CN118185913A - 一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用，所述酰化酶为来自于副球菌Paracoccus sp.KDSPL‑02的酰胺酶Pa404W和突变酶Pm‑F274A/W404G。本发明所述酰化酶Pa404W及其突变体Pm‑F274A/W404G催化酰胺化的应用，涉及到利用酰化酶Pa404W和突变酶Pm‑F274A/W404G催化水解β‑内酰胺类抗生素包括青霉素类(如青霉素G、青霉素V、青霉亚砜、阿莫西林、苯唑西林钠等)以及头孢菌素类(如：头孢噻吩、头孢氨苄、头孢唑林等)，可实现侧链与母核之间酰胺键完全水解，产生6‑氨基青霉烷酸(6‑APA)以及7‑氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7‑ADCA)。同时，Pa404W及Pm‑F274A/W404G也能催化6‑APA与D‑苯基甘氨酸甲酯或对羟基‑D‑苯基甘氨酸甲酯发生反应，实现6‑APA和7‑ADCA以及7‑ACA氨基上的酰化。
Description
技术领域
本发明属于酶催化技术领域，具体涉及一种副球菌Paracoccus sp KDSPL-02来源的酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G的酰化反应及应用于6-APA及7-ADCA的酶法制备以及半合成类β-内酰胺类抗生素的合成中。
背景技术
青霉素酰化酶属于氨基水解酶类，来源广泛(细菌、真菌和酵母)，是一种重要的工业用酶。青霉素酰化酶同时也是一种多功能酶，具有广泛的底物谱、高区域选择性、高化学选择性和高对映体选择性，能够催化多种反应。青霉素酰化酶在手性化学品合成中应用广泛，主要可以分为6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)的制备、半合成β-内酰胺抗生素的合成、甚至还包括手性化合物的拆分、前手性化合物的不对称水解和多肽合成5个方面。
6-APA和7-ADCA以及7-ACA和7-ACCA等是半合成β-内酰胺抗生素的关键中间体，需求量大，它们的生产直接影响世界抗生素市场的稳定性。6-APA的传统化学法生产以发酵产物青霉素G为原料，反应条件苛刻，需要使用高毒试剂，会产生大量废物。6-APA的酶法生产同样以青霉素G为原料，通过青霉素酰化酶水解生成6-APA。随着新的青霉素酰化酶的发现，重组DNA技术的运用以及固定化技术的发展，6-APA的酶法生产在20世纪80年代基本取代了化学法。时至今日，研究工作者仍然在发现新的青霉素酰化酶，酰化酶的定向进化，酶固定化技术等领域不断探索突破，以提高6-APA或7-ACA的生产效率。
β-内酰胺类抗生素因其杀菌活性强、适应症广、毒性低、临床疗效好，成为临床上应用最广泛的抗菌药物。由于近年来致病菌耐药性的出现，削弱了传统抗生素的疗效，导致一系列β-内酰胺类抗生素退出临床，并促使半合成抗生素的开发与使用。在β-内酰胺类半合成抗生素的制备过程中，青霉素酰化酶(酰胺酶)扮演了重要的角色，其可水解青霉素G获得重要的中间体6-APA，并能有效的催化酰基转移(主要是D-苯基甘氨酸和对羟基-D-苯基甘氨酸残基从其酰胺和酯转移到青霉素和头孢菌素母核)。因此本发明中的副球菌来源的酰胺酶及其突变体在半合成抗生素工业领域具有较强的实用性。
近年来，酰化酶，特别是青霉素酰化酶在欧美的一些发达国家中需求量逐渐上升，而我国在微生物产青霉素酰化酶方面虽然与国外相比，正处于发展中阶段。这一领域的发展，其根本在于新来源的酰化酶不断发现，才有可能进一步获得更高效的突变体及配套生产工艺。
发明内容
本发明提供了一种副球菌来源的酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G催化酰胺化反应及用于6-APA、7-ACA以及7-ADCA中，以及用于相关半合成β-内酰胺类抗生素制备中。
本发明所述副球菌来源酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G均由大肠杆菌工程菌株制备。
本发明提供了包含所述基因的表达盒、重组载体和重组转化子。
所述6-APA的酶法制备，即利用酶Pa404W或其突变体Pm-F274A/W404G催化青霉素G侧链水解，合成6-APA。
