CN117867104A - 多种分子标记物联合在制备胰腺癌的诊断产品中的应用 - Google Patents
多种分子标记物联合在制备胰腺癌的诊断产品中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117867104A CN117867104A CN202211232308.XA CN202211232308A CN117867104A CN 117867104 A CN117867104 A CN 117867104A CN 202211232308 A CN202211232308 A CN 202211232308A CN 117867104 A CN117867104 A CN 117867104A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- region
- detecting
- pancreatic cancer
- methylation
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 76
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 75
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 74
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 title claims abstract description 74
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 4
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims abstract description 88
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 88
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 108
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 60
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 16
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 16
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 claims description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 12
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 claims description 6
- 238000003062 neural network model Methods 0.000 claims description 6
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 claims description 6
- 238000007637 random forest analysis Methods 0.000 claims description 6
- 238000012706 support-vector machine Methods 0.000 claims description 6
- 101100240528 Caenorhabditis elegans nhr-23 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 238000007855 methylation-specific PCR Methods 0.000 claims description 4
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 claims description 3
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 claims description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 3
- 238000002493 microarray Methods 0.000 claims description 3
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 claims description 3
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 14
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 abstract description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 34
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 17
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 17
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 6
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 201000008129 pancreatic ductal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 5
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 101150087690 ACTB gene Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000012549 training Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5-{[2-(3,4-dimethoxyphenyl)ethyl](methyl)amino}-2-(propan-2-yl)pentanenitrile Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1CCN(C)CCCC(C#N)(C(C)C)C1=CC=C(OC)C(OC)=C1 SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 2
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 2
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- -1 BHQ3 Chemical compound 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001353 Chip-sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 206010013832 Duodenal perforation Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 101100495925 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) chr3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- GYDJEQRTZSCIOI-UHFFFAOYSA-N Tranexamic acid Chemical compound NCC1CCC(C(O)=O)CC1 GYDJEQRTZSCIOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 229940003587 aquaphor Drugs 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N pacific blue Chemical compound FC1=C(O)C(F)=C2OC(=O)C(C(=O)O)=CC2=C1 VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000012762 unpaired Student’s t-test Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- MTZBBNMLMNBNJL-UHFFFAOYSA-N xipamide Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC(=O)C1=CC(S(N)(=O)=O)=C(Cl)C=C1O MTZBBNMLMNBNJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
- G16H50/00—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
- G16H50/20—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for computer-aided diagnosis, e.g. based on medical expert systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Data Mining & Analysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Databases & Information Systems (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Primary Health Care (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请涉及多种分子标记物联合在制备胰腺癌的诊断产品中的应用。本申请的试剂通过检测分子标记物的甲基化水平可以诊断或辅助诊断胰腺癌,其具有高的灵敏度和特异性,且具有无创性。对胰腺癌的早期诊断和治疗以及提高患者的生存率具有重要意义。
Description
技术领域
本申请属于疾病诊断领域,具体涉及多种分子标记物联合在制备胰腺癌的诊断产品中的应用。
背景技术
胰腺癌是一种恶性程度极高的消化道恶性肿瘤,常被称为“癌症之王”。近年来,全球范围内胰腺癌的发病率和死亡率都呈现出快速上升的势头,且患者年龄越来越年轻化。约90%的胰腺癌为起源于胰导管上皮的胰腺导管腺癌。胰腺癌临床症状隐匿且不具有典型性,对其进行诊断和治疗都具有较高的难度。
现阶段,我国检测胰腺癌的常用方法包括:血清学检查、影像学检查以及病理活检等。血清学糖类抗原CA19-9常用于胰腺癌的筛查,但是其对于早期胰腺癌和癌前病变的敏感性很低。影像学检查如超声、胰腺多层螺旋CT、核磁共振等,其仍然存在难以检查微小胰腺病变的问题。超声内镜引导下的细针穿刺活检及病理判断是确诊胰腺癌的金标准,但是其操作难度很大,存在十二指肠穿孔的风险,且为有创操作,不适用于胰腺癌高危人群的常规检测和重点检测。因此,临床上急需高灵敏度、高特异性、无创的用于胰腺癌诊断或辅助诊断的方法。
液体活检是一门新兴的用于癌症筛查的技术,它通常收集外周体液进行检测,取样方便且风险低,可重复性高,在胰腺癌的早期诊断和个体化诊疗中具有重要的应用前景。当胰腺肿瘤细胞通过程序性死亡、凋亡、坏死等方式死亡时,其细胞内的肿瘤DNA会释放入血。此外,考虑到癌症患者体内肿瘤抑制基因启动子区域的DNA通常是高甲基化的,且这种甲基化状态从低或无到高的变化发生在癌症早期并可以持续存在,因此,推测通过液体活检技术检测血液中某些分子标志物DNA甲基化状态的改变可用于胰腺癌的诊断和辅助诊断。
发明内容
基于此,针对上述问题,本申请提供一种试剂,其为能够检测分子标记物的甲基化水平的试剂,并将其用于制备诊断胰腺癌的产品,该产品具有高的灵敏度和特异性。
具体技术方案如下:
一种试剂,所述试剂能够检测分子标记物的甲基化水平,以GRCh38.p14为参考,所述分子标记物包括区域1、区域2、区域3、区域4、区域5和区域6全长或部分区域的组合。
所述区域1为Chr17:48995974-48996223的负链;所述区域2为Chr12:49903846-49904095的正链;所述区域3为Chr10:11017614-11017863的正链;所述区域4为Chr2:176080246-176080495的正链;所述区域5为Chr3:129974546-129974795的负链;所述区域6为Chr12:128267365-128267614的正链。
在其中一个实施例中,所述试剂包括采用以下中的至少一种方法检测所述分子标记物的甲基化水平:甲基化特异性荧光定量PCR、甲基化特异性PCR、焦磷酸测序、亚硫酸氢盐测序、甲基化特异性聚合酶链式反应、数字聚合酶链式反应、限制性标记的基因组扫描、CpG岛微阵列和甲基化敏感的单核苷酸的扩增。
在其中一个实施例中,所述试剂包括检测所述区域1~区域6甲基化水平的引物对。
可选地,检测所述区域1甲基化水平的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.13~14所示;检测所述区域2甲基化水平的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.16~17所示:检测所述区域3甲基化水平的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.19~20所示:检测所述区域4甲基化水平的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.22~23所示:检测所述区域5甲基化水平的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.25~26所示:检测所述区域6甲基化水平的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.28~29所示。
在其中一个实施例中,所述试剂还包括检测所述区域1~区域6甲基化水平的检测探针。
可选地,检测所述区域1甲基化水平的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示,检测所述区域2甲基化水平的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示,检测所述区域3甲基化水平的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示,检测所述区域4甲基化水平的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示,检测所述区域5甲基化水平的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示,检测所述区域6甲基化水平的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示。
上述的试剂在制备胰腺癌诊断产品中的应用。
一种用于胰腺癌诊断的试剂盒,包括上述任一项所述的试剂。
一种预测胰腺癌风险的诊断模型的构建方法,根据所述区域1~区域6的甲基化水平,构建预测胰腺癌风险的诊断模型。
可选地,所述诊断模型使用选自以下中的一种或多种算法来构建:主成分分析、Logistic回归分析、最近邻分析、支持向量机、神经网络模型和随机森林。
一种预测胰腺癌风险的诊断模型,所述诊断模型采用上述的方法构建而成,以所述区域1~区域6的甲基化水平作为输入变量;
优选地,所述诊断模型为Logistic回归模型。
在其中一个实施例中,所述诊断模型的公式包括公式I和公式II:
概率值(P)=ef(x)/(1+ef(x)) 公式I
f(x)=(-0.46)*ΔCt(区域1)+(-0.216)*ΔCt(区域2)+(-0.116)*ΔCt(区域3)+(-0.4)*ΔCt(区域4)+(-0.232)*ΔCt(区域5)+(-0.212)*ΔCt(区域6)+27.782 公式II。
一种胰腺癌的预测装置,包括以下单元:
检测单元:检测待测者样本中所述区域1~区域6的甲基化水平;
分析单元:将检测得到的区域1~区域6的甲基化水平作为输入变量,输入预测胰腺癌风险的诊断模型进行分析;
评估单元:输出待测者样本对应的概率值;
可选地,所述预测胰腺癌风险的诊断模型使用选自以下中的一种或多种算法来构建:主成分分析、逻辑回归分析、最近邻分析、支持向量机、神经网络模型和随机森林。
在其中一个实施例中,所述诊断模型的阈值(截断值)为0.448,当概率值大于等于阈值0.448时,提示样本为胰腺癌阳性。
与现有技术相比较,本申请具有如下有益效果:
本申请利用六个特定区域的甲基化水平联合诊断胰腺癌患者血液样本的灵敏度为86.21%,其诊断健康人血液样本的特异性为95.83%。本申请公开的诊断胰腺癌的方法或产品具有高灵敏度、高特异性,且具有无创或微创性,对胰腺癌的早期诊断和治疗以及提高患者的生存率具有重要意义。
附图说明
图1为6个目标区域联合诊断胰腺癌血液样本的ROC曲线。
具体实施方式
为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合附图对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进,因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本申请。
术语“多个”指两个以上;“多种”指两种以上;“以上”与数字结合表示数量时包括本数,例如“两个以上”包括两个。
