CN118109333A - 一株高产耐热谷氨酰胺转氨酶的茂原链霉菌菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株高产耐热谷氨酰胺转氨酶的茂原链霉菌菌株,属于基因工程技术领域。本发明提供一种通过ARTP诱变结合同源重组双交换获得高产重组耐热谷氨酰胺转氨酶菌株的方法，通过发酵测定，诱变菌株smY2022最高酶活为41.9U/mL，利用该诱变菌株得到的重组菌发酵后，重组TGm2酶活达到61.7U/mL。通过酶学性质测定，其比酶活是smTG的2.9倍；最适反应温度比smTG高10℃。重组TGm2在60℃的半衰期达到64.05min。以上结果表明，通过ARTP诱变结合同源重组双交换可以获得高产的耐热重组耐热谷氨酰胺转氨酶菌株。为其他基因在茂原链霉菌中的高效表达奠定理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及一株高产耐热谷氨酰胺转氨酶的茂原链霉菌菌株,属于基因工程技术领域。
背景技术
谷氨酰胺转氨酶(EC 2.3.2.13)是一种蛋白质交叉连接和蛋白质修饰酶,能够催化谷氨酰胺残基与蛋白质中不同的酰基受体之间形成ε-(γ-谷氨酰胺)异肽键,导致交联或小分子修饰。目前已被广泛应用于肉制品,乳制品和豆制品等食品领域，同时还应用于抗体-药物偶联,组织工程等非食品领域，微生物TGase最早从Streptomyces mobaraenesis中分离,相较于动物和植物来源,S.mobaraenesis来源的TGase(smTG)具有不依赖Ca2+的催化反应,生产成本低等优势。这也使S.mobaraenesis发酵成为目前商业TGase的主要来源。然而,smTG低热稳定性和低比酶活的问题限制了其应用效率。
到目前为止,许多耐热的smTG突变体被构建出来，例如,通过随机突变以及饱和突变获得的smTG热稳定性组合突变体TGm1(S2P-S23V-Y24N-S199A-K294L),其在60℃的半衰期达到24.3min,是smTG的11.2倍；利用脯氨酸扫描并通过虚拟饱和突变的方法,获得的FRAPD-TGm2(S2P-S23V-Y24N-E28T-S199A-A265P-A287P-K294L),在60℃的半衰期为66.87min,比酶活为71.41U/mg；通过表面静电荷设计,获得的突变体FRAPD-TGm3(S2P-S23V-Y24N-E28T-N96E-S144E-N163D-R183E-S199A-R208E-A265P-A287P-K294L-K325E),60℃半衰期为122.91min,比酶活达到83.74U/mg；虽然已存在许多耐热的TGase突变体，但都是在大肠杆菌宿主中进行表达,无法进行食品等领域的应用。
作为TGase生产的主要菌株，S.mobaraenesis具有良好的蛋白分泌能力和安全性。尹小强等人通过ARTP诱变和基因定点修饰获得了高产TGase的S.mobaraenesis菌株，这也说明了通过基因定点修饰可以在S.mobaraenesis中重组表达TGase。但是目前TGase在S.mobaraenesis中的重组表达都需要引入额外的抗生素耐药基因，同时在S.mobaraenesis中双交换同源重组表达TGase的专利和报道还未见。本发明对TGase在S.mobaraenesis重组表达研究具有借鉴意义，同时为耐热TGase在工业上的应用奠定了基础。
发明内容
本发明要解决的问题是耐热TGase在S.mobaraenesis中的高效重组表达问题。
本实验先将S.mobaraenesis DSM40587(smWT)孢子进行ARTP诱变后筛选获得一株TGase高产菌株，利用同源重组双交换的方法将smTG基因原位替换为经密码子优化后的TGm2基因，并测定重组TGm2的酶学性质。TGm2的基因表达框核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
本发明提供了一株茂原链霉菌(Streptomyces mobaraenesis)SmY2022，已于2023年10月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M20231937，保藏地址为中国典型培养物保藏中心。
在本发明的一种实施方式中，所述高产菌株的诱变筛选，重组菌株的构建和酶学性质测定
(1)ARTP诱变及菌株筛选：首先，用ARTP处理smWT的预萌发的孢子，ARTP处理功率为120W，处理时间为70s。用PI染色后，用流式细胞术对活孢子进行分选，然后在48孔板中培养，分析TGase活性，选择酶活最高的前10个菌株进行摇瓶培养。然后，对TGase活性最高的突变体进行下一轮ARTP突变，共进行25轮诱变筛选后获得TGase高产菌株smY2022。
(2)重组菌株的构建：以茂原链霉菌(S.mobaraenesis DSM40587)全基因组为模板，利用引物delTG-FF/delTG-FR和delTG-RF/delTG-RR分别PCR扩增tg基因上下游同源序列各约3000bp。利用一步克隆的方法将上下游同源序列连接至载体pJTU1278的BamHⅠ-EcoRⅠ位点，得到质粒pJTU1278-Δtg。利用结合转移的方法将质粒pJTU1278-Δtg转化至smY2022中，筛选双交换菌株并进行PCR验证，获得tg缺失菌株smY2022-Δtg。以合成质粒pUC-TGm2为模板，用引物TGm2-F/TGm2-R扩增TGm2表达框共1745bp；再次以茂原链霉菌(S.mobaraenesis DSM40587)全基因组为模板，利用引物TGm2-FF/TGm2-FR和TGm2-RF/TGm2-RR分别扩增tg基因上下游同源序列各约3000bp。利用一步克隆的方法将三个片段一次连接在pJTU1278的BamHⅠ-EcoRⅠ位点，获得质粒pJTU1278-TGm2。将质粒转化至smY2022-Δtg中，筛选获得重组菌株smY2022-TGm2。
(3)重组TGm2的纯化和酶学性质测定：将smY2022-TGm2发酵60h后收集上清液，并进行乙醇沉淀。离心收集蛋白沉淀后用醋酸钠缓冲液(50mM pH 5.5)复溶。利用阳离子层析柱进行纯化，然后利用脱盐柱进行脱盐并测定最适反应温度和温度稳定性。乙醇沉淀后获得的蛋白沉淀制成干粉后测定最适pH。
本发明提供了一种发酵剂，含有上述茂原链霉菌(Streptomyces mobaraenesis)SmY2022。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵剂中，茂原链霉菌(Streptomycesmobaraenesis)SmY2022的添加量至少为：8％。
本发明还提供了制备上述发酵剂的方法，所述方法为，将上述茂原链霉菌(Streptomyces mobaraenesis)SmY2022接种于培养基中，培养24-36h后离心获得菌体，将菌体冷冻干燥得到发酵剂。
本发明还提供了含有上述茂原链霉菌(Streptomyces mobaraenesis)SmY2022的微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中，茂原链霉菌(Streptomycesmobaraenesis)SmY2022的添加量至少为：8％。
本发明还提供了上述茂原链霉菌SmY2022或上述发酵剂在制备谷氨酰胺转氨酶方面的应用。
本发明还提供了一种重组茂原链霉菌，所述重组茂原链霉菌是以上述茂原链霉菌(Streptomyces mobaraenesis)SmY2022为底盘细胞，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的谷氨酰胺转氨酶TGm2基因替换了所述茂原链霉菌基因组上的原始的谷氨酰胺转氨酶基因。
在本发明的一种实施方式中，所述茂原链霉菌基因组上的原始的谷氨酰胺转氨酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供了一种制备谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于，所述方法为，将上述茂原链霉菌SmY2022或权利要求2所述的发酵剂或权利要求5或6所述的重组茂原链霉菌接种至培养基进行发酵，获得含有谷氨酰胺转氨酶的发酵上清液。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为：温度为28-30℃，转速为200-250rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为：30℃、220rpm摇床发酵。
本发明还提供了上述重组茂原链霉菌在制备谷氨酰胺转氨酶方面的应用。
本发明还提供了上述茂原链霉菌SmY2022或上述发酵剂或上述重组茂原链霉菌制备得到的谷氨酰胺转氨酶在食品、化工领域的应用。
有益效果
本发明通过ARTP诱变结合同源重组双交换的方法，获得了一株高产耐热TGase的S.mobaraenesis菌株，获得的重组菌株smY2022-TGm2摇瓶发酵最高酶活达到61.7U/mL，重组TGm2具有优秀的比活力和热稳定性：比酶活为71.15U/mg，60℃半衰期达到64.05min；可适用于许多耐热的应用条件。本发明在茂原链霉菌中利用同源重组双交换实现了基因敲除和基因整合，通过同源重组双交换获得的smY2022-TGm2不含抗性标记基因，更利于工业生产及应用。获得的菌株smY2022-Δtg结合同源重组双交换方法，为其他基因在茂原链霉菌中的异源表达创造了基础，有望成为一个通用的链霉菌蛋白表达宿主。
总体来说，这对耐热TGase的应用以及其他基因在S.mobaraenesis中的重组表达具有重要借鉴意义。
生物材料保藏
一株茂原链霉菌(Streptomyces mobaraenesis)SmY2022，分类学命名为茂原链霉菌SmY2022 Streptomyces mobaraenesis SmY2022，已于2023年10月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M 20231937，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
附图说明
图1：smWT、smY2022和smY2022-TGm2的发酵曲线。
图2：重组smY2022-TGm2的构建过程示意图。
图3：smY2022-Δtg和smY2022的PCR验证图；M为DNAmaker，泳道1和4为smY2022-Δtg PCR条带，泳道2为smY2022 PCR条带，泳道3为smY2022-TGm2 PCR条带。
图4：纯化的smTG和重组TGm2的SDS-PAGE分析图。
图5：smTG和重组TGm2的热失活曲线。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
谷氨酰胺转氨酶酶活测定方法为：
以N-CBZ-Gln-Gly和羟胺为底物,采用比色法测定TGase活性。TGase反应由60μLTGase溶液与150μL底物溶液(30mM N-CBZGln-Gly,100mM羟胺,10mM谷胱甘肽,200mM Tris-HCl缓冲液,pH＝6.0)混合引发。在37℃孵育10min后,加入60μL终止试剂(1M盐酸,4％(v/v)三氯乙酸,2％(m/v)FeCl3·6H2O),终止酶反应。根据反应溶液的吸光度(A525)计算了反应产物(L-谷氨酸γ-单羟肟酸酯)。一个TGase活性单位定义为在37℃条件下,每分钟产生1μmol的CBZ-Glu-Gly羟肟酸所需的酶的量。
比酶活的测定：
比酶活测定是将纯化后的酶液经Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 8.0)稀释至0.4-0.6mg/mL，测定酶活以及蛋白浓度，计算获得比酶活参数。
温度稳定性的测定：
温度稳定性测定是将纯化后稀释的酶液在60℃条件下孵育0-120min后置于冰水混合物中保存，测定不同孵育时间样品的残余酶活。以孵育0min时的酶活为100％，计算不同孵育时间样品的相对酶活。在这些数据的基础上拟合回归方程，计算重组TGm2在60℃条件下的半衰期。
最适反应温度和最适pH的测定：
最适反应温度是将纯化后稀释的酶液分别在37-80℃条件下测定酶活，以37℃条件下的酶活为100％，计算各温度下的相对酶活。
最适pH是将发酵上清液通过乙醇沉淀以后，收集蛋白沉淀制成蛋白干粉，用pH3.5-8的缓冲液制成浓度相同的蛋白溶液，和对应pH的底物在37℃条件下反应10min测定酶活。以pH 8.0的蛋白溶液和pH 6.0的底物测得的酶活为100％，计算各pH下的相对酶活。
重组TGm2的纯化和酶学性质测定：
将smY2022-TGm2发酵60h后收集上清液，并进行乙醇沉淀。离心收集蛋白沉淀后用醋酸钠缓冲液(50mM pH 5.5)复溶。利用阳离子层析柱进行纯化，然后利用脱盐柱进行脱盐并测定最适反应温度和温度稳定性。乙醇沉淀后获得的蛋白沉淀制成干粉后测定最适pH。
下述实施例中所涉及的引物序列如表1所示：
表1.引物序列
注：下划线为一步克隆同源序列
下述实施例中所涉及的培养基和发酵条件如下：
GYM固体培养基：1％葡萄糖、0.4％酵母提取物、0.3％麦芽提取物、2％琼脂粉；
基础发酵培养基：2％甘油、2％蛋白胨、0.5％酵母提取物、2％大豆粉、0.4％K2HPO4、0.2％ KH2PO4、0.2％ CaCO3、0.2％ MgSO4；
种子培养基：2％甘油、2％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.2％ K2HPO4、0.2％ MgSO4、pH 7.2；
鱼粉发酵培养基：2％甘油、7.5％鱼粉蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.55％玉米浆粉、0.55％硫酸铵、0.2％ MgSO4、0.2％ K2HPO4、pH 7.0-7.2；
下述实施例中所涉及的茂原链霉菌发酵条件：
茂原链霉菌菌株首先在GYM固体平板上30℃培养4-5天，利用接种环刮取孢子及菌丝至含30mL种子培养基的摇瓶中，30℃、220rpm摇床培养24h，获得茂原链霉菌种子液；按8％的接种量将种子液接种至含30mL鱼粉发酵培养基的摇瓶中，30℃、220rpm进行发酵。
实施例1：ARTP诱变及菌株筛选
具体步骤如下：
1、诱变菌株的筛选
首先，通过ARTP对S.mobaraenesis DSM40587孢子进行处理，处理功率为120W，处理时间为70s，时间间隔为10s。用PI进行染色后，利用流式细胞仪对孢子进行分选，筛选到的活孢子在含有200uL GYM琼脂培养基48孔板中培养4天。然后，每个孔板加入2mL基础发酵培养基，然后在Titramax 1000微板摇床中30℃，800rpm条件培养4天。完成后，对上清液进行TGase酶活分析。
孔板酶活最高的前10个突变体进行摇瓶发酵验证，选择产量最高的突变体进行下一轮诱变。经过25轮诱变，最终筛选到一株TGase高产菌株SmY 2022，将其命名为茂原链霉菌SmY2022，并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M 20231937，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
2、菌株发酵产酶
分别采用接种环刮取茂原链霉菌S.mobaraenesis DSM40587和实施例1得到的茂原链霉菌SmY 2022孢子及菌丝至含30mL种子培养基的摇瓶中，30℃、220rpm摇床培养24h，获得茂原链霉菌种子液；
按8％(v/v)的接种量将种子液接种至含30mL鱼粉发酵培养基的摇瓶中，30℃、220rpm进行发酵，得到发酵液，将发酵液在10000r/min离心5min后，取上清液，检测谷氨酰胺转氨酶酶活。
结果显示，茂原链霉菌S.mobaraenesis DSM40587在72h达到最高酶活3.4U/mL，茂原链霉菌SmY 2022发酵56h达到最高酶活41.9U/mL，不仅发酵时间缩短，其酶活是smWT的12.2倍。
实施例2：重组茂原链霉菌菌株的构建
具体步骤如下：
(1)tg缺失菌株SmY 2022-Δtg的构建
以茂原链霉菌(S.mobaraenesis DSM40587)全基因组为模板，利用引物delTG-FF/delTG-FR(delTG-FF：GATAAGCTTGATATCGAATTCGTCGTCGACCGTGACGACGAACT，delTG-FR：GGCTCCAAAACCGGCCACTCCGTC)和delTG-RF/delTG-RR(delTG-RF：GTGGCCGGTTTTGGAGCCGTCGGCTCTACAGCTCGTGGCCC，delTG-RR：CGCTCTAGAACTAGTGGATCTGGTGAGCGTGTGCGCGAACCG)分别PCR扩增tg基因上下游同源序列各约3000bp。
利用一步克隆的方法将上下游同源序列连接至载体pJTU1278的BamHⅠ-EcoRⅠ位点，得到质粒pJTU1278-Δtg。
利用结合转移的方法将质粒pJTU1278-Δtg转化至茂原链霉菌smY2022中，挑取转化子至无抗的GYM固体平板上进行培养，再从无抗平板上挑选发生两次交换的菌株(即在无抗平板上生长，但是在抗性平板上无法生长的菌株)并进行PCR验证(图3)，获得tg缺失菌株smY2022-Δtg(SEQ ID NO:2为缺失的tg序列)。
SEQ ID NO:2缺失的tg序列：
gtggtgttgccggggagttaactgggagacatgatcacttctcgtagcgacccgatcactcgtccgggagtcgagaagtgttacgccgaaccccattccgcaccatca
cccctgccgccgtgaccgcggccggcagtctgcctctcgccgagagagccacccggagaaccgcccggacggggtccgcttcaccgctccggtgacggcttcgacg
taacacgaccgcgccgtcaccggccgtatccggtacgcaccgcatccccattccgccgtgcggccgcggcctcttcctcaccgccgttaccggcgcggcaccgcagg
acgggcaccgcccgacgttatgcgcggccactcgccgcaacctccaccccccgcgtcgcactctggcatgccctcgttccgcgaggttcgccagattcagccctttcg
tcacgttcgccaaaggagttgttgttcttcatgtcccaacgcgggagaactctcgtcttcgccgctctcggtgcggtcatgtgcaccaccgcgttaatgccgtccgcagg
cgcggccaccggcagtggcagtggcagcggcaccggggaagagaagaggtcctacgccgaaacgcaccgcctgacggcggatgacgtcgacgacatcaacgcg
ctgaacgaaagcgctccggccgcttcgagcgccggtccgtccttccgggcccccgactccgacgagcgggtgactcctcccgccgagccgctcgaccggatgcccg
acccgtaccggccctcgtacggcagggccgagacgatcgtcaacaactacatacgcaagtggcagcaggtctacagccaccgcgacggcaggaaacagcagatg
accgaggaacagcgggagtggctgtcctacggttgcgtcggtgtcacctgggtcaactcgggccagtatccgacgaacaggctggctttcgcgttcttcgacgagga
caagtacaagaacgagctgaagaacggcaggccccggtccggcgaaacgcgggcggagttcgaggggcgcgtcgccaaggacagcttcgacgaggcgaaggg
gttccagcgggcgcgtgacgtggcgtccgtcatgaacaaggccctggagaacgcccacgacgagggggcgtacctcgacaacctcaagaaggagctggcgaacg
gcaacgacgccctgcggaacgaggatgcccgctcgcccttctactcggcgctgcggaacacgccgtccttcaaggaccgcaacggcggcaatcacgacccgtcca
agatgaaggccgtcatctactcgaagcacttctggagcggccaggaccggtcgggctcctccgacaagaggaagtacggcgacccggaggccttccgccccgacc
gcggcaccggcctggtcgacatgtcgagggacaggaacattccgcgcagccccaccagccccggcgagagtttcgtcaatttcgactacggctggttcggagcgca
gacggaagcggacgccgacaagaccgtatggacccacggcaaccactaccacgcgcccaatggcagcctgggtgccatgcacgtgtacgagagcaagttccgca
actggtccgacggttactcggacttcgaccgcggagcctacgtggtcacgttcgtccccaagagctggaacaccgcccccgacaaggtgacacagggctggccgtg
atgtaagcggggaggggaggggaggcggagcatccggctcccctccccacc
(2)整合载体的构建
以pUC19质粒为载体，由上海生工生物公司化学合成pUC-TGm2，以pUC-TGm2为模板，用引物TGm2-F/TGm2-R扩增TGm2表达框共1745bp(SEQ ID NO:1)；
SEQ ID NO:1TGm2表达框序列
注：下划线为tgm2编码基因，波浪线为酶原和信号肽区域。
再次以茂原链霉菌(S.mobaraenesis DSM40587)全基因组为模板，利用引物TGm2-FF/TGm2-FR和TGm2-RF/TGm2-RR分别扩增tg基因上下游同源序列各约3000bp(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)；
SEQ ID NO:3同源臂序列TG-F
cgtcgtcgaccgtgacgacgaactcgccgccgcccgtcagccggaccacgagggcgtcgccggagcgcagcacgagcccgctgcggccggagcggacgcggtagccccagccgccgaactcgcggaacgcgtccagggcacggccgtcggccgacccgacgcggtcgagcccgatccgcagccgcgggcgcggcgcccacaggggtgtgacggtcaggccgtggcggtcgacggcgacgcgggccccggacagcgggaggaccagcagggcgccgaccgccatccccagcccggacgtccagccgcccgcgaagccgaacccggccgcgacggccaggagggcgacgccgagccccagcagtgggcgcgagaccacggcccgcgtccaggccgcgccttccgtggggccgagcggcagacggggggcgggggcggtggtcgcggcggcgaccgccttacgggggcgcggggcggtgaggccggcgaggaggatgccgagggcgcccgccacgagggcggagagcagggtcgtcagcagggtggcgaggccgagccgggcgtcgtcggggtcgtcggcggacgcgttgcagaggacggtccagatcatgagcgagccgatcagcgcggccacggcgtaggcggtggcggcgagggcgcgccaggagaggacttcgagttcgaggaagaaggcgagcgcggcgaagaggagggcgagggagaggacgaggacgaggccctcggaggcgaaggagccggtggcggtgaagccgtccgcccggccggagccgctgaagtggatggccagccggtccggcagccggtcccgccggcgctcgaagaggaggaggaaggcggcggctgacaggaggtagggcagcaggaggagggccgggcgccagggccgcccggcggtgcgcaggggaaggttcaccgaccacctctcgacgacgggcctcggggacgggtctccgggatttgttcgcatgccaatagaacaaagatagatcaccagagggatcccgcgaaagatctcatatctgagataccgtctacctcatgacagacgcttacctcgcccgcatcggcaagctcatccgtgacgcccggcagcaccgaggctggacccagtcacagctcgccgacgcactcggcaccagccagagcgcggtcaaccgcatcgagcggggaaatcagaacatcagtcttgatatgatcgctcgtatcggtgaagcgctggacagtgagatcgtctccctgggctatgccggccccatgcacctgagggtggtcggcgggcgccggctgtccggtgcgatcgacgtcaagaccagcaagaacgcctgcgtcgccctgctctgcgcgacccttctgaacgccggccgcaccaccctccggcgggtggcccggatcgaggaggtctaccggatcctggaggtgctgggcagcatcggcgtccgcgcccgctggatcaacgacggcaacgacctggagatcattcccccggccgacctcgacctggacgcgatggaccgcgaggccgcccggcgcacccgcagcgtcatcatgttcctcggcccgctgctgcaccgcatggaccagttcggcatcccgtacgccggcggctgcgacctgggcacccgcaccgtccagccgcatatgacggccctgcgccacttcggcctggagatcaccgccaccgacggcacgtaccacgcgaaggtcgaccgcagcgtctcccccacccgcgccatcgtcctgaccgagcgcggcgacaccgtcaccgagaacgccctgctggccgccgcccggcacgacggcgtcaccgtcatccgcaacgccagctccaactacatggtccaggacctctgcttcttcctggaggagctgggcgtcaaggtcgagggcatcggcaccacgaccctcaccgtccacggcgtgacccacatcgaccgcgacgtcgactacgcgccgtcggaggacccggtggaggcgatgagcctgctggccgcggccgtgatcacggagtcggagctgacgatccgccgggtgcccatcgagttcatggagatcgaactggccgtcctggaagagatgggcctcgaccacgagcgcagccccgagtaccgcgccaacaacggccgcacccgcctcctggacctcaccgtccgcccctccaagctccgggcccccatcgacaagatccacccgatgccgttccccggcctcaacatcgacaacgtccccttcttcgccgccatcgccgccttcgcccagggccagaccctcatccacgactgggtctacgacaaccgcgccatctacctcaccgacctcaaccgcctcggcgccgacgtcaaactcctcgacccccaccgcgtcctcgtcgagggccccacccgctggcgctccgccgaaatgatgtgcccgccggcgctccgccccgcggtcgtcgtcctcctggcgatgatggcggcggagggcacgtccgtactgcgcaacgtgtacgtgatcaaccggggttacgaggacctggcggaccggctgaactcgatcggcgcccagatcgagatcttccgggacatctgacggacggattccgccgcaccccgtctgaattgcttctcgcggtcgaagagttgaagaaggggtgcggcggcgtctctgggacttctccgggaccccgtggccctcggcaggccacgtcccaggggcacttccggcgccgatcggccgtggctacgcggagatcgcgtcgatggcggcgccgcctcgggtaccggcgcggggcgggaagcgggagttcctccgcgaagtcgaagtcctccaaggcgagtccaagcgccttcccttgcccgaggccagcgccgaccctgctgcgtcgatgacggacgcaggcgcaccgagtcccgcggtctcgctcgcccggaggggatgcggcggtgtccggcgcccagccggattccgctcctgtgacggagtggccggttttggagcc
SEQ ID NO:4同源臂序列TG-R
gtcggctctacagctcgtggcccgtcgtgctgtccacgtggtccgggatctcgccctcgtggcggtcgcccgtcgtcggggtgcccgtgggttcgaacatgaggatggaggcgcccggggaggacggcttgtgttcggtgcccttggggaccacgaaggtgtcgcccttgtggagccgcacagcgcgttccgtgccgtcggggtcgcggagggcgaggtcgaagcggccgtccaggacgaggaagaactcgtcggtgtcctcgtgtacgtgccagatgtgctcgccctgggtgtgggcaacgcggatgtcgtagtcgttcatgcgggcgacgatgcgcgggctgtagacgtcgtcgaaggaggcgagagccttggtgaggttgacgggctcggtgttgttcatggtgtgagtctcggcgggaggccgccgcggcgtcttgtacgttgctgtcacgccttgttgctgtcacgccttcatgagggcgctcgctccgaaggagacgtcaaagcggtcgcaccagatgctgacgctggtgtagcggtcgaggtccaggtcccgtgggagggcgtagttctggtcgcccttgttgcctttcagggagccgagactgacgtgggcgccgtcgtcgaagacgtgccagccggcacggcccggtttcaccggtgcgtcgctgaggaggaccttcacgtccgggccgttgctcgtgtcgaggccctccaggcggagggtgcggctgccgtccgggaggcggaggacgcggacggtgccggaggtggtgtgttcgtggctgatgagggtgcccgtggccagggtgcgggtggcggcggtgggcgccgcctcgtggaccgtctcgttctgccacagcttccacggctggaaccagtaggccgccactccggccgccaggaccgcgacgcccagcgccccggcggcgaacggccgccgccaccaccgtcgtacctgtacgtgcaccactgtccgtctcccgtcgtctcgcgccatccggacctgtatgaagcgcaacgtccggggcggccggatttctcccacaaccggcacggccacgggatcagtgcgtcacggcagcaccgccaccccgtccagttccaccagtgcctccccgtcccacagccgcaccgcgccgatcaccgccatcgccgggtagtcccgccccgccagccgccgccagacgcggcccagctccccggcgcacgcgcggtacgccgcgacgtccgtcgtgtagaccgtgacgcgggcgaggtcggccggggtaccgccggcggccgtgagggccgtgaggaggttggtcagcgcgcgctcgaactgcgcgggcaggccgcccgggaccacccggcccgtgccgtccaggcccgtctggcccgccaggaagaccaggcgcccgccctccgccgtcaccgcgtgggagaagcctcggggcggggacagttccggagggttgagacgggccaggtgtgccggatcgcccttttctcgttccgcgctcacctgtacagctccctcgcgatgatcgtgcgctgcacctccgtggcgccctcgtagatgcgcgtcgcccggacctccctgtacaggtgttccaggaggtgcccctgttccaggccgcgggcgccgtggatctgcagggcggcgtcgatgacgtactgggcggtctcggtggcgtagagcttggccatggccgagcggccggcgacgcccggttcgccggcgtcgtaggcggtggcggcggcgtggacgaggagggccgcggcctcggtgcgggtggccatgtcggcgagctggtgggagacggcctggagatccttcaacgggccgccgaacgcgtggcgttcggcggcgtgggcgagcgcggaccgcagggcggcgcgggacatcccgacggcgaacgcgccgacgctcgggcggaagaggtcgagggtgcgcagggcgacgccgaagccgccgtccacctcgccgaggacgtcgtcggggccgacggggacgccgtcgaaggtgagcagcccgacggggtgcggggcgatcaggttcagtggccggccgccgaggcccggccggtcggccgggaccaggaacgccgtgacgccgtgcgcccccgcgtccgggcgggtccgggcgaagacggtgtagaagtcggcctccggggcgttggagatccactgcttctcgccgtgcagcgtccagccggaggactccgacggtccggcgggttcggcgcgcagccgcagggcggcggcgtcggagcccgcctccggctcgctgagcgcgaaggcggcgacggcccgtccggcgacgacctccggcagccagcgggcgcgttgtgcctccgtgccggacgcggcgatcgggtgcgcgcccagaccttggagggcgagggcggtctccgcctcggtgcactcctggccgagcgcctcgcgcagcagacagaggtcgacggcgcggaccacaccgtcggcggggaagacccgggccagcaggccgtgttcaccgagggcggccaccagcgggcggttgacgcgcccgggttcgcccgccgcggcgagcgggcgcagccggcgggcggccagggtgcgtaacgtggccgtccaggcgcgctgttcgggcgtgagcgaggccggcgagacgagcggggcgcggcccggcgggcgttcttcggtggcgccttgtggggatgaccggaatgacggggatgacatcgccgtccgtcctttcggaagcgtgcgttcagaagcgtgcgttcggaagcatgcgttcgtttgtcgcgctctgttgactgccgtcacggtctcgttacgctggcagcgcatccgtacggctggcaagacctccccgcaccaccgccggcccccacgcgtcgccggcgctccccgcacctccacccttccccggcacgagggggcgcgacccgtcatggagctcatgccgtcggcccacgtcgacaccttctcccg
cgacagcctcccgccacccgaccagtggccggacctgacgtccgggccggacgtcccgcgctacccggaccggctcaactgcggcgccgagctgctggacgcgac
cgcggcgcggctgggtcccgaccggccggcgctgcgggacaaggccgggagcgtctggtcgtacggcgaactgcgcgagcgtgccgaccggttcgcgcacacgct
cacca
利用一步克隆的方法将三个片段(TGm2表达框、tg基因上下游同源序列)一次连接在pJTU1278的BamHⅠ-EcoRⅠ位点，获得质粒pJTU1278-TGm2。
(3)重组菌株的构建
将质粒pJTU1278-TGm2转化至smY2022-Δtg中，挑取转化子至无抗的GYM固体平板上进行培养，再从无抗平板上挑选发生两次交换的菌株(即在无抗平板上生长，但是在抗性平板上无法生长的菌株)并进行PCR验证(图3)，获得重组菌株SmY 2022-TGm2(图2)。
(4)对SmY 2022-TGm2进行发酵(图1)：
采用接种环刮取茂原链霉菌SmY 2022-TGm2孢子及菌丝至含30mL种子培养基的摇瓶中，30℃、220rpm摇床培养24h，获得茂原链霉菌种子液；
按8％(v/v)的接种量将种子液接种至含30mL鱼粉发酵培养基的摇瓶中，30℃、220rpm进行发酵，将发酵液在10000r/min离心5min后，取上清液，检测重组谷氨酰胺转氨酶(重组TGm2)酶活。
结果显示，发酵56h，重组TGm2的最高酶活达到61.7U/mL。
实施例3：重组TGm2的纯化和酶学性质测定
具体步骤如下：
(1)采用接种环刮取茂原链霉菌SmY 2022-TGm2孢子及菌丝至含30mL种子培养基的摇瓶中，30℃、220rpm摇床培养24h，获得茂原链霉菌种子液；
(2)按8％(v/v)的接种量将种子液接种至含30mL鱼粉发酵培养基的摇瓶中，30℃、220rpm进行发酵，将SmY 2022-TGm2发酵60h后，收集上清液，并进行乙醇沉淀。离心收集蛋白沉淀后用醋酸钠缓冲液(50mM pH 5.5)复溶。利用阳离子层析柱进行纯化，然后利用脱盐柱进行脱盐并测定最适反应温度和温度稳定性。乙醇沉淀后获得的蛋白沉淀制成干粉后测定最适pH。
(3)对照菌株的发酵：具体同步骤(1)～(2)，区别在于，调整茂原链霉菌SmY 2022-TGm2为SmY 2022菌株，发酵60h后收集上清液，并以相同方法纯化制备。
从图4可以看出，采用SmY 2022-TGm2制备得到的纯化后的TGm2(重组菌株得到的酶)和采用SmY 2022菌株制备得到的smTG(SmY 2022发酵后得到的酶)条带单一，蛋白纯度符合预期。
结果显示：
重组TGm2的比酶活为71.15U/mg，是smTG(24.65U/mg)的2.9倍；最适反应温度为60℃，比smTG高10℃；最适pH为6。
重组TGm2在60℃条件下处理60min后，依旧残余50％以上的酶活，60℃的半衰期达到64.05min(图5)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一株茂原链霉菌(Streptomyces mobaraenesis)SmY2022，已于2023年10月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20231937，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
2.一种发酵剂，其特征在，含有权利要求1所述的茂原链霉菌SmY2022。
3.制备权利要求2所述发酵剂的方法，其特征在于，将权利要求1所述茂原链霉菌SmY2022接种于培养基中，培养24-36h后离心获得菌体，将菌体冷冻干燥得到发酵剂。
4.权利要求1所述的茂原链霉菌SmY2022或权利要求2所述的发酵剂在制备谷氨酰胺转氨酶方面的应用。
5.一种重组茂原链霉菌，其特征在于，所述重组茂原链霉菌是以权利要求1所述的茂原链霉菌SmY2022为底盘细胞，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的谷氨酰胺转氨酶TGm2基因替换了所述茂原链霉菌基因组上的原始的谷氨酰胺转氨酶基因。
6.根据权利要求5所述的重组茂原链霉菌，其特征在于，所述茂原链霉菌基因组上的原始的谷氨酰胺转氨酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.一种制备谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1所述的茂原链霉菌SmY2022或权利要求2所述的发酵剂或权利要求5或6所述的重组茂原链霉菌接种至培养基进行发酵，获得含有谷氨酰胺转氨酶的发酵上清液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵的条件为：温度为28-30℃，转速为200-250rpm。
9.权利要求5或6所述的重组茂原链霉菌在制备谷氨酰胺转氨酶方面的应用。
10.权利要求1所述的茂原链霉菌SmY2022或权利要求2所述的发酵剂或权利要求5或6所述的重组茂原链霉菌制备得到的谷氨酰胺转氨酶在食品、化工领域的应用。
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