作为诊断肺腺癌的甲基化分子标志物(见表1),使用表2所示的扩增引物对进行PCR反应,扩增组织样本中的目标区域,并进行Sanger测序。具体地,首先配制表3的PCR反应体系,以亚硫酸氢盐转化后的样本DNA为模板,同时加入SYBR Green PCR Mix、目标区域的甲基化引物对和非甲基化引物对(见表2)以及内参基因ACTB的上下游引物:5’-AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG-3’(SEQ ID NO.15),5’-AATAACACCCCCACCCTGC-3’(SEQ IDNO.16),然后根据表4所示的反应程序进行PCR扩增,最后将扩增产物送公司进行Sanger测序。
表1目标区域的DNA序列信息
表2目标区域的扩增引物对
表3 SYBR Green PCR反应体系
组分 | 用量(μL) |
SYBR Green PCR Mix | 17.5 |
甲基化(非甲基化)上游引物(10μM) | 0.5 |
甲基化(非甲基化)下游引物(10μM) | 0.5 |
ACTB上游引物(10μM) | 0.5 |
ACTB下游引物(10μM) | 0.5 |
模板DNA | 5 |
超纯水 | 补至50 |
表4 SYBR Green PCR反应程序
5.结果分析
分析测序峰图、以焦磷酸测序的关键CpG位点的甲基化状态为准。具体地,一个CpG核苷酸中胞嘧啶的甲基化情况分为两种:即甲基化和未甲基化,其中甲基化又分为完全甲基化和部分甲基化,如果某一CpG二核苷酸位点上的胞嘧啶的测序结果显示在胞嘧啶的位置既有C也有T,则认为该位点是部分甲基化的。如果某一扩增子中95%以上的CpG二核苷酸位点中的C是甲基化的,则认为该样本在这一区域是甲基化的。
根据上述标准将扩增产物的测序结果同病理结果进行比对,根据扩增产物的CpG位点的甲基化状态计算此目标区域的灵敏度和特异性。灵敏度=病理结果为阳性的样本检出甲基化阳性的比例;特异性=病理结果为阴性的样本检出甲基化阴性的比例。检测结果见表5。
表5目标区域的CpG位点在训练集样本上的灵敏度和特异性
由表5可知,通过测序分析区域1和区域2诊断肺腺癌组织的灵敏度分别为87.5%和93.8%,其对癌旁组织样本的特异性分别为85.4%和83.3%,区域1、区域2均满足灵敏度≥80%,特异性≥80%。区域1、区域2检测健康人外周血样本的特异性均大于95%,在血细胞样本中具备良好的特异性。因此以区域1(Chr1:63319871-63320048负链)、区域2(Chr2:468298-468435正链)作为目标区域,通过检测上述区域的甲基化水平能够有效区分肺腺癌组织样本和癌旁正常组织样本且能够排除血细胞背景的干扰,区域1、区域2可以进行下一步验证。
实施例2基于Sanger测序法分析目标区域检测血浆样本的性能
利用焦磷酸测序的方法在30例肺腺癌血浆样本和30例健康人血浆样本对筛选得到的差异甲基化位点进行评估,具体过程如下:
1.提取DNA样品
将收集的血液样本离心,分离血浆层,备用。血浆层使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒(目录号:DP709)进行血浆cfDNA提取,所用血浆体积为1.5mL,具体操作参见试剂盒说明书。
2.亚硫酸氢盐转化和纯化处理
将提取好的各个样本的基因组DNA分别进行亚硫酸氢盐转化,所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸纯化试剂(鄂汉械备20200843),具体实验操作参见试剂盒说明书,转化完成后,用30μL纯化水进行洗脱。
3.PCR扩增、Sanger测序、结果分析同实施例2。检测结果见表6。
表6不同CpG位点在血浆样本上的灵敏性和特异性
目标区域 | 检测CpG位点 | 灵敏度 | 特异性 |
区域1 | SEQ ID NO.1中01~25号CpG位点 | 80.0%(24/30) | 90.0%(27/30) |
区域2 | SEQ ID NO.2中01~15号CpG位点 | 83.3%(25/30) | 86.7%(26/30) |
由表6可知,区分肺腺癌患者和健康人可通过检测血浆样本中靶区域的甲基化水平来实现无创诊断。区域1检测血浆样本的灵敏度和特异性分别为80.0%和90.0%,区域2检测血浆样本的灵敏度和特异性分别为83.3%和86.7%。
实施例3基于qMSP法分析目标区域检测临床血浆样本的性能
1.样本收集
本实施例纳入血液样本197例,其中血液样本中包含100例健康人的血液样本和97例肺腺癌血液样本。上述样本收集过程经过伦理委员会的审批,所有受试者都签署了知情同意书。本实施通过检测受试者体液样本中目标区域的甲基化水平来诊断肺腺癌患者,检测过程中对采集的样本经过编盲后,再由试验操作者进行试验,结果判读者根据判读标准,将得到的检测结果与病理结果(金标准)进行比对,考察肺腺癌目标区域的临床有效性。
2.提取样本DNA
使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取,具体操作按照试剂盒说明书进行。
3.亚硫酸氢盐转化同实施例2。