本申请一实施方式提供了一种试剂,该试剂能够检测分子标记物的甲基化水平,以GRCh38.p14为参考,分子标记物包括区域1、区域2、区域3、区域4、区域5和区域6全长或部分区域的组合;其中,区域1为Chr17:48995974-48996223的负链;区域2为Chr12:49903846-49904095的正链;区域3为Chr10:11017614-11017863的正链;区域4为Chr2:176080246-176080495的正链;区域5为Chr3:129974546-129974795的负链;区域6为Chr12:128267365-128267614的正链。在其他实施方式中,分子标记物也可以为包括上述各个区域互补链的组合。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式,能够在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数,既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中,可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下,可根据样本检测的Ct值进行比较;在一些情况下,可计算样本中基因甲基化的比例,即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100,然后再进行比较;在一些情况下,还需要对各个指标进行统计学上的分析整合,得出最终的判定指标。
在一个具体示例中,试剂包括采用以下中的至少一种方法检测所述分子标记物甲基化水平:甲基化特异性荧光定量PCR、甲基化特异性PCR、焦磷酸测序、亚硫酸氢盐测序、甲基化特异性聚合酶链式反应、数字聚合酶链式反应、限制性标记的基因组扫描、CpG岛微阵列和甲基化敏感的单核苷酸的扩增。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一,能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后,所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶,而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变,因此可分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物,通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。在本文公开内容中,进行甲基化特异性荧光定量PCR时加入甲基化引物,若Ct值满足所述要求(例如在组织样本中Ct≤38),则表明目标序列是甲基化的。
在一个具体示例中,试剂包括检测区域1~区域6甲基化水平的引物对。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中,基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常,用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素,包括温度、引物来源以及所用方法等。例如,对于诊断和预后应用,根据靶序列的复杂度,寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸,但是也可以含有更少的核苷酸。在本公开内容中,术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子,优选多于三个,并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素,而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生,包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
可选地,区域1~区域6所对应的引物对的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.13~14、SEQ ID NO.16~17、SEQ ID NO.19~20、SEQ ID NO.22~23、SEQ ID NO.25~26、SEQ IDNO.28~29所示。
在一个具体示例中,试剂还包括检测区域1~区域6甲基化水平的检测探针。
可选地,检测探针为TaqMan探针。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时,因为荧光基团附近存在淬灭基团,探针不会发出荧光。在扩增过程中,如果探针与被扩增的链结合,DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针,荧光基团远离淬灭基团,其能量不被吸收,即产生荧光信号。每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步的指数增长的过程。
可选地,淬灭基团可选自AMCA、Pacific Blue、FAM、Alexa Fluor 488、TET、JOE、Yakima Yellow、VIC、HEX、Quasar 570、Cy3、NED、TAMRA、ROX、Aqua Phluor593、Quasar 670以及Cy5.5中的任一种。
可选地,荧光基团可选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse以及MGB中的任一种。
可选地,区域1~区域6所对应的检测探针的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.15、SEQID NO.18、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.30所示。
上述试剂可用于诊断胰腺癌或将其用于制备胰腺癌诊断产品。本申请将区域1、区域2、区域3、区域4、区域5和区域6的组合用于诊断胰腺癌,具有高的灵敏度和高的特异性。
术语“诊断”包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。
