CN1175104C - 内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因 - Google Patents

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Abstract

编码以下蛋白(a)或(b)的内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因：(a)包含SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列的蛋白；和(b)包含衍生自缺失、置换、***或添加至少一个氨基酸的SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列的氨基酸序列并具有内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶活性的蛋白。

Description

内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因
技术领域
本发明涉及新的内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(endo-β-N-acetylglucosaminidase)基因，具体地说涉及得自毛霉菌属的基因。此外，本发明涉及包含所述基因的重组质粒、用所述质粒转化的生物体以及使用所述转化体生产新型内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的方法。
背景技术
糖蛋白广泛见于动物组织、植物组织以及真核微生物的细胞膜和细胞壁等。
在近些年，糖蛋白的糖链在诸如细胞分化、致癌作用和胞间识别的机制中起重要作用已变得越来越清晰。为了阐明这些机制，对糖链结构及其功能之间的相关性进行了研究。作为达到这一目的的手段，当切割糖蛋白的糖链或当鉴定糖链的结构时，使用各种糖苷酶。这其中，内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶对连接天冬酰胺的糖链(N连接的糖链，N-糖链)起作用，并具有切割存在于所述糖链中的双乙酰-几丁二糖部分的作用，从而释放出所述糖链。
因为内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶可以由蛋白部分中释放出糖蛋白的糖部分，所以认为分析糖蛋白中的糖链功能和结构很重要。
可以将天冬酰胺连接的糖链根据其结构分为高甘露糖型(甘露聚糖(mannane)型糖链)、杂合型或复合型。
已知的内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶包括Endo H(A.L.Tarentino和F.Maley，J.Biol.Chem.，249，811(1974))、Endo F(K.Takegawa等，Eur j.Biochem.，202，175(1991))和Endo A(K.Takegawa等，Appl.Environ.Microbiol.，55，3107(1989))。然而，这些酶仅对具有特定结构的糖起作用，并不对糖蛋白起作用，除非存在变性剂。
得自冻土毛霉(Mucor hiemalis)的内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶能够切割三触角的复合型糖链，该糖链不仅涉及高甘露糖型(甘露聚糖型糖链)和杂合型链，而且涉及复合型链。此外，对于脱唾液酸(asialylated)型，切割能力扩展到四触角杂聚糖链。而且，已知有可能使糖链由糖蛋白中释放出来，而不使所述蛋白经受变性处理(S.Kadowaki等，Agric.Biol.Chem.，54，97(1990))。因此认为得自冻土毛霉的内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶可用于研究糖蛋白的糖链和蛋白的功能和生理作用。
在另一方面，将得自酵母的甘露聚糖型糖链转变成适于人类的糖链形式在工业上具有非常重要的意义。作为用于此转变的方法，可以考虑通过用基因操作改善酵母糖链生物合成***的体内转变以及使用转糖基反应的体外转变。对于糖转变，内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶需要具有如下特征：1)底物特异性，即既能切割甘露聚糖型又能切割复合型的能力；和2)进行为分解反应的反向反应的转糖基反应的能力。因此认为得自冻土毛霉的内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶可以成为实施所述转变的适合酶。
本发明人已经提出了使用得自冻土毛霉的内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的糖链转变技术，该技术可以改变酵母糖链为适于人的形式(日本专利申请公开第Hei 7-59587号)。
为进行诸如以上的糖链转变，需要制备大量高纯度的可信酶。在此情况下，已经考虑了通过使用霉菌细胞的常规繁殖方法提高酶产量。然而，因为常规繁殖方法明显受限于由使用紫外灯或诱变剂获得的突变株中选择所述酶的方法，所以难以分离稳定的突变体。此外，常规繁殖方法常常伴随不良转化。而且，因为霉菌通常产生蛋白酶，所以它们通常不适于生产用于糖转变的酶。鉴于此，为了解决这些问题，必须进行许多纯化步骤，此工作复杂且产量低。例如，培养属于毛霉菌属(一类丝状霉菌)的微生物，即使对此培养物的上清液进行纯化，仍不能防止蛋白酶污染，并由于所述微生物的酶产量低而难以大量制备，因此该方法几乎没有实用价值。
据此，为了大量生产内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶，希望获得所述酶的基因并通过使用基因工程生产该基因。此外，如果可以获得该基因，可以预期能够使用蛋白工程技术获得提高了抗热性和pH抗性并增加了反应速率的酶。然而，至今尚未报导基因克隆方面的尝试。
发明公开
本发明的一个目的是提供内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶、内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因、包含所述基因的重组载体、用所述载体转化的生物和生产内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的方法。
本发明人通过他们对解决上述问题的深入细致的研究，基于得自冻土毛霉的所述内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的部分氨基酸序列信息，已成功获得编码来自cDNA文库的所述酶的基因，所述cDNA文库由生产所述酶的细菌—冻土毛霉制备，本发明人进一步在酵母中成功表达了此基因，从而完成了本发明。
因此，本发明提供以下(a)或(b)的重组蛋白：
(a)包含SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列的蛋白；和
(b)包含衍生自缺失、置换、***或添加至少一个氨基酸的SEQ IDNO：3表示的氨基酸序列的氨基酸序列并具有内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶活性的蛋白。
此外，本发明提供编码以下(a)或(b)的蛋白的内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因，以及在严格条件下与所述基因杂交并包含编码具有内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶活性的蛋白的DNA的基因。
(a)包含SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列的蛋白；和
(b)包含衍生自缺失、置换、***或添加至少一个氨基酸的SEQ IDNO：3表示的氨基酸序列的氨基酸序列并具有内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶活性的蛋白。
此外，本发明提供包含以下(c)或(d)的DNA的基因：
(c)由SEQ ID NO：2表示的核苷酸序列组成的DNA；和
(d)在严格条件下与由SEQ ID NO：2表示的核苷酸序列组成的DNA杂交并编码具有内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶活性的蛋白的DNA。
所述基因包括得自属于毛霉菌属的微生物的基因。
此外，本发明提供包含所述基因的重组载体。
此外，本发明提供包含所述重组载体的转化体。
此外，本发明提供生产内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的方法，该方法包括培养所述转化体并由获得的培养产物中收集内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。
以下将详细描述本发明。
本发明的特征在于培养产生内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的微生物，由获得的培养物中纯化内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶，根据所述酶的部分氨基酸序列设计简并探针，通过进行PCR克隆编码所述酶的基因，并进一步克隆编码来自产生内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的微生物的cDNA文库的所述酶的基因。此外，本发明的特征在于通过引入克隆的基因到载体中获得重组载体，以及通过引入所述重组载体到宿主细胞中获得转化体。此外，本发明的特征在于通过培养所述转化体大量生产内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。
1.培养产生内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的微生物
用于生产内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的微生物包括属于毛霉菌属的微生物，优选冻土毛霉，更优选是保藏在国立生命科学和人体技术研究所，工业科学和技术局(1-1-3，Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本)的冻土毛霉(保藏号FERM BP-4991)。
用于培养这些菌株的培养基组分可以是通常用于培养微生物的任何类型培养基组分。
碳源包括例如糖，诸如葡萄糖、蔗糖、甘露糖、半乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉和糊精。氮源包括酵母提取物、胰蛋白胨等。至于无机盐，除包含于上述氮源中的无机盐之外，还可以使用诸如所有种类的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和磷酸盐的盐。可任选地加入维生素。
所述培养基通过常规方法灭菌，并将所述菌株接种到该培养基中。此后于20-30℃、pH 5-7振荡培养或通气搅拌培养2至4天。
在本发明中，优选于25-30℃、pH 6、良好通气条件下，用半乳糖作为碳源，用酵母提取物和胰蛋白胨作为氮源，进行3至4天的培养，每种碳源和氮源的浓度都为2-3％，碳源与氮源的比率为2∶3。当在上述条件下进行培养时酶产量最大，与已知方法(S.Kadowaki等，Agric Biol.Chem.，54，97(1990)；葡萄糖0.5％，酵母提取物1％，蛋白胨1％)相比，可以获得约10倍高的产量。
此外，在本发明中，为确保培养所述微生物时的通气条件，最好使用小型发酵罐(jar fermenter)。
2.纯化内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶
由上述细菌菌株生产的内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的特征在于保有以下活性。换句话说，其特征可能在于以下活性：即作用于糖蛋白中的连接天冬酰胺的糖链，切割在所述糖链中的双乙酰-几丁二糖部分，并由此释放出所述糖链。
可以通过适当组合已知用于分离和纯化的方法，进行内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的纯化。所述方法的实例包括利用溶解性差异的方法，诸如盐沉淀和溶剂沉淀；利用分子量差异的方法，诸如透析、超滤、凝胶过滤和SDS-聚丙烯酰胺电泳；利用静电电荷差异的方法，诸如离子交换层析；利用疏水性差异的方法，诸如疏水层析和反相层析，以及利用等电点差异的方法，诸如等电聚焦。
在本发明中，通过采用改进了上述已知方法(S.Kadowaki等，Agric Biol.Chem.，54，97(1990)的培养方法，并进行多步纯化，可以有效纯化内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶，并有可能获得足量的蛋白，以测定获得所述基因必需的氨基酸序列。由纯化和对下文将描述的基因的分析结果可知，获得的酶由分子量约85,000的单一基因产物组成，并在翻译后部分消化所述基因产物之后发现其由2个或2个以上的包括分子量约60,000和14,000的肽的亚单位组成。
3.克隆新的内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因
显然，得自冻土毛霉的内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶由至少2个或2个以上的肽组成。
一般来说，当分离编码特异性蛋白的基因时，测定该蛋白的部分氨基酸序列，并可用由简并密码子组成的寡核苷酸的混合物作为探针，从基因文库中分离目的基因。此外，通过诸如在本发明中的PCR获得片段后，可以使用此片段作为探针由基因文库中分离目的基因。
然而，由于内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶是由2个或2个以上的亚单位组成的杂寡聚物分子，所以存在每个亚单位分别由它们各自不同的基因编码的可能性。而且，即使内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶衍生自一个基因，其结构，例如在结构基因中编码所述两个亚单位的区之间的位置关系，仍不明确。
因此，本发明人测定了2个亚单位的部分氨基酸序列，然后在通过PCR获得部分片段后，使用所述片段作为探针获得cDNA克隆，并通过分析基因结构，阐明所述基因编码的这2个亚单位。即，很明确是由编码内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的基因生产为一个多肽的新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶，并通过部分分解将其加工成为2个或2个以上的亚单位。