4.qMSP反应
分别以区域1、区域2经亚硫酸氢盐转化后的DNA序列为模板,设计用于甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)的引物对和TaqMan检测探针,要求该引物对具有良好的扩增特异性,即该引物对仅扩增发生甲基化的DNA模板,而不扩增未发生甲基化的DNA模板,同时其也不会引起其它非特异性扩增;另外,要求该引物对具有良好的扩增效率,即其对各个目标区域的扩增效率在90%~110%之间。满足上述要求的引物对和检测探针的核苷酸序列如表7所示。表7中所用到的探针均为TaqMan探针,该探针5’端为荧光报告基团,如FAM、VIC、HEX、NED、ROX、TET、JOE、CY3、CY5等,其3’端为荧光淬灭基团,如TAMRA、MGB、BHQ、BHQ1、BHQ2、BHQ3等。基于TaqMan探针的qPCR反应可以实现在一个反应体系中同时检测多个目标基因,此时,只需每个目标基因特异性的检测探针5’端所携带的荧光报告基团不同即可。本实施例中,每个qPCR反应体系需检测2个目标基因,分别为目标区域(肺腺癌甲基化分子标志物)和内参基因ACTB,ACTB的检测探针序列(SEQ ID NO.17:GGAGTGGTTTTTGGGTTTG),区域1的检测探针序列(SEQ ID NO.18:ATTATACAAACGCTATAATCCGCCT),区域2的检测探针序列(SEQ IDNO.19:CGCTACTTTACAACTCCTAA)。此时,目标区域特异性的TaqMan探针其5’端荧光报告基团为FAM,3’端为荧光淬灭基团NFQ;ACTB基因的检测探针5’端荧光报告基团为ROX,3’端荧光淬灭基团为BHQ。将上述引物、探针人工合成备用。
表7区域1、区域2的甲基化引物对和检测探针
目标区域 | 甲基化引物对(5’-3’) | 检测探针(5’-3’) | 扩增子位置 |
区域1 | SEQ ID NO.7~8 | SEQ ID NO.18 | Chr1:63319871-63320048负链 |
区域2 | SEQ ID NO.11~12 | SEQ ID NO.19 | Chr2:468298-468435正链 |
以经过亚硫酸氢盐转化和纯化的体液样本DNA作为模板,分别使用表7中提供的甲基化引物对和检测探针进行qMSP反应,qMSP的扩增体系如表8所示,扩增程序如表9所示。在对每个样本进行qPCR反应时,均需要检测内参基因ACTB的量,用以监测样本质量及结果判读。在每块PCR反应板内,除设置实验孔用以检测待测样本以外,还需要同时设置阳性对照孔和阴性对照孔。阳性对照孔的模板为103copies/μL含转化后ACTB序列的质粒和103copies/μL含完全甲基化且亚硫酸氢盐转化后目标区域DNA序列的质粒混合物(等体积混合),其它成分与实验管相同;阴性对照孔的模板为TE缓冲液,其它成分也与实验管相同。
表8 TaqMan PCR反应体系
组分 | 规格 | 体积(μL) |
Platinum II PCR缓冲液 | 5× | 5 |
dNTPs | 各2.5mM | 3 |
每一目标区域的甲基化上游引物 | 10μM | 0.5 |
每一目标区域的甲基化下游引物 | 10μM | 0.5 |
每一目标区域的检测探针 | 10μM | 0.5 |
ACTB基因上游引物 | 10μM | 0.5 |
ACTB基因下游引物 | 10μM | 0.5 |
ACTB基因检测探针 | 10μM | 0.5 |
DNA聚合酶 | / | 0.5 |
待测样本DNA | / | 5 |
纯化水 | / | 补至25 |
表9 TaqMan PCR程序
qPCR反应结束后,调整基线(一般将第3~15个循环所对应的信号值设置为基线水平),并设置阈值,阈值必须位于指数扩增期内,穿越阈值与X轴平行的直线称为阈值线,阈值线与扩增曲线的交点所对应的循环数即为Ct值。分析qPCR反应的结果,要求①阴性对照管无扩增;②阳性对照PCR管有明显的指数增长期,且阳性对照PCR管的目标基因的Ct值在26~30之间;③待测样本的内参基因ACTB的Ct值小于等于33。若阳性对照、阴性对照和内参基因均满足上述要求,则可以分析待测样本的检测结果并进行结果判读,否则,当次实验无效,必须重新进行检测。
5.结果判读
血浆样本的阳性判断值为45,若使用某一对甲基化检测引物对和检测探针进行扩增的Ct值≤45,认为该样本在此扩增区域为甲基化阳性,该样本为肺腺癌阳性样本;若使用某一对甲基化检测引物对和探针进行扩增的Ct值>45,认为该样本在此扩增区域为甲基化阴性,该样本为肺腺癌阴性样本。检测结果见表10。
表10qMSP法检测不同目标区域诊断受试者血浆样本的性能
表10中,目标区域检测肺腺癌血浆样本的AUC值范围为0.909~0.918,表明各目标区域对肺腺癌的检出具有较好的准确度。其中,区域1、区域2检测肺腺癌血浆样本的总灵敏度均大于等于83.5%,其检测Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ肺腺癌血浆样本的灵敏度分别可达80.6%、82.8%、88.9%、100%。另外,区域1、区域2检测健康人血浆样本的特异性均大于等于90%,检测准确度高,能够有效避免假阴性样本的检出。