所述7-ACA的酶法制备，即利用酶Pa404W或其突变体Pm-F274A/W404G催化头孢霉素C侧链水解，合成7-ACA。
所述7-ADCA的制备，即利用酶Pa404W和Pm-F274A/W404G对青霉素G扩环产物头孢G酸(7-苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢G酸，7PAADCA)的侧链酰胺的水解，以生成7-ADCA。
所述相关半合成β-内酰胺类抗生素的合成，即利用酶Pa404W和Pm-F274A/W404G对6-APA(或7-ADCA)与氨基侧链(如D-苯甘氨酸甲酯或D-对羟基苯甘氨酸甲酯)进行缩合反应。
本领域普通技术人员根据本发明提供的酰胺酶的氨基酸序列，可以方便地进行重组获得基因工程菌，以基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞破碎后的上清液或者纯化后的酶液作为酶源。
本发明的副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用的有益效果为：
本发明研究人员在前期研究中筛选得到一株高效水解青霉素的菌株，即Paracoccus sp.KDSPL-02，提示在该菌中，具有高效水解青霉素的酶。本发明利用生物信息学技术从Paracoccus sp.KDSPL-02中挖掘得到酰化酶的编码基因。本发明将副球菌酰化酶序列克隆至大肠杆菌中，对重组菌株进行优化，得到高表达副球菌来源酰化酶的工程菌株，制备酰化酶，并利用该酶进行青霉素或头孢菌素的水解生成重要的药物中间体6-APA、7-ACA及7-ADCA，为上述重要药物中间体的制备提供了新的生物催化剂选择。
本发明从副球菌中鉴定出新的编码酰化酶的序列，具备新颖性。其可应用于重要的抗生素工业中间体6-APA、7-ACA以及7-ADCA的制备，以及相关半合成β-内酰胺类抗生素的合成中。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G水解青霉素G制备6-APA；其中，A为反应式意图，B为液相检测，C为Pa404W水解青霉素G时程图，D为突变体Pm-F274A/W404G水解青霉素G时程图；
图2为酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G水解头孢菌素C制备7-ACA；其中，A为反应式意图，B为Pa404W水解头孢菌素C时程图，C为突变体Pm-F274A/W404G水解头孢菌素C时程图；
图3为酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G水解青霉G酸制备7-ADCA；其中，A为反应式意图，B为Pa404W水解头孢G酸时程图，C为突变体Pm-F274A/W404G水解头孢G酸时程图；
图4为酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G催化合成氨苄西林；其中，A为反应式意图，B为Pa404W催化合成氨苄西林时程图，C为突变体Pm-F274A/W404G催化合成氨苄西林时程图；
图5为酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G催化合成阿莫西林；其中，A为反应式意图，B为液相检测，C为Pa404W催化合成阿莫西林时程图，D为突变体Pm-F274A/W404G催化合成阿莫西林时程图；
图6为酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G催化合成头孢氨苄；其中，A为反应式意图，B为Pa404W催化合成头孢氨苄时程图，C为突变体Pm-F274A/W404G催化合成头孢氨苄时程图；
图7为酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G催化合成头孢羟氨苄，其中，A为反应式意图，B为Pa404W催化合成头孢羟氨苄时程图，C为突变体Pm-F274A/W404G催化合成头孢羟氨苄时程图；
图8为实施例1中PCR循环过程。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例1副球菌酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G的制备
1、副球菌酰胺酶的挖掘与分析
针对实验室前期对副球菌株(副球菌以保藏编号CGMCC No.12494保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。命名为Paracoccus sp.KDSPL-02.)进行基因组测序的基础上进一步对副球菌中的酰胺酶进行生物信息学挖掘，通过NCBI及Swiss-prot等数据库的分析，在测序得到的基因组中挖掘出了注释为酰胺酶的序列。
通过分析，从Paracoccus sp.KDSPL-02基因组中获得一条被注释为酰胺酶的序列，其氨基酸序列见SEQ ID NO.1。
将上述选定的酰胺酶序列在Blast模块的中的Swiss-prot数据库进行***的比较，发现其与NCBI数据库中登录号为P06875.2的同源性最高，为41％，相似性较低，具备序列及功能的新颖性。其中P06875.2序列编码Penicillin G acylase(Escherichia coli)蛋白。
经生物信息学预测分析，该副球菌酰胺酶分子量为87.61kDa，等电点pI为4.87。
2、表达副球菌酰胺酶的工程菌株构建
1)酰胺酶基因的合成以及扩增
本实施例利用PGEX-6p-1(购自Biofeng)为基础质粒构建表达载体，该质粒经过实验室改造把质粒上自带的氨苄西林抗性基因改造成卡那霉素的抗性基因质粒PGEX-6p-1-Kan。将目的片段***至PGEX-6p-1-Kan的Xho I和BanH I酶切位点。具体操作如下：
利用引物对F：5’-CGGGATCCATGCTCAGGTCTTCGCTTGGCCG-3’
R：5’-CCGCTCGAGCTAGCGCGGAACGGCGATGG-3’
以目的基因组DNA为模板进行PCR，可扩增得到所需基因的目的片段，PCR扩增条件如下：
2)目的片段与PGEX-6p-1-Kan质粒的双酶切与连接
将扩增完成的目的基因利用PCR产物纯化试剂盒(EasyPure PCR PurificationKit，购自于北京全式金生物技术有限公司)对其纯化。利用限制性内切酶XhoⅠ和BanHⅠ对上述扩增所得片段及载体分别进行PGEX-6p-1双酶切。酶切体系如下所示，酶切反应为37℃孵育30min：
表1
利用T4 DNALigase连接酶(购自宝生物工程有限公司)对目的片段和载体进行连接，连接体系如下：
表2
16℃连接过夜后，化转至E.coli DH5α感受态细胞中，涂布于卡那霉素抗性平板上，待其生长一段时间后出现单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR，选取阳性克隆子进行测序。测序验证成功后，将质粒化转至表达菌株E.coli BL21(DE3)中进行表达，获得重组工程菌株。
3、副球菌酰胺酶的异源表达与纯化
3.1副球菌酰胺酶的异源表达
将重组工程菌接种于5mL试管LB培养基中，添加卡那霉素至终浓度50μg/mL。37℃，200rpm震荡培养过夜，即得种子液。吸取0.5mL种子液，接种于50mL TB培养基中，添加卡那霉素至终浓度为50μg/mL。37℃，200rpm震荡培养3小时，并降低温度至20℃，同时添加诱导剂IPTG，使其终浓度为0.1μM，进行诱导表达，转速调整为120rpm，诱导表达至18h，收集菌体用于蛋白纯化。
准备若干个50mL的离心管，将诱导结束后的菌液放入离心管中，7000rpm,4℃，离心4min，弃上清液，保留离心后的产物。每个离心管中分别加入15mL的Binding Buffer，震荡混匀使沉在底部的菌体充分与非变形裂解液融合后离心，如此重复两次后，然后再次加入Binding Buffer与菌体充分混合，将离心管放在装有碎冰的烧杯中，利用超声破细胞碎机对菌体进行破碎。超声结束后溶液在4℃的离心机中12000rpm离心8min。留取上清液，沉淀用Binding Buffer重悬，取1.5mL的ep管分别留取沉淀和上清液用于蛋白电泳的分析。
3.2副球菌酰胺酶的纯化
利用GST琼脂糖纯化树脂对带有GST标签蛋白进行纯化，其操作流程如下：
1)将超声破碎后的蛋白上清液用直径为0.22μm的水洗超滤膜过滤后备用，准备6倍柱体积的蒸馏水，对柱子经行冲洗。
