CN117987545A - 一种用于乳腺癌辅助诊断的甲基化检测试剂、试剂盒及应用 - Google Patents
一种用于乳腺癌辅助诊断的甲基化检测试剂、试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医学体外诊断技术领域，更具体地，涉及一种用于乳腺癌辅助诊断的甲基化检测试剂、试剂盒及应用。本发明提供的试剂盒通过检测样本中Chr19:43699197‑43699997的全长区域或部分区域的甲基化水平，对乳腺癌组织样本和血浆样本均具有优异的检测效果，检测准确度高，能够有效区分乳腺癌患者和非癌患者，有效避免假阳性、假阴性结果的检出。本发明提供了一些能够用于乳腺癌辅助诊断的生物标志物，并提供了一种无创或微创、高灵敏度、高特异性的检测乳腺癌的方法，能够准确筛查乳腺癌高危人群，帮助实现乳腺癌的早诊早治。
Description
技术领域
本发明属于生物医学体外诊断技术领域，更具体地，涉及一种用于乳腺癌辅助诊断的甲基化检测试剂、试剂盒及应用。
背景技术
乳腺癌是乳腺上皮细胞在多种致癌因子的作用下，发生增殖失控的现象。疾病早期常表现为***肿块、***溢液、腋窝***肿大等症状，晚期可因癌细胞发生远处转移，出现多器官病变，直接威胁患者的生命。近年来，乳腺癌的治疗效果随着医疗水平的提高而显著提高，且在早期进行治疗，其治愈率更高。但是早期乳腺癌的症状多不明显，常以***肿块、***皮肤异常、***溢液、***或乳晕异常等局部症状为主，由于表现不明显，非常容易被忽视。对健康妇女进行***x线检查已经成为降低乳腺癌死亡率的主要方式。此外还发展出了全场数字***x线摄影(FFDM)，数字乳腺断层摄影术(DBT)，***计算机断层扫描(BCT)，自动***超声(ABUS)，FFDM与ABUS的融合，DBT与ABUS的融合，磁共振成像(MRI)，光学成像，无线电波成像，触觉传感器等技术。乳腺癌最终的确诊方法为病理学检测。影像学检测对医疗资源及阅片医师的要求较高，而且可能对受检者造成放射性伤害；病理检测需要细针穿刺取样，为有创性操作。因此，寻找无创、简单便捷、精确的乳腺肿瘤的早期诊断和筛查方法是当前临床上亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供了一种用于乳腺癌辅助诊断的甲基化检测试剂、试剂盒及应用，以改善现有技术对于乳腺癌诊断的侵入性操作，诊断性能较差，尤其是对乳腺癌血浆样本的检测灵敏度和特异性较低等的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种试剂在制备乳腺癌诊断产品中的应用，所述试剂是检测样本中生物标志物的甲基化水平的试剂，以GRCh38.p14为参考基因组，所述生物标志物包括Chr19:43699197-43699997的全长区域或部分区域中的至少一个。
优选地，所述Chr19:43699197-43699997的部分区域包括Chr19:43699337-43699527、Chr19:43699544-43699735、Chr19:43699752-43699939、Chr19:43699220-43699426和Chr19:43699756-43699949。
优选地，所述乳腺癌诊断产品包括引物、探针、试剂盒、芯片、膜条、蛋白阵列中的至少一种。
本发明还提供了一种用于乳腺癌辅助诊断的甲基化检测试剂，其为用于检测样本中生物标志物的甲基化水平的试剂，以GRCh38.p14为参考基因组，所述生物标志物包括Chr19:43699197-43699997的全长区域或部分区域中的至少一个。
优选地，所述Chr19:43699197-43699997的部分区域包括Chr19:43699337-43699527、Chr19:43699544-43699735、Chr19:43699752-43699939、Chr19:43699220-43699426和Chr19:43699756-43699949。
优选地，所述试剂包括用于检测所述生物标志物的甲基化水平的引物对，和/或检测探针。
优选地，所述引物对选自如下(1)-(5)组引物对中的至少一组：
(1)SEQ ID NO.11～12所示的第一引物对；
(2)SEQ ID NO.14～15所示的第二引物对；
(3)SEQ ID NO.17～18所示的第三引物对；
(4)SEQ ID NO.20～21所示的第四引物对；
(5)SEQ ID NO.23～24所示的第五引物对。
优选地，所述检测探针选自SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.22和SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列中的至少一个。
优选地，所述检测探针的5'端含有荧光报告基团，3'端含有荧光淬灭基团。
本发明还提供了一种用于乳腺癌辅助诊断的试剂盒，其包括所述试剂。