实施例4目标区域组合检测临床血浆样本的性能
鉴于区域1、区域2检测肺腺癌体液样本的性能,将两个区域组合的检测性能可能具有协同效应。因此,申请人进一步尝试分析区域1和区域2组合诊断的性能,所用的数据为实施例3中检测体液样本所获得的Ct值,区域1和区域2组合诊断肺腺癌时,阳性样本的判断标准与单个目标区域检测并不相同,具体的判定标准如下所示:
对于血浆样本:1)若扩增区域1的Ct值≤45,认为区域1为甲基化阳性,若扩增区域1的Ct值>45,认为区域1为甲基化阴性,区域2的判定同上;2)若某一待测样本中区域1或区域2中至少一个区域为甲基化阳性,则该样本为肺腺癌阳性样本;若某一待测样本中区域1和区域2均为甲基化阴性,则该样本为肺腺癌阴性样本。检测结果见表11。
表11区域1和区域2组合诊断受试者血浆样本的性能
表11中,目标区域组合检测肺腺癌患者血浆样本的总灵敏度为87.6%,检测健康人血浆样本的特异性为90%。对比表10、表11发现,目标区域组合检测肺腺癌的总灵敏度相较于单一区域具有明显提升;目标区域组合的检测特异性与区域2持平,略低于区域1。对于不同分期的肺腺癌血浆样本,其中目标区域组合检测Ⅰ期、Ⅱ期肺腺癌血浆样本的灵敏度分别为83.3%、86.2%,优于单一区域;而目标区域组合检测Ⅲ期、Ⅳ期肺腺癌血浆样本的灵敏度均与单一区域持平。本发明提供了能够用于肺腺癌的甲基化分子标志物,为肺腺癌患者带来了无创或微创、且检测灵敏度和特异性较高的肺腺癌检测试剂盒。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于肺腺癌检测的甲基化分子标志物,其特征在于,以GRCh38.p14为参考基因组,所述甲基化分子标志物选自Chr1:63319871-63320048负链的全长区域或部分区域,和/或,Chr2:468298-468435正链的全长区域或部分区域。
2.一种用于肺腺癌检测的试剂盒,其特征在于,其包括用于检测权利要求1所述的甲基化分子标志物的甲基化水平的引物对,和/或检测探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述引物对包括用于检测Chr1:63319871-63320048负链和/或Chr2:468298-468435正链的甲基化水平的甲基化引物对。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述甲基化引物对包括用于检测Chr1:63319871-63320048负链的甲基化水平的第一甲基化引物对,和/或,用于检测Chr2:468298-468435正链的甲基化水平的第二甲基化引物对;
所述第一甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7~8所示,所述第二甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11~12所示。
5.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述引物对还包括用于检测Chr1:63319871-63320048负链和/或Chr2:468298-468435正链的甲基化水平的非甲基化引物对;所述引物对包括如下组合中的至少一组:
SEQ ID NO.7~8所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.9~10所示的第一非甲基化引物对;
SEQ ID NO.11~12所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.13~14所示的第二非甲基化引物对。
6.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括用于检测Chr1:63319871-63320048负链的甲基化水平的第一甲基化引物对和第一检测探针,和/或,用于检测Chr2:468298-468435正链的甲基化水平的第二甲基化引物对和第二检测探针;
所述试剂盒包括如下组合中的至少一组:
SEQ ID NO.7~8所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.18所示的第一检测探针;
SEQ ID NO.11~12所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.19所示的第二检测探针。
7.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括内参基因的检测引物对及检测探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述检测探针和所述内参基因的检测探针的5’端包含有荧光报告基团,3’端包含有荧光淬灭基团。