本发明所述基因通过例如以下方法克隆。
(1)克隆内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因
在本发明中，包含编码新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的基因的DNA片段的实例是由图2所示的限制酶图谱表示的DNA片段。此片段可以使用基因工程方法(参见例如在Molecular Cloning：ALaboratoy Manual(Sambrook，Maniatis等，Cold Spring HarbourLaboratory Press(1989))中描述的方法)，采用mRNA模板从cDNA文库中分离，所述mRNA模板由属于毛霉菌属的微生物制备，优选由冻土毛霉制备，更优选由保藏在国立生命科学和人体技术研究所保藏号为FERM BP-4991的冻土毛霉菌株制备。
可以按照典型方法进行mRNA的制备。例如，在培养所述mRNA源冻土毛霉后，用可在市场上购买的试剂盒(ISOGEN(Nippon GeneCompamy))由培养的细胞中获得总的RNA，然后用可在市场上购买的纯化试剂盒(mRNA纯化试剂盒(Pharmacia Biotech))纯化。在mRNA制备中，最好是使培养时间短，以控制mRNA的分解。
将由此获得的mRNA用作模板，使用寡脱氧胸苷酸引物和逆转录酶合成单链cDNA。于是由所述单链cDNA合成双链cDNA。然后通过将所述双链cDNA掺入到合适的克隆载体中，构建重组载体。可以通过用所获得的重组载体转化大肠杆菌(E.Coli)，并用四环素抗性和氨苄青霉素抗性作为指征选择转化体，获得cDNA文库。
在本文中，按照诸如Hanahan法(Hanahan，D.：J.Mol.Biol.166：557-580(1983))的方法进行大肠杆菌的转化。当准备用质粒作为载体时，它必需包括抗诸如四环素或氨苄青霉素的药物的基因。此外，可以使用非质粒的克隆载体，例如λ噬菌体等。
从由此获得的转化体中选择(筛选)具有目的DNA的菌株。筛选方法包括例如合成对应于内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的部分氨基酸序列的有义和反义引物，并使用其进行聚合酶链式反应(PCR)的方法。模板DNA可以包括例如基因组DNA或通过逆转录由以上提及的mRNA合成的cDNA。至于所述有义链的引物，例如可以使用基于氨基酸序列：PSLQLQPDDK(SEQ ID NO：4)合成的5′-CARTTRCARCCNGAYGAYAA-3′(SEQ ID NO：5)，以及基于氨基酸序列：SYRNPEIYPTDQNIK(SEQ ID NO：6)合成的5′-CCHACNGAYCARAAYATYAA-3′(SEQ ID NO：7)。此外，关于所述反义链，可以使用基于氨基酸序列：SYRNPEIYPTDQNIK(SEQ ID NO：6)合成的3′-GGDTGNCTRGTYTTRTARTT-5′(SEQ ID NO：8)，以及基于氨基酸序列：GQRFNHRESHDVETEI(SEQ ID NO：9)合成的3′-TTYCCDGTYGCDAARTTRGT-5′(SEQ ID NO：10)。然而，本发明不限于这些引物。
这样，用例如32P、35S或生物素标记所获得的DNA扩增片段，并将其作为探针，然后使其与所述转化体的cDNA文库杂交，所述文库已经变性并在硝化纤维素膜上固定，然后可以通过查找所获得的阳性菌株进行筛选。
(2)测定所述核苷酸序列
对所获得的克隆的核苷酸序列进行测定。可以通过已知的方法，诸如Maxam-Gilbert化学修饰法或双脱氧法，对所述核苷酸序列进行测定，尽管典型的序列测定是使用自动化核苷酸测序仪(例如PERKIN-ELMER 377A DNA测序仪)进行。
SEQ ID NO：1表示所述内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的全长序列。其中，本发明所述基因的优选实施例为SEQ ID NO：1表示的核苷酸序列的位置71至位置2305的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。此外，本发明所述基因不仅包括编码SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列或下文描述的具有等价序列的氨基酸序列的序列，而且包括编码同一多肽的简并异构体(仅在于简并密码子不同)。
使用诸如定点诱变的方法，可以制备编码具有等价序列的氨基酸序列的核苷酸序列。即可以通过已知方法，诸如Kunkel法或缺口双链体法(Gapped duplex method)，或其它的等价方法，使用例如使用定点诱变的突变产生试剂盒(例如Mutant-K(Takara)，Mutant-G(Takara))等，或使用Takara的LA PCR体外诱变系列试剂盒，产生突变。
此外，内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因不仅包括由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2表示的核苷酸序列组成的DNA，而且包括在严格条件下与所述DNA杂交并编码具有内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶活性的蛋白的DNA。严格条件意指例如钠浓度为50-300mM(优选150mM)和温度为50-68℃(优选65℃)的条件。
一旦鉴定了所述内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，则由于测定了具有所述核苷酸序列的位置71至2305的序列(可读框)的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)，所以可通过化学合成；通过使用基因组DNA作为模板以及使用所述可读框(SEQ ID NO：2)的5′和3′末端序列(例如5′-ATGCCTTCACTTCAATTGCAACC-3′(SEQ ID NO：11)和5′-CTAGTTTAATGACAAATCTATGC-3′(SEQ ID NO：12))作为引物的PCR；或通过与作为探针的具有内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的核苷酸序列的DNA片段杂交，获得所述内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因。
将包含本发明所述基因的质粒pZL-Endo(参见下文实施例3)引入到大肠杆菌DH10B中(命名为DHBpZL-Endo)，并于1998年4月28日保藏于国立生命科学和人体技术研究所(1-1-3，Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本)，获得保藏号为FERM BP-6335。
在本发明中，提供SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列或包含等价序列的多肽，作为重组新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的优选实例。在本文中，“等价序列”是指包含SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列并在其中***、置换、缺失或添加至少一个氨基酸至任一端并保留所述新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶活性的序列。在此等价序列中保留新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶活性是指所述序列保持的活性足以使其以和具有SEQ ID NO：3表示的全长序列的多肽几乎相同的方式在与该多肽相同的条件下，以利用该活性的实际应用形式使用。显然，对于本领域的技术人员而言，可以选择和生产这种相对于SEQ ID NO：3表示的序列的等价序列，而没有特别的困难。例如，在SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列中，可以缺失至少1个、优选1-10个、更优选1-5个氨基酸；可以添加或***至少1个、优选1-10个、更优选1-5个氨基酸；或可以置换至少1个、优选1-10个、更优选1-5个氨基酸。因此，本发明所述蛋白包括具有在序列表中SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列的位置2至744的氨基酸序列的多肽(其中SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列的位置1的蛋氨酸已经缺失)。在本文中，通过对本发明的部分氨基酸序列的分析和基因结构分析，明确的是，通过在SEQ ID NO：3表示的氨基酸序列中的至少位置510的组氨酸和位置627的天冬酰胺的C端侧切割前体多肽，产生2个或2个以上的天然类型的亚单位。
2.构建重组载体和转化体
本发明提供包含本发明所述基因的DNA分子，尤其是表达载体。此DNA分子可以通过将编码按照本发明的新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的DNA片段掺入到载体分子中获得。因此，如果用DNA分子、尤其是为表达载体形式的DNA分子，进行宿主细胞的转化，则有可能使本发明所述新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶在所述宿主细胞中生产，所述DNA分子包括编码本发明所述新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的DNA片段，该片段的形式使得其可在所述宿主细胞中复制以及所述基因可表达。
可以基于在以上引用的Molecular Cloning：A Laboratory Manual(上文)中描述的方法构建按照本发明的DNA分子。
(1)构建重组载体
要用于本发明的载体可根据要使用的宿主细胞类型，适当选自病毒、质粒、粘粒载体等等。
例如，当所述宿主细胞为大肠杆菌时，可以使用λ噬菌体系的噬菌体、pBR系(pBR322、pBR325等)和pUC系(pUC118、pUC119等)的质粒；当所述宿主细胞为枯草杆菌(Bacillus subtilis)时，可以使用pUB系(pUB110等)的质粒；而当所述宿主细胞为酵母时，可以使用YEp和YCp系(例如YEp13、YEp24、YCp50等)的载体或用于以下实施例的pG-3-Not。此外，可以使用动物病毒(诸如逆转录病毒或痘苗病毒)载体或昆虫病毒(诸如杆状病毒)载体。
为将本发明所述基因引入到所述载体中，使用连接所述基因至所述载体的方法，诸如首先用合适的限制酶切割纯化的DNA，然后在合适的限制位点或所述载体DNA的多克隆位点***所述基因。
必须将本发明所述基因***到所述载体中，以便显示此基因的功能。因此，本发明所述载体最好包括选择标记。药物抗性标记和营养缺陷型标记可以用作选择标记。
此外，用作本发明所述表达载体的DNA分子最好具有表达所述新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因必需的DNA序列，诸如转录调节信号和翻译调节信号，例如启动子、转录起始信号、核糖体结合位点、翻译终止信号和转录终止信号。
(2)构建所述转化体
可以通过将本发明所述重组载体引入到允许题述基因表达形式的宿主中，获得本发明所述转化体。对于可以使用的所述宿主没有特别限制，只要其允许本发明所述基因表达。实例包括诸如大肠杆菌的埃希氏杆菌属细菌、诸如枯草杆菌的杆菌属细菌或诸如恶臭假单胞菌(Pseodomonas putida)的假单胞杆菌(Pseudomonas)属细菌等，以及诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的酵母。
至于宿主细胞，除了大肠杆菌、枯草杆菌和酵母之外，还可以使用诸如COS细胞和CHO细胞等的动物细胞以及诸如Sf9和Sf21等的昆虫细胞。
当使用诸如大肠杆菌的细菌作为宿主时，本发明所述重组载体最好在所述细菌中自主复制，并包含启动子、核糖体结合位点、本发明所述基因以及转录终止序列。还可以包括控制所述启动子的基因。
大肠杆菌的实例包括大肠杆菌K12、DH1、DH5α、JM109等。枯草杆菌的实例包括枯草杆菌MI 114、207-21等。已知存在分泌蛋白至微生物体外的枯草杆菌菌株。还已知几乎不分泌任何蛋白酶的菌株。最好使用这些菌株作为宿主。
至于启动子，当然可以使用即使在所述宿主中也能够起作用的在***片段中的启动子。在大肠杆菌中的启动子的实例包括乳糖操纵子(lac)和色氨酸操纵子(trp)等。
至于将所述重组载体引入到细菌中的方法，可以使用任何将DNA引入到细菌中的方法，对其没有特别限制。实例包括使用钙离子的方法[Cohen，S.N.等：Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，69：2110-2114(1972)]和电穿孔。
当酵母要作为宿主时，可以使用酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、博伊丁假丝酵母等。在此情况下，对可以使用的启动子没有特别限制，只要其可以在酵母中表达。例如，可以优选使用诸如醇脱氢酶(ADH)启动子、酸性磷酸酶(PHO)启动子、半乳糖基因(GAL)启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)启动子、热激蛋白启动子、MFα1启动子、PGK启动子、GAP启动子和AOX1启动子的启动子。
至于将所述重组载体引入到酵母中的方法，可以使用任何将DNA引入到酵母中的方法，对其没有特别限制。实例包括电穿孔[Backer，D.M.等：Meththods.Enzymol.，194：182-187(1990)]、原生质球法[Hinnen，A.等：Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，75：1929-1933(1978)]和乙酸锂法[Itoh，H.：J.Bacteriol.，153：163-168(1983)]。
当动物细胞要作为宿主时，可以使用猴细胞COS-7、非洲绿猴肾细胞株系(Vero)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、小鼠L细胞、大鼠GH3细胞和人FL细胞等。至于启动子，可以使用SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV启动子或诸如此类的启动子。还可以使用人巨细胞病毒的起始启动子等等。
将所述重组载体引入到动物细胞中的方法实例包括电穿孔、磷酸钙法和脂质转染法。
当昆虫细胞要作为宿主时，可以使用Sf9细胞、Sf21细胞和诸如此类的细胞。
将所述重组载体引入到昆虫细胞中的方法的实例包括磷酸钙法、脂质转染和电穿孔。
4.生产本发明所述蛋白
本发明的蛋白具有由本发明的基因编码的氨基酸序列，或具有其中已经引入所述至少1个氨基酸的修饰的所述氨基酸序列，并具有内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶活性。
