CN1650006A

CN1650006A - 葡萄糖脱氢酶β亚基及其编码DNA

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Publication number: CN1650006A
Application number: CNA038093820A
Authority: CN
Inventors: 早出广司
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-04-26
Filing date: 2003-04-25
Publication date: 2005-08-03
Also published as: DE60316424T2; US20060252123A1; US20050214766A1; JPWO2003091430A1; US20060211094A1; EP1498484A4; US7094585B2; EP1498484A1; ATE373706T1; JP4107389B2; EP1498484B1; WO2003091430A1; AU2003235854A1; US7432094B2; US7329519B2; DE60316424D1

Abstract

利用基于GDHβ亚基的N－末端信号序列区的碱基序列设计的引物，通过反向PCR获得编码所述β亚基的DNA片段，所述GDH源于洋葱伯克霍尔德菌KS1株。

Description

葡萄糖脱氢酶β亚基及其编码DNA

技术领域

本发明涉及构成葡萄糖脱氢酶β亚基的细胞色素C，编码所述细胞色素C的DNA，以及它们的应用。所述葡萄糖脱氢酶可用于利用酶电极或类似物的葡萄糖传感器。

背景技术

在多种工业领域都在积极地发展使用与特定的底物特异性反应的酶的生物传感器。关于葡萄糖传感器，它是生物传感器的一种，特别地，主要在医学领域正在积极地发展使用这种方法的测量方法和设备。例如，自从Clark和Lyons于1962年首次报道有关包括葡萄糖氧化酶和氧电极结合起来的生物传感器以来葡萄糖传感器有大约40年的历史(L.c.Clark，J.和Lyonas，C.″Electrode systems forcontinuous monitoring in cardiovascular surgery.″Ann.n.y.Acad.Sci.，105：20-45)。

因此，葡萄糖氧化酶作为葡萄糖传感器的酶的应用具有长期的历史。这是因为葡萄糖氧化酶显示对于葡萄糖的高度的底物特异性和优良的热稳定性，这种酶可以进一步大规模地进行生产，并且其生产成本比其它酶要低。高度底物特异性意指这种酶不与除了葡萄糖的糖类反应，这带来了一个益处，即能够在测量值中无误差地获得精确的测量。另外，优良的热稳定性意指能够避免关于酶变性和它的酶活性失活的问题，这带来一个益处，即能够在较长期的时间上进行精确的测量。

但是，尽管葡萄糖氧化酶具有如上所述的益处，它有一个问题，即该酶被溶解的氧所影响并且这影响测量的结果。

同时，除了葡萄糖氧化酶之外，利用葡萄糖脱氢酶(下文称为“葡萄糖脱氢酶”或“GDH”)也已被发展。这种酶也在微生物中发现。例如，有已知的源自芽孢杆菌属(Bacillus)(EC 1.1.1.47)的葡萄糖脱氢酶和源自隐球菌属(Cryptococcus)(EC 1.1.1.119)的葡萄糖脱氢酶。

前一种葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)为一种催化β-D-葡萄糖+NAD(P)⁺→D-δ-葡萄糖酸内酯+NAD(P)H+H⁺反应的酶，而后一种葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.119)为一种催化D-葡萄糖+NADP⁺→D-δ-葡萄糖酸内酯+NADPH+H⁺反应的酶。上述源自微生物的葡萄糖脱氢酶已经上市。

这些葡萄糖脱氢酶具有一个益处，即它们不会被测量样品中的溶解氧所影响。这带来一种益处，即使当在其中氧分压低的环境中进行测量，或者使用需要大量氧的高浓度样品进行测量时也能够在测量结果中无误差地获得精确的测量。

但是，尽管传统的葡萄糖脱氢酶不被溶解氧所影响，它还有低热稳定性和比葡萄糖氧化酶低的底物特异性的问题。对于用于传感器的酶，期望克服葡萄糖氧化酶和葡萄糖脱氢酶二者缺点的酶。

本发明的发明人在Sode K.，Tsugawa W.，Yamazaki T.，Watanabe M.，Ogasawara N.和Tanaka M.，Enzyme Microb.Technol.，19，82-85(1996)；Yamazaki T.，Tsugawa W.和Sode K.，Appli.Biochemi.and Biotec.，77-79/0325(1999)；和Yamazaki T.，Tsugawa W.和Sode K.，Biotec.Lett.，21，199-202(1999)中报道了他们使用收集自温泉附近土壤的样品的关于GDH的研究结果。在那些样品中的微生物产生一种结合辅酶的GDH，并且已清楚酶的特性如最佳反应温度、热稳定性和底物特异性(参见前述文件)。这里所述酶为由具有高度耐热性的催化亚基(α亚基)、电子传递亚基(β亚基)以及未知功能的γ亚基所构成的异低聚酶，并且在45℃和75℃分别观察到其活性峰。另外，所述γ和α亚基基因已被克隆，并且已经清楚前述微生物属于洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)，而且所述β亚基的N-末端氨基酸序列已清楚(Ken Inose，东京农业工程大学硕士论文(2001))。但是，所述β亚基基因的结构尚未被报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供编码属于伯克霍尔德菌属(Burkholderia)的微生物的GDHβ亚基的DNA，以及使用所述DNA的方法。

本发明的发明人进一步进展了在洋葱伯克霍尔德菌KS1株的GDH上的研究并且成功分离了编码GDHβ亚基的DNA，从而完成了本发明。

也就是说，本发明能够如下进行描述。

(1)定义于下面(A)或(B)中的蛋白质：

(A)蛋白质，其具有至少包含SEQ ID NO：16的氨基酸23-425的氨基酸序列；

(B)蛋白质，其具有至少包含SEQ ID NO：16的氨基酸23-425的氨基酸序列，包括1-20个氨基酸残基的替换、删除、***或添加。

(2)编码定义于下面(A)或(B)中的蛋白质的DNA：

(3)根据项目(2)所述的DNA，其中所述DNA定义于下面(a)或(b)中：

(a)包含由SEQ ID NO：15的核苷酸187-1398组成的核苷酸序列的DNA；

(b)可与由SEQ ID NO：15的核苷酸187-1398组成的核苷酸序列在严格条件下杂交的DNA。

(4)根据项目(3)所述的DNA，所述DNA还包含由SEQ ID NO：15的核苷酸121-187组成的核苷酸序列。

(5)重组载体，所述重组载体包含根据项目(2)到(4)任一项所述的DNA。

(6)用根据项目(2)到(4)任一项所述的DNA或根据项目(5)所述的重组载体转化的转化体。

(7)生产葡萄糖脱氢酶β亚基的方法，包括培养项目(6)的转化体以产生葡萄糖脱氢酶β亚基作为所述DNA的表达产物，并收集产生的β亚基。

(8)根据项目(3)或(4)所述的DNA，其中所述DNA还包含编码洋葱伯克霍尔德菌的葡萄糖脱氢酶的α亚基和γ亚基的核苷酸序列。

(9)包含根据项目(8)所述的DNA的重组载体。

(10)用根据项目(8)所述的DNA或根据项目(9)所述的重组载体转化的转化体。

(11)生产葡萄糖脱氢酶复合物的方法，包括培养根据项目(10)所述的转化体以产生葡萄糖脱氢酶复合物作为所述DNA的表达产物，并收集产生的复合物。

实施本发明的最佳方式

下面将详细描述本发明。

本发明的发明人已搜索并分离了编码洋葱伯克霍尔德菌KS1株的GDHβ亚基的DNA。前述的菌株于2000年9月25日保藏于国际专利生物保藏中心，国立先进工业科学与技术学院(中心6，1-1，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibarakiken，Japan，postal code：305-8566)，并收到微生物登记号FERM BP-7306。在本说明书中，编码GDHβ亚基的DNA有时称为本发明DNA、“β亚基结构基因”或简称为“β亚基基因”。

本发明的发明人已确认由洋葱伯克霍尔德菌KS1株产生的GDH为包含α亚基、β亚基和γ亚基的聚合蛋白质。本发明的蛋白质与出自这些亚基的β亚基相应。GDH的分光光度计分析显示氧化的GDH的吸收波长与葡糖杆菌(Gluconobacter sp.)和醋酸杆菌(Acetobacter sp.)的醇脱氢酶和醛脱氢酶的吸收波长相似，这些酶由脱氢酶细胞色素复合物组成，并且这种吸收通过热处理消失。这个事实和如下面所述的在β亚基存在和缺失之间GDH最佳反应温度的差异提示，β亚基由细胞色素C组成。

上面的GDH的物理和化学特性在下面显示。

(1)功能：该酶催化葡萄糖的脱氢化反应。

(2)该酶由在还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示大约60kDa分子量和大约43kDa分子量的亚基组成。