9.权利要求1所述的甲基化分子标志物或权利要求2至8任一项所述的试剂盒在制备肺腺癌检测产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述肺腺癌包括Ⅰ期肺腺癌、Ⅱ期肺腺癌、Ⅲ期肺腺癌和Ⅳ期肺腺癌中的至少一种;所述肺腺癌检测产品包括试剂盒、芯片和测序文库中的一种或多种。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311241298.0A CN117144012A (zh) | 2023-09-25 | 2023-09-25 | 一种用于肺腺癌检测的甲基化分子标志物、试剂盒及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311241298.0A CN117144012A (zh) | 2023-09-25 | 2023-09-25 | 一种用于肺腺癌检测的甲基化分子标志物、试剂盒及应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117144012A true CN117144012A (zh) | 2023-12-01 |
Family
ID=88902625
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311241298.0A Pending CN117144012A (zh) | 2023-09-25 | 2023-09-25 | 一种用于肺腺癌检测的甲基化分子标志物、试剂盒及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117144012A (zh) |
-
2023
- 2023-09-25 CN CN202311241298.0A patent/CN117144012A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN113265456A (zh) | 一种检测宫颈高级别病变及***相关基因甲基化的引物和探针组合 | |
CN117431321A (zh) | 一种用于***癌或癌前病变检测的核酸组合物、试剂盒及应用 | |
CN114959030B (zh) | 检测hcg9基因甲基化的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的应用 | |
CN116004831A (zh) | 一种用于膀胱癌的诊断或辅助诊断的试剂及检测试剂盒 | |
CN117144012A (zh) | 一种用于肺腺癌检测的甲基化分子标志物、试剂盒及应用 | |
CN117265110A (zh) | 一种用于检测肺鳞癌的试剂盒及应用 | |
CN117778572A (zh) | 一种用于检测甲状腺癌的核酸组合、检测试剂盒及应用 | |
CN115786502B (zh) | 检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌的诊断产品中的应用 | |
WO2024125308A1 (zh) | 检测分子标志物甲基化水平的试剂及尿路上皮癌检测试剂盒 | |
CN115948561B (zh) | 一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的试剂、检测试剂盒及其应用 | |
CN118109589A (zh) | 用于检测胰腺癌分子标志物甲基化水平的试剂、试剂盒及应用 | |
CN117106899A (zh) | 一种用于检测肺结节良恶性的引物对、引物探针组合、试剂盒及应用 | |
CN118256621A (zh) | 一种用于检测胃癌的核酸试剂、检测试剂盒及应用 | |
CN118064592A (zh) | 用于检测***癌的核酸组合、试剂盒及应用 | |
CN117327794A (zh) | 一种用于检测肺结节良恶性的试剂、试剂盒及应用 | |
CN118028472A (zh) | 用于检测***癌的引物对、引物探针组合、试剂盒及应用 | |
CN118064593A (zh) | ***癌生物标志物、***癌检测试剂盒及应用 | |
CN117467763A (zh) | 一种检测非小细胞肺癌生物标志物甲基化水平的核酸组合和试剂盒 | |
CN116751863A (zh) | 一种用于检测咽部恶性肿瘤分子标志物甲基化水平的试剂盒及应用 | |
CN117778573A (zh) | 一种用于检测甲状腺癌生物标志物的核酸组合、试剂盒及应用 | |
CN118127161A (zh) | 用于检测胃癌的甲基化分子标志物、试剂、试剂盒及应用 | |
CN117248018A (zh) | 一种用于检测子宫内膜癌的试剂盒 | |
CN117106907A (zh) | 一种用于检测肾透明细胞癌的试剂、试剂盒及应用 | |
CN117778582A (zh) | 用于检测胃癌的核酸组合、试剂盒及应用 | |
CN117587124A (zh) | 诊断胰腺癌的检测试剂和试剂盒及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |