CN104507952B - 基于磷灰石的色谱树脂的原位恢复 - Google Patents
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Abstract
提供用钙离子、磷酸根离子和氢氧根离子与任何样品加载和洗脱缓冲剂分开地处理基于磷灰石的树脂的方法和组合物,所述树脂中保留的溶质已用含碱金属盐的洗脱缓冲液洗脱。所述处理溶液使树脂恢复,使由洗脱缓冲液中的碱金属盐所致的退化逆转。
Description
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2012年5月30日提交的美国临时专利申请号61/653,172的优先权,该申请通过引用纳入本文用于所有目的。
背景技术
1.发明领域
本发明涉及基于磷灰石的色谱树脂,及其从生物样品纯化蛋白质和其它靶分子的应用。
2.现有技术说明
磷灰石的多种形式,例如羟磷灰石、陶瓷羟磷灰石、氟磷灰石和氟强化(fluoride-enhanced)磷灰石,均以色谱固相形式通过多种结合机制(包括亲和性、离子交换或疏水相互作用或这些机制的结合)用于各种靶分子的分离与纯化。基于磷灰石的色谱树脂具体用于蛋白质纯化,尤其是从宿主细胞蛋白质、聚集体、内毒素和DNA纯化重组蛋白。基于磷灰石的树脂的样品装载,尤其是带有蛋白质的样品,最常见地通过如下方式实施:首先用2mM-5mM的磷酸盐缓冲液将所述树脂平衡至pH 6.5,然后加载内含所述样品的具有相同pH和缓冲剂含量的溶液。一旦样品被加载,未结合的组分从所述树脂被洗掉,而靶分子用通常包含碱金属盐的洗脱缓冲液(最常见pH是8.0或更低)洗脱。平衡和加载缓冲液均使羟磷灰石的表面被水合氢离子(H3O+)浸湿,随后,所述水合氢离子在暴露至洗脱缓冲液之后解吸。该解吸作用导致所述树脂随时间劣化,导致大量树脂损失和树脂的颗粒强度降低。
该问题的可能相关文献是共同拥有的共同待审的2011年8月8日提交的美国专利申请号13/205,354,题为“Elution of Proteins From Hydroxyapatite Resins WithoutResin Deterioration(以树脂无损方式从羟磷灰石树脂洗脱蛋白质)”的公开内容,发明人L.J.Cummings。该公开内容描述洗脱缓冲液的应用,所述洗脱缓冲液包含钙离子和磷酸根离子,pH是6.0或更低,由此用这些离子同时进行蛋白质的洗脱和树脂的处理。尽管该缓冲液有效于抑制不含钙离子的缓冲液中发生的树脂劣化,但在该方法中,树脂与钙离子的接触受限于洗脱步骤的时间和洗脱缓冲液的体积,并且产物洗脱物,虽然没有原始样品中的杂质,但含有钙离子。
发明内容
已经发现,用于从样品纯化靶分子的色谱过程中,基于磷灰石的树脂的劣化可通过用连续的处理溶液在洗脱后处理所述树脂来恢复,所述连续的处理溶液包含钙离子、磷酸根离子和氢氧根离子,所述恢复通过与样品纯化步骤(例如柱平衡、样品加载和洗脱)分开的方式施加这些溶液来进行。钙离子、磷酸根离子和氢氧根离子在本文中被称为恢复材料。因此,包含这些离子的处理溶液不干扰平衡、加载和洗脱缓冲液,并且在本文中被称为“恢复材料”的所述离子本身不会从这些处理溶液转移至经纯化靶分子的溶液,即,产物溶液。在某些情况中,磷酸根离子可包含在所述平衡、加载和洗脱溶液中作为这些溶液中缓冲液的部分,并且将因此从这些溶液保留至纯化产物中。然而,本文中证明,不论部分抑或完全的树脂恢复均可因此与产品纯化分开进行,只需简单地将所述恢复材料作为由系列溶液通过树脂的方案中的额外步骤施加即可。在本发明的某些实施方式中,采用单一树脂进行多重纯化,即,从多个样品连续纯化靶分子,其中在各样品后用三种恢复离子处理该树脂,随后在加载下一样品之前从该树脂清除所述恢复离子,或至少清除钙离子。因此,通过简单地交换通过所述柱的溶液即可使样品纯化与柱恢复交替进行,同时获得分离纯化的蛋白质,即,从不含所述恢复材料的溶液中分离纯化的蛋白质。
通过以下说明,不难了解本发明的这些和其它目的、特征、实施方式和优点。
所选实施方式的详细描述
在某些实施方式中,用包含钙离子的处理溶液、包含磷酸根离子的处理溶液和包含氢氧根离子的处理溶液在洗脱后处理磷灰石树脂,能使该磷灰石树脂恢复。所述一种或多种这些处理溶液用于恢复磷灰石树脂的应用可在如本文所述已经进行的平衡、加载、清洗和洗脱步骤之后进行。