本申请一实施方式还提供了一种用于胰腺癌诊断的试剂盒,包括上述任一项的试剂。
在一个具体示例中,该试剂盒还包括核酸提取试剂、DNA的纯化试剂、亚硫酸氢盐、PCR试剂等。其中PCR试剂可包括缓冲液、dNTP、Mg2+、DNA聚合酶等。
本申请一实施方式还提供了一种预测胰腺癌风险的诊断模型的构建方法,根据区域1~区域6的甲基化水平,构建预测胰腺癌风险的诊断模型。
在一个具体示例中,诊断模型使用选自以下中的一种或多种算法来构建:主成分分析、Logistic回归分析、最近邻分析、支持向量机、神经网络模型和随机森林。可选地,使用Logistic回归分析来构建。
本申请一实施方式还提供了一种预测胰腺癌风险的诊断模型,所述诊断模型采用上述的方法构建而成,以区域1、区域2、区域3、区域4、区域5和区域6的甲基化水平作为输入变量。
具体地,各区域的甲基化水平为计算扩增样本该区域的ΔCt值。
优选地,所述诊断模型为Logistic回归模型。
在一个具体示例中,诊断模型的公式包括公式I和公式II:
概率值(P)=ef(x)/(1+ef(x)) 公式I
f(x)=(-0.46)*ΔCt(区域1)+(-0.216)*ΔCt(区域2)+(-0.116)*ΔCt(区域3)+(-0.4)*ΔCt(区域4)+(-0.232)*ΔCt(区域5)+(-0.212)*ΔCt(区域6)+27.782 公式II。
本申请一实施方式还提供了一种胰腺癌的预测装置,包括以下单元:
检测单元:检测待测者样本中区域1~区域6的甲基化水平。
分析单元:将检测得到的各区域的甲基化水平作为输入变量,输入预测胰腺癌风险的诊断模型进行分析。
具体地,预测胰腺癌风险的诊断模型使用选自以下中的一种或多种算法来构建:主成分分析、逻辑回归分析、最近邻分析、支持向量机、神经网络模型和随机森林。
可选地,使用Logistic回归分析来构建。可选地,诊断模型的公式包括上述公式I和公式II。
评估单元:输出待测者样本对应的概率值。
在一个具体示例中,诊断模型的阈值(截断值)为0.448,当概率值大于等于阈值0.448时,提示样本为胰腺癌阳性。可选地,本领域技术人员也可通过对胰腺癌患者和健康人的样本集进行ROC曲线分析,选择约登指数最大时的截断值作为阈值。当诊断模型的阈值为0.448时,该模型的灵敏度为90.5%,特异性为97.2%。
术语“ROC曲线”是诊断测试的不同可能切割点的真阳性率相比于假阳性率的图。其取决于所选择切割点的灵敏度与特异性之间的权衡(灵敏度的任何增加将伴随着特异性的降低)。ROC曲线下面积(AUC)是诊断测试准确度的度量(面积越大越好;最佳值是1;随机测试将具有位于对角线上的ROC曲线,面积为0.5)。
在一个具体示例中,待测者样本可以来自血液、细胞、粪便、唾液、组织等。
具体实施例
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解,这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,优先参考本申请中给出的指引,还可以按照本领域的实验手册或常规条件,还可以按照制造厂商所建议的条件,或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中,涉及原料组分的量度参数,如无特别说明,可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数,允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1分子标记物的筛选
从GEO数据库中获取编号为GSE74071、GSE155353和GSE49149的3个数据集的Illumina 450K甲基化芯片测序数据,并将三个数据集合并为一个数据集,该数据集共包括71例正常胰腺癌旁组织(或胰腺非癌组织)样本和268例胰腺癌组织样本。1)将以上339例样本的甲基化数据导入R软件(版本4.1.0)中,分析每个探针在胰腺非癌组织和胰腺癌组织中的甲基化水平,并使用unpaired student t-test进行统计学比较,认为当P<0.05时,该探针在胰腺非癌组织和胰腺癌组织中的甲基化水平具有显著差异,选择甲基化水平在两种不同病理组织样本中具有显著差异的探针用于下一步筛选。2)通过步骤1)筛选得到的探针再进行β值筛选,保留β值在胰腺非癌组织中小于0.2且在胰腺癌组织中大于0.3的探针。3)计算2)中筛选得到的探针在胰腺癌组织中的β值与探针在胰腺非癌组织中的β值的比值(foldchange),然后根据比值从高到底的顺序对探针进行排序,保留比值大于3的探针,发现共有6个探针满足上述所有条件。满足条件的6个探针的具体信息如表1所示。
表1在胰腺癌组织和胰腺非癌组织中具有显著差异的探针信息
表1中所示的6个探针在胰腺癌组织和胰腺非癌组织中的甲基化水平具有十分显著的差异,且这6个探针在胰腺癌组织中的甲基化水平都显著高于各自在胰腺非癌组织中的甲基化水平。因此,这6个探针所识别的DNA区域可以作为诊断胰腺癌的分子标记物。
实施例2分子标记物的性能验证(训练集)
1、设计和筛选检测引物对和检测探针
为了验证上述探针识别的DNA区域的甲基化水平具有诊断胰腺癌的性能,本实施例以探针识别的起始位点上游100bp处作为起始端,以探针识别的终点下游100bp处作为末端,获取一段250bp的DNA序列,以此序列作为针对该探针的目标区域,以GRCh38.p14为参考基因组,针对每个探针所设置的目标区域的位置如表2所示。在哺乳动物中,胞嘧啶的甲基化主要发生在CpG二核苷酸中,DNA序列经亚硫酸氢盐转化以后,未发生甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶仍然为胞嘧啶。每个目标区域的DNA序列及完全甲基化的序列经过亚硫酸氢盐转化后的DNA序列如表3所示。以表3中转化后的目标序列做为模板,分别针对每个区域设计甲基化检测引物对和对应的检测探针,利用甲基化特异性荧光定量PCR法(qMSP)检测每个区域的甲基化水平。
表2根据探针识别位置所设置的目标区域
探针号 | 探针识别的位置 | 目标区域 |
cg12477716 | Chr17:48996074-48996123 | 区域1,Chr17:48995974-48996223,负链 |