(3)该酶在使用TSK Gel G3000SW(Tosoh公司制造)的凝胶过滤层析中显示大约380kDa的分子量。

(4)最佳反应温度：45℃左右(Tris-HCl缓冲液，pH8.0)。

α亚基自身的物理和化学特性在下面显示。

(1)′该蛋白质具有葡萄糖脱氢酶活性。

(2)′该蛋白质在还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示大约60kDa的分子量。

(3)′最佳反应温度：75℃左右(Tris-HCl缓冲液，pH8.0)。

所述β亚基能够通过使用GDH活性作为指标纯化GDH的复合物从洋葱伯克霍尔德菌KS1株的培养物中与其它亚基一起获得。GDH的活性能够以与在已知的GDH活性测定中相同的方式进行测量。具体地，所述测定可以如下进行。将包含594μM-甲氧基吩嗪甲硫酸盐(mPMS)和5.94μM 2，6-二氯靛酚(DCIP)的10mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)加入到酶样品和作为底物的葡萄糖中，将混合物在37℃温育。使用分光光度计记录DCIP在600nm的吸光度的变化，并且将吸光度中的下降速率定义为酶反应速率。

此外，由于本发明已经测定了编码所述β亚基的基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：15)，所述β亚基也能够通过在合适的载体中表达具有所述核苷酸序列的DNA或编码与这种DNA编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列的DNA进行生产。将能够被SEQ ID NO：15的开放阅读框(ORF)编码的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：16。从该蛋白质中测得的β亚基的N-末端氨基酸序列与SEQ ID NO：16的氨基酸23-38相同。所以，推测氨基酸1-22为信号肽。注意尽管在SEQ ID NO：15和16中氨基酸残基1被描述为缬氨酸，它却有很高的可能性为蛋氨酸并且它还有可能在翻译后被丢掉。

通过BLAST对上述氨基酸序列的同源性检索显示了全面的高度高源性；与源自甘薯青枯病菌(Ralstonia solanacearum)的氧化还原酶脱氢酶的细胞色素C亚基有65％的同源性，与源自氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)的山梨糖醇脱氢酶的细胞色素C亚基有48％的同源性，与源自杓兰欧文氏菌(Eriwinia cypripedii)的葡萄糖酸脱氢酶的细胞色素C亚基有44％的同源性，以及与源自柠檬泛菌(Pantoea citrea)的2-酮-葡萄糖酸脱氢酶的细胞色素C亚基在核苷酸序列水平上有55.7％的同源性或在氨基酸水平上有46.4％的同源性。另外，这些细胞色素C的氨基酸序列保留了一个边缘连接基序(them-linking motif)(SEQ ID NO：18)。这些事实显示本发明的β亚基为细胞色素C。

本发明的β亚基可以是具有包含SEQ ID NO：16的氨基酸23到425的氨基酸序列的蛋白质，包括在氨基酸序列中的1-20个，优选1到10个，更加优选1到5个氨基酸残基的替换、删除、***或添加，只要它可以作为GDHβ亚基起作用即可。注意术语“作为GDH的β亚基起作用”意为“作为细胞色素C起作用而不破坏GDH的酶活性”。

本发明的DNA为编码上述β亚基的DNA并且可以从，例如洋葱伯克霍尔德菌KS1株中获得。在本发明完成的过程中已经从洋葱伯克霍尔德菌KS1株中分离到了本发明的DNA。本发明的DNA可以，例如通过利用具有SEQ ID NO：13和14的核苷酸序列的引物以及洋葱伯克霍尔德菌KS1株的染色体DNA作为模板的PCR来获得。此外，由于本发明已经确定了本发明的DNA的核苷酸序列以及由该核苷酸序列所编码的氨基酸序列，本发明的DNA也可以通过进行基于这些序列的化学合成来获得。另外，本发明的DNA可以通过利用基于上述序列制备的寡核苷酸作为探针的杂交而从洋葱伯克霍尔德菌KS1株的染色体DNA中获得。

本发明的DNA可以是编码具有包含SEQ ID NO：16的氨基酸23到425的氨基酸序列的蛋白质，或者具有1-20个，优选1到10个，更加优选1到5个氨基酸残基的替换、删除、***或添加的氨基酸序列，并且编码作为GDHβ亚基起作用的蛋白质的DNA。

具体地说，本发明的DNA包括具有由SEQ ID NO：15的核苷酸187-1398组成的核苷酸序列的DNA。另外，本发明的DNA可以是与SEQID NO：15或可以由这一序列制备的探针在严格条件下杂交的，并且编码可作为GDHβ亚基起作用的蛋白质的DNA。所述严格条件包括那些使得具有70％或更多、优选80％或更多，更加优选90％或更多同源性的DNA相互杂交的条件，特别是1×SSC、0.1％SDS和60℃的条件。

可以通过培养含有本发明的DNA或包含本发明的DNA的重组载体的转化体以产生GDHβ亚基作为所述DNA的表达产物，并且通过从微生物细胞或培养基中收集GDHβ亚基来进行GDHβ亚基的生产。在此种情况下，编码本发明的GDHβ亚基的DNA可以与编码α亚基的DNA或进一步与编码γ亚基的DNA结合进行表达以生产GDH复合物。接着可以通过利用具有SEQ ID NO：18和19核苷酸序列的引物的PCR来获得编码γ亚基或α亚基的DNA片段。

生产GDHβ亚基或GDH复合物的微生物的例子包括：包括大肠杆菌(Bscherichia coli)的肠杆菌；包括假单胞菌(Pseudomonas)和葡糖杆菌的革兰氏阴性菌；包括芽孢杆菌属(Bacillus)如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的革兰氏阳性菌；酶母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；以及霉菌如黑曲霉(Aspergillusniger)。但是，所述微生物并不限于这些并且任何微生物只要它为适合于外源蛋白质生产的宿主微生物都可以加以利用。

用于克隆或表达本发明的DNA的载体是那些适于由质粒或噬菌体构建以进行基因重组的载体，它们可以在宿主微生物中自主地复制。用于大肠杆菌的载体的例子包括pBR322、pUC18、pUC118、pUC19、pUC119、pTrc99A、pBluescript或粘粒SuperCosI。将DNA从用于克隆本发明的DNA的载体转移到其它适于表达等的重组载体，可以通过利用限制性内切酶或通过PCR方法从含有本发明的DNA的重组载体中回收本发明的DNA并将它与载体片段连接而实施。另外，通过对属于埃希杆菌属(Escheriachia)的细胞用钙处理的感受态细胞法、对属于芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌用原生质法、对霉菌用KU法或KUR法、对霉菌用显微操作法等进行这些载体对微生物的转化。此外，也可以广泛应用电穿孔法。

基于其中目标重组载体的导入的存在或缺失的宿主微生物的筛选可以通过使用含目标DNA的载体的化学抗性标记等来进行。例如，可以筛选能够在基于化学抗性标记的选择性培养基中生长并产生GDH的微生物。

至于转化体的培养方法，可以通过考虑宿主的营养和生理特性来选择培养条件。在许多情况下，优选液体培养基。进行摇动的通气培养在工业上是有利的。

作为所述培养基的营养成份，可以广泛使用那些通过用于微生物培养的成份。作为碳源，可以使用任何可同化的碳化合物，这些会被利用的化合物的例子包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜和丙酮酸等。另外，作为氮源，可以使用任何可利用的氮化合物，这些会被利用的化合物的例子包括胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解产物、豆饼碱性提取物等。此外，根据需要使用镁、钙、钾、铁、锰、锌等的磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐，特定的氨基酸，特定的维生素等。

尽管可以在一个范围内适当地变化培养温度，在这样的范围内细菌生长并产生本发明的蛋白质，但培养温度优选为大约20℃到42℃。培养时间在一定程度上依赖于条件而变化。但是，培养可以在据估计给出最大GDH产量的合适的时间结束，培养时间通常为大约12到72小时。尽管可以在一个范围内适当地变化培养基的pH，在这样的范围内细菌生长并产生本发明的蛋白质，但培养基的pH优选在大约6.0到9.0的范围。

可以收集含有在培养物中产生本发明的蛋白质的微生物的细胞的培养基并直接进行利用。但是，当本发明的蛋白质存在于培养基中时，通常通过过滤、离心等以传统的方式将培养基分离成含有本发明的蛋白质和微生物细胞的溶液并且随后进行应用。当本发明的蛋白质存在于细胞中时，通过过滤、离心等手段收集细胞，随后通过机械的方法或酶法如使用溶菌酶进行破碎。另外，将螯合剂如EDTA和表面活性剂加入到细胞中以溶解本发明的蛋白质，根据需要，接下来作为水溶液进行分离和收集。

可以从所得的含蛋白质的溶液例如通过真空浓缩、膜浓缩、用硫酸铵、硫酸钠等盐析，或用亲水的有机溶剂如甲醇、乙醇和丙酮进行分级沉淀来将蛋白沉淀出来。另外，热处理和等电点处理也是有效的纯化方式。随后，可以通过利用吸附剂、凝胶过滤剂等的凝胶过滤、吸附层析、离子交换层析和亲和层析的适当组合进行纯化以得到纯化的本发明的蛋白质。

可以通过基于柱层析的分离和纯化获得纯化的酶制剂。尽管这种纯化的酶制剂优选纯化到在电泳(SDS-PAGE)中得到一个单条带的程度，它可能包含α亚基或γ亚基。

这样得到的纯化的酶可以通过，例如冻干法、真空干燥、喷雾干燥等进行粉末化并进行散布。

含有本发明的β亚基、α亚基或必要时γ亚基的GDH复合物，或包含这些的转化体，可以被用于葡萄糖传感器的酶电极。作为电极，可以使用碳电极、金电极、铂电极等，并将本发明的GDH固定到电极上。固定方法的实例包括使用交联剂的方法、将酶置于聚合物基质中的方法、用透析膜封盖酶的方法、使用光交联聚合物、导电性聚合物、氧化还原聚合物等的方法。选择性地，通过与电介质，其典型的例子为二茂铁及其衍生物，共同的吸附作用将酶固定在聚合物中或固定在电极上，或者可以结合使用这些方法。一般地，通过利用戊二醛将本发明的葡萄糖脱氢酶固定在碳电极上，随后通过用含胺基的试剂处理将戊二醛封闭。

可以如下对葡萄糖的浓度进行测量。将缓冲液置于一个恒温槽中，加入介质。随后，保持恒定温度。作为介质，可以使用铁***、吩嗪甲硫酸盐等。将其上固定着本发明的酶的电极用作工作电极，并使用计量电极(例如，铂电极)和参照电极(例如，Ag/AgCl电极)。在施加恒定电压到碳电极以获得稳态电流后，加入含葡萄糖的样品并测量电流的增加。样品中的葡萄糖浓度可以根据用具有标准浓度的葡萄糖溶液制定的标准曲线来计算。

可以将含本发明的β亚基的GDH复合物用作糖类如葡萄糖的分析试剂盒中的组分。一般地，该试剂盒除了GDH复合物还包括，对分析必要的缓冲液、介质、用于制备标准曲线的例如葡萄糖的标准溶液和试剂盒使用手册。可以以各种形式提供根据本发明的酶，例如作为冻干的试剂或适合的贮存溶液。

实施例

下面，将参照实施例对本发明进行具体地描述。

参考实施例1：编码洋葱伯克霍尔德菌KS1株的GDHα亚基的基因的分离

<1>来自洋葱伯克霍尔德菌KS1株的染色体DNA的制备。

以一种传统的方式从洋葱伯克霍尔德菌KS1株制备染色体基因。即，通过使用TL液体培养基(10克聚蛋白胨，1克酵母提取物，5克NaCl，2克KH₂PO₄，5克葡萄糖于1升，pH7.2)将细菌菌株于34℃摇动过液。通过离心收集生长的细胞。将细胞悬于含有10mM NaCl、20mMTris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、0.5％SDS和100μg/ml蛋白酶K的溶液中并在50℃处理6小时。将这一混合物加入等体积的酚-氯仿中并在室温搅拌10分钟，随后通过离心收集上清液。将醋酸钠加入上清液终浓度为0.3M并覆以2倍体积的乙醇以在中间层沉淀染色体DNA。以玻璃棒取出DNA，用70％乙醇洗涤，并溶于适量的TE缓冲液中以获得染色体DNA溶液。

<2>测定GDHα亚基的N-末端氨基酸序列

通过冷冻干燥对用与实施例2相同的方式纯化的GDH进行浓缩并通过使用12.5％的SDS电泳进行分离以分离出α亚基。将得到的α亚基转移到一个聚偏乙烯氟化物膜上，随后通过使用氨基酸测序仪(PPSQ-10，Shimadzu公司生产)对N-末端的氨基酸序列进行测定。结果，发现该酶包含由SEQ ID NO：3的氨基酸序列的氨基酸号2到12的11个氨基酸残基组成的肽序列。

<3>克隆编码α亚基的基因

将在<1>中制备的DNA用限制性内切酶Sau3AI进行部分消化，接着进行小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)处理。单独地，用BamHI对粘粒SuperCosI(获自Stratagene)进行处理并且通过使用T4 DNA连接酶将由用Sau3AI部分消化源自α-15株的染色体DNA片段获得的DNA片段导入SuperCosI中。用得到的重组DNA对大肠杆菌XL-1 Blue MR(获自Stratagene)进行转化。在含10μg/ml新霉素和25μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂糖培养基上基于新霉素抗性和氨苄青霉抗性筛选转化体，所述抗性为在SuperCosI上的抗生素抗性。将得到的转化体在LB液体培养基中进行培养。收集这些转化体细胞并悬于试剂中以测量GDH的活性，并通过利用对葡萄糖的脱氢酶活性作为指标来筛选克隆。结果，获得一个显示葡萄糖脱氢酶活性的克隆。

<4>亚克隆

从粘粒SuperCosI中制备含目标基因的DNA片段，SuperCosI含在<3>中获得的编码α亚基的基因。用限制性内切酶NotI将***基因片段从所述粘粒上剪切下来。用限制性内切酶XbaI处理这些DNA片段并导入用XbaI消化过的质粒pUC18中。用包含各个***片段的质粒pUC18转化大肠杆菌DH5α-MCR株，收集出现在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂糖培养基上的菌落。将得到的转化体在LB液体培养基中进行培养，继而以与<3>中相同的方式检测这些细胞中的GDH活性。结果获得显示葡萄糖脱氢酶活性的转化体。从这个转化体中提取质粒并分析***的DNA片段。结果，确认了一个大约8.8kbp的***片段。将这一质粒命名为pKS1。

<5>测定核苷酸序列

进行在pKS1中的***片段的限制性内切酶分析并根据传统方法测定片段的核苷酸序列。结果，确定了编码在<2>中发现的α亚基的N-末端氨基酸序列的DNA的序列在这个***的DNA片段中，并发现一个含这一序列的开放阅读框。将测定的核苷酸序列以及可由这个核苷酸序列编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：1和3中。在SEQ ID NO：1的核苷酸序列中，从核苷酸号2,386下游的核苷酸序列编码SEQ ID NO：4的氨基酸序列，并编码β亚基。

参考实施例2：通过重组体大肠杆菌的GDHα亚基的生产

由于测定了α亚基的核苷酸序列，利用上述α亚基的结构基因制备一种载体，并用这种载体进一步生产一种转化体。

首先，如下制备***到载体中的基因。

通过利用源自所述KS1株的基因组片段作为模板的PCR进行扩增从而纳入一个需要的限制性内切酶位点。下面的寡核苷酸引物对用于PCR中。

(正向的)

5’-CCCAAGCTTGGGCCGATACCGATACGCA-3’(SEQ ID NO：5)

(反向的)

5’-GAGAAGCTTTCCGCACGGTCAGACTTCC-3’(SEQ ID NO：6)

用限制性内切酶HindIII消化由PCR扩增的基因并将其***到一个表达载体pFLAG-CTS(SIGMA)于其克隆位点，HindIII位点。将得到的质粒命名为pFLAG-CTS/α。

用上述质粒pFLAG-CTS/α转化大肠杆菌DH5α-MCR株，并收集出现在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂糖培养基上的菌落。

另外，当在α亚基的上游检索到pKS1***片段的开放阅读框时，新发现一个含有编码示于SEQ ID NO：2(SEQ ID NO：1中的核苷酸号258到761)的包括168个氨基酸残基的多肽的507个核苷酸。据认为该结构基因是编码γ亚基的。

由于发现编码γ亚基的区域存在于α亚基的编码区的上游，生产一种包含具有连续地包括γ亚基和α亚基的多顺反子结构的基因的重组载体，并且构建一种导入这种载体的的转化体。

首先，如下制备待***到载体中的基因。

通过利用源自KS1株的基因组片段作为模板的引物的PCR进行扩增从而纳入所需要的限制性内切酶位点，所述基因组片段连续地包括γ亚基的结构基因和α亚基的结构基因。下面的寡核苷酸引物对用于PCR中。

5’-CATGCCATGGCACACAACGACAACACT-3’(SEQ ID NO：7)

(反向的)

