CN117778572A - 一种用于检测甲状腺癌的核酸组合、检测试剂盒及应用 - Google Patents
一种用于检测甲状腺癌的核酸组合、检测试剂盒及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117778572A CN117778572A CN202311655171.3A CN202311655171A CN117778572A CN 117778572 A CN117778572 A CN 117778572A CN 202311655171 A CN202311655171 A CN 202311655171A CN 117778572 A CN117778572 A CN 117778572A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- methylation
- thyroid cancer
- nucleic acid
- detecting
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 96
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 94
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 72
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 34
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 34
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 34
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims abstract description 138
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 138
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims abstract description 41
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 83
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 37
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 36
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 claims description 24
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 21
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 21
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 21
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 12
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 11
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 10
- 101100495925 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) chr3 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 9
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims description 5
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 claims description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000003498 protein array Methods 0.000 claims description 3
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 13
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 63
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 25
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 20
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- 101150098613 ST3GAL6 gene Proteins 0.000 description 18
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 15
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 14
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 12
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 8
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 8
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 7
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 7
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 6
- 101000663222 Homo sapiens Serine/arginine-rich splicing factor 1 Proteins 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 6
- 102100024458 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A Human genes 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000007855 methylation-specific PCR Methods 0.000 description 5
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 3
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000012549 training Methods 0.000 description 3
- AOSFMYBATFLTAQ-UHFFFAOYSA-N 1-amino-3-(benzimidazol-1-yl)propan-2-ol Chemical compound C1=CC=C2N(CC(O)CN)C=NC2=C1 AOSFMYBATFLTAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000009453 Thyroid Nodule Diseases 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 238000007854 ligation-mediated PCR Methods 0.000 description 2
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- DJEHXEMURTVAOE-UHFFFAOYSA-M potassium bisulfite Chemical compound [K+].OS([O-])=O DJEHXEMURTVAOE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940099427 potassium bisulfite Drugs 0.000 description 2
- 235000010259 potassium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 2
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150087690 ACTB gene Proteins 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 102000009508 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p16 Human genes 0.000 description 1
- 108010009392 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p16 Proteins 0.000 description 1
- 108010076804 DNA Restriction Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000712958 Homo sapiens Ras association domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000772267 Homo sapiens Thyrotropin receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000836755 Homo sapiens Type 2 lactosamine alpha-2,3-sialyltransferase Proteins 0.000 description 1
- -1 MGB Chemical compound 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108010011536 PTEN Phosphohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 102000014160 PTEN Phosphohydrolase Human genes 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102100033243 Ras association domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000033781 Thyroid carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102100029337 Thyrotropin receptor Human genes 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- JAECLFYFGIPXRT-UHFFFAOYSA-K aluminum;hydrogen sulfite Chemical compound [Al+3].OS([O-])=O.OS([O-])=O.OS([O-])=O JAECLFYFGIPXRT-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000003150 biochemical marker Substances 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- NNTOJPXOCKCMKR-UHFFFAOYSA-N boron;pyridine Chemical compound [B].C1=CC=NC=C1 NNTOJPXOCKCMKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- LVGQIQHJMRUCRM-UHFFFAOYSA-L calcium bisulfite Chemical compound [Ca+2].OS([O-])=O.OS([O-])=O LVGQIQHJMRUCRM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000010260 calcium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- YQRQRUBEHCXCPR-UHFFFAOYSA-M cesium hydrogen sulfite Chemical compound [Cs+].OS([O-])=O YQRQRUBEHCXCPR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 150000002429 hydrazines Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006607 hypermethylation Effects 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- LPHFLPKXBKBHRW-UHFFFAOYSA-L magnesium;hydrogen sulfite Chemical compound [Mg+2].OS([O-])=O.OS([O-])=O LPHFLPKXBKBHRW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 206010043688 thyroid adenoma Diseases 0.000 description 1
- 208000013077 thyroid gland carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物医药领域，更具体地，涉及一种用于检测甲状腺癌的核酸组合、检测试剂盒及应用。本发明提供的检测试剂盒通过检测样本中甲状腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平能够有效区分甲状腺癌患者和健康人，有效提高甲状腺癌的检出率，有助于提高患者的生命质量和存活率，且检测准确度高，能够降低假阴性结果的检出，避免过度诊疗。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及一种用于检测甲状腺癌的核酸组合、检测试剂盒及应用。
背景技术
甲状腺癌(thyroid carcinoma，TC)是内分泌***中最常见的肿瘤之一，其占癌症发病率的2.59％。在诊断方面，甲状腺癌常以无痛性甲状腺结节为主要临床表现。在临床上主要通过触诊、彩超、核素显像及细针穿刺细胞学检查(fine needle aspiration biopsy，FNAB)等方法进行诊断，但却难以确定甲状腺结节的性质，即使进行病理活检，甲状腺腺瘤与结节性增生，良性肿瘤与恶性肿瘤也不易明确辨认。当前亟待解决的主要问题是避免治疗不足或治疗过度的两个极端。
DNA甲基化改变是癌症进程中最早发生的分子变化之一，并贯穿癌症的发生和发展过程且具有组织特异性，肿瘤抑制基因的高甲基化水平已被确定为抑制基因表达和促进癌细胞生长和扩增的重要机制。研究表明，多个抑癌基因如CDKN2A、RASSF1、TSHR和PTEN等可以作为辨别甲状腺癌的诊断标志物。
尽管对于肿瘤标志物的研究很多，方法也不同，但单一的肿瘤标志物因灵敏性及特异性不高不能被广泛应用。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供了一种用于检测甲状腺癌的核酸组合、检测试剂盒及应用，以改善现有技术的甲状腺癌甲基化生物标志物检测甲状腺癌的灵敏性和特异性欠佳，准确度低等的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种核酸组合在制备甲状腺癌诊断产品中的应用，所述核酸组合用于检测样本中甲状腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平；
以GRCh38.p14为参考基因组，所述甲状腺癌甲基化生物标志物选自(a)-(c)中至少一项：
(a)chr3:98733897-98734297的全长区域或部分区域，所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点；
(b)(a)中CpG二核苷酸位点发生部分甲基化或全部甲基化的多核苷酸分子；
(c)与(a)具有85％以上序列一致性的多核苷酸分子，其CpG二核苷酸位点与(a)保持一致。
优选地，所述甲状腺癌诊断产品包括引物、探针、试剂盒、芯片、测序文库、膜条和蛋白阵列中的至少一种。
本发明还提供了一种用于检测甲状腺癌的核酸组合，其用于检测样本中甲状腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平；
以GRCh38.p14为参考基因组，所述甲状腺癌甲基化生物标志物选自(a)-(c)中至少一项：
(a)chr3:98733897-98734297的全长区域或部分区域，所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点；
(b)(a)中CpG二核苷酸位点发生部分甲基化或全部甲基化的多核苷酸分子；
(c)与(a)具有85％以上序列一致性的多核苷酸分子，其CpG二核苷酸位点与(a)保持一致。
优选地，所述甲状腺癌甲基化生物标志物选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5中的至少一个。
优选地，所述核酸组合包括用于检测所述甲状腺癌甲基化生物标志物甲基化水平的甲基化引物对。
进一步优选地，所述甲基化引物对的核苷酸如SEQ ID NO.11～12所示，
优选地，所述核酸组合还包括用于检测所述甲状腺癌甲基化生物标志物甲基化水平的非甲基化引物对；
所述非甲基化引物对的核苷酸如SEQ ID NO.13～14所示。
优选地，所述核酸组合还包括检测探针；进一步优选地，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
优选地，所述检测探针的5'端包含有荧光报告基团，3'端包含有荧光淬灭基团。
本发明还提供了一种用于检测甲状腺癌的检测试剂盒，其包括所述核酸组合。
优选地，所述检测试剂盒还包括内参基因的上下游引物及检测探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的一种用于检测甲状腺癌的核酸组合、检测试剂盒，通过检测样本中甲状腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平能够有效区分甲状腺癌患者和健康人，实现低侵袭性、低成本、高灵敏性、高特异性的检测甲状腺癌。
(2)优选实施例中，本发明提供的检测试剂盒通过检测ST3GAL6基因的靶区域(chr3:98733897-98734297)的甲基化水平检测甲状腺癌血液样本的灵敏性可达87.8％，检测健康人血液样本的特异性可达93.4％。本发明提供的检测试剂盒可有效提高甲状腺癌的检出率，有助于提高患者的生命质量和存活率，且检测准确度高，能够降低假阴性结果的检出，避免过度诊疗。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语“诊断”是指确定受试者的健康状态，涵盖检测疾病的存在与否、对治疗手段的反应、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。在一些情况下，术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态。一些实施例中，“检测”甲状腺癌是指检测疾病存在与否，即判断受试者是否患有甲状腺癌。
术语“受试者”是指接受观察、检测或实验的对象。一些实施例中，受试者可以是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于灵长类(包括人和非人灵长类)以及啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。一些实施例中，哺乳动物可以是人。
术语“样本”或“样品”包括从任何个体(较佳地为人)或分离的组织、细胞或体液(如血浆)中获得的、适合于DNA甲基化状态检测的物质。例如，所述样本可以包括但不限于：血液样本、组织样本(如石蜡包埋样本)、细胞样本；较佳地，所述样本包括但不限于：血液样本、血浆样本、血清样本，或其组合。
术语“甲基化生物标志物”是指一种生化指标，其包括至少一个甲基化基因座和/或至少一个甲基化基因座的甲基化状态，例如高甲基化基因座。特别地，甲基化生物标志物是甲基化状态在癌症个体和非癌个体呈现差异化的一个或多个核酸基因座。其中，“甲基化基因座”是指包含至少一个差异甲基化区域的DNA区域或片段。在选定的条件下，例如癌症状态下，甲基化基因座是高甲基化的，即相比于非癌状态包括更多数量或频率的甲基化位点；或者，在癌症状态下，甲基化基因座可以是低甲基化的，即相比于非癌状态包括较少数量或频率的甲基化位点。甲基化生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。筛选可用于疾病筛查、早期诊断的甲基化生物标志物可大大提高患者的临床治疗效果。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以通过任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而调控基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应，PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本发明公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指上游引物和下游引物组成的组。
术语“硫化测序PCR(Bisulfite Sequencing PCR，BSP)”是通过对基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理，非甲基化的胞嘧啶被脱氨基而转变成尿嘧啶，在随后的PCR反应中尿嘧啶转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不能被脱氨基，在反应完成时被保留；然后在非甲基化区域设计引物进行PCR扩增，将扩增得到的PCR产物进行克隆测序，将测得的序列与原始序列比对，统计甲基化位点及数量，并分析甲基化程度。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后，所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。在本公开内容中，进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物，若Ct值满足所述要求(例如在血浆样本中Ct≤45)，则表明目标序列是甲基化的。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对，从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来，qMSP最终的检测指标为荧光信号，因此，在qMSP反应***中，除加入甲基化检测引物以外，还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比，qMSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高，更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段，且该技术不需要凝胶电泳检测，操作更加简便。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。
本发明提供了一种核酸组合在制备甲状腺癌诊断产品中的应用，上述核酸组合用于检测样本中甲状腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平；
以GRCh38.p14为参考基因组，上述甲状腺癌甲基化生物标志物选自(a)-(c)中至少一项：
(a)chr3:98733897-98734297的全长区域或部分区域，上述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点；
(b)(a)中CpG二核苷酸位点发生部分甲基化或全部甲基化的多核苷酸分子；
(c)与(a)具有85％以上序列一致性的多核苷酸分子，其CpG二核苷酸位点与(a)保持一致。
一些实施例中，上述甲状腺癌甲基化生物标志物选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5中的至少一个。
一些实施例中，上述诊断包括但不限于甲状腺癌的鉴别诊断、微小病灶残留评估及动态监测、甲状腺癌复发及预后的辅助判断、药物疗效评估及耐药监测等。其中，上述甲状腺癌的鉴别诊断具体可以是用于确认个体是否患有甲状腺癌或者更加有可能患有甲状腺癌；上述微小病灶残留评估及动态监测具体可以是用于确认个体中是否残留微小病灶；上述甲状腺癌复发及预后的辅助判断是指甲状腺癌复发的风险和预后情况预测，具体可以是用于确认个体甲状腺癌复发的可能性或恶化倾向，可用于指导临床诊疗；上述药物疗效评耐药监测具体可以是用于确认某种药物或治疗手段是否对个体有效。
一些实施例中，上述甲状腺癌诊断产品包括引物、探针、试剂盒、芯片、测序文库、膜条和蛋白阵列中的至少一种。
本发明还提供了一种用于检测甲状腺癌的核酸组合，其用于检测样本中甲状腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平；
以GRCh38.p14为参考基因组，上述甲状腺癌甲基化生物标志物选自(a)-(c)中至少一项：
(a)chr3:98733897-98734297的全长区域或部分区域，上述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点；
(b)(a)中CpG二核苷酸位点发生部分甲基化或全部甲基化的多核苷酸分子；
(c)与(a)具有85％以上序列一致性的多核苷酸分子，其CpG二核苷酸位点与(a)保持一致。
一些实施例中，上述甲状腺癌甲基化生物标志物选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5中的至少一个。
一些实施例中，上述核酸组合包括用于检测上述甲状腺癌甲基化生物标志物甲基化水平的甲基化引物对。
一些实施例中，上述核酸组合包括用于检测chr3:98733897-98734297的全长区域或部分区域的甲基化水平的甲基化引物对。可以理解的是，在检测chr3:98733897-98734297的甲基化水平时，可以针对其全长区域进行检测，还可以针对其部分区域进行检测。
较佳实施例中，上述甲基化引物对的核苷酸如SEQ ID NO.11～12所示，
一些实施例中，上述核酸组合还包括用于检测上述甲状腺癌甲基化生物标志物甲基化水平的非甲基化引物对。
一些实施例中，上述核酸组合还包括用于检测chr3:98733897-98734297的全长区域或部分区域的甲基化水平的非甲基化引物对。
较佳实施例中，上述非甲基化引物对的核苷酸如SEQ ID NO.13～14所示。
需要说明的是，若一种引物对与上述甲基化引物对、上述非甲基化引物对所示的核苷酸序列具有至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等)以上的序列一致性，且该引物对同样具有一定的甲状腺癌诊断功能(特异性或灵敏性与本申请引物对相比，相当或略有下降或略有提高或大幅提高等)，也在本发明的保护范围内。
一些实施例中，上述核酸组合还包括检测探针。
较佳实施例中，上述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
本发明还提供了一种用于检测甲状腺癌的检测试剂盒，其包括上述核酸组合。
一些实施例中，上述检测试剂盒还包括内参基因的上下游引物及检测探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
一些实施例中，上述内参基因可以为但不限于ACTB。在一个可选地具体示例中，内参基因ACTB的上下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.15～16所示，检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.18。可以理解的是，在其他实施例中，还可以选择其他内参基因，此时，内参引物对对应设计即可。
一些实施例中，上述检测探针的5'端均含有荧光报告基团，3'端均含有荧光淬灭基团。上述检测各探针的荧光报告基团独立地选自FAM、VIC、HEX、NED、ROX、TET、JOE、CY3和CY5中的任意一种；上述各检测探针的荧光淬灭基团独立地选自TAMRA、MGB、BHQ、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的任意一种。在同一个反应体系中有两种以上的检测探针时，不同检测探针上连接的荧光基团不同。各检测探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团的举例各自独立地包括但不限于上述所列举。
一些实施例中，上述甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。本发明对甲基化转化试剂无特别限制，现有技术中报道的可实现胞嘧啶到尿嘧啶转化的试剂均可以，如肼盐、重亚硫酸盐(例如重硫酸钠、重硫酸钾、重硫酸铵)和亚硫酸氢盐(例如亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铝、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)中的一种或多种。
一些实施例中，上述扩增试剂包括但不限于扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。一些实施例中，上述阳性对照是指其中包含甲基化的甲状腺癌甲基化生物标志物，用于监测试剂盒中试剂的检测性能。上述阴性对照是指其中不包含甲基化的甲状腺癌甲基化生物标志物，用于监测实验是否受到污染。
一些实施例中，上述检测试剂盒还包括用于容纳受试者生物样品的容器。一些实施方式中，上述试剂盒还包括使用和解释检测结果的说明。
一些实施例中，上述样本包括但不限于通过本领域技术人员已知的任何方法获得的个体的细胞、组织、器官和/或生物体液。一些实施方式中，上述样本选自下组：组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、体液、手术切除样本、分离的血细胞、分离自血液的细胞，及其任意组合。一些实施方式中，上述体液选自下组：全血、血清、血浆，及其任意组合。
基于本发明公开的内容，本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术对上述甲状腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平进行检测，对甲状腺癌进行诊断，无论采用何种技术，其都是属于本发明的保护范围。上述检测样本中甲状腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平的方法包括但不限于亚硫酸氢盐测序(BSP)、甲基化特异性PCR(qMSP)、亚硫酸氢盐微阵列分析、甲基化敏感性随机引物聚合酶链反应(MS AP-PCR)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)、甲基化敏感性DNA限制酶分析、基于限制酶的测序、基于限制酶的微阵列分析、联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)、甲基化CpG岛扩增(MCA)、甲基化CpG岛扩增和微阵列(MCAM)、通过连接介导PCR进行的HpaII小片段富集(HELP)、甲基化特异性焦磷酸测序、HELP测序(HELP-seq)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、Gal水解和连接衔接子依赖性PCR(GLAD-PCR)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-Seq)或甲基化DNA免疫沉淀-微阵列分析(MeDIP-chip)、使用甲基敏感性限制酶的Southern印迹法和基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。
本发明还提供了一种通过检测样本中甲状腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平进而检测甲状腺癌的方法，包括如下步骤：采集受试者外周血，分离血浆或血清，抽取血浆样本中游离DNA，采用甲基化转化试剂对其进行转化，然后对转化后的DNA进行纯化，并采用本发明提供的上述检测试剂盒进行qPCR扩增，通过qMSP法检测样本中甲状腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平，从而判断待测血浆样本是否为甲状腺癌。
以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。
实施例1甲状腺癌甲基化生物标志物及检测区域的确定
收集临床确诊为甲状腺癌的癌组织样本50例、癌旁组织样本50例及健康人外周血50例作为训练集筛选特异甲基化的区域，选择检测组织样本的灵敏性、特异性均≥80％，检测外周血样本的特异性≥90％的区域进入下一步验证。所有样本的收集过程已获得伦理委员会的审批。
本发明以GRCh38.p14为参考基因组，提供的甲状腺癌甲基化生物标志物为基于SFRS1基因、ST3GAL6基因分离的多核苷酸分子SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，其中SEQ IDNO.1位于SFRS1基因的17号染色体正链第58005728-58006128位的碱基的片段；SEQ IDNO.2位于ST3GAL6基因的3号染色体正链第98733897-98734297位的碱基的片段。具体序列如下：
SEQ ID NO.1的DNA序列为(5'-3')：
TTACCTTGAAATTCCACTGTTAAGACCACTGTATCCAATTCTGGTCAAAGAAAAGAATACGTGTATAACCTACCTCATGAGATCTAAACTTAGTGTTATCCAGTTTTCGAACTGCATAGGTCATATCTTCTTTCCGTACAAACTCCACGACACCAGTGCCATCTCGGTAAACATCAGCATAACATACATCACCTGCTTCACGCATGTGATCCTTTAAATCCTGCCAACTTCCACTTGGAGGCAGTCCTGAAAAAGTGATTTTTTTTTTCTTAGTACCAATTATCTTAAATTTCACGTTAAGCTGGTAAGGTACATTAGGACAAAGAGTACTTTAAAGTACTTAATAGGTGTACTTAAGTGATACCAGGTAAAGAGAGCTGGTAAGATTCTGGAATCCAGAG。
SEQ ID NO.2的DNA序列为(5'-3')：
AAAATAACGTGGTGACTGCTAGTGTATCAGAAATCACACCGAGTCTAAAGTCGTAAGTCCCATTTGCCTTACGAGGACCAGCTGGGTGCTGTGAGTAGGTGGATAGTTAAGGAAACTGTAGATCTGCTGAAAGCTCCTCGTGGTCTGTGGTCTCGTGTCCACGCTGACCTTTGAACCTCGTAACTCTTCGGGTCTCCAGCGGCCACCTCTTTTAGGCTAGCCCGAATGTTTGACTTTCCGGTCCTCAATCTTCCTCACCTAGCTGCAGACCATAAAACTGTCTTTTTATTTACAGGGAGATGTTAAATATTTGGGAACATCTGCTCAGGCTGCCAGGTTATTTTCCGTTTGAAAGCATGCCGATTTGACATTTGCAAGTTGGTTTATGTTGCTTCCTTTTT。
上述多核苷酸分子经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸盐处理后，DNA双链中的“C”转化为“U”，通过随后的PCR，将“U”转化为“T”，但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的DNA的“C”发生上述转化。SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2经过亚硫酸氢盐处理后的序列见表1。
表1 SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2经亚硫酸氢盐处理后的序列
根据上述经亚硫酸氢盐处理后的多核苷酸分子设计引物，对于硫化测序PCR(bisulfite sequencing PCR，BSP)需要设计两对引物，一对是针对于经亚硫酸氢盐处理后的甲基化序列(完全甲基化且经亚硫酸氢盐转化后的序列)；另一对是针对于经亚硫酸氢盐处理后的非甲基化序列(完全未甲基化且经亚硫酸氢盐转化后的序列)。根据甲基化引物对只特异性扩增甲基化序列，非甲基化引物对只特异性扩增非甲基化序列的引物设计原则，本实施例设计的甲基化引物对、非甲基化引物对见表2。
表2甲基化引物对和非甲基化引物对的核苷酸序列
基于上述设计的引物对和焦磷酸测序法检测SFRS1基因和ST3GAL6基因的靶区域在甲状腺癌组织样本、癌旁正常组织样本、外周血样本的甲基化状态，具体步骤如下：
1)样本DNA的提取
DNA样品为甲状腺癌组织、癌旁正常组织和外周血时，采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP304)提取各样本的细胞基因组DNA，具体操作参见试剂盒说明书。
2)亚硫酸氢盐转化和纯化处理
将提取好的各个样本的基因组DNA分别进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸纯化试剂(鄂汉械备20200843)，具体操作参见试剂盒说明书。
3)PCR反应
以经亚硫酸氢盐转化后的多核苷酸分子为模板，加入SYBR Green PCR Mix、甲状腺癌甲基化生物标志物(SFRS1基因的靶区域、ST3GAL6基因的靶区域)的甲基化引物对和非甲基化引物对进行PCR扩增，同时加入内参基因ACTB的上下游引物，上游引物为：5'-AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG-3'(SEQ ID NO.15)，下游引物为：5'-AATAACACCCCCACCCTGC-3'(SEQ ID NO.16)。PCR反应体系、反应条件见表3、表4。
表3 SYBR Green PCR反应体系
| 组分 | 用量(μL) |
| SYBR Green PCR Mix | 17.5 |
| 甲基化(非甲基化)上游引物(10μM) | 0.5 |
| 甲基化(非甲基化)下游引物(10μM) | 0.5 |
| ACTB上游引物(10μM) | 0.5 |
| ACTB下游引物(10μM) | 0.5 |
| 模板DNA | 4 |
| 超纯水 | 补至25 |
表4 SYBR Green PCR反应程序
4)焦磷酸测序
将PCR产物送至测序公司进行焦磷酸测序，分析测序峰图、以焦磷酸测序的关键CpG位点的甲基化状态为准。具体地，一个CpG核苷酸中胞嘧啶的甲基化情况分为两种：即甲基化和未甲基化，其中甲基化又分为完全甲基化和部分甲基化，如果某一CpG二核苷酸位点上的胞嘧啶的测序结果显示在胞嘧啶的位置既有C也有T，则认为该位点是部分甲基化的。如果某一扩增子中95％以上的CpG二核苷酸位点中的C是甲基化的，则认为该样本在这一区域是甲基化的。
5)结果分析
