CN113943660A - 一株用于防控连作土传枯萎病的篮状菌属真菌njau-l8及其应用 - Google Patents

一株用于防控连作土传枯萎病的篮状菌属真菌njau-l8及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株用于防控连作土传枯萎病的篮状菌属真菌NJAU‑L8及其应用。所述菌种保藏编号为CGMCC No.21476，所述菌株的应用为降低西瓜和香蕉枯萎病种植土壤病原菌的数量、促进植株生长和降低发病率。本发明证明从轮作菠萝根际分离获得的菌株NJAU‑L8可有效降低尖孢镰刀菌在多种作物根际的定殖，并表明其在实际生产中具有防控枯萎病的潜力。

Description

一株用于防控连作土传枯萎病的篮状菌属真菌NJAU-L8及其 应用
技术领域
本发明属于生物防控技术领域，具体涉及一株用于防控香蕉和西瓜等作物枯萎病的Talaromyces pinophilus NJAU-L8及其应用。
背景技术
土传枯萎病是由尖孢镰刀菌引起的一种世界性土传病害，该病害在整个生长期均可发生，同属尖孢镰刀菌的不同专化型病原菌可引起不同作物的枯萎病。由尖孢镰刀菌西瓜专化型侵染所引起的、发生在西瓜上的枯萎病以及由尖孢镰刀菌古巴专化型侵染所引起的，发生在香蕉上的枯萎病已经成为西瓜、香蕉等种植产业危害最为严重，造成经济损失最大的病害之一。由于尖孢镰刀菌能在土壤中长期存活，一旦侵染，能在土壤中不断富集，很难再将其从土壤中去除，因此该病害发病率呈逐年上升态势，目前我国受土传枯萎病影响的西瓜、香蕉等种植区达80％以上，其中严重的地区发病率达85％甚至绝收。
对于枯萎病的防治方法大部分都是依靠改变土壤理化性质、影响土壤中微生物群落结构达成。由于化学杀菌剂的多种限制条件，应在未来减少化学杀菌剂的使用，而轮作模式虽然能够明显抑制枯萎病的发病率，但由于其较为高昂的经济代价，因此该方法的推广上存在较大阻碍。目前国内外对枯萎病的生防菌研究大多为细菌，在真菌方面较少涉及，但在本实验室之前的研究中发现，真菌同样具有优秀的抗病能力。因此，本研究尝试从具备抑病能力的轮作作物根际分离筛选出一种能够有效抑制尖孢镰刀菌生长繁殖的生防真菌，并对其抑病特征进行测定，此真菌应具有优秀的拮抗尖孢镰刀菌的能力，且能够适应自然条件在田间植物根际有效定殖。
发明内容
本发明目的在于有效遏制西瓜和香蕉等作物长期连作后枯萎病发病率高的现象，筛选出一株篮状菌属真菌NJAU-L8，为降低土传枯萎病发病率提供技术支持及应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现:
一种具有拮抗尖孢镰刀菌能力的Talaromyces pinophilus NJAU-L8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年3月31日，保藏编号为CGMCC No.21476。
由本发明所述的Talaromyces pinophilus NJAU-L8制备的菌剂。
作为本发明的一种优选，所述的菌剂通过以下方法制备得到：取活化后的NJAU-L8加入PDB培养基中于28℃的摇床中培养4-5天即得所述的菌剂。
本发明所述的Talaromyces pinophilus NJAU-L8在防治尖孢镰刀菌中的应用。
作为本发明的一种优选，所述的Talaromyces pinophilus NJAU-L8在防治西瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌西瓜专化型Fon中的应用。
作为本发明的另一种优选，所述的Talaromyces pinophilus NJAU-L8在防治香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号生理小种Foc4中的应用。
本发明所述的菌剂在防治尖孢镰刀菌中的应用。
作为本发明的一种优选，所述的菌剂在防治西瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌西瓜专化型Fon或香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号生理小种Foc4中的应用。
本发明所述的Talaromyces pinophilus NJAU-L8或本发明所述的菌剂在促进西瓜或香蕉生长中的应用。
本发明所述的Talaromyces pinophilus NJAU-L8或本发明所述的菌剂在防治西瓜或香蕉枯萎病中的应用。
有益效果
本发明提供一株用于防控土传枯萎病的篮状菌。使用NJAU-L8发酵液能够有效降低香蕉和西瓜种植土体土壤和根际土壤中病原菌尖孢镰刀菌的数量，一周后，与未接种对照根际和土体中尖孢镰刀菌的数量相比，接种NJAU-L8发酵液处理的土壤中病原菌的数量显著降低，可见NJAU-L8对香蕉和西瓜土传枯萎病有抑制效果，且NJAU-L8在一定程度上对西瓜和香蕉植株还具有促生效果。
本发明涉及的NJAU-L8，筛于轮作菠萝根际土壤。将NJAU-L8于28度培养箱恒温培养十天后观察，其直径为9cm，形状为圆形，边缘完整，正面中间部分为墨绿色褶皱状突起，边缘为黄白色，反面中间部分为黄褐色，边缘为黄白色，表面粗糙无光泽，菌落干燥扁平且不透明。NJAU-L8碳氮源利用情况见图2.通过相关实验可知，该菌可有效拮抗尖孢镰刀菌，且不会对土壤中其他有益菌造成不利影响，对人体亦无害，将其施入土壤后，可以减少尖孢镰刀菌的数量，从而达到降低作物的发病率的效果。
附图说明
图1功能菌NJAU-L8 ITS序列构建的***发育树；
图2为NJAU-L8与西瓜枯萎病病原菌平板拮抗结果；
图3为NJAU-L8与香蕉枯萎病病原菌平板拮抗结果；
图4为NJAU-L8对西瓜的促生效果：
图5为NJAU-L8对香蕉的促生效果：
图6为NJAU-L8对西瓜枯萎病病原菌数量的抑制效果；
图7为NJAU-L8对香蕉枯萎病病原菌数量的抑制效果；
生物材料保藏证明
NJAU-L8，分类命名为Talaromyces pinophilus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年3月31日，保藏编号为CGMCC No.21476。
具体实施方式
实施例1抑尖孢镰刀菌真菌的分离与筛选
试验流程
1.供试材料：
供试病原菌：香蕉枯萎病致病菌尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense tropical race 4,Foc4)由江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室分离和保存。
供试土壤：海南乐东县尖峰镇高病蕉园土壤。
供试培养基：PDA培养基(g/L)：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂18.0g，pH自然；NA培养基(g/L)：NaCl 5.0g，牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，pH 7.0-7.2。
主要试剂和仪器设备：Premix Taq(TaKaRa Taq Version 2.0)试剂盒，真菌基因组DNA小量纯化试剂盒、基因扩增仪、立式振荡培养箱，紫外可见分光光度计。
2.菌株的分离：
将所采集的菠萝根际土壤样品处理后，称取10g土样，加入1L无菌水混合，180r/min震荡30分钟，保持温度在25℃，将土悬液震荡充分后将浓度稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/L并混合均匀。用灭过菌的移液枪吸取1mL液体加入配置好的50℃PDA培养基中，摇匀后放入28℃的培养箱中培养3-5天，之后分别挑取其中不同类型的菌落至新的PDA平板上纯化。
3.拮抗菌初筛：
将西瓜和香蕉枯萎病病原菌进行活化培养，用直径6mm的打孔器在活化后的病原菌菌落边缘取菌碟，接种在新的PDA平板中央，置于28℃培养箱1天。取出从土悬液中分离得到的菌种，均匀接种于病原菌菌块四周，置于28℃培养箱恒温培养大约5天，观察各菌落与香蕉枯萎病病原菌Foc4的拮抗效果，挑选其中抑制效果较强的菌落，划线接入试管斜面并保存。
4拮抗菌复筛：
复筛采用平板对峙法将保存的病原菌活化培养，用直径6mm的打孔器在菌落边缘取病原菌块，接种于新的PDA培养基中央，用灭过菌的接种环挑取活化后的拮抗菌单菌落点在致病菌2cm处，以相同条件下不接种拮抗菌的PDA平板作为对照，设置三个重复，全部置于28℃培养箱中培养5天，观察各拮抗菌对尖孢镰刀菌的抑制情况，选取其中抑病效果最好的拮抗菌种，将其命名为NJAU-L8，于-20℃冰箱冷冻保存待用。
实施例2功能菌NJAU-L8的鉴定
菌株NJAU-L8在PDA培养基上培养96小时。该菌落生长速度较快，边缘菌丝稀疏，中间浓密，菌落为黄白色，菌丝疏松呈紧密绒毛状，孢子为淡黄色，边缘不整齐，不透明，与培养基连接紧密不易被挑取；ITS序列构建的发育树比对分析结果表明，菌株NJAU-L8与Talaromyces pinophilus同源性最高，与Talaromyces sp.DYM25同源性最远，结合ITS序列构建的发育树比对分析结果和生理生化性状，将菌株NJAU-L8鉴定为篮状菌属真菌(Talaromyces sp.)(图1)。该菌株对作物无害，对人和动物无致病性。
实施例3功能菌NJAU-L8与西瓜枯萎病病原菌的平板拮抗
将菌株NJAU-L8及西瓜枯萎病病原菌同时接种到PDA培养基中，在28℃恒温培养箱中培养4天。待两株菌长好后，与同条件下只接种病原菌的PDA平板相比较，观察发现该菌株在PDA培养基上能够明显的抑制尖孢镰刀菌西瓜专化型Fon的生长。结果表明，功能菌NJAU-L8对西瓜枯萎病病原菌具有抑制作用(图2)。
实施例4功能菌NJAU-L8与香蕉枯萎病病原菌的平板拮抗
将菌株NJAU-L8及香蕉枯萎病病原菌同时接种到PDA培养基中，在28℃恒温培养箱中培养4天。待两株菌长好后，与同条件下只接种病原菌的PDA平板相比较，观察发现该菌株在PDA培养基上能够明显的抑制尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号生理小种Foc4的生长。结果表明，功能菌NJAU-L8对香蕉枯萎病病原菌具有抑制作用(图3)。
实施例5菌株NJAU-L8对西瓜枯萎病病原菌的抑制
1.1供试材料
供试西瓜品种为早佳8424，供试菌种分别为抗病菌NJAU-L8(Talaromyces sp.)，西瓜枯萎病病原菌致病菌尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum,Fon)。
1.2供试试剂：PDB培养基(g/L)：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，pH自然；K2培养基(g/L)：(1)磷酸氢二钾1.0g，氯化钾0.5g，硫酸镁0.5g，EDTA铁钠盐0.01g，D-半乳糖20g，L-天门冬酰胺2g，琼脂20g，(2)抗生素：硼酸钠，五氯硝基苯(PCNB)，牛胆汁，硫酸链霉素，用磷酸微调pH，先配置(1)部分并进行灭菌处理，待(1)部分温度降至45度左右加入(2)部分，摇匀后倒K2平板。
1.3供试组培苗：西瓜种子先以60℃的温水浸泡，搅拌至室温后，取沉淀种子以5％次氯酸钠消毒处理3min，再以无菌水清洗3-4次，并于30℃培养箱中遮光催芽至露白后分别埋入一定含水量的基质中，分别长至两叶一心后移栽入盆栽。
1.4供试菌培养：配置300mL的PDB培养基，向锥形瓶中加入20颗玻璃珠来保证菌液的浓度，将PDB培养基进行灭菌处理。使用灭菌后的牙签，分别挑取活化后的NJAU-L8和Fon菌块加入PDB培养基中，将培养基置于28℃的摇床中培养4-5天，用血球计数板计算培养基中NJAU-L8和Fon的孢子数量。
1.5供试土壤：供试土壤由普通育苗基质和采集至南京市蔬菜科学研究所的草地土土壤按重量1:1混合而成。
2.试验设置：
盆栽实验地点位于江苏省南京市南京农业大学的温室大棚，试验时间为2021.3.18-2021.5.15，试验中保证试验组的充足光照和热量，控制浇水的频率模拟环境降水。试验使用西瓜测试功能菌的促生和抑制土传病原菌的效果，每种作物设置两个处理，分别为接菌处理和不接菌对照组。具体设置如下，西瓜：加入西瓜枯萎病病原菌和抗病菌NJAU-L8(L8)和只加入西瓜枯萎病病原菌(CK)。每个处理10个重复，每个盆钵装500g混合土壤。西瓜苗移栽入花盆后，等待7天让作物根系固着在土壤中并发育出新生根系后，将培养的NJAU-L8菌液离心后使用无菌水重悬，保证菌液中孢子的浓度在105个/ml及以上。把重悬过的菌液加入西瓜L8处理组，每个盆钵中加入菌液50mL，生长10d后，处理和对照分别取3盆西瓜进行生物量的测定，同时，将培养的Fon菌液用血球计数板计算培养基中病原菌的孢子数量，然后将病原菌菌液行离心后用无菌水重悬，保证重悬后的菌浓度在105个/ml及以上，将重悬后的菌液分别加入西瓜的处理和对照中，每个重复加入菌液50ml，再次让西瓜植株分别生长10d后，处理和对照分别取3盆西瓜进行生物量的测定。
3.植物生物量的测定
对加入功能菌后的处理和对照西瓜植株样品进行生物量的测定，结果如图4、表1所示，从地上部株高、茎粗以及鲜重上看，接种NJAU-L8菌液处理的西瓜植株各项指标优于未接种功能菌对照中的西瓜植株，且L8处理各重复间各生物量指标差异较小，CK中各重复的长势存在较大差异，其中L8处理中西瓜的鲜重显著高于对照；从地下部根的鲜重上看，接种NJAU-L8菌液的处理与未接种对照间的地下部根鲜重未有明显差异，但处理组西瓜的根长优于对照组。综上所述，相对于对照，接种NJAU-L8菌液对盆栽西瓜植株体现出优异的促生效果。
表1、西瓜促生育苗试验生物量情况
Figure BDA0003293906210000061
注：CK，未接菌空白对照。表中数据表示平均值±标准偏差。
4.根际可培养病原菌数量的测定：
每个处理取三个重复，从没有植物根系生长的周围取适量土壤，剔除蛭石和植物残根等杂质，搅拌均匀，保留作为土体土；将植物根系整个挖出，抖落根上残留的土壤，作为土体土；将植物根保留，称取3g植物根于装有27ml灭菌水的组培瓶中，放入170r/min的摇床震荡20min，将震荡后的悬液离心，倒掉上清，沉淀的土壤作为根际土壤。植物根际土壤中的病原菌数量使用稀释涂布平板法来测定。从根际土壤以及土体土壤中各称取2g置于50mL离心管中，加入18ml无菌去离子水，放入180r/min的摇床震荡30min，此溶液为10-1土悬液，吸取100微升摇匀后的土壤悬浮液加入900微升的无菌去离子水中，制成10-2次方的土悬液，摇匀，同理依次稀释制备10-3土壤悬浮液，将其摇匀，用微量移液枪分别吸取所制土悬液100微升，加入K2培养皿，用玻璃棒涂布均匀，每个处理重复两次，将涂布完成的培养基放入28℃培养箱培养3-5d，观察记录每个重复中可培养镰刀菌总菌落数。
结果如图6所示，处理和对照间土体土壤中可培养镰刀菌属真菌的数量不具有显著性差异，但接种菌株NJAU-L8的处理L8中病原菌的数量要低于对照；处理和对照间根际土壤中镰刀菌属真菌的数量具有显著性差异，接种菌株NJAU-L8的处理中根际镰刀菌属真菌的数量要显著低于对照。
实施例6菌株NJAU-L8对香蕉枯萎病病原菌数量的抑制
试验流程
1.1供试材料
供试香蕉由广东省农业科学院果树研究所提供，品种为巴西蕉，供试菌种分别为抗病菌NJAU-L8(Talaromyces sp.)，以及香蕉枯萎病致病菌尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense tropical race 4,Foc4)。
1.2供试试剂：PDB培养基(g/L)：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，pH自然；K2培养基(g/L)[23]：(1)磷酸氢二钾1.0g，氯化钾0.5g，硫酸镁0.5g，EDTA铁钠盐0.01g，D-半乳糖20g，L-天门冬酰胺2g，琼脂20g，(2)抗生素：硼酸钠，五氯硝基苯(PCNB)，牛胆汁，硫酸链霉素，用磷酸微调pH，先配置(1)部分并进行灭菌处理，待(1)部分温度降至45度左右加入(2)部分，摇匀后倒K2平板。
1.3供试组培苗：取4-5片叶、株高13-15cm的香蕉幼苗，将其移栽入花盆中。
1.4供试菌培养：配置300mL的PDB培养基，向锥形瓶中加入20颗玻璃珠来保证菌液的浓度，将PDB培养基进行灭菌处理。使用灭菌后的牙签，分别挑取活化后的NJAU-L8和Foc4菌块加入PDB培养基中，将培养基置于28℃的摇床中培养4-5天，用血球计数板计算培养基中NJAU-L8和Foc4的孢子数量。
1.5供试土壤：供试土壤由普通育苗基质和采集至南京市蔬菜科学研究所的草地土土壤按重量1:1混合而成。
2.试验设置：
盆栽实验地点位于江苏省南京市南京农业大学的温室大棚，试验时间为2021.3.18-2021.5.15，试验中保证试验组的充足光照和热量，控制浇水的频率模拟环境降水。
试验使用香蕉试功能菌的促生和抑制土传病原菌的效果，每种作物设置两个处理，分别为接菌处理和不接菌对照组。具体设置如下，香蕉：加入香蕉枯萎病病原菌和抗病菌NJAU-L8(L8)和只加入香蕉枯萎病病原菌(CK)。每个处理10次重复，每个盆钵装500g混合土壤。香蕉苗移栽入花盆后，等待7天让作物根系固着在土壤中并发育出新生根系后，将培养的NJAU-L8菌液离心后使用无菌水重悬，保证菌液中孢子的浓度在105个/ml及以上。把重悬过的菌液加入香蕉L8处理组，每个盆钵中加入菌液50mL，生长10d后，处理和对照分别取3盆香蕉进行生物量的测定，同时，将培养的Foc4菌液用血球计数板计算培养基中病原菌的孢子数量，然后将病原菌菌液离心后用无菌水重悬，保证重悬后的菌浓度在105个/ml及以上，将重悬后的菌液加入香蕉的处理和对照中，每个重复加入菌液50ml，再次让香蕉植株分别生长10d后，处理和对照分别取3盆香蕉进行生物量的测定。
3.植物生物量的测定
从地上部株高、茎粗以及地上部鲜重上看(如图5、表2所示)，接种NJAU-L8菌液的处理的香蕉植株指标明显优于未接种功能菌对照中的香蕉植株，且L8处理各重复间的生物量指标差异较小，CK对照各重复的长势存在较大差异；从地上部鲜重看，接种NJAU-L8菌液处理的香蕉的鲜重显著高于对照；从地下部根的重量上看，接种NJAU-L8菌液处理的香蕉植株略弱于CK对照，从地下部根的长度上看，接种NJAU-L8菌液的处理与未接种对照间的地下部根的长度未有明显差异，但L8处理各重复间的各生物量指标差异较小，CK对照各重复长势存在较大差异。综上所述，相对于对照，接种NJAU-L8菌液能促进香蕉植株生长。
表2、香蕉促生育苗试验生物量情况
Figure BDA0003293906210000081
注：CK，未接菌空白对照。表中数据表示平均值±标准偏差。
4.根际可培养病原菌数量的测定：
每个处理取三个重复，从没有植物根系生长的周围挖取适量土壤，剔除蛭石和植物残根等杂质，搅拌均匀，保留作为土体土；将植物根系整个挖出，抖落根上残留的土壤，将植物根保留待制备根际土壤。植物根际土壤中的病原菌数量使用稀释涂布平板法来测定。从根际土壤以及土体土壤中各称取2g置于50mL离心管中，加入18ml无菌去离子水，放入180r/min的摇床震荡30min，此溶液为10-1土悬液，吸取100微升摇匀后的土壤悬浮液加入900微升的无菌去离子水中，制成10-2次方的土悬液，摇匀，同理依次稀释制备10-3土壤悬浮液，将其摇匀，用微量移液枪分别吸取所制土悬液100微升，加入K2培养皿，用玻璃棒涂布均匀，每个处理重复两次，将涂布完成的培养基放入28℃培养箱培养3-5d，观察记录每个重复中尖孢镰刀菌的总菌落数。
结果如图7所示，处理和对照间土体土土壤中镰刀菌属真菌的数量不具有显著性差异，但接种菌株NJAU-L8的处理L8中病原菌的数量要低于对照；处理和对照间根际土壤中镰刀菌属真菌的数量具有显著性差异，接种菌株NJAU-L8的处理L8根际镰刀菌属真菌的数量要显著低于对照。
结果与分析
综合西瓜和香蕉的盆栽试验可知，相对于CK未接种功能菌，接种功能菌NJAU-L8能够在具有病原菌的情况下，促进西瓜和香蕉植株苗期的生长，并减少土壤中可培养镰刀菌的数量，体现出优异的促生及抗病能力。

Claims (10)

1.一种具有拮抗尖孢镰刀菌能力的Talaromyces pinophilus NJAU-L8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年3月31日，保藏编号为CGMCCNo.21476。
2.由权利要求1所述的NJAU-L8制备的菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于所述的菌剂通过以下方法制备得到：取活化后的NJAU-L8加入PDB培养基中于28℃的摇床中培养4-5天即得所述的菌剂。
4.权利要求1所述的Talaromyces pinophilus NJAU-L8在防治尖孢镰刀菌中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的Talaromyces pinophilus NJAU-L8在防治西瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌西瓜专化型Fon中的应用。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的Talaromyces pinophilus NJAU-L8在防治香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号生理小种Foc4中的应用。
7.权利要求2所述的菌剂在防治尖孢镰刀菌中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的菌剂在防治西瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌西瓜专化型Fon或香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号生理小种Foc4中的应用。
9.权利要求1所述的Talaromyces pinophilus NJAU-L8或权利要求2所述的菌剂在促进西瓜或香蕉生长中的应用。
10.权利要求1所述的Talaromyces pinophilus NJAU-L8或权利要求2所述的菌剂在防治西瓜或香蕉枯萎病中的应用。
CN202111174497.5A 2021-10-08 2021-10-08 一株用于防控连作土传枯萎病的篮状菌属真菌njau-l8及其应用 Active CN113943660B (zh)

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