优选地，所述试剂盒还包括内参基因的检测引物对和检测探针、PCR反应试剂、甲基化转化试剂、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、阳性对照和阴性对照中的一种或多种。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的一种用于乳腺癌辅助诊断的甲基化检测试剂，通过检测样本中Chr19:43699197-43699997的全长区域或部分区域的甲基化水平，能够有效区分乳腺癌患者和非癌患者，检测准确度高。
(2)本发明提供的基于上述试剂制备的用于乳腺癌辅助诊断的试剂盒，通过检测样本中Chr19:43699197-43699997的部分区域(如区域1～5)的甲基化水平，对乳腺癌组织样本和血浆样本均具有较高的检出率，检测乳腺癌血浆样本的灵敏度可达95.9％，检测健康人血浆样本的特异性可达92.5％，能够有效避免假阳性、假阴性结果的检出。基于此，本发明提供了一些能够用于乳腺癌辅助诊断的生物标志物，并提供了一种无创或微创、高灵敏度、高特异性的检测乳腺癌的方法，能够准确地筛查乳腺癌高危人群，帮助实现乳腺癌的早诊早治。
附图说明
图1为区域1检测乳腺癌血浆样本的ROC曲线；
图2为区域2检测乳腺癌血浆样本的ROC曲线；
图3为区域3检测乳腺癌血浆样本的ROC曲线；
图4为区域4检测乳腺癌血浆样本的ROC曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语“诊断”是指确定受试者的健康状态，涵盖检测疾病的存在与否、对治疗手段的反应、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。在一些情况下，术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态，“辅助诊断”用于在患者临床状态确定或验证过程中提供各种信息辅助判断，不作为唯一确定指标。一些实施例中，“检测”乳腺癌是指检测疾病的存在与否，即判断受试者是否患有乳腺癌。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而调控基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
术语“生物标志物”是指可以标记***、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，如蛋白质、DNA或RNA等，具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。筛选可用于疾病筛查、早期诊断的生物标志物可大大提高患者的临床治疗效果。低甲基化生物标志物容易在检测中由于检测方法不当或者操作失误而检不出甲基化胞嘧啶，极易造成假阳性结果。在临床应用时，筛选高甲基化、高灵敏度、高特异性的生物标志物对于提高乳腺癌的检出率是十分重要的。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应，PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本发明公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指上游引物和下游引物组成的组。
术语“硫化测序(Bisulfite Sequencing PCR，BSP)”是通过对基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理，非甲基化的胞嘧啶被脱氨基而转变成尿嘧啶，在随后的PCR反应中尿嘧啶转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不能被脱氨基，在反应完成时被保留；然后在非甲基化区域设计引物进行PCR扩增，将扩增得到的PCR产物进行克隆测序，将测得的序列与原始序列比对，统计甲基化位点及数量，并分析甲基化程度。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后，所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术也是基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对，从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来，但是qMSP最终的检测指标为荧光信号，因此，在qMSP反应***中，除加入甲基化检测引物以外，还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比，qMSP法检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高，更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段，且该技术不需要凝胶电泳检测，操作更加简便。在本公开内容中，进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物，若Ct值满足所述要求(例如在组织样本中Ct≤38)，则表明目标序列是甲基化的。
术语“TaqMan探针”是指包含5'荧光基团和3'淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5'-3'核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。
术语“AUC”是“曲线下面积”的缩写。具体地，其是指接受者操作特征(ROC)曲线下面积。ROC曲线是诊断测试的不同可能切割点的真阳性率相比于假阳性率的图。其取决于所选择切割点的灵敏度与特异性之间的权衡(灵敏度的任何增加将伴随着特异性的降低)。ROC曲线下面积(AUC)是诊断测试准确度的度量(面积越大越好；最佳值是1；随机测试将具有位于对角线上的ROC曲线，面积为0.5)。
本发明提供了一种试剂在制备乳腺癌诊断产品中的应用，上述试剂是检测样本中生物标志物的甲基化水平的试剂，以GRCh38.p14为参考基因组，所述生物标志物包括Chr19:43699197-43699997的全长区域或部分区域中的至少一个。可以理解的是，在检测上述生物标志物的甲基化水平时，可以针对其全长区域进行检测，还可以对其部分区域进行检测。
一些实施例中，上述Chr19:43699197-43699997的部分区域包括Chr19:43699337-43699527、Chr19:43699544-43699735、Chr19:43699752-43699939、Chr19:43699220-43699426和Chr19:43699756-43699949。
一些实施例中，上述乳腺癌诊断产品可以是任意合适的产品形式，包括但不限于是引物、探针、试剂盒、芯片、膜条、蛋白阵列等。可选地，上述产品可以是冻干粉状、溶液、悬浮液、乳液等产品形态。
本发明还提供了一种用于乳腺癌辅助诊断的甲基化检测试剂，其为用于检测样本中生物标志物的甲基化水平的试剂，以GRCh38.p14为参考基因组，上述生物标志物包括Chr19:43699197-43699997的全长区域，或Chr19:43699197-43699997的部分区域中的至少一个。可以理解的是，在检测上述生物标志物的甲基化水平时，可以针对其全长区域进行检测，还可以对其部分区域进行检测。
一些实施例中，上述Chr19:43699197-43699997的部分区域包括Chr19:43699337-43699527、Chr19:43699544-43699735、Chr19:43699752-43699939、Chr19:43699220-43699426和Chr19:43699756-43699949。
一些实施例中，上述试剂包括用于检测上述生物标志物的甲基化水平的引物对，和/或检测探针。
一些实施例中，上述引物对选自如下组合中的至少一组：
检测Chr19:43699337-43699527正链的甲基化水平的第一引物对；
检测Chr19:43699544-43699735正链的甲基化水平的第二引物对；
检测Chr19:43699752-43699939正链的甲基化水平的第三引物对；
检测Chr19:43699756-43699949负链的甲基化水平的第四引物对；
检测Chr19:43699220-43699426负链的甲基化水平的第五引物对。
在本发明一些实施例中，上述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～12所示；上述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.14～15所示；上述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.17～18所示；上述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.20～21所示；上述第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.23～24所示。
需要说明的是，若一种引物对与上述引物对(第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对、第五引物对)所示的核苷酸序列具有至少具有85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等)以上的序列一致性，且该引物对同样具有一定的乳腺癌诊断功能(特异性或灵敏度与本申请引物对相比，相当或略有下降或略有提高或大幅提高等)，也在本发明的保护范围内。
