CN111849815A - 一种植物根际促生菌株Gxun-20及其在植物促生中的应用 - Google Patents

一种植物根际促生菌株Gxun-20及其在植物促生中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种植物根际促生菌株Gxun‑20及其在植物促生中的应用，从红树林根际土壤中，通过ADF筛选培养基、LB纯化培养基筛选出一株具有高效分泌IAA和溶磷促生能力的菌株，对该菌株的16S rRNA及生理生化特性进行测定，确定该菌株为短芽孢杆菌，该菌为革兰氏阳性菌，菌落形态为圆形、平滑、凸起、白色。2019年6月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。对Gxun‑20的发酵条件进行优化，应用其发酵得到的菌液对植物进行促生试验。本发明的菌株Gxun‑20相比于其他的菌株具有较高产IAA能力，可利用其促进植物的生长和发育，从而有效减少化学肥料的使用以及化肥对土壤的伤害。

Description

一种植物根际促生菌株Gxun-20及其在植物促生中的应用
技术领域
本发明属于植物促生技术领域，特别涉及一种植物根际促生菌株Gxun-20及其在植物促生的应用。
背景技术
根据研究发现，化肥的过量使用造成土壤重金属污染，降低土壤生物活性，土壤酸碱度失衡、土壤板结等等这些不利于作物健康生长的影响。这些影响导致农作物重金属含量超标严重，人类食用含有大量重金属的粮食，会使人类的身体健康受到威胁。为了减少有害化肥的使用，使得人类的食物变得健康，需要引进和研究出更加健康有效的化肥。
植物根际促生菌是一类可以分泌表面活性剂、植物生长激素如3-吲哚乙酸等物质的有益菌类。部分PGPR菌株不仅可以合成植物类激素IAA，并且可以促进植物的生长和发育。利用植物根际促生菌的作用机制可以改善土壤成分，使得土壤肥力越来越适合植物生长，进一步提高植物修复的效率。
利用PGPR菌制作成微生物肥料，有利于提高土壤的使用效率，减少化肥造成土壤板结等问题。目前研究已发现此类PGPR菌株包括土壤杆菌、芽孢杆菌、根瘤菌和假单胞杆菌等。多项研究表明PGPR对植物的生长具有促进作用。如于素梅发现植物促生细菌Bacillus.sp YM-1对土壤Pb钝化及促进油菜的生长；汪钱龙等人发现的七株生防细菌可以促进玉米的生长；谭石勇等人发现苎麻促生菌对苎麻有促进生长的作用。也有研究表明，植物根际促生细菌对土壤重金属污染也有修复作用，如潘凤山研究发现东南景天促生菌可以提高植物萃取镉，从而起到修复土壤的作用；杨亚男从番茄根际分离出根际微生物，研究了这些根际微生物对番茄的促生效果，同时改善土壤肥力下降、土传病害加重、自毒物质积累等问题。
目前我国微生物肥料存在菌株纯度不够高、针对性促生作用不强、作用效果不稳定等问题。所以还需要对植物根际土壤周围的微生物进行大量纯化并且优化其培养条件。
发明内容
针对目前我国微生物肥料存在的上述问题，本发明提供一种植物根际促生菌株Gxun-20及其在植物促生中的应用，可用于促进植物生长。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种植物根际促生菌株Gxun-20，所述的植物根际促生菌株Gxun-20为短芽孢杆菌，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：中国，广州，广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，分类学名称为Brevibacillus parabreivs，保藏编号为GDMCC NO：60686，保藏时间为2019年6月13日。
进一步的，所述的植物根际促生菌Gxun-20革兰氏染色阳性，菌落形态为圆形、平滑、凸起、白色。
同时，本发明还提供所述的植物根际促生菌株Gxun-20在植物促生中的应用，包括以下步骤：
（1）挑选饱满、无破损、质量良好的种子，首先用50℃温水浸泡10 min后倒出，再用无菌水浸泡8 h，最后用质量浓度为10％的Na3PO4溶液浸种10～15 min；将浸泡好的种子用清水冲洗干净并控去水分，放置于铺好纸巾的培养皿中，然后喷洒无菌水浸润；最后将其放入黑暗、25℃通风恒温培养箱中，每天喷洒无菌水保持湿润，直至大部分种子露白，得到催好芽的种子；
（2）取大棚表层土与木屑、有机肥按1:1:1混合，消毒灭菌制备得到育苗营养土；先用无菌水浇透育苗营养土，再把催好芽的种子接种至育苗营养土里，盖上一层薄的育苗营养土，最后铺盖透明地膜，等到75～80%的幼苗破土而出时及时揭掉透明地膜，使幼苗顺利进行光合作用；
（3）当幼苗长出3～4片叶子且生长状态稳定后，采用菌液灌根的方式向每株幼苗浇灌10mL稀释5～10倍的发酵菌液，每7d浇一次发酵菌液，一共处理4～5次即可。
经过本发明筛选出来的根际细菌相比于其他的菌株具有较高产IAA能力，由于R2A液体培养基可能并不是该菌株的最佳发酵培养基，所以需要进行培养基优化。对于产IAA的培养基优化，大多从发酵时间、pH、碳源、氮源、无机盐、温度等方面来进行研究。本发明首先确定了菌株的发酵时间为26～40h，这时菌株IAA产量有27.50mg/L。并且当该菌株选择玉米浆为氮源，浓度为0.05%(w/v)时，菌株产IAA最高达到65.16 mg/L。由此可以，本发明筛选的菌株具有发展为微生物肥料的潜力。
作为本发明植物根际促生菌株Gxun-20在植物促生中应用的进一步改进，所述发酵菌液的发酵方法，包括以下步骤，
（1）取植物根际促生菌株Gxun-20接种于LB液体培养基中，在200r/min的摇床中30℃恒温振荡培养进行活化，每隔2h测定培养液的OD600值，绘制生长曲线；
（2）在灭菌后的R2A液体培养基中加入2mg/L的L-色氨酸，调节初始pH为6.0～6.5，然后按照5μL/mL培养基的接种量，将对数生长期的活化后的植物根际促生菌株Gxun-20接入，于200r/min摇床中25～30℃下振荡发酵26～40h，得到发酵菌液；
作为本发明植物根际促生菌株Gxun-20在植物促生中应用的进一步改进，所述的R2A液体培养基配方如下：
葡萄糖0.5g、酵母粉0.5g、酪蛋白氨基酸0.5g、K2HPO4 0.1～0.4g、丙酮酸钠0.3g、胰蛋白胨0.5g、可溶性淀粉0.05～0.5g、L-色氨酸1.5～2.5mg、七水硫酸镁0.05g，溶于1000mL水，用K2HPO4与KH2PO4将pH值调至6.0～6.5，于121℃条件下灭菌20 min。
或者，所述的R2A液体培养基配方如下：
蔗糖0.4g、玉米浆0.5g、酪蛋白氨基酸0.5g、氯化钠0.1g、丙酮酸钠0.3g、胰蛋白胨0.5g、可溶性淀粉0.5g、L-色氨酸2mg、七水硫酸镁0.05g，溶于1000mL水，用K2HPO4与KH2PO4将pH值调至6.0～6.5，于121℃条件下灭菌20 min。
本发明经过试验发现，碳源对菌株产IAA的影响由大到小依次为蔗糖＞果糖＞麦芽糖＞蜜糖＞葡萄糖＞玉米粉，当碳源为蔗糖时，IAA产量达到了最高的22.76mg/L，明显高于其他碳源。当碳源为玉米粉时，IAA产量仅有7.85mg/L，当碳源为果糖、麦芽糖、葡萄糖时，IAA产量为分别为16.99mg/L、14.34mg/L、14.13mg/L。故选择的最佳碳源为蔗糖。
氮源对Gxun-20产IAA量由多到少依次为：酵母粉＞蛋白胨＞玉米浆＞硝酸钾＞硫酸铵。对于IAA产量来说，当氮源为酵母粉时，IAA产量达到了最高的68.56mg/L，明显高于其他氮源，当氮源为硝酸钾、硫酸铵等无机氮源时，IAA产量明显少于蛋白胨和酵母粉等有机氮源。玉米浆IAA产量为52.63mg/L，略低于蛋白胨和酵母粉等有机氮源，但是就经济耗材方面来说，玉米浆较蛋白胨和酵母粉这些有机氮源便宜，所以本发明优选玉米浆作为氮源。
本发明在发酵过程分别添加不同的无机盐观察其对Gxun-20菌株产IAA的影响，发现在同等条件下加入氯化钠后，Gxun-20产IAA的量高达58.01mg/L，与其他无机盐（硫酸镁、硝酸钠、氯化钙、硫酸铵、磷酸氢二钾）相比产量较多一些，因此氯化钠最有利于Gxun-20菌株产IAA。
作为本发明植物根际促生菌株Gxun-20在植物促生中应用的进一步改进，所述的蔗糖的质量浓度为0.4%；所述的玉米浆的质量浓度为0.05%；所述的可溶性淀粉的质量浓度为0.05%。
Gxun-20菌株随着蔗糖浓度的升高，IAA产量也逐渐增加，当蔗糖浓度为0.4%（w/v）时，IAA产量最高达到39.74 mg/L。因此，选择的最佳蔗糖浓度为0.4%（w/v）。
随着玉米浆浓度的升高，IAA产量锐减，明显低于0.05%（w/v）达到的产量，所以选择玉米浆最佳浓度为0.05%（w/v）。
可溶性淀粉浓度为0.05%（w/v）时，Gxun-20菌株产IAA量达到53.60mg/L，与产IAA最高浓度相差不大，考虑到经济用材方面，因此选择0.05%（w/v）作为可溶性淀粉最佳浓度。
作为本发明植物根际促生菌株Gxun-20在植物促生中应用的进一步改进，所述的有机肥氮含量为0.7%～0.8%，磷含量为0.45%～0.6%，钾含量为0.4%～0.5%。
同时，本发明还提供所述植物根际促生菌株Gxun-20的筛选方法，包括以下步骤：
（1）取红树林根系土壤样品1g，加入20mL无菌水，在200r/min摇床、30℃下震荡30min后静置5～10min，得到土壤悬浮液；所述的红树林源于广西北海；
（2）取5mL土壤悬浮液于LB液体培养基中富集培养24h，富集后的菌液进行梯度稀释，每个梯度取100μL菌液于ADF固体培养基上涂布，然后于34℃恒温培养箱中培养3d，得到单菌落；
（3）挑取平板上形态大小不同的单菌落，接种于LB固体培养基上进行分离纯化；
（4）将分离纯化后的菌株接种至含有50mg/mL L-色氨酸的LB液体培养基中，于200r/min摇床中30℃下培养24h，然后在无菌环境中，每种菌液取2μL滴加到溶磷培养基上，倒放置于34℃恒温培养箱中培养3d，观察溶磷培养基上的菌体生长情况和溶磷圈大小，出现溶磷圈表示菌株具有溶磷能力，溶磷圈越大溶磷能力越强；
（5）把装有菌液的离心管在12000r/min下离心2min，取上清液100μL于白色透明的96比色空板上，随后滴加100μL的Salkowski比色液，以10mg/L的IAA作对照，加入等量Salkowski比色液反应，将比色板放于38℃恒温培养箱中避光40min后，取出观察，颜色变红表示能够产生IAA，颜色越深表示IAA产量越高；
（6）取溶磷能力强、IAA产量高的菌株，即为植物根际促生菌株，命名为Gxun-20；
所述的Salkowski比色液为0.1mL 0.5mol/L FeCl3与5mL 质量浓度为35%的HClO4混合制备而得。
作为本发明植物根际促生菌株Gxun-20的筛选方法的进一步改进，所述的ADF固体培养基具体组成如下：
组分一：MoO3 10mg、一水硫酸锰11.19mg、七水硫酸镁124.6mg；CuSO4﹒5H2O 78.22 mg；H3BO3 10mg；组分二：七水硫酸亚铁100 mg；
按上述配方称量后，将组分一溶于100mL的蒸馏水中，组分二溶于10mL的蒸馏水中，低温冷藏备用；
分别取0.5mL的组分一和0.2mL的组分二加入烧杯中，再加入以下试剂：MgSO4﹒7H2O0.2g、柠檬酸2.0g、1-氨基环丙烷-1-羧酸2.0g、葡糖酸2.0g、葡萄糖2.0g、KH2PO4 4.0g、Na2HPO4 6.0g，然后加入蒸馏水，调节pH为7.0并定容至1000mL，最后在121℃下灭菌20min，即得到ADF固体培养基。
作为本发明植物根际促生菌株Gxun-20的筛选方法的进一步改进，所述的LB液体培养配方如下：以1000mL计，酵母粉5g、胰蛋白胨10g、NaCl 10g、pH7.0，LB固体培养基为在LB液体培养基基础上加入20g琼脂。
所述的溶磷培养基为：葡萄糖10g、(NH4)2SO4 0.5g；MgSO4﹒7H2O 0.3gz、MnSO4﹒4H2O0.03g、KCl 0.3g、FeSO4﹒7H2O 0.03g、NaCl 0.3g、Ca3(PO4)2 20g、琼脂粉20g，然后加入蒸馏水，调节pH为7.0并定容至1000mL，121℃条件下灭菌20 min。
本发明的有益效果：
1、本发明提供的植物根际促生菌株Gxun-20具有较高的IAA产量，选择玉米浆为氮源，浓度为0.05%(w/v)时，菌株产IAA最高达到65.16 mg/L，对植物促生具有很好的应用效果。
2、本发明通过ADF筛选培养基、LB纯化培养基筛选出具有分泌IAA和溶磷促生能力的菌株，再经过过发酵条件优化，改善发酵培养基的配方与用量，提高植物根际促生菌株Gxun-20产IAA的效率以及IAA产量，降低了发酵成本，提高了发酵效率；最后利用发酵液对农作物进行浇灌，有效提高农作物生长速度。减少了使用化肥对土地的伤害。
生物保藏说明：
植物根际促生菌株Gxun-20，为短芽孢杆菌，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：中国，广州，广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，分类学名称为Brevibacillus parabreivs，保藏编号为GDMCC NO：60686，保藏时间为2019年6月13日。
附图说明
图1为本发明植物根际促生菌株Gxun-20的形态学特征图。
图2为本发明植物根际促生菌株Gxun-20的生理生化指标鉴定结果表。
图3为本发明实施例1中植物根际促生菌株Gxun-20的生长曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一、植物根际促生菌株Gxun-20的筛选
（1）取红树林根系土壤样品1g，分别加入到五个装有20mL无菌水的摇瓶中，贴好标签，放入200r/min摇床30℃下震荡30min，取出后静置5～10min，得到土壤悬浮液；
（2）从这五瓶样品中分别吸取5mL土壤悬浮液于LB液体培养基中富集培养24h，富集后的菌液进行梯度稀释，每个梯度取100μL菌液于ADF固体培养基上涂布，每个涂布三个平行，然后将涂布好的平板放置于34℃恒温培养箱中培养3d，得到单菌落；
（3）挑取平板上形态大小不同的单菌落，接种于LB固体培养基上进行分离纯化；
（4）将分离纯化后的菌株接种至含有50mg/mL L-色氨酸的LB液体培养基中，于200r/min摇床中30℃下培养24h，然后在无菌环境中，每种菌液取2μL滴加到溶磷培养基上，倒放置于34℃恒温培养箱中培养3d，观察溶磷平板上的菌体生长情况和溶磷圈大小，出现溶磷圈表示菌株具有溶磷能力，溶磷圈越大溶磷能力越强；
（5）把装有菌液的离心管在12000 r/min下离心2 min，取上清液100μL于白色透明的96比色空板上，随后滴加100μL的Salkowski比色液（0.1mL 0.5mol/L FeCl3+5mL 35% HClO4），以10mg/L的IAA作对照，加入等量Salkowski比色液反应，将比色板放于38℃恒温培养箱中避光40min后，取出观察，颜色变红表示能够产生IAA，颜色越深表示IAA产量越高；
（6）取IAA产量高、溶磷圈大的菌液对应的菌株，取溶磷能力强、IAA产量高的菌株，即为植物根际促生菌株，命名为Gxun-20；
所述的ADF固体培养基如下：
组分一：MoO3 10mg、一水硫酸锰11.19mg、七水硫酸镁124.6mg；CuSO4﹒5H2O 78.22 mg；H3BO3 10mg；组分二：七水硫酸亚铁100 mg；
按上述配方称量后，将组分一溶于100mL的蒸馏水中，组分二溶于10mL的蒸馏水中，低温冷藏备用；
分别取0.5mL的组分一和0.2mL的组分二加入烧杯中，再加入以下试剂：MgSO4﹒7H2O0.2g、柠檬酸2.0g、1-氨基环丙烷-1-羧酸2.0g、葡糖酸2.0g、葡萄糖2.0g、KH2PO4 4.0g、Na2HPO4 6.0g，然后加入蒸馏水，调节pH为7.0并定容至1000mL，最后在121℃下灭菌20min，即得到ADF固体培养基。
所述的LB液体培养基如下：
以1000mL计，酵母粉5g、胰蛋白胨10g、NaCl 10g、pH7.0，LB固体培养基为在LB液体培养基基础上加入20g琼脂；
所述的溶磷培养基如下：
葡萄糖10g、(NH4)2SO4 0.5g；MgSO4﹒7H2O 0.3gz、MnSO4﹒4H2O 0.03g、KCl 0.3g、FeSO4﹒7H2O 0.03g、NaCl 0.3g、Ca3(PO4)2 20g、琼脂粉20g，然后加入蒸馏水，调节pH为7.0并定容至1000mL，121℃条件下灭菌20 min。
本实施例经过LB培养基分离纯化四代后，得到单菌落，命名为Gxun-20。Gxun-20菌株形态学特征描述为短芽孢杆菌，菌落形态为圆形、平滑、凸起、白色，如图1所示，为革兰氏阳性菌。根据一些特征生理生化指标鉴定，参考《常见细菌鉴定手册》，结果如图2。
二、植物根际促生菌株Gxun-20发酵菌液的制备
（1）取植物根际促生菌株Gxun-20接种于LB液体培养基中，在200r/min的摇床中30℃恒温振荡培养进行活化，每隔2h测定培养液的OD600值，绘制生长曲线，如图3所示；
（2）在灭菌后的R2A液体培养基中加入2mg/L的L-色氨酸，调节初始pH为6.0，然后按照5μL/mL培养基的接种量，将对数生长期的活化后的目的菌株接入，于200r/min摇床中25℃下振荡发酵26h，得到发酵菌液；
所述的R2A液体培养基如下：
葡萄糖0.5g、酵母粉0.5g、酪蛋白氨基酸0.5g、K2HPO4 0.1g、丙酮酸钠0.3g、胰蛋白胨0.5g、可溶性淀粉0.05、L-色氨酸1.5mg、七水硫酸镁0.05g，溶于1000mL水，用K2HPO4与KH2PO4将pH值调至6.0，于121℃条件下灭菌20min；所述的玉米浆的质量浓度为0.05%；所述的可溶性淀粉的质量浓度为0.05%。
三、应用植物根际促生菌株Gxun-20进行植物促生
本实施例处理的作物为玉米。
（1）挑选饱满、无破损、质量良好的玉米种子用50℃温水浸泡10min后倒出，再用无菌水浸泡8h，最后用10％的Na3PO4溶液浸种15min左右以杀死种子表面各种有害菌类；
（2）将浸泡好的种子用清水冲洗干净并控去水分，放置于铺好纸巾的培养皿中，然后喷洒无菌水浸润，最后将其放入暗25℃通风恒温培养箱中，每天喷洒无菌水保持湿润，直至大部分种子露白；
（3）取大棚表层土与木屑、有机肥按1:1:1混合，消毒灭菌制备得到育苗营养土；先用无菌水浇透育苗营养土，再把催好芽的玉米种子接种至育苗营养土里，再盖一层薄的育苗营养土，最后铺盖透明地膜，等到75％的幼苗破土而出时及时揭掉透明地膜，使幼苗顺利进行光合作用；所述的有机肥氮含量为0.7%，磷含量为0.6%，钾含量为0.5%。
（4）当幼苗长出3～4片叶子且生长状态稳定后，采用菌液灌根的方式向每株幼苗浇灌10mL稀释5倍的发酵菌液，每7d浇一次发酵菌液，一共处理4次即可。
本实施例的玉米幼苗株高相比于对照组（浇灌无菌水的植株）平均增加了12.68%。
实施例2
与实施例1相比较，本实施例的不同点在于：
所述的R2A液体培养基优选配方如下：
蔗糖0.4g、玉米浆0.5g、酪蛋白氨基酸0.5g、氯化钠0.1g、丙酮酸钠0.3g、胰蛋白胨0.5g、可溶性淀粉0.5g、L-色氨酸2mg、七水硫酸镁0.05g，溶于1000mL水，用K2HPO4与KH2PO4将pH值调至6.5，于121℃条件下灭菌20 min。所述的蔗糖的质量浓度为0.4%；所述的玉米浆的质量浓度为0.05%；所述的可溶性淀粉的质量浓度为0.05%。
发酵条件为于200r/min摇床中28℃下振荡发酵38h。
本实施例处理的作物为小麦，具体方法如下：
（1）挑选饱满、无破损、质量良好的小麦种子用50℃温水浸泡10min后倒出，再用无菌水浸泡8h，最后用10％的Na3PO4溶液浸种15min左右以杀死种子表面各种有害菌类；
（2）将浸泡好的种子用清水冲洗干净并控去水分，放置于铺好纸巾的培养皿中，然后喷洒无菌水浸润，最后将其放入暗25℃通风恒温培养箱中，每天喷洒无菌水保持湿润，直至大部分种子露白；
（3）取大棚表层土与木屑、有机肥按1:1:1混合，消毒灭菌制备得到育苗营养土；先用无菌水浇透育苗营养土，再把催好芽的玉米种子接种至育苗营养土里，再盖一层薄的育苗营养土，最后铺盖透明地膜，等到75％的幼苗破土而出时及时揭掉透明地膜，使幼苗顺利进行光合作用；所述的有机肥氮含量为0.8%，磷含量为0.5%，钾含量为0.4%。
（4）当幼苗长出3～4片叶子且生长状态稳定后，采用菌液灌根的方式向每株幼苗浇灌10mL稀释5倍的发酵菌液，每7d浇一次发酵菌液，一共处理4次即可。
本实施例的小麦幼苗株高相比于对照组（浇灌无菌水的植株）平均增加了20.74%。
实施例3
与实施例1相比较，本实施例的不同点在于：
所述的R2A液体培养基优选配方如下：
蔗糖0.4g、玉米浆0.5g、酪蛋白氨基酸0.5g、氯化钠0.1g、丙酮酸钠0.3g、胰蛋白胨0.5g、可溶性淀粉0.5g、L-色氨酸2mg、七水硫酸镁0.05g，溶于1000mL水，用K2HPO4与KH2PO4将pH值调至6.2，于121℃条件下灭菌20 min。所述的蔗糖的质量浓度为0.4%；所述的玉米浆的质量浓度为0.05%；所述的可溶性淀粉的质量浓度为0.05%。
发酵条件为于200r/min摇床中28℃下振荡发酵38h。
本实施例处理的作物为辣椒，具体方法如下：
（1）挑选饱满、无破损、质量良好的辣椒种子用50℃温水浸泡10min后倒出，再用无菌水浸泡8h，最后用10％的Na3PO4溶液浸种15min左右以杀死种子表面各种有害菌类；
（2）将浸泡好的种子用清水冲洗干净并控去水分，放置于铺好纸巾的培养皿中，然后喷洒无菌水浸润，最后将其放入暗25℃通风恒温培养箱中，每天喷洒无菌水保持湿润，直至大部分种子露白；
（3）取大棚表层土与木屑、有机肥按1:1:1混合，消毒灭菌制备得到育苗营养土；先用无菌水浇透育苗营养土，再把催好芽的玉米种子接种至育苗营养土里，再盖一层薄的育苗营养土，最后铺盖透明地膜，等到75％的幼苗破土而出时及时揭掉透明地膜，使幼苗顺利进行光合作用；所述的有机肥氮含量为0.7%，磷含量为0.45%，钾含量为0.5%。
（4）当幼苗长出3～4片叶子且生长状态稳定后，采用菌液灌根的方式向每株幼苗浇灌10mL稀释8倍的发酵菌液，每7d浇一次发酵菌液，一共处理4次即可。
本实施例的小麦幼苗株高相比于对照组（浇灌无菌水的植株）平均增加了18.6%。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种植物根际促生菌株Gxun-20，其特征在于：所述的植物根际促生菌株Gxun-20为短芽孢杆菌，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：中国，广州，广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，分类学名称为Brevibacillus parabreivs，保藏编号为GDMCC NO：60686，保藏日期为2019年6月13日。
2.根据权利要求1所述的植物根际促生菌株Gxun-20，其特征在于：菌体革兰氏染色阳性，菌落形态为圆形、平滑、凸起、白色。
3.一种如权利要求1所述的植物根际促生菌株Gxun-20在植物促生中的应用，其特征在于：包括以下步骤：
（1）挑选饱满、无破损、质量良好的种子，首先用50℃温水浸泡10 min后倒出，再用无菌水浸泡8 h，最后用质量浓度为10％的Na3PO4溶液浸种10～15 min；将浸泡好的种子用清水冲洗干净并控去水分，放置于铺好纸巾的培养皿中，然后喷洒无菌水浸润；最后将其放入黑暗、25℃通风恒温培养箱中，每天喷洒无菌水保持湿润，直至大部分种子露白，得到催好芽的种子；
（2）取大棚表层土与木屑、有机肥按1:1:1混合，消毒灭菌制备得到育苗营养土；先用无菌水浇透育苗营养土，再把催好芽的种子接种至育苗营养土里，盖上一层薄的育苗营养土，最后铺盖透明地膜，等到75～80%的幼苗破土而出时及时揭掉透明地膜，使幼苗顺利进行光合作用；
（3）当幼苗长出3～4片叶子且生长状态稳定后，采用菌液灌根的方式向每株幼苗浇灌10mL稀释5～10倍的发酵菌液，每7d浇一次发酵菌液，一共处理4～5次即可。
4.根据权利要求3所述的植物根际促生菌株Gxun-20在植物促生中的应用，其特征在于，所述的发酵菌液的发酵方法，包括以下步骤，
（1）取植物根际促生菌株Gxun-20接种于LB液体培养基中，在200r/min的摇床中30℃恒温振荡培养进行活化，每隔2h测定培养液的OD600值，绘制生长曲线；
（2）在灭菌后的R2A液体培养基中加入2mg/L的L-色氨酸，调节初始pH为6.0～6.5，然后按照5μL/mL培养基的接种量，将对数生长期的活化后的植物根际促生菌株Gxun-20接入，于200r/min摇床中25～30℃下振荡发酵26～40h，得到发酵菌液。
5.根据权利要求4所述的植物根际促生菌株Gxun-20在植物促生中的应用，其特征在于，所述的R2A液体培养基配方如下：
葡萄糖0.5g、酵母粉0.5g、酪蛋白氨基酸0.5g、K2HPO4 0.1～0.4g、丙酮酸钠0.3g、胰蛋白胨0.5g、可溶性淀粉0.05～0.5g、L-色氨酸1.5～2.5mg、七水硫酸镁0.05g，溶于1000mL水，用K2HPO4与KH2PO4将pH值调至6.0～6.5，于121℃条件下灭菌20 min；
或者，所述的R2A液体培养基配方为：
蔗糖0.4g、玉米浆0.5g、酪蛋白氨基酸0.5g、氯化钠0.1g、丙酮酸钠0.3g、胰蛋白胨0.5g、可溶性淀粉0.5g、L-色氨酸2mg、七水硫酸镁0.05g，溶于1000mL水，用K2HPO4与KH2PO4将pH值调至6.0～6.5，于121℃条件下灭菌20 min。
6.根据权利要求5所述的植物根际促生菌株Gxun-20在植物促生中的应用，所述的蔗糖的质量浓度为0.4%；所述的玉米浆的质量浓度为0.05%；所述的可溶性淀粉的质量浓度为0.05%。
7.根据权利要求3所述的植物根际促生菌株Gxun-20在植物促生中的应用，所述的有机肥氮含量为0.7%～0.8%，磷含量为0.45%～0.6%，钾含量为0.4%～0.5%。
8.一种如权利要求1所述的植物根际促生菌株Gxun-20的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取红树林根系土壤样品1g，加入20mL无菌水，在200r/min摇床、30℃下震荡30min后静置5～10min，得到土壤悬浮液；
（2）取5mL土壤悬浮液于LB液体培养基中富集培养24h，富集后的菌液进行梯度稀释，每个梯度取100μL菌液于ADF固体培养基上涂布，然后于34℃恒温培养箱中培养3d，得到单菌落；
（3）挑取平板上形态大小不同的单菌落，接种于LB固体培养基上进行分离纯化；
（4）将分离纯化后的菌株接种至含有50mg/mL L-色氨酸的LB液体培养基中，于200r/min摇床中30℃下培养24h，然后在无菌环境中，每种菌液取2μL滴加到溶磷培养基上，倒放置于34℃恒温培养箱中培养3d，观察溶磷培养基上的菌体生长情况和溶磷圈大小，出现溶磷圈表示菌株具有溶磷能力，溶磷圈越大溶磷能力越强；
（5）把装有菌液的离心管在12000r/min下离心2min，取上清液100μL于白色透明的96比色空板上，随后滴加100μL的Salkowski比色液，以10mg/L的IAA作对照，加入等量Salkowski比色液反应，将比色板放于38℃恒温培养箱中避光40min后，取出观察，颜色变红表示能够产生IAA，颜色越深表示IAA产量越高；
（6）取溶磷能力强、IAA产量高的菌株，即为植物根际促生菌株，命名为Gxun-20；
所述的Salkowski比色液为0.1mL 0.5mol/L FeCl3与5mL 质量浓度为35%的HClO4混合制备而得。
9.根据权利要求8所述的植物根际促生菌株Gxun-20的筛选方法，其特征在于，所述的ADF固体培养基具体组成如下：
组分一：MoO3 10mg、一水硫酸锰11.19mg、七水硫酸镁124.6mg；CuSO4﹒5H2O 78.22 mg；H3BO3 10mg；组分二：七水硫酸亚铁100 mg；
按上述配方称量后，将组分一溶于100mL的蒸馏水中，组分二溶于10mL的蒸馏水中，低温冷藏备用；
分别取0.5mL的组分一和0.2mL的组分二加入烧杯中，再加入以下试剂：MgSO4﹒7H2O0.2g、柠檬酸2.0g、1-氨基环丙烷-1-羧酸2.0g、葡糖酸2.0g、葡萄糖2.0g、KH2PO4 4.0g、Na2HPO4 6.0g，然后加入蒸馏水，调节pH为7.0并定容至1000mL，最后在121℃下灭菌20min，即得到ADF固体培养基。
10.根据权利要求8所述的植物根际促生菌株Gxun-20的筛选方法，其特征在于，所述的LB液体培养配方如下：以1000mL计，酵母粉5g、胰蛋白胨10g、NaCl 10g、pH7.0，LB固体培养基为在LB液体培养基的基础上加入20g琼脂；
所述的溶磷培养基为：葡萄糖10g、(NH4)2SO4 0.5g；MgSO4﹒7H2O 0.3gz、MnSO4﹒4H2O0.03g、KCl 0.3g、FeSO4﹒7H2O 0.03g、NaCl 0.3g、Ca3(PO4)2 20g、琼脂粉20g，然后加入蒸馏水，调节pH为7.0并定容至1000mL，121℃条件下灭菌20 min。
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