5’-CCCAAGCTTGGGTCAGACTTCCTTCTTCAGC-3’(SEQ ID NO：8)

将由PCR扩增的基因的5’末端和3’末端分别用NcoI和HindIII消化，并将该基因***载体pTrc99A(Pharmacia)在它的克隆位点，NcoI/HindIII位点。将所得的质粒命名为pTrc99A/γ+α。

用上述质粒pTrc99A/γ+α转化大肠杆菌DH5α-MCR株，并收集出现在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂糖培养基上的菌落。

利用以每种上述质粒pKS1、pFLAG-CTS/α和pTrc99A/γ+α转化的大肠杆菌DH5α-MCR株生产α亚基。将每种转化体接种到3ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中并在37℃培养12小时，通过离心收集细胞。通过French press(1,500kgf)将细胞破碎，并通过超速离心(4℃，160，400×g，90分钟)分离膜部分(10mM磷酸钾缓冲液，pH6.0)。

参考实施例3：确定GDH的活性

首先，确定在每种上述膜部分中的GDH的活性。具体地，通过利用包含594μM的甲基吩嗪甲硫酸盐(mPMS)和5.94μM的2，6-二氯靛酚(DCIP)的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)进行可视的测定。结果显示如下，+号代表由蓝色到无色的改变程度。

培养的用pFLAG-CTS/α转化的转化体的膜级分：+

培养的用pKS1转化的转化体的膜级分：++

培养的用pTrc99A/γ+α转化的转化体的膜级分：+++

培养的只包含α亚基的用pFLAG-CTS/α转化的转化体的膜级分的GDH活性最低，而培养的用pTrc99A/γ+α转化的转化体的膜级分的GDH活性最高，用pTrc99A/γ+α有效地构建了一种载体。

尽管α亚基甚至在以只使用α亚基的结构基因的载体转化的转化体中得以表达，α亚基能够通过使用一种含γ亚基的结构基因和α亚基的结构基因相结合的载体而有效地获得。

使用本发明的葡萄糖脱氢酶测定葡萄糖。通过使用具有各种浓度的葡萄糖测量本发明的葡萄糖脱氢酶(α亚基)的酶活性。GDH活性在包含594μM的甲基吩嗪甲硫酸盐(mPMS)和5.94μM的2，6-二氯靛酚(DCIP)的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中进行测量。加入酶样品和作为底物的葡萄糖，接着在37℃培养，并通过使用分光光度计监测DCIP在60nm的吸光度的改变。测量吸光度的下降速率作为酶的反应速率。可以用本发明的GDH对葡萄糖在0.01-1.0mM的范围内进行量化。

实施例1：编码洋葱伯克霍尔德菌KS1株的GDHβ亚基的基因的分离

<1>洋葱伯克霍尔德菌KS1株GDHβ亚基的检索

使用桑格中心(http：www.sanger.ac.uk/)的洋葱伯克霍尔德菌J2315株基因组文库检索源自KS1株的GDHβ亚基的基因。根据已知的KS1株的GDHβ亚基(SEQ ID NO：9)的N-端序列，设计一种与源自醋酸杆菌或葡糖杆菌的醇脱氢酶(Tamaki等，Biochim Bioohys Acta1088(2)：292-300(1991)，Matsushita K.等，Biosc.Biotech.Biochem.，56，304-310(1992)，Takemura H.等，J Bacteriol，175，6857-66(1993)，Kondo K.等，Appl Environ Microbiol，63，1131-8(1997))；源自欧文氏菌(Erwinia sp.)或假单胞菌(Pseudomonas sp.)的葡糖酸脱氢酶(Yum DY等，J Bacteriol，179，6566-72(1997)，Matsushita K.等，J Biochem，85，1173-81(1979))；源自葡糖杆菌(Gluconobacter sp.)的山梨糖醇脱氢酶(Choi，E.S.等，FEMS Microbiol.Lett.，125，45-50(1995))；和源自欧文氏菌或泛菌(Pantoea sp.)的2-酮葡糖酸脱氢酶(Pujol CJ等，J Bacteriol，182，2230-7(2000))的每种细胞色素C亚基都具有高度同源性的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。

在上述氨基酸序列的基础上，从上述洋葱伯克霍尔德菌J2315株基因组文库中检索编码具有高度同源性的氨基酸序列的基因序列。随后，检索获得的五个序列与KS1株的GDHα亚基的C-末端的同源性。结果，由两个基因片段翻译的氨基酸序列显示了高度的同源性(大于90％)。每个基因片段短至200到500bp，从而通过BLAST从洋葱伯克霍尔德菌J2315株基因组文库中检索与这些序列具有高度同源性的序列并将这些片段相互连接。结果，获得了一个3,110bp的片段。在所获得的核苷酸序列中，存在据推测为GDH的C-末端的ORF和一个1,275bp的据推测为细胞色素C结构基因的开放阅读框(SEQ IDNO：11)。由该开放阅读框编码的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：12。在所获得的J2315株的核苷酸序列和已被克隆的KS1株的α亚基的核苷酸序列之间的比较显示在所述α亚基的下游，包含与编码J2315株的细胞色素C信号肽的核苷酸序列具有高度同源性的核苷酸序列。

由上面的内容，推测在参考实施例1中所得的洋葱伯克霍尔德菌KS1株的克隆片段的第三个开放阅读框(SEQ ID NO：1的核苷酸2386)编码β亚基。在纯化的β亚基的N-末端的氨基酸序列对应于由包含SEQID NO：1中的核苷酸2452到2466的核苷酸序列所翻译的5个氨基酸残基，这也提示上述的开放阅读框编码β亚基。

<2>使用反向PCR方法扩增β亚基结构基因

(1)微生物细胞的培养和基因组的提取

使用5ml的完全培养基(0.5％的多聚蛋白胨，0.3％的酵母提取物，0.5％的NaCl)，在37℃过夜摇动培养KS1株。利用GennomicPrep^TM细胞及组织DNA分离试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)从所获得的微生物细胞中提取基因组。根据所附的手册进行该方法。将所得的基因组进行酚/氯仿处理并用乙醇沉淀，随后在纯化的水中溶解。

(2)基因组片段的环化

用BamHI、EcoRI、HindIII、SmaI、SacI和XhoI消化从KS1株中提取的基因组并通过用乙醇沉淀回收基因组片段。随后，利用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)在16℃过夜对1μg用限制性内切酶消化的基因组进行连接反应。

(3)PCR

将50pmol基于在KS1株的GDHβ亚基的N-末端信号序列区中的核苷酸序列设计的正向引物(EF1 SEQ ID NO：13)、50pmol反向引物(ER1 SEQ ID NO：14)(所有引物均委托Invitrogen合成)、0.5ml的LATaq(Takara生物有限公司)、8μl的dNTP溶液和5μl的10×PCR缓冲液加入到纯化的水中以得到总体积50μl，利用程序温度控制***PC-801(ASTEC)进行PCR。PCR反应在下列条件下进行：在94℃5分钟、98℃ 20秒、62℃ 30秒、72℃ 6分钟的30个循环之后，72℃ 10分钟。

当使用采用限制酶(SmaI)消化的基因组作为模板时，在琼脂糖电泳上证实了约2.1kbp的片段。

<3>PCR扩增片段的测序

(1)TA克隆

在将上述反向PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳后，切出条带并用Gene clean II试剂盒(Biol0l inc.)进行纯化。用pGEMR-T和pGEMR-T EASY载体***(Promega)将片段连接到pGEM-T载体上去。用连接的载体转化大肠杆菌DH5α，将转化体在含50μg/ml氨苄青霉素、40μg/ml X-gal和0.1μM IPTG的LB琼脂培养基中培养过夜。从显现的菌落中，挑选白色菌落并在含50μg/ml氨苄青霉素的L培养基中过夜培养，随后通过碱法从细胞中提取质粒。

(2)序列样本的制备

以RNA酶处理得到的质粒并加入0.6倍体积的20％PEG6000/2.5M的NaCl。将混合物置于冰上1小时。此后，将混合物于15,000转/分4℃离心15分钟以获得沉淀。将沉淀用70％的乙醇洗涤并在真空中干燥。将干燥过的产品溶于纯化的水中。

(3)DNA的核苷酸序列的分析

利用ABI PRISM^TM310遗传分析仪(PERKIN-ELMER AppliedBiosystems)对在(2)中获得的质粒的***片段的核苷酸序列进行分析。利用M13引物从该载体的多克隆位点测定该***片段的一部分序列。结果，确定了含有已经分析过的β亚基的N-末端的核苷酸序列。基于这一序列，接着制备引物并用于对***片段的核苷酸序列进行测序。结果显示于SEQ ID NO：15。另外，将由在所述核苷酸序列中的开放阅读框所编码的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：16。

所述β亚基共有425个氨基酸残基，从与已获得的N-末端氨基酸序列的比较中，认为其中的22个残基为信号肽。基于氨基酸序列计算的β亚基的分子量为45,276Da并且排除了信号肽的那部分的分子量42,731Da基本上与KS1株的GDHβ亚基的分子量43Da相同。在β亚基的氨基酸序列中，连接细胞色素C中的边缘的连接基序(SEQ IDNO：18)在3个位置被确定。开放阅读框被定位于α亚基的结构基因的开放阅读框的紧邻的下游，而被推测为SD序列的序列存在于起始密码子上游。

通过BLAST对得到的氨基酸序列的同源性检索显示了全面的高度同源性；与源自甘薯青枯病菌的氧化还原酶脱氢酶的细胞色素C亚基有65％的同源性，与源自氧化葡糖杆菌的山梨糖醇脱氢酶的细胞色素C亚基有48％的同源性，与源自杓兰欧文氏菌(Eriwinia cypripedii)的葡萄糖酸脱氢酶的细胞色素C亚基有44％的同源性，以及与源自柠檬泛菌(Pantoea citrea)的2-酮-葡萄糖酸脱氢酶的细胞色素C亚基在氨基酸水平上有46.4％的同源性。另外，这些细胞色素C的氨基酸序列保留了边缘连接基序(SEQ ID NO：18)。

KS1株的GDHβ亚基的结构基因与J2315株的GDHβ亚基的结构基因在核苷酸序列水平上具有92.0％的同源性而在氨基酸水平上具有92.2％的同源性。

工业实用性

本发明提供了属于伯克霍尔德菌属的微生物的GDHβ亚基以及编码它的DNA。

序列表

<110>SODE，Koji

<120>葡萄糖脱氢酶及其编码DNA

<130>G780-OP1551

<141>2003-04-25

<150>JP 2002-125353

<151>2002-04-26

<160>19

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>2467

<212>DNA

<213>洋葱伯克霍尔德菌

<220>

<221>CDS

<222>(258)..(761)

<220>

<221>CDS

<222>(764)..(2380)

<220>

<221>CDS

<222>(2386)..(2466)

<400>1

aagctttctg tttgattgca cgcgattcta accgagcgtc tgtgaggcgg aacgcgacat 60

gcttcgtgtc gcacacgtgt cgcgccgacg acacaaaaat gcagcgaaat ggctgatcgt 120

tacgaatggc tgacacattg aatggactat aaaaccattg tccgttccgg aatgtgcgcg 180

tacatttcag gtccgcgccg atttttgaga aatatcaagc gtggttttcc cgaatccggt 240

gttcgagaga aggaaac atg cac aac gac aac act ccc cac tcg cgt cgc 290

Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg

1 5 10

cac ggc gac gca gcc gca tca ggc atc acg cgg cgt caa tgg ttg caa 338

His Gly Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln

15 20 25

ggc gcg ctg gcg ctg acc gca gcg ggc ctc acg ggt tcg ctg aca ttg 386

Gly Ala Leu Ala Leu Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu

30 35 40

cgg gcg ctt gca gac aac ccc ggc act gcg ccg ctc gat acg ttc atg 434

Arg Ala Leu Ala Asp Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met

45 50 55

acg ctt tcc gaa tcg ctg acc ggc aag aaa ggg ctc agc cgc gtg atc 482

Thr Leu Ser Glu Ser Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile

60 65 70 75

ggc gag cgc ctg ctg cag gcg ctg cag aag ggc tcg ttc aag acg gcc 530

Gly Glu Arg Leu Leu Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala

80 85 90

gac agc ctg ccg cag ctc gcc ggc gcg ctc gcg tcc ggt tcg ctg acg 578

Asp Ser Leu Pro Gln Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr

95 100 105

cct gaa cag gaa tcg ctc gca ctg acg atc ctc gag gcc tgg tat ctc 626

Pro Glu Gln Glu Ser Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu

110 115 120

ggc atc gtc gac aac gtc gtg att acg tac gag gaa gca tta atg ttc 674

Gly Ile Val Asp Asn Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe

125 130 135

ggc gtc gtg tcc gat acg ctc gtg atc cgt tcg tat tgc ccc aac aaa 722

Gly Val Val Ser Asp Thr Leu Val Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Asn Lys

140 145 150 155

ccc ggc ttc tgg gcc gac aaa ccg atc gag agg caa gcc tg atg gcc 769

Pro Gly Phe Trp Ala Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gln Ala Met Ala

160 165 170

gat acc gat acg caa aag gcc gac gtc gtc gtc gtt gga tcg ggt gtc 817

Asp Thr Asp Thr Gln Lys Ala Asp Val Val Val Val Gly Ser Gly Val

175 180 185

gcg ggc gcg atc gtc gcg cat cag ctc gcg atg gcg ggc aag gcg gtg 865

Ala Gly Ala Ile Val Ala His Gln Leu Ala Met Ala Gly Lys Ala Val

190 195 200

atc ctg ctc gaa gcg ggc ccg cgc atg ccg cgc tgg gaa atc gtc gag 913

Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile Val Glu

205 210 215

cgc ttc cgc aat cag ccc gac aag atg gac ttc atg gcg ccg tac ccg 961

Arg Phe Arg Asn Gln Pro Asp Lys Met Asp Phe Met Ala Pro Tyr Pro

220 225 230

tcg agc ccc tgg gcg ccg cat ccc gag tac ggc ccg ccg aac gac tac 1009

Ser Ser Pro Trp Ala Pro His Pro Glu Tyr Gly Pro Pro Asn Asp Tyr

235 240 245 250

ctg atc ctg aag ggc gag cac aag ttc aac tcg cag tac atc cgc gcg 1057

Leu Ile Leu Lys Gly Glu His Lys Phe Asn Ser Gln Tyr Ile Arg Ala

255 260 265

gtg ggc ggc acg acg tgg cac tgg gcc gcg tcg gcg tgg cgc ttc att 1105

Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp Ala Ala Ser Ala Trp Arg Phe Ile

270 275 280

ccg aac gac ttc aag atg aag agc gtg tac ggc gtc ggc cgc gac tgg 1153

Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser Val Tyr Gly Val Gly Arg Asp Trp

285 290 295

ccg atc cag tac gac gat ctc gag ccg tac tat cag cgc gcg gag gaa 1201

Pro Ile Gln Tyr Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Tyr Gln Arg Ala Glu Glu

300 305 310

gag ctc ggc gtg tgg ggc ccg ggc ccc gag gaa gat ctg tac tcg ccg 1249

Glu Leu Gly Val Trp Gly Pro Gly Pro Glu Glu Asp Leu Tyr Ser Pro

315 320 325 330

cgc aag cag ccg tat ccg atg ccg ccg ctg ccg ttg tcg ttc aac gag 1297

Arg Lys Gln Pro Tyr Pro Met Pro Pro Leu Pro Leu Ser Phe Asn Glu

335 340 345

cag acc atc aag acg gcg ctg aac aac tac gat ccg aag ttc cat gtc 1345

Gln Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Phe His Val

350 355 360

gtg acc gag ccg gtc gcg cgc aac agc cgc ccg tac gac ggc cgc ccg 1393

Val Thr Glu Pro Val Ala Arg Asn Ser Arg Pro Tyr Asp Gly Arg Pro

365 370 375

act tgt tgc ggc aac aac aac tgc atg ccg atc tgc ccg atc ggc gcg 1441

Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys Pro Ile Gly Ala

380 385 390

atg tac aac ggc atc gtg cac gtc gag aag gcc gaa cgc gcc ggc gcg 1489

Met Tyr Asn Gly Ile Val His Val Glu Lys Ala Glu Arg Ala Gly Ala

395 400 405 410

aag ctg atc gag aac gcg gtc gtc tac aag ctc gag acg ggc ccg gac 1537

Lys Leu Ile Glu Asn Ala Val Val Tyr Lys Leu Glu Thr Gly Pro Asp

415 420 425

aag cgc atc gtc gcg gcg ctc tac aag gac aag acg ggc gcc gag cat 1585

Lys Arg Ile Val Ala Ala Leu Tyr Lys Asp Lys Thr Gly Ala Glu His

430 435 440

cgc gtc gaa ggc aag tat ttc gtg ctc gcc gcg aac ggc atc gag acg 1633

Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Val Leu Ala Ala Asn Gly Ile Glu Thr

445 450 455

ccg aag atc ctg ctg atg tcc gcg aac cgc gat ttc ccg aac ggt gtc 1681

Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn Gly Val

460 465 470

gcg aac agc tcg gac atg gtc ggc cgc aac ctg atg gac cat ccg ggc 1729

Ala Asn Ser Ser Asp Met Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His Pro Gly

475 480 485 490

acc ggc gtg tcg ttc tat gcg agc gag aag ctg tgg ccg ggc cgc ggc 1777

Thr Gly Val Ser Phe Tyr Ala Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly Arg Gly

495 500 505

ccg cag gag atg acg tcg ctg atc ggt ttc cgc gac ggt ccg ttc cgc 1825

Pro Gln Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro Phe Arg

510 515 520

gcg acc gaa gcg gcg aag aag atc cac ctg tcg aac ctg tcg cgc atc 1873

Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser Arg Ile

525 530 535

gac cag gag acg cag aag atc ttc aag gcc ggc aag ctg atg aag ccc 1921

Asp Gln Glu Thr Gln Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met Lys Pro

540 545 550

gac gag ctc gac gcg cag atc cgc gac cgt tcc gca cgc tac gtg cag 1969

Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr Val Gln

555 560 565 570

ttc gac tgc ttc cac gaa atc ctg ccg caa ccc gag aac cgc atc gtg 2017

Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg Ile Val

575 580 585

ccg agc aag acg gcg acc gat gcg atc ggc att ccg cgc ccc gag atc 2065

Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro Glu Ile

590 595 600

acg tat gcg atc gac gac tac gtg aag cgc ggc gcc gcg cat acg cgc 2113

Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His Thr Arg

605 610 615

gag gtc tac gcg acc gcc gcg aag gtg ctc ggc ggc acg gac gtc gtg 2161

Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp Val Val

620 625 630

ttc aac gac gaa ttc gcg ccg aac aat cac atc acg ggc tcg acg atc 2209

Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser Thr Ile

635 640 645 650

atg ggc gcc gat gcg cgc gac tcc gtc gtc gac aag gac tgc cgc acg 2257

Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys Arg Thr

655 660 665

ttc gac cat ccg aac ctg ttc att tcg agc agc gcg acg atg ccg acc 2305

Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met Pro Thr

670 675 680

gtc ggt acc gta aac gtg acg ctg acg atc gcc gcg ctc gcg ctg cgg 2353

Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala Leu Arg

685 690 695

atg tcg gac acg ctg aag aag gaa gtc tgacc gtg cgg aaa tct act ctc 2403

Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val Val Arg Lys Ser Thr Leu

700 705 710

act ttc ctc atc gcc ggc tgc ctc gcg ttg ccg ggc ttc gcg cgc gcg 2451

Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu Pro Gly Phe Ala Arg Ala

715 720 725

gcc gat gcg gcc gat c 2467

Ala Asp Ala Ala Asp

730

<210>2

<211>168

<212>PRT

<213>洋葱伯克霍尔德菌

<400>2

Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg His Gly Asp Ala Ala

1 5 10 15

Ala Ser Gly Ile Thr Arg Arg Gln Trp Leu Gln Gly Ala Leu Ala Leu

20 25 30

Thr Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ser Leu Thr Leu Arg Ala Leu Ala Asp

35 40 45

Asn Pro Gly Thr Ala Pro Leu Asp Thr Phe Met Thr Leu Ser Glu Ser

50 55 60

Leu Thr Gly Lys Lys Gly Leu Ser Arg Val Ile Gly Glu Arg Leu Leu

65 70 75 80

Gln Ala Leu Gln Lys Gly Ser Phe Lys Thr Ala Asp Ser Leu Pro Gln

85 90 95

Leu Ala Gly Ala Leu Ala Ser Gly Ser Leu Thr Pro Glu Gln Glu Ser

100 105 110

Leu Ala Leu Thr Ile Leu Glu Ala Trp Tyr Leu Gly Ile Val Asp Asn

115 120 125

Val Val Ile Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Met Phe Gly Val Val Ser Asp

130 135 140

Thr Leu Val Ile Arg Ser Tyr Cys Pro Asn Lys Pro Gly Phe Trp Ala

145 150 155 160

Asp Lys Pro Ile Glu Arg Gln Ala

165

<210>3

<211>539

<212>PRT

<213>洋葱伯克霍尔德菌

<400>3

Met Ala Asp Thr Asp Thr Gln Lys Ala Asp Val Val Val Val Gly Ser

1 5 10 15

Gly Val Ala Gly Ala Ile Val Ala His Gln Leu Ala Met Ala Gly Lys

20 25 30

Ala Val Ile Leu Leu Glu Ala Gly Pro Arg Met Pro Arg Trp Glu Ile

35 40 45

Val Glu Arg Phe Arg Asn Gln Pro Asp Lys Met Asp Phe Met Ala Pro

50 55 60

Tyr Pro Ser Ser Pro Trp Ala Pro His Pro Glu Tyr Gly Pro Pro Asn

65 70 75 80

Asp Tyr Leu Ile Leu Lys Gly Glu His Lys Phe Asn Ser Gln Tyr Ile

85 90 95

Arg Ala Val Gly Gly Thr Thr Trp His Trp Ala Ala Ser Ala Trp Arg

100 105 110

Phe Ile Pro Asn Asp Phe Lys Met Lys Ser Val Tyr Gly Val Gly Arg

115 120 125

Asp Trp Pro Ile Gln Tyr Asp Asp Leu Glu Pro Tyr Tyr Gln Arg Ala

130 135 140

Glu Glu Glu Leu Gly Val Trp Gly Pro Gly Pro Glu Glu Asp Leu Tyr

145 150 155 160

Ser Pro Arg Lys Gln Pro Tyr Pro Met Pro Pro Leu Pro Leu Ser Phe

165 170 175

Asn Glu Gln Thr Ile Lys Thr Ala Leu Asn Asn Tyr Asp Pro Lys Phe

180 185 190

His Val Val Thr Glu Pro Val Ala Arg Asn Ser Arg Pro Tyr Asp Gly

195 200 205

Arg Pro Thr Cys Cys Gly Asn Asn Asn Cys Met Pro Ile Cys Pro Ile

210 215 220

Gly Ala Met Tyr Asn Gly Ile Val His Val Glu Lys Ala Glu Arg Ala

225 230 235 240

Gly Ala Lys Leu Ile Glu Asn Ala Val Val Tyr Lys Leu Glu Thr Gly

245 250 255

Pro Asp Lys Arg Ile Val Ala Ala Leu Tyr Lys Asp Lys Thr Gly Ala

260 265 270

Glu His Arg Val Glu Gly Lys Tyr Phe Val Leu Ala Ala Asn Gly Ile

275 280 285

Glu Thr Pro Lys Ile Leu Leu Met Ser Ala Asn Arg Asp Phe Pro Asn

290 295 300

Gly Val Ala Asn Ser Ser Asp Met Val Gly Arg Asn Leu Met Asp His

305 310 315 320

Pro Gly Thr Gly Val Ser Phe Tyr Ala Ser Glu Lys Leu Trp Pro Gly

325 330 335

Arg Gly Pro Gln Glu Met Thr Ser Leu Ile Gly Phe Arg Asp Gly Pro

340 345 350

Phe Arg Ala Thr Glu Ala Ala Lys Lys Ile His Leu Ser Asn Leu Ser

355 360 365

Arg Ile Asp Gln Glu Thr Gln Lys Ile Phe Lys Ala Gly Lys Leu Met

370 375 380

Lys Pro Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr

385 390 395 400

Val Gln Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg

405 410 415

Ile Val Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro

420 425 430

Glu Ile Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His

435 440 445

Thr Arg Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp

450 455 460

Val Val Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser

465 470 475 480

Thr Ile Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys

485 490 495

Arg Thr Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met

500 505 510

Pro Thr Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala

515 520 525

Leu Arg Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val

530 535

<210>4

<211>27

<212>PRT

<213>洋葱伯克霍尔德菌

<400>4

Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu

1 5 10 15

Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp

20 25

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：引物

<400>5

cccaagcttg ggccgatacc gatacgca 28

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：引物

<400>6

gagaagcttt ccgcacggtc agacttcc 29

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：引物

<400>7

catgccatgg cacacaacga caacact 27

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：引物

<400>8

cccaagcttg ggtcagactt ccttcttcag c 31

<210>9

<211>16

<212>PRT

<213>洋葱伯克霍尔德菌

<400>9

Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys Arg Gly Glu Tyr Leu Ala

1 5 10 15

<210>10

<211>25

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：一致

<220>

<221>不确定的

<222>(6，17，18，19，22)

<223>Xaa＝未知的

<400>10

Ala Asp Ala Ala Asp Xaa Ala Leu Val Lys Arg Gly Glu Tyr Leu Ala

1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Asp Cys Xaa Ala Cys His

20 25

仸<210>11

<211>2410

<212>DNA

<213>洋葱伯克霍尔德菌

<220>

<221>CDS

<222>(673)..(1950)

<400>11

gatggaccac ccgggcaccg gcgtgtcgtt ctacgcgaac gagaagctgt ggccgggccg 60

cggcccgcag gatatgacgt cgctgatcgg tttccgcgac ggcccgttcc gcgcgaccga 120

agccgcgaag aagatccatc tgtcgaacat gtcccgcatc aaccaggaga cgcagaagat 180

cttcaaggcc ggcaaactga tgaagcacga ggagctcgac gcgcagatcc gcgaccgttc 240

cgcgcgctac gtgcagttcg actgcttcca cgagattctg ccgcagcccg agaaccgcat 300

cgtgccgagc aagacggcca ccgacgcgat cgggatcccg cgccccgaga tcacgtatgc 360

gatcgacgat tacgtgaagc gcggcgccgt gcacacgcgc gaggtctacg cgacggccgc 420

gaaggtgctg ggcggcaccg acgtcgtctt caacgacgag ttcgcgccga acaaccacat 480

cacgggcgcg aggatcatgg gcgcggatgc acgcgactcg gtcgtcgaca aggactgccg 540

cacgttcgac catccgaacc tgttcctctc gagcagctcg acgatgccga ccgtcggtac 600

ggtgaacgtg acgctgacga tcgcggcgct cgcgctgcgg atgtcggaca cgctgaagaa 660

ggaagtctga cc gtg cgg aaa tct act ctc acc ttc ctc ctc gcc ggc tgc 711

Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Leu Ala Gly Cys

1 5 10

ctc gcg ctg ccc ggc ctc gca cgc gcg gcc gat tcg gcc gat ccg gcg 759

Leu Ala Leu Pro Gly Leu Ala Arg Ala Ala Asp Ser Ala Asp Pro Ala

15 20 25

cat gtc aag cgc ggc gaa tac ctc gcc gtc gcg ggc gac tgc atg gca 807

His Val Lys Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Val Ala Gly Asp Cys Met Ala

30 35 40 45

tgc cac acc gcg aag ggc ggc aag ccg ttc gcg ggc ggc ctc ggc atg 855

Cys His Thr Ala Lys Gly Gly Lys Pro Phe Ala Gly Gly Leu Gly Met

50 55 60

ccg gtg ccg atg ctc ggc aag atc tat acg agc aac atc aca ccg gat 903

Pro Val Pro Met Leu Gly Lys Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp

65 70 75

ccc gat acc ggc atc ggc aac tgg acg ttc gag gac ttc gag cgc gcg 951

Pro Asp Thr Gly Ile Gly Asn Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala

80 85 90

gtg cgg cac ggc gta tcg aag aac ggc gac aac ctg tac ccg gcg atg 999

Val Arg His Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met

95 100 105

ccg tac gtg tcg tac gcg aag atc aac gac gac gac gtg caa gcg ctg 1047

Pro Tyr Val Ser Tyr Ala Lys Ile Asn Asp Asp Asp Val Gln Ala Leu

110 115 120 125

tac gcg tac ttc atg cac ggc gtc gaa ccg gtc aag cag gcg ccg ccg 1095

Tyr Ala Tyr Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro

130 135 140

aag aac gag atc ccc gcg ctg ctg agc atg cgc tgg ccg ctg aag atc 1143

Lys Asn Glu Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile

145 150 155

tgg aac tgg ctg ttc ctg aag gac ggc gtg tac cag ccg aag ccc gag 1191

Trp Asn Trp Leu Phe Leu Lys Asp Gly Val Tyr Gln Pro Lys Pro Glu

160 165 170

cag agc gcc gag tgg aac cgc ggc gcc tat ctc gtg cag ggc ctc gcg 1239

Gln Ser Ala Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala

175 180 185

cac tgc agc acg tgc cac acg ccg cgc ggc atc gcg atg cag gag aag 1287

His Cys Ser Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys

190 195 200 205

tcg ctc gac gaa acg ggc ggc agc ttc ctg tcg ggc tcg gtg ctc gcg 1335

Ser Leu Asp Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ser Gly Ser Val Leu Ala

210 215 220

ggc tgg gac ggc tac aac atc acg tcc gac ccg aac gcg ggg atc ggc 1383

Gly Trp Asp Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly

225 230 235

ggc tgg acg cag cag cag ctc gtc cag tac ctg cgc acc ggc agc gtg 1431

Gly Trp Thr Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val

240 245 250

ccg ggc ctc gcg cag gcg gcc ggc ccg atg gcc gag gcg atc gag cac 1479

Pro Gly Leu Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Ile Glu His

255 260 265

agc ttc tcg aag atg acc gaa gcc gac atc ggc ggc ccg atg gcc gag 1527

Ser Phe Ser Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Gly Pro Met Ala Glu

270 275 280 285

gcg atc gag cac agc ttc tcg aag atg acc gaa gcc gac atc ggc cgc 1575

Ala Ile Glu His Ser Phe Ser Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Arg

290 295 300

tcg tcg tgg ggc aag ccg gcc gag gat ggc ctg aag ctg cgc ggc gtc 1623

Ser Ser Trp Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val

305 310 315

gcg ctc gcg tcg tcg ggc atc gat ccg gca ccg ctg tat ctc ggc aac 1671

Ala Leu Ala Ser Ser Gly Ile Asp Pro Ala Pro Leu Tyr Leu Gly Asn

320 325 330

tgc gcg acc tgc cac cag atg cag ggc aag ggc acg ccg gac ggt tac 1719

Cys Ala Thr Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr

335 340 345

tac ccg ccg ttg ttc cac aac tcg acg gtc ggc gcg tcg aat ccg acc 1767

Tyr Pro Pro Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Thr

350 355 360 365

aac ctc gtg cag gtg atc ctg aac ggc gtg cag cgc aag gcc ggc agc 1815

Asn Leu Val Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ala Gly Ser

370 375 380

gag gac gtc ggg atg ccc gcg ttc cgc cac gag ctg tcg gat gcg cag 1863

Glu Asp Val Gly Met Pro Ala Phe Arg His Glu Leu Ser Asp Ala Gln

385 390 395

atc gcc gcg ctg acg aac tac ctg acg ggg cag ttc ggc aat ccg gcc 1911

Ile Ala Ala Leu Thr Asn Tyr Leu Thr Gly Gln Phe Gly Asn Pro Ala

400 405 410

gcg aag gtg acc gag cag gac gtc gcg aag ctg cgc tga aacgcggcac 1960

Ala Lys Val Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg

415 420 425

gcggcgaggc agggcaacaa tagaaaagag gaggagcaca gcacatcggg cgggccccga 2020

tgccggttgt tgcagagcgg gacgggcggc gcaggcggtc gcccgtcctg gttcacaggc 2080

aatccggtgc gcgcacgccg cgcatcgttt tcgttgatcg agaccatgac accgaaccaa 2140

ccgtttctcg cgtcccagcg cgatgtgctg ctgctgctgt cccgaatcct gctcgtgatc 2200

ctgttcgtga tgttcggctg gaagaagatt atcgacttct ccggtacgat cgcgttcatg 2260

ggcagcgagg gcgcgccggc gccgatcatc tcggcggcga tctccgtcgt gatggagctc 2320

atcgtcggga ttgcgatcct cgtcggtttc cagacgcggc cgctcgcgct gttgcttgcg 2380

ctgtacacga tcggtaccgg catcatcggc 2410

<210>12

<211>425

<212>PRT

<213>洋葱伯克霍尔德菌

<400>12

Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Leu Ala Gly Cys Leu Ala Leu

1 5 10 15

Pro Gly Leu Ala Arg Ala Ala Asp Ser Ala Asp Pro Ala His Val Lys

20 25 30

Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Val Ala Gly Asp Cys Met Ala Cys His Thr

35 40 45

Ala Lys Gly Gly Lys Pro Phe Ala Gly Gly Leu Gly Met Pro Val Pro

50 55 60

Met Leu Gly Lys Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr

65 70 75 80

Gly Ile Gly Asn Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His

85 90 95

Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val

100 105 110

Ser Tyr Ala Lys Ile Asn Asp Asp Asp Val Gln Ala Leu Tyr Ala Tyr

115 120 125

Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu

130 135 140

Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp

145 150 155 160

Leu Phe Leu Lys Asp Gly Val Tyr Gln Pro Lys Pro Glu Gln Ser Ala

165 170 175

Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser

180 185 190

Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp

195 200 205

Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ser Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp

210 215 220

Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Gly Trp Thr

225 230 235 240

Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Leu

245 250 255

Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Ile Glu His Ser Phe Ser

260 265 270

Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Gly Pro Met Ala Glu Ala Ile Glu

275 280 285

His Ser Phe Ser Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Arg Ser Ser Trp

290 295 300

Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala

305 310 315 320

Ser Ser Gly Ile Asp Pro Ala Pro Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr

325 330 335

Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Pro

340 345 350

Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Thr Asn Leu Val

355 360 365

Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ala Gly Ser Glu Asp Val

370 375 380

Gly Met Pro Ala Phe Arg His Glu Leu Ser Asp Ala Gln Ile Ala Ala

385 390 395 400

Leu Thr Asn Tyr Leu Thr Gly Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val

405 410 415

Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg

420 425

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：引物

<400>13

tgcaccgtgc ggaaatctac tctcact 27

<210>14

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：引物

<400>14

acttccttct tcagcgtgtc cgacatc 27

仸<210>15

<211>1441

<212>DNA

<213>洋葱伯克霍尔德菌

<220>

<221>CDS

<222>(121)..(1398)

<400>15

tccgaacctg ttcatttcga gcagcgcgac gatgccgacc gtcggtaccg taaacgtgac 60

gctgacgatc gccgcgctcg cgctgcggat gtcggacacg ctgaagaagg aagtctgacc 120

gtg cgg aaa tct act ctc act ttc ctc atc gcc ggc tgc ctc gcg ttg 168

Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu

1 5 10 15

ccg ggc ttc gcg cgc gcg gcc gat gcg gcc gat ccg gcg ctg gtc aag 216

Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys

20 25 30

cgc ggc gaa tac ctc gcg acc gcc atg ccg gta ccg atg ctc ggc aag 264

Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Ala Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys

35 40 45

atc tac acg agc aac atc acg ccc gat ccc gat acg ggc gac tgc atg 312

Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Asp Cys Met

50 55 60

gcc tgc cac acc gtg aag ggc ggc aag ccg tac gcg ggc ggc ctt ggc 360

Ala Cys His Thr Val Lys Gly Gly Lys Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly

65 70 75 80

ggc atc ggc aaa tgg acg ttc gag gac ttc gag cgc gcg gtg cgg cac 408

Gly Ile Gly Lys Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His

85 90 95

ggc gtg tcg aag aac ggc gac aac ctg tat ccg gcg atg ccg tac gtg 456

Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val

100 105 110

tcg tac gcg aag atc aag gac gac gac gta cgc gcg ctg tac gcc tac 504

Ser Tyr Ala Lys Ile Lys Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr

115 120 125

ttc atg cac ggc gtc gag ccg gtc aag cag gcg ccg ccg aag aac gag 552

Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu

130 135 140

atc cca gcg ctg cta agc atg cgc tgg ccg ctg aag atc tgg aac tgg 600

Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp

145 150 155 160

ctg ttc ctg aag gac ggc ccg tac cag ccg aag ccg tcg cag agc gcc 648

Leu Phe Leu Lys Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala

165 170 175

gaa tgg aat cgc ggc gcg tat ctg gtg cag ggt ctc gcg cac tgc agc 696

Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser

180 185 190

acg tgc cac acg ccg cgc ggc atc gcg atg cag gag aag tcg ctc gac 744

Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp

195 200 205

gaa acc ggc ggc agc ttc ctc gcg ggg tcg gtg ctc gcc ggc tgg gac 792

Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp

210 215 220

ggc tac aac atc acg tcg gac ccg aat gcg ggg atc ggc agc tgg acg 840

Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Ser Trp Thr

225 230 235 240

cag cag cag ctc gtg cag tat ttg cgc acc ggc agc gtg ccg ggc gtc 888

Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Val

245 250 255

gcg cag gcg gcc ggg ccg atg gcc gag gcg gtc gag cac agc ttc tcg 936

Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Val Glu His Ser Phe Ser

260 265 270

aag atg acc gaa gcg gac atc ggt gcg atc gcc acg tac gtc cgc acg 984

Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Ala Ile Ala Thr Tyr Val Arg Thr

275 280 285

gtg ccg gcc gtt gcc gac agc aac gcg aag cag ccg cgg tcg tcg tgg 1032

Val Pro Ala Val Ala Asp Ser Asn Ala Lys Gln Pro Arg Ser Ser Trp

290 295 300

ggc aag ccg gcc gag gac ggg ctg aag ctg cgc ggt gtc gcg ctc gcg 1080

Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala

305 310 315 320

tcg tcg ggc atc gat ccg gcg cgg ctg tat ctc ggc aac tgc gcg acg 1128

Ser Ser Gly Ile Asp Pro Ala Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr

325 330 335

tgc cac cag atg cag ggc aag ggc acg ccg gac ggc tat tac ccg tcg 1176

Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Ser

340 345 350

ctg ttc cac aac tcc acc gtc ggc gcg tcg aat ccg tcg aac ctc gtg 1224

Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Ser Asn Leu Val

355 360 365

cag gtg atc ctg aac ggc gtg cag cgc aag atc ggc agc gag gat atc 1272

Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ile Gly Ser Glu Asp Ile

370 375 380

ggg atg ccc gct ttc cgc tac gat ctg aac gac gcg cag atc gcc gcg 1320

Gly Met Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Asn Asp Ala Gln Ile Ala Ala

385 390 395 400

ctg acg aac tac gtg acc gcg cag ttc ggc aat ccg gcg gcg aag gtg 1368

Leu Thr Asn Tyr Val Thr Ala Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val

405 410 415

acg gag cag gac gtc gcg aag ctg cgc tga catagtcggg cgcgccgaca 1418

Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg

420 425

cggcgcaacc gataggacag gag 1441

<210>16

<211>425

<212>PRT

<213>洋葱伯克霍尔德菌

<400>16

Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu

1 5 10 15

Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys

20 25 30

Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Ala Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys

35 40 45

Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Asp Cys Met

50 55 60

Ala Cys His Thr Val Lys Gly Gly Lys Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly

65 70 75 80

Gly Ile Gly Lys Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His

85 90 95

Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val

100 105 110

Ser Tyr Ala Lys Ile Lys Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr

115 120 125

Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu

130 135 140

Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp

145 150 155 160

Leu Phe Leu Lys Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala

165 170 175

Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser

180 185 190

Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp

195 200 205

Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp

210 215 220

Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Ser Trp Thr

225 230 235 240

Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Val

245 250 255

Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Val Glu His Ser Phe Ser

260 265 270

Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Ala Ile Ala Thr Tyr Val Arg Thr

275 280 285

Val Pro Ala Val Ala Asp Ser Asn Ala Lys Gln Pro Arg Ser Ser Trp

290 295 300

Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala

305 310 315 320

Ser Ser Gly Ile Asp Pro Ala Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr

325 330 335

Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Ser

340 345 350

Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Ser Asn Leu Val

355 360 365

Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ile Gly Ser Glu Asp Ile

370 375 380

Gly Met Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Asn Asp Ala Gln Ile Ala Ala

385 390 395 400

Leu Thr Asn Tyr Val Thr Ala Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val

405 410 415

Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg

420 425

<210>17

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：边缘结合基序

<220>

<221>不确定的

<222>(2，3)

<223>Xaa＝未知的

<400>17

Cys Xaa Xaa Cys His

1 5

<210>18

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：引物

<400>18

catgccatgg cacacaacga caacact 27

<210>19

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的说明：引物

<400>19

cccaagcttg ggtcagactt ccttcttcag c 31

Claims

1.定义于下面(A)或(B)中的蛋白质：

2.编码定义于下面(A)或(B)中的蛋白质的DNA：

3.根据权利要求2所述的DNA，其中所述DNA定义于下面(a)或(b)中：

(a)包含由SEQ ID NO：15的核苷酸187-1398组成的核苷酸序列的DNA；

4.根据权利要求3所述的DNA，所述DNA还包含由SEQ ID NO：15的核苷酸121-187组成的核苷酸序列。

5.重组载体，所述重组载体包含根据权利要求2到4任一项所述的DNA。

6.用根据权利要求2到4任一项所述的DNA或根据权利要求5所述的重组载体转化的转化体。

7.生产葡萄糖脱氢酶β亚基的方法，包括培养权利要求6的转化体以产生葡萄糖脱氢酶β亚基作为所述DNA的表达产物，并收集产生的β亚基。

8.根据权利要求3或4所述的DNA，其中所述DNA还包含编码洋葱伯克霍尔德菌的葡萄糖脱氢酶的α亚基和γ亚基的核苷酸序列。

9.包含根据权利要求8所述的DNA的重组载体。

10.用根据权利要求8所述的DNA或根据权利要求9所述的重组载体转化的转化体。

11.生产葡萄糖脱氢酶复合物的方法，包括培养根据权利要求10所述的转化体以产生葡萄糖脱氢酶复合物作为所述DNA的表达产物，并收集产生的复合物。