KR100673049B1

KR100673049B1 - 엔도-β-Ｎ-아세틸글루코사미니다제 유전자

Info

Publication number: KR100673049B1
Application number: KR1020007012943A
Authority: KR
Inventors: 고바야시가즈오; 타케우치마코토; 이와마츠아키히코; 요시다사토시; 야마모토켄지; 쿠마가이히데히코
Original assignee: 기린 비루 가부시키가이샤
Priority date: 1998-05-22
Filing date: 1999-05-20
Publication date: 2007-01-22
Also published as: HK1049682A1; DE69939823D1; JP4160652B2; US6815191B1; HK1049682B; AU3849999A; EP1081221A1; EP1081221A4; KR20010071288A; TWI245800B; CN1376195A; EP1081221B1; WO1999061591A1; JPH11332568A; CN1175104C

Abstract

이하 (a) 또는 (b)의 단백질을 암호화하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자:

(a) 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질

(b) 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열에서 적어도 1개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며 또 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제활성을 갖는 단백질.

Description

엔도-β-Ｎ-아세틸글루코사미니다제 유전자 {Endo-β-N-acetylglucos aminidase gene}

본 발명은 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자에 관한 것이다. 상세하게는 상기 유전자가 무코르(Mucor)속 유래인 유전자에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드, 상기 플라스미드에 의해 형질전환된 생물, 상기 형질전환체를 사용한 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자의 제조법에 관한 것이다.

당 단백질은 동식물의 조직, 진핵 미생물의 세포막, 벽 등에 널리 존재하고 있다.

근년, 당단백질의 당쇄가 세포의 분화, 암(癌)화, 세포간의 인식 등의 메카니즘에 중요한 역할을 발휘하고 있는 것이 밝혀지고 있고 그 메카니즘 해명을 위한 당쇄의 구조와 기능과의 관계에 관하여 연구가 진행되고 있다. 그 목적을 달성하기 위한 수단으로서 당단백질로부터 당쇄를 절취한 경우 또는 당쇄의 구조를 확인하는 경우 각종 글리코시다제가 사용되고 있다. 그중에서도 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제는 당단백질에 존재하는 아스파라긴 결합형 당쇄 (N-결합형 당쇄, N형 당쇄)에 작용하여 당쇄중에 존재하는 디아세틸케토비오스 부분을 절단하여 당쇄를 유리 시키는 작용을 갖는다.

엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제는 당단백질의 당쇄 부분을 단백질 부분 보다 더 잘 유리시킬 수 있기 때문에 당단백질 당쇄의 구조, 기능의 해석에 중요한 것으로 보여진다.

아스파라긴 결합형 당쇄는 그 구조로부터 고 만노스형(만난형 당쇄), 하이브리드형 및 복합형으로 분류된다.

종래 알려져있는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제로서는, Endo H(A. L. Tarentino and F. Maley, J. Biol. Chem., 249, 811 (1974)), Endo F (K.Takegawa, et al., Eur. J. Biochem., 202, 175 (1991)), 엔도 A(K.Takegawa, et al., Appl. Environ. Microbiol., 55, 3107 (1989))등을 들 수 있지만, 이들 효소는 특정한 구조의 당쇄에 대해서만 작용하고 또 당단백질에 대해서는 변성제존재하가 아니면 작용하지 않는다.

무코르 히에말리스(Mucor hiemalis) 유래의 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제는 고 만노스형(만난형 당쇄), 하이브리드형 뿐만아니라 복합형에 관해서도 3분지 복합 당쇄까지 절단능이 있고 또한 탈시알형이면 4분지 복합 당쇄까지 절단능이 있으며 또 단백질을 변성 처리하는 일 없이 당단백질로부터 당쇄를 유리할 수가 있다고 알려져있다 (S.Kadowaki, et al., Agric. Biol. Chem., 54, 97 (1990)). 따라서, 무코르 히에말리스 유래의 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제는 당단백질의 당쇄 및 단백질의 기능적, 생리적 역할을 연구하는 데에 있어서 유용하다고 말할 수 있다.

한편, 효모 유래의 만난형 당쇄로부터 인간 적응형 당쇄로 변환하는 것은 물질 생산 면에서는 대단히 의의가 있는 것이다. 그 변환방법으로서는 효모의 당쇄 생합성계를 유전자 조작에 의해 변형하는 생체내(in vivo)에서의 변환과 함께 트랜스글리코실레이션 반응을 이용한 시험관(in vitro)에서의 변환을 고려할 수 있다. 당 변환을 목적으로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 특성으로서 1) 기질특이성으로서 만난형, 복합형의 양쪽에 대하여 절단능력을 가질 것, 2) 분해반응의 역반응인 트랜스글리코실레이션 반응하는 능력을 가질 것이 요구된다. 따라서, 무코르 히에말리스(Mucor hiemalis) 유래의 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제는 상기 변환을 실행하기에 어울리는 효소라고 말할 수 있다.

본 발명자들은 효모형 당쇄를 인간 적응형으로 바꿀 수 있는 무코르 히에말리스(Mucor hiemalis) 유래의 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 사용한 당쇄 변환 기술을 제안하고 있다 (공개 특허공보 7-59587호 공보).

이상과 같은 당쇄 변환을 하기위해서는 정제도가 높은 효소 상품을 다량 필요로하게된다. 이 경우, 곰팡이의 균체를 사용한 종래의 육종법에 의해 효소 생산성의 향상을 목표로 하는 것으로 생각된다. 그러나, 종래의 육종 방법은 주로 자외선이나 돌연변이 유발제에 의해서 얻어지는 변이주로부터 선택하는 방법에 한정되고 있었기 때문에 안정한 변이체를 단리하는 것이 곤란하였다. 또한, 종래법에 의한 육종의 경우, 바람직하지 않은 형질변화를 수반하는 것도 많다. 더욱, 일반적으로 곰팡이는 여러가지 단백질 분해효소를 생성하기 때문에 당변환을 목적으로 한 효소를 생산하기 위해서는 바람직한 것이 아니다. 따라서 이들 문제점을 제거하기 위해서는 다단의 정제공정을 밟지 않으면 안되기 때문에 작업이 번잡하여 지고 또한 효소의 수량도 적다. 예컨대, 털 곰팡이의 일종인 무코르(Mucor)속에 속하는 미생물을 배양하여 그 배양상청액으로부터 효소를 정제하더라도 단백질분해효소의 혼입을 배제할 수 없고 또 균체의 효소 생산성이 낮기 때문에 대량 조제할 수 없어 실용상의 가치는 적었다.

이상과 같은 점에서, 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 대량 생산하기 위해 상기 효소의 유전자를 취득하여 유전자 공학적으로 그것을 생산하는 것이 요청되고 있다. 또한, 유전자를 취득할 수 있으면, 단백질 공학의 기술을 이용하여 내열성, 내 pH성 향상, 반응 속도가 증대된 효소를 얻는 것도 기대할 수 있다. 그렇지만 유전자 클로닝을 시험하고 있는지에 대한 보고는 현재까지 없다.

본 발명은 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제, 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체 및 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구한 결과, 상기 무코르 히에말리스(Mucor hiemalis) 유래 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 부분 아미노산 서열 정보를 바탕으로 해당 효소의 생산균인 무코르 히에말리스(Mucor hiemalis)로부터 작성한 cDNA 라이브러리로부터 해당 효소를 암호화하는 유전자를 취득하는 것에 성공하고 효모에서의 발현에도 성공하여 본 발명을 완성하기에 이르 렀다.

즉, 본 발명은, 이하의 (a) 또는 (b)의 재조합 단백질이다:

(a) 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는

또한 본 발명은 이하의 (a) 또는 (b)의 단백질을 암호화하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자 및 상기 유전자와 스트린젠트 조건하에서 잡종화하고 또 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 유전자이다:

(b) 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열에서 적어도 1개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고 또 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제활성을 갖는 단백질.

또한 본 발명은 이하의 (c) 또는 (d)의 DNA를 포함하는 유전자이다:

(c) 서열번호 2에 나타낸 염기서열로 이루어지는 DNA, 또는

(d) 서열번호 2에 나타낸 염기서열로 이루어지는 DNA와 스트린젠트 조건하에서 잡종화하고 또 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.

상기 유전자로서는 무코르(Mucor) 속에 속하는 미생물(예컨대 무코르 히에말 리스(Mucor hiemalis)) 유래의 유전자를 들 수 있다.

또한 본 발명은 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터이다.

또한 본 발명은 상기 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체이다.

또한 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 채취하는 것을 특징으로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 제조방법이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 생산하는 균을 배양하여, 얻어지는 배양물로부터 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 정제한 후, 상기 효소의 부분 아미노산 서열로부터 축퇴 탐침을 설계하여, PCR을 실시하는 것에 의해 상기효소를 암호화하는 유전자를 클로닝하고, 또한 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 생산하는 균의 cDNA 라이브러리로 부터 상기 효소를 암호화하는 유전자를 클로닝하는 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명은 클로닝된 벡터에 넣어 재조합 벡터를 얻는 것과 함께 상기 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입하여 형질전환체를 얻는 것을 특징으로한다. 또한 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하는 것에 의해 대량으로 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 생산하는 것을 특징으로 한다.

1. 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 생산하는 균의 배양

엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 생산하는 균으로서는, 무코르 속(Mucor )에 속하는 균체, 바람직하게는 무코르 히에말리스(Mucor hiemalis), 보다 바람직하게는 공업기술원 생명공학기술연구소(일본 이바라기켄 쓰쿠바시 토 1쪼메 1번 3 호)에 기탁되어 있는 무코르 히에말리스(Mucor hiemalis) (수탁번호 FERM BP-4991)를 들 수 있다.

이들 균주의 배양에 사용되는 배지 조성은 통상의 미생물 배양에 사용되는 것이면 어떠한 것이라도 좋다.

탄소원으로서는 예컨대 글루코오스, 수크로오스, 만노오스, 갈락토오스, 말토오스, 가용성 전분, 덱스트린 등의 당질, 질소원으로서는 효모 엑기스, 트립톤 등을 들 수 있다. 무기염으로서는 상기의 질소원에 함유하는 무기염 이외에 각종 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염, 인산염 등의 염류가 사용되며, 경우에 따라서는 비타민류를 첨가할 수 있다.

배양은 배지를 통상의 방법으로 멸균하고 균주를 접종한 후, 20∼30℃, pH 5∼7에서 2∼4일간 진동 또는 통기 교반 배양을 실시한다.