本文所述方法中用作恢复材料的钙离子可由任何可溶性钙盐(通常是可溶于水的盐)供给或通过氢氧化钙供给。钙卤化物和硝酸钙是可用钙盐的示例,而当洗脱缓冲液中的碱金属卤化物是碱金属氯化物时,氯化钙尤其便利。通过树脂的钙离子浓度和钙离子溶液的量是可变的,但通常选择使因洗脱缓冲液中的碱金属卤化物所致的树脂劣化至少部分恢复的任何量。在本文概念中的某些实施方式中,最好的结果将由约10ppm(0.25mM)~约2000ppm(49.9mM)的钙离子浓度获得,而在许多情况中是约30ppm(0.75mM)~约1000ppm(24.95mM),包括40ppm、50ppm、60ppm、70ppm、100ppm、150ppm、200ppm、250ppm、500ppm或750ppm。实现恢复所需的溶液体积可随钙离子浓度变化,但在大多数情况下,最佳结果可采用约1.0~约10.0树脂体积的溶液来获得,而在大多数情况下,约1.5~约6树脂体积,包括2、3、4或5树脂体积。所述钙离子溶液可以简单地是不含其它溶质的钙盐水性溶液,而采用该溶液处理过程中的pH相比紧接该溶液之前的溶液pH可以没有变化。
该洗脱缓冲液中所用的磷酸根离子同样可由任何可溶性磷酸盐(尤其是可溶于水的盐)供给。碱金属或碱土金属磷酸盐是示例,其中磷酸钠是特别便利的示例。就钙离子而言,磷酸根离子溶液的浓度和量是可变的,但通常选择使树脂劣化至少部分逆转的任何量,尤其是结合钙离子处理时。同样地,需要以获得所需程度的恢复的磷酸根溶液的体积将视磷酸根离子浓度和需要获得的恢复程度而变化。在本文概念中的某些实施方式中,最佳结果将由约50mM~约1M的磷酸根离子浓度获得,而在许多情况中是约200mM~约750mM,包括250mM、300mM、350mM、400mM、500mM、600mM或700mM。在许多情况中,供于最佳结果的体积将在约1.0~约20.0树脂体积的范围内,常常是约1.5~约10.0树脂体积,包括2、4、5、6、7、8或9树脂体积。磷酸根离子溶液的pH通常将会是约6.5或更高,在许多情况下是约6.5~约9.0,而常常最便利地是约6.5~约7.5,包括6.6、6.8、7.0、7.2和7.4。因此,磷酸盐缓冲液可用于供给磷酸根离子,而在许多实施方式中,处理溶液可包含调节至所需pH的磷酸盐缓冲液而不含其它溶质。
树脂恢复的程度可采用在磷酸根离子处理之前用钙离子处理(即,在施加含有碱金属卤化物的洗脱缓冲液至树脂供于靶分子洗脱之后直接用钙离子处理)来实现,或在钙离子处理之前用磷酸根离子处理来实现。然而,在一些情况中,更大的恢复程度可通过首先施加钙离子处理,然后施加磷酸根离子处理来实现。而在一些情况中,最佳结果可在单次恢复离子处理之间用洗涤溶液处理树脂以去除任何过剩钙离子、磷酸根离子或氢氧根离子来实现。用水洗涤通常是足够的,用量可广泛变化。典型的水洗涤将至少是约0.2树脂体积,而在大多数情况中是约0.2~约1.5,或约0.2~约2树脂体积。
不论钙离子是在磷酸根离子之前还是之后,氢氧根离子处理均作为树脂恢复的最后处理步骤来施加。可采用氢氧根离子的任何可溶形式,优选是水溶性的,并且碱金属氢氧化物(在许多情况中是氢氧化钠)特别便利。就钙离子和磷酸根离子的情况而言,氢氧根离子溶液的浓度和量是可变的。氢氧根离子可清洁树脂的残余蛋白质和污染物,并且也可作为将树脂平衡至待用于后续样品加载和靶分子洗脱的第一步骤,或平衡至适合储存的条件的第一步骤。在大多数情况中,最佳结果将采用约0.1M~约5.0M的氢氧根离子浓度来获得,而在许多情况中是约0.3M~约3.0M,包括0.5M、0.75M、1.0M、1.25M、1.5M、2.0M或2.5M。含氢氧根离子的处理溶液的合适体积的范围是约1.0~约20.0树脂体积,而在许多情况中是约1.5~约10.0树脂体积,包括2、3、4、5、6、7、8或9体积。
本文所用的术语“基于磷灰石的色谱树脂”指的是磷灰石、羟磷灰石或磷灰石的任何衍生形式。例如,氟磷灰石或氟增强磷灰石,可通过磷酸钙与氟化铵反应来形成。羟磷灰石是磷灰石的一种形式,其可以多种形式获得。示例有凝胶,例如Bio-Gel HT凝胶(悬浮于磷酸钠缓冲液中的羟磷灰石)、Bio-Gel HTP凝胶(Bio-Gel HT的干燥形式)和DNA-级Bio-Gel HTP(Bio-Gel HT的干燥形式,其粒径小于Bio-Gel HTP)。陶瓷羟磷灰石(CHT)是羟磷灰石的化学纯形式,其已在高温下烧结。陶瓷羟磷灰石形状为球形,粒径范围在约10微米~约100微米,并且通常可以20微米、40微米和80微米的标定获得。陶瓷羟磷灰石是大孔性的,并且可以两种类型获得:类型I,具有中等多孔性和相对高的结合能力,和II型,具有较大多孔性和较低结合能力。可采用任何多孔性,并且供于任何特定蛋白质分离或纯化的最优化多孔性将视所述蛋白质或来源混合物的组成而变化。本段中所有基于磷灰石的树脂可获自Bio-Rad实验室公司(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯)。树脂可以填充床形式用作色谱固相,并且可组成整个填充床或主要部分,例如填充床的50%体积或更多。填充床可保持在任何构型的容器中,并且在该树脂中进行的纯化和该树脂的恢复可以批处理、连续处理或混合批次/连续处理形式进行。合适的容器包括长比宽长的柱,且合适的处理包括连续处理例如连续流动通过柱。
使用后出现的树脂劣化可造成树脂颗粒失去其强度,并因而破损成导致柱内阻塞的较小颗粒。劣化也可以磷灰石的化学破损形式出现,造成质量损失,这可转而导致柱体积损失、颗粒破损增加或两者同时出现。全部这些效应均可通过本发明而逆转。可通过实践本发明而实现的劣化的逆转可导致较低的树脂质量损失速率、较低的颗粒强度减弱速率,或同时导致上述两者。在许多情况中,劣化的逆转可伴随树脂体积增加、颗粒强度增加或两者均有。
树脂平衡,样品加载和洗脱缓冲液是本领域所熟知的,而在各情况中,最优缓冲液的选择将视纯化的靶分子以及靶分子与树脂结合的相互作用类型而变化。特别感兴趣的靶分子是蛋白质,包括酸性蛋白质、抗体和单克隆抗体,以及蛋白质片段,和多肽。在纯化这些分子中的多数(如果不是大多数)的树脂劣化可归因于洗脱缓冲液中碱金属卤化物的存在。在靶分子和树脂之间的相互作用是阳离子交换的情况中,洗脱缓冲液中包括高浓度的碱金属卤化物,通常是约30mM或更高,常常是如下范围:约30mM~约200mM,或约30mM~约2M。在所述相互作用涉及钙配位复合物(例如通过螯合化学作用)的情况中,可采用具有较低氯化钠浓度的洗脱缓冲液。在大多数情况中,洗脱缓冲液的pH将是约8.0或更低,而更特别地是约6.0~约8.0。然而,在洗脱缓冲液包含碱金属卤化物的所有情况中,本发明将是受益的。
洗脱缓冲液通常可包含一种或多种常用缓冲液物质以保持所需pH。示例有甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、哌嗪-N,N'-2-乙磺酸(PIPES)、2-(N-吗啉代)-2-羟基-丙磺酸(MOPSO)、N,N-二-(羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-(N-吗啉代)-丙磺酸(MOPS)、N-2-羟基乙基-哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)、3-(N-三-(羟基甲基)甲基氨基)-2-羟基丙磺酸(TAPSO)、3-(N,N-二[2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、N-(2-羟基乙基)哌嗪-N'-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPPS)、N-[三(羟基甲基)-甲基]甘氨酸(Tricine)、N,N-二(2-羟基乙基)甘氨酸(Bicine)、[(2-羟基-1,1-二(羟基甲基)乙基)氨基]-1-丙磺酸(TAPS)、N-(1,1-二甲基-2-羟基乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)、三(羟基甲基)甲胺(Tris)和二[2-羟基乙基]亚氨基三-[羟基甲基]甲烷(Bis-Tris)。还可采用本领域已知的其它缓冲物质。
根据本文描述的基于磷灰石的树脂恢复可在树脂上的单一样品纯化之后进行,或者在连续多次纯化(共同造成比单一纯化更大幅的树脂降解)之后进行。在本发明的某些实施方式中,单一树脂可用于在各样品后进行恢复处理的该树脂上运行连续样品。以该方式在树脂上运行的样品数量可以是十种或更多,而在许多情况下是二十种或更多,甚至五十种或更多。以范围表达,样品数量(其各自之后衔接有恢复处理)可以是10~300,20~200或50~100。例如,可通过单轴限制的批量压缩(uniaxial confined bulk compression)来观察树脂强度。
在一些情况中,恢复处理可进行多次以实现磷灰石树脂的强化恢复。例如,降解的磷灰石树脂可通过施加磷酸根离子溶液、钙离子溶液和氢氧根离子溶液,以连续或适宜的2、3、4或5次顺序来恢复。或者,降解的磷灰石树脂可通过施加钙离子溶液、磷酸根离子溶液和氢氧根离子溶液,以连续或适宜的2、3、4或5次顺序来恢复。
基于磷灰石的靶分子纯化和一般色谱通常以本领域已知的步骤次序进行。在平衡和色谱之前,树脂可在溶液(例如盐和/或缓冲溶液)中预平衡以置换用于使所述树脂再生的溶液,或树脂储存的溶液,或上述恢复材料的溶液。最优的预平衡溶液的组成可视被置换的溶液的组成和靶分子组成,以及纯化中待采用的样品加载和洗脱溶液而变化。因此,合适的预平衡溶液可包含用于进行色谱的相同缓冲剂或盐,任选地以高于用于色谱的浓度采用。例如,若用于进行色谱的溶液包含约0.5mM~约50mM的磷酸钠,则可在包含约0.2M~约0.5M浓度的磷酸钠,更优选地约0.3M~约0.4M(含)浓度的磷酸钠的溶液中发生预平衡。
在将样品施加至所述柱之前,通常使基于磷灰石的树脂在用于加载样品的缓冲剂或盐中平衡。可采用任何各种缓冲剂或盐,包括具有阳离子(例如钠、钾、铵和钙)的那些,以及具有阴离子(例如氯、氟、乙酸根、磷酸根和柠檬酸根)的那些。平衡溶液的pH通常是约5.5或更高,在多种情况中pH在范围约6.0~约8.6内或范围约6.5~约7.5内。在一些实施方式中,平衡可在包含Tris或磷酸钠缓冲剂的溶液中进行。磷酸钠缓冲剂的浓度可以是约0.5mM~约50mM,或约15mM~35mM。
如上所述,本文所述的所有色谱、预处理和后处理步骤可在传统色谱柱中进行。所述柱可在加压或无加压下,自顶至底或自底至顶运行,并且所述柱中的液体流动方向可在过程中逆转。在一些情况中,在维持填充床的填充构型的同时逆转液体流可能是有利的。所述多个步骤还可以成批方式进行,其中树脂首先与用于加载样品、洗涤该柱和洗脱样品的溶液或液体接触,然后与用于加载样品、洗涤该柱和洗脱样品的溶液或液体分离。接触和分离可通过任何合适的方式进行,包括重力、离心或过滤。
就蛋白质分离而言,一类蛋白质的一个示例是由已经过遗传学工程改造以产生所述蛋白质的活宿主细胞产生的那些。遗传工程改造细胞以产生蛋白质的方法是本领域熟知的。参见,例如Ausabel等,编.(1990),Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学方案》)(纽约的威利公司(Wiley))。此类方法包括将编码并允许所述蛋白质表达的核酸引入活宿主细胞。所述宿主细胞可以是培养中生长的细菌细胞、真菌细胞或优选地,动物细胞。细菌宿主细胞的示例有大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。合适的大肠杆菌(E.coli)菌株的示例有HB101、DH5α、GM2929、JM109、KW251、NM538和NM539。在一些情况中,可采用无法切割外来DNA的大肠杆菌(E.coli)菌株作为宿主细胞。真菌宿主细胞的示例有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)和曲霉(Aspergillus)细胞。动物细胞系的示例有CHO、VERO、BHK、HeLa、Cos、MDCK、293、3T3和WI38。新动物细胞系可采用本领域技术人员熟知的方法建立,例如通过转化、病毒感染和/或选择。在一些情况中,可对由宿主细胞分泌的蛋白质进行分离。例如,所述蛋白质可分泌进入培养基,而将所述培养基加载至所述树脂上。
可在基于磷灰石的树脂中纯化的蛋白质的其它示例有包含一个或多个恒定抗体免疫球蛋白结构域,任选抗体的分选酶C酶部分的重组融合蛋白,和与如下蛋白质之一相同或基本相似的蛋白质:flt3配体、CD40配体、***、促血小板生成素、降血钙素、Fas配体、NF-κB的受体激活剂的配体(RANKL)、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF相关的凋亡诱导性配体(TRAIL)、胸腺基质源性的淋巴细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肥大细胞生长因子、干细胞生长因子、表皮生长因子、RANTES、生长激素、胰岛素、促胰岛素、***、甲状旁腺激素、干扰素、神经生长因子、胰高血糖素、白介素1至18、集落刺激因子、淋巴毒素-β、白血病抑制因子、制瘤素-M和细胞表面分子ELK和Hek的多种配体(例如eph-相关激酶或LERKS的配体)。
而其它示例有包含一个或多个恒定抗体免疫球蛋白结构域,任选抗体的FC部分,加任何上述蛋白质的受体或与此类受体基本相似的蛋白质的重组融合蛋白。这些受体包括TNFR的两种形式(指p55和p75)、白介素-1受体I型和II型、白介素-2受体、白介素-4受体、白介素-15受体、白介素-17受体、白介素-18受体、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体、粒细胞集落刺激因子受体、制瘤素-M和白血病抑制因子的受体、NF-κB的受体激活剂(RANK)、TRAIL的受体(包括TRAIL受体1、2、3和4),以及包含死亡结构域的受体,例如Fas或凋亡诱导受体(AIR)。
蛋白质的其它示例是分化抗原(指CD蛋白)及其配体,其与至少一个恒定抗体免疫球蛋白结构域(任选地,抗体的分选酶C酶部分)融合。此类抗原公开于“白细胞分型VI(Leukocyte Typing VI)”(Proceedings of the VIth International Workshop andConference(《第六次国际研讨会及会议学报》),Kishimoto,Kikutani等编,日本神户,1996)。此类抗原的示例有CD27、CD30、CD39、CD40及其配体(CD27配体、CD30配体等)。
其它示例还有酶促活性蛋白质及其配体。重组融合蛋白的示例包含至少一个恒定抗体免疫球蛋白结构域加上如下蛋白质之一或其配体或与如下这些之一基本相似的蛋白质的全部或部分:金属蛋白酶-解聚素家族成员、各种激酶、葡糖脑苷脂酶、过氧化物歧化酶、组织胞浆素原激活剂、因子VIII、因子IX、载脂蛋白E、载脂蛋白A-I、珠蛋白、IL-2拮抗剂、α-1抗胰蛋白酶、TNF-α转化酶、任何上述酶的配体,以及多种其它酶及其配体。
其它示例还有抗体或其部分,以及嵌合抗体,即,具有偶联至一个或多个鼠可变抗体免疫球蛋白结构域的至少一个人恒定抗体免疫球蛋白结构域的抗体,或其片段,以及抗体和细胞毒性或发光物质的共轭物。此类物质包括:美登素衍生物(例如DM1);肠毒素(例如葡萄球菌肠毒素);碘同位素(例如碘-125);锝同位素(例如Tc-99m);花青荧光染料(例如Cy5.5.18);和核糖体-失活蛋白质(例如波苷素(bouganin)、白树毒素或皂草素-S6)。抗体或抗体/细胞毒素或抗体/发光体共轭物的示例有识别上述蛋白质和/或如下抗原中任何一种或联合形式的那些:CD2、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD14、CD18、CD20、CD22、CD23、CD25、CD33、CD40、CD44、CD52、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD147、IL-1α、IL-1β、IL4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-2受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-13受体、IL-18受体亚基、PDGF-β、VEGF、TGF、TGF-β2、TGF-β1、EGF受体、VEGF受体、C5补体、IgE、肿瘤抗原CA125、肿瘤抗原MUCI、PEM抗原、LCG(其为与肺癌关联表达的基因产物)、HER-2、肿瘤相关的糖蛋白TAG-72、SK-1抗原、以升高的水平存在于结肠和/或胰腺癌患者血清中的肿瘤相关的表位、在乳腺癌、结肠癌、鳞状细胞癌、***癌、胰腺癌、肺癌和/或肾癌细胞和/或黑素瘤、神经胶质瘤或成神经细胞瘤细胞、肿瘤的坏死中心上表达的癌相关表位或蛋白质、整联蛋白α4β7、整联蛋白VLA-4、B2整联蛋白、TRAIL受体1、2、3和4、RANK、RANK配体、TNFα、粘着分子VAP-1、上皮细胞粘着分子(EpCAM)、胞间粘着分子-3(ICAM-3)、白整联蛋白粘附素、血小板糖蛋白gp Ilb/IIIa、心肌肌球蛋白重链、副甲状腺激素、rNAPc2(其为因子VIIa-组织因子的抑制剂)、MHC I、癌胚抗原(CEA)、α-胎蛋白(AFP)、肿瘤坏死因子(TNF)、CTLA-4(其为细胞毒性T淋巴细胞关联抗原)、Fc-γ-1受体、HLA-DR 10β、HLA-DR抗原、L-选择蛋白、IFN-γ.、呼吸道合胞病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、变形链球菌(Streptococcus mutans)或金黄色酿脓葡萄球菌(Staphlycoccus aureus)。
实施例1-对照实验
该实施例说明了羟磷灰石树脂在一系列使该树脂接触模拟蛋白质分离时那些条件的循环之后的劣化情况(但不加载并洗脱蛋白质)。该实验在测量长度为20cm且内径为2.2cm,内部体积为76mL的柱上进行,并且填充物是称重约48g的40微米颗粒中的陶瓷羟磷灰石I型,所得流动相流通该柱的流速为250cm/h。进行一系列25次连续循环,各循环由如下八个步骤组成:
表I
分离和柱恢复的模拟循环的处理方案
在该方案中,步骤2是用于降低步骤8的碱处理之后的柱pH的调整步骤;而步骤3和4使该柱暴露至一般在柱平衡、样品加载和洗脱过程中出现的条件。在第一次循环之前和最末次循环之后,于该柱的各三个区段中进行颗粒质量和颗粒强度的测量(通过单轴限制的批量压缩,“UCBC”),所述三个区段为顶部25%、中部50%和底部25%(流动相入口位于该柱顶部)。结果列于下表II。
表II
对于分离和柱恢复的模拟循环的三个柱位置处的固相质量和强度的变化
表II中的数据指示,通过质量损失和颗粒强度下降证明该树脂经历了化学改变。总体质量损失为6.89%,而这种情况贯穿该柱的柱高是大致均一的。颗粒强度的下降在顶部和底部最大,但也一般延伸贯穿该柱。
实施例2
该实施例说明实施例1柱循环中包括了本发明的柱恢复的结果。在相同的羟磷灰石柱上进行与实施例I那些相同的一些列运行,不同之处在于在模拟平衡、样品加载、洗涤和洗脱条件的溶液之后使氯化钙溶液通过该柱。因此,各循环由如下九个步骤组成:
表III
分离和柱恢复的模拟循环的处理方案
如实施例1所示,进行25次循环,并在第一次循环之前和最末次循环之后测量颗粒质量和颗粒强度。测量指示,经过了所述25次循环过程,整个柱的颗粒体积增加4.72%,而颗粒强度增加9%。
实施例3
该实施例进一步说明本发明的柱恢复,说明相同柱的不同部分发生的变化,以提供与对照实施例(实施例1)的直接比较。所述柱构造与前述实施例中相同,处理方案与表III中相同,并在第一次循环之前和最末次循环之后获得该柱各三个区段的质量和颗粒强度变化。结果示于下表IV。
表IV
对于分离和柱恢复的模拟循环的三个柱位置处的固相质量和强度的变化
表IV显示,在该柱的上部25%中出现了轻微质量损失,而在该柱的中部50%和下部25%出现质量增加。该柱整体上质量增加4.18%。颗粒强度在上部25%中下降,在中部50%中保持大致中性,而在下部25%中增加13%。将这些结果与实施例1中的那些(表II)比较,其中质量变化为损失6.89%,各三个柱区段中的颗粒强度下降,在下部25%中下降50%。
实施例4
该实施例说明采用本发明一系列恢复处理但不采用模拟柱平衡、样品加载、洗涤和洗脱时条件的介入处理来处理柱的效果。柱构造与前述实施例中那些相同,但25次循环各自采用下表V中所示的处理方案。
表V
柱恢复的处理方案
如实施例3中那样,对该柱的三个区段进行树脂质量和颗粒强度的测量,所述测量均在第一次循环之前和第25次循环之后进行,结果示于表VI。
表VI
经过25次柱恢复循环的三个柱位置处的固相质量和强度的变化
质量变化百分数的小值指示极少(若有)发生树脂结构改变。该柱的上部25%中的颗粒强度的25%的下降是用于重复蛋白质纯化而在平衡、加载和洗脱溶液中不含氯化钠的磷灰石填充柱的特点。中部和下部区段中的增加显示钙恢复材料的有利效果。
实施例5
该实施例说明在部分接触模拟样品纯化过程中的条件(不同之处在于不接触洗脱或平衡过程中会出现的碱金属)的介入处理之后用本发明的一系列恢复处理来处理柱的效果。柱构造与前述实施例中那些相同,但25次循环各自采用下表VII中所示的处理方案。
表VII
分离和柱恢复的模拟循环但不接触碱金属卤化物的处理方案
如实施例3中那样,对该柱的三个区段进行树脂质量和颗粒强度的测量,所述测量均在第一次循环之前和第25次循环之后进行,结果示于表VIII。
表VIII
经过25次柱恢复循环的三个柱位置处的固相质量和强度的变化
如实施例4中那样,质量变化百分数的小值指示极少(若有)发生树脂结构改变,而在该柱上部25%中出现的颗粒强度损失是用于重复蛋白质纯化的磷灰石填充柱中通常会出现的。中部和下部区段中的较少损失(以及下部区段中质量的增加)显示本发明的恢复方案的有利效果。
实施例6
该实施例说明前述实施例的方案的变化形式(倒转钙离子和磷酸根离子的顺序)。除此以外,25次循环各自的处理方案与表III(实施例2)中那些相似。柱构造与前述实施例的那些相同,并且各循环由如下七个步骤组成:
表IX
分离和柱恢复的模拟循环的处理方案
如实施例3中那样,对该柱的三个区段进行树脂质量和颗粒强度的测量,所述测量均在第一次循环之前和第25次循环之后进行,结果示于表X。
表X
经过25次柱恢复循环的三个柱位置处的固相质量和强度的变化
质量和颗粒强度均在测试过程后下降,尽管下降得不如对照(实施例1,表II)那么多。不过,比较这些结果和实施例3(表IV)那些,显示当已暴露至碱金属盐洗脱液(步骤4)的磷灰石表面用钙离子处理然后用磷酸根离子处理时实现了改进的树脂恢复。
实施例7
该实施例说明对柱施加本发明恢复方法,该柱施加有NaCl补充的浅磷酸根梯度。该实施例中所用的柱长40cm,内径1.6cm,流速200cm/h或6.70mL/分钟。填充材料与前述实施例中所用的相同,但填充重量为50.67g且柱体积为80.42mL。总共运行25次循环,而各循环的方案示于表XI:
表XI
采用磷酸根梯度的分离和柱恢复的模拟循环的处理方案
树脂质量和颗粒强度的测量示于表XII。
表XII
磷酸根梯度测试:
经过25次柱恢复循环的三个柱位置处的固相质量和强度的变化
尽管表XII中显示显示柱的所有三个区段中的颗粒强度值均有降低,使填充至高40cm且宽20cm的小规模柱运行通过相同循环而不含恢复步骤8和10且不含中间洗涤步骤9(即,采用表XI的仅步骤1、2、3、4、5、6、7和11组成的循环作为替代)。对于这些缩减循环而言,在仅11次循环之后,该柱顶部、中部和底部区段中的颗粒强度的下降分别是-26%、-40%和-46%。这些值与表XII的那些之间的比较显示,当各个循环中包括了恢复步骤时,该柱的所有三个区段中的颗粒强度均下降至比省去恢复步骤时少得多的程度(并且超过两倍循环数)。
在其它测试中,重复该方案,其中步骤8中的CaCl2浓度分别降低至25mM和2mM,所有其它步骤不变,以评估浓度对填充树脂的作用。结果示于表XIII,指示对CaCl2浓度的一些依赖性,其中较高浓度获得较大恢复程度,尤其是在该柱的上部部分中。
表XIII
具有可变CaCl2浓度的磷酸根梯度测试:
经过25次柱恢复循环的三个柱位置处的固相质量和强度的变化
尽管有颗粒强度损失,表XIII中所示的两个浓度下的损失程度仍显著少于上述对比测试(即,采用表XI的方案但各循环减去步骤8、9和10的测试)中所观察到的,在该柱的至少中部和底部区段是如此。
在所附的权利要求书中,术语“一个”或“一种”是用来表示“一个(种)或多个(种)”。在述及步骤或要素时,其术语“包含”及其变化形式例如“包括”和“含有”旨在表示其它步骤或要素的增加是可任选且不被排除的。本说明书中引用的所有专利、专利申请和其它公开的参考材料都通过引用全文纳入本文中。当本说明书的内容与本发明引用的任何参考材料或任何现有技术之间存在矛盾之处的时候,以本说明书为准。所述矛盾之处包括现有技术对词或词组的定义与本说明书对相同的词或词组明确给出的定义之间的差异。
Claims (31)
1.一种在采用基于磷灰石的色谱树脂进行靶分子纯化之后增加所述树脂的树脂质量和/或颗粒强度的方法,所述方法包括:平衡所述基于磷灰石的色谱树脂、将所述靶分子加载至所述基于磷灰石的色谱树脂、从所述基于磷灰石的色谱树脂洗脱所述靶分子,和,在进行其它靶分子的后续加载之前进行洗脱后处理:
(a)使钙离子溶液通过所述树脂;
(b)使pH为至少6.5的磷酸根离子溶液通过所述树脂;和
(c)使氢氧根离子通过所述树脂;
步骤(a)、(b)和(c)与平衡、样品加载和洗脱缓冲液通过所述树脂的任何通过过程分开进行,并且所述离子的浓度和所述溶液的体积有效地增加所述基于磷灰石的色谱树脂的树脂质量和/或颗粒强度;
其中,步骤(a)在步骤(b)之前进行,并且步骤(b)在步骤(c)之前进行;
其中所述钙离子溶液的钙离子浓度是10ppm~2000ppm;所述磷酸根离子溶液的磷酸根离子浓度是50mM~1M;且所述氢氧根离子溶液的氢氧根离子浓度是0.1M~5.0M。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,从与所述树脂连续接触的多个样品提取靶分子,并且步骤(a)、(b)和(c)在各所述样品与所述树脂接触之后进行。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法还包括分别在步骤(a)和(b)之后使水性洗涤溶液通过所述树脂。
4.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述方法还包括分别在步骤(a)、(b)和(c)之后使水性洗涤溶液通过所述树脂。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述基于磷灰石的色谱树脂是陶瓷羟磷灰石。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述基于磷灰石的色谱树脂是选自下组的成员:氟磷灰石和氟强化磷灰石。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述钙离子溶液以1.0树脂体积~10.0树脂体积的量通过所述树脂。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述钙离子溶液的钙离子浓度是30ppm~1000ppm,并且以1.5树脂体积~6.0树脂体积的量通过所述树脂。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述磷酸根离子溶液的pH是6.5~9.0,并且以1.0树脂体积~20.0树脂体积的量通过所述树脂。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述磷酸根离子溶液的pH是6.5~7.5,其磷酸根离子浓度是200mM~750mM,并且以1.5树脂体积~10.0树脂体积的量通过所述树脂。
11.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述氢氧根离子溶液以1.0树脂体积~20.0树脂体积的量通过所述树脂。
12.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述氢氧根离子溶液的氢氧根离子浓度是0.3M~3.0M,并且以1.5树脂体积~10.0树脂体积的量通过所述树脂。
13.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述树脂是已经接触pH为8.0或更低的所述洗脱缓冲液的树脂。
14.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述树脂是已经接触pH为6.0~8.0的所述洗脱缓冲液的树脂。
15.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述树脂是已经接触含有浓度为至少30mM的碱金属卤化物的所述洗脱缓冲液的树脂。
16.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述树脂是已经接触含有浓度为30mM~3000mM的碱金属卤化物的所述洗脱缓冲液的树脂。
17.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述靶分子是多肽。
18.一种在基于磷灰石的色谱树脂上从多个样品纯化靶分子的方法,所述方法如下进行:将所述样品连续加载至所述树脂,并在各所述加载之后用含有碱金属盐的洗脱缓冲液从所述树脂洗脱所述靶分子,改进之处包括在各靶分子洗脱之后和各后续样品加载之前通过如下方式处理所述树脂:
(a)使钙离子溶液通过所述树脂;
(b)使pH为至少6.5的磷酸根离子溶液通过所述树脂;和
(c)使氢氧根离子溶液通过所述树脂;
步骤(a)、(b)和(c)与柱平衡、样品加载和洗脱缓冲液通过所述树脂的全部通过过程分开进行,并且所述离子的浓度和所述溶液的体积有效地增加所述基于磷灰石的色谱树脂的树脂质量和/或颗粒强度;
其中,步骤(a)在步骤(b)之前进行,并且步骤(b)在步骤(c)之前进行;
其中所述钙离子溶液的钙离子浓度是10ppm~2000ppm;所述磷酸根离子溶液的磷酸根离子浓度是50mM~1M;且所述氢氧根离子溶液的氢氧根离子浓度是0.1M~5.0M。
19.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述多个样品由至少20个样品组成。
20.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述多个样品由至少50个样品组成。
21.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述方法还包括分别在步骤(a)、(b)和(c)之后使水性洗涤溶液通过所述树脂。
22.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述基于磷灰石的色谱树脂是陶瓷羟磷灰石。
23.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述基于磷灰石的色谱树脂是选自下组的成员:氟磷灰石和氟强化磷灰石。
24.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述钙离子溶液以1.0树脂体积~10.0树脂体积的量通过所述树脂。
25.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述钙离子溶液的钙离子浓度是30ppm~1000ppm,并且以1.5树脂体积~6.0树脂体积的量通过所述树脂。
26.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述磷酸根离子溶液的pH是6.5~9.0,并且以1.0树脂体积~20.0树脂体积的量通过所述树脂。
27.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述磷酸根离子溶液的pH是6.5~7.5,其磷酸根离子浓度是200mM~750mM,并且以1.5树脂体积~10.0树脂体积的量通过所述树脂。
28.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述氢氧根离子溶液以1.0树脂体积~20.0树脂体积的量通过所述树脂。
29.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述氢氧根离子溶液的氢氧根离子浓度是0.3M~3.0M,并且以1.5树脂体积~10.0树脂体积的量通过所述树脂。
30.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述洗脱缓冲液的pH是8.0或更低。
31.如权利要求18所述的方法,其特征在于,所述洗脱缓冲液的pH是6.0~8.0。
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