CN117887634B - 一株具有促生作用的细菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株具有促生作用的细菌及其应用，涉及植物生长技术领域，所述细菌为芽孢杆菌属（Bacillus sp.），菌种已在广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）登记保藏，保藏编号为GDMCC.No 64088。将本发明提供的菌株接种植物后，菌株能够定植于植物体内，并且能对植物的生长产生影响，将本发明提供的菌株接种小麦后，可以促进小麦的生长，为学术界探究植物内生菌的菌群结构和作用机理提供研究依据。
Description
技术领域
本发明涉及植物生长技术领域，具体涉及一株具有促生作用的细菌及其应用。
背景技术
内生细菌是一种可以在健康植物组织中定植并与植物建立和谐关系的微生物，可以直接促进宿主植物的生长，其作用主要有两点：其一，植物内生细菌可作为生物防治剂；其二，植物内生细菌的促生作用。植物内生细菌的促生作用可以从改善营养形态促进吸收；增强对冷、热、干旱等胁迫的耐受性；通过拮抗、竞争、诱导或启动植物的***抗性来增强植物的抗病性；产生（或协同）调节植物激素四个方面促进植物生长。
由于、组织偏好性、地区差异性等是影响植物内生细菌在植物体内分布的主要因素，阻碍了对植物内生菌的开发利用。不仅如此，现如今，对植物内生菌的利用还没有找到完整适宜的技术体系，能够高效的研究植物内生菌。因而，对于植物内生菌的菌群结构的了解和作用机理的成了学术界探究的热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一株具有促生作用的细菌及其应用，该细菌是从滇重楼种子的假种皮中提取的内生细菌，为芽孢杆菌属（Bacillus sp.），菌种已于2023年11月30日保藏于广东省微生物保藏中心（广东省微生物分析检测中心），保藏编号为GDMCC.No64088，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
该菌的分离、纯化包括：
A、取样：收集云南滇重楼种子，用75 %乙醇浸泡1 min，无菌水淋洗3 次，再用有效氯5 %的次氯酸钠溶液浸泡3 min，无菌水清洗4次对滇重楼种子表面进行消毒处理，将消毒后的滇重楼种子保存备用。用1000 μL移液枪取其最后一次清洗所用的无菌水120 μL，接入牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，再用无菌的不锈钢涂布棒涂布均匀。完成后，放置到隔水式培养箱中培养，培养条件为28 ℃，培养3 d后，观察培养皿上没有长出任何细菌，说明消毒成功。
B、培养基的制备：制备牛肉膏蛋白胨培养培养基：基牛肉膏：3.0 g，蛋白胨10.0g，氯化钠 5.0 g，水1000ml，pH 7.4～7.6，琼脂 20 g；
1/2 PDA：马铃薯100 g，葡萄糖10 g，琼脂20 g，水1000 ml，自然pH。
C、分离纯化：无菌条件下，剥下已消毒滇重楼种子的假种皮，在无菌研钵中放入滇重楼种子的假种皮，充分研磨，并适当稀释，用1000 μL移液枪取其研磨液200 μL接入牛肉膏蛋白胨培养基平板上，再用不锈钢涂布棒涂布均匀。完成后，放置到温度条件为28 ℃的隔水式培养箱中培养，培养7 d。此过程中，在长出细菌菌落后，挑取长出的菌落接入的新的培养基进行培养，重复多次，采用划线法纯化，获得单克隆。
D、菌株鉴定：
1）形态鉴定：参考周德庆和徐德强主编的《微生物实验教程》第八版、《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）和细菌分类表的结果进行细菌的常规鉴定：
a、固体培养基细菌的菌落特征：菌落呈黄色、圆形、透明度较高、表面光滑且粘稠，边缘整齐、湿润。
b、液体培养基细菌的菌落特征：挑选少量菌苔，接入液体培养基，25℃、170 rmp摇床培养24 h，再静置24 h观察菌液。
菌液浑浊均匀、沉淀为颗粒状、无菌膜。
c、革兰氏染色：准备干净的载玻片，取一环水在载玻片上，用接种环挑选少许菌苔，在水中涂开，使其薄而均匀，完成涂片。将菌面朝上过火2～3次，完成固定。将固定后的涂片滴加草酸铵结晶液染色1～2 min，水洗，完成染色。滴加碘液染色1～2 min，水洗，完成媒染。吸取残留的水，滴加95 %乙醇在菌面上来回晃动进行脱色，每次30 s，重复三次后立即水洗，完成脱色。滴加蕃红染色2～3 min，水洗，完成复染。染色完毕，在显微镜下进行菌体形状和颜色的观察。
镜下菌体呈红色，杆状，为革兰氏阴性菌。
2）分子学鉴定：将纯化的细菌送到天一辉远生物科技有限公司进行测序，采用27F和1492 Ｒ引物扩增内生细菌的16S rDNA 序列，测序完成后，在Geneious里用BLAST将内生细菌的16S rDNA 序列进行比对分析。
3）理化性质实验：将菌种进行接触酶实验，实验过程中产生气泡，说明菌种呈阳性；将菌种进行氧化酶实验，实验过程中滤纸60s内出现红色，说明菌种呈阳性；将菌种进行糖发酵实验，实验过程中有气泡产生，说明菌种发酵产气。
结合形态学特征、分子鉴定结果和理化性质实验结果，最终将该菌株鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。
本发明的有益效果是：
芽孢杆菌属GDMCC 64088接种植物后，能够定植于植物体内，并且能对植物的生长产生影响，将本发明提供的菌株接种小麦后，可以促进小麦的生长，为学术界探究植物内生菌的菌群结构和作用机理提供研究依据。
附图说明
图1为芽孢杆菌属GDMCC 64088在培养基上菌落的形态；
图2为芽孢杆菌属GDMCC 64088进行革兰氏染色后的镜下图；
图3为实验组共培7 d的小麦幼苗生长情况；
图4为对照组共培7 d的小麦幼苗生长情况。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：芽孢杆菌属GDMCC 64088的分离、筛选与鉴定
A、取样：收集云南滇重楼种子，用75 %乙醇浸泡1 min，无菌水淋洗3 次，再用有效氯5 %的次氯酸钠溶液浸泡3 min，无菌水清洗4次对滇重楼种子表面进行消毒处理，将消毒后的滇重楼种子保存备用。用1000 μL移液枪取其最后一次清洗所用的无菌水120 μL，接入牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上，再用无菌的不锈钢涂布棒涂布均匀。完成后，放置到隔水式培养箱中培养，培养条件为28 ℃，培养3 d后，观察培养皿上没有长出任何细菌，说明消毒成功。
B、培养基的制备：制备牛肉膏蛋白胨培养培养基：基牛肉膏：3.0 g，蛋白胨10.0g，氯化钠 5.0 g，水1000ml，pH 7.4～7.6，琼脂 20 g；
1/2 PDA：马铃薯100 g，葡萄糖10 g，琼脂20 g，水1000 ml，自然pH。
C、分离纯化：无菌条件下，剥下已消毒滇重楼种子的假种皮，在无菌研钵中放入滇重楼种子的假种皮，充分研磨，并适当稀释，用1000 μL移液枪取其研磨液200 μL接入牛肉膏蛋白胨培养基平板上，再用不锈钢涂布棒涂布均匀。完成后，放置到温度条件为28 ℃的隔水式培养箱中培养，培养7 d。此过程中，在长出细菌菌落后，挑取长出的菌落接入的新的培养基进行培养，重复多次，采用划线法纯化，获得单克隆。
D、菌株鉴定：
1）形态鉴定：参考周德庆和徐德强主编的《微生物实验教程》第八版、《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）和细菌分类表的结果进行细菌的常规鉴定：
a、固体培养基细菌的菌落特征：菌落呈黄色、圆形、透明度较高、表面光滑且粘稠，边缘整齐、湿润。
b、液体培养基细菌的菌落特征：挑选少量菌苔，接入液体培养基，25℃、170 rmp摇床培养24 h，再静置24 h观察菌液。
菌液浑浊均匀、沉淀为颗粒状、无菌膜。
c、革兰氏染色：准备干净的载玻片，取一环水在载玻片上，用接种环挑选少许菌苔，在水中涂开，使其薄而均匀，完成涂片。将菌面朝上过火2～3次，完成固定。将固定后的涂片滴加草酸铵结晶液染色1～2 min，水洗，完成染色。滴加碘液染色1～2 min，水洗，完成媒染。吸取残留的水，滴加95 %乙醇在菌面上来回晃动进行脱色，每次30 s，重复三次后立即水洗，完成脱色。滴加蕃红染色2～3 min，水洗，完成复染。染色完毕，在显微镜下进行菌体形状和颜色的观察。
镜下菌体呈红色，杆状，为革兰氏阴性菌。
2）分子学鉴定：将纯化的细菌送到天一辉远生物科技有限公司进行测序，采用27F和1492 Ｒ引物扩增内生细菌的16S rDNA 序列，测序完成后，在Geneious里用BLAST将内生细菌的16S rDNA 序列进行比对分析。
3）理化性质实验：将菌种进行接触酶实验，实验过程中产生气泡，说明菌种呈阳性；将菌种进行氧化酶实验，实验过程中滤纸60s内出现红色，说明菌种呈阳性；将菌种进行糖发酵实验，实验过程中有气泡产生，说明菌种发酵产气。
结合形态学特征、分子鉴定结果以及理化性质实验结果，最终将该菌株鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。
实施例2：芽孢杆菌属GDMCC 64088对小麦生长的影响
A、制备菌液：用接种环挑取少量菌苔，接入牛肉膏蛋白胨液体培养基内，10 ml/支，25℃、170 rmp摇床培养24 h，待用。
B、小麦种子处理：用75%乙醇对小麦种子表面进行消毒3 min，后用无菌水浸洗2min，重复5次，最后用无菌滤纸将水分吸干，自然晾干12 h后，待用。
C、促生培养：取350 mL组培瓶，向其倒入1 /2 PDA培养基50 mL，灭菌，凝固后待用。取 10 μL菌液接入组培瓶，再将菌液用不锈钢材质的涂布棒均匀涂布在1 /2 PDA培养基上，最后用无菌镊子接入表面消毒处理的小麦种子到组培瓶，每一组培瓶中接入小麦种子12粒，作为实验组，设置三个重复。在没有接入菌液的组培瓶中直接接入表面消毒处理的小麦种子作为对照组，同样，每瓶12粒小麦种子，共三个重复。完成后，置于人工气候培养箱中培养7 d，人工气候培养箱条件设置为28 ℃、39%湿度、光照时间和黑暗时间分别为14 h和10 h。7 d后，观察小麦幼苗存活情况，测定其根长、株高、鲜重、根数，其中，株高由植株茎的基部开始测量直到第一片真叶叶柄处；根长分别取左、中、右三条最长的根测量，取平均作为最终的根长；根数由小麦胚上长出的根系为准。
芽孢杆菌属GDMCC 64088菌株影响白小麦苗生长数据统计如表1；实验组和对照组共培7 d的小麦幼苗生长情况如图3-4。
表1共培养的小麦幼苗形态指标的测定
| 组别 | 株高/cm | 株高增长率/% | 根长/cm | 根长增长率/% | 根数/个 | 根数增长率/% | 鲜重/g | 鲜重增长率/% |
| 对照组 | 3.15±2.8 | - | 2.29±1.3 | - | 6 | - | 0.098 | - |
| 实验组 | 7.96±.4.4 | 152.7 | 3.12±1.4 | 36.2 | 7 | 16.6 | 0.185 | 88.7 |
总结：
芽孢杆菌属GDMCC 64088菌株对小麦幼苗的生长有明显的促进作用，与芽孢杆菌属GDMCC 64088菌株共培养的小麦幼苗的株高、根长、根数和鲜重与对照的株高、根长、根数和鲜重相比都有增长。株高增长率为152.7%，根长增长率为36.2%，根数为16.6%，鲜重增长率为88.7%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (2)
1.一株具有促生作用的细菌，其特征在于：所述细菌为芽孢杆菌属（Bacillus sp.），菌种已在广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）登记保藏，保藏编号为GDMCC.No 64088。
2.根据权利要求1所述的细菌在小麦种植中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN202410225134.7A Active CN117887634B (zh) | 2024-02-29 | 2024-02-29 | 一株具有促生作用的细菌及其应用 |
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| CN (1) | CN117887634B (zh) |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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-
2024
- 2024-02-29 CN CN202410225134.7A patent/CN117887634B/zh active Active
Patent Citations (12)
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Non-Patent Citations (8)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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