CN117265110A - 一种用于检测肺鳞癌的试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，更具体地，涉及一种用于检测肺鳞癌的试剂盒及应用。本发明提供的试剂盒通过检测样本中LINC00391基因的靶区域的甲基化水平，能够对肺鳞癌组织样本、血浆样本进行高灵敏度和高特异性检测，对Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期等不同病理分期的肺鳞癌均具有良好的检测效果，提供了能够用于检测肺鳞癌的生物标志物，有利于肺鳞癌的早期检出。

Description

一种用于检测肺鳞癌的试剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及一种用于检测肺鳞癌的试剂盒及应用。
背景技术
肺癌是世界上最常见的癌症，也是癌症死亡的主要原因。肺鳞状细胞癌(LUSC)是非小细胞肺癌的常见病理类型，约占所有肺癌30％。肺鳞癌常见于男性、老龄、具有吸烟史的患者，主要发病于中心气道。早期肺鳞癌患者的5年总生存率仅为63％～79％。
肺鳞癌的发生发展是一个多因素和多基因变异的累积过程，其中遗传变异和表观遗传异常所导致的癌基因的扩增或突变和肿瘤抑制基因的沉默与功能丧失，在肺鳞癌发生和进展中起重要作用。表观遗传通过DNA甲基化及组蛋白等的修饰改变调控细胞组织特异性基因表达，参与机体的发育分化、功能代谢诸多生命活动。与基因突变不同，表观遗传改变导致的渐进性表型变化在一定条件下可以逆转，这一特性为一些疾病尤其是肿瘤的预防治疗开辟了新的途径，尤其是抑癌基因启动子区CpG岛异常高甲基化及组蛋白修饰异常所致基因表达与功能的异常改变，可作为表观遗传标志物与靶点应用于肿瘤的分子诊断。因此，探索肺鳞癌的早期诊断标志物具有重要意义。为了提高肺鳞癌诊断的准确率，寻找新的肺鳞癌标志物势在必行。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供了一种用于检测肺鳞癌的试剂盒及应用，以改善现有技术对肺鳞癌的诊断手段不足，检测肺鳞癌的灵敏度、特异性有待提升，缺少对不同病理分期的肺鳞癌均具有优异检测效果的生物标志物等技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种用于检测肺鳞癌的试剂在制备肺鳞癌诊断产品中的应用，所述试剂包括用于检测LINC00391基因中靶区域CpG位点的甲基化水平的第一试剂；所述肺鳞癌诊断产品包括试剂盒、芯片和测序文库中的一种或多种。
本发明还提供了一种用于检测肺鳞癌的试剂盒，其包括用于检测LINC00391基因中靶区域CpG位点的甲基化水平的第一试剂。
优选地，以GRCh38.p14为参考基因组，所述LINC00391基因的靶区域选自Chr13:94702749-94702940正链的全长或部分区域。
优选地，所述第一试剂包括用于检测Chr13:94702749-94702940正链的全长或部分区域的甲基化水平的甲基化引物对；所述甲基化引物对包括SEQ ID NO.7～8所示的第一甲基化引物对，和/或，SEQ ID NO.11～12所示的第二甲基化引物对。
优选地，所述引物对还包括用于检测Chr13:94702749-94702940正链的全长或部分区域的甲基化水平的非甲基化引物对。
进一步优选地，所述第一试剂包括如下至少一个组合：
SEQ ID NO.7～8所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.9～10所示的第一非甲基化引物对；
SEQ ID NO.11～12所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.13～14所示的第二非甲基化引物对。
优选地，所述试剂盒还包括用于检测SOX2基因中靶区域CpG位点的甲基化水平的第二试剂。
优选地，以GRCh38.p14为参考基因组，所述SOX2基因的靶区域选自Chr3:181704394-181704509负链的全长或部分区域。
进一步优选地，所述第二试剂包括用于检测Chr3:181704394-181704509负链的全长或部分区域的甲基化水平的第三甲基化引物对；所述第三甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15～16所示。
优选地，所述第二试剂还包括用于检测Chr3:181704394-181704509负链的全长或部分区域的甲基化水平的第三非甲基化引物对；所述第三非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.17～18所示。
优选地，所述第一试剂和所述第二试剂还包括所述靶区域的检测探针；所述试剂盒包括如下至少一个所述甲基化引物对与所述靶区域的检测探针的组合：
SEQ ID NO.7～8所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.19所示的第一检测探针；
SEQ ID NO.11～12所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.20所示的第二检测探针；
SEQ ID NO.15～16所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.21所示的第三检测探针。
优选地，所述试剂盒还包括DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、内参基因的甲基化引物对、内参基因的检测探针和质控品中的一种或多种。
