CN111499688B - 一种信号肽及其在生产α-淀粉酶中的应用 - Google Patents

一种信号肽及其在生产α-淀粉酶中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种信号肽及其在生产α‑淀粉酶中的应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明提供了一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的信号肽AspB’，以枯草芽孢杆菌为宿主，将此信号肽与超高温α‑淀粉酶进行共表达，可显著提升超高温α‑淀粉酶的产量；将本发明的共表达了信号肽AspB’与超高温α‑淀粉酶的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9/pHY300PLK‑AspB’‑pfa接种至发酵培养基中进行发酵，发酵60h，就可使发酵液中超高温α‑淀粉酶的酶活高达119.01U/mL，在此基础上，对含菌体的发酵液进一步进行高温热处理，可有效提高发酵液中超高温α‑淀粉酶的可溶性酶活。

Description

一种信号肽及其在生产α-淀粉酶中的应用
技术领域
本发明涉及一种信号肽及其在生产α-淀粉酶中的应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。
背景技术
α-淀粉酶(α-amylase，EC.3.2.1.1)是一种重要的糖苷水解酶，其具有广泛的底物偏好性以及产物特异性，能切断淀粉以及相关α-葡聚糖分子中的α-1,4-葡萄糖苷键，并将淀粉水解为可溶性糊精、低聚糖及麦芽糖和葡萄糖，同时，其能够保留产物的α-异构体构象。因此，α-淀粉酶被广泛应用于食品、洗涤、造纸、纺织、酒精和医药等行业。
根据作用温度的不同，α-淀粉酶可分为超高温、高温、中温和低温α-淀粉酶。其中，超高温α-淀粉酶是指最适温度在90℃以上的α-淀粉酶，与工业上广泛应用的其他a-淀粉酶相比，其具有更高的最适温度(接近100℃)、更好的热稳定性、较低的最适pH(5.5)以及Ca2+不依赖性，这些优良的酶学性质使得超高温α-淀粉酶较其他a-淀粉酶具有更高的工业应用价值。
但是，超高温α-淀粉酶在表达宿主中的表达量不高，例如，沈微等人将超高温α-淀粉酶在多种宿主菌中进行重组表达，其中，以大肠杆菌为宿主重组表达超高温α-淀粉酶的总酶活仅有11.4U/mL、胞外酶活仅有1.76U/mL，以枯草芽孢杆菌为宿主重组表达超高温α-淀粉酶的总酶活仅有1.4U/mL、胞外酶活仅有0.6U/mL，以酿酒酵母为宿主重组表达超高温α-淀粉酶的总酶活仅有0.16U/mL，以巴斯德毕赤酵母为宿主重组表达超高温α-淀粉酶的总酶活仅有64U/mL(具体可见参考文献：沈微,Pyrococcus furiosus α-淀粉酶基因在不同宿主中的表达,江南大学,2003.)，此缺陷大大限制了超高温α-淀粉酶在工业上的应用。因此，继续找到一种可提高超高温α-淀粉酶产量的方法。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种可提高超高温α-淀粉酶产量的信号肽。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了一种信号肽，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明还提供了一种基因，所述基因编码上述信号肽。
在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带上述基因；或者，所述重组质粒携带上述基因以及目的基因；或者，所述重组质粒携带上述基因、目的基因以及编码分子伴侣prsA的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述目的基因为编码α-淀粉酶的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶为超高温α-淀粉酶。
在本发明的一种实施方式中，所述编码超高温α-淀粉酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述编码分子伴侣prsA的基因的核苷酸序列如SEQID No.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pHY300PLK质粒。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞携带上述重组质粒；或者，所述宿主细胞携带上述重组质粒，且所述宿主细胞的基因组中***有编码分子伴侣pfefoldinγ的基因；或者，所述宿主细胞携带上述重组质粒，且所述宿主细胞的基因组中***有编码分子伴侣PPlase的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述编码分子伴侣pfefoldinγ的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述编码分子伴侣PPlase的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WS9。
本发明还提供了一种生产α-淀粉酶的方法，所述方法为先将上述宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，然后从发酵液中分离得到α-淀粉酶；
或者，所述方法为先将上述宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，然后将发酵液进行热处理，得到经热处理的发酵液，最后从经热处理的发酵液中分离得到α-淀粉酶；
或者，所述方法为先将上述宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，然后将发酵液进行离心，得到菌体，再将菌体重悬，得到重悬液，接着将重悬液进行热处理，得到经热处理的重悬液，最后从经热处理的重悬液中分离得到α-淀粉酶。
在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶为超高温α-淀粉酶。
在本发明的一种实施方式中，所述编码超高温α-淀粉酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述热处理的温度为80～100℃、时间为10min～90min。
在本发明的一种实施方式中，所述热处理的温度为90℃、时间为15min。
本发明还提供了上述信号肽或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述方法在制备α-淀粉酶中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶为超高温α-淀粉酶。
在本发明的一种实施方式中，所述编码超高温α-淀粉酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
有益效果：
(1)本发明提供了一种氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的信号肽AspB’，以枯草芽孢杆菌为宿主，将此信号肽与超高温α-淀粉酶进行共表达，可显著提升超高温α-淀粉酶的产量；将本发明的共表达了信号肽AspB’与超高温α-淀粉酶的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9/pHY300PLK-AspB’-pfa接种至发酵培养基中进行发酵，发酵60h，就可使发酵液中超高温α-淀粉酶的酶活高达119.01U/mL，较仅表达了超高温α-淀粉酶的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9/pHY300PLK-pfa提高了6.49倍。
(2)本发明提供了一种可高产超高温α-淀粉酶的重组枯草芽孢杆菌B.subtilisWS9/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa，此枯草芽孢杆菌共表达了编码氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的信号肽AspB’的基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的编码分子伴侣prsA的基因与超高温α-淀粉酶；将此重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa接种至发酵培养基中进行发酵，发酵60h，就可使发酵液中超高温α-淀粉酶的酶活高达134.15U/mL，较仅表达了超高温α-淀粉酶的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9/pHY300PLK-pfa提高了7.32倍。
(3)本发明提供了一种可高产超高温α-淀粉酶的重组枯草芽孢杆菌B.subtilisWS9dinγ/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa，此枯草芽孢杆菌共表达了编码氨基酸序列如SEQID NO.1所示的信号肽AspB’的基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的编码分子伴侣prsA的基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的编码分子伴侣pfefoldinγ的基因与超高温α-淀粉酶；将此重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9dinγ/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa接种至发酵培养基中进行发酵，发酵60h，就可使发酵液中超高温α-淀粉酶的酶活高达137.30U/mL，较仅表达了超高温α-淀粉酶的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9/pHY300PLK-pfa提高了7.51倍。
(4)本发明提供了一种可高产超高温α-淀粉酶的重组枯草芽孢杆菌B.subtilisWS9PPlase/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa，此枯草芽孢杆菌共表达了编码氨基酸序列如SEQID NO.1所示的信号肽AspB’的基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的编码分子伴侣prsA的基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的编码分子伴侣PPlase的基因与超高温α-淀粉酶；将此重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9dinγ/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa接种至发酵培养基中进行发酵，发酵60h，就可使发酵液中超高温α-淀粉酶的酶活高达150.38U/mL，较仅表达了超高温α-淀粉酶的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9/pHY300PLK-pfa提高了8.20倍。
(5)本发明提供了一种产量高的生产超高温α-淀粉酶的方法，此方法以重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9dinγ/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa为生产菌株，先将重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9dinγ/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，然后将发酵液进行热处理，得到经热处理的发酵液，最后从经热处理的发酵液中分离得到超高温α-淀粉酶；利用此方法发酵72h获得的经热处理的发酵上清液中，超高温α-淀粉酶的酶活高达1682.98U/mL；利用此方法发酵120h获得的经热处理的发酵上清液中，超高温α-淀粉酶的酶活高达1837.96U/mL。
附图说明
图1为重组质粒pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa经酶切后的SDS-PAGE图谱。
图2为B.subtilis WS9dinγ基因组的PCR电泳验证结果；其中，M为DL1000DNAMarker，泳道1、2为B.subtilis WS9dinγ菌落的PCR产物。
图3为B.subtilis WS9PPlase基因组的PCR电泳验证结果；其中，M为DL1000 DNAMarker，泳道1、2为B.subtilis WS9PPlase菌落的PCR产物。
图4为重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9PPlase/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa发酵不同时间后获得的发酵液中超高温α-淀粉酶的酶活。
图5为温度对超高温α-淀粉酶酶活的影响。
图6为pH对超高温α-淀粉酶酶活的影响。
图7为超高温α-淀粉酶在不同温度条件下保存不同时间后的酶活变化。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS9记载于参考文献“张康,枯草芽孢杆菌菌株改造、启动子优化和普鲁兰酶的高效制备研究,江南大学,2018.”中，此参考文献中涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5(已于2016年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016536，保藏地址为中国.武汉.武汉大学)记载于公开号为CN106754466A的专利文本中；下述实施例中涉及的pHY300PLK质粒、pMDTM19-T质粒、pET24a质粒、pBE-S质粒、大肠杆菌(Escherichia coli)JM109、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RIK1285、B.subtilis Secretory Protein Expression System试剂盒购自Takara公司；下述实施例中涉及的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；下列实施例中涉及的引物由天霖生物有限公司合成(枯草芽孢杆菌WS9、大肠杆菌JM109和枯草芽孢杆菌RIK1285均可以购买得到或已经进行过保藏，无需再次进行用于专利程序的保藏)。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
超高温α-淀粉酶酶活检测方法：将1mL的10g/L的可溶性淀粉溶液和0.9mL的50mM、pH 5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液充分混匀，得到反应体系；将反应体系在100℃预热5min后，在反应体系中加入0.1mL粗酶液，振荡混匀进行反应；反应10min后，在反应获得的反应液中加入3mLDNS显色液，振荡，置于冰水中终止反应；反应终止后，将添加有显色液的反应液先煮沸7min，然后置于冰水中迅速冷却，接着添10mL去离子水，540nm下测吸光度(以灭活的酶液为催化剂进行同样操作作为空白)。
超高温α-淀粉酶酶活的定义：在上述条件下，定义每分钟催化产生相当于1μmol葡萄糖所需酶量为一个解活力单位(1U)。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
LB固体培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/LNaCl、1.5g/L琼脂粉。
LB液体培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母膏、10g/LNaCl。
TB液体培养基：24g/L酵母粉、12g/L胰蛋白胨、5g/L甘油、12.54g/LK2HPO4、2.31g/LKH2PO4。
枯草芽孢杆菌化学转化相关培养基：
10X最低盐溶液：183g/L K2HPO4·3H2O、60g/L KH2PO4、20g/L(NH4)2SO4、10g/L柠檬酸三钠、2g/LMgSO4·7H2O。
色氨酸溶液：10mg/mL，过滤除菌。
GM I溶液：10X最低盐溶液500μL、200g/L葡萄糖125μL、50g/L水解酪蛋白溶液20μL、10g/L酵母汁50μL、10g/L色氨酸溶液25μL、用无菌水补齐至5mL。
GM II溶液：10X最低盐溶液2mL、200g/L葡萄糖0.5mL、50g/L水解酪蛋白溶液16μL、10g/L酵母汁8μL、1M MgCl溶液50μL、1M CaCl溶液10μL、10g/L色氨酸溶液20μL，用无菌水补齐至20mL。
实施例1：信号肽AspB’的制备
具体步骤如下：
合成编码超高温α-淀粉酶(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，来源于Pyrococcusfuriosus)的基因pfa；以P1和P2为引物(引物具体可见表1)，以编码超高温α-淀粉酶的基因pfa为模板，通过PCR扩增基因pfa；以P3和P4为引物(引物具体可见表1)，以pHY300PLK质粒为模板，通过PCR扩增出pHY300PLK的线性化片段；通过in-fusion无缝连接基因pfa和pHY300PLK的线性化片段，得到连接产物1；将连接产物1转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，得到转化产物1；将转化产物1涂布在LB固体培养基(含有100μg·mL-1氨苄青霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子1；挑取转化子1接种至LB液体培养基中，于37℃、200rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得转化成功的重组质粒pHY300PLK-pfa。
以P5和P6为引物(引物具体可见表1)，以重组质粒pHY300PLK-pfa为模板，通过PCR扩增获得两端分别连接有Nde I、EcoR I酶切位点的基因pfa；将两端分别连接有Nde I、EcoR I酶切位点的基因pfa和pMDTM19-T质粒经限制性内切酶Nde I、EcoR I酶切后通过T4连接酶连接，得到连接产物2；将连接产物2转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，得到转化产物2；将转化产物2涂布在LB固体培养基(含有30μg·mL-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子2；挑取转化子2接种至LB液体培养基中，于37℃、200rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得转化成功的重组质粒pMDTM19T-pfa。
通过质粒少量提取试剂盒提取转化子2中的重组质粒pMDTM19T-pfa；将重组质粒pMDTM19T-pfa和pBE-S质粒经限制性内切酶Nde I、EcoR I酶切后通过T4连接酶连接，得到连接产物3；将连接产物3转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，得到转化产物3；将转化产物3涂布在LB固体培养基(含有100μg·mL-1氨苄青霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子3；挑取转化子3接种至LB液体培养基中，于37℃、200rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得转化成功的重组质粒pBES-pfa。
以P7和P8为引物(引物具体可见表1)，以重组质粒pBES-pfa为模板，通过PCR扩增出不带信号肽的pBES-pfa线性化片段；通过in-fusion(In-Fusion要求基因片段与载体片段的摩尔比在3:1～10:1之间)无缝连接编码不同信号肽的基因SP DNA mixture和不带信号肽的pBES-pfa线性化载体片段(编码不同信号肽的基因SP DNA mixture是信号肽筛选试剂盒B.subtilis Secretory Protein Expression System里配备的，共173条)，得到连接产物4；将连接产物4转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，得到转化产物4；将转化产物4涂布在LB固体培养基(含有100μg·mL-1氨苄青霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子4；挑取转化子4接种至LB液体培养基中，于37℃、200rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得转化成功的携带有不同信号肽的重组质粒pBES-sp-pfa。
将携带有不同信号肽的重组质粒pBES-sp-pfa转化枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)RIK1285，得到携带有不同信号肽的重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RIK1285；将携带有不同信号肽的重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RIK1285涂布在LB固体培养基上(含有30μg·mL-1卡那霉素)，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到单菌落；以携带重组质粒pBES-pfa的重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RIK1285作为空白对照，挑取携带有不同信号肽的重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RIK1285的单菌落接种至每孔含有600μL LB液体培养基(含有30μg·mL-1卡那霉素)的96孔板中，于37℃恒温摇床中培养8～12h后，转接到每孔含有600μL TB液体培养基(含有30μg·mL-1卡那霉素)的96孔板中，于37℃恒温摇床中培养60h，得到发酵液；将发酵液离心取上清，按超高温α-淀粉酶酶活测定方法测定上清于540nm下的吸光度进行初筛(吸光度越高，酶活越高)，初筛共1152株；重复初筛的操作，将初筛获得的菌株进行复筛，复筛共288株；将复筛获得的10株酶活较好的菌株进行摇瓶发酵验证，选择其中酶活最高的6株菌株进行信号肽测序，结果显示，这6株菌株携带三种信号肽，酶活从高到低排列的6株菌株携带信号肽的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示；其中，SEQ ID No.1的氨基酸序列如SEQID No.1的信号肽与最初的173条信号肽有所不同，可能是产生了突变。
选择这3种信号肽对应的菌株，分别以P9、P10、P11和P12为引物(引物具体可见表1)，分别以携带有氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示的信号肽的重组枯草芽孢杆菌为模板，通过菌落PCR分别将编码氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8所示的信号肽的核苷酸序列连同编码超高温α-淀粉酶的基因pfa扩增出来，得到目的基因1～3；以P3、P13为引物(引物具体可见表1)，以pHY300PLK质粒为模板，通过PCR扩增出pHY300PLK的线性化片段；通过in-fusion无缝连接目的基因1～3和pHY300PLK的线性化片段，得到连接产物5～7；将连接产物5～7转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，得到转化产物5～7；将转化产物5～7涂布在LB固体培养基(含有100μg·mL-1氨苄青霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子5～7；挑取转化子5～7接种至LB液体培养基中，于37℃、200rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得转化成功的分别携带有氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8所示的信号肽的重组质粒pHY300PLK-AspB’-pfa、pHY300PLK-YfhK-pfa、pHY300PLK-aprE-pfa。
将重组质粒pHY300PLK-pfa(含有原始信号肽amyE)和分别携带有氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示的信号肽的重组质粒pHY300PLK-AspB’-pfa、pHY300PLK-YfhK-pfa、pHY300PLK-aprE-pfa分别转化至枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WS9，得到重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9/pHY300PLK-pfa和分别携带有氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示的信号肽的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9/pHY300PLK-AspB’-pfa、B.subtilis WS9/pHY300PLK-YfhK-pfa、B.subtilis WS9/pHY300PLK-aprE-pfa。
将重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9/pHY300PLK-pfa、B.subtilis WS9/pHY300PLK-AspB’-pfa、B.subtilis WS9/pHY300PLK-YfhK-pfa、B.subtilis WS9/pHY300PLK-aprE-pfa分别涂布在LB固体培养基上(含有20μg·mL-1四环素)，于37℃恒温培养箱中培养8～12h，得到单菌落；挑取单菌落分别接种至LB液体培养基(含有20μg·mL-1四环素)中，再转接至37℃恒温摇床中发酵60h，得到发酵液，检测发酵液中超高温α-淀粉酶的酶活，检测结果如下：
重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9/pHY300PLK-pfa、B.subtilis WS9/pHY300PLK-AspB’-pfa、B.subtilis WS9/pHY300PLK-YfhK-pfa、B.subtilis WS9/pHY300PLK-aprE-pfa发酵获得的发酵液中超高温α-淀粉酶的酶活分别为18.33U/mL、119.01U/mL、60.73U/mL、3.8U/mL。可见，重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9/pHY300PLK-AspB’-pfa携带的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的信号肽(核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)促进超高温α-淀粉酶表达的效果最好，但此信号肽序列是一种新的信号肽，只由9个氨基酸组成(MKLAITAKA)，推测是由信号肽AspB(MKLAKRVSALTPSTTLAITAKA)缺失了中间的13个氨基酸导致突变产生，因此，将此信号肽命名为AspB’。
表1引物及其核苷酸序列
Figure BDA0002450132260000081
Figure BDA0002450132260000091
注：下划线表示酶切位点和保护碱基。
实施例2：重组枯草芽孢杆菌的制备
具体步骤如下：
1、重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa的制备
以P3、P4为引物(引物具体可见表2)，以携带编码分子伴侣PrsA的基因的pHY300PLK质粒为模板，通过PCR扩增出携带编码分子伴侣PrsA的基因的pHY300PLK质粒的线性化片段；通过in-fusion无缝连接携带编码分子伴侣PrsA的基因的pHY300PLK质粒的线性化片段和实施例1获得的目的基因1，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，得到转化产物1；将转化产物1涂布在LB固体培养基(含有100μg·mL-1氨苄青霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子1；挑取转化子1接种至LB液体培养基中，于37℃、200rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证(酶切验证结果见图1)以及测序验证，验证正确即获得转化成功的重组质粒pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa；将重组质粒pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa转化重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9，得到转化产物2；将转化产物2涂布在LB固体培养基(含有20μg·mL-1四环素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子2；挑取转化子2接种至LB液体培养基中，于37℃、200rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证，验证正确即获得转化成功的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa。
表2引物及其核苷酸序列
引物 核苷酸序列(5’-3’)
P3 AAGCTTGGTAATAAAAAAACACCTCC(SEQIDNo.11)
P4 TTCAGCACTCGCAGCCGC(SEQIDNo.12)
2、重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9dinγ/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa的制备
合成编码分子伴侣pfefoldinγ的基因(核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，来源于Pyrococcus furiosus)；将编码分子伴侣pfefoldinγ的基因与编码木糖启动子Pxyl(SEQID No.22)和终止子(SEQ ID No.23)的基因进行连接，得到分子伴侣pfefoldinγ的基因表达盒；通过in-fusion无缝连接分子伴侣pfefoldinγ的基因表达盒和pBE-S载体，得到分子伴侣pfefoldinγ的基因表达盒大片段pBES-dinγ；通过重叠PCR依次连接amyE上游同源修复臂(887bp、SEQ ID No.24)、分子伴侣pfefoldinγ的基因表达盒大片段pBES-dinγ和amyE下游同源修复臂(851bp、、SEQ ID No.25)，得到带有上下游同源修复臂的分子伴侣pfefoldinγ的基因表达盒；以基因敲除质粒pHYcas9damy(记载于参考文献“张康,枯草芽孢杆菌菌株改造、启动子优化和普鲁兰酶的高效制备研究,江南大学,2018”中，含有cas9基因、sgRNA、PE194温度敏感型复制原点、p15A大肠杆菌复制原点、抗性标记基因等)为骨架，通过in-fusion无缝连接将带有上下游同源修复臂的分子伴侣pfefoldinγ的基因表达盒替换到基因敲除质粒pHYcas9damy的amyE基因的位置上，得到基因编辑质粒pHYcas9dinγ。
将基因编辑质粒pHYcas9dinγ转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS9，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有20μg·mL-1四环素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子1；以转化子1的基因组为模板进行菌落PCR(菌落PCR条件：94℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸1kb/min，30个循环)，扩增同源修复片段，由于正确***基因的同源修复片段长度与未***基因的同源修复片段长度大小不同，对PCR产物进行核酸电泳；将PCR验证正确的转化子在LB固体培养基上划线，于51℃培养10h进行基因编辑质粒的消除，再对质粒消除菌进行菌落PCR验证(电泳结果见图2)，并对PCR产物进行测序验证，验证正确即获得在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS9的基因组中正确***编码分子伴侣pfefoldinγ的基因的枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9dinγ。
将实施例1获得的重组质粒pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa转化重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9dinγ，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有20μg·mL-1四环素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子2；挑取转化子2接种至LB液体培养基中，于37℃、200rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证，验证正确即获得转化成功的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9dinγ/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa。
3、重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9PPlase/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa的制备
合成编码分子伴侣PPlase的基因(核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，来源于Pyrococcus furiosus)；将编码分子伴侣PPlase的基因编码木糖启动子Pxyl(SEQ IDNo.22)和终止子(SEQ ID No.23)的基因进行连接，得到分子伴侣PPlase的基因表达盒；通过in-fusion无缝连接分子伴侣PPlase的基因表达盒和pBE-S载体，得到分子伴侣PPlase的基因表达盒大片段pBES-PPlase；通过重叠PCR依次连接amyE上游同源修复臂(887bp、SEQID No.24)、分子伴侣PPlase的基因表达盒大片段pBES-PPlase和amyE下游同源修复臂(851bp、SEQ ID No.25)，得到带有上下游同源修复臂的分子伴侣PPlase的基因表达盒；以基因敲除质粒pHYcas9damy(记载于参考文献“张康,枯草芽孢杆菌菌株改造、启动子优化和普鲁兰酶的高效制备研究,江南大学,2018”中，含有cas9基因、sgRNA、PE194温度敏感型复制原点、p15A大肠杆菌复制原点、抗性标记基因等)为骨架，通过in-fusion无缝连接将带有上下游同源修复臂的分子伴侣PPlase的基因表达盒替换到基因敲除质粒pHYcas9damy的amyE基因的位置上，得到基因编辑质粒pHYcas9PPlase。
将基因编辑质粒pHYcas9PPlase转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS9，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有20μg·mL-1四环素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子1；以转化子1的基因组为模板进行菌落PCR(菌落PCR条件：94℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸1kb/min，30个循环)，扩增同源修复片段，由于正确***基因的同源修复片段长度与未***基因的同源修复片段长度大小不同，对PCR产物进行核酸电泳；将PCR验证正确的转化子在LB固体培养基上划线，于51℃培养10h进行基因编辑质粒的消除，再对质粒消除菌进行菌落PCR验证(电泳结果见图3)，并对PCR产物进行测序验证，验证正确即获得在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS9的基因组中正确***编码分子伴侣PPlase的基因的枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9PPlase。
将实施例1获得的重组质粒pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa转化重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9PPlase，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有20μg·mL-1四环素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子2；挑取转化子2接种至LB液体培养基中，于37℃、200rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证，验证正确即获得转化成功的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9PPlase/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa。
实施例3：超高温α-淀粉酶的制备
具体步骤如下：
从甘油管中蘸取实施例1和实施例2获得的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9/pHY300PLK-pfa、B.subtilis WS9/pHY300PLK-AspB’-pfa、B.subtilis WS9/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa、B.subtilis WS9dinγ/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa、B.subtilisWS9PPlase/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa的菌液在LB固体培养基上(含有20μg·mL-1四环素)划线，于37℃的条件下培养8～12h，得到单菌落；挑取单菌落分别接种至10mL LB液体培养基中，37℃、200rpm培养10h，得到种子液；将种子液以5％(v/v)的接种量接种至50mL TB液体培养基中(含有20μg·mL-1四环素)，37℃、200rpm培养60h，得到发酵液；检测发酵液中超高温α-淀粉酶的酶活，检测结果如下：
重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9/pHY300PLK-pfa、B.subtilis WS9/pHY300PLK-AspB’-pfa、B.subtilis WS9/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa、B.subtilis WS9dinγ/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa、B.subtilis WS9PPlase/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa发酵获得的发酵液中超高温α-淀粉酶的酶活分别为18.33U/mL、119.01U/mL、134.15U/mL、137.30U/mL、150.38U/mL。可见，重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9PPlase/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa发酵生产超高温α-淀粉酶的产量最高。
实施例4：热处理对重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9PPlase/pHY300PLK-prsA-sp-pfa发酵产超高温α-淀粉酶产量的影响
以实施例3获得的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9PPlase/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa发酵获得的发酵液为粗酶液，考察热处理对重组枯草芽孢杆菌B.subtilisWS9PPlase/pHY300PLK-prsA-sp-pfa发酵产超高温α-淀粉酶产量的影响，具体步骤如下：
挑取实施例3获得的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9PPlase/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa的单菌落接种至LB液体培养基上(含有20μg·mL-1四环素)，于37℃的条件下培养10h，得到种子液；将种子液以5％(v/v)的接种量接种至50mLTB液体培养基中(含有20μg·mL-1四环素)，37℃、200rpm培养120h，得到发酵液；发酵过程中，间隔一段时间检测发酵液中超高温α-淀粉酶的酶活，检测结果见图4。
由图4可知，随着摇瓶发酵时间的延长，重组枯草芽孢杆菌B.subtilisWS9PPlase/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa发酵获得的发酵液中超高温α-淀粉酶的酶活越高，这种特性可能是由于来源于Pyrococcus furiosuss的超高温α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌宿主中部分蛋白未获得充分正确折叠，而在持续37℃摇瓶发酵的过程中，这部分蛋白会被缓慢折叠并分泌到细胞外(通常枯草芽孢杆菌宿主作为其他异源蛋白的表达宿主的最优发酵时间为48～60h)。通过同样的实验可发现，重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa、B.subtilis WS9dinγ/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa与重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9PPlase/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa具有类似的发酵现象，即随着摇瓶发酵时间的延长(≤300h)，发酵液中超高温α-淀粉酶的酶活逐渐增加。
发酵72h时，取部分重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9PPlase/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa发酵获得的发酵液(含有菌体)于80～100℃的条件下热处理10min～1.5h后，离心取上清，检测热处理前后发酵上清液中超高温α-淀粉酶的酶活。
由检测结果可知，热处理可显著提高发酵上清液中超高温α-淀粉酶的酶活，其中，热处理条件为90℃、15min时，发酵上清液中超高温α-淀粉酶酶活的提升最为明显，由热处理前的402.58U/mL提高至1682.98U/mL。
发酵120h时，取部分重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9PPlase/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa发酵获得的发酵液(含有菌体)于80～100℃的条件下热处理10min～1.5h后，离心取上清，检测热处理前后发酵上清液中超高温α-淀粉酶的酶活。
由检测结果可知，热处理可显著提高发酵上清液中超高温α-淀粉酶的酶活，其中，热处理条件为90℃、15min时，发酵上清液中超高温α-淀粉酶酶活的提升最为明显，由热处理前的676.83U/mL提高至1837.96U/mL。
发酵120h时，取1mL重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9PPlase/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa发酵获得的发酵液(含有菌体)离心取菌体；在菌体中加入1mL去离子水悬浮菌体，得到水悬液；将水悬液于90℃的条件下热处理15min后，离心取上清，检测热处理前后水悬上清液中超高温α-淀粉酶的酶活。
由检测结果可知，热处理可显著提高水悬上清液中超高温α-淀粉酶的酶活，使得水悬上清液中超高温α-淀粉酶的酶活由热处理前的0U/mL提高至1507.42U/mL。
综上，热处理可有效促进超高温α-淀粉酶在重组枯草芽孢杆菌B.subtilisWS9PPlase/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa中的胞外可溶性表达。
实施例5：超高温α-淀粉酶的酶学性质
以实施例3获得的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9PPlase/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa发酵获得的发酵液为粗酶液，考察重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9PPlase/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa发酵获得的超高温α-淀粉酶的酶学性质，具体步骤如下：
1、超高温α-淀粉酶的最适温度
分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的条件下测定粗酶液中超高温α-淀粉酶的酶活，设定酶活最高的为100％，其余酶活与之相比计算相对酶活，以考察酶的最适作用温度(检测结果见图5)；
由图5可知，重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9PPlase/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa发酵获得的超高温α-淀粉酶的最适温度为100℃。
2、超高温α-淀粉酶的最适pH
配制pH值分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液代替超高温α-淀粉酶酶活测定方法中的缓冲液，在100℃下测定粗酶液中超高温α-淀粉酶的酶活，以酶活最高的为100％，其余酶活与之相比计算相对酶活，以考察酶的最适作用pH(检测结果见图6)；
由图6可知，重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9PPlase/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa发酵获得的超高温α-淀粉酶的最适pH为5.0。
3、超高温α-淀粉酶的温度稳定性
将粗酶液分别于90℃、100℃、110℃的条件下保温0h、1h、2h、3h、4h后将粗酶液取出，迅速冷却，在pH为5.0、温度为100℃的条件下测定粗酶液中超高温α-淀粉酶的酶活，以初始酶活为100％，保温后酶活与之相比计算残留酶活，以考察其温度稳定性(检测结果见图7)。
由图7可知，重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WS9PPlase/pHY300PLK-prsA-AspB’-pfa发酵获得的超高温α-淀粉酶的温度稳定性较好，在90℃条件下保温4h后，仍保留有76.30％的相对酶活，在100℃条件下保温4h后，仍保留有67.98％的相对酶活。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种信号肽及其在生产α-淀粉酶中的应用
<160> 25
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Lys Leu Ala Ile Thr Ala Lys Ala
1 5
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgaaactgg caatcacagc gaaagcg 27
<210> 3
<211> 1308
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gccaaatact tagaactcga agagggcggt gttataatgc aagcattcta ttgggatgtt 60
ccaggaggcg gaatctggtg ggaccacatc agaagcaaga ttcctgaatg gtacgaggcc 120
ggcataagcg ccatctggct gccacctcct tctaaaggaa tgagtggagg atatagtatg 180
gggtacgacc catacgacta ctttgacctg ggtgaatatt atcagaaagg cacagtagag 240
acacgctttg gatcaaagga ggaattagtt cggttgattc aaacagctca tgcttatggg 300
attaaggtta tcgccgatgt ggttatcaac catagagctg gaggcgatct tgaatggaac 360
ccattcgttg gtgattatac atggacagat ttttctaagg ttgcttctgg aaagtatact 420
gcgaactact tggacttcca cccaaatgag cttcactgtt gtgacgaggg tacctttggt 480
gggttcccgg atatatgtca ccacaaggag tgggatcaat actggctttg gaaatcaaac 540
gaatcttacg cggcatattt acggagcata gggttcgacg ggtggcgttt cgactacgtg 600
aagggatacg gtgcttgggt ggttcgcgac tggctgaact ggtggggagg ttgggcagtc 660
ggagagtatt gggacacgaa cgttgacgct ttgctttcct gggcttacga gagcggtgca 720
aaggtctttg actttccact ttattataag atggacgagg cttttgataa caataatatt 780
cctgcattag tatacgcgtt acaaaacggt cagacggttg taagcagaga tccattcaag 840
gcagttacat ttgtcgccaa ccatgatacg gacatcattt ggaacaagta ccctgcctac 900
gcatttatct taacttacga gggtcaacca gtaattttct atagagattt tgaagaatgg 960
ttgaacaagg ataaacttat taacctcatc tggatacacg accacctggc tggtgggtcc 1020
acgacaatag tctactacga caacgatgag ttaatctttg ttcggaacgg agattcccgc 1080
cgcccaggtt taatcactta cataaatctg tcccctaact gggtggggcg ttgggtgtat 1140
gtcccgaaat ttgcaggtgc ctgtatacat gagtatactg gcaatcttgg aggctgggta 1200
gataaacgtg ttgacagtag tggatgggtt tacttggagg ctccgccgca tgatcctgcc 1260
aacgggtact atggatattc cgtgtggtca tattgcgggg tagggtaa 1308
<210> 4
<211> 879
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgaagaaaa tcgcaatagc agctatcact gctacaagca tcctcgctct cagtgcttgc 60
agcagcggcg acaaagaagt tatcgcaaaa acagacgcag gcgatgtcac aaaaggcgag 120
ctttacacaa acatgaagaa aacagctggc gcaagcgtac tgacacagct agtgcaagaa 180
aaagtattgg acaagaagta taaagtttcg gataaagaaa ttgacaacaa gctgaaagaa 240
tacaaaacgc agcttggcga tcaatatact gccctcgaaa agcaatatgg caaagattac 300
ctgaaagaac aagtaaaata tgaattgctg acacaaaaag cggctaaaga taacatcaaa 360
gtaacagacg ccgatatcaa agagtactgg gaaggcttaa aaggcaaaat ccgtgcaagc 420
cacatccttg ttgctgataa aaagacagct gaagaagtag agaaaaagct gaaaaaaggc 480
gagaagtttg aagaccttgc gaaagaatac tcaacagaca gctctgcttc aaaaggcggg 540
gatcttggct ggttcgcaaa agaaggccaa atggacgaaa cattcagcaa agctgcattc 600
aaattaaaaa caggtgaagt cagtgatcct gtcaaaacgc aatacggcta ccatatcatt 660
aaaaagacag aagaacgcgg caaatatgat gatatgaaaa aagaactgaa atctgaagtg 720
cttgaacaaa aattaaatga caacgcagct gttcaggaag ctgttcaaaa agtcatgaag 780
aaggctgaca tcgaagtaaa agataaagat ctgaaagaca catttaatac atcttcaaca 840
agcaacagca cttcttcatc ttcaagcaat tctaaataa 879
<210> 5
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atggtcaatg aagttattga catcaatgaa gcagttcgtg cgtatatcgc gcaaatcgaa 60
ggattacggg cggaaattgg ccgccttgat gcgacgattg caacgttacg ccaatcatta 120
gcgacactta aatcacttaa aacattagga gaaggcaaaa cggtgttagt cccggtgggc 180
tctattgcac aagtcgaaat gaaagtggaa aaaatggata aagtggttgt gagcgtcggc 240
caaaatatct cagcggaact ggaatatgaa gaagcactta aatatatcga agatgaaatt 300
aaaaaactgc tgacgtttag acttgtcctg gaacaagcga ttgcagaact gtatgcgaaa 360
atcgaggacc tgatcgcgga agcacaacaa acgtctgaag aagaaaaagc agaagaagaa 420
gaaaatgaag aaaaagcgga a 441
<210> 6
<211> 774
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgaaagtcg aaaaaggaga tgtcattcgt ctgcattata cgggcaaagt caaagaaaca 60
ggcgaaatct ttgatacgac ctacgaagat gttgcgaaag aagcacgtat ctataatcct 120
aatggcatct atggacctgt ccctattgca gtgggagcag gacatgtgtt accgggactg 180
gataaacgcc ttatcggcct ggaagtcaaa aaaaaatatg tgatcgaagt gccgccggaa 240
gaaggctttg gcttgcgtga tcctggcaaa attaaaatta ttcctctggg caaatttcgc 300
aaatcaggca ttattccgta tccgggctta gaaattgaag tcgaaacgga aaatggccgt 360
aaaatgcggg gtcgtgtgct gacggtctca ggaggccgcg tgagagtgga ttttaatcat 420
ccgttagcag gcaaaacgtt ggtgtatgaa gtggaagttg tcgaaaaaat cgaagatccg 480
attgaaaaaa tcaaagcgct gattgaactg cggttaccga tgatcgataa agataaagtc 540
atcatcgaaa ttagcgaaaa agatgtcaaa cttaatttta aagatgtgga tattgatcct 600
aaaacactta ttcttggcga aattctgtta gaatcagatc ttaaatttat cggctatgaa 660
aaagtggaat ttgaaccgac gattgaagaa ctgcttaaac ctaaatcagc ggaagaacaa 720
gaatcaccta atgaagaaca acaagaagaa tctgaatcta aagcggaaga atct 774
<210> 7
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Met Lys Lys Lys Gln Val Met Leu Ala Leu Thr Ala Ala Ala Gly Leu
1 5 10 15
Gly Leu Thr Ala Leu His Ser Ala Pro Ala Ala Lys Ala
20 25
<210> 8
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Val Arg Ser Lys Lys Leu Trp Ile Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr Leu
1 5 10 15
Ile Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala
20 25
<210> 9
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gctgcgagtg ctgaaatggc caaatactta gaactcgaag agg 43
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tttattacca agcttttacc ctaccccgca atatga 36
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
aagcttggta ataaaaaaac acctcc 26
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttcagcactc gcagccgc 18
<210> 13
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ccactggaat tccatatggc caaatactta gaactcgaag agg 43
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gttgaccgga attcttaccc taccccgcaa tatgac 36
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gcggccggtg cacatatg 18
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
acgcgtccct ctccttttg 19
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tcaaataagg agtgtcaaga atgaaactgg caatcacagc g 41
<210> 18
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tcaaataagg agtgtcaaga atgaaaaaga aacaagtaat gctcgc 46
<210> 19
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tcaaataagg agtgtcaaga gtgagaagca aaaaattgtg gatc 44
<210> 20
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gtttttttat taccaagctt ttaccctacc ccgcaatatg ac 42
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tcttgacact ccttatttga ttttttg 27
<210> 22
<211> 1433
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
atcaacgtga tataggtttg ctaacctttg cgttcactta actaacttat aggggtaaca 60
cttaaaaaag aatcaataac gatagaaacc gctcctaaag caggtgcatt ttttcctaac 120
gaagaaggca atagttcaca tttattgtct aaatgagaat ggactctaga agaaacttcg 180
tttttaatcg tatttaaaac aatgggatga gattcaatta tatgatttct caagataaca 240
gcttctatat caaatgtatt aaggatattg gttaatccaa ttccgatata aaagccaaag 300
ttttgaagtg catttaacat ttctacatca tttttatttg cgcgttccac aatctctttt 360
cgagaaatat tcttttcttc tttagagagc gaagccagta acgctttttc agaagcatat 420
aattcccaac agcctcgatt tccacagctg catttgggtc cattaaaatc tatcgtcata 480
tgacccattt ccccagaaaa accctgaaca cctttataca attcgttgtt aataacaagt 540
ccagttccaa ttccgatatt aatactgatg taaacgatgt tttcatagtt ttttgtcata 600
ccaaatactt tttcaccgta tgctcctgca ttagcttcat tttcaacaaa aaccggaaca 660
ttaaactcac tctcaattaa aaactgcaaa tctttgatat tccaatttaa gttaggcatg 720
aaaataattt gctgatgacg atctacaagg cctggaacac aaattcctat tccgactaga 780
ccataagggg actcaggcat atgggttaca aaaccatgaa taagtgcaaa taaaatctct 840
tttacttcac tagcggaaga actagacaag tcagaagtct tctcgagaat aatatttcct 900
tctaagtcgg ttagaattcc gttaagatag tcgactccta tatcaatacc aatcgagtag 960
cctgcattct tattaaaaac aagcattaca ggtcttctgc cgcctctaga ttgccctgcc 1020
ccaatttcaa aaataaaatc tttttcaagc agtgtattta cttgagagga gacagtagac 1080
ttgtttaatc ctgtaatctc agagagagtt gccctggaga caggggagtt cttcaaaatt 1140
tcatctaata ttaatttttg attcattttt tttactaaag cttgatctgc aatttgaata 1200
ataaccactc ctttgtttat ccaccgaact aagttggtgt tttttgaagc ttgaattaga 1260
tatttaaaag tatcatatct aatattataa ctaaattttc taaaaaaaac attgacataa 1320
acatttattt tgtatatgat gagataaagt tagtttattg gataaacaaa ctaactcaat 1380
taagatagtt gatggataaa cttgttcact taaatcaagg aggtgaatgt aca 1433
<210> 23
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gagctcggta ccctcgaggg atccgaattc aagcttgtcg acctgcagtc tagacatcac 60
catcatcacc actaatgcgg tagtttatca cagttaaatt gctaacgcag tcaggcaccg 120
tgtatgaaat ctaacaatgc gctcatcgtc atcctcggca ccgtcaccct ggatgctgta 180
ggcataggct tggttatgcc ggtactgccg gg 212
<210> 24
<211> 887
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ctgcgtaata gactttcagg cgtgaatggg aaaaataaga gagtaaaaga aaaagaacaa 60
aaaatctggt cggagattgg gatgatagcg ggagcatttg cgctgcttga tgtgatcatc 120
cgcggcatta tgtttgaatt tccgtttaaa gaatgggctg caagccttgt gtttttgttc 180
atcattatct tatattactg catcagggct gcggcatccg gaatgctcat gccgagaata 240
gacaccaaag aagaactgca aaaacgggtg aagcagcagc gaatagaatc aattgcggtc 300
gcctttgcgg tagtggtgct tacgatgtac gacaggggga ttccccatac attcttcgct 360
tggctgaaaa tgattcttct ttttatcgtc tgcggcggcg ttctgtttct gcttcggtat 420
gtgattgtga agctggctta cagaagagcg gtaaaagaag aaataaaaaa gaaatcatct 480
tttttgtttg gaaagcgagg gaagcgttca cagtttcggg cagctttttt tataggaaca 540
ttgatttgta ttcactctgc caagttgttt tgatagagtg attgtgataa ttttaaatgt 600
aagcgttaac aaaattctcc agtcttcaca tcggtttgaa aggaggaagc ggaagaatga 660
agtaagaggg atttttgact ccgaagtaag tcttcaaaaa atcaaataag gagtgtcaag 720
aatgtttgca aaacgattca aaacctcttt actgccgtta ttcgctggat ttttattgct 780
gtttcatttg gttctggcag gaccggcggc tgcgagtgct gaaacggcga acaaatcgaa 840
tgagcttaca gcaccgtcga tcaaaagcgg aaccattctt catgcat 887
<210> 25
<211> 851
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ggtcgttcaa tacgttaaaa cacaatatga aggatattca tgatgcagga tatacagcca 60
ttcagacatc tccgattaac caagtaaagg aagggaatca aggagataaa agcatgtcga 120
actggtactg gctgtatcag ccgacatcgt atcaaattgg caaccgttac ttaggtactg 180
aacaagaatt taaagaaatg tgtgcagccg ctgaagaata tggcataaag gtcattgttg 240
acgcggtcat caatcatacc accagtgatt atgccgcgat ttccaatgag gttaagagta 300
ttccaaactg gacacatgga aacacacaaa ttaaaaactg gtctgatcga tgggatgtca 360
cgcagaattc attgctcggg ctgtatgact ggaatacaca aaatacacaa gtacagtcct 420
atctgaaacg gttcttagac agggcattga atgacggggc agacggtttt cgatttgatg 480
ccgccaaaca tatagagctt ccagatgatg gcagttacgg cagtcaattt tggccgaata 540
tcacaaatac atctgcagag ttccaatacg gagaaatcct gcaggatagt gcctccagag 600
atgctgcata tgcgaattat atggatgtga cagcgtctaa ctatgggcat tccataaggt 660
ccgctttaaa gaatcgtaat ctgggcgtgt cgaatatctc ccactatgca tctgatgtgt 720
ctgcggacaa gctagtgaca tgggtagagt cgcatgatac gtatgccaat gatgatgaag 780
agtcgacatg gatgagcgat gatgatatcc gtttaggctg ggcggtgata gcttctcgtt 840
caggcagtac g 851

Claims (10)

1.一种信号肽，其特征在于，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述信号肽。
3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带权利要求2所述基因；或者，所述重组质粒携带权利要求2所述基因以及目的基因；或者，所述重组质粒携带权利要求2所述基因、目的基因以及编码分子伴侣prsA的基因。
4.如权利要求3所述的一种重组质粒，其特征在于，所述目的基因为编码α-淀粉酶的基因。
5.如权利要求4所述的一种重组质粒，其特征在于，所述α-淀粉酶为超高温α-淀粉酶。
6.如权利要求5所述的一种重组质粒，其特征在于，所述编码超高温α-淀粉酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
7.如权利要求4-6任一所述的一种重组质粒，其特征在于，所述编码分子伴侣prsA的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞携带权利要求4-7任一所述的重组质粒；或者，所述宿主细胞携带权利要求4-7任一所述的重组质粒，且所述宿主细胞的基因组中***有编码分子伴侣pfefoldinγ的基因；或者，所述宿主细胞携带权利要求4-7任一所述的重组质粒，且所述宿主细胞的基因组中***有编码分子伴侣PPlase的基因。
9.一种生产α-淀粉酶的方法，其特征在于，所述方法为先将权利要求8所述的宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，然后从发酵液中分离得到α-淀粉酶；
或者，所述方法为先将权利要求8所述的宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，然后将发酵液进行热处理，得到经热处理的发酵液，最后从经热处理的发酵液中分离得到α-淀粉酶；
或者，所述方法为先将权利要求8所述的宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，然后将发酵液进行离心，得到菌体，再将菌体重悬，得到重悬液，接着将重悬液进行热处理，得到经热处理的重悬液，最后从经热处理的重悬液中分离得到α-淀粉酶。
10.权利要求1所述的信号肽或权利要求2所述的基因或权利要求4-7任一所述的重组质粒或权利要求8所述的宿主细胞或权利要求9所述的方法在制备α-淀粉酶中的应用。
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