본 발명에서 온도가 25∼30℃, pH가 6, 탄소원으로서 갈락토오스, 질소원으로서 효모 엑기스, 트립톤을 사용하여 탄소원, 질소원의 농도가 함께 2∼3%, 탄소원과 질소원의 비 2:3에서 3∼4일간 양호한 통기 조건으로 배양하는 것이 보다 바람직하다. 이러한 배양조건으로 배양한 경우는 효소의 생산량이 최대로 되어, 공지방법〔S. Kadowaki, et al., Agric. Biol. Chem., 54, 97(1990); 글루코오스 0.5%, 효모 엑기스 1%, 펩톤 1%]과 비교하여 약 1O 배의 효소 생산성을 얻을 수 있다.

본 발명에서는 미생물을 배양할 때에 통기 조건을 확보하기 위해 단지 발효기(jar fermenter)를 사용하는 것이 바람직하다.

2. 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 정제

상기 균주가 생산하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제는 이하의 활성을 유지하는 것을 특징으로 한다. 즉, 당단백질에 존재하는 아스파라긴 결합형 당쇄에 작용하여 당쇄중에 존재하는 디아세틸케토비오스 부분을 절단하여 당쇄를 유리하는 활성으로 특징지워진다.

엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 정제는 공지의 분리 정제방법을 적당히 결합하여 실시할 수 있다. 예컨대 염 침전, 용매 침전과 같은 용해성의 차이를 이용하는 방법, 투석, 한외여과, 겔 여과 및 SDS-폴리아크릴 전기영동과 같은 분자량의 차이를 이용하는 방법, 이온교환 크로마토그래피와 같은 전하의 차이를 이용하는 방법, 소수 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피와 같은 소수성의 차이를 이용하는 방법 및 등전점 전기영동과 같은 등전점의 차이를 이용하는 방법 등을 들 수 있다.

본 발명에서는 상술한 바와 같은 공지 방법(S. Kadowaki, et al., Agric. Biol. Chem., 54, 97 (1990))을 개량한 배양법을 채용하고 또한 다단의 정제공정을 거치는 것에 의해 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 효율 좋게 정제할 수가 있어, 유전자를 취득하기위해 필요한 아미노산 서열을 얻기에 충분한 양의 단백질을 얻을 수 있다. 얻어지는 효소는 효소 정제의 결과 및 후술한 유전자 해석의 결과, 분자량 약 85,000의 단일한 유전자 산물에 의해 구성되며, 유전자의 번역 뒤의 제한 분해를 통하여 적어도 분자량 약 60,000 및 14,000의 펩티드를 포함하는 2개 이상의 서브유닛으로 구성되는 것이 밝혀졌다.

3. 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자의 클로닝

무코르 히에말리스(Mucor hiemalis)로부터 얻어지는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제는 적어도 2개 이상의 펩티드로 구성되어 있는 것을 알았다.

일반적으로 어떤 특정한 단백질을 암호화하는 유전자를 단리하는 경우, 단백질의 부분 아미노산 서열을 결정하여, 그 축퇴 코돈으로 이루어지는 혼합 올리고뉴클레오티드를 탐침으로하여 유전자 라이브러리로부터 원하는 유전자를 단리할 수 있다. 또한 본 발명에서 실시한 것과 같은 PCR에 의한 부분 단편의 취득 후, 그 단편을 탐침으로 하여 유전자 라이브러리로부터 목적하는 유전자를 단리할 수 있다.

그렇지만, 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제는 두 가지 이상의 서브유닛으로 이루어지는 헤테로 올리고머 분자이기 때문에 각각의 서브유닛이 각각 상이한 유전자에 독립적으로 암호화될 가능성이 있다. 또한 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제가 한개의 유전자로부터 유래하더라도 2개의 서브유닛을 암호화하는 영역이 구조 유전자중에서 어떤 위치 관계로 되어있는가 등 그 구조에 관해서는 분명하지 않다.

본 발명자들은 2개의 서브유닛의 부분 아미노산 서열을 결정하고 PCR에 의해 부분 단편을 취득한 후, 상기 단편을 탐침으로하여 cDNA의 클로닝에 성공하여, 유전자 구조를 해석함으로써 이들 2개의 서브유닛이 동일한 유전자에 의해 암호화된다는 것을 밝혀내었다. 즉, 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제는 상기 효소를 암호화하는 유전자로부터 1개의 폴리펩티드로서 생성되어, 부분 분해를 받는 것에 의해 2개 이상의 서브유닛으로 처리되는 것이 밝혀졌다.

본 발명의 유전자는 예컨대 아래와 같이 하여 클로닝된다.

(1) 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자의 클로닝

본 발명에 있어서 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 암호화하고 있는 유전자를 포함하는 DNA 단편의 구체예로서는 도 2에 도시되어 있는 제한효소 지도로 표시되는 DNA 단편을 들 수 있다. 이 단편은 무코르 속(Mucor)에 속하는 균체, 바람직하게는 무코르 히에말리스(Mucor hiemalis)주(株), 보다 바람직하게는 공업기술원생명공학기술연구소에 수탁번호 FERM BP-4991의 번호로 기탁되어 있는 무코르 히에말리스(Mucor hiemalis)주로부터 제조되는 mRNA를 주형으로하여 cDNA 라이브러리로부터 유전자 공학적인 수법을 이용하여 단리할 수 있다 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, Maniatis 등, Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989))등에 기재된 방법을 참조).

mRNA의 제조는 통상의 수법에 의해 할 수 있다. 예컨대 mRNA의 공급원인 무코르 히에말리스(Mucor hiemalis)를 배양한 후, 시판되는 키트(ISOGEN (닛폰진사제))로 처리하여 전체 RNA를 얻고, 시판하는 정제 키트(mRNA Purification Kit (Pharmacia Biotech사제))를 이용하여 정제할 수 있다. 또한 mRNA의 제조에는 mRNA의 분해를 억제하는 의미로 배양시간을 짧게 하는 것이 바람직하다.

이렇게하여 얻어진 mRNA를 주형으로하고, 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 사용하여 단일가닥의 cDNA를 합성한 후 상기 단일가닥 cDNA로부터 이중가닥의 cDNA를 합성한다. 수득한 이중가닥 cDNA를 적당한 클로닝 벡터에 넣어 재조합 벡터를 제조한다. 수득한 재조합 벡터를 이용하여 대장균 등을 형질전환하여, 테트라사이클린 내성, 암피실린 내성을 지표로하여 형질전환체를 선택하는 것에 의해, cDNA 의 라이브러리를 얻을 수 있다.

여기서, 대장균의 형질전환은, Hanahan의 방법[Hanahan, D.: J.Mo1. Bio1. 166: 557-580 (1983)]등에 따라서 할 수 있다. 또한 벡터로서 플라스미드를 사용하는 경우 테트라사이클린, 암피실린 등의 약제 내성 유전자를 함유하는 것이 필요하다. 또한, 플라스미드 이외의 클로닝 벡터, 예컨대 람다 파아지 등을 사용할 수 있다.

상기한 바와 같이 하여 얻어지는 형질전환체로부터 원하는 DNA를 갖는 주를 선택(스크리닝)한다. 스크리닝 방법으로서는 예컨대 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 아미노산 서열에 해당하는 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머를 합성하여, 이것을 사용하여 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 하는 방법을 들 수 있다. 예컨대, 주형 DNA로서는 게놈 DNA 또는 상기 mRNA로부터 역전사반응에 의해 합성된 cDNA를 들 수 있고, 프라이머로서는 예컨대 센스 쇄(sense chain)에 관해서는 아미노산 서열: PSLQLQPDDK (서열번호 4)에 따라서 합성한 5' -CARTTRCARCCNGAYGAYAA-3' (서열번호 5 ) 및 아미노산 서열: SYRNPEIYPTDQNIK (서열번호 6)에 따라서 합성한 5'-CCHACNGAYCARAAYATYAA-3' (서열번호 7)를 사용할 수 있다. 안티센스 쇄에 관해서는 아미노산 서열: SYRNPEIYPTDQNIK (서열번호 6 )에 따라서 합성한 3'-GGDTGNCTRGTYTTRTARTT-5' (서열번호 8) 및 아미노산 서열: GQRFNHRESHDVETEI (서열번호 9)에 따라서 합성한 3'-TTYCCDGTYGCDAARTTRGT-5' (서열번호 10)를 사용할 수 있다. 단, 본 발명에 있어서는 이들의 프라이머에 한정되는 것이 아니다.

이렇게하여 얻어진 DNA 증폭 단편을, ³²P, ³⁵S 또는 비오틴 등으로 표지시켜 탐침으로하고, 이것을 형질전환체의 cDNA 라이브러리를 변성 고정시킨 니트로셀룰로오스 필터와 혼성화시켜 수득한 포지티브 주를 검색하는 것에 의해 스크리닝할 수 있다.

(2) 염기서열의 결정

얻어진 클론에 관하여 염기 서열을 결정한다. 염기서열의 결정은 막삼 길버트의 화학수식법, 또는 디데옥시법 등의 공지 수법에 의해 행할 수 있지만, 통상은 자동 염기서열 결정기(예컨대 PERKIN-ELMER사제 377 A DNA 시퀀서 등)를 이용하여 서열결정이 행하여진다.

서열번호 1에 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자의 전체 서열을 나타낸다. 이 중, 본 발명의 유전자의 바람직한 구체예로서는 서열번호 1에 나타낸 염기서열 71번째로부터 2305번째 까지의 염기서열(서열번호 2)을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 유전자는 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열 또는 후술하는 등가 서열을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 갖는 것 이외에 축퇴 코돈에서만 상이한 동일한 폴리펩티드를 암호화하는 축퇴 이성체를 포함하는 것이다.

또 등가서열을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열은, 부위 특이적 돌연변이 유발법 등을 이용하여 제조할 수가 있다. 즉, 쿤켈법 또는 Gapped duplex 법 등의 공지수법 또는 이것에 준하는 방법에 의해, 예컨대 부위 특이적 돌연변이유발법을 이용한 돌연변이 도입용 키트(예컨대 Mutant-K(TAKARA 사제), Mutant-G(TAKARA 사제))등을 이용하거나 또는 TAKARA사의 LA PCR in vitro Mutagenesis 시리즈 키트를 이용하여 변이가 도입된다.

또한 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자에는 서열번호 1 또는 2에 나타낸 염기서열로 이루어지는 DNA 이외에 상기 DNA와 스트린젠트 조건하에서 혼성화하고 또 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA도 포함된다. 스트린젠트 조건은 예컨대 나트륨 농도가 50∼300 mM, 바람직하게는 150 mM이고, 온도가 50∼68℃, 바람직하게는 65℃에서의 조건을 말한다.