一些实施例中，上述检测探针选自SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列中的至少一个。
较佳实施例中，上述试剂选自如下组合中的至少一组：
SEQ ID NO.11～12所示的引物对和SEQ ID NO.13所示的检测探针；
SEQ ID NO.14～15所示的引物对和SEQ ID NO.16所示的检测探针；
SEQ ID NO.17～18所示的引物对和SEQ ID NO.19所示的检测探针；
SEQ ID NO.20～21所示的引物对和SEQ ID NO.22所示的检测探针；
SEQ ID NO.23～24所示的引物对和SEQ ID NO.25所示的检测探针。
本发明还提供了一种用于检测乳腺癌辅助诊断的试剂盒，其包括上述试剂。
一些实施例中，上述试剂盒还包括内参基因的检测引物对和检测探针、PCR反应试剂、甲基化转化试剂、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、阳性对照和阴性对照中的一种或多种。
一些实施例中，上述内参基因可以为但不限于ACTB。在本发明具体实施例中，上述内参基因ACTB的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.26～27所示，检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.28。可以理解的是，在其他实施例中，还可以选择其他内参基因，此时，内参引物对对应设计即可。
一些实施例中，本发明所用检测探针为荧光探针，例如为TaqMan探针。上述检测探针均含有荧光报告基因和荧光淬灭基因，其中检测探针的5'端含有荧光报告基团，所述荧光报告基团包括但不限于FAM、VIC、HEX、NED、ROX、TET、JOE、CY3和CY5；检测探针的3'端含有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团包括但不限于TAMRA、MGB、BHQ、BHQ1、BHQ2和BHQ3。可以理解的是，在同一个反应体系中有两种以上的检测探针时，不同检测探针上连接的荧光基团不同。各检测探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团的举例各自独立地包括但不限于上述所列举。
一些实施例中，上述PCR反应试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。一些实施例中，上述阳性对照是指其中包含甲基化的生物标志物，用于监测试剂盒中试剂的检测性能。上述阴性对照是指其中不包含甲基化的生物标志物，用于监测实验是否受到污染。
一些实施例中，上述甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。本发明对甲基化转化试剂无特别限制，现有技术中报道的可实现胞嘧啶到尿嘧啶转化的试剂均可以，如肼盐、重亚硫酸氢盐和亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)中的一种或多种。
一些实施例中，上述试剂盒还可以包括至少一个设备的任何制品(例如，包装或容器)。容器可包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器和/或其他容器。试剂盒还可以进一步包括用于接收生物样品的适合装置、用于实施在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书。
基于本发明公开的内容，本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术对上述样本中生物标志物的甲基化水平进行检测，对乳腺癌进行诊断，无论采用何种技术，其都是属于本发明的保护范围。在可选的实施方案中，上述甲基化水平通过如下至少一种的方法进行检测：甲基化特异性PCR(MSP)、硫化测序(BSP)、甲基化敏感性随机引物聚合酶链反应(MS AP-PCR)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)、甲基化敏感性DNA限制酶分析、基于限制酶的测序、基于限制酶的微阵列分析、联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)、甲基化CpG岛扩增(MCA)、甲基化CpG岛扩增和微阵列(MCAM)、通过连接介导PCR进行的HpaII小片段富集(HELP)、亚硫酸氢盐微阵列分析、甲基化特异性焦磷酸测序、HELP测序(HELP-seq)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、Gal水解和连接衔接子依赖性PCR(GLAD-PCR)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-Seq)或甲基化DNA免疫沉淀-微阵列分析(MeDIP-chip)、使用甲基敏感性限制酶的Southern印迹法和基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。
一些实施例中，上述样本包括但不限于通过本领域技术人员已知的任何方法获得的个体的细胞、组织、器官和/或生物体液。一些实施方式中，上述样本选自下组：组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、体液、手术切除样本、分离的血细胞、分离自血液的细胞，及其任意组合。一些实施方式中，上述体液选自下组：全血、血清、血浆，及其任意组合。
本发明提供的试剂盒能够实现乳腺癌的鉴别诊断、微小病灶残留评估及动态监测、乳腺癌复发及预后的辅助判断、药物疗效评估及耐药监测等。其中，上述乳腺癌的鉴别诊断具体可以是用于确认个体是否患有乳腺癌或者更加有可能患有乳腺癌；上述微小病灶残留评估及动态监测具体可以是用于确认个体中是否残留微小病灶；上述乳腺癌复发及预后的辅助判断是指乳腺癌复发的风险和预后情况预测，具体可以是用于确认个体乳腺癌复发的可能性或恶化倾向，可用于指导临床诊疗；上述药物疗效评耐药监测具体可以是用于确认某种药物或治疗手段是否对乳腺癌个体有效。
基于此，本发明还提供了一种利用上述试剂盒无创检测乳腺癌的方法，包括如下步骤：提取受试者血浆样本的DNA并用甲基化转化试剂对其进行转化，随后对转化的DNA进行纯化，然后采用本发明提供的上述试剂盒进行qPCR扩增，通过qMSP法检测生物标志物的甲基化水平，进而判断待测血浆样本为乳腺癌阴性或阳性。本发明提供的试剂盒通过对血浆样本进行检测，能够准确地筛查乳腺癌高危人群，帮助实现乳腺癌的早诊早治，弥补现有影像学诊断资源不足、普及率低的缺陷。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。
以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。
实施例1
发明人以Chr19:43699197-43699997bp作为生物标志物，通过检测其甲基化的发生可以对乳腺癌进行诊断或辅助诊断，具有较高的灵敏度和特异性，可以有效提高乳腺癌的检出率。
生物标志物Chr19:43699197-43699997bp的DNA序列为(5'-3')：
TGTGATTGTGCCACTGCACTCCAGCCTGGGTGACAGAGCGAGACTCTGTCTCATTTTTTTAAAAAAAGTTTTTAAAAAAGGAAACAAACATTGCACACGAGTGAAAACACACCTGTAACATACGTGTAAGGTAGAAAGAGTGACAACGAGAGAGAGACAGCCGTGACCAGCTCCCAGCTCAAAGAAAAGAACATTCCTGATGAGCTTTCACGAAGGACATGGACTCGAGGGGCTCGCGGGCCCTGTGCGTGTGCAAGGCGCGCGCGTGTGCGCTTGGGTGCGCGCGGGGGTGGCCTTCTGCCTGCGCGCGCCCCCACGTCCCCTCCTTGCACCCTGTCTCCGTCTCGGCAGGCGGCCGGAACGTGAACGTACGCGGCTGCGGCTCCCGAGACCTGTGCAGCGCCCTGGACTGGACCCACGGGCTCTCTGTGCTCCCAAGACACTGGCTGTCGAGCCACTGCAGCCCCCACCGCCGCGCCGTCCTAGAGTCCCACTGCCGCTCGGGCGCCGCGCCCGGCCTCCGCCTCTCCCTCCCGGTTCTGGTGGTAGTCCTGGCAACCGCGACGCTGTGCTAAGGAATCCCGCCTGGACCACCCCGCCGCCCGGGAGGCCCCCTCCACCTGCTTGTTCGGCACGTCGCTAGATGGTGCCCTGGCTCCCCTCTGCTGGGGCAATGCGGAGACCTGGAAGCCTCTGGTGAGAAACTCAGGAAGCAGGGATGAGCTTCCTCCCTCAGACTAGCGTTTCCCAAAGCCAGACCTTCTGCTCCAGACTCAGGGCTTACTCAAGGCTAAGTCCTCT(SEQ ID NO.31)。
Chr19:43699197-43699997bp完全甲基化且经亚硫酸氢盐处理后的序列为(5'-3')：
TGTGATTGTGTTATTGTATTTTAGTTTGGGTGATAGAGCGAGATTTTGTTTTATTTTTTTAAAAAAAGTTTTTAAAAAAGGAAATAAATATTGTATACGAGTGAAAATATATTTGTAATATACGTGTAAGGTAGAAAGAGTGATAACGAGAGAGAGATAGTCGTGATTAGTTTTTAGTTTAAAGAAAAGAATATTTTTGATGAGTTTTTACGAAGGATATGGATTCGAGGGGTTCGCGGGTTTTGTGCGTGTGTAAGGCGCGCGCGTGTGCGTTTGGGTGCGCGCGGGGGTGGTTTTTTGTTTGCGCGCGTTTTTACGTTTTTTTTTTGTATTTTGTTTTCGTTTCGGTAGGCGGTCGGAACGTGAACGTACGCGGTTGCGGTTTTCGAGATTTGTGTAGCGTTTTGGATTGGATTTACGGGTTTTTTGTGTTTTTAAGATATTGGTTGTCGAGTTATTGTAGTTTTTATCGTCGCGTCGTTTTAGAGTTTTATTGTCGTTCGGGCGTCGCGTTCGGTTTTCGTTTTTTTTTTTCGGTTTTGGTGGTAGTTTTGGTAATCGCGACGTTGTGTTAAGGAATTTCGTTTGGATTATTTCGTCGTTCGGGAGGTTTTTTTTATTTGTTTGTTCGGTACGTCGTTAGATGGTGTTTTGGTTTTTTTTTGTTGGGGTAATGCGGAGATTTGGAAGTTTTTGGTGAGAAATTTAGGAAGTAGGGATGAGTTTTTTTTTTTAGATTAGCGTTTTTTAAAGTTAGATTTTTTGTTTTAGATTTAGGGTTTATTTAAGGTTAAGTTTTTT(SEQ ID NO.32)。
上述Chr19:43699197-43699997bp包括区域1～5，区域1～5的具体信息见表1。分别以区域1～区域5完全甲基化且经亚硫酸氢盐转化后的序列为模板，设计对应的甲基化特异性引物和检测探针，见表2。
表1区域1～5的具体信息
表2区域1～区域5、ACTB的引物对和检测探针的核苷酸序列
实施例2
1)样本收集
于郑州某医院收集42例乳腺癌患者的癌组织样本和对应的42例癌旁正常组织样本，所有的样本均为***浸泡、石蜡包埋的组织样本。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2)DNA样本的提取、纯化和转化
采用QIAamp DNAFFPE Tissue Kit(56404)提取组织DNA，具体操作参见试剂盒说明书。将提取好的全部基因组进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843)，具体实验操作参见试剂盒说明书。
3)qPCR扩增及测序
设计简并引物对(见表3)，分别以亚硫酸氢盐转化后的组织基因组DNA为模板，进行PCR反应扩增Chr19:43699197-43699997，PCR反应体系见表4，PCR扩增程序见表5。在PCR扩增结束后，使用简并引物对对扩增产物进行桑格尔测序(送测序公司)，同时从5'端和3'端测序。
表3简并引物对
表4 PCR反应体系
| 组分 | 用量(μL) |
| 10×Taq buffer(Mg2+Free) | 5 |
| 25mM Mg2+ | 4 |
| dNTP Mix(10mM each) | 1 |
| 上游简并引物(10μM) | 1 |
| 下游简并引物(10μM) | 1 |
| 热启动Taq DNA聚合酶 | 0.5 |
| 模板DNA | 10 |
| 超纯水 | 补至50 |
表5 PCR扩增程序
4)结果分析
剔除测序失败的样本，保留测序成功的样本进行结果分析。
根据测序峰图对每个样本的扩增子中的CpG位点的甲基化情况进行分析。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果为胸腺嘧啶，则其为非甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果仍然为胞嘧啶，则其为完全甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果既有胞嘧啶也有胸腺嘧啶(双峰)，则其为部分甲基化的。如果扩增子中95％以上的CpG二核苷酸中胞嘧啶是甲基化的，则认为此样本在该基因区域中是甲基化阳性的。将样本的甲基化检测结果同病理结果进行对比，计算甲基化检测的灵敏度和特异性，灵敏度是指测序成功的且病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例。特异性是指测序成功的且病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。检测结果见表6。
表6硫化测序法检测Chr19:43699197-43699997的甲基化水平
由表6可以看出，以Chr19:43699197-43699997作为生物标志物时，其在乳腺癌组织样本中的甲基化水平(甲基化阳性样本的例数)明显高于其在癌旁正常组织样本中的甲基化水平(甲基化阴性样本的例数)，即Chr19:43699197-43699997在乳腺癌组织样本中呈高甲基化状态。使用硫化测序法检测Chr19:43699197-43699997的甲基化水平，可以有效区分乳腺癌组织样本和癌旁正常组织样本，检测灵敏度大于76％，特异性高于83％。