PCR反应结束后，将扩增产物测序的结果同病理结果进行比对，计算该扩增产物的CpG位点的甲基化状态来计算此靶区域的灵敏性和特异性。灵敏性＝甲基化阳性样本/病理结果为阳性的样本；特异性＝甲基化阴性样本/病理结果为阴性的样本。检测结果见表5。
表5不同靶区域在训练集上的灵敏性和特异性
由表5可以看出，SFRS1基因和ST3GAL6基因作为甲状腺癌甲基化生物标志物，其在甲状腺癌组织样本中的甲基化水平明显高于其在癌旁组织样本中的甲基化水平。在训练集样本上，通过检测SFRS1基因的靶区域(SEQ ID NO.1)的甲基化水平检测外周血样本的特异性为88.0％，不满足检测外周血样本的特异性≥90％的初步筛选标准，通过检测ST3GAL6基因的靶区域(SEQ ID NO.2)的甲基化水平满足检测灵敏性和特异性均≥80％，且检测外周血样本的特异性≥90％的初步筛选标准，因此，选择ST3GAL6基因的靶区域(SEQ ID NO.2)进入下一步验证。
实施例2在血液样本上检测ST3GAL6基因的靶区域的甲基化状态
利用焦磷酸测序的方法在48例甲状腺癌患者的血液样本及48例健康人血液样本的测试集中对筛选得到的差异甲基化位点进行评估，具体过程如下：
1)提取DNA样品
DNA样品为血液样本时，采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒(目录号：DP709)进行血浆cfDNA提取，所用血浆体积为1.5mL，具体操作参见试剂盒说明书，提取完成后，用50μL纯化水进行洗脱。
2)亚硫酸氢盐转化和纯化处理
将提取好的各个样本的基因组DNA分别进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸纯化试剂(鄂汉械备20200843)，具体实验操作参见试剂盒说明书，转化完成后，用30μL纯化水进行洗脱。
3)PCR反应、焦磷酸测序、结果分析同实施例1。
4)检测结果
通过检测测试集样本中ST3GAL6基因的靶区域(SEQ ID NO.2)的甲基化状态可以区分甲状腺癌样本和正常样本。ST3GAL6基因的靶区域(SEQ ID NO.2)检测甲状腺癌血液样本的灵敏性为85.4％，检测健康人血液样本的特异性为93.5％。因此，选择选择ST3GAL6基因的靶区域(SEQ ID NO.2)进入后续临床样本的验证。
实施例3基于qMSP法用于检测甲状腺癌血液样本的甲基化检测试剂盒
本实施例在试验过程中对采集的样本经过编盲后，再由试验操作者进行试验，结果判读者根据判读标准，将得到的检测结果与病理结果(金标准)进行比对，考察甲状腺癌甲基化生物标志物的临床有效性。
为了实现无创检测和进一步提高试剂盒诊断甲状腺癌血液样本的灵敏性，本实施例共纳入151例健康人血液样本，49例甲状腺癌患者血液样本。本研究经本院伦理委员会审核满足展开标准，且患者均签署知情同意书文件。本实施通过检测受试者血液样本中甲状腺癌甲基化生物标志物(即ST3GAL6基因的靶区域)的甲基化水平来诊断甲状腺癌患者。具体过程如下：
1)DNA样品提取、亚硫酸氢盐转化和纯化处理同实施例2。
2)qPCR反应
以亚硫酸氢盐转化后的多核苷酸序列为模板设计检测探针，用TaqMan探针法对临床样本进行ST3GAL6基因的靶区域的PCR扩增。每个PCR管中需加入反应成分、模板、ST3GAL6基因的靶区域的甲基化引物对(SEQ ID NO.11～12)和检测探针(SEQ ID NO.17:5'-TCAAAAATCAACGTAAACAC-3')，以及内参基因ACTB的上下游引物(SEQ ID NO.15～16)和检测探针(SEQ ID NO.18:5'-GGAGTGGTTTTTGGGTTTG-3')。上述检测探针的5'端均为荧光报告基团，如FAM、ROX、VIC、CY5等，3'端均为荧光淬灭基团，如TAMRA、BHQ、BHQ1、MGB等。本实施例中，ST3GAL6基因的靶区域的检测探针5'端的荧光报告基团为ROX，3'端的荧光淬灭基团为BHQ或BHQ1，ACTB基因的检测探针5'端的荧光报告基团为FAM，3'端的荧光淬灭基团为MGB。此外还需要设置阴性和阳性对照：阴性对照PCR管的模板为TE缓冲液，其它成分与实验管相同；阳性对照PCR管的模板为103copies/μL含完全甲基化且亚硫酸氢盐转化后ACTB序列的质粒和103copies/μL含完全甲基化且亚硫酸氢盐转化后靶区域的质粒等体积的混合物，其它成分也与实验管相同。qPCR反应体系、反应条件见表6、表7。
表6 qPCR反应体系
表7 qPCR程序
qPCR反应结束后，需手动调整基线和设置合适的阈值，基线通常是3～15个循环的荧光信号，阈值置于指数扩增期内。
3)结果分析
分析qPCR反应的结果，要求①阴性对照PCR管无扩增；②阳性对照PCR管有明显的指数增长期，且阳性对照PCR管目标区域的Ct值在26～30之间；③待测样本的内参基因的Ct值小于等于34。
若阳性对照、阴性对照和内参基因均满足上述要求，则可以分析待测样本的检测结果并进行结果判读，否则，当次实验无效，必须重新进行检测。对于血液样本，阳性判断值为45，若使用ST3GAL6基因的靶区域的甲基化引物对和检测探针进行扩增的Ct值≤45，则判定该样本在此靶区域为甲基化阳性；若使用ST3GAL6基因的靶区域的甲基化引物对和检测探针进行扩增的Ct值＞45，则判定该样本在此靶区域为甲基化阴性。
4)检测结果
通过qMSP法检测血液样本中ST3GAL6基因的靶区域的甲基化水平诊断甲状腺癌的灵敏度为87.8％，检测健康人血液样本的特异性为93.4％。因此，本发明制备的检测试剂盒可以有效区分健康人和甲状腺癌患者，可有效提高甲状腺癌的检出率，检测准确度高。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种核酸组合在制备甲状腺癌诊断产品中的应用，其特征在于，所述核酸组合用于检测样本中甲状腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平；
以GRCh38.p14为参考基因组，所述甲状腺癌甲基化生物标志物选自(a)-(c)中至少一项：
(a)chr3:98733897-98734297的全长区域或部分区域，所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点；
(b)(a)中CpG二核苷酸位点发生部分甲基化或全部甲基化的多核苷酸分子；
(c)与(a)具有85％以上序列一致性的多核苷酸分子，其CpG二核苷酸位点与(a)保持一致。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述甲状腺癌诊断产品包括引物、探针、试剂盒、芯片、测序文库、膜条和蛋白阵列中的至少一种。
3.一种用于检测甲状腺癌的核酸组合，其特征在于，其用于检测样本中甲状腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平；
以GRCh38.p14为参考基因组，所述甲状腺癌甲基化生物标志物选自(a)-(c)中至少一项：