일단 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자의 염기서열(서열번호 1)이 확정되면, 상기 염기서열의 71번으로부터 2305번까지의 서열을 갖는 DNA 단편(오픈리딩 프레임)의 염기서열이 정해지기 때문에 (서열번호 2), 그 후는 화학합성에 의해서, 또는 해당 오픈 리딩 프레임 (서열번호 2)의 5' 및 3' 말단의 염기서열(예컨대 5' -ATGCCTTCACTTCAATTGCAACC-3' (서열번호 11) 및 5'-CTAGTTTAATGACAAATCTATGC-3'(서열번호 12))을 프라이머로 하여, 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR에 의해서, 또는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자의 염기서열을 갖는 DNA 단편을 탐침으로 하여 혼성화하는 것에 의해 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자를 얻을 수 있다.

또 본 발명의 유전자를 함유하는 플라스미드 pZL-Endo (후술하는 실시예 3 참조)는, 대장균 E.coli DH1OB에 도입되고 (명칭: DHlOBpZL-Endo),공업기술원 생명공학공업 기술연구소(이바라기켄 쓰쿠바시 토1쪼메 1번 3호)에 평성10년 4월28일부로 FERM BP-6335으로서 기탁되어 있다.

본 발명에서 재조합 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 바람직한 구체예로서는 서열번호 3에 나타내는 아미노산 서열 또는 그 등가서열을 포함하여 되 는 폴리펩티드를 들 수 있다. 여기서, "등가서열"이라는 것은 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열에서 적어도 1개의 아미노산이 삽입, 치환 또는 결실 또는 양 말단으로 부가가 실시된 것이고 또 상술한 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 활성을 여전히 유지하는 서열을 말한다. 그 등가서열에 있어서의 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 활성 유지라는 것은 그 활성을 이용한 실제의 사용 태양에 있어서 서열번호 3에 나타낸 서열을 모두 갖는 폴리펩티드와 동일 조건에서 거의 동일한 이용이 가능한 정도의 활성이 유지되어 있는 것을 말한다. 이러한 등가서열은, 서열번호 3에 나타낸 서열을 참조하면 당업자라면 각별한 곤란없이 선택하여 제조할 수 있는 것은 명백한 것이다. 예컨대, 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는1∼1O개, 더욱 바람직하게는 1∼5개의 아미노산이 결실되어도 좋고, 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열에 적어도 1개, 바람직하게는 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개의 아미노산이 부가 또는 삽입하더라도 좋고, 혹은 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열의 적어도 1개, 바람직하게는 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어도 좋다. 따라서, 서열목록의 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열에서 2번으로부터 744번까지 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 (서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열의 제1번째의 메티오닌이 결실된 것)도 본 발명의 단백질에 포함된다.

여기서, 본 발명에 의한 부분 아미노산 서열 분석 및 유전자 구조해석에 의해서 전구체 폴리펩티드가 적어도 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열의 510번째의 히스티딘 및 627번째 아스파라긴산의 아미노산의 C 말단측에서 절단되는 것에 의해 천연체의 2개 이상의 서브유닛이 생긴 것이 분명하게 되었다.

2. 재조합 벡터 및 형질전환체의 작성

본 발명에 있어서는 본 발명의 유전자를 포함한 DNA 분자, 특히 발현벡터가 제공된다. 이 DNA 분자는 벡터 분자에 본 발명에 의한 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 암호화하는 DNA 단편을 조립하는 것에 의해 수득할 수 있다. 따라서 본 발명의 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 암호화하는 유전자 단편을 숙주 세포내에서 복제가능하고 또한 동 유전자가 발현가능한 상태로 포함하는 DNA분자, 특히 발현 벡터의 형태로서 숙주 세포를 형질전환시키면 숙주 세포에서 본 발명의 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 생산시킬 수 있다.

본 발명에 의한 DNA 분자의 작성은 전술한 Molecular Cloning: A Laboratory Manua1에 기재된 방법에 준하여 작성할 수 있다.

(1) 재조합 벡터의 작성

본 발명에서 이용되는 벡터는 사용하는 숙주세포의 종류를 감안하면서, 바이러스, 플라스미드, 코스미드 벡터 등으로부터 적당히 선택할 수 있다.

예컨대, 숙주 세포가 대장균인 경우는 람다 파아지(λ phage)계의 박테리오파아지, pBR계(pBR322, pBR325 등), pUC계(pUC118, pUC119 등)의 플라스미드, 고초균인 경우는 pUB계의 플라스미드 (pUBl10 등), 효모인 경우는 YEp, YCp 계의 벡터 (예컨대 YEp13, YEp24, YCp50등), 또는 하기한 실시예에서 사용되는 pG-3-Not를 들 수 있다. 또한 레트로바이러스 또는 워크시니아 바이러스 등의 동물 바이러스, 배큘로바이러스 등의 곤충 바이러스 벡터를 이용할 수 있다.

벡터에 본 발명의 유전자를 삽입하기 위해서는 우선 정제된 DNA를 적당한 제한효소로 절단하여 적당한 벡터 DNA의 제한효소 부위 또는 멀티클로닝 사이트에 삽입하여 벡터에 연결하는 방법 등을 채용할 수 있다.

본 발명의 유전자는 그 유전자의 기능이 발휘되도록 벡터에 조립될 필요가 있다. 여기서, 본 발명의 벡터에는 형질전환체의 선택 마커를 포함하는 것이 바람직하고, 선택 마커로서는 약제 내성 마커, 영양요구 마커 유전자를 사용할 수가 있다.

또한 본 발명의 발현 벡터로서의 DNA 분자는 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자의 발현에 필요한 DNA 서열, 예컨대 프로모터, 전사개시 신호, 리포좀 결합부위, 번역정지 시그널, 전사 종결 시그널 등의 전사 조절 신호, 번역조절 신호 등을 갖고 있는 것이 바람직하다.

(2) 형질전환체의 작성

본 발명의 형질전환체는 본 발명의 재조합 벡터를 목적 유전자가 발현될 수 있도록 숙주중에 도입하는 것에 의해 수득할 수 있다. 여기서 숙주로서는 본 발명의 유전자를 발현시킬 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예컨대 에세리키아 콜리 (Escherichia coli)등의 대장균속, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)등의 바실루스속, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)등의 슈도모나스속에 속하는 세균을 들 수 있고, 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae),시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 칸디다 보이디니이(Candida boidinii), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)등의 효모를 들 수 있다.

숙주 세포로서는 대장균, 고초균, 효모 이외로, COS 세포, CHO 세포 등의 동물 세포를 들 수 있고, 또는 Sf9, Sf21 등의 곤충세포를 들 수 있다.

대장균 등의 세균을 숙주 세포로하는 경우, 본 발명의 재조합 벡터가 세포중에서 자율복제가능한 것과 동시에 프로모터, 리포좀 결합 서열, 본 발명의 유전자, 전사종결 서열로 구성되어 있는 것이 바람직하다. 또한 프로모터를 제어하는 유전자가 포함될 수 있다.

대장균으로서는 예컨대 에세리키아 콜리(Escherichia coli) K12, DH1, DH5α, JMl09 등을 들 수 있고, 고초균으로서는 예컨대 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) MI 114, 2O7-21 등을 들 수 있다. 고초균에는 단백질을 균체외로 분비하는 주가 존재하는 것이 알려지고 있다. 또한 단백질분해효소를 전혀 분비하지 않는 주도 알려져 있고, 이러한 주를 숙주로 사용하는 것이 바람직하다.

프로모터로서는 삽입 단편에 포함되는 숙주중에서도 작용할 수 있는 프로모터는 물론 대장균에서는 락토오스 오페론(lac), 트립토판 오페론(trp) 등의 프로모터를 들 수 있다.

세균으로 재조합 벡터를 도입하는 방법으로서는 세균에 DNA를 도입하는 방법이면 특별히 제한되지 않는다. 예컨대 칼슘 이온을 사용하는 방법 [Cohen, S.N. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69: 2110-2114(1972)], 엘렉트로포레이션법 등을 들 수 있다.

효모를 숙주로하는 경우는 예컨대 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 칸디다 유틸 리스 (Candida utilis) 등이 사용된다. 이 경우, 프로모터로서는 효모속에서 발현되는 것이면 특히 한정되지 않고, 예컨대 알코올 데히드로게나제(ADH), 산성 포스파타제(PHO), 갈락토오스 유전자(GAL), 글리세르알데히드 3인산 탈수소효소 유전자(GAPDH) 등의 프로모터, 열충격 단백질 프로모터, MFα1 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, AOX1 프로모터 등을 바람직하게 사용할 수 있다.

효모로 재조합 벡터를 도입하는 방법으로서는 효모에 DNA를 도입하는 방법이면 특별히 한정되지 않고, 예컨대 엘렉트로포레이션법[Becker, D.M. et al. : Methods. Enzymo1., 194: 182-187(1990)], 스페로플라스트법[Hinnen, A. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75: 1929-1933 (1978)], 아세트산 리튬법[Itoh, H.: J. Bacterio1., 153: 163-168 (1983)]등을 들 수 있다.

동물세포를 숙주로하는 경우는 원숭이 세포 C0S-7, Vero, 차이니즈 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cell)(CHO 세포), 마우스 세포, 쥐 GH3, 인간 FL 세포 등이 사용된다. 프로모터로서는 SRα 프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV 프로모터등이 사용되고 인간 사이토메가로 바이러스의 초기 유전자 프로모터 등을 사용할 수 있다.

동물세포로 재조합 벡터를 도입하는 방법으로서는 예컨대 엘렉트로포레이션법, 인산 칼슘법, 리포펙션법 등을 들 수 있다.

곤충세포를 숙주로 하는 경우는, Sf9세포, Sf21 세포 등이 사용된다.

곤충세포로 재조합 벡터를 도입하는 방법으로서는 예컨대 인산 칼슘법, 리포팩션법, 엘렉트로포레이션법 등을 사용할 수 있다.

4. 본 발명의 단백질의 생산

본 발명의 단백질은 본 발명의 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 것, 또는 상기 아미노산 서열에서 적어도 1개의 아미노산에 상기 변이가 도입된 아미노산 서열을 갖고 또 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 활성을 갖는 것이다.

본 발명의 단백질은 상기 형질전환체를 배양하고 그 배양물로부터 채취하는 것에 의해 얻을 수 있다. 「배양물」이라는 것은 배양 상청액, 배양 세포, 배양균체 또는 세포 또는 균체의 파쇄물 중의 어느 하나를 의미한다.

본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은 숙주 배양에 이용되는 통상의 방법에 의해 실행한다.

대장균이나 효모균 등의 미생물을 숙주로 하여 수득한 형질전환체를 배양하는 배지로서는 미생물이 이용할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하여, 형질전환체의 배양을 효율적으로 할 수 있는 배지라면 천연 배지, 합성 배지 어떤 것이라도 사용할 수 있다.

탄소원으로서는, 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스, 전분 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알코올류가 사용된다.

질소원으로서는 암모니아, 염화 암모늄, 황산 암모늄, 아세트산 암모늄, 인산 암모늄 등의 무기 산 또는 유기산의 암모늄염 또는 그외의 질소함유 화합물 이외에, 펩톤, 고기 엑기스, 콘스티 푸리카 등이 쓰인다.

무기물로서는 인산제일칼륨, 인산제이칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염 화나트륨, 황산제일철, 황산망간, 황산동, 탄산칼슘 등이 사용된다.

배양은 통상 진탕배양 또는 통기교반 배양 등의 호기 조건하, 37℃에서 12∼72시간 실시한다. 배양기간중, pH는 4∼7.5로 유지한다. pH의 조정은 무기 또는 유기산, 알칼리 용액 등을 사용하여 실시한다.

배양중은 필요에 따라서 암피실린 또는 테트라사이클린 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수 있다.

프로모터로서는 유도성의 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환시킨 미생물을 배양하는 경우는 필요에 따라서 유도제를 배지에 첨가할 수 있다. 예컨대 Lac 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토시드 (IPTG) 등을 trp 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환시킨 미생물을 배양할 때에는 인돌 아세트산 (IAA) 등을 배지에 첨가할 수 있다.

동물세포를 숙주로하여 수득한 형질전환체를 배양하는 배지로서는 일반적으로 사용되는 RPMI1640 배지, DMEM 배지 또는 이들의 배지에 우 태아 혈청 등을 첨가한 배지 등이 사용된다.

배양은 통상 5% CO₂존재하, 37℃에서 2∼10일간 한다. 배양중은 필요에 따라서 카나마이신, 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수 있다.

배양후 본 발명의 단백질이 균체내 또는 세포내에 생산되는 경우에는 균체 또는 세포를 파쇄하는 것에 의해 본 발명의 단백질을 추출한다. 또한 본 발명의 단백질이 균체외 또는 세포외로 생산되는 경우에는 배양액을 그대로 사용하든지 원심 분리 등에 의해 균체 또는 세포를 제거한다.

재조합 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 정제는 공지의 분리, 정제방법을 적당히 조합하여 실시할 수 있다. 예컨대 염침전, 용매 침전과 같은 용해성의 차이를 이용하는 방법, 투석, 한외여과, 겔 여과 및 SDS-폴리아크릴 전기영동과 같은 분자량의 차이를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피 같은 전하의 차이를 이용하는 방법, 소수 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 같은 소수성의 차이를 이용하는 방법, 또는 등전점 전기영동과 같은 등전점의 차이를 방법 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서는 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이 사카로마이세스 세레비시에를 숙주로하여 GAPDH 프로모터의 지배하에 이 유전자를 발현시킨 경우, 세포 추출액 중에 높은 효소 활성이 확인되었다. 이것에 의해 재조합체에서 본 발명의 유전자를 발현하는 것에 의해 활성형의 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 대량 생산가능함이 밝혀졌다.

도 1은 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 정제 결과를 나타내는 전기영동사진,

도 2는 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자의 전체 길이를 포함하는 pZL-Endo의 제한효소지도,

도 3은 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자의 전체 길이를 포함하는 pZL-Endo의 SalI-NotI 부위에 삽입된 단편의 전체 염기서열을 도시,

도 4는 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자의 전체 길이를 포함하는 pZL-Endo의 SalI-NotI 부위에 삽입된 단편의 전체 염기서열을 도시 (도 3의 계속),

도 5는 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자로부터 추정되는 아미노산 서열 및 상기 아미노산을 암호화하는 DNA의 염기 서열을 도시,

도 6은 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자로부터 추정되는 아미노산 서열 및 상기 아미노산을 암호화하는 DNA의 염기서열을 도시 (도 5의 계속),

도 7은 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자로부터 추정되는 아미노산 서열 및 상기 아미노산을 암호화하는 DNA의 염기서열을 도시 (도 6의 계속),

도 8은 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자를 포함하는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)용의 발현 벡터 pGEndo-SC의 구조를 도시,

도 9는 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자가 도입된 효모에서의 상기 효소의 발현을 나타내는 크로마토그래피 사진.

이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예에 그 기술적 범위가 한정되는 것이 아니다. 또한 조작 순서는 특별히 기재하지 않은 한 Molecular C1oning: A Laboratory Manual (Sambrook, Maniatis등, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989))에 기재된 방법에 따랐다.

[실시예 1] 효소활성의 측정

엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 활성은 기본적으로 S. Kadowaki, et al., Agric. Biol. Chem., 54, 97 (1990)에 나타낸 방법에 따랐다. 즉, 단실화된 인간 아시알로트랜스페링 리코펩티드 (DNS-GP)를 기질로서 사용하고, pH 6.0의 인산 칼륨 완충액 중 37℃에서 반응을 실시하고 이하에 나타낸 조건에서 박층 크로마토그래피 (TLC) 또는 HPLC에 의해 측정하였다.

TLC에서의 분석조건

전개상: HPTLC 실리카 겔 60 (머크)

용매: 부탄올: 아세트산: 물= 2:1:1

검출: 형광법에의한 검출

HPLC 에서의 분석조건

칼럼: TSK-gel ODS80TM (토소)

이동상: 25 mM 붕산 나트륨 완충액 pH 7.5 + 11% 아세토니트릴

칼럼 온도: 50℃

유속: 0.5 m1/분

검출기: 형광검출기

활성의 정의는 상기 HPLC에 의해 측정한 조건으로 1분간 1μmo1의 단실화 아스파라길 아세틸글루코사민을 생성하는 효소량을 1 유닛으로 정의하였다.

[실시예 2〕 무코르 히에말리스(Mucor hiemalis)의 배양

500 ml용 사카구치 플라스크에 100 ml 배지(갈락토오스 2%, 효모 엑기스 3%)를 넣고, 슬랜트 3 내지 5분의 1본분의 무코르 히에말리스(Mucor hiemalis) 포자를 접종하고 28℃에서 2일간 배양하였다. mRNA의 제조에는 그 배양액을 흡입여과하여 분리한 균체를 사용하였다.

또한 효소의 제조에 관해서는 상기 배양액을 배양한 후 3리터용 단지 발효기에 2리터의 배지를 넣어 교체하여 28℃, 회전수 300 내지 400 rpm, 통기량 2리터/분의 조건으로 4일간 배양하였다.

〔실시예 3〕신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 정제

실시예 2에서 수득한 배양액 4 리터분(3 리터용 단지 발효기 배양 2회분)을 흡입 여과하여 균체를 분리하고, 한외여과(분자량 13000 커트)에 의해 200 ml 까지 농축시킨 것을 조 효소액으로 하였다. 이것을 5 mM EDTA를 포함하는 10 mM 인산 칼륨 완충액 (pH 7.0)으로 평형화한 이온교환 크로마토그래피 (파마시아사 Q Sepharose FF, 50O ml)에 통과시켰다. 칼럼을 동일 완충액으로 세정하고, 계속해서 900 ml의 0 M∼0.3 M 식염의 선상 구배로 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 용리시켰다. 활성 분획에 최종 농도가 1M 황산 암모늄, 5 mM EDTA를 포함하는 50 mM 인산 칼륨 (pH 7.0)으로 되도록 시약을 가하여 동일 완충액으로 평형화하여 소수 크로마토그래피(토소사 Phenyl-TOYOPEARL 650 S 20O ml)에 통과시켰다. 칼럼을 동일 완충액으로 세정하고, 다음에 1 mM의 EDTA를 포함하는 황산 암모늄 600 m1를 사용하여 1 M∼OM의 선상 구배로 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 용리시켰다.

얻어진 용리액을 한외여과막(분자량 커트 13000)을 이용하여 5 ml까지 농축하고, 계속해서 0.l5 M의 식염, 1 mM의 EDTA를 포함하는 10 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 세정, 탈염하였다. 다음에 동일 완충액으로 평형화한 겔 여과 크로마토그래피 (파마시아사 Sephacryl S300)에 걸어, 동일 완충액으로 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 용리시켰다.

활성 분획을 한외여과막(분자량 커트 13000)으로 농축하고, 계속해서 1 mM의 EDTA를 포함하는 10 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 세정, 탈염하였다. 다음에 동일 완충액으로 평형화한 히드록시아파타이트 크로로마트그래피 (토소사 TSK-gel HAlOOO)에 통과시켰다. 칼럼을 동일 완충액으로 세정하고, 이어서 1 mM의 EDTA를 포함하는 인산 칼륨 (pH 7.0) 30 m1를 사용하여 0 M∼0.3 M의 선상 구배로 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 용리시켰다.

활성 분획을 한외여과막(분자량 커트 13000)으로 농축하고, 계속해서 이미노디아세트산으로 pH 7.1로 제조된 25 mM 비스트리스 완충액으로 세정, 탈염하였다. 다음에 동일 완충액으로 평형화하여 등전점 크로마토그래피 (파마시아사 MonoP)에 통과시켰다. 칼럼을 동일 완충액으로 세정하고, 이어서 5 0 ml의 이미노디아세트산으로 pH 3.9로 제조된 10% 폴리버퍼 74 (파마시아사)로 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 용리시켰다.

활성 분획을 한외여과막(분자량 커트 13000)으로 농축하고, 계속해서 1 mM의 EDTA를 포함하는 10 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 세정, 탈염하였다. 다음에 동일 완충액으로써 평형화한 이온교환 크로마토그래피(파마시아사 MonoQ)에 통과시켰다. 칼럼을 동일 완충액으로 세정하고, 이어서 30 m1의 0 M∼0.3 M 식염의 선상 구배로 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 용리시켰다.

활성 분획을 한외여과막 (분자량 커트 13000)으로 농축하고, 계속해서 1 mM 의 EDTA를 포함하는 50 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 세정, 탈염한 것을 효소샘플로 하였다. 또, 각 칼럼 크로마토그래피는 파마시아사 FPLC를 이용하여 실행하였다.

단백질량은 바이오라드사 프로테인 에세이 키트를 이용하고 또 흡광도(280 nm)에 의해 측정하였다. 단백질의 분자량, 등전점은 SDS-PAGE (15-25% 구배), 겔 여과 크로마토그래피, IEF-PAGE 등에 의해 측정하였다.

Native-SDSPAGE, IEF-SDSPAGE에 의한 2차원 전기영동 및 상기 크로마토그래피에 있어서 각 분획의 활성과 SDS-PAGE 분석의 결과로부터 SDS-PAGE 상에서 적어도 60 kDa (p60로 칭한다) 및 14 kDa (p14로 칭함)의 밴드가 검출되었다 (도 1).

〔실시예 4〕신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 부분 아미노산 서열의 결정

부분 아미노산 서열 분석은 이와무쓰(생화학 63, 139∼143 (1991))의 방법에 의해 실시하였다. 정제 효소를 전기영동용 완충액(10% 글리세롤, 2.5% SDS, 2% 2-머캅토에탄올, 62 mM 트리스 염산 완충액(pH 6.8))에 현탁시키고 SDS 폴리아크릴아미드 전기영동에 제공하였다. 영동후, 엘렉트로블로팅에 의해 해당 효소를 겔로부터 10 cm x 7 cm의 PVDF 막((ProBlot) 업라이트 바이오시스템즈사제)으로 전사시켰다. 엘렉트로블로팅 장치로서는 잘트블로트 IIs 형(잘트리우스사)을 이용하여 엘렉트로블로팅을 160 mA로 1시간 실시하였다.

전사후, 해당 효소의 전사된 부분의 막을 절취하고 그 일부를 직접 기상 블로팅 시퀀서로 분석하고 N말단 아미노산 서열을 결정하였다. 또한 나머지 막은 약 300 μ1의 환원용 완충액(8 M 구아니딘 염산, 0.5 M 트리스염산 완충액 (pH 8.5), 0.3% EDTA, 2% 아세트니트릴)에 담구고 1 mg의 디티오쓰레이톨(DTT)을 가하여, 아르곤하 25℃에서 약 1시간 동안 환원하였다. 이것에 3.0 mg의 모노요오드 아세트산을 0.5 N 수산화 나트륨액 10μl에 녹인 것을 가하여, 차광하에서 20분간 교반하였다. PVDF 막을 꺼내어, 2% 아세토니트릴로 충분히 세정한 후, 0.5% 폴리비닐피롤리돈 40을 포함하는 10O mM 아세트산에 침지시켜 30분간 방치하였다. 이어 PVDF 막을 물로 충분히 세정하고 lmm 사방으로 절단한 막을 분해용 완충액 (8% 아세토니트릴, 90 mM 트리스염산 완충액 (pH 9.0))에 침지하고, 아크로모박터 프로테아제 I (와코 쥰야쿠사제) 1 pmo1을 가하고 실온에서 15 시간 분해시켰다. 그 분해물을 C 18 칼럼(와코 쥰야쿠사제 Wakosil AR II C18 300 Å 2.0 X 150 mm)을 사용하여 역상 고속 액체 크로마토그래피(히타치 L 6200)에 의해 분리하여, 각 서브유닛에 관해서 7종류의 펩티드 단편을 얻었다.

펩티드의 용출 용매로서는 A 용매(0.05% 트리플루오로아세트산), B 용매(0.02% 트리플루오로아세트산을 포함하는 2-프로판올/아세트니트릴 7:3)를 사용하고 용출은 B 용매에 관하여 2∼50%의 직선 농도 구배로 O.25 mL/분의 유속으로 40분간 용출시키는 것에 의해 실시하였다.

신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 후보 단백질로부터 얻어진 단편화 펩티드에 관하여 아미노산 서열분석을 실시하였다. p60 유래의 단편을 p60-AP, p1 4 유래의 단편을 p14-AP로 명명하였다. 얻어진 단편화 펩티드에 관해서 아미노산 서열 결정 시험을 기상 프로테인 시퀀서(PPSO-10형(Shimazu제작소))를 이용하여 매 뉴얼에 따라 자동 에드맨 분해법에 의해 실시하였다. 얻어진 부분 아미노산 서열을 표 1에 수록한다.

표 1

엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 후보 단백질의 부분 아미노산 서열

p60 p60-AP-5 PSLQLQPDDK (서열번호 17) p60-AP-6 (K) SYRNPEIYPtDQNIK (서열번호 18) p60-AP-8 (K) FNVSSVALQPRVK (서열번호 19) p60-AP-9 (K) MDRLFLCGgK (서열번호 20) S p60-AP-11 (K) GQRFNHREShDVETEI (서열번호 21) mal p lllt p14 p14-AP-1 (K) EGYISSSGSIDLSLN (서열번호 22)

표 1에 기재한 아미노산 서열에 있어서, 알파벳의 소문자로 표시된 아미노산은 아미노산 서열상 불확정 아미노산을 의미한다.

부분 아미노산 서열로 사용한 아크로모박터 프로테아제 I은 리신 잔기의 카르복시기 측을 특이적으로 절단하기 때문에 이하의 배열에 N 말단에 괄호 표기로 K(리신)를 기록한다. p60-AP-5는 N 말단 아미노산 서열인 것이 판명되었기 때문에 괄호 표기의 K(리신)를 제외하였다.

p60 및 p14의 아크로모박터 프로테아제 I 분해물에 관해서는 C18 칼럼(지엘 사이언스 Inertsil ODS-3 0.5 x 40 mm)를 사용하여 역상 고속 액체 크로마토그래피 (히타치 L 6200)를 온라인화한 질량분석기(PE SciexAPI-III)로 질량분석도 포함하여 실시하였다. 결과 분석을 표 2에 나타낸다.

표 2

* B는 시스테인, 카르복시메틸을 나타낸다.

표 2중, 질량 (M+H+)에 있어서 실측치가 701.50를 갖는 단편은 p60-AP-7, 실측치가 1541.50를 갖는 단편은 p14-AP-3의 분자량에 거의 일치하고, 그의 C 말단의 아미노산이 K (리신)가 아닌 것을 알았다. 아크로모박터 프로테아제 I로 분해한 단편은 그 효소의 기질 특이성에 의해 서브유닛 자신의 C 말단 단편 이외의 단편은 K(리신)가 C 말단 아미노산 잔기로 되는 것으로부터 이 단편화 펩티드가 p60 및 p14의 서브유닛의 C 말단 단편이라고 추정하였다.

결정된 p60 및 p14의 부분 아미노산 서열을 단백질 데이터 베이스 BLASTP를 사용하여 상동성 검색을 실행한 경우, 수득한 서열은 신규한 것을 알았다. 이상의 결과로부터 p60 및 p14를 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 후보로 하여 유전자 클로닝을 실시하였다.

[실시예 5〕 무코르 히에말리스(Mucor hiemalis)주 cDNA 라이브러리의 작성 먼저 실시예 2에서 수득한 균체 5 g으로부터 ISOGEN (닛폰진사)을 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 추출한 전체 RNA로부터 mRNA 정제 키트 (Pharmacia Biotech)를 이용하여 mRNA를 정제하였다. SuperScriptTM Lambda System for cDNA Synthesis andλ Cloning kit (GIBCO BRL)를 이용하여 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, SalI 어댑터를 접속시킨 후 λ ZipLoxTMSal I-Not I Arms (GIBCOBRL)에 접속(라이게이션)하였다. GigapackIII Gold Packaging Extract (Stratagene)를 사용하여 팩케이징을 실시하고 E. coli Yl090주에 감염시켜 cDNA 라이브러리를 완성시켰다.

[실시예 6〕신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 cDNA의 클로닝

부분 아미노산 서열 p60-AP-5, p60-AP-6, p60-AP-11을 바탕으로 PCR 프라이머를 설계하였다. 이하에 그 서열을 나타낸다. 사용하고 있는 기호는 모두 IUPAC-IUB에 기초로한다.

p60-AP-5

p60-AP-5F 5' CARTTRCARCCNGAYGAYAA 3' (센스 프라이머) (서열번호 5)

p60-AP-6

p60-AP-6F 5' CCHACNGAYCARAAYATYAA 3' (센스 프라이머)(서열번호 7)

p60-AP-6R 3' GGDTGNCTRGTYTTRTARTT 5' (안티센스 프라이머)(서열번호 8)

p60-AP-11

p60-AP-llR 3'TTYCCDGTYGCDAARTTRGT5' (안티센스 프라이머)(서열번호 10)

무코르 히에말리스(Mucor hiemalis) 배양균체로부터 페놀법에 의해 게놈 DNA를 작성하고 게놈 PCR(94℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 1분, 30 사이클)을 실시한 경우 특이적으로 증폭하는 밴드가 확인되었다. p60에 관해서는 p60-AP-5F와 p60-AP-1lR과의 프라이머의 조합에 의해 1.7 kb, p60-AP-5F와 p60-AP-6R과의 프라이머의 조합에 의해 1.5 kb, p60-AP-6F와 p60-AP-1lR과의 프라이머의 조합에 의해 0.2 kb의 PCR 단편이 얻어졌다. 이 단편에 관해서 pCR-Script 클로닝 키트(Strategene)를 사용하여 pCR-ScriptAmp에 서브클로닝하였다. 제한효소 분해에 의한 해석으로 p60-AP-5F와 p60-AP-1lR과의 증폭 단편이 p60-AP-5F와 p60-AP-6R 및 p60-AP-6F와 p60-AP-1lR과의 증폭 단편을 포함하고 있는 것이 추정되었기 때문에, p60-AP-5F와 p60-AP-1lR과의 증폭 단편의 염기서열을 어플라이드 바이오 시스템즈사 PRISM Ready Reaction kit 및 같은 제조사 제조의 PRISM377 DNA 시퀀서(sequencer)를 이용하여 실시하였다. 유전자 해석은 히타치 소프트웨어 엔지니어링(engineering) DNASIS 등을 이용하여 실시하였다.

그 결과, p60-AP-5F와 p60-AP-1lR과의 증폭 단편은 결정된 다른 부분 아미노산 서열을 포함하고 있었다. 따라서 이 DNA 단편은 p60 유전자의 일부인 것이 판명되었기때문에, 더욱 PCR 증폭 단편의 내측의 서열을 바탕으로 새롭게 DNA 프라이머를 작성하여, 실시예 5에서 얻은 mRNA를 주형으로 하여, Access RT-PCR System (Promega)을 이용하여 RT-PCR(조건은 게놈 PCR과 동일)을 실시하였다. 새롭게 작성한 DNA 프라이머의 서열은 이하와 같다.

p60-AP-5NF 5' CACTTAAGTCTATGAATGAG 3' (센스 프라이머)(서열번호 13)

p60-AP-6NR 3' CGATAGCTTTAGGTCTCTAA 5' (안티센스 프라이머)(서열번호 14) 그 결과, 약 1.2 kb의 단편이 증폭되었다. 증폭된 단편의 염기서열을 결정한 바 인트론을 포함하지 않는 단편이 얻어졌기 때문에, 이 단편을 탐침으로하여 cDNA의 클로닝을 실시하였다. 탐침은 Megaprime DNA labelling systems (Amersham)를 이용하여 α-³²P dCTP(11O TBq/mmo1)로 표지시켰다.

실시예 5에서 수득한 cDNA 라이브러리로부터 전체 길이의 유전자 취득은 플라크 하이브리다이제이션에 의해 실시하였다. 그 결과 20만개 플라크로부터 5개의 포지티브 클론을 얻었다. 그중 4개의 클론에 관하여 2차 스크리닝을 실시하여 시그널 그래프를 얻었다. 또한 플라크로부터 수득한 파아지 액을 E. coli DHlOB 주에 감염시켜, 파아지로부터 pZL1 유래의 플라스미드를 회수하였다. 이들의 클론에 관하여 제한 효소분석을 실시하고 상류영역을 가장 길게 포함하는 클론에 관해서 염기 서열의 해석을 실시하였다. 또한 이 플라스미드를 pZL-Endo로 명명한다 (도 2).

삽입되어 있던 약 2.3 kb의 SalI-NotI 단편에 관해서 염기서열을 결정하였다. 즉, pBluescript II KS+ (Strategene) 또는 pUC118(다까라스조)로 세분화한 단편을 서브클로닝하고, 이어 엑소뉴클레아제 III 및 맥빈누크레아제를 사용하여 연속한 결실 변이체를 작성하는 것에 의해 여러가지의 결실 변이를 갖는 플라스미드를 작성하고 DNA 시퀀서를 이용하여 2370 bp로 이루어지는 SalI-NotI 단편의 서열을 결정하였다 (도 3∼4, 서열번호 1).

예상되는 구조 유전자의 영역의 해석을 실시한 경우 744개로부터 구성되는 아미노산 서열(추정 분자량 85 kDa)을 암호화하는 오픈 리딩 프레임이 존재하고 있다(도 5∼7, 서열번호 2). 이 아미노산 서열은 결정한 p60 및 p14의 부분 아미노산서열 모두를 포함하고 있는 것을 알았다. p60-AP-5의 N 말단 측의 이웃하는 아미노산이 리신이 아니라 메티오닌이기때문에, 이 메티오닌를 암호화하는 ATG가 번역의 개시 코돈인 것을 확인하였다. 본 발명의 효소의 N 말단은 프롤린인 것이 밝혀졌다.

한편, 질량분석의 결과와 동일하게, p14-AP-3가 본 발명의 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 C 말단인 것을 알았다. 또한 질량분석의 결과와 더불어 p14의 N 말단의 적어도 일종은 서열번호 2에 나타내는 아미노산 서열의 628번째의 세린이라고 추정되었다.

이상의 것부터 본 발명의 유전자는 5' 영역에 p60, 3' 영역에 p14를 암호화하는 것을 알았다. 아미노산 서열로부터 N 말단 시그널 서열은 밝혀지지 않았기 때문에 본 발명의 효소는 세포내 단백질인 것으로 생각되지만 도 1에서 복수의 밴드가 존재하는 점에서 본 발명의 효소는 균체의 용균이 원인인 것으로 생각되는 단백질 분해 효소의 작용을 받고 있는 것으로 생각되었다.

[실시예 7〕 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자의 발현 벡터의 구축 본 실시예에서는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자 및 GAPDH 유전자 프로모터-PGK 터미네이터를 포함하는, TRP1 유전자를 상보하는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 조합용 발현 벡터의 작성을 실시하였다.

실시예 3에서 확인한 744 아미노산을 암호화하고 있는 오픈 리딩 프레임을 얻기 위해서 양단에 NotI 부위를 부가한 N말단, C말단의 아미노산 서열에 상당하는 DNA 서열에 기초한 DNA 프라이머를 합성하고 pZL-Endo를 주형으로하여 PCR을 실행하여 증폭 단편을 얻었다. 이하에 센스, 안티센스의 프라이머 서열을 기재한다.

Endo-Not-F (센스 프라이머)

5' GGGGCGGCCGCTTTTATTTTACATAAATATGCCTTCACTTC 3' (서열번호 15)

Endo-Not-R (안티센스 프라이머)

5' CCCGCGGCCGCCTAGTTTAATGACAAATCTATGCTACC 3' (서열번호 16)

증폭된 단편을 아가로오스 겔 전기영동으로 분리한 후, Prep-A-Gene DNA Purification System (Bio-Rad)을 이용하여 회수, 정제하였다. 또한 이 단편을 Not I으로 분해시킨 후 정제하여 pBluescript II KS+의 NotI에 삽입하여 pBlue-Endo-Not를 작성하였다.

신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자는 곰팡이 유래의 유전자이기 때문에 효모에서의 발현이 적합한 것으로 생각하여, 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)의 글리세르알데히드 3인산 데히드로게나제 (GAPDH) 유전자의 프로모터, 3-포스포글리세린산 키나제 (PGK) 유전자 터미네이터 및 트립토판 합성유전자 TRP1 유전자를 포함하는, trp1 유전자를 선택 마커로 하는 사카로마이세스 세레비시에용의 발현 플라스미드를, 발현 벡터 pG-3 (Methods in Enzymo1ogy Vo1.194 p.389)을 베이스로하여 작성하였다. pG-3를 BamHI으로 분해시켜 클레노 처리에 의해 무딘 말단으로 만들고 NotI 링커를 부가하여 pG-3-Not를 작성하였다.

상술한 pBlue-Endo-Not를 NotI으로 분해시켜 약 2.3 kb의 삽입 단편을 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리 정제하고, 이것을 pG-3-Not의 NotI 부위에 삽입하여 pGEndo-SC를 구축하였다 (도 8).

[실시예 8〕신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)에서의 발현

숙주로서 효모 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) YPH 500 주(Strategene)의 pep4유전자 파괴주를 사용하였다. pep4 유전자 파괴주에 관해서는 Sikorski, R. S.와 Hieter, P의 방법(Genetics 122권 19-27 (1989))에 의해 작성하였다. 10 μg의 pGEndo-SC를 이용하여 상기 주를 형질전환하였다. 형질전환은 아세트산 리튬법(W0/95/32289호 참조)에 의해 실시하고 형질전환체는 트립토판을 포함하지 않는 배지 플레이트(효모 니트로겐 베이스 0.67%, 카자미노산 0.5%, 글루코오스 1%)로써 선택하였다.

얻어진 형질전환에 관해서 균체내의 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 활성을 확인하였다. 5 mL의 YPD 배지(효모 엑기스 1%, 폴리펩톤 2%, 글루코오스 2%)중, 30℃에서 2일간 배양한 균에 관해서 1500 g, 5분간, 4℃에서 원심분리 하여 배양상청액과 균체를 분리하고 균체는 증류수로 세정하였다. 균체에 50 mM 인산칼륨 완충액 (pH 6.0)과 5 mM EDTA의 혼합액을 1O0 마이크로리터 가하여 잘 현탁시켰다. 또한 50 mg의 유리 비이드를 가하여 격하게 교반한 후 원심분리하여 상청액을 세포 추출액으로 하였다.

활성측정은 기질로서 DNS-GP를 사용하여 TLC 또는 HPLC로 실시하였다. TLC 에서의 결과를 도 9에 도시한다. 무코르 히에말리스(Mucor hiemalis) 배양 상청액으로부터 정제한 효소와 반응시킨 샘플과 동일하게 pGEndo-SC 생성물인 단실화 아스파라길아세틸글루코사민 (DNS-Asn-GlcNAc)과 일치하는 피이크가 얻어졌다. 한편, 네거티브 대조용인 pG3-Not로 형질전환한 주의 배양 상청액을 사용한 것으로부터는 DNS-Asn-GlcNAc에 대응하는 피이크는 검출되지 않았다. pGEndo-SC의 세포 추출액을 1O배 농축하여 탈염한 것을 조효소로 하여 DNS-GP와 반응시켜 DNS-Asn-GlcNAc에 해당하는 피이크를 상기 조건의 HPLC를 이용하여 분취하였다. 분취한 샘플을 증발기로 농축하여 매스 스펙트럼 분석을 실시하였다. 그 결과, 분취한 샘플의 분석 결과가 DNS-Asn-GlcNAc의 분석 결과와 일치하는 것을 확인하였다. 따라서, pGEndo-SC의 삽입 단편에의해 암호화되는 유전자 산물은 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제인 것을 알았다.

표 3에 배지 1 mL 당의 본 발명의 신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 활성(생산량)을 나타낸다. 이 결과는 무코르 히에말리스(Mucor hiemalis) 값의 48배이었다.

표 3

신규 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 활성

활성(유닛/리터)
무코르 히에말리스(Mucor hiemalis) 배지상청액 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자 도입 에스. 세레비시에	0.9 43.2

주) 배양액을 집균한 후 균체를 유리 비이드로 분쇄하고 그의 원심분리후의 상청액의 활성을 측정하고 그 값으로부터 배양액당 활성을 산출하였다.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본국 특허출원 평10-141717호의 명세서 및/또는 도면에 기재된 내용을 포함한다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 포함하는 것으로 한다.

본 발명에 의해 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제, 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터, 이 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체 및 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 유전자를 함유하는 벡터를 숙주에 도입하고 유전자를 발현시키는 것에 의해 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 효율적으로 대량 생산할 수 있다.

본 발명의 효소는 당쇄의 분석, 해석 및 당쇄의 변형을 실시하는 데 있어서 산업상 중요한 효소이고, 본 발명에 의해 수득한 형질전환체는 본 효소를 대량 생산하고 이들 효소를 사용하여 산업계에 큰 공헌을 할 수 있다.

서열목록의 설명

서열번호 4: 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 부분 아미노산 서열.

서열번호 5: 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 부분 아미노산 서열로부터 설계한 올리고뉴클레오티드.

서열번호 5: n은 a, g, c 또는 t을 나타낸다 (존재위치 12).

서열번호 6: 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 부분 아미노산 서열.

서열번호 7: 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 부분 아미노산 서열로부터 설계한 올리고뉴클레오티드.

서열번호 7: n은 a, g, c 또는 t를 나타낸다 (존재위치 6).

서열번호 8: 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 부분 아미노산 서열로부터 설계한 올리고뉴클레오티드.

서열번호 8: n은 a, g, c 또는 t를 나타낸다 (존재위치 15).

서열번호 9: 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 부분 아미노산 서열.

서열번호 1O: 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 부분 아미노산 서열로부터 설계한 올리고뉴클레오티드.

서열번호 11: 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자의 5' 말단 영역의 올리고뉴클레오티드 서열.

서열번호 12: 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자의 3' 말단 영역의 올리고뉴클레오티드 서열.

서열번호 13: 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자 서열로부터 설계한 올리고뉴클레오티드.

서열번호 14: 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자 서열로부터 설계한 올리고뉴클레오티드.

서열번호 15: 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자 서열로부터 설계한 올리고뉴클레오티드.

서열번호 16: 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자 서열로부터 설계한 올리고뉴클레오티드.

서열번호 20: Xaa는 Met 또는 Ser를 나타낸다 (존재위치 2).

서열번호 21: Xaa는 Gly 또는 Met을 나타낸다 (존재위치 2).

서열번호 21: Xaa는 Gln 또는 Ala를 나타낸다 (존재위치 3).

서열번호 21: Xaa는 Arg 또는 Leu를 나타낸다 (존재위치 4).

서열번호 21: Xaa는 Asn 또는 Pro를 나타낸다 (존재위치 6).

서열번호 21: Xaa는 Arg 또는 Leu를 나타낸다 (존재위치 8).

서열번호 21: Xaa는 Glu 또는 Leu를 나타낸다 (존재위치 9).

서열번호 21: Xaa는 Ser 또는 Leu를 나타낸다 (존재위치 1O)

서열번호 21: Xaa는 His 또는 Thr를 나타낸다 (존재위치 11)

서열번호 27: 카르복시메틸시스테인 (존재위치 3).

서열번호 28: 카르복시메틸시스테인 (존재위치 6).

서열번호 33: 카르복시메틸시스테인 (존재위치 8).

<110> Kirin Beer Kabushiki Kaisha <120> Endo-beta-N-acetylglucosaminidase gene <160> 37 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2369 <212> DNA <213> Mucor hiemalis <400> 1 gtcgacccac gcgtccgcgg acgcgtgggc ggacgcgtgg gcggacgcgt gggttttatt 60 ttacataaat atgccttcac ttcaattgca acctgatgac aaactagcac ctgtttcttt 120 tgcacttaag tctatgaatg agttgaggga ctggacgcca gacgaaaaga taaagtttaa 180 cgtttcaagc gtggcactac agcctcgtgt gaaaaacgcc ctgaaacctc aattattgtt 240 aactcatgat atggcaggag gatataaaga agataaaaat attcaaggaa acaattataa 300 agacatttat aacattcaat attggcattt agctgatact tttgtatatt tctctcatga 360 gcgagttagc attcctccag tcaattggac aaatgcttgt catagaaatg gtgtaaagtg 420 tttaggtact tttttagtag aaggaaataa ccaaatgcat gaaatggaag ccttgcttca 480 cggtccacct ttacttaata acactgacga ccctatgaga ttatggagtc cgtattatgc 540 agaccaatta gttgctattg ctaaacacta tggttttgat ggctggttgt tcaatattga 600 atgcgaattc tttccttttc ctacaaatcc aaaattcaaa gctgaagagt tggcaaagtt 660 tctacactat tttaaggaaa aattgcataa cgaaatacct ggatctcaac tcatttggta 720 cgacagcatg acaaatgaag gagaaatcca ctggcagaac cagctcacat ggaaaaatga 780 gttatttttt aaaaacacgg atggtatttt tttgaattat tggtggaaaa aagaataccc 840 tgaaatggcg cgtagagtag ctgaaggaat aggtagatca ggtttagaag tttattttgg 900 tacagatgta tgggaaaggc atacttatgg tggcggtggt ttcaaatcat ataagggtgt 960 aaaaactgcc tactctgcaa tgacatcttc tgcattattt ggtatggcat ggacatacga 1020 gcatttcgaa aagtctgaat ttgaaaagat ggatcgtttg ttttggtgtg gtggtaaata 1080 ctctgactat cctcccccac ctcctaaaaa cccagatgac gaaaaagaag tagaaagcga 1140 tgatagtgaa gatgagctca tgtacggaca caagaaaggt attgctgaca cggtagaatc 1200 tattcctgta ccaggaacag attggtttgt taccaatttt gatagggggt ttggaaatag 1260 gttttattat agaggaaaga gattactttc tcagccttgg tcccatttat cgcatcaagc 1320 tattctcccc aataaaagct atcgaaatcc agagatttat cccactgatc aaaacattaa 1380 aatcactagt tctctcgatt gcgatcatgg agcttttctt ggtggaacct cgcttattat 1440 caaaggccaa cgtttcaatc atagagaatc gcatgatgtt gaaactgaaa ttagtatacc 1500 tctgtataag ctttcattag atgctagtaa aggatgctca ttgcgttata tttatagaac 1560 tttgttgatg aaagatgtaa agttgacagt agcatgtcac ttttcgttaa aaacaaacga 1620 ctcagttaat ttcttcaagg tatggcagcc agatgaaaat ttctcttttg aatatgatga 1680 tggaatgaga gccactgtta caactgaaaa ttctaccgaa agcagatgct ttttattacg 1740 tacaacagaa gaagatacag gagaaaatga ttggataaca aaaactatta atgtgcctgc 1800 tgttccagaa ggaagtcaat tatacattac aagacttgaa gtgagcgtag tattagatac 1860 agctggttta gtaggtcttg ttaatcaagt tattgcttgc ttgggatata ttagcatcat 1920 accaactata aattctggaa taaaaacaga ttcatcacgc attattcagg atctcttttg 1980 gaaagatcag aaatatacca aaatcggaaa agaaagttta gacgacatag ctcaagaaga 2040 agttcataga tattatggaa cattgaactg ggaaaacaca gcaaatgtag taaacgcttg 2100 ggaggaaata gattactaca acgtttttta caaagaaagt gacgactctg caactcgcat 2160 ctttttagga acagcattct gtaatcaatt tcgtgtatct ggtttagata ttattttatc 2220 taagctacca aagatagtta ttgaagctgt taacaaagaa ggatacatct cttcaagtgg 2280 tagcatagat ttgtcattaa actaggactt gaaataaaat attatgataa agaaaaaaaa 2340 aaaaaaaaaa aaaaaaaaag ggcggccgc 2369 <210> 2 <211> 2235 <212> DNA <213> Mucor hiemalis <400> 2 atgccttcac ttcaattgca acctgatgac aaactagcac ctgtttcttt tgcacttaag 60 tctatgaatg agttgaggga ctggacgcca gacgaaaaga taaagtttaa cgtttcaagc 120 gtggcactac agcctcgtgt gaaaaacgcc ctgaaacctc aattattgtt aactcatgat 180 atggcaggag gatataaaga agataaaaat attcaaggaa acaattataa agacatttat 240 aacattcaat attggcattt agctgatact tttgtatatt tctctcatga gcgagttagc 300 attcctccag tcaattggac aaatgcttgt catagaaatg gtgtaaagtg tttaggtact 360 tttttagtag aaggaaataa ccaaatgcat gaaatggaag ccttgcttca cggtccacct 420 ttacttaata acactgacga ccctatgaga ttatggagtc cgtattatgc agaccaatta 480 gttgctattg ctaaacacta tggttttgat ggctggttgt tcaatattga atgcgaattc 540 tttccttttc ctacaaatcc aaaattcaaa gctgaagagt tggcaaagtt tctacactat 600 tttaaggaaa aattgcataa cgaaatacct ggatctcaac tcatttggta cgacagcatg 660 acaaatgaag gagaaatcca ctggcagaac cagctcacat ggaaaaatga gttatttttt 720 aaaaacacgg atggtatttt tttgaattat tggtggaaaa aagaataccc tgaaatggcg 780 cgtagagtag ctgaaggaat aggtagatca ggtttagaag tttattttgg tacagatgta 840 tggggaaggc atacttatgg tggcggtggt ttcaaatcat ataagggtgt aaaaactgcc 900 tactctgcaa tgacatcttc tgcattattt ggtatggcat ggacatacga gcatttcgaa 960 aagtctgaat ttgaaaagat ggatcgtttg ttttggtgtg gtggtaaata ctctgactat 1020 cctcccccac ctcctaaaaa cccagatgac gaaaaagaag tagaaagcga tgatagtgaa 1080 gatgagctca tgtacggaca caagaaaggt attgctgaca cggtagaatc tattcctgta 1140 ccaggaacag attggtttgt taccaatttt gatagggggt ttggaaatag gttttattat 1200 agaggaaaga gattactttc tcagccttgg tcccatttat cgcatcaagc tattctcccc 1260 aataaaagct atcgaaatcc agagatttat cccactgatc aaaacattaa aatcactagt 1320 tctctcgatt gcgatcatgg agcttttctt ggtggaacct cgcttattat caaaggccaa 1380 cgtttcaatc atagagaatc gcatgatgtt gaaactgaaa ttagtatacc tctgtataag 1440 ctttcattag atgctagtaa aggatgctca ttgcgttata tttatagaac tttgttgatg 1500 aaagatgtaa agttgacagt agcatgtcac ttttcgttaa aaacaaacga ctcagttaat 1560 ttcttcaagg tatggcagcc agatgaaaat ttctcttttg aatatgatga tggaatgaga 1620 gccactgtta caactgaaaa ttctaccgaa agcagatgct ttttattacg tacaacagaa 1680 gaagatacag gagaaaatga ttggataaca aaaactatta atgtgcctgc tgttccagaa 1740 ggaagtcaat tatacattac aagacttgaa gtgagcgtag tattagatac agctggttta 1800 gtaggtcttg ttaatcaagt tattgcttgc ttgggatata ttagcatcat accaactata 1860 aattctggaa taaaaacaga ttcatcacgc attattcagg atctcttttg gaaagatcag 1920 aaatatacca aaatcggaaa agaaagttta gacgacatag ctcaagaaga agttcataga 1980 tattatggaa cattgaactg ggaaaacaca gcaaatgtag taaacgcttg ggaggaaata 2040 gattactaca acgtttttta caaagaaagt gacgactctg caactcgcat ctttttagga 2100 acagcattct gtaatcaatt tcgtgtatct ggtttagata ttattttatc taagctacca 2160 aagatagtta ttgaagctgt taacaaagaa ggatacatct cttcaagtgg tagcatagat 2220 ttgtcattaa actag 2235 <210> 3 <211> 744 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 3 Met Pro Ser Leu Gln Leu Gln Pro Asp Asp Lys Leu Ala Pro Val Ser 1 5 10 15 Phe Ala Leu Lys Ser Met Asn Glu Leu Arg Asp Trp Thr Pro Asp Glu 20 25 30 Lys Ile Lys Phe Asn Val Ser Ser Val Ala Leu Gln Pro Arg Val Lys 35 40 45 Asn Ala Leu Lys Pro Gln Leu Leu Leu Thr His Asp Met Ala Gly Gly 50 55 60 Tyr Lys Glu Asp Lys Asn Ile Gln Gly Asn Asn Tyr Lys Asp Ile Tyr 65 70 75 80 Asn Ile Gln Tyr Trp His Leu Ala Asp Thr Phe Val Tyr Phe Ser His 85 90 95 Glu Arg Val Ser Ile Pro Pro Val Asn Trp Thr Asn Ala Cys His Arg 100 105 110 Asn Gly Val Lys Cys Leu Gly Thr Phe Leu Val Glu Gly Asn Asn Gln 115 120 125 Met His Glu Met Glu Ala Leu Leu His Gly Pro Pro Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Thr Asp Asp Pro Met Arg Leu Trp Ser Pro Tyr Tyr Ala Asp Gln Leu 145 150 155 160 Val Ala Ile Ala Lys His Tyr Gly Phe Asp Gly Trp Leu Phe Asn Ile 165 170 175 Glu Cys Glu Phe Phe Pro Phe Pro Thr Asn Pro Lys Phe Lys Ala Glu 180 185 190 Glu Leu Ala Lys Phe Leu His Tyr Phe Lys Glu Lys Leu His Asn Glu 195 200 205 Ile Pro Gly Ser Gln Leu Ile Trp Tyr Asp Ser Met Thr Asn Glu Gly 210 215 220 Glu Ile His Trp Gln Asn Gln Leu Thr Trp Lys Asn Glu Leu Phe Phe 225 230 235 240 Lys Asn Thr Asp Gly Ile Phe Leu Asn Tyr Trp Trp Lys Lys Glu Tyr 245 250 255 Pro Glu Met Ala Arg Arg Val Ala Glu Gly Ile Gly Arg Ser Gly Leu 260 265 270 Glu Val Tyr Phe Gly Thr Asp Val Trp Gly Arg His Thr Tyr Gly Gly 275 280 285 Gly Gly Phe Lys Ser Tyr Lys Gly Val Lys Thr Ala Tyr Ser Ala Met 290 295 300 Thr Ser Ser Ala Leu Phe Gly Met Ala Trp Thr Tyr Glu His Phe Glu 305 310 315 320 Lys Ser Glu Phe Glu Lys Met Asp Arg Leu Phe Trp Cys Gly Gly Lys 325 330 335 Tyr Ser Asp Tyr Pro Pro Pro Pro Pro Lys Asn Pro Asp Asp Glu Lys 340 345 350 Glu Val Glu Ser Asp Asp Ser Glu Asp Glu Leu Met Tyr Gly His Lys 355 360 365 Lys Gly Ile Ala Asp Thr Val Glu Ser Ile Pro Val Pro Gly Thr Asp 370 375 380 Trp Phe Val Thr Asn Phe Asp Arg Gly Phe Gly Asn Arg Phe Tyr Tyr 385 390 395 400 Arg Gly Lys Arg Leu Leu Ser Gln Pro Trp Ser His Leu Ser His Gln 405 410 415 Ala Ile Leu Pro Asn Lys Ser Tyr Arg Asn Pro Glu Ile Tyr Pro Thr 420 425 430 Asp Gln Asn Ile Lys Ile Thr Ser Ser Leu Asp Cys Asp His Gly Ala 435 440 445 Phe Leu Gly Gly Thr Ser Leu Ile Ile Lys Gly Gln Arg Phe Asn His 450 455 460 Arg Glu Ser His Asp Val Glu Thr Glu Ile Ser Ile Pro Leu Tyr Lys 465 470 475 480 Leu Ser Leu Asp Ala Ser Lys Gly Cys Ser Leu Arg Tyr Ile Tyr Arg 485 490 495 Thr Leu Leu Met Lys Asp Val Lys Leu Thr Val Ala Cys His Phe Ser 500 505 510 Leu Lys Thr Asn Asp Ser Val Asn Phe Phe Lys Val Trp Gln Pro Asp 515 520 525 Glu Asn Phe Ser Phe Glu Tyr Asp Asp Gly Met Arg Ala Thr Val Thr 530 535 540 Thr Glu Asn Ser Thr Glu Ser Arg Cys Phe Leu Leu Arg Thr Thr Glu 545 550 555 560 Glu Asp Thr Gly Glu Asn Asp Trp Ile Thr Lys Thr Ile Asn Val Pro 565 570 575 Ala Val Pro Glu Gly Ser Gln Leu Thr Ile Thr Arg Leu Glu Val Ser 580 585 590 Val Val Leu Asp Thr Ala Gly Leu Val Gly Leu Val Asn Gln Val Ile 595 600 605 Ala Cys Leu Gly Thr Ile Ser Ile Ile Pro Thr Ile Asn Ser Gly Ile 610 615 620 Lys Thr Asp Ser Ser Arg Ile Ile Gln Asp Leu Phe Trp Lys Asp Gln 625 630 635 640 Lys Tyr Thr Lys Ile Gly Lys Glu Ser Leu Asp Asp Ile Ala Gln Glu 645 650 655 Glu Val His Arg Tyr Thr Gly Thr Leu Asn Trp Glu Asn Thr Ala Asn 660 665 670 Val Val Asn Ala Trp Glu Glu Ile Asp Tyr Tyr Asn Val Phe Tyr Lys 675 680 685 Glu Ser Asp Asp Ser Ala Thr Arg Ile Phe Leu Gly Thr Ala Phe Cys 690 695 700 Asn Gln Phe Arg Val Ser Gly Leu Asp Ile Ile Leu Ser Lys Leu Pro 705 710 715 720 Lys Ile Val Ile Glu Ala Val Asn Lys Glu Gly Tyr Ile Ser Ser Ser 725 730 735 Gly Ser Ile Asp Leu Ser Leu Asn 740 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial amino acid sequence of endo-beta-N-acetylglucosaminidase <400> 4 Pro Ser Leu Gln Leu Gln Pro Asp Asp Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide designed based on the partial amino acid sequence of endo-beta-N-acetylglucosaminidase <400> 5 carttrcarc cngaygayaa 20 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial amino acid sequence of endo-beta-N-acetylglucosaminidase <400> 6 Ser Tyr Arg Asn Pro Glu Ile Tyr Pro Thr Asp Gln Asn Ile Lys 1 5 10 15 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide designed based on the partial amino acid sequence of endo-beta-N-acetylglucosaminidase <400> 7 cchacngayc araayatyaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide designed based on the partial amino acid sequence of endo-beta-N-acetylglucosaminidase <400> 8 ttratrttyt grtcngtdgg 20 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> partial amino acid sequence of endo-beta-N-acetylglucosaminidase <400> 9 Gly Gln Arg Phe Asn His Arg Glu Ser His Asp Val Glu Thr Glu Ile 1 5 10 15 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide designed based on the partial amino acid sequence of endo-beta-N-acetylglucosaminidase <400> 10 tgrttraadc gytgdccytt 20 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide sequence of 5' terminal region of endo-beta-N-acetylglucosaminidase gene <400> 11 atgccttcac ttcaattgca acc 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide sequence of 3' terminal region of endo-beta-N-acetylglucosaminidase gene <400> 12 ctagtttaat gacaaatcta tgc 23 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide desinged based on the sequence of endo-beta-N-acetylglucosaminidase gene <400> 13 cacttaagtc tatgaatgag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide designed based on the sequence of endo-beta-N-acetylglucosaminidase gene <400> 14 aatctctgga tttcgatagc 20 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide designed based on the sequence of endo-beta-N-acetylglucosaminidase gene <400> 15 ggggcggccg cttttatttt acataaatat gccttcactt c 41 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide desinged based on the sequence of endo-beta-N-acetylglucosaminidase gene <400> 16 cccgcggccg cctagtttaa tgacaaatct atgctacc 38 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 17 Pro Ser Leu Gln Leu Gln Pro Asp Asp Lys 1 5 10 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 18 Lys Ser Tyr Arg Asn Pro Glu Ile Tyr Pro Thr Asp Gln Asn Ile Lys 1 5 10 15 <210> 19 <211> 14 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 19 Lys Phe Asn Val Ser Ser Val Ala Leu Gln Pro Arg Val Lys 1 5 10 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 20 Lys Xaa Asp Arg Leu Phe Leu Cys Gly Gly Lys 1 5 10 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 21 Lys Xaa Xaa Xaa Phe Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Val Glu Thr Glu 1 5 10 15 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 22 Lys Glu Gly Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ile Asp Leu Ser Leu Asn 1 5 10 15 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 23 Lys Asn Ile Gln Gly Asn Asn Tyr Lys 1 5 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 24 Lys Tyr Ser Asp Tyr Pro Pro Pro Pro Pro Lys 1 5 10 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 25 Lys Leu Ser Leu Asp Ala Ser Lys 1 5 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 26 Lys Asn Thr Asp Gly Ile Phe Leu Asn Tyr Trp Trp Lys 1 5 10 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 27 Lys Gly Cys Ser Leu Arg Tyr Ile Tyr Arg Thr Leu Leu Met Lys 1 5 10 15 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 28 Lys Leu Thr Val Ala Cys His 1 5 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 29 Lys Pro Gln Leu Leu Leu Thr His Asp Met Ala Gly Gly Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 30 <211> 14 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 30 Lys Ser Met Asn Glu Leu Arg Asp Trp Thr Pro Asp Glu Lys 1 5 10 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 31 Lys Leu Ala Pro Val Ser Phe Ala Leu Lys 1 5 10 <210> 32 <211> 23 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 32 Lys Gly Gln Arg Phe Asn His Arg Glu Ser His Asp Val Glu Thr Glu 1 5 10 15 Ile Ser Ile Pro Leu Tyr Lys 20 <210> 33 <211> 22 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 33 Lys Ile Thr Ser Ser Leu Asp Cys Asp His Gly Ala Phe Leu Gly Gly 1 5 10 15 Thr Ser Leu Ile Ile Lys 20 <210> 34 <211> 19 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 34 Lys Asn Glu Leu Phe Phe Lys Asn Thr Asp Gly Ile Phe Leu Asn Tyr 1 5 10 15 Trp Trp Lys <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 35 Lys Ile Val Ile Glu Ala Val Asn Lys 1 5 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 36 Ser Ser Arg Ile Ile Gln Asp Leu Phe Trp Lys 1 5 10 <210> 37 <211> 14 <212> PRT <213> Mucor hiemalis <400> 37 Lys Thr Asp Ser Ser Arg Ile Ile Gln Asp Leu Phe Trp Lys 1 5 10

Claims

서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열로 표시되는 재조합 단백질.
서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 암호화하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제 유전자.
서열번호 2에 나타낸 염기서열로 이루어지는 DNA를 포함하는 유전자.
삭제
제2항 또는 제3항에 있어서, 유전자가 무코르(Mucor) 속에 속하는 미생물 유래인 유전자.
제5항에 있어서, 무코르(Mucor) 속에 속하는 미생물이 무코르 히에말리스(Mucor hiemalis)인 유전자.
제2항 또는 제3항에 기재된 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
제7항에 기재된 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체.
제8항에 기재된 형질전환체를 배양하고, 수득한 배양물로부터 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 채취하는 것을 특징으로 하는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제의 제조방법.