优选地，所述靶区域的检测探针和所述内参基因的检测探针的5’端包含有荧光报告基团，3’端包含有荧光淬灭基团。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的一种用于检测肺鳞癌的试剂盒，通过检测样本中LINC00391基因的靶区域的甲基化水平，对肺鳞癌组织样本、血浆样本均具有优异的检测效果，提供了能够用于检测肺鳞癌的生物标志物，有利于肺鳞癌的早期检出。
(2)本发明提供的试剂盒对Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期等不同病理分期的肺鳞癌均具有良好的检测灵敏度和特异性，能够有效区分肺鳞癌患者和健康人。优选实施例中，上述试剂盒通过检测样本中LINC00391基因的靶区域和SOX2基因的靶区域的甲基化水平，检测Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期肺鳞癌血浆样本的灵敏度分别可达79.4％、88.5％、93.3％、100％，检测健康人血浆样本的特异性可达90％。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语“诊断”是指确定受试者的健康状态，涵盖检测疾病的存在与否、对治疗手段的反应、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。在一些情况下，术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态。一些实施例中，“检测”肺鳞癌是指检测疾病的存在与否，即判断受试者是否患有肺鳞癌。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以通过任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而调控基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
术语“生物标志物”或“标志物”是指可以标记***、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，如蛋白质、DNA或RNA等，具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。筛选可用于疾病筛查、早期诊断的生物标志物可大大提高患者的临床治疗效果。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应，PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本发明公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指上游引物和下游引物组成的组。
术语“亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite Sequencing PCR，BSP)”是通过对基因组DNA进行重亚硫酸盐处理，非甲基化的胞嘧啶被脱氨基而转变成尿嘧啶，在随后的PCR反应中尿嘧啶转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不能被脱氨基，在反应完成时被保留；然后在非甲基化区域设计引物进行PCR扩增，将扩增得到的PCR产物进行克隆测序，将测得的序列与原始序列比对，统计甲基化位点及数量，并分析甲基化程度。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后，所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。在本公开内容中，进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物，若Ct值满足所述要求(例如在组织样本中Ct≤38)，则表明目标序列是甲基化的。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术也是基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对，从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来，但是qMSP最终的检测指标为荧光信号，因此，在qMSP反应***中，除加入甲基化检测引物以外，还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比，qMSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高，更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段，且该技术不需要凝胶电泳检测，操作更加简便。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。
术语“AUC”是“曲线下面积”的缩写。具体地，其是指接受者操作特征(ROC)曲线下面积。ROC曲线是诊断测试的不同可能切割点的真阳性率相比于假阳性率的图。其取决于所选择切割点的灵敏度与特异性之间的权衡(灵敏度的任何增加将伴随着特异性的降低)。ROC曲线下面积(AUC)是诊断测试准确度的度量(面积越大越好；最佳值是1；随机测试将具有位于对角线上的ROC曲线，面积为0.5)。
本发明提供了一种用于检测肺鳞癌的试剂在制备肺鳞癌诊断产品中的应用，上述试剂包括用于检测LINC00391基因中靶区域CpG位点的甲基化水平的第一试剂。
一些实施例中，以GRCh38.p14为参考基因组，上述LINC00391基因的靶区域选自Chr13:94702749-94702940正链的全长或部分区域。
一些实施例中，上述第一试剂包括用于检测Chr13:94702749-94702940正链的全长或部分区域的甲基化水平的甲基化引物对。较佳实施例中，上述甲基化引物对包括SEQID NO.7～8所示的第一甲基化引物对，和/或，SEQ ID NO.11～12所示的第二甲基化引物对。
一些实施例中，上述第一试剂还包括用于检测Chr13:94702749-94702940正链的全长或部分区域的甲基化水平的非甲基化引物对。较佳实施例中，上述非甲基化引物对包括SEQ ID NO.9～10所示的第一非甲基化引物对，和/或，SEQ ID NO.13～14所示的第二非甲基化引物对。
一些实施例中，上述第一试剂还包括上述LINC00391基因的靶区域的检测探针。较佳实施例中，上述第一试剂包括如下至少一个上述甲基化引物对与上述靶区域的检测探针的组合：
SEQ ID NO.7～8所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.19所示的第一检测探针；
SEQ ID NO.11～12所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.20所示的第二检测探针。
一些实施例中，上述试剂还包括用于检测SOX2基因中靶区域CpG位点的甲基化水平的第二试剂。
一些实施例中，以GRCh38.p14为参考基因组，上述SOX2基因的靶区域选自Chr3:181704394-181704509负链的全长或部分区域。
一些实施例中，上述第二试剂包括用于检测Chr3:181704394-181704509负链的全长或部分区域的甲基化水平的第三甲基化引物对。较佳实施例中，上述第三甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15～16所示。
一些实施例中，上述第二试剂还包括用于检测Chr3:181704394-181704509负链的全长或部分区域的甲基化水平的第三非甲基化引物对。较佳实施例中，上述第三非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.17～18所示。
一些实施例中，上述第二试剂还包括上述SOX2基因的靶区域的检测探针。较佳实施例中，上述第二试剂包括SEQ ID NO.15～16所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.21所示的第三检测探针。
一些实施例中，上述肺鳞癌诊断产品包括试剂、试剂盒、芯片和测序文库中的一种或多种。可选地，上述试剂可以是冻干粉状、溶液、悬浮液、乳液等产品形态。
需要说明的是，本发明提供的肺鳞癌诊断产品并不限于上述所列举的检测肺鳞癌的试剂，只要能满足肺鳞癌的诊断或辅助诊断的需求的产品均在本发明的保护范围内。
本发明还提供了一种用于检测肺鳞癌的试剂盒，其包括用于检测LINC00391基因中靶区域CpG位点的甲基化水平的第一试剂。
一些实施例中，以GRCh38.p14为参考基因组，上述LINC00391基因的靶区域选自Chr13:94702749-94702940正链的全长或部分区域。
一些实施例中，上述第一试剂包括用于检测Chr13:94702749-94702940正链的全长或部分区域的甲基化水平的甲基化引物对。较佳实施例中，上述甲基化引物对包括SEQID NO.7～8所示的第一甲基化引物对，和/或，SEQ ID NO.11～12所示的第二甲基化引物对。
一些实施例中，上述引物对还包括用于检测Chr13:94702749-94702940正链的全长或部分区域的甲基化水平的非甲基化引物对。
较佳实施例中，上述第一试剂包括如下至少一个组合：
SEQ ID NO.7～8所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.9～10所示的第一非甲基化引物对；
SEQ ID NO.11～12所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.13～14所示的第二非甲基化引物对。
本申请的发明人发现，上述区域在肺鳞癌组织样本中的甲基化水平显著高于正常样本，用上述区域作为肺鳞癌标志物，通过检测样本中上述区域的全长或部分区域的甲基化水平，可以有效区分肺鳞癌患者和健康人，可帮助评估受试者(对象)是否存在肺鳞癌或者是否存在肺鳞癌的风险，为肺鳞癌的检测提供参考。进一步实验发现，将上述LINC00391基因的靶区域与SOX2基因的靶区域进行组合，检测靶区域组合的甲基化水平时，一些区域组合检测肺鳞癌的灵敏性和特异性相较于单一基因的靶区域进行检测时有所提高。
一些实施例中，上述试剂盒还包括用于检测SOX2基因中靶区域CpG位点的甲基化水平的第二试剂。
一些实施例中，以GRCh38.p14为参考基因组，上述SOX2基因的靶区域选自Chr3:181704394-181704509负链的全长或部分区域。
一些实施例中，上述第二试剂包括用于检测Chr3:181704394-181704509负链的全长或部分区域的甲基化水平的第三甲基化引物对。较佳实施例中，上述第三甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15～16所示。
一些实施例中，上述第二试剂还包括用于检测Chr3:181704394-181704509负链的全长或部分区域的甲基化水平的第三非甲基化引物对。较佳实施例中，上述第三非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.17～18所示。