可以通过培养上文提及的转化体并由该培养产物中收集所述蛋白获得本发明所述蛋白。“培养产物”是指培养上清液、培养的细胞或微生物细胞，或破碎的细胞或破碎的微生物细胞。
天然培养基或合成培养基可以用作培养由微生物(诸如大肠杆菌或酵母)作为宿主获得的转化体的培养基，只要其包含能够被所述微生物吸收的碳源、氮源、无机盐等，并可以用于对所述转化体进行有效培养。
至于碳源，使用诸如葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉的碳水化合物；诸如乙酸和丙酸的有机酸以及诸如乙醇和丙醇的醇类。
至于氮源，使用诸如氨、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵的无机酸；诸如乙酸铵的有机酸或其它含氮化合物，以及蛋白胨、肉膏、玉米浆等。
至于无机物，使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜和碳酸钙等。
通常在诸如振摇培养或通气搅拌培养的有氧条件下于37℃进行12至72小时的培养。在培养过程中，pH保持在4-7.5。使用无机酸或有机酸或碱性溶液等对pH进行调节。
在培养过程中，可以根据需要向所述培养基中加入抗生素，诸如氨苄青霉素和四环素。
当培养用包含诱导型启动子的表达载体转化的微生物时，可以根据需要向所述培养物中加入诱导剂。例如当培养使用Lac启动子的表达载体转化的微生物时，可以向该培养物中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)等，而当培养使用trp启动子的表达载体转化的微生物时，可以加入吲哚乙酸(IAA)。
至于用于培养由动物宿主细胞获得的转化体的培养基，使用通常使用的RPMI1640培养基、DMEM培养基或已加入胎牛血清等的这些培养基。
培养通常在5％CO2存在下于37℃进行2至10天。在培养过程中可以根据需要加入诸如卡那霉素和青霉素的抗生素。
培养后，当已在所述微生物或细胞中产生本发明所述蛋白时，通过破碎所述微生物或细胞提取本发明所述蛋白。当已在所述微生物或细胞外产生本发明所述蛋白时，可以原样使用所述微生物或细胞的培养液，或可以使用通过离心分离等除去所述微生物或细胞的培养液。
通过适当组合已知的分离和纯化方法，进行所述重组新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的纯化。这些方法的实例包括利用溶解性差异的方法，诸如盐沉淀和溶剂沉淀法；利用分子量差异的方法，诸如透析、超滤、凝胶过滤和SDS-聚丙烯酰胺电泳；利用静电荷(化合价)差异的方法，诸如离子交换层析；利用疏水性差异的方法，诸如疏水层析和反相层析；以及利用等电点差异的方法，诸如等电聚焦。
在本发明中，正如以下实施例所指出，当所述基因在GAPDH启动子控制下于酿酒酵母宿主中进行表达时，证实了细胞提取物中的高酶活性。这表明，通过在所述重组体中表达本发明所述基因，可以大量产生活性新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。
附图简述
图1是表示内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶纯化结果的电泳图片。
图2是包含新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的全长序列的pZL-Endo的限制酶图谱。
图3表示在包含新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的全长序列的pZL-Endo的SalI-NotI位点***的片段的完整核苷酸序列。
图4表示在包含新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的全长序列的pZL-Endo的SalI-NotI位点***的片段的完整核苷酸序列(图3的延续)。
图5显示根据新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因推断的氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的DNA的核苷酸序列。
图6显示根据新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因推断的氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的DNA的核苷酸序列(图5的延续)。
图7显示根据新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因推断的氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的DNA的核苷酸序列(图6的延续)。
图8显示表达载体pGEndo-SC的结构，它包含用于酿酒酵母的新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因。
图9是表示在其中已引入新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的酵母中表达所述酶的层析图片。
实施本发明的最好方式
以下将利用实施例更具体地描述本发明。然而，要考虑的是本发明的技术范围不限于这些实施例。除非本文另有说明，否则按照在Molecular Cloning：A Laboratoy Manual(Sambrook，Maniatis等，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989))中描述的方法进行所述步骤。
实施例1：检测酶活性
基本上按照在S.Kadowaki等，Agric.Biol.Chem.，54，97(1990)中指出的方法对内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的活性进行检测。即，使用丹磺酰化人脱唾液酸运铁蛋白糖肽(DNS-GP)作为底物，在磷酸钾缓冲液(pH 6.0)中于37℃进行反应，并在以下条件下通过薄层层析(TLC)或通过HPLC检测活性。
用于TLC的分析条件：
展开相：HPTLC硅胶60(Merck)
溶剂：丁醇∶乙酸∶水＝2∶1∶1
检测：通过荧光法检测
用于HPLC的分析条件：
柱：TSK-胶ODS80TM(TOSO)
溶剂：25mM硼酸钠缓冲液(pH 7.5)+11％乙腈
柱温：50℃
流速；0.5ml/分钟
检测器：荧光检测器
将活性定义为1单位等于在上述HPLC检测条件下1分钟产生1μmol丹磺酰化天冬酰胺酰乙酰葡糖胺所需的酶的量。
实施例2：培养冻土毛霉
将100ml培养基(半乳糖2％，酵母提取物3％)置于500mlSakaguchi瓶中，用1/3至1/5斜面的冻土毛霉孢子接种，于28℃进行2天的培养。通过吸滤从所述培养物中分离微生物细胞，用于制备mRNA。
关于所述酶的制备，将培养后的上述培养物转移到在3升小型发酵罐中的2升所述培养基中，在28℃、300-400rpm转速和2升/分钟通气体积的条件下进行4天的培养。
实施例3：纯化新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶
对在实施例2中获得的4升所述培养物(来自在3升小型发酵罐中进行的两批培养)进行吸滤，以分离所述细胞，并使用超滤浓缩至200ml。将此粗制酶溶液进行离子交换层析(Pharmacia Q SepharoseFF，500ml)，该层析柱用包含5mM EDTA的10mM磷酸钾缓冲液平衡。用相同缓冲溶液清洗该柱，接着用900ml线性梯度的0M-0.3MNaCl洗脱。向活性流分中加入试剂，以便获得1M硫酸铵、包含5mMEDTA的50mM磷酸钾的终浓度。将所述产物进行疏水层析(TOSOPhenyl-TOYOPEARL 650S 200ml)，该层析柱用相同缓冲液平衡。用此相同缓冲液清洗该柱，然后用线性梯度的包含1mM EDTA的1M-0M硫酸铵洗脱内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。
用超滤膜(截流分子量13000)将获得的洗出液浓缩至5ml，然后用包含1mM EDTA和0.15M NaCl的10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)清洗并脱盐。接下来将所述活性流分上凝胶过滤层析柱(PharmaciaSephacryl S300)，该柱用相同缓冲溶液平衡，并用相同缓冲溶液洗脱内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。
用超滤膜(截流分子量13000)浓缩所述活性流分，然后用包含1mM EDTA的10mM磷酸钾(pH 7.0)清洗并脱盐。接下来对所述活性流分进行羟磷灰石层析(TOSO TSK-凝胶HA1000)，该层析柱用相同缓冲溶液平衡。用此相同缓冲溶液清洗该柱，然后用线性梯度的包含1mM EDTA的0M-0.3M硫酸铵(pH 7.0)(30ml)洗脱内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。
用超滤膜(截流分子量13000)浓缩所述活性流分，然后用25mM双Tris缓冲溶液(用亚氨基二乙酸调节至pH 7.1)清洗并脱盐。对所述活性流分进行等电点层析(Pharmacia，MonoQ)，该层析柱用相同缓冲溶液平衡。用此相同缓冲溶液清洗该柱，然后用50ml的10％Polybuffer 74(Pharmacia)(用亚氨基二乙酸调节至pH 3.9)洗脱内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。
用超滤膜(截流分子量13000)浓缩所述活性流分，然后用包含1mM EDTA的10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)清洗并脱盐。接下来对所述活性流分进行离子交换层析(Pharmacia，MonoQ)。用此相同缓冲溶液清洗该柱，然后用线性梯度的0M-0.3M NaCl(30ml)洗脱内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。
用超滤膜(截流分子量13000)浓缩所述活性流分，然后用包含1mM EDTA的50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)清洗并脱盐，以获得酶样品。应当注意的是每个柱层析都使用FPLC(Pharmacia)进行。
使用BioRad生产的蛋白质检定试剂盒或通过吸光度(280nm)检测所述蛋白的量。通过SDS-PAGE(15-25％梯度)、凝胶过滤层析、IEF-PAGE等检测所述蛋白的分子量和等电点。
根据在Native-SDSPAGE和IEF-SDSPAGE的双向电泳和在上述层析中的每个所述流分的活性，并根据SDS-PAGE分析的结果，检测到在SDS-PAGE上的至少60kDa(用p60代表)和14kDa(用p14代表)的带(图1)。
实施例4：测定新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的部分氨基酸序列
按照Iwamatsu法(Seikagaku(Biochemistry)63，139-143(1991))对部分氨基酸序列进行分析。在电泳缓冲溶液(10％甘油、2.5％SDS、2％2-巯基乙醇、62mM Tris-HCl缓冲液(pH 6.8))中悬浮纯化的酶，并进行SDS聚丙烯酰胺电泳。电泳后，通过电印迹将所述酶由所述凝胶转移到10cm×7cm PVDF膜((ProBlot)Applied Biosystems)。使用ZARUTO Blot II型(Zarutorius)作为电印迹装置，于160mA进行1小时的电印迹。转移后，切除所述酶转移至其上的所述膜部分，将此部分的一部分直接用气相蛋白质测序仪分析，从而测定N端氨基酸序列。此外，在300μl的还原缓冲溶液(8M盐酸胍、0.5M Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)、0.3％EDTA、2％乙腈)中浸泡剩余的膜，加入1mg二硫苏糖醇(DTT)，在氩气存在下于25℃进行约1小时的还原。向其中加入溶解在10μl 0.5N氢氧化钠溶液中的3.0mg一碘乙酸，并在黑暗条件下搅拌20分钟。取出PVDF膜，在用2％乙腈充分清洗后将其浸泡在包含0.5％聚乙烯吡咯烷酮-40的100mM乙酸中，并使其静止30分钟。其后，用水彻底清洗所述PVDF膜。由所述膜切下1mm2，将其浸泡在消化缓冲液(8％乙腈、90mM Tris-HCl缓冲液pH 9.0)中，向其中加入1pmol Acromobacter蛋白酶I(Wako Pure ChemicalsInduatries)。然后于室温消化所述酶15分钟。通过在C18柱(Wakosil ARII C18 300 2.0×150mm(Wako Pure Chemicals Induatries))上的反相高效液相层析分离所述消化产物，并获得每个亚单位的7个肽片段。
至于用于所述肽的洗脱溶剂，使用溶剂A(0.05％三氟乙酸)和溶剂B(2-丙醇/乙腈溶液7∶3，包含0.02％三氟乙酸)，并用2-50％线性浓度梯度的溶剂B以0.25ml/分钟的流速进行40分钟的洗脱。
分析得自新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶候选蛋白的肽片段的氨基酸序列。得自p60的片段和得自p14的片段分别命名为p60-AP和p14-AP。使用气相蛋白测序仪PPSO-10(Shimadzu)，采用Edman降解法根据说明书对获得的肽片段进行测序。
获得的部分氨基酸序列示于表1。
表1-内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶候选蛋白的部分氨基酸序列
p60
p60-AP-5         PSLQLQPDDK         (SEQ ID NO：17)
p60-AP-6    (K)  SYRNPEIYPtDQNIK    (SEQ ID NO：18)
p60-AP-8    (K)  FNVSSVALQPRVK      (SEQ ID NO：19)
p60-AP-9    (K)  MDRLFLCGgK         (SEQ ID NO：20)
                 S
p60-AP-11   (K)  GQRFNHREShDVETEI   (SEQ ID NO：21)
                 mal p lllt
p14
p14-AP-1    (K)  EGYISSSGSIDLSLN    (SEQ ID NO：22)
在表1描述的氨基酸序列中，由字母表的小写字体字母表示的氨基酸是在所述氨基酸序列中未测定的氨基酸。
因为应用在部分氨基酸序列上的Acromobacter蛋白酶I特异性切割赖氨酸残基的羧基侧，所以已将K(赖氨酸)记入在下文所述序列的N端侧的括号中。
因为所述p60-AP-5见于氨基酸序列的N端，所以去除括号中的K(赖氨酸)。
关于p60和p14的Acromobacter蛋白酶I消化产物，也用在线质量分析仪(PE Sciex API-III)连同在C18柱(GL Science Inertsil ODS-30.5×40mm)上的反相高效液相层析(Hitachi L6200)对分子量进行分析。分析结果示于表2。
表2通过LC/MS分析60kDa肽(p60)和14kDa肽(p14)的Lys-C消化产物的结果
p60   检测值   理想值     误差范围 对应序列  SEQIDNO：
AP-1：AP-2：AP-3：AP-4：AP-5：AP-6：AP-7：AP-8：AP-9：AP-10：AP-11：   950.501160.50733.251838.501141.001157.501774.75701.501544.501621.001444.75945.752655.002206.752335.00   950.471160.56733.411837.911140.591556.751774.94701.391543.791620.731444.83945.582655.332206.112335.16     +0.03-0.06-0.16+0.59+0.41+0.75-0.19+0.11+0.71+0.27-0.08+0.17-0.33+0.64-0.16 (K)NIQGNNYK(K)YSDYPPPPPK(K)LSLDASK(K)SYRNPEIYPTDQMK()PSLQLQPDDK…p60 N端(K)NTDGIFLNYWWK(K)GB*SLRYIYRTLLMK(K)LTVAB*H…p60 C端(K)PQLLLTHDMAGGYK(K)SMNELRDWTPDEK(K)FNVSSVALQPRVK(K)LAPVSFALK(K)GQRFNHRESHDVETEISIPLYK(K)ITSSLDB*DHGAFLGGTSLIIK(K)NELFFKNTDGIFLNYWWK  232425181726272829301931323334
p14   检测值   理想值     误差范围 对应序列  SEQIDNO：
AP-1：AP-2：AP-3：   888.751392.501541.501608.50   888.451392.761541.731608.84     +0.30-0.26-0.23-0.34 (K)IVIEAVNK()SSRIIQDLFWK…p14 N端(K)EGYISSSGSIDLSLN…p14 C端(K)TDSSRIIQDLFWK  35362237
*B代表羧甲基半胱氨酸。
在表2中，具有质量(M+H+)检测值701.50的片段为p60-AP-7，而检测值1541.50的片段几乎同p14-AP-3的分子量一样，并发现在该C端的氨基酸不是K(赖氨酸)。关于用Acromobacter蛋白酶I消化的所述片段，因为所述亚单位自身的片段而不是C端片段将由于所述底物对该酶的特异性而具有为赖氨酸(K)的C端氨基酸残基，所以这些肽片段明显是所述亚单位p60和p14的C端片段。
使用蛋白质数据库BLASTP对测定的p60和p14部分氨基酸序列进行同源性检索，结果表明获得的序列是新的。根据以上结果，对p60和p14进行基因克隆，选择所述p60和p14作为内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶候选物。
实施例5：构建冻土毛霉菌株cDNA文库。
首先，使用ISOGEN(Nippon Gene，Inc.)由5克在实施例2中获得的微生物中提取总的RNA。使用mRNA纯化试剂盒(PharmaciaBiotech)由提取的总的RNA中纯化mRNA。使用用于cDNA合成的SuperScriptTMλ***和λ克隆试剂盒(GIBCO BRL)，由所述mRNA合成cDNA，然后将其连接至SalI连接物，并最终连接至λZipLoxTMSalI-Not Arms(GIBCO BRL)。使用Gigapack III Gold Packaging Extract(Stratagene)进行包装，用于感染大肠杆菌Y1090菌株，从而构建所述cDNA文库。
实施例6：克隆新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶cDNA。
消化基于部分氨基酸序列p60-AP-5、p60-AP-6、p60-AP-11的PCR引物。这些序列示于下文。本文使用的符号全部基于IUPAC-IUB。
p60-AP-5
p60-AP-5F   5′CARTTRCARCCNGAYGAYAA 3′(有义引物)(SEQ ID NO：5)
p60-AP-6
p60-AP-6F   5′CCHACNGAYCARAAYATYAA 3′(有义引物)(SEQ ID NO：7)
p60-AP-6R   3′GGDTGNCTRGTYTTRTARTT 5′(反义引物)(SEQ ID NO：8)
p60-AP-11
p60-AP-11R  3′TTYCCDGTYGCDAARTTRGT 5′(反义引物)(SEQ ID NO：10)
通过酚法由冻土毛霉大量培养物中纯化基因组DNA，并在进行基因组PCR(94℃30秒，55℃1分钟，72℃1分钟，30个循环)时，证实特异性扩增的条带。关于p60，用组合的p60-AP-5F和p60-AP-11R引物获得1.7kb的PCR片段，用组合的p60-AP-5F和p60-AP-6R引物获得1.5kb的PCR片段，而用组合的p60-AP-6F和p60-AP-11R引物获得0.2kb的PCR片段。关于此片段，使用pCR-Script克隆试剂盒(Stratagene)将其亚克隆到pCR-Script Amp中。由限制酶消化分析可知，p60-AP-5F和p60-AP-11R的扩增片段包括p60-AP-5F和p60-AP-6R的扩增片段以及p60-AP-6F和p60-AP-11R的扩增片段。因此，使用PRISM Ready反应试剂盒(Applied Biosystems)和PRISM 377DNA测序仪(Applied Biosystems)测定p60-AP-5F和p60-AP-11R的扩增片段的核苷酸序列。使用DNASIS(Hitachi Software Engineering Co.，Ltd.)等进行基因分析。
结果，p60-AP-5F和p60-AP-11R的扩增片段包括测定的其它部分氨基酸序列。因此确定此片段为p60基因的一部分。于是基于所述PCR扩增片段的内部序列构建新DNA引物，然后使用AccessRT-PCR***(Promega)，并用在实施例5中获得的mRNA作为模板，(在和基因组PCR一样的条件下)进行RT-PCR。新构建的DNA引物的序列如下：
p60-AP-5NF  5′CACTTAAGTCTATGAATGAG 3′(有义引物)(SEQ ID NO：13)
p60-AP-6NR  3′CGATAGCTTTAGGTCTCTAA 5′(反义引物)(SEQ ID NO：14)
结果，扩增了约1.2kb的片段。在对扩增的片段测序时发现已经获得了不包括内含子的片段。因此，使用此片段作为探针进行cDNA克隆。使用Megaprime DNA标记***(Amersham)用α-32PdCTP(110TBq/mmol)进行标记。
通过噬菌斑杂交由在实施例5中获得的cDNA文库得到全长基因。结果，由200,000噬菌斑中获得5个阳性克隆。其中4个克隆进行二次筛选，从而获得单一噬菌斑。此外，用由所述噬菌斑获得的噬菌体流体感染大肠杆菌DH10B，并由所述噬菌体回收衍生自pZL1的质粒。对这些克隆进行限制酶分析，并对包含最长上游区的克隆进行核苷酸序列分析。此质粒称为pZL-Endo(图2)。
测定***的约2.3kb的SalI-Not I片段的核苷酸序列。换言之，将所述限制片段亚克隆到pBluescript II KS+(Stratagene)或pUC118(Takara Shuzo)中，并通过用外切核酸酶III和绿豆核酸酶产生连续的缺失突变体，构建具有各种缺失突变的质粒，以及用DNA测序仪测定包括2370bp的Sal I-Not I片段的序列(图3-4，SEQ ID NO：1)。
对所述结构基因的预定区进行分析，发现存在编码由744个氨基酸残基组成的氨基酸序列(推断分子量85kDa，图5-7，SEQ ID NO：2)的可读框，此氨基酸序列包含所有测定的p60和p14的部分氨基酸序列。因为在N端侧的p60-AP-5的下一个氨基酸不是赖氨酸而是蛋氨酸，所以证实编码此蛋氨酸的ATG是翻译的起始密码子。因此已经明确，本发明所述酶的N端是脯氨酸。
在另一方面，正如定性分析结果一样，发现p14-AP-3位于本发明所述基因编码的蛋白的C端。此外，结合质量分析的结果可知，至少一种类型的p14的N端是丝氨酸，该氨基酸位于SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列中的位置628。
根据以上所述，显然本发明所述基因的5′区编码p60，而3′区编码p14。因为在所述氨基酸序列中没有发现N端信号序列，所以认为本发明所述酶是胞内蛋白。然而，由于在图1中存在多个条带，故认为本发明所述酶受到由细胞裂解产生的蛋白酶作用的影响。
实施例7：构建所述内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶表达载体
在此实施例中，构建用于酿酒酵母的互补于TRP1基因的表达载体，它包括内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因和GAPDH基因启动子-PGK终止子。
为获得在实施例3中证实的编码744个氨基酸的可读框，合成基于与所述N端和C端的氨基酸序列等价的DNA序列的DNA引物，所述氨基酸序列的两个末端都已经加入Not I位点，用pZL-Endo作为模板进行PCR，从而获得扩增的片段。以下是所述有义和反义引物的序列：
Endo-Not-F(有义引物)
5′GGGGCGGCCGCTTTTATTTTACATAAATATGCCTTCACTTC3′(SEQ ID NO：15)
Endo-Not-R(反义引物)
5′CCCGCGGCCGCCTAGTTTAATGACAAATCTATGCTACC3′(SEQ ID NO：16)
在通过琼脂糖凝胶电泳分离后，回收扩增的片段，并使用Prep-A-Gene DNA纯化***(Bio-Rad)对其纯化。此外，在用Not I消化该片段后，对其纯化并将其***到pBluescript II KS+的Not I中，从而产生pBlue-Endo-Not。
因为新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因是衍生自霉菌的基因，所以认为其适于在酵母中表达。用表达载体pG-3构建用trp1基因作为选择标记的用于酿酒酵母的表达质粒(Methods in Enzymology，第194卷，第389页)，所述trp1基因包含酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GADPH)启动子、3-磷酸甘油酸激酶(PGK)基因终止子和色氨酸合成基因TRP1基因。通过用BamHI消化pG-3，用Klenow处理平端化，接着添加Not I连接体，构建所述pG-3-Not。
用Not I消化上述pBlue-Endo-Not，并通过琼脂糖凝胶电泳分离和纯化约2.3kb的***片段。此片段于pG-3-Not的Not I位点***，由此构建pG-Endo-SC(图8)。
实施例8：在酿酒酵母中表达新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶
使用酵母菌酿酒酵母YPH500菌株的pep4基因破坏的菌株(Stratagene)作为宿主。利用Sikorski，R.S.和Hieter，P的方法(Genetics第122卷19-27(1989))生产pep4基因破坏的菌株。用10μg pGEndo-SC转化所述菌株。用乙酸锂法(参见WO95/32289)进行转化，并在不包括色氨酸的培养平板(0.67％酵母含氮碱基，0.5％酪蛋白氨基酸、1％葡萄糖)上选择转化体。
对所述转化体的胞内新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶活性进行证实。所述转化细胞于30℃在5ml YPD培养基(1％酵母提取物、2％聚胨、2％葡萄糖)中培养2天，于4℃以1500g进行5分钟的离心，由此分离上清液和细胞物质。用蒸馏水清洗所述细胞物质。向所述细胞物质中加入10μl的50mM硫酸钾缓冲液(pH 6.0)和5mM EDTA的混合物，并充分悬浮。此外，加入50mg的玻璃珠，并在剧烈搅拌后离心，取出上清液作为细胞提取物。
使用DNS-GP作为底物，通过TLC或HPLC进行活性检测。TLC的结果示于图9。如同所述样品和纯化自冻土毛霉培养上清液的所述酶反应一样，由pGEndo-SC产物获得和丹磺酰化天冬酰胺酰乙酰葡糖胺(DNS-Asn-GlcNAc)相同的峰。另一方面，没有从用pG-3-Not转化的阴性对照菌株的培养上清液中检测到对应于DNS-Asn-GlcNAc的峰。将所述pGEndo-SC细胞提取物浓缩10倍，脱盐，与DNS-GP反应，并在上述条件下使用HPLC分离对应于DNS-Asn-GlcNAc的峰。用蒸发器浓缩分离的样品，紧接着进行质谱分析。结果证实，质谱结果和DNS-Asn-GlcNAc结果相匹配。因此由所述pGEndo-SC***片段编码的基因产物明显是新的内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。
表3显示了每升培养物的本发明所述新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的活性(产物量)。该活性是冻土毛霉值的48倍。
      表3新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶活性
                                           活性(单位/升)
冻土毛霉培养上清液                              0.9
新内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因引入其中的      43.2
酿酒酵母的培养液*
*由所述培养物收集细胞后，用玻璃珠破碎所述细胞。在采用离心分离上清液后，检测所述上清液的活性，并由此值计算每培养体积的活性。
本说明书加入了在日本专利申请第10-141717号中的说明书和/或附图中描述的内容，本申请的优先权以该专利申请为依据。
本文引用的所有公开出版物、专利和专利申请都通过引用整体结合到本文中。
工业适用性
本发明提供内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶、内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因、包含所述基因的重组质粒、用所述质粒转化的生物，以及生产内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的方法。
通过将包含本发明所述基因的载体引入到宿主中，并使所述基因表达，可以有效并大规模地生产内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。
本发明所述酶是分析和测定糖链和糖链修饰的工业上重要的酶。通过本发明获得的转化体产生大量题述酶，并对使用这些酶的工业产生巨大贡献。
序列表独立文本
SEQ ID NO：4：  内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的部分氨基酸序列
SEQ ID NO：5：  根据内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的部分氨基酸序列
                设计的寡核苷酸
SEQ ID NO：5：  n表示a、g、c或t(位置：12)
SEQ ID NO：6：  内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的部分氨基酸序列
SEQ ID NO：7：  根据内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的部分氨基酸序列
                设计的寡核苷酸
SEQ ID NO：7：  n表示a、g、c或t(位置：6)
SEQ ID NO：8：  根据内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的部分氨基酸序列
                设计的寡核苷酸
SEQ ID NO：8： n表示a、g、c或t(位置：15)
SEQ ID NO：9： 内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的部分氨基酸序列
SEQ ID NO：10：根据内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的部分氨基酸序列
               设计的寡核苷酸
SEQ ID NO：11：根据内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的5′末端区设
               计的寡核苷酸序列
SEQ ID NO：12：根据内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的3′末端区设
               计的寡核苷酸序列
SEQ ID NO：13：根据内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的核苷酸序列
               设计的寡核苷酸
SEQ ID NO：14：根据内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的核苷酸序列
                 设计的寡核苷酸
SEQ ID NO：15：根据内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的核苷酸序列
               设计的寡核苷酸
SEQ ID NO：16：根据内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的核苷酸序列
               设计的寡核苷酸
SEQ ID NO：20：Xaa表示Met或Ser(位置：2)
SEQ ID NO：21：Xaa表示Gly或Met(位置：2)
SEQ ID NO：21：Xaa表示Gln或Ala(位置：3)
SEQ ID NO：21：Xaa表示Arg或Leu(位置：4)
SEQ ID NO：21：Xaa表示Asn或Pro(位置：6)
SEQ ID NO：21：Xaa表示Arg或Leu(位置：8)
SEQ ID NO：21：Xaa表示Glu或Leu(位置：9)
SEQ ID NO：21：Xaa表示Ser或Leu(位置：10)
SEQ ID NO：21：Xaa表示His或Thr(位置：11)
SEQ ID NO：27：羧甲基半胱氨酸(位置：3)
SEQ ID NO：28：羧甲基半胱氨酸(位置：6)
SEQ ID NO：33：羧甲基半胱氨酸(位置：8)
                          序列表
<110>KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA
<120>内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因
<130>PH-657-PCT
<140>
<141>
<150>JP 98/141717
<151>1998年5月22日
<160>37
<170>PatentIn，版本2.0
<210>1
<211>2369
<212>DNA
<213>冻土毛霉
<400>1
gtcgacccac gcgtccgcgg acgcgtgggc ggacgcgtgg gcggacgcgt gggttttatt 60
ttacataaat atgccttcac ttcaattgca acctgatgac aaactagcac ctgtttcttt 120
tgcacttaag tctatgaatg agttgaggga ctggacgcca gacgaaaaga taaagtttaa 180
cgtttcaagc gtggcactac agcctcgtgt gaaaaacgcc ctgaaacctc aattattgtt 240
aactcatgat atggcaggag gatataaaga agataaaaat attcaaggaa acaattataa 300
agacatttat aacattcaat attggcattt agctgatact tttgtatatt tctctcatga 360
gcgagttagc attcctccag tcaattggac aaatgcttgt catagaaatg gtgtaaagtg 420
tttaggtact tttttagtag aaggaaataa ccaaatgcat gaaatggaag ccttgcttca 480
cggtccacct ttacttaata acactgacga ccctatgaga ttatggagtc cgtattatgc 540
agaccaatta gttgctattg ctaaacacta tggttttgat ggctggttgt tcaatattga 600
atgcgaattc tttccttttc ctacaaatcc aaaattcaaa gctgaagagt tggcaaagtt 660
tctacactat tttaaggaaa aattgcataa cgaaatacct ggatctcaac tcatttggta 720
cgacagcatg acaaatgaag gagaaatcca ctggcagaac cagctcacat ggaaaaatga 780
gttatttttt aaaaacacgg atggtatttt tttgaattat tggtggaaaa aagaataccc 840
tgaaatggcg cgtagagtag ctgaaggaat aggtagatca ggtttagaag tttattttgg 900
tacagatgta tggggaaggc atacttatgg tggcggtggt ttcaaatcat ataagggtgt 960
aaaaactgcc tactctgcaa tgacatcttc tgcattattt ggtatggcat ggacatacga 1020
gcatttcgaa aagtctgaat ttgaaaagat ggatcgtttg ttttggtgtg gtggtaaata 1080
ctctgactat cctcccccac ctcctaaaaa cccagatgac gaaaaagaag tagaaagcga 1140
tgatagtgaa gatgagctca tgtacggaca caagaaaggt attgctgaca cggtagaatc 1200
tattcctgta ccaggaacag attggtttgt taccaatttt gatagggggt ttggaaatag 1260
gttttattat agaggaaaga gattactttc tcagccttgg tcccatttat cgcatcaagc 1320
tattctcccc aataaaagct atcgaaatcc agagatttat cccactgatc aaaacattaa 1380
aatcactagt tctctcgatt gcgatcatgg agcttttctt ggtggaacct cgcttattat 1440
caaaggccaa cgtttcaatc atagagaatc gcatgatgtt gaaactgaaa ttagtatacc 1500
tctgtataag ctttcattag atgctagtaa aggatgctca ttgcgttata tttatagaac 1560
tttgttgatg aaagatgtaa agttgacagt agcatgtcac ttttcgttaa aaacaaacga 1620
ctcagttaat ttcttcaagg tatggcagcc agatgaaaat ttctcttttg aatatgatga 1680
tggaatgaga gccactgtta caactgaaaa ttctaccgaa agcagatgct ttttattacg 1740
tacaacagaa gaagatacag gagaaaatga ttggataaca aaaactatta atgtgcctgc 1800
tgttccagaa ggaagtcaat tatacattac aagacttgaa gtgagcgtag tattagatac 1860
agctggttta gtaggtcttg ttaatcaagt tattgcttgc ttgggatata ttagcatcat 1920
accaactata aattctggaa taaaaacaga ttcatcacgc attattcagg atctcttttg 1980
gaaagatcag aaatatacca aaatcggaaa agaaagttta gacgacatag ctcaagaaga 2040
agttcataga tattatggaa cattgaactg ggaaaacaca gcaaatgtag taaacgcttg 2100
ggaggaaata gattactaca acgtttttta caaagaaagt gacgactctg caactcgcat 2160
ctttttagga acagcattct gtaatcaatt tcgtgtatct ggtttagata ttattttatc 2220
taagctacca aagatagtta ttgaagctgt taacaaagaa ggatacatct cttcaagtgg 2280
tagcatagat ttgtcattaa actaggactt gaaataaaat attatgataa agaaaaaaaa 2340
aaaaaaaaaa aaaaaaaaag ggcggccgc                                   2369
<210>2
<211>2235
<212>DNA
<213>冻土毛霉
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(2235)
<400>2
atg cct tca ctt caa ttg caa cct gat gac aaa cta gca cct gtt tct    48
Met Pro Ser Leu Gln Leu Gln Pro Asp Asp Lys Leu Ala Pro Val Ser
  1               5                  10                  15
ttt gca ctt aag tct atg aat gag ttg agg gac tgg acg cca gac gaa    96
Phe Ala Leu Lys Ser Met Asn Glu Leu Arg Asp Trp Thr Pro Asp Glu
             20                  25                  30
aag ata aag ttt aac gtt tca agc gtg gca cta cag cct cgt gtg aaa    144
Lys Ile Lys Phe Asn Val Ser Ser Val Ala Leu Gln Pro Arg Val Lys
         35                  40                  45
aac gcc ctg aaa cct caa tta ttg tta act cat gat atg gca gga gga    192
Asn Ala Leu Lys Pro Gln Leu Leu Leu Thr His Asp Met Ala Gly Gly
     50                  55                  60
tat aaa gaa gat aaa aat att caa gga aac aat tat aaa gac att tat    240
Tyr Lys Glu Asp Lys Asn Ile Gln Gly Asn Asn Tyr Lys Asp Ile Tyr
 65                  70                  75                  80
aac att caa tat tgg cat tta gct gat act ttt gta tat ttc tct cat    288
Asn Ile Gln Tyr Trp His Leu Ala Asp Thr Phe Val Tyr Phe Ser His
                 85                  90                  95
gag cga gtt agc att cct cca gtc aat tgg aca aat gct tgt cat aga    336
Glu Arg Val Ser Ile Pro Pro Val Asn Trp Thr Asn Ala Cys His Arg
            100                 105                 110
aat ggt gta aag tgt tta ggt act ttt tta gta gaa gga aat aac caa    384
Asn Gly Val Lys Cys Leu Gly Thr Phe Leu Val Glu Gly Asn Asn Gln
        115                 120                 125
atg cat gaa atg gaa gcc ttg ctt cac ggt cca cct tta ctt aat aac    432
Met His Glu Met Glu Ala Leu Leu His Gly Pro Pro Leu Leu Asn Asn
    130                 135                 140
act gac gac cct atg aga tta tgg agt ccg tat tat gca gac caa tta    480
Thr Asp Asp Pro Met Arg Leu Trp Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Gln Leu
145                 150                 155                 160
gtt gct att gct aaa cac tat ggt ttt gat ggc tgg ttg ttc aat att    528
Val Ala Ile Ala Lys His Tyr Gly Phe Asp Gly Trp Leu Phe Asn Ile
                165                 170                 175
gaa tgc gaa ttc ttt cct ttt cct aca aat cca aaa ttc aaa gct gaa    576
Glu Cys Glu Phe Phe Pro Phe Pro Thr Asn Pro Lys Phe Lys Ala Glu
            180                 185                 190
gag ttg gca aag ttt cta cac tat ttt aag gaa aaa ttg cat aac gaa    624
Glu Leu Ala Lys Phe Leu His Tyr Phe Lys Glu Lys Leu His Asn Glu
        195                 200                 205
ata cct gga tct caa ctc att tgg tac gac agc atg aca aat gaa gga    672
Ile Pro Gly Ser Gln Leu Ile Trp Tyr Asp Ser Met Thr Asn Glu Gly
    210                 215                 220
gaa atc cac tgg cag aac cag ctc aca tgg aaa aat gag tta ttt ttt    720
Glu Ile His Trp Gln Asn Gln Leu Thr Trp Lys Asn Glu Leu Phe Phe
225                 230                 235                 240
aaa aac acg gat ggt att ttt ttg aat tat tgg tgg aaa aaa gaa tac    768
Lys Asn Thr Asp Gly Ile Phe Leu Asn Tyr Trp Trp Lys Lys Glu Tyr
                245                 250                 255
cct gaa atg gcg cgt aga gta gct gaa gga ata ggt aga tca ggt tta    816
Pro Glu Met Ala Arg Arg Val Ala Glu Gly Ile Gly Arg Ser Gly Leu
            260                 265                 270
gaa gtt tat ttt ggt aca gat gta tgg gga agg cat act tat ggt ggc    864
Glu Val Tyr Phe Gly Thr Asp Val Trp Gly Arg His Thr Tyr Gly Gly
        275                 280                 285
ggt ggt ttc aaa tca tat aag ggt gta aaa act gcc tac tct gca atg    912
Gly Gly Phe Lys Ser Tyr Lys Gly Val Lys Thr Ala Tyr Ser Ala Met
    290                 295                 300
aca tct tct gca tta ttt ggt atg gca tgg aca tac gag cat ttc gaa    960
Thr Ser Ser Ala Leu Phe Gly Met Ala Trp Thr Tyr Glu His Phe Glu
305                 310                 315                 320
aag tct gaa ttt gaa aag atg gat cgt ttg ttt tgg tgt ggt ggt aaa    1008
Lys Ser Glu Phe Glu Lys Met Asp Arg Leu Phe Trp Cys Gly Gly Lys
                325                 330                 335
tac tct gac tat cct ccc cca cct cct aaa aac cca gat gac gaa aaa    1056
Tyr Ser Asp Tyr Pro Pro Pro Pro Pro Lys Asn Pro Asp Asp Glu Lys
            340                 345                 350
gaa gta gaa agc gat gat agt gaa gat gag ctc atg tac gga cac aag    1104
Glu Val Glu Ser Asp Asp Ser Glu Asp Glu Leu Met Tyr Gly His Lys
        355                 360                 365
aaa ggt att gct gac acg gta gaa tct att cct gta cca gga aca gat    1152
Lys Gly Ile Ala Asp Thr Val Glu Ser Ile Pro Val Pro Gly Thr Asp
    370                 375                 380
tgg ttt gtt acc aat ttt gat agg ggg ttt gga aat agg ttt tat tat    1200
Trp Phe Val Thr Asn Phe Asp Arg Gly Phe Gly Asn Arg Phe Tyr Tyr
385                 390                 395                 400
aga gga aag aga tta ctt tct cag cct tgg tcc cat tta tcg cat caa    1248
Arg Gly Lys Arg Leu Leu Ser Gln Pro Trp Ser His Leu Ser His Gln
                405                 410                 415
gct att ctc ccc aat aaa agc tat cga aat cca gag att tat ccc act    1296
Ala Ile Leu Pro Asn Lys Ser Tyr Arg Asn Pro Glu Ile Tyr Pro Thr
            420                 425                 430
gat caa aac att aaa atc act agt tct ctc gat tgc gat cat gga gct    1344
Asp Gln Asn Ile Lys Ile Thr Ser Ser Leu Asp Cys Asp His Gly Ala
        435                 440                 445
ttt ctt ggt gga acc tcg ctt att atc aaa ggc caa cgt ttc aat cat    1392
Phe Leu Gly Gly Thr Ser Leu Ile Ile Lys Gly Gln Arg Phe Asn His
    450                 455                 460
aga gaa tcg cat gat gtt gaa act gaa att agt ata cct ctg tat aag    1440
Arg Glu Ser His Asp Val Glu Thr Glu Ile Ser Ile Pro Leu Tyr Lys
465                 470                 475                 480
ctt tca tta gat gct agt aaa gga tgc tca ttg cgt tat att tat aga    1488
Leu Ser Leu Asp Ala Ser Lys Gly Cys Ser Leu Arg Tyr Ile Tyr Arg
                485                 490                 495
act ttg ttg atg aaa gat gta aag ttg aca gta gca tgt cac ttt tcg    1536
Thr Leu Leu Met Lys Asp Val Lys Leu Thr Val Ala Cys His Phe Ser
            500                 505                 510
tta aaa aca aac gac tca gtt aat ttc ttc aag gta tgg cag cca gat    1584
Leu Lys Thr Asn Asp Ser Val Asn Phe Phe Lys Val Trp Gln Pro Asp
        515                 520                 525
gaa aat ttc tct ttt gaa tat gat gat gga atg aga gcc act gtt aca    1632
Glu Asn Phe Ser Phe Glu Tyr Asp Asp Gly Met Arg Ala Thr Val Thr
    530                 535                 540
act gaa aat tct acc gaa agc aga tgc ttt tta tta cgt aca aca gaa    1680
Thr Glu Asn Ser Thr Glu Ser Arg Cys Phe Leu Leu Arg Thr Thr Glu
545                 550                 555                 560
gaa gat aca gga gaa aat gat tgg ata aca aaa act att aat gtg cct    1728
Glu Asp Thr Gly Glu Asn Asp Trp Ile Thr Lys Thr Ile Asn Val Pro
                565                 570                 575
gct gtt cca gaa gga agt caa tta tac att aca aga ctt gaa gtg agc    1776
Ala Val Pro Glu Gly Ser Gln Leu Tyr Ile Thr Arg Leu Glu Val Ser
            580                 585                 590
gta gta tta gat aca gct ggt tta gta ggt ctt gtt aat caa gtt att    1824
Val Val Leu Asp Thr Ala Gly Leu Val Gly Leu Val Asn Gln Val Ile
        595                 600                 605
gct tgc ttg gga tat att agc atc ata cca act ata aat tct gga ata    1872
Ala Cys Leu Gly Tyr Ile Ser Ile Ile Pro Thr Ile Asn Ser Gly Ile
    610                 615                 620
aaa aca gat tca tca cgc att att cag gat ctc ttt tgg aaa gat cag    1920
Lys Thr Asp Ser Ser Arg Ile Ile Gln Asp Leu Phe Trp Lys Asp Gln
625                 630                 635                 640
aaa tat acc aaa atc gga aaa gaa agt tta gac gac ata gct caa gaa    1968
Lys Tyr Thr Lys Ile Gly Lys Glu Ser Leu Asp Asp Ile Ala Gln Glu
                645                 650                 655
gaa gtt cat aga tat tat gga aca ttg aac tgg gaa aac aca gca aat    2016
Glu Val His Arg Tyr Tyr Gly Thr Leu Asn Trp Glu Asn Thr Ala Asn
            660                 665                 670
gta gta aac gct tgg gag gaa ata gat tac tac aac gtt ttt tac aaa    2064
Val Val Asn Ala Trp Glu Glu Ile Asp Tyr Tyr Asn Val Phe Tyr Lys
        675                 680                 685
gaa agt gac gac tct gca act cgc atc ttt tta gga aca gca ttc tgt    2112
Glu Ser Asp Asp Ser Ala Thr Arg Ile Phe Leu Gly Thr Ala Phe Cys
    690                 695                 700
aat caa ttt cgt gta tct ggt tta gat att att tta tct aag cta cca    2160
Asn Gln Phe Arg Val Ser Gly Leu Asp Ile Ile Leu Ser Lys Leu Pro
705                 710                 715                 720
aag ata gtt att gaa gct gtt aac aaa gaa gga tac atc tct tca agt    2208
Lys Ile Val Ile Glu Ala Val Asn Lys Glu Gly Tyr Ile Ser Ser Ser
                725                 730                 735
ggt agc ata gat ttg tca tta aac tag                                2235
Gly Ser Ile Asp Leu Ser Leu Asn
            740                 745
<210>3
<211>744
<212>PRT
<213>冻土毛霉
<400>3
Met Pro Ser Leu Gln Leu Gln Pro Asp Asp Lys Leu Ala Pro Val Ser
  1               5                  10                  15
Phe Ala Leu Lys Ser Met Asn Glu Leu Arg Asp Trp Thr Pro Asp Glu
             20                  25                  30
Lys Ile Lys Phe Asn Val Ser Ser Val Ala Leu Gln Pro Arg Val Lys
         35                  40                  45
Asn Ala Leu Lys Pro Gln Leu Leu Leu Thr His Asp Met Ala Gly Gly
     50                  55                  60
Tyr Lys Glu Asp Lys Asn Ile Gln Gly Asn Asn Tyr Lys Asp Ile Tyr
 65                  70                  75                  80
Asn Ile Gln Tyr Trp His Leu Ala Asp Thr Phe Val Tyr Phe Ser His
                 85                  90                  95
Glu Arg Val Ser Ile Pro Pro Val Asn Trp Thr Asn Ala Cys His Arg
            100                 105                 110
Asn Gly Val Lys Cys Leu Gly Thr Phe Leu Val Glu Gly Asn Asn Gln
        115                 120                 125
Met His Glu Met Glu Ala Leu Leu His Gly Pro Pro Leu Leu Asn Asn
    130                 135                 140
Thr Asp Asp Pro Met Arg Leu Trp Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Gln Leu
145                 150                 155                 160
Val Ala Ile Ala Lys His Tyr Gly Phe Asp Gly Trp Leu Phe Asn Ile
                165                 170                 175
Glu Cys Glu Phe Phe Pro Phe Pro Thr Asn Pro Lys Phe Lys Ala Glu
            180                 185                 190
Glu Leu Ala Lys Phe Leu His Tyr Phe Lys Glu Lys Leu His Asn Glu
        195                 200                 205
Ile Pro Gly Ser Gln Leu Ile Trp Tyr Asp Ser Met Thr Asn Glu Gly
    210                 215                 220
Glu Ile His Trp Gln Asn Gln Leu Thr Trp Lys Asn Glu Leu Phe Phe
225                 230                 235                 240
Lys Asn Thr Asp Gly Ile Phe Leu Asn Tyr Trp Trp Lys Lys Glu Tyr
                245                 250                 255
Pro Glu Met Ala Arg Arg Val Ala Glu Gly Ile Gly Arg Ser Gly Leu
            260                 265                 270
Glu Val Tyr Phe Gly Thr Asp Val Trp Gly Arg His Thr Tyr Gly Gly
        275                 280                 285
Gly Gly Phe Lys Ser Tyr Lys Gly Val Lys Thr Ala Tyr Ser Ala Met
    290                 295                 300
Thr Ser Ser Ala Leu Phe Gly Met Ala Trp Thr Tyr Glu His Phe Glu
305                 310                 315                 320
Lys Ser Glu Phe Glu Lys Met Asp Arg Leu Phe Trp Cys Gly Gly Lys
                325                 330                 335
Tyr Ser Asp Tyr Pro Pro Pro Pro Pro Lys Asn Pro Asp Asp Glu Lys
            340                 345                 350
Glu Val Glu Ser Asp Asp Ser Glu Asp Glu Leu Met Tyr Gly His Lys
        355                 360                 365
Lys Gly Ile Ala Asp Thr Val Glu Ser Ile Pro Val Pro Gly Thr Asp
    370                 375                 380
Trp Phe Val Thr Asn Phe Asp Arg Gly Phe Gly Asn Arg Phe Tyr Tyr
385                 390                 395                 400
Arg Gly Lys Arg Leu Leu Ser Gln Pro Trp Ser His Leu Ser His Gln
                405                 410                 415
Ala Ile Leu Pro Asn Lys Ser Tyr Arg Asn Pro Glu Ile Tyr Pro Thr
            420                 425                 430
Asp Gln Asn Ile Lys Ile Thr Ser Ser Leu Asp Cys Asp His Gly Ala
        435                 440                 445
Phe Leu Gly Gly Thr Ser Leu Ile Ile Lys Gly Gln Arg Phe Asn His
    450                 455                 460
Arg Glu Ser His Asp Val Glu Thr Glu Ile Ser Ile Pro Leu Tyr Lys
465                 470                 475                 480
Leu Ser Leu Asp Ala Ser Lys Gly Cys Ser Leu Arg Tyr Ile Tyr Arg
                485                 490                 495
Thr Leu Leu Met Lys Asp Val Lys Leu Thr Val Ala Cys His Phe Ser
            500                 505                 510
Leu Lys Thr Asn Asp Ser Val Asn Phe Phe Lys Val Trp Gln Pro Asp
        515                 520                 525
Glu Asn Phe Ser Phe Glu Tyr Asp Asp Gly Met Arg Ala Thr Val Thr
    530                 535                 540
Thr Glu Asn Ser Thr Glu Ser Arg Cys Phe Leu Leu Arg Thr Thr Glu
545                 550                 555                 560
Glu Asp Thr Gly Glu Asn Asp Trp Ile Thr Lys Thr Ile Asn Val Pro
                565                 570                 575
Ala Val Pro Glu Gly Ser Gln Leu Tyr Ile Thr Arg Leu Glu Val Ser
            580                 585                 590
Val Val Leu Asp Thr Ala Gly Leu Val Gly Leu Val Asn Gln Val Ile
        595                 600                 605
Ala Cys Leu Gly Tyr Ile Ser Ile Ile Pro Thr Ile Asn Ser Gly Ile
    610                 615                 620
Lys Thr Asp Ser Ser Arg Ile Ile Gln Asp Leu Phe Trp Lys Asp Gln
625                 630                 635                 640
Lys Tyr Thr Lys Ile Gly Lys Glu Ser Leu Asp Asp Ile Ala Gln Glu
                645                 650                 655
Glu Val His Arg Tyr Tyr Gly Thr Leu Asn Trp Glu Asn Thr Ala Asn
            660                 665                 670
Val Val Asn Ala Trp Glu Glu Ile Asp Tyr Tyr Asn Val Phe Tyr Lys
        675                 680                 685
Glu Ser Asp Asp Ser Ala Thr Arg Ile Phe Leu Gly Thr Ala Phe Cys
    690                 695                 700
Asn Gln Phe Arg Val Ser Gly Leu Asp Ile Ile Leu Ser Lys Leu Pro
705                 710                 715                 720
Lys Ile Val Ile Glu Ala Val Asn Lys Glu Gly Tyr Ile Ser Ser Ser
                725                 730                 735
Gly Ser Ile Asp Leu Ser Leu Asn
            740
<210>4
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的部分氨基酸序列
<400>4
Pro Ser Leu Gln Leu Gln Pro Asp Asp Lys
  1               5                  10
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的部分氨基酸序列设计的寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>12
<223>n代表a、g、c或t
<400>5
carttrcarc cngaygayaa                                            20
<210>6
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的部分氨基酸序列
<400>6
Ser Tyr Arg Asn Pro Glu Ile Tyr Pro Thr Asp Gln Asn Ile Lys
  1               5                  10                  15
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的部分氨基酸序列设计的寡
     核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>6
<223>n代表a、g、c或t
<400>7
cchacngayc araayatyaa                                            20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的部分氨基酸序列设计的寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>15
<223>n代表a、g、c或t
<400>8
ttratrttyt grtcngtdgg                                            20
<210>9
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的部分氨基酸序列
<400>9
Gly Gln Arg Phe Asn His Arg Glu Ser His Asp Val Glu Thr Glu Ile
  1               5                  10                  15
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的部分氨基酸序列设计的寡核苷酸
<400>10
tgrttraadc gytgdccytt                                            20
<210>11
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的5′末端区的寡核苷酸序列
<400>11
atgccttcac ttcaattgca acc                                        23
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的3′末端区的寡核苷酸序列
<400>12
ctagtttaat gacaaatcta tgc                                        23
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的序列设计的寡核苷酸
<400>13
cacttaagtc tatgaatgag                                            20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的序列设计的寡核苷酸
<400>14
aatctctgga tttcgatagc                                            20
<210>15
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的序列设计的寡核苷酸
<400>15
ggggcggccg cttttatttt acataaatat gccttcactt c                    41
<210>16
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的序列设计的寡核苷酸
<400>16
cccgcggccg cctagtttaa tgacaaatct atgctacc                        38
<210>17
<211>10
<212>PRT
<213>冻土毛霉
<400>17
Pro Ser Leu Gln Leu Gln Pro Asp Asp Lys
  1               5                  10
<210>18
<211>16
<212>PRT
<213>冻土毛霉
<400>18
Lys Ser Tyr Arg Asn Pro Glu Ile Tyr Pro Thr Asp Gln Asn Ile Lys
  1               5                  10                  15
<210>19
<211>14
<212>PRT
<213>冻土毛霉
<400>19
Lys Phe Asn Val Ser Ser Val Ala Leu Gln Pro Arg Val Lys
  1               5                  10
<210>20
<211>11
<212>PRT
<213>冻土毛霉
<220>
<221>肽
<222>2
<223>Xaa代表Met或Ser
<400>20
Lys Xaa Asp Arg Leu Phe Leu Cys Gly Gly Lys
  1               5                  10
<210>21
<211>17
<212>PRT
<213>冻土毛霉
<220>
<221>肽
<222>2
<223>Xaa代表Gly或Met
<220>
<221>肽
<222>3
<223>Xaa代表Gln或Ala
<220>
<221>肽
<222>4
<223>Xaa代表Arg或Leu
<220>
<221>肽
<222>6
<223>Xaa代表Asn或Pro
<220>
<221>肽
<222>8
<223>Xaa代表Arg或Leu
<220>
<221>肽
<222>9
<223>Xaa代表Glu或Leu
<220>
<221>肽
<222>10
<223>Xaa代表Ser或Leu
<220>
<221>肽
<222>11
<223>Xaa代表His或Thr
<400>21
Lys Xaa Xaa Xaa Phe Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Val Glu Thr Glu
  1               5                  10                  15
Ile
<210>22
<211>16
<212>PRT
<213>冻土毛霉
<400>22
Lys Glu Gly Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ile Asp Leu Ser Leu Asn
  1               5                  10                  15
<210>23
<211>9
<212>PRT
<213>冻土毛霉
<400>23
Lys Asn Ile Gln Gly Asn Asn Tyr Lys
  1               5
<210>24
<211>11
<212>PRT
<213>冻土毛霉
<400>24
Lys Tyr Ser Asp Tyr Pro Pro Pro Pro Pro Lys
  1               5                  10
<210>25
<211>8
<212>PRT
<213>冻土毛霉
<400>25
Lys Leu Ser Leu Asp Ala Ser Lys
  1               5
<210>26
<211>13
<212>PRT
<213>冻土毛霉
<400>26
Lys Asn Thr Asp Gly Ile Phe Leu Asn Tyr Trp Trp Lys
  1               5                  10
<210>27
<211>15
<212>PRT
<213>冻土毛霉
<220>
<221>肽
<222>3
<223>羧甲基半胱氨酸
<400>27
Lys Gly Cys Ser Leu Arg Tyr Ile Tyr Arg Thr Leu Leu Met Lys
  1               5                  10                  15
<210>28
<211>7
<212>PRT
<213>冻土毛霉
<220>
<221>肽
<222>6
<223>羧甲基半胱氨酸
<400>28
Lys Leu Thr Val Ala Cys His
  1               5
<210>29
<211>15
<212>PRT
<213>冻土毛霉
<400>29
Lys Pro Gln Leu Leu Leu Thr His Asp Met Ala Gly Gly Tyr Lys
  1               5                  10                  15
<210>30
<211>14
<212>PRT
<213>冻土毛霉
<400>30
Lys Ser Met Asn Glu Leu Arg Asp Trp Thr Pro Asp Glu Lys
  1               5                  10
<210>31
<211>10
<212>PRT
<213>冻土毛霉
<400>31
Lys Leu Ala Pro Val Ser Phe Ala Leu Lys
  1               5                  10
<210>32
<211>23
<212>PRT
<213>冻土毛霉
<400>32
Lys Gly Gln Arg Phe Asn His Arg Glu Ser His Asp Val Glu Thr Glu
  1               5                  10                  15
Ile Ser Ile Pro Leu Tyr Lys
             20
<210>33
<211>22
<212>PRT
<213>冻土毛霉
<220>
<221>肽
<222>8
<223>羧甲基半胱氨酸
<400>33
Lys Ile Thr Ser Ser Leu Asp Cys Asp His Gly Ala Phe Leu Gly Gly
  1               5                  10                  15
Thr Ser Leu Ile Ile Lys
             20
<210>34
<211>19
<212>PRT
<213>冻土毛霉
<400>34
Lys Asn Glu Leu Phe Phe Lys Asn Thr Asp Gly Ile Phe Leu Asn Tyr
  1               5                  10                  15
Trp Trp Lys
<210>35
<211>9
<212>PRT
<213>冻土毛霉
<400>35
Lys Ile Val Ile Glu Ala Val Asn Lys
  1               5
<210>36
<211>11
<212>PRT
<213>冻土毛霉
<400>36
Ser Ser Arg Ile Ile Gln Asp Leu Phe Trp Lys
  1               5                  10
<210>37
<211>14
<212>PRT
<213>冻土毛霉
<400>37
Lys Thr Asp Ser Ser Arg Ile Ile Gln Asp Leu Phe Trp Lys
  1               5                  10

Claims (9)

1.选自以下的重组蛋白：
(a)具有SEQ ID NO：3代表的氨基酸序列的蛋白；和
(b)具有衍生自缺失、置换、***或添加1至10个氨基酸的SEQID NO：3代表的氨基酸序列的氨基酸序列并具有内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶活性的蛋白。
2.内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因，它编码：
(a)具有SEQ ID NO：3代表的氨基酸序列的蛋白；或
(b)具有缺失、置换、***或添加1至10个氨基酸的SEQ ID NO：3代表的氨基酸序列并具有内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶活性的蛋白。
3.具有以下DNA的基因：
(c)由SEQ ID NO：2代表的核苷酸序列组成的DNA；或
(d)在钠浓度为50-300mM，温度为50-68℃的条件下与由SEQID NO：2代表的核苷酸序列组成的DNA杂交并编码具有内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶活性的蛋白的DNA。
4.在钠浓度为50-300mM，温度为50-68℃的条件下与按照权利要求2的基因杂交并具有编码有内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶活性的蛋白的DNA的基因。
5.按照权利要求2至4中任一项的基因，其中所述基因衍生自属于毛霉菌(Mucor)属的微生物。
6.按照权利要求5的基因，其中所述属于毛霉菌属的微生物是冻土毛霉(Mucor hiemalis)。
7.包含按照权利要求2至6中任一项的基因的重组载体。
8.包含权利要求7的重组载体的转化体。
9.生产内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的方法，该方法包括培养按照权利要求8的转化体并由培养产物中收集内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。
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