CN114196585B - 一株用于防治番茄青枯病的伯克霍尔德菌及其应用 - Google Patents

一株用于防治番茄青枯病的伯克霍尔德菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株用于防治番茄青枯病的伯克霍尔德菌及其应用，属于农业微生物技术领域。本发明伯克霍尔德菌(Burkholderia anthina)MMYH13，其保藏号为：GDMCC No：61895。该菌株极易培养，该菌株在LB、NA、TTC平板上均能生长良好，菌株细胞为短杆状，在TTC平板上培养时菌落易产生较多的胞外多糖；活性高，能够有效抑制青枯菌生长，其发酵液能有效降低番茄青枯病的发病率为番茄青枯病，是一株有潜力的生防菌。

Description

一株用于防治番茄青枯病的伯克霍尔德菌及其应用
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一株用于防治番茄青枯病的伯克霍尔德菌及其应用。
背景技术
番茄青枯病(Tomato bacteria wilt)是由茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum，也称为青枯菌)侵染引起的一种呈世界性分布的毁灭性土传维管束病害。在我国华东、华南、华中及西南地区均有发生，其中华南区发病尤为严重，病害的发生对农业生产构成了巨大的威胁。青枯病可以由土壤或者水体进行传播，且病原青枯菌在无寄主植物时可在土壤中存活数年以上，如何高效实现土传病害的防治极为困难。
青枯菌是属于β-变形菌纲中伯克氏菌目(Burkholderiales)伯克氏菌科(Burkholderiaceae)雷尔氏菌属(Ralstonia)的一种革兰氏阴性细菌，是一个复合种(RSSC)，具有明显的生理分化与遗传多样性，且寄主范围非常广泛，可侵染50多个科的200多种植物，包括番茄、烟草、茄子、马铃薯、香蕉、胡椒等。我国华南地区常年高温、多雨，植物终年生长繁殖，这为青枯病的发生流行创造了十分有利的条件。最新的调查与监测结果表明，目前，就广东地区至少有35种植物发生了青枯病，且病害的发生逐年呈上升趋势，对农业生产造成巨大的经济损失，如何实现作物青枯病绿色高效防控是目前亟待解决的重大问题。
传统的防治土传病害的方法为物理防治(如暴晒)和以药剂熏蒸为主的化学防治，这些方法在短期内可以有效减少根际病原菌的数量，减少病害的发生，但由于物理防治方法的非针对性，在减少病原菌的同时也减少了根际有益菌群的数量及种类，破坏了植物根际微生物群落结构及微生态平衡，从长远来看，不利于植物根际及土壤的可持续发展及病害防控。根际微生物组被誉为作物的“第二基因组”，在维持作物健康中扮演着非常重要角色。利用基于根际有益菌的生物防治，可有效保护植物根际免受病原菌的侵染，同时可有效维持植物根际微生物群落的稳定性，对环境无污染。因此，利用根际有益微生物或其基因产物防治植物病害逐渐成为研究热点及应用研究的重要方向。2021年中国科协也将“如何高效利用农业微生物种质资源？”列为10个工程技术难题之一。此外，目前我国作为专利保护的生防菌资源较少，基于当前的现状，对分离的生防菌进行专利保护对于实现病害的防控具有重要的意义。
发明内容
本发明的首要目的是解决目前土传病害的防治困难的问题，克服现有的防治技术的缺点与不足，提供一株能够防治番茄青枯病的伯克霍尔德菌(Burkholderia anthina)MMYH13，于2021年8月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，其保藏号为：GDMCC No：61895。
本发明菌株MMYH13的16S rDNA序列与Burkholderia anthina(伯克霍尔德菌)的同源性达99.65％，其形态特征与Burkholderia anthina(伯克霍尔德菌)最为相似。革兰氏染色结果为阴性，在LB、NA、TTC等培养基中生长良好，菌株细胞为短杆状，有鞭毛，在TTC平板上培养时菌落易产生较多的胞外多糖。根据16S rDNA序列和形态特征结果，将菌株MMYH13归为伯克霍尔德菌(Burkholderia anthina)。
本发明的第二个目的是提供伯克霍尔德菌MMYH13在防治青枯病中的应用。
优选，是将伯克霍尔德菌的菌液施于种植作物的土壤中。
优选，所述的作物为未被青枯菌侵染的作物，或是已被青枯菌侵染的作物。
优选，所述的作物为青枯病易感病作物；更优选，所述的作物为番茄。
本发明的第三个目的是提供一种生物防治菌剂，其含有权利要求1所述的伯克霍尔德菌MMYH13。
本发明的第四个目的是提供一种培养所述伯克霍尔德菌MMYH13的方法，是将其接种于LB、NA、NB或TTC培养基。
优选地，将所述伯克霍尔德菌MMYH13接种于NB培养基，培养条件为：28-30℃、130-200rpm培养1-2d。
本发明相对于目前番茄青枯病的生物防治现状具有以下优点：本发明提供了一株对青枯菌具有良好拮抗作用的伯克霍尔德菌，且该菌株极易培养，能够有效抑制青枯菌生长，其发酵液能有效降低番茄青枯病的发病率，为番茄青枯病的防治提供了一条新的方法途径。
本发明的Burkholderia anthina MMYH13，于2021年8月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，其保藏号为：GDMCC No：61895。
附图说明
图1为本发明菌株MMYH13在平板上对青枯菌的拮抗效果图片；其中，NB(营养肉汤)为阴性对照，Gm(25μg/mL的庆大霉素)为阳性对照。
图2为本发明菌株MMYH13细胞透射电镜观察图，标尺为5μm。
图3为本发明菌株MMYH13对番茄青枯病的生防效果统计结果图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下面结合实施例对本发明作进一步说明，下述实施例中试验方法如无特殊说明，均为常规试验方法，下述实施例中所述的实验试剂及耗材如无特殊说明，均来自常规生化试剂公司。
实施例1菌株的分离纯化
1、分离培养基
TTC琼脂培养基(TTC固体培养基)：细菌学蛋白胨10.0g、酸水解酪蛋白1.0g、葡萄糖5.0g、2,3,5-氯化三苯基四氮唑0.5g、琼脂粉15.0g，用蒸馏水溶解定容至1L，pH 7.2。配制好后115℃高温蒸汽灭菌20min。
2、实验步骤
(1)样品采集：选择广东省茂名地区番茄青枯病发病严重的田地，去除表层土壤，小心将番茄植株拔出，抖落并收集根际土壤，装入采样袋中带回实验室在室温下自然风干。
(2)土壤梯度稀释液准备，称取10g土壤，加入到事先加有玻璃珠和100mL无菌水的灭菌三角瓶中，于30℃摇床上200rpm震荡培养30min。静置5min后取1mL上清液加入到事先装有9mL灭菌水的试管中，依次进行梯度稀释至10-2-10-7g/mL的土壤悬浮液备用。
(3)细菌分离：分别取100μL稀释好的土壤菌悬液(10-2-10-7g/mL)加入到TTC平板中用一次性塑料涂布棒均匀涂开，每个浓度设置三个重复，涂布完成后将平板倒置放于30℃恒温培养箱中培养。隔天观察平板上菌落的生长情况，挑取菌落形态不一致的单菌落在TTC平板上划线，对菌株进行纯化。
(4)分离结果：总共分离得到184株细菌。
实施例2.分离得到的菌株对青枯菌的平板拮抗试验
1、培养基
NA固体培养基：利用合成培养基营养肉汤配制。
2、实验步骤
2.1平板拮抗试验-初筛
2.1.1菌株的活化
将青枯菌GMI1000和实施例1分离得到的184株细菌分别转接至TTC固体平板和NA固体平板中，于30℃培养1-2d，备用。
2.1.2含菌平板的制备
挑取青枯菌GMI1000菌株单菌落接种到2-5mL NB培养基(不含琼脂的NA培养基)中，30℃200rpm培养24h，制成约1010cfu/mL的菌悬液，吸取1mL菌悬液加入冷却至45℃左右的100mL NA培养基中，待青枯菌摇匀后即可倒板。
2.1.2拮抗菌初筛
分别将前期分离并纯化后的菌株在NA平板上划线活化，用灭菌的竹签挑取活化菌株点接到含菌平板上，每个平板点接8个供试菌株，30℃培养48h，观察抑菌圈的有无，并用螺旋测微尺测量其大小，保存有抑菌圈的菌株用于复筛。
2.2平板拮抗试验-复筛
2.2.1菌株活化
同2.1.1，对初筛有拮抗效果的菌株进行活化。
2.2.2分离菌株的液体发酵
挑取初筛获得的拮抗菌株的单菌落接入100mL NB培养基(置于250mL三角瓶)中，28℃130rpm培养48h即得拮抗菌发酵液。
2.2.3平板涂布法复筛
取100μL青枯菌GMI1000菌株菌悬液均匀涂布于NA固体培养基上，用黄色枪头在平板上打孔，然后取100μL拮抗菌发酵液加入孔中，28℃培养1-3d，观察是否有抑菌圈出现，于超净台中打开盖子拍照记录结果。
2.2.4倾注法复筛
配置100mL/瓶的NA固体培养基，待培养基冷却至45℃左右后，按1％的比例加入1mL青枯菌菌悬液，制作放有牛津杯的双层平板，待平板干燥后，取出牛津杯，取100μL拮抗菌发酵液加入孔中，28℃培养1-3d，观察是否有抑菌圈出现，于超净台中打开盖子拍照记录结果。
3、实验结果
通过初筛试验得到有拮抗效果的细菌28株，通过平板复筛和倾注法复筛得到拮抗效果明显的菌株6株，本发明中的MMYH13就是其中的一株拮抗效果优良的菌株。
图1为菌株MMYH13在平板上对青枯菌GMI1000的拮抗效果图，可以看出有明显的抑菌圈出现，说明菌株MMYH13对青枯菌具有显著的拮抗作用。
实施例3：分离菌株的鉴定
参考《常见细菌***鉴定手册》(东秀珠主编科学出版社)对分离菌株进行鉴定。试验方法如下：通过水煮法提取菌株MMYH13的DNA，利用细菌的16S rDNA特异性引物27F和1492R和Taq酶对MMYH13的16S rDNA基因序列进行扩增，扩增产物经电泳分析产生约1500b左右的条带，切胶回收该条带后送苏州金唯智生物科技有限公司进行sanger测序，测序得到的序列经seqman软件拼接后获得16S rDNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，提交至EzBioClode网站(https://www.ezbiocloud.net/)进行鉴定。鉴定结果为：菌株MMYH13的16S rDNA序列与Burkholderia anthina(伯克霍尔德菌)的同源性达99.65％，其形态特征与Burkholderia anthina(伯克霍尔德菌)最为相似。革兰氏染色结果为阴性，在LB、NA、TTC等培养基中均能生长良好，菌株细胞为短杆状，有鞭毛(图2)，在TTC平板上培养时菌落易产生较多的胞外多糖。根据16S rDNA序列和形态特征结果，将菌株MMYH13归为伯克霍尔德菌(Burkholderia anthina)。
根据鉴定结果，将菌株MMYH13命名为Burkholderia anthina MMYH13，于2021年8月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，其保藏号为：GDMCC No：61895。
实施例4：菌株MMYH13对番茄青枯病的生防效果试验
菌株MMYH13在平板上对青枯菌表现出明显的拮抗作用，为了验证其对番茄青枯病的生防效果，通过温室盆栽试验对菌株MMYH13的发酵液对番茄青枯病的生防效果进行评估。
试验步骤
1.番茄品种“中蔬四号”育苗
1.1种子催芽及播种
将番茄种子37℃水浴2h，75％的酒精中浸泡30s，用去离子水洗两次，用5％NaClO溶液表面消毒15min，然后用去离子水冲洗干净。均匀放在铺有两层纱布的培养皿中，加入适量蒸馏水，保持种子和纱布湿润，置于28℃恒温培养箱中催芽2d。待种子萌发长出1-2mm左右胚根后，将其播种到装有珍珠岩育苗盘中，每穴播种1粒种子，置于温室大棚中培养。
1.2幼苗移栽
将基质土用水拌湿，在花盆(直径9cm)中装一半拌好的基质土，小心将番茄幼苗从育苗盘中取出，放入花盆中，再加入一半基质土，用手指轻轻按压使植株稳固，浇水，含水量控制在30％左右，在温室大棚中培养约28d左右后备用。
2、青枯菌及接抗菌MMYH13活化及发酵液制备
同实施例1中2.1.1的方法活化青枯菌GMI1000和拮抗菌MMYH13，然后挑取单菌落分别接入装有TM液体培养基(不含TTC和琼脂的TTC培养基)和NB培养基(不含琼脂的NA培养基)的三角瓶中，于28℃恒温摇床上200rpm震荡培养2d(OD600＝2.5)。
3、青枯菌和接抗菌发酵液接种番茄植株
本试验设置7个处理，分别为(1)不加任何菌的无菌水的空白对照，(2)TM液体培养基的阴性对照，(3)只接种青枯菌发酵液的阳性对照，(4)只接种拮抗菌MMYH13发酵液的对照，(5)拮抗菌MMYH13和青枯菌以体积比为1：1混合接种的处理；(6)拮抗菌MMYH13和青枯菌以体积比为3：1混合接种的处理，(7)拮抗菌MMYH13和青枯菌以体积比为5：1混合接种的处理。每个处理接种五个重复，每个重复为10株幼苗。菌液接种量为每盆5mL，采用菌液灌根的方法进行接种，接种完成后置于玻璃温室中培养14d(温度28℃，湿度40％)，接种后第二天开始每天浇水1次。如Kempe发表的论文所述，每天观察并记录番茄幼苗的病害严重程度，按以下公式计算各处理的发病率。
植株发病率＝(发病株数/总株数)×100％
4、试验结果
如图3所示，经接种处理后，无菌水空白对照、TM液体培养基阴性对照和只接种拮抗菌的处理的番茄发病率均为0；只接种青枯菌GMI1000发酵液的番茄全部枯萎死亡，发病率为100％；同时接种拮抗菌MMYH13发酵液和青枯菌GMI1000发酵液的处理组(1:1、3:1和5:1)番茄的发病率均值分别为52％、30％、18％，由此可见，本发明中拮抗菌MMYH13发酵液处理能有效降低番茄青枯病的发病率，是一株有潜力的生防菌。

Claims (7)

1.一株伯克霍尔德菌(Burkholderia anthina)MMYH13，其特征在于，其保藏号为：GDMCC No：61895。
2.权利要求1所述的伯克霍尔德菌MMYH13在防治青枯病中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的伯克霍尔德菌MMYH13是在防治番茄感染青枯病中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，是将所述伯克霍尔德菌MMYH13的菌液施加于种植作物的土壤中。
5.一种生物防治菌剂，其特征在于，其含有权利要求1所述的伯克霍尔德菌MMYH13。
6.一种培养权利要求1所述伯克霍尔德菌MMYH13的方法，其特征在于，将其接种于LB、NA、NB或TTC培养基。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述伯克霍尔德菌MMYH13接种于NB培养基，培养条件为：28-30℃、130-200rpm培养1-2d。
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