需要说明的是，若一种引物对与上述引物对(第一甲基化引物对、第一非甲基化引物对、第二甲基化引物对、第二非甲基化引物对、第三甲基化引物对、第三非甲基化引物对)所示的核苷酸序列具有至少具有85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等)以上的序列一致性，且该引物对同样具有一定的肺鳞癌诊断功能(特异性或灵敏性与本申请引物对相比，相当或略有下降或略有提高或大幅提高等)，也在本发明保护范围内。
一些实施例中，上述第一试剂和上述第二试剂还包括上述靶区域的检测探针。较佳实施例中，上述试剂盒包括如下至少一个上述甲基化引物对与上述靶区域的检测探针的组合：
SEQ ID NO.7～8所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.19所示的第一检测探针；
SEQ ID NO.11～12所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.20所示的第二检测探针；
SEQ ID NO.15～16所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.21所示的第三检测探针。
一些实施例中，上述试剂盒还包括DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、内参基因的甲基化引物对、内参基因的检测探针和质控品中的一种或多种。
一些实施例中，上述甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。本发明对甲基化转化试剂无特别限制，现有技术中报道的可实现胞嘧啶到尿嘧啶转化的试剂均可以，如肼盐、重硫酸盐(例如重硫酸钠、重硫酸钾、重硫酸铵)和亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)中的一种或多种。
一些实施例中，上述扩增试剂包括但不限于扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。
一些实施例中，上述内参基因可以为但不限于ACTB。在一个可选地具体示例中，上述内参基因ACTB的甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.22～23所示，上述内参基因ACTB的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示。可以理解的是，在其他实施例中，还可以选择其他内参基因，此时，内参基因的甲基化引物对和检测探针对应设计即可。
一些实施例中，上述质控品包括阳性对照和阴性对照，阳性对照是指其中包含甲基化的肺鳞癌标志物，用于监测试剂盒中试剂的检测性能；阴性对照是指其中不包含甲基化的肺鳞癌标志物，用于监测实验是否受到污染。
一些实施例中，上述靶区域的检测探针和上述内参基因的检测探针的5’端包含有荧光报告基团，3’端包含有荧光淬灭基团，上述各探针的荧光报告基团独立地选自FAM、VIC、HEX、NED、ROX、TET、JOE、CY3和CY5中的任意一种；上述各探针的荧光淬灭基团独立地选自TAMRA、MGB、BHQ、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的任意一种。各探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团的举例各自独立地包括但不限于上述所列举。
一些实施例中，上述试剂盒的检测样本包括但不限于分离自受试者的器官、组织、细胞和/或体液的组合物。一些实施例中，上述样本可以为组织、体液样本，进一步地，上述组织包括肺组织；上述体液包括血液、血浆、血清、细胞外液、组织液、淋巴液等，还包括痰液、尿液、唾液、粪便等。更进一步地，在本发明的具体实施例中，待测样本为血浆样本。
本发明还提供了一种检测样本中靶区域的甲基化水平来检测肺鳞癌的方法，包括如下步骤：1)提取受试者的血浆样本DNA并用甲基化转化试剂处理；2)以经转化和纯化的样本DNA为模板，加入用于检测靶区域甲基化水平的引物对和检测探针，以及试剂盒其它组分，进行PCR反应，获得样本中扩增靶区域的Ct值；3)根据样本中扩增靶区域的Ct值与扩增内参基因的Ct值的差值(ΔCt)判断该血浆样本是否为肺鳞癌阳性样本。
基于本发明公开的内容，本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术对上述样本中肺鳞癌标志物(靶区域)的甲基化水平进行检测，对肺鳞癌进行诊断，无论采用何种技术，其都是属于本发明的保护范围。上述试剂盒检测样本中肺鳞癌标志物的甲基化的方法可以是但不限于甲基化敏感性随机引物聚合酶链反应(MS AP-PCR)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)、甲基化特异性PCR(qMSP)、甲基化敏感性DNA限制酶分析、基于限制酶的测序、基于限制酶的微阵列分析、联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)、甲基化CpG岛扩增(MCA)、甲基化CpG岛扩增和微阵列(MCAM)、通过连接介导PCR进行的HpaII小片段富集(HELP)、亚硫酸氢盐测序(BSP)、亚硫酸氢盐微阵列分析、甲基化特异性焦磷酸测序、HELP测序(HELP-seq)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、Gal水解和连接衔接子依赖性PCR(GLAD-PCR)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-Seq)或甲基化DNA免疫沉淀-微阵列分析(MeDIP-chip)、使用甲基敏感性限制酶的Southern印迹法和基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。
本发明提供的上述方法能够低侵袭性地进行高灵敏度和高特异性的肺鳞癌的诊断，由此带来早期的治疗和预后的改善，进一步地，还能够监视疾病憎恶、监视外科治疗、放射线疗法的治疗和化学疗法的治疗的有效性。应当理解的是，本申请所述的检测肺鳞癌的试剂盒所获得的结果仅作为肺鳞癌诊断的中间结果或提示受试者患有肺鳞癌的可能性或风险，还需结合个体的临床表现及其他生理指标最终得出是否罹患肺鳞癌的结论。
应当理解，上述术语和相关定义仅用于解释的目的，而不旨在具有限制性。任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。
以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。
实施例1肺鳞癌标志物检测区域的引物及探针的设计
本发明提供了分离的多核苷酸SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4组合作为肺鳞癌标志物，SEQ ID NO.1位于LINC00391基因的靶区域(物理位置为chr13:94702749-94702940正链)，SEQ ID NO.4位于SOX2基因的靶区域(物理位置为chr3:181704394-181704509负链)。上述核苷酸序列中有多处甲基化的位点，发生在胞嘧啶的C-5位，产物称为5-甲基胞嘧啶(5-mC)，其中SEQ ID NO.1序列从5’-3’有16个甲基化位点，SEQ ID NO.4序列从5’-3’有14个甲基化位点，所有甲基化位点均已用标识出来。
上述多核苷酸分子经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后，DNA双链中的“C”转化为“U”，通过随后的PCR，将“U”转化为“T”，但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的DNA的“C”发生上述转化。因此，SEQ ID NO.1经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的多核苷酸分子包括SEQ ID NO.2(完全甲基化序列)和SEQ ID NO.3(非甲基化序列)，SEQ ID NO.4经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的多核苷酸分子包括SEQ ID NO.5(完全甲基化序列)和SEQ ID NO.6(非甲基化序列)，上述多核苷酸分子的具体信息见表1。
表1 LINC00391基因的靶区域和SOX2基因的靶区域
根据经亚硫酸氢盐处理的多核苷酸分子设计引物时，先输入原始的DNA序列，程序将会显示2种序列：一种是输入的原始的DNA序列；另一种是硫化处理后的DNA序列，除了CpG岛上的5甲基胞嘧啶(5mC)之外，所有非甲基化的“C”都转换成了“T”，根据转化后的序列设计引物。
对于BSP需要设计两对引物，一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的甲基化序列；另一对是针对于经亚硫酸氢盐处理的非甲基化序列，其中甲基化引物只特异性扩增甲基化的序列，非甲基化引物只特异性扩增非甲基化的序列。根据以上引物设计原则，以多核苷酸序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3为模板设计引物对(包括第一引物对、第二引物对)，第一引物对包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的甲基化引物对、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的非甲基化引物对，第一引物对的扩增产物包含SEQ ID NO.1中02～09号CpG位点(物理位置为Chr13:94702756-94702816正链)；第二引物对包括SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的甲基化引物对、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的非甲基化引物对，第二引物对的扩增产物包含SEQ ID NO.1中10～16号CpG位点(物理位置为Chr13:94702821-94702934正链)。以多核苷酸序列SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6为模板设计引物对(第三引物对)，其中第三引物对包括SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示的甲基化引物对、SEQ ID NO.19和SEQ IDNO.20所示的非甲基化引物对，第三引物对的扩增产物包含SEQ ID NO.4中01～12号CpG位点(物理位置为Chr3:181704400-181704500负链)。第一引物对、第二引物对、第三引物对的具体信息见表2。
表2第一引物对、第二引物对、第三引物对的核苷酸序列
以多核苷酸序列SEQ ID NO.2为模板设计第一检测探针(SEQ ID NO.19)、第二检测探针(SEQ ID NO.20)，并分别与上述甲基化引物对SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.11～SEQ ID NO.12组成第一引物探针组合、第二引物探针组合。以多核苷酸序列SEQ IDNO.5为模板设计第三检测探针(SEQ ID NO.21)，并与上述甲基化引物对SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.16组成第三引物探针组合。上述引物探针组合的具体信息见表3。将上述引物对、探针人工合成备用。
表3引物探针组合
实施例2基于Sanger测序法分析肺鳞癌标志物检测肺鳞癌组织样本的性能
采用Sanger测序法分析肺鳞癌标志物检测肺鳞癌组织样本的性能。具体步骤如下：
1.样本收集
本实施例共收集临床确诊为肺鳞癌的癌组织样本48例样本和癌旁组织样本48例，所述组织样本均为经***固定且经石蜡包埋的样本，所有样本的收集过程已获得伦理委员会的审批，所有志愿者在样本收集前签署了知情同意书。
2.提取组织样本DNA
对于石蜡包埋的组织样本，使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(56404)提取组织样本基因组DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。
3.亚硫酸氢盐转化
采用武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)对提取的DNA进行亚硫酸氢盐转化，随后对转化的DNA进行纯化，用于后续实验，具体操作步骤参见试剂盒说明书。
4.PCR扩增及Sanger测序
使用PCR法扩增组织样本中的靶区域，并进行Sanger测序。首先配制PCR反应体系(见表4)，以亚硫酸氢盐转化后的样本DNA为模板，同时加入SYBR Green PCR Mix、靶区域的甲基化引物对和非甲基化引物对(见表2)以及内参基因ACTB的上下游引物：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ ID NO.22)，AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.23)，按照表5所示的反应程序进行PCR扩增，最后将扩增产物送公司进行Sanger测序。
表4 SYBR Green PCR反应体系
组分 用量(μL)
SYBR Green PCR Mix 17.5
甲基化引物对上游引物(10μM) 0.5
甲基化引物对下游引物(10μM) 0.5
非甲基化引物对上游引物(10μM) 0.5
非甲基化引物对下游引物(10μM) 0.5
ACTB上游引物(10μM) 0.5
ACTB下游引物(10μM) 0.5
模板DNA 5
超纯水 补至50
表5 SYBR Green PCR反应程序
5.结果分析
分析测序峰图、以焦磷酸测序的关键CpG位点的甲基化状态为准。具体地，一个CpG核苷酸中胞嘧啶的甲基化情况分为两种：即甲基化和未甲基化，其中甲基化又分为完全甲基化和部分甲基化，如果某一CpG二核苷酸位点上的胞嘧啶的测序结果显示在胞嘧啶的位置既有C也有T，则认为该位点是部分甲基化的。如果某一扩增子中95％以上的CpG二核苷酸位点中的C是甲基化的，则认为该样本在这一区域是甲基化的。
根据上述标准将扩增产物测序结果同病理结果进行比对，计算该扩增产物的CpG位点的甲基化状态来计算此靶区域的灵敏度和特异性。灵敏度＝病理结果为阳性的样本检出甲基化阳性的比例；特异性＝病理结果为阴性的样本检出甲基化阴性的比例。检测结果见表6。
表6不同CpG位点在组织样本上特异性和灵敏度
分析表6发现，第一、第二、第三引物对均可用于肺鳞癌组织样本的检测，上述引物对通过检测肺鳞癌标志物的甲基化水平，可以有效区分肺鳞癌组织样本和癌旁正常组织样本，检测灵敏度均大于91％，检测特异性均大于81％，其中第二引物对通过检测SEQ IDNO.1中10～16号CpG位点的甲基化水平诊断肺鳞癌组织样本的灵敏度为93.8％，检测癌旁正常组织样本的特异性为89.6％。
实施例3在血液样本上检测肺鳞癌标志物的特异性和灵敏性
利用焦磷酸测序的方法在30例肺鳞癌血浆样本、30例健康人血浆样本和血细胞样本中对筛选得到的差异甲基化位点进行评估，具体过程如下：
1.提取DNA样品
将收集的血液样本离心，分离血浆层和血细胞，备用。血浆层使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒(目录号：DP709)进行血浆cfDNA提取，所用血浆体积为1.5mL，具体操作参见试剂盒说明书。血细胞使用采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP304)提取各样本的细胞基因组DNA，具体操作参见试剂盒说明书。
2.亚硫酸氢盐转化和纯化处理
将提取好的各个样本的基因组DNA分别进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸纯化试剂(鄂汉械备20200843)，具体实验操作参见试剂盒说明书，转化完成后，用30μL纯化水进行洗脱。
3.PCR扩增及Sanger测序同实施例2。
4.结果分析同实施例2。检测结果见表7。
表7不同CpG位点在血浆样本上的灵敏性和特异性
表8不同CpG位点在健康人血细胞样本的特异性
靶区域 检测CpG位点 健康人血细胞样本(100例)
靶区域1 SEQ ID NO.1中02～09号CpG位点 98％(98/100)
靶区域2 SEQ ID NO.1中10～16号CpG位点 97％(97/100)
靶区域3 SEQ ID NO.4中01～12号CpG位点 100％(100/100)
由表7可知，区分肺鳞癌患者和健康人可通过检测血浆样本中靶区域的甲基化水平来实现无创诊断。靶区域1检测血浆样本的灵敏性和特异性分别为83.3％和86.7％，靶区域2检测血浆样本的灵敏性和特异性分别为83.3％和90.0％，靶区域3检测血浆样本的灵敏性和特异性分别为76.7％和93.3％。
在肺鳞癌发生高甲基化的靶区域可能会释放到血浆cfDNA中，因此要排除靶区域在血细胞中的干扰。由表8可知，LINC00391基因的靶区域1、靶区域2和SOX2基因的靶区域3检测健康人血细胞样本的特异性均大于等于97％，在血细胞样本中具备良好的特异性。
实施例4基于qMSP法分析肺鳞癌标志物检测临床血液样本的性能
1.样本收集
本实施例纳入血液样本189例，其中血液样本中包含100例健康人的血液样本和89例肺鳞癌血液样本(Ⅰ期34例、Ⅱ期26例、Ⅲ期15例、Ⅳ期14例)。上述样本收集过程经过伦理委员会的审批，所有受试者都签署了知情同意书。本实施通过检测受试者样本中靶区域的甲基化水平来诊断肺鳞癌患者，检测过程中对采集的样本经过编盲后，再由试验操作者进行试验，结果判读者根据判读标准，将得到的检测结果与病理结果(金标准)进行比对，考察肺鳞癌标志物的临床有效性。
2.提取样本DNA
使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取，具体操作按照试剂盒说明书进行。
3.亚硫酸氢盐转化
采用武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)对其进行转化，随后对转化的DNA进行纯化，用于后续实验，具体操作步骤参见试剂盒说明书。
4.qMSP反应
用表3中的甲基化引物对和TaqMan检测探针扩增发生甲基化的DNA模板，不扩增未发生甲基化的DNA模板，同时其也不会引起其它非特异性扩增；此外，该引物对具有良好的扩增效率，即其对各个靶区域的扩增效率在90％～110％之间。表3中所用到TaqMan探针的5’端为荧光基团，如FAM、ROX、VIC、CY5等，其3’端为荧光淬灭基团，如TAMRA、BHQ、MGB等。基于TaqMan探针的qPCR反应可以实现在一个反应体系中同时检测多个目标基因，此时，只需每个目标基因特异性的检测探针5’端所携带的荧光报告基团不同即可。本实施例中，每个qPCR反应体系需检测2个目标基因，分别为肺鳞癌标志物的靶区域和内参基因ACTB，ACTB检测探针序列为GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ ID NO.24)。此时，靶区域特异性的TaqMan探针其5’端荧光基团为ROX，其3’端为非荧光淬灭基团NFQ；ACTB检测探针5’端荧光基团为VIC，3’端荧光淬灭基团为BHQ。
以经过亚硫酸氢盐转化和纯化的体液样本DNA作为模板，分别使用甲基化引物对和检测探针进行qMSP反应，qMSP的扩增体系如表9所示，扩增程序如表10所示。在对每个样本进行qPCR反应时，均需要检测内参基因ACTB的量，用以监测样本质量及结果判读。在每块PCR反应板内，除设置实验孔用以检测待测样本以外，还需要同时设置阳性对照孔和阴性对照孔。阳性对照孔的模板为103copies/μL含转化后ACTB序列的质粒和103copies/μL含完全甲基化且经亚硫酸氢盐转化后靶区域DNA序列的质粒混合物(等体积混合)，其它成分与实验管相同；阴性对照孔的模板为TE缓冲液，其它成分也与实验管相同。
表9 qPCR反应体系
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表10 qPCR反应程序
qPCR反应结束后，调整基线(一般将第3～15个循环所对应的信号值设置为基线水平)，并设置阈值，阈值必须位于指数扩增期内，穿越阈值与X轴平行的直线称为阈值线，阈值线与扩增曲线的交点所对应的循环数即为Ct值。分析qPCR反应的结果，要求①阴性对照管无扩增；②阳性对照PCR管有明显的指数增长期，且阳性对照PCR管的目标基因的Ct值在26～30之间；③待测样本的内参基因ACTB的Ct值小于等于33。若阳性对照、阴性对照和内参基因均满足上述要求，则可以分析待测样本的检测结果并进行结果判读，否则，当次实验无效，必须重新进行检测。
5.结果判读
对于血浆样本，阳性判断值为45，若使用某一对甲基化检测引物对和检测探针进行扩增的Ct值≤45，认为该样本在此扩增区域为甲基化阳性，该样本为肺鳞癌阳性样本；若使用某一对甲基化检测引物对和检测探针进行扩增的Ct值＞45，认为该样本在此扩增区域为甲基化阴性，该样本为肺鳞癌阴性样本。
通过qMSP法检测单一靶区域的甲基化水平诊断受试者血浆样本的性能如表11所示。
表11 qMSP法检测单一靶区域诊断肺鳞癌血浆样本的性能
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由表11可以看出，通过检测靶区域1、靶区域2的甲基化水平检测肺鳞癌血浆样本的效果优异，其AUC值均大于0.919。靶区域1和靶区域2来自LINC00391基因的不同位置，通过检测靶区域1、靶区域2的甲基化水平检测肺鳞癌血浆样本的总灵敏度和特异性基本持平，检测灵敏度均为83.1％，特异性分别为91％、90％，但是靶区域1、靶区域2检测不同分期的肺鳞癌还是有区别的。通过检测靶区域3的甲基化水平检测肺鳞癌血浆样本的灵敏度为76.4％，低于靶区域1、靶区域2；特异性为94％，略高于靶区域1、靶区域2。
对于不同分期的肺鳞癌血浆样本，通过检测靶区域1、靶区域2的甲基化水平检测Ⅰ期肺鳞癌的灵敏度均大于等于73.5％，检测Ⅱ期肺鳞癌的灵敏度均大于等于80.8％，检测Ⅲ期肺鳞癌的灵敏度均大于等于86.7％，检测Ⅳ期肺鳞癌的灵敏度均大于等于100％，均优于靶区域3检测Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期肺鳞癌的灵敏度。由表11可以看出，本实施例提供的试剂盒都可以有效区分肺鳞癌患者和健康人，为肺鳞癌患者带来了无创或微创、且检测灵敏度和特异性较高的诊断产品。
实施例5靶区域组合检测临床血液样本的性能
鉴于靶区域1、靶区域2检测肺鳞癌的灵敏度均优于靶区域3，将靶区域1、靶区域2分别与靶区域3组合的检测性能可能具有协同效应。因此，申请人进一步尝试分析靶区域1和靶区域3、靶区域2和靶区域3联合诊断肺鳞癌的性能，所用的数据为实施例3中检测体液样本所获得的Ct值，但是靶区域联合诊断肺鳞癌时，阳性样本的判断标准与单个靶区域检测并不相同，具体的判定标准如下所示：
对于血浆样本：1)若扩增靶区域的Ct值小于等于45，认为该靶区域为甲基化阳性，若扩增靶区域的Ct值大于45，认为该区域为甲基化阴性。2)若某一待测样本中两个靶区域中至少一个靶区域为甲基化阳性，则该样本为肺鳞癌阳性样本；若某一待测样本中两个靶区域均为甲基化阴性，则该样本为肺鳞癌阴性样本。靶区域组合检测受试者血浆样本的性能如表12。
表12靶区域组合检测受试者血浆样本的性能
表12中，靶区域组合检测肺鳞癌患者血浆样本的总灵敏度可达87.6％，检测健康人血浆样本的特异性可达90％。对于不同分期的肺鳞癌血浆样本，靶区域组合检测Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期肺鳞癌血浆样本的灵敏度分别可达79.4％、88.5％、93.3％、100％。
对比表11、表12发现，靶区域组合检测肺鳞癌患者血浆样本的总灵敏度相较于单一靶区域均有提升，显著优于靶区域3(SOX2基因的靶区域)；靶区域组合检测健康人血浆样本的特异性与单一靶区域持平或略低于单一靶区域。本实施例提供的试剂盒通过检测靶区域组合的甲基化水平，可以提高肺鳞癌患者的检出率，进而提高肺鳞癌患者的生存率。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测肺鳞癌的试剂在制备肺鳞癌诊断产品中的应用，其特征在于，所述试剂包括用于检测LINC00391基因中靶区域CpG位点的甲基化水平的第一试剂；所述肺鳞癌诊断产品包括试剂盒、芯片和测序文库中的一种或多种。
2.一种用于检测肺鳞癌的试剂盒，其特征在于，其包括用于检测LINC00391基因中靶区域CpG位点的甲基化水平的第一试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，以GRCh38.p14为参考基因组，所述LINC00391基因的靶区域选自Chr13:94702749-94702940正链的全长或部分区域；
所述第一试剂包括用于检测Chr13:94702749-94702940正链的全长或部分区域的甲基化水平的甲基化引物对；所述甲基化引物对包括SEQ ID NO.7～8所示的第一甲基化引物对，和/或，SEQ ID NO.11～12所示的第二甲基化引物对。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述第一试剂还包括用于检测Chr13:94702749-94702940正链的全长或部分区域的甲基化水平的非甲基化引物对；
所述第一试剂包括如下至少一个组合：
SEQ ID NO.7～8所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.9～10所示的第一非甲基化引物对；
SEQ ID NO.11～12所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.13～14所示的第二非甲基化引物对。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，其还包括用于检测SOX2基因中靶区域CpG位点的甲基化水平的第二试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，以GRCh38.p14为参考基因组，所述SOX2基因的靶区域选自Chr3:181704394-181704509负链的全长或部分区域；
所述第二试剂包括用于检测Chr3:181704394-181704509负链的全长或部分区域的甲基化水平的第三甲基化引物对；所述第三甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15～16所示。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述第二试剂还包括用于检测Chr3:181704394-181704509负链的全长或部分区域的甲基化水平的第三非甲基化引物对；所述第三非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.17～18所示。
8.根据权利要求3或6所述的试剂盒，其特征在于，所述第一试剂和所述第二试剂还包括所述靶区域的检测探针；
所述试剂盒包括如下至少一个所述甲基化引物对与所述靶区域的检测探针的组合：
SEQ ID NO.7～8所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.19所示的第一检测探针；
SEQ ID NO.11～12所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.20所示的第二检测探针；
SEQ ID NO.15～16所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.21所示的第三检测探针。
9.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、内参基因的甲基化引物对、内参基因的检测探针和质控品中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述靶区域的检测探针和所述内参基因的检测探针的5’端包含有荧光报告基团，3’端包含有荧光淬灭基团。
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