(a)chr3:98733897-98734297的全长区域或部分区域，所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点；
(b)(a)中CpG二核苷酸位点发生部分甲基化或全部甲基化的多核苷酸分子；
(c)与(a)具有85％以上序列一致性的多核苷酸分子，其CpG二核苷酸位点与(a)保持一致。
4.根据权利要求3所述的核酸组合，其特征在于，所述甲状腺癌甲基化生物标志物选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5中的至少一个。
5.根据权利要求3或4所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括用于检测所述甲状腺癌甲基化生物标志物甲基化水平的甲基化引物对；
所述甲基化引物对的核苷酸如SEQ ID NO.11～12所示。
6.根据权利要求5所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合还包括用于检测所述甲状腺癌甲基化生物标志物甲基化水平的非甲基化引物对；
所述非甲基化引物对的核苷酸如SEQ ID NO.13～14所示。
7.根据权利要求5所述的核酸组合，其特性在于，所述核酸组合还包括检测探针；所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
8.根据权利要求7所述的核酸组合，其特征在于，所述检测探针的5'端包含有荧光报告基团，3'端包含有荧光淬灭基团。
9.一种用于检测甲状腺癌的检测试剂盒，其特征在于，其包括权利要求3至8任一项所述的核酸组合。
10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括内参基因的上下游引物及检测探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311655171.3A CN117778572A (zh) | 2023-12-05 | 2023-12-05 | 一种用于检测甲状腺癌的核酸组合、检测试剂盒及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311655171.3A CN117778572A (zh) | 2023-12-05 | 2023-12-05 | 一种用于检测甲状腺癌的核酸组合、检测试剂盒及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117778572A true CN117778572A (zh) | 2024-03-29 |
Family
ID=90391877
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311655171.3A Pending CN117778572A (zh) | 2023-12-05 | 2023-12-05 | 一种用于检测甲状腺癌的核酸组合、检测试剂盒及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117778572A (zh) |
-
2023
- 2023-12-05 CN CN202311655171.3A patent/CN117778572A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2883671A1 (en) | Method for screening cancer | |
| CN113621704B (zh) | 肝癌的检测和诊断的试剂及试剂盒 | |
| CN117431321A (zh) | 一种用于***癌或癌前病变检测的核酸组合物、试剂盒及应用 | |
| CN116004831A (zh) | 一种用于膀胱癌的诊断或辅助诊断的试剂及检测试剂盒 | |
| CN116555423A (zh) | 肺癌甲基化标志物组合、检测产品及其应用 | |
| CN117778572A (zh) | 一种用于检测甲状腺癌的核酸组合、检测试剂盒及应用 | |
| CN117778573A (zh) | 一种用于检测甲状腺癌生物标志物的核酸组合、试剂盒及应用 | |
| CN117265110A (zh) | 一种用于检测肺鳞癌的试剂盒及应用 | |
| CN115948561B (zh) | 一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的试剂、检测试剂盒及其应用 | |
| CN117106899A (zh) | 一种用于检测肺结节良恶性的引物对、引物探针组合、试剂盒及应用 | |
| CN115786502B (zh) | 检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌的诊断产品中的应用 | |
| CN117144012A (zh) | 一种用于肺腺癌检测的甲基化分子标志物、试剂盒及应用 | |
| CN117467763A (zh) | 一种检测非小细胞肺癌生物标志物甲基化水平的核酸组合和试剂盒 | |
| CN115094139B (zh) | 检测甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用以及膀胱癌诊断试剂盒 | |
| CN118028472A (zh) | 用于检测***癌的引物对、引物探针组合、试剂盒及应用 | |
| CN118064592A (zh) | 用于检测***癌的核酸组合、试剂盒及应用 | |
| CN117248018A (zh) | 一种用于检测子宫内膜癌的试剂盒 | |
| CN116179698A (zh) | 检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备子宫内膜癌诊断产品中的应用 | |
| CN118256621A (zh) | 一种用于检测胃癌的核酸试剂、检测试剂盒及应用 | |
| CN118109589A (zh) | 用于检测胰腺癌分子标志物甲基化水平的试剂、试剂盒及应用 | |
| CN117327794A (zh) | 一种用于检测肺结节良恶性的试剂、试剂盒及应用 | |
| CN118308481A (zh) | 用于诊断卵巢癌的生物标志物、引物对、核酸产品、试剂盒及应用 | |
| CN118127161A (zh) | 用于检测胃癌的甲基化分子标志物、试剂、试剂盒及应用 | |
| CN117402973A (zh) | 一种用于检测乳腺癌的核酸试剂、试剂盒及应用 | |
| CN116751863A (zh) | 一种用于检测咽部恶性肿瘤分子标志物甲基化水平的试剂盒及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |