CN102851243A - 一株多粘类芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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CN102851243A
CN102851243A CN2012103302555A CN201210330255A CN102851243A CN 102851243 A CN102851243 A CN 102851243A CN 2012103302555 A CN2012103302555 A CN 2012103302555A CN 201210330255 A CN201210330255 A CN 201210330255A CN 102851243 A CN102851243 A CN 102851243A
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paenibacillus polymyxa
jzb120001
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刘伟成
卢彩鸽
刘霆
董丹
张涛涛
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刘德文
张殿朋
裘季燕
赵爽
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Abstract

本发明公开了一株多粘类芽孢杆菌及其应用。本发明所提供的多粘类芽孢杆菌是多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的藏编号为CGMCC No.5563。该菌株经过发酵后产生具有强烈抑菌作用的活性代谢产物，该菌株及其活性代谢产物可用于制备广谱性抑制病原真菌和病原细菌的生防制剂，用于防治植物真菌病害。

Description

一株多粘类芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株多粘类芽孢杆菌及其应用，特别涉及该株多粘类芽孢杆菌及其在抑制病原真菌、病原细菌和防治植物真菌病害中的应用。
背景技术
多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa(Prazmonski)Ash,Priest&Collins)是一种产芽孢的***，为类芽孢杆菌属的模式种，1993年之前分类上归为芽孢杆菌属，拉丁名为Bacillus polymyxa(Prazmonski)Macé。多粘类芽孢杆菌对植物具有非致病性，同时具有防病作用和促生作用，作为生防菌广泛应用在农业生产中。研究表明多粘类芽孢杆菌有从土壤向植物根部移动定殖的能力，并能产生肽类和蛋白质类，以及核苷类、吡嗪类和酚类等多种抗菌物质，可防治多种植物病害。多粘类芽孢杆菌产生的肽类抗菌物质按作用效果不同可分为两类，一类是只对细菌（包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌）有抑制作用的抗菌物质，这类肽类抗生素包括多粘菌素、粘菌素、环杆菌素、多肽菌素、Paenibacillin、Gavaserin和Saltavidin。而另一类是对真菌和***均有活性的抗菌物质，包括乔利肽菌素、谷缬菌素、杀镰孢菌素等。多粘类芽孢杆菌产生的抗菌蛋白主要为水解酶类，这些蛋白类抗菌物质通常只能给出分子量及部分性质，分子量从10KDa到37KDa不等，立体结构及氨基酸一级结构还需进一步研究。多粘类芽孢杆菌的核苷类抗菌活性物质主要为多氧霉素（Polyxin）此外，多粘类芽孢杆菌能通过固氮和溶磷作用为宿主植物提供养料，促进植株生长，提高植物的抗病原微生物效果。多粘类芽孢杆菌作用范围广，对植物病原细菌、病原真菌、根结线虫（Khan Z,Kim S G，Jeon YH,et al.,2008，A plant growth promotingrhizobacterium,Paenibacillus polymyxa strainGBR-1,suppresses root-knot nematode,Bioresource Technology，99(8):3016-3023）等多种有害生物均有抑制作用。其作用机理多样，既可产生抗菌活性物质，又有可以菌体直接起作用，还能与植物互作而增强植物抗病性。
综上所述，多粘类芽孢杆菌能分泌多种胞外抗菌物质，对多种植物病原物有抑制活性，是一种很好的生防菌。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株新的多粘类芽孢杆菌，该菌株经过发酵后产生具有强烈抑菌作用的活性代谢产物，该菌株及其活性代谢产物可用于制备广谱性抑制病原真菌和病原细菌的生防制剂，用于防治植物真菌和细菌病害。
本发明所提供的多粘类芽孢杆菌，是多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001，已于2011年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏登记号为CGMCC No.5563。
本发明的另一个目的是提供一种生防制剂。
该生防制剂的活性成分为所述多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563的代谢产物，或/和所述多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563。
所述代谢产物可从除去多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001CGMCC No.5563菌体的发酵滤液中获得。
在本发明中，所述生防制剂具体为如下两种：
生防制剂1：菌体与代谢产物混合制剂，即所述多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563的发酵液，或所述多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563的发酵液和草炭的混合物。
生防制剂2：代谢产物制剂，即所述多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563的无菌发酵滤液。
在本发明的一个实施例中，所述生防制剂具体按照如下如下A）或B）的方法获得：
A）将所述多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563活化培养后取2－3环接种到装液量为摇瓶1/10体积的NB培养基中。28℃，26mm振幅，170r/min振荡培养48h，收集发酵液。收集发酵液后可根据需要将所述发酵液与草炭按照体积比1：1的比例混合，得到混合物。所述发酵液或所述混合物即为所述生防制剂1。
B）将所述多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563活化培养后取2－3环接种到装液量为摇瓶1/10体积的NB培养基中。28℃，26mm振幅，170r/min振荡培养48h，室温离心，取上清并过滤灭菌，得到所述多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563的无菌发酵滤液，即为所述生防制剂2。
所述NB培养基的pH为7.0-7.2，溶质为葡萄糖、蛋白胨和牛肉膏，溶剂为水；所述葡萄糖、所述蛋白胨和所述牛肉膏在所述NB培养基中的终浓度依次为0.5g/100ml、0.5g/100ml、0.3g/100ml。
所述生防制剂为下述1）-4）中任一的生防制剂：
1）用于防治植物真菌病害的生防制剂；
2）用于防治植物细菌病害的生防制剂；
3）用于抑制病原真菌的生防制剂；
4）用于抑制病原细菌的生防制剂。
所述多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563在制备下述1）-4）中任一生防制剂中的应用也属于本发明的保护范围：
1）用于防治植物真菌病害的生防制剂；
2）用于防治植物细菌病害的生防制剂；
3）用于抑制病原真菌的生防制剂；
4）用于抑制病原细菌的生防制剂。
在上述生防制剂和生防制剂的应用中，所述病原真菌具体可为下述真菌中至少一种：苹果轮纹病菌（Botryosphaeria berengeriana f.sp piricela）、棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）、桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）、禾谷丝核菌(小麦纹枯病菌)（Rhizoctonia cerealis）、百合基腐病菌（Fusarium oxysporum f.sp.lilii)和甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans）；
所述病原细菌具体可为下述细菌中至少一种：黄瓜角斑病菌（Pseudomonassyringae pv.lachrymans）和根癌土壤杆菌（桃冠瘿病菌）（Agrobacteriumtumefaciens）。
在本发明的一个实施例中，所述植物真菌病害具体为枯萎病，更加具体的，所述枯萎病具体为由尖镰孢粘团专化型（Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans），即上述甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans）所引起的十字花科枯萎病。所述植物为甘蓝；所述甘蓝的具体品种为中甘21。
所述多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563，或所述生防制剂在如下a）或b）中应用也属于本发明的保护范围：
a）促进植物生长；所述促进植物生长体现在促进根系扩展和/或提高植株鲜重和/或提高植株干重上；所述植物具体可为甘蓝，如中甘21。
b）制备微生物肥料。
本发明的再一个目的是提供一种含有所述多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563，或所述生防制剂的微生物肥料。
通常情况下，所述微生物肥料为含有所述多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563发酵液的肥料。
所述生防制剂的制备方法也属于本发明的保护范围。该方法包括如下步骤：将所述多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polxmyxa）JZB120001 CGMCC No.5563的代谢产物，或/和所述多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563作为活性成分，得到所述生防制剂。
所述代谢产物可从除去多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001CGMCC No.5563菌体的发酵滤液中获得。
在本发明的一个实施例中，所述生防制剂具体按照如下如下A）或B）的方法获得：
A）将所述多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563活化培养后取2－3环接种到装液量为摇瓶1/10体积的NB培养基中。28℃，26mm振幅，170r/min振荡培养48h，收集发酵液。收集发酵液后可根据需要将所述发酵液与草炭按照体积比1：1的比例混合，得到混合物。所述发酵液或所述混合物即为所述生防制剂1。
B）将所述多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563活化培养后取2－3环接种到装液量为摇瓶1/10体积的NB培养基中。28℃，26mm振幅，170r/min振荡培养48h，室温离心，取上清并过滤灭菌，得到所述多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563的无菌发酵滤液，即为所述生防制剂2。
所述NB培养基的pH为7.0-7.2，溶质为葡萄糖、蛋白胨和牛肉膏，溶剂为水；所述葡萄糖、所述蛋白胨和所述牛肉膏在所述NB培养基中的终浓度依次为0.5g/100ml、0.5g/100ml、0.3g/100ml。
本发明所提供的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCCNo.5563具有如下优点：
1、本发明所提供的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCCNo.5563及其无菌发酵滤液具有明显的抗菌活性，抗菌谱广，对甘蓝枯萎病菌（F.oxysporum f.sp.conglutinans）、禾谷丝核菌(小麦纹枯病菌)（R.cerealis）、桃褐腐病菌（M.fructicola）、苹果轮纹病菌（B.berengeriana f.sp piricola）、百合基腐病菌（F.oxysporum f.sp.lilii)、棉花黄萎病菌（V.dahliae）、黄瓜角斑病菌（P.syringae pv.lachrymans）、根癌土壤杆菌（桃冠瘿病菌）（Agrobacteriumtumefaciens）等病原菌和蜡状芽孢杆菌（B.cereus）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、大肠杆菌（E.coli)、等细菌均有强烈的抑制作用。
2、在甘蓝枯萎病的温室和田间防治试验中，本发明所提供的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563发酵液的防治效果均优于阳性对照50%多菌灵500倍液，在温室盆栽防治试验中，多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563发酵液对甘蓝枯萎病的平均预防和治疗效果分别可达91.21%和67.43%。在田间小区栽培防治试验中，多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563发酵液及其生防制剂（草炭+发酵液）对甘蓝枯萎病的平均防治效果分别可达79.93%和88.03%。另外，多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563的发酵液对甘蓝根系扩展和植株生长有促进作用。表现出良好的开发应用前景。
3、多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563的无菌发酵滤液pH值范围耐受范围宽，在pH 1-14的条件下均能保持较高的抑菌活性，对紫外线的照射不敏感，并能经受90℃的高温，这些特点使得多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563发酵产物在田间应用中具有较强的环境适应能力，为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCCNo.5563生防制剂的开发应用提供了很好的依据。
保藏说明
菌种名称：多粘类芽孢杆菌
拉丁名：（Paenibacillus polymyxa）
菌株编号：JZB120001
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2011年12月9日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.5563
附图说明
图1为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563的菌体形态显微照片（1000×）。
图2为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563的芽孢染色结果的显微照片（1000×）。
图3为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563的16S rDNA扩增产物电泳检测结果。其中，泳道M为250bp DNA Ladder Marker；泳道1和泳道2均为16S rDNA PCR产物。
图4为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563基于16S rDNA序列的***发育树。
图5为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563对不同真菌的抑菌活性检测结果。其中，a为甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans）；b为禾谷丝核菌(小麦纹枯病菌)（Rhizoctonia cerealis）；c为桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）；d为苹果轮纹病菌（Botryosphaeriaberengeriana f.sp piricola）；e为百合基腐病菌（F.oxysporum f.sp.lilii)；f为棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）。
图6为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563无菌发酵滤液对不同细菌的抑菌活性检测结果。其中，a为蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus）；b为枯草芽孢杆菌（B.subtilis）；c为大肠杆菌（Escberichia coli)；d为桃根癌病菌（Agrobacterium tumefaciens）；e为黄瓜角斑病菌（Pseudomonassyringae pv.lachrymans）。a-e中，位于平板左侧的A均为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563无菌发酵滤液处理组；位于平板右侧的B均为无菌水对照。
图7为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563无菌发酵滤液抗细菌活性稳定性检测的结果。其中，a为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563无菌发酵滤液经不同pH处理后的检测结果；数值1、3、5、9、11、14分别表示六个不同的pH处理组。b为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563无菌发酵滤液经紫外线（254nm）光照处理不同时间后的检测结果；数值30、60、90、120、150分别表示五个不同时间的紫外线（254nm）光照处理组，单位为min。c为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563无菌发酵滤液经不同温度处理后的检测结果；数值60、70、80、90、100分别表示五个不同的温度处理组，单位为℃。a-c中，A均为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCCNo.5563无菌发酵滤液对照组；B均为50μg/ml的硫酸链霉素（20μl）阳性对照。
图8为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563发酵液对甘蓝苗植株的促生作用。其中，从左至右依次为促生空白对照、发酵液单独处理（促生作用组）、发酵液处理后接种枯萎病菌（预防作用组）、接种枯萎病菌后用发酵液处理（治疗作用组）、接种枯萎病菌后用多菌灵处理（药剂治疗对照组）、单独接种枯萎病菌（防治空白对照组）。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
供试菌：
蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）由沈阳农业大学提供（中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌株库藏号ACCC10263）；
甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans）：李明远,张涛涛,李兴红,等.十字花科蔬菜枯萎病及其病原鉴定[J].植物保护,2003,29(3):44-45.
禾谷丝核菌(小麦纹枯病菌)（Rhizoctonia cerealis）:中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌株库藏号ACCC37699；
桃褐腐病菌（Monilinia Fructicola）:陈笑瑜,师迎春,骆勇,国立耘.桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)对3种杀菌剂的敏感性[J].植物保护,2006,32(3):25-28.
苹果轮纹病菌（Botryosphaeria berengeriana f.sp piricola）：冷伟锋，李保华，国立耘，等.苹果轮纹病菌诱导产孢方法.植物病理学报，2009，39(5):536-539.
百合基腐病菌（F. oxysporum f.sp.lilii)：许志刚.拉汉－汉拉植物病原生物名称.北京：中国农业出版社，2007.
棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）：中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌株库藏号ACCC 30308；
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）：中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌株库藏号ACCC 10115；
大肠杆菌（Escherichia coli)：中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌株库藏号ACCC 10080；
根癌土壤杆菌（桃冠瘿病菌）（Agrobacterium tumefaciens）：中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌株库藏号ACCC 10055；；
黄瓜角斑病菌（Pseudomonas syringae pv.lachrymans）：许志刚.拉汉－汉拉植物病原生物名称.北京：中国农业出版社，2007.；
以上各供试菌公众均可从北京市农林科学院植环所获得。
NB培养基：葡萄糖5.0g，蛋白胨5.0g，牛肉膏3.0g，蒸馏水定容1000ml，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min。
PDA培养基：葡萄糖20g，琼脂18g，马铃薯200g，加水1000mL煮沸30min滤取汁液，加水补足1000ml，pH6.0-7.0，121℃灭菌20min。
NA培养基：葡萄糖5.0g，蛋白胨5.0g，牛肉膏3.0g，琼脂18g，水1000ml，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min。
甘蓝品种中甘21号：中国农科院蔬菜花卉研究所，中甘21号甘蓝种子。
实施例1、多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001的分离与鉴定
一、菌株JZB120001的分离筛选
多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001，是从北京郊区种植蔬菜的耕作土壤中分离筛选获得。具体方法如下：从北京郊区蔬菜田采集土壤样品，取10ｇ加入装有100ml无菌水和10粒玻璃珠的三角瓶中，于26mm振幅摇床上100r/min振荡20min，取0.5ml加入4.5ml无菌水中制成土壤悬液，再依次稀释10-2，10-3，10-4倍，分别取各稀释土壤悬液0.1ml在NA培养基平板上均匀涂布，超净工作台内吹至略干；每浓度3个重复，置28℃恒温箱中培养5-10d，挑取细菌单菌落在NA平板上再次稀释划线获得纯培养。以甘蓝枯萎病菌等病原真菌和黄瓜角斑病菌等细菌为靶标菌，利用对峙培养法分别在PDA培养基和NA培养基平板上进行拮抗菌的初筛；对初筛获得的有拮抗活性的菌株进行摇瓶发酵培养，发酵液经0.45μm的无菌微孔滤膜过滤除菌获得无菌发酵滤液；分别利用牛津杯法和凹玻片法进一步测试无菌发酵滤液对病原菌菌丝生长和分生孢子萌发的抑制作用，利用温室盆栽接种试验测试发酵液对甘蓝枯萎病的温室防病效果，最终筛选出性状优良的生防菌株。将筛选所得的一株菌编号为JZB120001。
二、菌株JZB120001的鉴定
从以下几个方面对步骤一中分离得到的菌株JZB120001进行分类鉴定：
1、形态学鉴定
将上述步骤一分离得到的菌株JZB120001培养至对数生长期且菌落大小稳定时，进行菌落形态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态（是否平坦、突起、褶皱、凹陷等）、菌落边缘状态（是否整齐、不规则、放射状等）。
对于处于对数生长期的所述菌株JZB120001，经涂片后进行美蓝染色、芽孢染色和革兰氏染色，光镜下观察菌体和芽孢形态及革兰氏染色特性。
结果表明，上述步骤一分离得到的菌株JZB120001菌落在NA培养基平板上呈薄层、似变形虫的移动扩散状；在PDA培养基平板上为大型粘液状，乳白至浅黄色，表面光滑，中央常有小突起；菌体杆状，2-5×0.6-0.8μm（图1），革兰氏染色阳性，芽孢膨大，呈椭圆形，位于菌体的末端或次末端（图2）。
2、生理生化特征分析
采用常规方法对菌株JZB120001进行生理生化特性分析，试验项目及其结果见表1。
表1拮抗菌株JZB120001的生理生化特性
Figure BDA00002111160900081
3、16s rDNA序列同源性分析
常规方法培养上述步骤一分离得到的菌株JZB120001，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，以细菌16s rDNA通用引物，27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR反应。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸8min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收目标条带送北京三博远志测序。所得序列通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）在线Blast比对，选择与其16S rDNA序列相似性高的模式菌株利用Mega5软件构建***发育树。
菌株JZB120001的16S rDNA扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测获得了约1500bp的条带（图3），测序结果表明其长度为1463bp，其序列详见序列表中序列1；经在线Blast比对，与其序列相似性较高的前23个菌株中，除枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）菌株RZ(EU220428.1)和4个Paenibacillus sp.菌株（HQ317156.1、GU328695.1、GU979221.1和GU328690.1）外，包括前8个菌株在内的其余18个菌株均为多粘类芽孢杆菌；而枯草芽孢杆菌的模式菌株DSM 10T(NR_027552.1)16S rRNA基因序列与菌株JZB120001的相似性却相距较远，应用两序列比对程序比对的结果仅为87%，由此推测枯草芽孢杆菌菌株RZ与菌株JZB120001的相似性尚不能代表枯草芽孢杆菌与菌株JZB120001的亲缘关系。选择Blast结果中与菌株JZB120001相似性在97%以上的6个种及枯草芽孢杆菌的模式菌株与菌株JZB120001一起构建的基于16S rDNA序列的NJ***发育树如图4。由图4可见，菌株JZB120001与多粘类芽孢杆菌的2个模式菌株IAM 13419T和DSM 36T聚为同一分支，与其另一模式菌株NRS-1105T的距离也较近；而枯草芽孢杆菌的模式菌株DSM 10T与所有菌株的遗传距离均最远，成为该发育树的外群。
鉴于上述形态、生理生化特征和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤一分离得到的菌株JZB120001鉴定为类芽孢杆菌科（Paenibacillaceae）类芽孢杆菌属(Paemibacillus)多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）。该菌株JZB120001已于2011年12月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），建议的分类命名为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa），保藏编号为CGMCC No.5563。
实施例2、多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563及其代谢产物的抑菌活性检测
一、多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563发酵液及无菌发酵滤液的制备
将多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563在NA培养基斜面上活化培养后取2-3环接种到500ml三角瓶内的50ml NB培养基中。28℃，26mm振幅，170r/min振荡培养24h作为种子培养液；将其按2%（v/v）的接种量转接于500ml三角瓶内的50ml NB培养基中，28℃，170r/min振荡培养48h，得多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563发酵液(原液)。所得发酵液6.87×103g（8500r/min）室温离心15min，取上清用0.45μm微孔滤膜过滤灭菌，得到多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563的无菌发酵滤液（除去菌体的代谢产物溶液）。
二、多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563抗真菌活性的测定
供试的病原真菌为：甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans）、禾谷丝核菌(小麦纹枯病菌)（Rhizoctonia cerealis）、桃褐腐病菌（Moniliniafructicola）、苹果轮纹病菌（Botryosphaeria berengeriana f.sp piricola）、百合基腐病菌（Fusarium oxysporum f.sp.lilii）、棉花黄萎病菌（Verticilliumdahliae）。
采用平板对峙培养法：先在PDA平板相对两侧接种拮抗菌多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563，28℃培养2d后，在上述已接种好多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563的PDA平板中央接种靶标病原真菌，28℃继续培养3d，观察并测量接种拮抗菌和病原真菌菌落之间的抑菌带宽度（杨慧勇，李飞凤,陆琼娴，等，2006.拮抗菌株AFR0406对小麦赤霉病菌和纹枯病菌的生物活性测定.江苏农业科学,6:142-144）。每个处理三次重复，实验结果以三次重复的平均值±标准差的形式表示。同时设置只接病原真菌而不接多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563的对照。
测定结果如表2和图5所示，多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563在PDA平板上对所有供试的病原真菌都有抑制作用。其中对苹果轮纹病菌（Botryosphaeria berengeriana f.sp piricola）的抑菌带宽度达15.6mm；对桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）和棉花黄萎病菌（Verticilliumdahliae）的抑菌带宽度可达14.5mm以上；对甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans）、禾谷丝核菌(小麦纹枯病菌)（Rhizoctonia cerealis）和百合基腐病菌（F.oxysporum f.sp.lilii)的抑菌带宽度也达11.5mm以上。
表2多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563的抗真菌活性检测结果
Figure BDA00002111160900111
注：抑菌带宽度以平均值±标准误表示。抑菌活性按差异显著性区分，+表示抑菌带宽度在11.0-12.9mm之间；++表示抑菌带宽度在13.0-14.9mm之间,+++表示抑菌带宽度在15.0-16.9mm之间。同一列中的小写字母表示在0.05水平上的差异显著。
三、多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563发酵滤液抗细菌活性的测定
供试的病原细菌有***和革兰氏阴性细菌两类。其中***为：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）；革兰氏阴性细菌为大肠杆菌（Escherichia coli）、根癌土壤杆菌（桃冠瘿病菌）（Agrobacterium tumefaciens）、黄瓜角斑病菌（Pseudomonas syringaepv.lachrymans）。采用牛津杯法（周立刚.植物抗菌化合物[M].北京:中国农业科学技术出版社,2005）：在混有1%（v/v）供试细菌菌悬液的NA平板上放置两个牛津杯，其中一个加入步骤一制备的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001CGMCC No.5563的无菌发酵滤液50μL，另外一个加入等量的无菌水作为对照。待发酵滤液扩散到培养基内后置28℃培养过夜，次日观察，并采用十字交叉法测量牛津杯周围抑菌圈的直径（以牛津杯中心为圆心）。每个处理三次重复，实验结果以三次重复的平均值±标准差的形式表示。
计算公式：多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563对供试细菌的抑菌圈直径（mm）=牛津杯中心为圆心的抑菌圈直径（mm）-牛津杯直径（mm）
测定结果如表3和图6所示，多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563的无菌发酵滤液对所有供试的***和革兰氏阴性细菌均具有抑菌活性。其中，对蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）和黄瓜角斑病菌（Pseudomonas syringae pv.lachrymans）的抑菌圈直径达25.5mm以上；对枯草芽孢杆菌（B.subtilis）的抑菌圈直径达20.6mm；对大肠杆菌（Escherichia coli)和根癌土壤杆菌（桃冠瘿病菌）（Agrobacterium tumefaciens）的抑菌圈直径达14.6mm以上。
表3多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563发酵滤液的抗细菌活性检测结果
Figure BDA00002111160900121
注：抑菌活性按差异显著性区分，++表示抑菌圈直径在14.0-18.9mm之间；+++表示抑菌圈直径在19.0-23.9mm之间；++++表示抑菌圈直径在24.0-28.9mm之间。同一列中的小写字母表示在0.05水平上的差异显著。
四、多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563发酵滤液抗细菌活性稳定性检测
1、热稳定性检测
取6份步骤一制备的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCCNo.5563无菌发酵滤液，其中5份分别于60℃、70℃、80℃、90℃和100℃下处理30min，得到五个处理组；其余的1份不经处理，作为对照组。以蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus）为指示菌，用平板打孔药剂扩散法（周立刚.植物抗菌化合物[M].北京:中国农业科学技术出版社,2005）测定发酵滤液抑菌活性，孔的直径为5mm，各处理组及对照组的样品用量为20μl。同时以对蜡状芽孢杆菌具有抑制作用的72%农用硫酸链霉素（20μl，50μg/ml）为阳性对照。
2、酸碱稳定性检测
取六个试管，各加入步骤一制备的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563无菌发酵滤液8ml，分别调节pH为1、3、5、9、11、14，冰箱放置过夜，次日取出，将pH值调回7，并用无菌水将各个处理配平到同一体积，得到六个处理组；设置不经任何处理的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001CGMCC No.5563无菌发酵滤液作为对照组。以蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus）为指示菌，用平板打孔药剂扩散法（周立刚.植物抗菌化合物[M].北京:中国农业科学技术出版社,2005）测定发酵滤液抑菌活性，孔直径为5mm，各处理组及对照组的样品用量为20μl。同时以对蜡状芽孢杆菌具有抑制作用的72%农用硫酸链霉素（20μl，50μg/ml）为阳性对照。
3、紫外光稳定性检测
取5个无盖培养皿，每皿加入步骤一制备的多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563无菌发酵滤液4ml，置于强度30w的紫外灯（254nm）下65cm等距离照射，处理时间分别为30、60、90、120、150min，得到五个处理组；设置不经任何处理的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCCNo.5563无菌发酵滤液作为对照组。以蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）为指示菌，用平板打孔药剂扩散法（周立刚.植物抗菌化合物[M].北京:中国农业科学技术出版社,2005）测定发酵滤液抑菌活性，孔直径为5mm，各处理组及对照组的样品用量为20μl。同时以对蜡状芽孢杆菌具有抑制作用的72%农用硫酸链霉素（20μl，50μg/ml）为阳性对照。
以上三方面对步骤一制备的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563无菌发酵滤液抗细菌活性稳定性检测的结果如图7所示，多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563无菌发酵滤液的pH值耐受范围为1-14；发酵滤液在90℃下处理30min仍能保持活性，在100℃下处理30min则完全失去活性；紫外线试验中，JZB120001发酵滤液紫外处理120min后仍能保持原有活性，抑菌圈仍为23mm，处理150min后活性减退30.4%，产生的抑菌圈为16mm。
实施例3、多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563及其代谢产物的温室及田间防病实验
一、温室盆栽防治试验
在温室内用花盆移植甘蓝品种中甘21号的健康苗，分为如下六组，每组植株数为20株，重复3次：
预防作用组（JZB120001发酵液+甘蓝枯萎病菌）：待甘蓝健康苗定植后，以实施例2步骤一制备的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCCNo.5563发酵液灌根处理，每盆灌50ml。48h后，灌根接种浓度为108cfu/ml的甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans）孢子悬浮液，每盆灌10ml。观察多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563发酵液对甘蓝枯萎病的预防作用。
治疗作用组（甘蓝枯萎病菌+JZB120001发酵液）：待甘蓝健康苗定植后，灌根接种浓度为108cfu/ml的甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans）孢子悬浮液，每盆灌10ml。接种后48h以实施例2步骤一制备的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563发酵液灌根处理，每盆灌50ml。观察多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563无菌发酵滤液对甘蓝枯萎病的治疗作用。
药剂预防对照组（50%多菌灵500倍液+甘蓝枯萎病菌）：待甘蓝健康苗定植后，以50%多菌灵可湿性粉剂（江阴市农药二厂有限公司，产品货号ECS000145）500倍液灌根处理，每盆灌50ml。48h后，灌根接种浓度为108cfu/ml的甘蓝枯萎病菌（Fusariumoxysporum f.sp.conglutinans）孢子悬浮液，每盆灌10ml。观察50%多菌灵可湿性粉剂500倍液对甘蓝枯萎病的预防作用。
药剂治疗对照组（甘蓝枯萎病菌+50%多菌灵500倍液）：待甘蓝健康苗定植后，灌根接种浓度为108cfu/ml的甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans）孢子悬浮液，每盆灌10ml。接种后48h以50%多菌灵可湿性粉剂500倍液灌根处理，每盆灌50ml。观察50%多菌灵可湿性粉剂500倍液对甘蓝枯萎病的治疗作用。
促生作用组（JZB120001发酵液）：待甘蓝健康苗定植后，以实施例2步骤一制备的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563发酵液单独灌根处理，每盆灌50ml。观察其对植株的促生作用。
防治空白对照组（灭菌的发酵培养基+甘蓝枯萎病菌）：待甘蓝健康苗定植后，以灭菌的发酵培养基（NB培养基）灌根处理，每盆灌50ml。同时灌根接种浓度为108cfu/ml的甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans）孢子悬浮液，每盆灌10ml。观察甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans）对甘蓝苗的致病性。
促生空白对照组（灭菌的发酵培养基）：待甘蓝健康苗定植后，以灭菌的发酵培养基（NB培养基）灌根处理，每盆灌50ml。
7d后统计各组甘蓝苗发病情况，参照农药田间试验准则(二)第92部分：杀菌剂防治棉花黄、枯萎病的标准进行病害分级，按照以下公式计算各组发病率、病情指数和防治效果（中国国家标准化管理委员会.农药田间药效试验准则（二）[M].北京：中国标准出版社，2009）
发病率=发病数（株）/处理总数（株）×100%
Figure BDA00002111160900141
同时称量多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563发酵液单独灌根处理组（促生作用组）与促生空白对照组甘蓝苗鲜重与干重，计算促进生长的比率。各处理实验数据使用SPSS软件进行差异显著性分析。
温室盆栽防治试验结果如表4所示，多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001CGMCC No.5563对甘蓝枯萎病有显著的预防和治疗作用，其平均预防效果为91.21%，平均治疗效果为67.43%，分别优于药剂对照多菌灵的75.32%和57.96%。另外，多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563单独灌根处理组对甘蓝苗的植株生长有一定的促进作用（图8），与空白对照组相比，其甘蓝植株平均鲜重和干重分别增加27.0%和24.5%。
表4多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563发酵液对甘蓝枯萎病的温室盆栽防治效果
  处理   发病率（%）   病情指数  防治效果（%）
  JZB120001发酵液+甘蓝枯萎病菌   11.06±0.03e   4.38±0.01e   91.21
  甘蓝枯萎病菌+JZB120001发酵液   30.26±0.06c   16.23±1.73c   67.43
  50%多菌灵500倍液+甘蓝枯萎病菌   20.89±0.02d   12.30±0.02d   75.32
  甘蓝枯萎病菌+50%多菌灵500倍液   53.03±0.02b   20.95±0.05b   57.96
  JZB120001发酵液   0   0   -
  灭菌的发酵培养基   0   0   -
  灭菌的发酵培养基+甘蓝枯萎病菌   100±0a   49.83±0.46a   -
注：同一列中的小写字母表示在0.05水平上的差异显著。
二、田间小区防治试验
在延庆县甘蓝生产基地春茬中甘21号甘蓝移栽定植时进行田间小区防治试验。设置如下五个小区：（1）草炭与实施例2步骤一制备的多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563发酵液（原液）1：1（V/V）混合穴施，每株用量为300ml；（2）多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563发酵液原液灌根，每株用量为300ml；（3）多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563发酵液二倍稀释液灌根，每株用量为300ml；（4）以自来水灌根为空白对照，每株用量为300ml；（5）50%多菌灵可湿性粉剂500倍液灌根为药剂对照，每株用量为300ml。小区面积为20m2，每小区处理植株数约为200株，各小区随机排列，3个重复。定植20d后进行第二次防治，具体操作同上。
于第二次防治后20d进行病情调查，参照农药田间试验准则(二)第92部分（中国国家标准化管理委员会.农药田间药效试验准则（二）[M].北京：中国标准出版社，2009）：杀菌剂防治棉花黄、枯萎病的标准进行病害分级，计算发病率、病情指数，结果以三次重复的平均值±标准误的形式表示，同时应用SPSS软件检验各处理间的差异显著性，并计算防治效果。计算公式如下：
发病率=发病数（株）/处理总数（株）×100%
Figure BDA00002111160900161
Figure BDA00002111160900162
田间小区防治试验对甘蓝枯萎病的抑制效果如表5所示，草炭与多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563发酵原液1：1（V/V）混合穴施对甘蓝枯萎病的防治效果可达88.03%，显著高于药剂对照50%多菌灵可湿性粉剂500倍液的防效（73.61%）。多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCCNo.5563发酵液原液灌根对甘蓝枯萎病的防治效果可达79.93%；多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563发酵液的二倍稀释液对甘蓝枯萎病的防治效果也达74.31%，二者与作为药剂对照的50%多菌灵可湿性粉剂500倍液无显著差异。
表5多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563发酵液对甘蓝枯萎病的田间小区防治效果
Figure BDA00002111160900163
Figure IDA00002111162000011
Figure IDA00002111162000021

Claims (9)

1.多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的藏编号为CGMCC No.5563。
2.一种生防制剂，它的活性成分为权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563的代谢产物和/或权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563。
3.根据权利要求2所述的生防制剂，其特征在于：所述生防制剂为下述1）-4）中任一的生防制剂：
1）用于防治植物真菌病害的生防制剂；
2）用于防治植物细菌病害的生防制剂；
3）用于抑制病原真菌的生防制剂；
4）用于抑制病原细菌的生防制剂。
4.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCCNo.5563在制备下述1）-4）中任一生防制剂中的应用：
1）用于防治植物真菌病害的生防制剂；
2）用于防治植物细菌病害的生防制剂；
3）用于抑制病原真菌的生防制剂；
4）用于抑制病原细菌的生防制剂。
5.根据权利要求3所述的生防制剂或权利要求4所述的应用，其特征在于：所述病原真菌为下述中至少一种：苹果轮纹病菌（Botryosphaeria berengeriana f.sppiricola）、棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）、桃褐腐病菌（Moniliniafructicola）、小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）、百合基腐病菌（Fusariumoxysporum f.sp.lilii)和甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans）；
所述病原细菌为下述中至少一种：黄瓜角斑病菌（Pseudomonas lachrymans）和桃冠瘿病菌（Agrobacterium tumefaciens）；
所述植物真菌病害为枯萎病。
6.根据权利要求5所述的生防制剂或应用，其特征在于：所述枯萎病为由甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.conglutinans）所引起的病害。
7.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCCNo.5563，或权利要求2、3、5或6所述的生防制剂在如下a）或b）中应用：
a）促进植物生长；
b）制备微生物肥料。
8.含有权利要求1所述多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001CGMCC No.5563，或权利要求2、3、5或6所述生防制剂的微生物肥料。
9.权利要求2、3、5或6所述生防制剂的制备方法，包括如下步骤：将所述多粘类芽孢杆菌（Paenibaeillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563的代谢产物，或/和所述多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）JZB120001 CGMCC No.5563作为活性成分，得到所述生防制剂。
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