2)缓慢加入5倍柱体积的蒸馏水对柱子经行清洗。在加入5倍柱体积的平衡缓冲液对柱子进行平衡，维持柱子pH值为8.0。
3)将过滤后的蛋白上清液缓慢的加入含有GST琼脂糖树脂的柱子中，控制上清液在填料中的流速，保证上清液中的蛋白能最大限度的与GST树脂结合，此步骤重复两次。
4)加入8倍柱体积的平衡缓冲液，对柱子经行洗脱，收集此步骤中流出的洗脱液用于蛋白电泳分析。
5)加入2倍柱体积的Elution Buffer洗脱液，收集洗脱下来的液体用于SDS蛋白检测。
6)加入3倍柱体积的平衡洗脱液，对柱子进行清洗。
7)加入5倍柱体积的蒸馏水和5倍柱体积的20％乙醇对柱子进行冲洗，冲洗结束后，加入1倍柱体积的20％乙醇封存柱子，放置在4℃冰箱里。
在Elution Buffer洗脱液加入终浓度为10mM的还原型谷胱甘肽。注意：还原型谷胱甘肽易于被氧化，需要现配先用。由于GST标签的特异性，只会与谷胱甘肽结合从而达到洗脱出蛋白的目的。
利用高回收过滤器对蛋白进行浓缩
使用Millipore的高回收过滤器(MWCO50kDa)对在10mM谷胱甘肽洗脱液洗下来的蛋白液进行超滤浓缩，离心机提前降温至4℃，过滤器先5000xg离心超纯水洗10min，然后加入约12mL的蛋白液超滤，当过滤器中的溶液量大概为1mL时停止过滤，缓慢的加入pH为6.5的磷酸钠缓冲溶液10mL，将溶液中残留的谷胱甘肽置换除去，此操作步骤循环四次后，过滤器中剩余约1mL的浓缩蛋白液，小心吸取蛋白液于1.5mL的离心管中加一定比例的甘油放置于-80℃的冰箱中保存用于后续的实验。
4、副球菌酰胺酶突变体的构建
利用重叠延伸PCR技术将副球菌酰胺酶的第274位苯丙氨酸(F)突变为丙氨酸(A)，获得突变体Pm-F274A；在此基础上，利用重叠延伸PCR技术将Pm-F274A的第404位色氨酸(W)突变为甘氨酸(G)，获得突变体Pm-F274A/W404G。
根据青霉素G酰化酶的基因序列结合所要进行的突变形式进行引物的设计，合成部分由上海生工生物公司完成。
所设计的引物碱基序列分别为：
(1)PGA-a-F：5’-CGGGATCCATGCTCAGGTCTTCGCTTGGCCG-3’
(2)PGA-a-R：5’-CCGCTCGAGCTAGCGCGGAACGGCGATGGTTTC-3’
(3)PGA-b-F：5’-TCCTGATCAACGGCCCGCAAGCCGGCAATTTCAACCCG-3’
(4)PGA-b-R：5’-CGGGTTGAAATTGCCGGCTTGCGGGCCGTTGATCAAGA-3’
(5)PGA-c-F：5’
-CAGGAGATCTCGACGCTCAGGGCCTGGGTGAACTCG-3’
(6)PGA-c-F：
5’-CCTTGGTCGAGTTCACCCCGGCCATGAGCGTCGAGATC-3’
引物PGA-b-F和PGA-b-R分别为包含突变位点的上下引物，突变形式是由苯丙氨酸(TTC)变成丙氨酸(GCC)。引物PGA-c-F和PGA-c-R分别为包含突变位点的上下引物，突变形式是由色氨酸(TGG)变成甘氨酸(GGG)
以实验室构建的能够高效表达副球菌中青霉素G酰化酶的基因工程菌DNA为模板，运用重叠延伸PCR技术进行目的基因的扩增，需进行三次PCR即可得到突变后的目的基因。
PCR反应体系如下：
表3PCR反应体系1
将反应体系中的各个溶液用移液枪吸取，并温和地放置于PCR管中混合均匀，然后放入PCR仪中进行反应。
根据该反应体系扩增出目的基因，用琼脂糖凝胶电泳检测，并将此DNA切胶回收，命名为上片段。
表4PCR反应体系2
根据该反应体系扩增出目的基因，用琼脂糖凝胶电泳检测，并将此DNA切胶回收，命名为下片段。
回收的上下片段作为第三次PCR的模板用于扩增突变的目的基因。
表5PCR反应体系3
根据该反应体系扩增出的目的基因大小应为2373bp左右(应与原青霉素G酰化酶基因长度一致)，用琼脂糖凝胶电泳检测，并将此DNA切胶回收，即为完成突变后的目的基因。PCR循环过程如下图8所示。
获得的编码突变体的目的基因，按照上述实例1中基因工程菌株构建的方法，构建工程菌株，并表达酰胺酶的突变体，纯化制得用于抗生素的水解研究。其他突变体的制备方法同本实施例过程。
实施例2副球菌酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G水解青霉素G制备6-APA
反应体系：利用pH7.0的磷酸钠缓冲液，溶解青霉素G钠(CAS号：69-57-8)，使底物溶液终浓度为0.5mM。底物溶液中加入酶液，使酶的终浓度为500ug/mL。
反应条件：当在青霉素G钠溶液中加入酶后，启动反应，28℃水浴反应，20min后，取10μL反应液稀释至90μL水中，充分混合，高效液相色谱仪检测产物峰滞留时间与出峰面积，记录数据并计算酶的比活力。
计算方式：
比活力＝U/M
U:28℃，每催化反应1μmol的底物所需要的酶量；
w:反应的产率，即底物的减少量与初底物的比值；
c:反应液中初底物的浓度(mol/L)；
V:反应液体积(ml)
t:反应时间(min)；
v:加入反应酶液的量(ml)；
M:酶液的蛋白含量。
经高效液相色谱检测，产物的保留时间与6-氨基青霉烷酸标准品(CAS:551-16-6)对应，另一个产物保留时间与苯乙酸标准品(CAS:103-82-2)对应。表明副球菌酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G能够将青霉素G进行水解产生重要的中间体6-APA。
参见图1，其中利用Pa404W在反应20min条件下，产率为78.4％，比活为32.5U/mg，利用突变体Pm-F274A/W404G在反应20min条件下，产率为94.3％，比活为49.2U/mg。
实施例3副球菌酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G水解头孢菌素C制备7-ACA
反应体系：利用pH7.0的磷酸钠缓冲液，溶解头孢菌素C(CAS号：61-24-5)，使底物溶液终浓度为0.5mM。底物溶液中加入酶液，使酶的终浓度为500ug/mL。
反应条件：当在头孢菌素C溶液中加入酶后，启动反应，28℃水浴反应，20min后，取10μL反应液稀释至90μL水中，充分混合，高效液相色谱仪检测产物峰滞留时间与出峰面积，记录数据并计算酶的比活力。
酶的比活力计算同实施例2。
经高效液相色谱检测，产物的保留时间与7-氨基头孢烷酸标准品(CAS:957-68-6)对应，。表明副球菌酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G能够将青霉素G进行水解产生重要的中间体7-ACA。
参见图2，其中利用Pa404W在反应20min条件下，产率为58.4％，比活为26.8U/mg，利用突变体Pm-F274A/W404G在反应20min条件下，产率为81.2％，比活为39.4U/mg。
实施例4利用副球菌酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G，进行酶法制备7-ADCA
反应体系：利用pH7.0的磷酸钠缓冲液，溶解青霉素G扩环产物头孢G酸(扩环酸)，使底物溶液终浓度为0.5mM。底物溶液中加入酶液，使酶的终浓度为500ug/mL。
反应条件：当在7PAADCA溶液中加入酶后，启动反应，28℃水浴反应，20min后，取10μL反应液稀释至90μL水中，充分混合，高效液相色谱仪检测产物峰滞留时间与出峰面积，记录数据并计算酶的比活力。
酶的比活力计算同实施例2。
经高效液相色谱检测，产物的保留时间与7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸标准品(CAS:22252-43-3)对应。表明副球菌酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G能够将青霉素G进行水解产生重要的中间体7-ADCA。
参见图3，其中利用Pa404W在反应20min条件下，7-ADCA产率为70.2％，比活为31.1U/mg，利用突变体Pm-F274A/W404G在反应20min条件下，7-ADCA产率为85.3％，比活为42.1U/mg。
实施例5利用副球菌酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G制备氨苄西林
反应体系：利用异丙醇分别溶解6-氨基青霉烷酸以及D-苯甘氨酸甲酯，将两种底物溶液1:1混合，使底物终浓度均为0.5mM。将底物溶液中加入酶液(水溶)，使酶的终浓度为500ug/mL，反应体系中水的体积控制在2％以下。
反应条件：当在底物溶液中加入酶后，启动反应，28℃水浴反应，反应过程防止异丙醇的挥发，20min后，取10μL反应液稀释至90μL水中，充分混合，高效液相色谱仪检测产物峰滞留时间与出峰面积，记录数据并计算酶的比活力。
酶的比活力计算同实施例2。
经高效液相色谱检测，产物的保留时间与氨苄西林标准品(CAS:69-53-4)对应。表明副球菌酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G能够将6-氨基青霉烷酸与D-苯甘氨酸甲酯缩合产生半合成抗生素氨苄西林。
参见图4，其中利用Pa404W在反应20min条件下，7-ADCA产率为37.5％，比活为16.8U/mg，利用突变体Pm-F274A/W404G在反应20min条件下，7-ADCA产率为66.3％，比活为32.8U/mg。
实施例6利用副球菌酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G制备阿莫西林
反应体系：利用异丙醇分别溶解6-氨基青霉烷酸以及D-对羟基苯甘氨酸甲酯(CAS:37763-23-8)，将两种底物溶液1:1混合，使底物终浓度均为0.5mM。将底物溶液中加入酶液(水溶)，使酶的终浓度为500ug/mL，反应体系中水的体积控制在2％以下。
反应条件：当在底物溶液中加入酶后，启动反应，28℃水浴反应，反应过程防止异丙醇的挥发，20min后，取10μL反应液稀释至90μL水中，充分混合，高效液相色谱仪检测产物峰滞留时间与出峰面积，记录数据并计算酶的比活力。
酶的比活力计算同实施例2。
经高效液相色谱检测，产物的保留时间与阿莫西林标准品(CAS:26787-78-0)对应。表明副球菌酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G能够将6-氨基青霉烷酸与D-对羟基苯甘氨酸甲酯缩合产生半合成抗生素阿莫西林。
参见图5，其中利用Pa404W在反应20min条件下，阿莫西林产率为41.2％，比活为18.2U/mg，利用突变体Pm-F274A/W404G在反应20min条件下，阿莫西林产率为74.3％，比活为38.2U/mg。
实施例7利用副球菌酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G酶法制备头孢氨苄
反应体系：利用异丙醇分别溶解7-ADCA以及D-苯甘氨酸甲酯，将两种底物溶液1:1混合，使底物终浓度均为0.5mM。将底物溶液中加入酶液(水溶)，使酶的终浓度为500ug/mL，反应体系中水的体积控制在2％以下。
反应条件：当在底物溶液中加入酶后，启动反应，28℃水浴反应，反应过程防止异丙醇的挥发，20min后，取10μL反应液稀释至90μL水中，充分混合，高效液相色谱仪检测产物峰滞留时间与出峰面积，记录数据并计算酶的比活力。
酶的比活力计算同实施例2。
经高效液相色谱检测，产物的保留时间与头孢氨苄标准品(CAS:15686-71-2)对应。表明副球菌酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G能够将7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸与D-苯甘氨酸甲酯缩合产生半合成抗生素头孢氨苄。
参见图6，其中利用Pa404W在反应20min条件下，头孢氨苄产率为22.4％，比活为9.6U/mg，利用突变体Pm-F274A/W404G在反应20min条件下，头孢氨苄产率为59.1％，比活为26.4U/mg。
实施例8利用副球菌酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G酶法制备头孢羟氨苄
反应体系：利用异丙醇分别溶解7-ADCA以及D-对羟基苯甘氨酸甲酯，将两种底物溶液1:1混合，使底物终浓度均为0.5mM。将底物溶液中加入酶液(水溶)，使酶的终浓度为500ug/mL，反应体系中水的体积控制在2％以下。
反应条件：当在底物溶液中加入酶后，启动反应，28℃水浴反应，反应过程防止异丙醇的挥发，20min后，取10μL反应液稀释至90μL水中，充分混合，高效液相色谱仪检测产物峰滞留时间与出峰面积，记录数据并计算酶的比活力。
酶的比活力计算同实施例2。
经高效液相色谱检测，产物的保留时间与头孢羟氨苄标准品(CAS:66592-87-8)对应。表明副球菌酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G能够将7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸与D-对羟基苯甘氨酸甲酯缩合产生半合成抗生素头孢羟氨苄。
参见图7，其中利用Pa404W在反应20min条件下，头孢羟氨苄产率为26.8％，比活为11.0U/mg，利用突变体Pm-F274A/W404G在反应20min条件下，头孢羟氨苄产率为40.5％，比活为20.2U/mg。
本发明利用基因工程技术对酰化酶Pa404W进行克隆及诱导表达制，将所得到的纯酶液用于6-APA,7-ACA以及7-ADCA等重要的药物中间体的制备，以及用于半合成抗生素氨苄西林、阿莫西林、头孢氨苄以及头孢羟氨苄的酶法合成制备。本发明为酶法高效制备抗生素工业重要中间体以及相关半合成β-内酰胺类抗生素提供了一定的技术支持，实验中所用到的制备酰化酶Pa404W及其突变体Pm-F274A/W404G的方法为其在工业中的应用提供了可能性。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (9)
1.一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用，其特征在于，所述应用为利用酰胺酶或其突变体催化酰胺化反应，所述副球菌为副球菌Paracoccussp.KDSPL-02。
2.根据权利要求1所述的一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用，其特征在于，所述酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1或2所述的一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用，其特征在于，所述应用为利用酰胺酶或其突变体催化青霉素G侧链水解，合成6-APA。
4.根据权利要求1或2所述的一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用，其特征在于，所述应用为利用酰胺酶或其突变体催化头孢霉素C侧链水解，合成7-ACA。
5.根据权利要求1或2所述的一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用，其特征在于，所述应用为在化学合成7-ADCA或7-ACCA母核过程中利用酰胺酶或其突变体催化侧链酰胺的水解。
6.根据权利要求1或2所述的一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用，其特征在于，所述应用为利用酰胺酶或其突变体催化6-APA的氨基与不同半合成抗生素侧链缩合，合成相关半合成青霉素类β-内酰胺抗生素。
7.根据权利要求1或2所述的一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用，其特征在于，所述应用为利用酰胺酶或其突变体催化7-ACA、7-ADCA或7-ACCA的氨基与不同半合成抗生素侧链缩合，合成相关半合成头孢菌素类β-内酰胺抗生素。
8.根据权利要求1或2所述的一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用，其特征在于，所述应用为利用酰胺酶或其突变体催化6-APA的氨基与D-苯甘氨酸甲酯缩合，合成氨苄西林；或催化6-APA的氨基与D-对羟基苯甘氨酸甲酯缩合，合成阿莫西林。
9.根据权利要求1或2所述的一种副球菌来源的酰胺酶及其突变体的应用，其特征在于，所述应用为利用酰胺酶或其突变体催化7-ADCA的氨基与D-苯甘氨酸甲酯缩合，合成头孢氨苄；或催化7-ADCA的氨基与D-对羟基苯甘氨酸甲酯缩合，合成头孢羟氨苄。
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