实施例3在组织样本中用甲基化特异性PCR法检测乳腺癌
本实施例提供使用试剂盒进行乳腺癌诊断或辅助诊断的方法，包括如下步骤：
1)DNA样本的提取、纯化和转化同实施例2。
2)甲基化荧光定量PCR反应
将亚硫酸氢盐转化后的DNA进行甲基化荧光定量PCR反应，以检测区域1～5在组织样本的甲基化水平，每个区域单独进行检测，即一个PCR管中每次只加入一个区域的检测引物和探针，同时加入内参基因ACTB的检测引物和探针。各个区域及ACTB基因的上下游引物及探针序列如表2所示。
本实施例中所用到的探针均为TaqMan探针，区域1～5的探针5'端的荧光报告基团均为FAM，3'端的荧光淬灭基团均为MGB，ACTB探针5'端的荧光报告基团为VIC，3'端的荧光淬灭基团为BHQ1。采用Invitrogen Platinum II Taq热启动DNA聚合酶进行PCR扩增，PCR反应液配置体系如表7所示。
表7 PCR反应体系中各组分配方成分表
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检测区域1～5中任一区域在样本中的甲基化状态时，只需将某一区域对应的引物探针、ACTB引物探针、缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和样本DNA等按照表7中的体积加入到反应体系中，按照表8所示的扩增程序进行扩增。
表8 PCR扩增程序
阴性对照和阳性对照：在对生物标志物的不同区域分别进行检测时，阴性对照和阳性对照应进行同步检测。阴性对照为纯化水。阳性对照的制备方法为：将ACTB的扩增区域对应的经亚硫酸氢盐完全转化后的序列进行人工合成，并克隆至载体上，形成人工合成质粒。将区域1～5对应的完全甲基化且经亚硫酸氢盐转化后的序列进行人工合成，并分别克隆至载体，形成人工合成质粒。区域1～5的阳性对照为103拷贝/微升的ACTB人工合成质粒和103拷贝/微升的每一区域的人工合成质粒1:1混合而成，如区域1的阳性对照为103拷贝/微升的ACTB人工合成质粒和103拷贝/微升的区域1的人工合成质粒1:1混合而成。
Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1～2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。
质量控制：阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照的Ct值应在26～30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
3)PCR结果分析
结果分析和判读方法：对于组织样本，当某一区域在样本上的Ct值≤38时，即认为该样本在此区域被检出甲基化，若某一区域在样本上的Ct值＞38，则认为该样本在此区域为甲基化阴性。检测结果如表9所示。
表9区域1～5在组织样本中的灵敏度和特异性
由表9可以看出，通过MSP法检测组织样本中生物标志物Chr19:43699197-43699997的区域1～5中任一区域的甲基化水平，都可以有效区分乳腺癌组织样本和癌旁正常组织样本。具体地，通过检测区域1、区域2、区域4、区域5、的甲基化水平诊断乳腺癌组织样本的灵敏度均大于80％；通过检测区域1、区域2、区域3、区域4的甲基化水平检测癌旁正常组织样本的特异性均大于80％。
实施例4
考虑到使用甲基化荧光定量PCR的方法检测受试者样本的甲基化程度更加便捷和节约时间，本申请收集了受试者的血液样本，结合实施例1中的引物对和探针检测受试者血浆cfDNA的甲基化状态，进而判断其是否为癌症阳性。
具体操作如下：于郑州某医院收集经组织活检确诊为乳腺癌患者的血浆样本及健康人血浆样本，每份样本的体积均大于8mL，共收集到乳腺癌患者血浆样本64例、健康人血浆样本53例。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。将所有样本编盲后进行检测，检测完成后揭盲和病理结果对比，进行生物标志物的性能分析。
血浆样本用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取。具体操作步骤参见试剂盒说明书。按照实施例3提供的方法对血浆cfDNA进行亚硫酸氢盐转化。
选用区域1～5的引物对和探针进行甲基化特异性PCR检测，PCR检测的方法、步骤和质量控制标准同实施例3。PCR检测结果用2-ΔΔCt法进行ROC分析，统计每个区域对乳腺癌患者的灵敏度、特异性及AUC值。
用2-ΔΔCt法对乳腺癌样本和健康人样本进行ROC(Receiver operatingcharacteristic curve，受试者操作特征曲线)分析，记录约登指数(Youden’s index，其值为灵敏度和特异性之和减去1)最大时的灵敏度、特异性和AUC值，其中ΔΔCt＝(Ct待检区域-CtACTB)样本-(Ct待检区域-CtACTB)阳性对照。结果见表10所示，区域1、区域2、区域3、区域4检测乳腺癌血浆样本的ROC曲线分别如图1、图2、图3、图4所示。
表10区域1～5在乳腺癌血浆样本中的灵敏度、特异性及AUC值
| 检测区域 | 灵敏度 | 特异性 | AUC值 |
| 区域1 | 95.9％ | 92.5％ | 0.89 |
| 区域2 | 91.5％ | 90.6％ | 0.88 |
| 区域3 | 94.6％ | 84.9％ | 0.81 |
| 区域4 | 90.6％ | 92.5％ | 0.91 |
| 区域5 | 80.1％ | 83.0％ | 0.80 |
由表10可以看出，通过MSP法检测区域1～5的甲基化水平诊断乳腺癌血浆样本的效果优异，其AUC值都大于0.80，检测准确度高。具体地，通过检测区域1～5的甲基化水平诊断乳腺癌血浆样本的灵敏度范围为80.1％～95.9％，其检测健康人血浆样本的特异性范围为83.0％～92.5％，能有效避免假阳性、假阴性结果的检出。综合来看，通过检测区域1、区域2、区域4的甲基化水平诊断乳腺癌患者和健康人血浆样本的性能较优，检测乳腺癌患者血浆样本的灵敏度、检测健康人血浆样本的特异性均大于90％。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种试剂在制备乳腺癌诊断产品中的应用，其特征在于，所述试剂是检测样本中生物标志物的甲基化水平的试剂，以GRCh38.p14为参考基因组，所述生物标志物包括Chr19:43699197-43699997的全长区域或部分区域中的至少一个。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Chr19:43699197-43699997的部分区域包括Chr19:43699337-43699527、Chr19:43699544-43699735、Chr19:43699752-43699939、Chr19:43699220-43699426和Chr19:43699756-43699949；
所述乳腺癌诊断产品包括引物、探针、试剂盒、芯片、膜条、蛋白阵列中的至少一种。
3.一种用于乳腺癌辅助诊断的甲基化检测试剂，其特征在于，其为用于检测样本中生物标志物的甲基化水平的试剂，以GRCh38.p14为参考基因组，所述生物标志物包括Chr19:43699197-43699997的全长区域或部分区域中的至少一个。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述Chr19:43699197-43699997的部分区域包括Chr19:43699337-43699527、Chr19:43699544-43699735、Chr19:43699752-43699939、Chr19:43699220-43699426和Chr19:43699756-43699949。
5.根据权利要求3或4所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括用于检测所述生物标志物的甲基化水平的引物对，和/或检测探针。
6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述引物对选自如下(1)-(5)组引物对中的至少一组：
(1)SEQ ID NO.11～12所示的第一引物对；
(2)SEQ ID NO.14～15所示的第二引物对；
(3)SEQ ID NO.17～18所示的第三引物对；
(4)SEQ ID NO.20～21所示的第四引物对；
(5)SEQ ID NO.23～24所示的第五引物对。
7.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述检测探针选自SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列中的至少一个。
8.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于，所述检测探针的5'端含有荧光报告基团，3'端含有荧光淬灭基团。
9.一种用于乳腺癌辅助诊断的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求3至8任一所述的试剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包括内参基因的检测引物对和检测探针、PCR反应试剂、甲基化转化试剂、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、阳性对照和阴性对照中的一种或多种。
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