cg18486102 | Chr12:49903946-49903995 | 区域2,Chr12:49903846-49904095,正链 |
cg03813164 | Chr10:11017714-11017763 | 区域3,Chr10:11017614-11017863,正链 |
cg14715696 | Chr2:176080346-176080395 | 区域4,Chr2:176080246-176080495,正链 |
cg22512438 | Chr3:129974646-129974695 | 区域5,Chr3:129974546-129974795,负链 |
cg26682580 | Chr12:128267465-128267514 | 区域6,Chr12:128267365-128267614,正链 |
表3目标区域的DNA序列及经亚硫酸氢盐转化后的DNA序列
针对每一个目标区域,将其转化后序列人工合成并克隆至质粒载体上,以含有目标区域的质粒作为模板或以胰腺癌阳性细胞系的基因组DNA作为模板,分别设计多对检测引物对用于PCR扩增该目标区域,从这些检测引物对中筛选扩增效率在90%-110%且无非特异性扩增的引物对作为最终使用的检测引物对。然后设计并合成针对每个目标区域的检测探针,所用检测探针均为TaqMan探针,其5’端含荧光报告基团,3’端含荧光淬灭基团,对于不同的目标区域,其检测探针的5’端荧光基团均为FAM,其3’端荧光淬灭基团均为MGB。测试针对每个目标区域的检测引物对和检测探针联用的扩增效果,确保检测引物对与检测探针之间、检测探针与模板之间无非特异性结合,从而筛选得到最终用于检测每个目标区域甲基化水平的引物对和对应的检测探针,其核苷酸序列如表4所示。针对每个目标区域的的检测引物对和检测探针可检测的甲基化的胞嘧啶位点如表5所示。
表4检测引物对及其对应的检测探针的核苷酸序列
表5检测引物对和检测探针可识别的甲基化的胞嘧啶位点
2、测试目标区域联合诊断胰腺癌的性能
在建立qMSP检测体系以后,收集生物样本,测试用目标区域的甲基化水平诊断胰腺癌的性能,具体过程如下。
1)样本收集:
共招募326名志愿者,其中有144名为经病理组织活检确诊为胰腺导管腺癌的患者,剩余182名志愿者为健康人,每名志愿者抽取大于8mL静脉血。所述样本收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者都签署了知情同意书。
随机选择86名胰腺导管腺癌患者和110名健康人的血液样本作为训练集。
剩余58名胰腺导管腺癌患者和72名健康人的血液样本作为验证集。
2)样本游离DNA的提取:
新鲜的抗凝血样本经离心后,吸取上层血浆层,用于提取血浆游离DNA。使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取,具体操作按照试剂盒说明书进行。
3)样本DNA的转化和纯化:
得到cfDNA以后,采用武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)对其进行DNA的转化,随后对转化的DNA进行纯化,用于后续实验,具体操作步骤参见试剂盒说明书。
4)甲基化特异性荧光定量PCR反应
以转化后的血浆cfDNA作为模板,分别使用表4中提供的检测引物对和检测探针进行荧光定量PCR反应来扩增各个不同的目标区域。具体地,按照表6提供的配方配置PCR扩增体系,配方中用到的DNA聚合酶及缓冲液等成分均购自Invitrogen(Cat:14966005)。需要说明的是,在进行每一个PCR反应时,需要同时检测内参基因ACTB的量,用于监测样本质量及结果判读。本实施例中用到的扩增ACTB基因片段的上游引物序列为:5’-AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG-3’,SEQ ID NO.31;扩增ACTB基因片段的下游引物序列为:5’-AATAACACCCCCACCCTGC-3’,SEQ ID NO.32;与之对应的检测探针序列为:5’-VIC-GGAGTGGTTTTTGGGTTTG-BHQ1-3’,SEQ ID NO.33,检测探针的5’端荧光基团为VIC,3’端荧光淬灭基团为BHQ1。此外,在检测生物样本中每一个目标区域时,需要同时设置质控实验,即需要设置阳性对照PCR管和阴性对照PCR管。对于某一目标区域,阳性对照PCR管和阴性对照PCR管的配置体系与实验测试PCR管相同,但是阳性对照PCR管的模板为103拷贝/微升的含转化后该目标区域的质粒和103拷贝/微升的含转化后ACTB基因片段的质粒等体积混合而成,阴性对照PCR管的模板为TE缓冲液。当阳性对照PCR管、实验测试PCR管和阴性对照PCR管的体系配置完成后,按照表7提供的程序在荧光定量PCR仪上进行反应。
表6 qMSP反应体系
表7 qMSP扩增程序
qPCR反应结束后,调整基线,并设置阈值,阈值必须位于指数扩增期内,穿越阈值与X轴平行的直线称为阈值线,阈值线与扩增曲线的交点所对应的循环数即为Ct值。分析qPCR反应的结果,要求①阴性对照PCR管无扩增(即不起线);②阳性对照PCR管有明显的指数增长期,且阳性对照PCR管目标基因的Ct值在26~30之间;③待测样本的内参基因的Ct值小于等于33。若阳性对照、阴性对照和内参基因均满足上述要求,则可以分析待测样本的检测结果并进行结果判读,否则,当时实验无效,必须重新进行检测。
5)结果判读
分析训练集中共196例血液样本的qPCR结果,计算每个样本中不同目标区域的ΔCt值,ΔCt=Ct(目的区域)-Ct(ACTB),然后使用IBMSPSS 22.0软件构建Logistic回归模型。具体地,将胰腺癌血浆样本的状态变量定为“1”,将健康人血浆样本的状态变量定为“0”,输入各个目标区域的ΔCt值及其对应的状态变量值,点击“分析”-“回归”-“二元Logistic”,将状态变量值输入“因变量”数据框,将各个目标区域的ΔCt值输入“协变量”数据框,分析方法选择“向前-LR”,保存预测的概率值,得到最终的分析结果,根据Logistic回归模型,得出预测样本患胰腺癌的风险概率值的方程,如下所示:
Probability(P)=ef(x)/(1+ef(x)) 公式I
f(x)=(-0.46)*ΔCt(区域1)+(-0.216)*ΔCt(区域2)+(-0.116)*ΔCt(区域3)+(-0.4)*ΔCt(区域4)+(-0.232)*ΔCt(区域5)+(-0.212)*ΔCt(区域6)+27.782 公式II
然后,以二元Logistic分析得到的概率值作为检验变量,将样本的病理状态作为状态变量,同样将状态变量的值定为1,并选择“较大的检验结果表示更明确的检验”,得出ROC分析结果,选择约登指数(灵敏度+特异性-1)最大时的概率值为截断值,并得到AUC值、灵敏度和特异性数值,如图1所示,该诊断模型的曲线下面积为0.98,当约登指数最大时,概率值(截断值)为0.448,此时该模型的灵敏度为90.5%,特异性为97.2%。
结果判读:把待测样本中各个目标区域的ΔCt值带入上述公式,得到概率值P,若P值大于等于0.448,则该样本为胰腺癌阳性,若P值小于0.448,则该样本为胰腺癌阴性。
实施例3分子标记物的性能验证(验证集)
将剩余58名胰腺导管腺癌患者和72名健康人的血液样本作为验证集样本。
采用表4中的提供的检测引物对和检测探针,通过甲基化特异性荧光定量PCR的方法检测验证集中血液样本的甲基化水平,将得到的各样本中各个目标区域的ΔCt值带入上述公式I和II中,计算出最终的概率值P,并根据实施例2中结果判读的标准评估待测样本为胰腺癌阳性样本或胰腺癌阴性样本。根据公式I和II以及截断值评估待测样本的灵敏度和特异性如表8所示。
表8六个目标区域诊断胰腺癌血液样本的性能
由表8可以看出,利用六个标记物的特定区域的甲基化水平联合诊断胰腺癌患者血液样本的灵敏度高达86.21%,其诊断健康人血液样本的特异性高达95.83%。此方法提供了无创或微创的、高灵敏度、高特异性的诊断或辅助诊断胰腺癌的方法,对胰腺癌的早期诊断和治疗以及提高患者的生存率具有重要意义。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本申请的保护范围。因此,本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准,说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (11)
1.一种试剂,其特征在于,所述试剂能够检测分子标记物的甲基化水平,以GRCh38.p14为参考,所述分子标记物包括区域1、区域2、区域3、区域4、区域5和区域6全长或部分区域的组合;
所述区域1为Chr17:48995974-48996223的负链;所述区域2为Chr12:49903846-49904095的正链;所述区域3为Chr10:11017614-11017863的正链;所述区域4为Chr2:176080246-176080495的正链;所述区域5为Chr3:129974546-129974795的负链;所述区域6为Chr12:128267365-128267614的正链。
2.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于,所述试剂包括采用以下中的至少一种方法检测所述分子标记物的甲基化水平:甲基化特异性荧光定量PCR、甲基化特异性PCR、焦磷酸测序、亚硫酸氢盐测序、甲基化特异性聚合酶链式反应、数字聚合酶链式反应、限制性标记的基因组扫描、CpG岛微阵列和甲基化敏感的单核苷酸的扩增。
3.根据权利要求1或2所述的试剂,其特征在于,所述试剂包括检测所述区域1~区域6甲基化水平的引物对;
可选地,检测所述区域1甲基化水平的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.13~14所示;检测所述区域2甲基化水平的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.16~17所示:检测所述区域3甲基化水平的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.19~20所示:检测所述区域4甲基化水平的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.22~23所示:检测所述区域5甲基化水平的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.25~26所示:检测所述区域6甲基化水平的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.28~29所示。
4.根据权利要求3所述的试剂,其特征在于,所述试剂还包括检测所述区域1~区域6甲基化水平的检测探针;
可选地,检测所述区域1甲基化水平的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示,检测所述区域2甲基化水平的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示,检测所述区域3甲基化水平的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示,检测所述区域4甲基化水平的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示,检测所述区域5甲基化水平的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示,检测所述区域6甲基化水平的检测探针的核苷酸序列如SEQID NO.30所示。
5.权利要求1~4任一项所述的试剂在制备胰腺癌诊断产品中的应用。
6.一种用于胰腺癌诊断的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1~4任一项所述的试剂。
7.一种预测胰腺癌风险的诊断模型的构建方法,其特征在于,包括根据权利要求1中所定义的区域1~区域6的甲基化水平,构建预测胰腺癌风险的诊断模型;
优选地,所述诊断模型使用选自以下中的一种或多种算法来构建:主成分分析、Logistic回归分析、最近邻分析、支持向量机、神经网络模型和随机森林。
8.一种预测胰腺癌风险的诊断模型,其特征在于,所述诊断模型采用权利要求7所述的方法构建而成,以权利要求1中所定义的区域1~区域6的甲基化水平作为输入变量;
可选地,所述诊断模型为Logistic回归模型。
9.根据权利要求8所述的诊断模型,其特征在于,所述诊断模型的公式包括公式I和公式II:
概率值(P)=ef(x)/(1+ef(x)) 公式I
f(x)=(-0.46)*ΔCt(区域1)+(-0.216)*ΔCt(区域2)+(-0.116)*ΔCt(区域3)+(-0.4)*ΔCt(区域4)+(-0.232)*ΔCt(区域5)+(-0.212)*ΔCt(区域6)+27.782 公式II。
10.一种胰腺癌的预测装置,其特征在于,包括以下单元:
检测单元:检测待测者样本中权利要求1中所定义的区域1~区域6的甲基化水平;
分析单元:将检测得到的区域1~区域6的甲基化水平作为输入变量,输入预测胰腺癌风险的诊断模型进行分析;
评估单元:输出待测者样本对应的概率值;
可选地,所述预测胰腺癌风险的诊断模型使用选自以下中的一种或多种算法来构建:主成分分析、逻辑回归分析、最近邻分析、支持向量机、神经网络模型和随机森林。
11.根据权利要求10所述的预测装置,所述诊断模型的阈值为0.448,当概率值大于等于阈值0.448时,提示样本为胰腺癌阳性。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211232308.XA CN117867104A (zh) | 2022-10-10 | 2022-10-10 | 多种分子标记物联合在制备胰腺癌的诊断产品中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211232308.XA CN117867104A (zh) | 2022-10-10 | 2022-10-10 | 多种分子标记物联合在制备胰腺癌的诊断产品中的应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117867104A true CN117867104A (zh) | 2024-04-12 |
Family
ID=90595407
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211232308.XA Pending CN117867104A (zh) | 2022-10-10 | 2022-10-10 | 多种分子标记物联合在制备胰腺癌的诊断产品中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117867104A (zh) |
-
2022
- 2022-10-10 CN CN202211232308.XA patent/CN117867104A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107630093B (zh) | 用于诊断肝癌的试剂、试剂盒、检测方法及用途 | |
CN111424085B (zh) | tRNA来源片段在制备乳腺癌诊断试剂中的应用 | |
CN117431321A (zh) | 一种用于***癌或癌前病变检测的核酸组合物、试剂盒及应用 | |
CN113337608B (zh) | 用于肝癌早期诊断的组合标志物及其应用 | |
CN117867104A (zh) | 多种分子标记物联合在制备胰腺癌的诊断产品中的应用 | |
CN115948561B (zh) | 一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的试剂、检测试剂盒及其应用 | |
CN115786502B (zh) | 检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌的诊断产品中的应用 | |
CN116356029B (zh) | Txnrd1基因甲基化水平检测在子宫内膜癌诊断和/或筛查中的应用 | |
CN117778573A (zh) | 一种用于检测甲状腺癌生物标志物的核酸组合、试剂盒及应用 | |
CN117987545A (zh) | 一种用于乳腺癌辅助诊断的甲基化检测试剂、试剂盒及应用 | |
CN117327794A (zh) | 一种用于检测肺结节良恶性的试剂、试剂盒及应用 | |
CN116179698A (zh) | 检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用 | |
CN118109589A (zh) | 用于检测胰腺癌分子标志物甲基化水平的试剂、试剂盒及应用 | |
CN118127153A (zh) | 检测头颈鳞状细胞癌的试剂及其应用 | |
CN117587124A (zh) | 诊断胰腺癌的检测试剂和试剂盒及应用 | |
CN117778572A (zh) | 一种用于检测甲状腺癌的核酸组合、检测试剂盒及应用 | |
CN118308481A (zh) | 用于诊断卵巢癌的生物标志物、引物对、核酸产品、试剂盒及应用 | |
CN116287227A (zh) | 用于诊断***癌的试剂和试剂盒 | |
CN117467763A (zh) | 一种检测非小细胞肺癌生物标志物甲基化水平的核酸组合和试剂盒 | |
CN117265110A (zh) | 一种用于检测肺鳞癌的试剂盒及应用 | |
CN117778582A (zh) | 用于检测胃癌的核酸组合、试剂盒及应用 | |
CN116411073A (zh) | 用于检测食管癌或癌前病变的核酸产品、试剂盒及应用 | |
CN117106899A (zh) | 一种用于检测肺结节良恶性的引物对、引物探针组合、试剂盒及应用 | |
CN116179693A (zh) | 检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备妇科恶性肿瘤诊断产品中的应用 | |
CN118256621A (zh) | 一种用于检测胃癌的核酸试剂、检测试剂盒及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |