ES2598005T3 - Uso de IL-15 para aumentar la salida del timo y para tratar la linfopenia - Google Patents

Uso de IL-15 para aumentar la salida del timo y para tratar la linfopenia Download PDF

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Barbara K. Felber
Antonio Valentin
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Abstract

Un heterodímero que comprende (i) una IL-15 y (ii) una proteína de fusión de IL-15Rα-Fc que comprende un IL- 15Rα soluble que carece de la porción de anclaje transmembrana fusionada a una región Fc para su uso en una método de prevención o reducción de la linfopenia inducida por fármacos, que comprende administrar sistémicamente el heterodímero a un paciente humano tratado con un agente anticanceroso o que serán tratados con el agente anticanceroso a una dosis que mantiene los niveles suprafisiológicos en plasma de IL-15 durante un período prolongado de tiempo de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más días.

Description

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imagen7
Las sustituciones de codones degenerados para los aminoácidos de origen natural se encuentran en la tabla 1.
TABLA 1
1ª posición (extremo 5’)
2ª posición 3ª posición (extremo 3’)
U(T)
C A G
U(T)
Phe Phe Leu Leu Ser Ser Ser Ser Tyr TyrTERMINACIÓN TERMINACIÓN Cys CysTERMINACIÓN Trp U(T) C A G
C
Leu Leu Leu Leu Pro Pro Pro Pro His His Gln Gln Arg Arg Arg Arg U(T) C A G
A
Ile Ile Ile Met Thr Thr Thr Thr Asn Asn Lys Lys Ser Ser Arg Arg U(T) C A G
G
Val Val Val Val Ala Ala Ala Ala Asp Asp Glu Glu Gly Gly Gly Gly U(T) C A G
5 Los términos “idéntico” o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son los mismos (es decir, una identidad de aproximadamente 70 %, preferentemente una identidad del 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o mayor sobre una región especificada (por ejemplo, de una secuencia de IL-15 o IL
10 15Rα), cuando se comparan y se alinean para una correspondencia máxima sobre una ventana de comparación o región designada) medido usando algoritmos de comparación de secuencia BLAST o BLAST 2.0 con los parámetros por defecto descritos más adelante o mediante alineamiento manual e inspección visual (véase, por ejemplo, el sitio web de NCBI o similares). Por tanto, se dice que dichas secuencias son "sustancialmente idénticas”. Esta definición también se refiere a la complementaria de una secuencia de ensayo o se puede aplicar a la misma. La definición
15 también incluye secuencias que tienen deleciones y/o adiciones, así como aquellas que tienen sustituciones. Como se describe a continuación, los algoritmos preferidos pueden representar los huecos y similares. Preferentemente, existe identidad en una región que tiene una longitud de al menos aproximadamente 25, 50, 75, 100, 150, 200 aminoácidos o nucleótidos y, a menudo, en una región que tiene una longitud de 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500 aminoácidos o nucleótidos o más sobre la longitud completa de las secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico.
20 Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de ensayo (aquí, toda una secuencia completa de aminoácidos o ácido nucleico de IL-15 "nativa de mamífero"). Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias problema y de referencia se introducen en un ordenado, se designan las coordenadas de la subsecuencia, en caso necesario, y se
25 designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Preferentemente, se pueden usar los parámetros por defecto del programa o parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias problema con respecto a la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa.
30 Un ejemplo preferente de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST, que se describen en Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:33893402 (1977) y Altschul y col., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. El software BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información sobre Biotecnología en la red mundial en ncbi.nlm.nih.gov/. Se pueden usar ambos parámetros por defecto u otros parámetros no predeterminados. El
35 programa BLASTN (para las secuencias de nucleótidos) usad como defecto una longitud de texto (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=4 y una comparación de ambas hebras. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como parámetros por defecto una longitud de texto de 3, y una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras.
40 El término "contenido de GC" se refiere al porcentaje de una secuencia de ácido nucleico compuesta por los residuos desoxirribonucleósidos, desoxiguanosina (G) y/o desoxicitidina (C) o los ribonucleótidos guanosina (G) y/citidina (C).
45 El término "unido operativamente" se refiere a un enlace funcional entre una primera secuencia de ácido nucleico y una segunda secuencia de ácido nucleico, de manera que la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico se transcriben en una sola secuencia de ácido nucleico. Las secuencias de ácido nucleico unidas operativamente no
9
imagen8
sobre el peso del bazo (panel superior), el peso del timo (panel central) y el porcentaje de linfocitos en la médula ósea (panel inferior).
La Figura 3 ilustra los efectos de la coadministración sistémica de polinucleótidos que expresan IL-15 e IL-15Rα
5 sobre la maduración de las células T en el timo. Las células T CD4+CD8+ dobles positivas disminuyen con un aumento concomitante de las células T positivas simples con altos niveles de CD3 (es decir, células T CD4+ o CD8+).
La Figura 4 ilustra la migración de timocitos cargados con éster de succinimidilo carboxifluoresceína ("CFSE") en
10 división al pulmón en ratones tratados con IL-15 y control sin tratar (paneles superiores). Los paneles inferiores muestran un aumento de expresión de CD122 (IL-2Rβ/IL-15Rβ) en los linfocitos, por ejemplo, células T totales y células CD+ en el pulmón.
La Figura 5 ilustra la reconstitución de linfocitos en el tejido pulmonar de ratones defectivos (KO) para IL-15 15 tratados con ADN plasmídico que codifica IL-15/IL-15Rα en comparación con los ratones KO control sin tratar.
La Figura 6 proporciona un esquema de la evolución temporal de un experimento de depleción linfocitaria.
La Figura 7 ilustra el peso del bazo con el tiempo después de la administración de ciclofosfamida (Cyp) y Cyp + 20 IL-15/IL-15Rα.
La Figura 8 ilustra el aumento en las células NK de pulmón después de la administración de Cyp.
Figura 9 ilustra el aumento en las células T de pulmón T en presencia de IL-15/IL-15Rα.
25 La Figura 10 ilustra que las células T CD8+ se recuperan parcialmente después de la administración de IL-15/IL15Rα.
La Figura 11 ilustra el aumento de las células T CD8+ de pulmón en presencia de IL-15/IL-15Rα como se refleja 30 en el cambio de la relación de células T CD8+ y CD4+ después de la administración de IL-15.
La Figura 12 ilustra un análisis de células T en el bazo después de administración de Cyp y IL-15/IL-15Rα.
La Figura 13 ilustra la recuperación completa de las células T de la médula ósea después de la administración de 35 IL-15/IL-15Rα.
La Figura 14 ilustra el protocolo de tratamiento con IL-15/IL-15Rα para ratones linfopénicos usados en el Ejemplo
3.
40 La figura 15 ilustra que una sola administración de ADN que codifica IL-15/IL-15sRαes suficiente para la recuperación completa de las células NK en bazo y pulmón 5 días después de la inyección de ADN.
La Figura 16 ilustra que la administración de IL-15/IL-15sRα estimula la recuperación de las células T CD8 dentro de los 10 días después del tratamiento, sin afectar significativamente a la recuperación de las células T CD4.
45 La Figura 17 ilustra que los niveles altos de IL-15/IL-15sRα circulantes estimulan aumento transitorio de la relación T efectoras/T reguladoras después de la linfoablación.
La Figura 18 ilustra los niveles de IL-15 en suero después de la liberación hidrodinámica de vectores de ADN que 50 expresan diferentes formas de IL-15.
La Figura 19 ilustra la expresión de CD25 en la superficie de las células T de bazo después de la liberación de ADN de IL-15/IL-15Rα.
55 La Figura 20 ilustra la expresión de CD62L en la superficie de las células T de bazo después de la liberación de ADN de IL-15/IL-15Rα.
La Figura 21 ilustra la expresión de CD44 en la superficie de las células T de bazo después de la liberación de ADN de IL-15/IL-15Rα. 60 La Figura 22 ilustra un protocolo (Ejemplo 5) para la administración de IL-15/IL-15sRα purificados in vivo.
La Figura 23 ilustra que IL-15/IL-15Rα purificada es bioactiva in vivo.
11
Descripción detallada
1. Introducción
5 La invención actualmente reivindicada se basa, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que sometiendo el tejido tímico a niveles suprafisiológicos de IL-15 estimula la maduración de las células T en el timo de células T dobles positivas CD4+CD8+ en células T simples positivas (es decir, CD4+ o CD8+) con niveles altos de CD3, disminuye la frecuencia de timocitos apoptóticos y aumenta la migración de las células T maduras desde el timo a los tejidos periféricos, incluyendo los tejidos periféricos linfoides y no linfoides.
La invención actualmente reivindicada se basa además, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que la administración sistémica de niveles suprafisiológicos de IL-15 estimula la maduración y la exportación de los linfocitos de los tejidos linfoides centrales (por ejemplo, en el timo y la médula ósea) a los tejidos periféricos, incluyendo los tejidos periféricos linfoides y no linfoides.
15
2. Métodos de estimulación de la maduración de los linfocitos en un órgano linfoide central y la migración de los linfocitos a los tejidos periféricos
La invención actualmente reivindicada proporciona la estimulación de la maduración de las células T en el timo, la disminución de la apoptosis de las células T en el timo y la estimulación de la migración o la salida de las células T maduras desde el timo, poniendo en contacto el tejido del timo con niveles suprafisiológicos de IL-15. En algunos casos de la divulgación, el tejido tímico puede ser in vivo o in vitro.
Cuando la IL-15 se administra in vivo, se proporciona a un sujeto o paciente o individuo en necesidad de la misma.
25 El sujeto puede ser cualquier mamífero, tal como un primate no humano. En la invención reivindicada, el sujeto es un ser humano. Los sujetos que se beneficiarán de la presente divulgación tienen una deficiencia de timocitos maduros y/o en otros linfocitos en los tejidos periféricos, incluyendo tejidos periféricos linfoides y no linfoides. En algunos casos, el sujeto en la divulgación es inmunodeficiente o tiene linfopenia. En la invención reivindicada, el sujeto tiene una inmunodeficiencia inducida por el fármaco debido a medicamentos contra el cáncer. En el presente documento también se divulgan sujetos que tienen una inmunodeficiencia secundaria a una enfermedad, por ejemplo, infección por VIH. Los sujetos pueden tener una mutación genética que de lugar a una IL-15 no funcional o a una subunidad del receptor de IL-15 no funcional (por ejemplo, IL-15Rα, IL-15Rβ, o IL-15Rγ).
La exposición sostenida del tejido del timo a niveles suprafisiológicos de IL-15 estimula la maduración de células T
35 doble positivas. La IL-15 estimula la diferenciación terminal de los timocitos en células T simples positivas que expresan bien CD4 o CD8. Las células T maduras pueden también expresar CD122 (también conocido como la subunidad beta del receptor de IL-2/IL-15). Las células T maduras pueden también expresar niveles altos de la proteína de superficie CD3. La maduración inducida por IL-15 de las células T también corresponde a una reducción en la frecuencia de células T inmaduras que sufren apoptosis. Poniendo en contacto el tejido del timo con niveles suprafisiológicos de IL-15, las células T doble positivas CD4+CD8+ y las células T con niveles bajos de CD3 se pueden eliminar sustancialmente a medida que las células maduran en células T simples positivas con niveles altos de CD3. Después de la exposición a niveles suprafisiológicos de IL-15, al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más de las células T son células T simples positivas CD4+ o CD8+ con niveles altos de CD3.
45 La maduración inducida por IL-15 de las células T en el tejido del timo también estimula la migración de las células T maduras a los tejidos periféricos, incluyendo los tejidos periféricos linfoides y no linfoides. Las células T maduras que salen del timo pueden o no pueden estar activadas. Por ejemplo, después de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más días de exposición a niveles suprafisiológicos de IL-15, el órgano del timo puede haber disminuido de tamaño, por ejemplo, en al menos aproximadamente 30 %, 40 %, 50 %, o más, debido a la salida del timo inducida por IL-15.
La administración sistémica de niveles suprafisiológicos de IL-15, por ejemplo, sostenida a lo largo de, por ejemplo, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más días, también estimula la maduración y la migración de linfocitos, incluyendo las células NK, de la médula ósea. Por ejemplo, después de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o
55 más días de exposición a niveles suprafisiológicos de IL-15, el porcentaje de linfocitos en la médula ósea puede haber disminuido, por ejemplo, en al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, o más, debido a la salida de los linfocitos de la médula ósea inducida por IL-15.
Al mismo tiempo que el número de linfocitos disminuye en los tejidos linfoides centrales, es decir, en el timo y la médula ósea, el número de linfocitos en los tejidos linfoides periféricos, por ejemplo, el bazo, los ganglios linfáticos, los tejidos linfoides asociados a las mucosas (MALT), por ejemplo, las amígdalas, y/o los tejidos linfoides asociados al intestino (GALT), incluyendo las placas de Peyer, aumenta. Adicionalmente, el número de linfocitos en los tejidos no linfoides periféricos, incluyendo el pulmón, el hígado, el riñón, la piel, y otros tejidos, también se incrementa. En algunas realizaciones, la administración de niveles suprafisiológicos de IL-15 aumenta el número de linfocitos,
65 incluyendo células T, células B y células NK, en la sangre.
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3. Tratamiento de la linfopenia
Como se ha explicado anteriormente, en un aspecto, la divulgación se basa en el descubrimiento de que la administración sistémica de niveles suprafisiológicos de IL-15 estimula la maduración y la exportación de los 5 linfocitos de los tejidos linfoides centrales (por ejemplo, en el timo y la médula ósea) a los tejidos periféricos, incluyendo los tejidos periféricos linfoides y no linfoides.
Por consiguiente, la divulgación proporciona la prevención, reducción e inhibición de la depleción de linfocitos, incluyendo células T, células B y células asesinas naturales (NK), en la circulación periférica o en los tejidos mediante la administración sistémica de IL-15 a un sujeto en necesidad del mismo. La presente divulgación también proporciona la aceleración de la recuperación y acortamiento del periodo de tiempo de depleción de linfocitos, incluyendo células T, células B y células asesinas naturales (NK), en la circulación periférica o en los tejidos mediante la administración sistémica de IL-15 a un sujeto en necesidad del mismo.
15 Como se divulga en el presente documento, los sujetos, pacientes o individuos pueden ser cualquier mamífero, tal como un primate no humano. En la invención reivindicada, el mamífero ser humano. En el presente documento también se divulgan casos los que el individuo es un mamífero doméstico (por ejemplo, un canino o felino), un mamífero de laboratorio (por ejemplo, un ratón, una rata, un conejo, un hámster), o un mamífero agrícola (por ejemplo, un bovino, un porcino, un ovino, un equino). Los sujetos que se beneficiarán de los presentes procedimientos o bien ya tienen o tendrán (como resultado de un ciclo de tratamiento de fármacos) una deficiencia de linfocitos maduros en la circulación periférico o en los tejidos, incluyendo los tejidos periféricos linfoides y no linfoides. En algunos casos, el sujeto es inmunodeficiente o tiene linfopenia. Para los fines de tratamiento, el paciente ya está sufriendo niveles anormalmente bajos de linfocitos circulantes. Para los fines de prevención, el paciente puede tener niveles normales de linfocitos periféricos y es probable que experimente depleción de linfocitos
25 como resultado de un tratamiento quimioterapéutico.
Los patrones para el diagnóstico de la linfopenia se conocen en la materia y se lo puede realizar cualquier médico capacitado. En algunas realizaciones, el paciente tiene un recuento de linfocitos totales en sangre circulante que es inferior a aproximadamente 600/mm3. El paciente puede tener un recuento de linfocitos totales circulantes en sangre es menor que aproximadamente 2.000/µl de los linfocitos totales circulantes en el momento del nacimiento, menor que aproximadamente 4.500/µl de linfocitos totales circulantes aproximadamente a los 9 meses de edad o menor que aproximadamente 1.000/µl de linfocitos totales circulantes en pacientes mayores de aproximadamente 9 meses (niños y adultos). Véase, por ejemplo, The Merck Manual, 18ª Edición, 2006, Merck & Co.
35 El origen o la etiología de la depleción o los niveles anormalmente bajos de linfocitos pueden ser por cualquier razón. La linfocitopenia tiene una amplia gama de posibles causas, incluyendo infecciones víricas (por ejemplo, infección por el VIH), bacterianas (por ejemplo, infección por tuberculosis activa) y fúngicas; insuficiencia crónica del ventrículo derecho del corazón, enfermedad de Hodgkin y cánceres del sistema linfático, leucemia, una fuga o rotura en el conducto torácico, efectos secundarios de medicamentos de prescripción médica, incluyendo agentes anticancerosos, agentes antivirales y glucocorticoides, malnutrición resultante de las dietas que tienen niveles bajos de proteínas, radioterapia, uremia, trastornos autoinmunes, síndromes de deficiencia inmunitaria, niveles de estrés altos y traumatismo. La linfopenia también puede ser de etiología desconocida (es decir, linfopenia idiopática).
La depleción de linfocitos puede implicar linfocitos totales (por ejemplo, células T, células B y células NK, etc.), o
45 puede implicar solamente una subpoblación de linfocitos totales (una o más de células T, células T CD4+, células T CD8+, células B, células NK).
Los pacientes que tienen una enfermedad que causa depleción de los linfocitos circulantes periféricos se describen en el presente documento. Por ejemplo, el paciente puede sufrir un cáncer, incluyendo enfermedad de Hodgkin y cánceres del sistema linfático, leucemia; una infección vírica, incluyendo el VIH o el virus de la hepatitis. En la invención reivindicada, el paciente está recibiendo un agente contra el cáncer, tal como quimioterapia, que causa depleción de linfocitos circulantes periféricos. Entre los ejemplos de agentes farmacológicos que pueden causar depleción de linfocitos se incluyen, sin limitaciones, vinblastina, fludarabina, aclarubicina, doxorubicina, exemestano, alefacept, alemtuzumab, cloranfenicol, pamidronato, idarubicina y ciclofosfamida. Los pacientes también podrían
55 también recibir agentes antivíricos, agentes retrovirales o glucocorticoides.
En el presente documento se divulgan sujetos que tienen una mutación genética que de lugar a una IL-15 no funcional o a una subunidad del receptor de IL-15 no funcional (por ejemplo, IL-15Rα, IL-15Rβ, o IL-15Rγ).
4. IL-15
La IL-15 para su uso en la invención reivindicada puede ser cualquier IL-15 fisiológicamente activa (es decir, funcionales). La IL-15 se puede liberar como un polipéptido o un polinucleótido que codifica IL-15. La IL-15 puede ser de longitud completa o un fragmento fisiológicamente activo de la misma, por ejemplo, un fragmento de IL-15 65 que retiene la unión a IL-15Ra y/o IL-15Rβ, o un fragmento de IL-15 que estimula la proliferación y/o maduración de células T. En algunas realizaciones, el polipéptido de IL-15 liberado o expresado tiene uno o más aminoácidos que
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están sustituidos, añadidos o eliminados, al tiempo que conserva la actividad fisiológica de IL-15. En algunas realizaciones, la IL-15 liberada o expresada comparte una identidad de la secuencia de aminoácidos de al menos 90 %, 93 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % con una IL-15 de tipo silvestre, por ejemplo, SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica la IL-15 comparte una identidad de la secuencia de aminoácidos de, al
5 menos, 90 %, 93 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % con una secuencia de codificación de IL-15 de tipo silvestre, SEQ ID NO: 1.
El polinucleótido que codifica IL-15 puede tener uno o más codones alterados para mejorar la expresión. En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica IL-15 comparte una identidad de la secuencia de ácido nucleico de al menos 90 %, 93 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % con una de secuencia de codificación de IL-15 de tipo silvestre, por ejemplo, la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica IL-15 comparte una identidad de secuencia de ácido nucleico al menos la SEQ ID NO: 4. Los polinucleótidos que codifican IL-15 que tienen codones alterados para mejorar la expresión, por ejemplo en el documento WO 2007/084342 y en el documento WO 2004/059556..
15 El polinucleótido que codifica la IL-15 puede unirse operativamente a un olinucleótido que codifica una secuencia de péptido señal nativo, por ejemplo, la secuencia del péptido señal largo de la IL15(LSP) o la secuencia del péptido señal de IL-15 corto (SSP). En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de IL-15 nativa se sustituye con una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de una proteína heteróloga. La proteína heteróloga puede ser, por ejemplo, de activador del plasminógeno tisular (tPA), hormona del crecimiento, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) o una inmunoglobulina (por ejemplo, IgE). Un ejemplo de una fusión de GMCSF-IL-15 humana se proporciona en SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica la IL-15 está unido operativamente a un ácido nucleico que codifica un elemento de exportación de ARN, por ejemplo un CTE o RTEm26CTE.
25 En algunos casos de la divulgación, la IL-15 se administra como un heterodímero con IL-15Rα. Uno o ambos de IL15 y IL-15Ra se pueden administrar como un polipéptido. Uno o ambos de IL-15 y IL-15Rα se pueden administrar como un polipéptido. En una realización, la IL-15 y IL-15Ra se pueden administrar de forma conjunta como polipéptidos. En una realización, un polipéptido de IL-15 se administra de forma conjunta con un polinucleótido que codifica IL-15Rα. En una realización, un polipéptido de IL-15Rα se administra de forma conjunta con un polinucleótido que codifica IL-15.
En algunos caso de la divulgación, el IL-15Rα administrado puede ser cualquier IL-15Rα fisiológicamente activo (es decir, funcional. El IL-15Rα se puede liberar como un polipéptido o un polinucleótido que codifica IL-15Rα. El IL
35 15Rα puede ser de longitud completa o un fragmento fisiológicamente activo del mismo, por ejemplo, un fragmento de IL-15Rα que conserva la unión específica a IL-15. Además, el IL-15Rα, por ejemplo, un fragmento que conserva la unión específica a IL-15 y carece de la región de anclaje transmembrana, puede fusionarse con una región Fc. En algunas realizaciones, el polipéptido de IL-15Rα liberado o expresado tiene uno o más aminoácidos que están sustituidos, añadidos o eliminados, al tiempo que conserva la actividad fisiológica de IL-15Rα. En algunas realizaciones, la IL-15 liberada o expresada comparte una identidad de la secuencia de aminoácidos de al menos 90 %, 93 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % con un IL-15Rα, de tipo silvestre, por ejemplo, las SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica IL-15 comparte una identidad de la secuencia de ácido nucleico de al menos 90 %, 93 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % con una secuencia de codificación de IL15 de tipo silvestre, por ejemplo, las SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8.
45 El polinucleótido que codifica IL-15Rα puede tener uno o mαs codones alterados para mejorar la expresión. En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica IL-15Rα comparte una identidad de secuencia de ácido nucleico de al menos 90 %, 93 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % con una secuencia de codificación de IL-15Rα de tipo silvestre, por ejemplo, la SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11. Los polinucleótidos que codifican IL-15Rα que tienen codones alterados para la mejora de la expresión se describen en, por ejemplo, el documento WO 2007/084342.
El polinucleótido que codifica IL-15Rα puede estar unido operativamente al polinucleótido que codifica una secuencia del péptido señal nativo. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de IL-15Rα nativo se sustituye con una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de una
55 proteína heteróloga. La proteína heteróloga puede ser, por ejemplo, de activador del plasminógeno tisular (tPA), hormona del crecimiento, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) o una inmunoglobulina (por ejemplo, IgE). En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el IL-15Ra está unido operativamente a un ácido nucleico que codifica un elemento de exportación de ARN, por ejemplo un CTE o RTEm26CTE.
En la invención reivindicada, el IL-15Ra está en forma de una proteína de fusión de Fc. Los ejemplos de secuencias polipeptídicas de sIL-15Ra se muestran en las SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 20. Típicamente, tales proteínas se secretan y pueden encontrarse solubles en el plasma, o pueden estar asociadas con la superficie de las células que expresan el receptor de Fc para la región Fc de la proteína de fusión. Diferentes fragmentos de IL-15Ra se pueden
65 fusionar a la región Fc. Dos ejemplos de fusiones funcionales se proporcionan como la SEQ ID NO: 17 y la SEQ ID NO: 20, que contienen 205 o 200 aminoácidos dentro de la región de IL-15Rα. En algunas realizaciones, la región de
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linfocitos o subpoblaciones de linfocitos circulantes periféricamente se pueden mantener a niveles de al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de los niveles normales. En algunas realizaciones, los linfocitos o las subpoblaciones de linfocitos se mantienen a niveles normales.
5 En algunos casos de la divulgación, la IL-15 se administra de forma conjunta con un agente quimioterapéutico que causa o puede causar linfopenia o depleción de linfocitos en los tejidos periféricos. El agente quimioterapéutico puede ser un agente anticanceroso o un agente antiviral. En algunos casos, la IL-15 se administra después de un ciclo de tratamiento con un agente quimioterapéutico que causa o puede causar linfopenia o depleción de linfocitos en los tejidos periféricos. En algunos casos, la IL-15 también podría administrarse antes, durante o después de un ciclo de radioterapia.
Ejemplos
Los ejemplos siguientes se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar, la invención reivindicada.
15 Ejemplo 1: La administración sistémica de IL-15 estimula la maduración de las células T en el timo y la migración de las células T a los tejidos periféricos
El ADN de IL-15/IL-15Rα se expresó por vía sistémica y localmente a varios niveles, tanto en ratones normales como en defectivos (KO) para IL-15 para entender mejor la biología de IL-15. Véase, Bergamaschi, et al., (2008) J Biol Chem 283:4189–4199. Los niveles suprafisiológicos de IL-15/IL-15Rα en los ratones normales tienen efectos rápidos y profundos en muchos tejidos. Hay un aumento rápido y reversible del tamaño del bazo, mientras que el timo se hace más pequeño y el número de linfocitos de la médula ósea disminuyen (Figura 2). Previamente, los inventores han demostrado que el incremento del tamaño del bazo y de los ganglios linfáticos es proporcional a la 25 cantidad de IL-15 en el plasma. Véase, Bergamaschi, et al., (2008) JBiol Chem 283:4189–4199. La cinética y la composición de los linfocitos en muchos tejidos se estudiaron usando 10 parámetros de citometría de flujo, así como la transferencia adoptiva de células y el marcaje in vivo. Los resultados de los investigadores ponen de relieve los fuertes efectos de la IL-15 en todas las etapas de desarrollo de los linfocitos, como también han sugerido muchos investigadores. Revisado en, por ejemplo, Boyman, et al., (2007) Curr Opin Immunol 19:320–326: Sprent, et al., (2008) Immunol Cell Biol 86:312–319; Sprent y Surh, (2003) Immunol Lett 85:145–149; Surh, et al., (2006) Immunol Rev 211:154–163; Surh y Sprent, (2005) Semin Immunol 17:183–191; y Surh y Sprent, (2008) Immunity 29:848–862. Sin embargo, antes de la presente invención, no se han aclarado los efectos de la IL-15 en el timo. Los resultados de los inventores indican que la IL-15 estimula la maduración de los timocitos dobles positivos CD4+ CD8+ en células T simples positivas con niveles altos de CD3 (Figura 3) y acelera su rápida migración a la periferia (Figura 4).
35 Siete días después del marcaje in situ de los timocitos, IL-15/IL-15Rα estimuló su migración al pulmón. En presencia de IL-15/IL-15Rα, los linfocitos en el pulmón tienen mayores niveles de IL-2/IL-15Rα (CD122, véase, la Figura 4, parte inferior) que indican que están activados. Estos resultados son consistentes con la idea de que la IL-15 estimula no solo la salida acelerada del timo, sino también la migración a los tejidos periféricos y la activación de estos linfocitos.
Los resultados de los investigadores también muestran que, además de las células NK y T de memoria CD8+ que están profundamente afectadas, como era de esperar, todos los linfocitos, incluyendo las células CD4 y CD8 de memoria e intactas, y los linfocitos B también se ven afectadas para dividirse, migrar o estar activados. Esto es consistente con la expresión generalizada (pero no universal) del receptor betagamma de IL-2/IL-15. La jerarquía de
45 la capacidad de respuesta de las subpoblaciones de linfocitos a la IL-15 refleja los niveles de CD122 (IL-2Rbeta) en su superficie. Véase, Bergamaschi, et al., (2008) J Biol Chem 283:4189–4199.
Las observaciones de los inventores están apoyadas además por experimentos realizados en un modelo de KO en IL-15, para corregir los defectos de los linfocitos mediante la administración de ADN de plásmido que codifica el heterodímero IL-15/IL-15Rα. Los ratones KO en IL-15 se caracterizan por una disminución en el recuento total de células T que afecta, preferentemente, a las células T CD8+, que están casi completamente ausentes en los tejidos periféricos. Los inventores han demostrado que IL-15/IL-15Rα puede repoblar órganos no linfoides, tales como los pulmones, con linfocitos T CD4 y CD8 maduros. El aumento en las células T CD4 tras el tratamiento con IL-15/IL15Rα se multiplica por 10, mientras que el aumento de la población CD8+ es significativamente mayor,
55 multiplicándose por 100 (Figura 5). Estos resultados subrayan la viabilidad de la utilización de ADN de IL-15/IL-15Rα para corregir los defectos asociados con linfopenia (por ejemplo, causadas por la ausencia total de IL-15 o de otra etiología). El análisis de los linfocitos que migran en diferentes órganos, en presencia de IL-15 sugiere que muchos adquieren rápidamente un fenotipo de memoria en ausencia de reconocimiento del antígeno y que la IL-15 estimula la reentrada de algunos linfocitos en el timo. La cuestión de la reentrada de los linfocitos en el timo es objeto de controversia y el estudio de los efectos de la IL-15 pueden contribuir a la comprensión de este fenómeno. Véase, Sprent y Surh (2009) Immunol Cell Biol 87:46–49; Bosco, et al., (2009) Immunol Cell Biol 87:50–57; Agus, et al., (1991) J Exp Med 173:1039–1046. Los datos preliminares de los investigadores indican que la transferencia de los timocitos cargados con CFSE en ratones tiene como resultado la llegada al timo solo en los animales que recibieron IL-15.
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Los inventores han descubierto que la IL-15 disminuye la frecuencia de los timocitos apoptóticos, principalmente mediante la estimulación de su diferenciación terminal en las células T simples positivas maduras. Los resultados de los inventores después de la inyección intratímica de CFSE indican que la IL-15 aumenta la salida del timo, como se refleja en la mayor frecuencia de células T marcadas con CFSE completamente maduras.
5 Los inventores han observado además que el mayor tamaño del bazo tras el tratamiento de IL-15 se debe, en parte, al aumento de la frecuencia de los linfocitos B, ya sea mediante proliferación local, migración de células B de otros compartimentos, o ambos. Además, durante los experimentos in vivo con esplenocitos marcadas con CFSE transferidos adoptivos se observó proliferación inducida por IL-15 tanto de células T CD4 intactas como de memoria. En contraste con las células T CD8+, que proliferan casi universalmente en presencia de IL-15, las respuestas de las células T CD4+ parecen estar restringidas a una subpoblación de células.
Ejemplo 2: Corrección de la linfopenia inducida por ciclofosfamida mediante la administración de ADN de IL-15/IL15Rα
15 Sumario
El presente ejemplo muestra la inversión de la linfopenia inducida por ciclofosfamida en ratones jóvenes normales mediante la administración sistémica de IL-15. Una o dos dosis elevadas de IL-15 se administraron dos (2) días (o dos (2) y doce (12) días) después de la ciclofosfamida mediante inyección de ADN hidrodinámico. Los resultados muestran que los ratones se recuperan más rápidamente de la linfopenia después de la administración de IL-15 en comparación con los ratones control con linfopenia inducida por ciclofosfamida que no recibieron IL-15. Los linfocitos se recuperaron más rápidamente en los tejidos periféricos después de la administración de IL-15. Las células NK fueron las primeras en recuperarse, mientras que las células T se recuperaron en aproximadamente un mes. En el
25 curso de estos estudios, los inventores descubrieron que dos administraciones de IL-15 mejoraron la recuperación de las células T a través de una única administración de IL-15. Además, los niveles bajos y sostenidos de IL-15 proporcionan una repoblación más eficiente de los linfocitos a los tejidos periféricos en comparación con una sola dosis alta. Estos resultados demuestran que la IL-15 es útil en el tratamiento y/o prevención de la linfopenia.
Métodos
Administración de ciclofosfamida
Los ratones Balb/c hembras de seis a ocho semanas de edad se obtuvieron en Charles River Laboratory (Frederick,
35 MD). La ciclofosfamida (Sigma) se disolvió en solución salina apirógena y se inyecta por vía intraperitoneal (i.p.) a una dosis de 200 mg/kg de peso corporal. Se realizaron dos tratamientos con ciclofosfamida los días -4 y -2.
Inyección de ADN
El día 0, se realizó una inyección hidrodinámica de cualquiera de un vector control o plásmido de expresión de IL-15 e IL-15Rα en ratones tratados con ciclofosfamida. El ADN del vector vacío también se administró a los ratones no tratados con ciclofosfamida, como control. Brevemente, se inyectaron de 0,2 µg a 2 µg de ADN en 1,6 ml de solución estéril de NaCl al 0,9 % en ratones a través de la vena de la cola en un plazo de 7 segundos utilizando una aguja de calibre 27,5. Se produjeron plásmidos de ADN libre de endotoxina altamente purificados utilizando el kit Qiagen
45 EndoFree Giga (Qiagen, Hilden).
Análisis de los linfocitos
Se sacrificó a los ratones en diferentes puntos de tiempo (días 2-26) después de la inyección de ADN y se recogieron suero, médula ósea, timo, bazo, hígado y pulmones para su análisis.
Para el aislamiento de linfocitos de médula ósea se recogieron los fémures izquierdos y derechos y se centrifugaron a 13.000 durante 5 minutos, se resuspendieron y se centrifugaron de nuevo (total de 3 veces). Las células recogidas se resuspendieron en RPMI que contenía 10 % de suero bovino fetal y las células viables se contaron usando
55 colorante naranja de acridina (Molecular Probes)/bromuro de etidio (Fisher).
Para el aislamiento de esplenocitos o timocitos, se apretaron suavemente los bazos o los timos a través de un Cell Strainer (Thomas) de 100 µm y se lavaron en medio RPMI (Gibco) para eliminar cualquier resto de los linfocitos del estroma de órganos. Después de la centrifugación, las células se resuspendieron en RPMI que contenía suero bovino fetal al 10 % y se contaron.
Para aislar los linfocitos de los hígados o los pulmones, los tejidos se desmenuzaron y se incubaron con 200 U/ml de colagenasa (Sigma) y 30 U/ml de ADNasa (Roche) durante 1 hora a 37 ºC, a continuación, se recogieron las células individuales, se centrifugaron y se resuspendieron en RPMI completo con 10 % de suero bovino fetal.
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Para la fenotipificación, las células se incubaron con la siguiente mezcla de anticuerpos anti-ratón directamente conjugados (BD Pharmingen): CD3–APC, CD4–PerCP, CD8–PECy7, CD44–APC, CD49b–FITC, CD19–PE, CD62L–PE. Las muestras de células marcadas se analizaron mediante citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo LSR II (BD) y se analizaron utilizando el software FlowJo (Árbol Star, San Carlos, CA).
5 Los linfocitos de los diferentes grupos de ratones se contaron y se compararon. Se realizaron análisis estadísticos usando el programa Prism Software. Las comparaciones de los dos grupos se realizaron mediante la prueba t de Mann-Whitney no paramétrica. Los intervalos de confianza fueron 0,05, y todos los valores de p fueron de dos colas.
Resultados
Se usaron dos inyecciones de ciclofosfamida los días -4 y -2 para generar ratones con depleción de linfocitos. Al día 0 (y también, para algunos ratones el día 10) se inyectó el vector de expresión de ADN de IL-15/15Rα en la vena de la cola, lo que generó niveles sistémicos altos de de IL-15/15Ra bioactiva, tal como se publicó (Bergamaschi, et al..,
15 J Biol Chem. (2008) 283(7):4189–99). Los efectos biológicos después de la inyección de ADN de 15Ra IL-15/se compararon con la inyección de un ADN no productor (vector BV) como control negativo en los animales tratados con ciclofosfamida.
Se extrajeron diferentes tejidos, incluyendo los pulmones, el hígado, el bazo, el timo y la médula ósea de los ratones sacrificados los días 2-26 de de la inyección de ADN y se estudiaron las poblaciones de linfocitos.
El tratamiento con ciclofosfamida tuvo fuertes efectos sobre los linfocitos, tal como se refleja en el aumento del peso del bazo de los animales tratados (Figura 7). Se sacrificó a cuatro animales por punto de tiempo y se controló el peso del bazo. Los dos grupos tratados con ciclofosfamida (CP + vector, tratados con un vector de ADN no
25 productor; CP + IL-15) tenían un bazo más pequeño el día 2 después del tratamiento de ADN (4 días después de la ciclofosfamida). En este punto temprano y también el día 5, los animales tratados con IL-15 mostraron una diferencia estadísticamente significativa en el tamaño del bazo, lo que indica la recuperación acelerada por la IL-15.
Pulmón
Los inventores también analizaron el número de linfocitos y las subpoblaciones en diferentes tejidos para evaluar los efectos de la administración de IL-15/15Rα. Estos experimentos se realizaron después de una o dos administraciones de ADN IL-15/15Rα los días 0 y 10).
35 Los linfocitos del pulmón se evaluaron con el fin de determinar los efectos de IL-15/15Rα en un lugar periférico, donde los linfocitos tienen que funcionar. Se sabe que la IL-15 afecta fuertemente a las células T CD8+ T y las células NK. Los niveles altos de IL-15 (que se logran con dos inyecciones de ADN 2 µg los días 0 y 10), favorece la recuperación de linfocitos en el pulmón después del tratamiento con Cyp.
Efectos sobre las células asesinas naturales (NK):
Los ratones se trataron los días -4 y -2 y se inyectó el ADN el día 0. En dos grupos de ratones se inyectó ADN control negativo BV o ADN de IL-15/IL-15Rα. Los animales tratados con IL-15/IL-15Rα tenían una tendencia a números más altos de NK para todos los puntos de tiempo. Al día 14, la comparación de el grupo que recibió el
45 vector vacío con el grupo de administración de 2x IL-15/IL-15Rα (inyecciones de AD los días 0 y 10) mostraron que IL-15/15Rα aumentó significativamente la recuperación de células NK de pulmón (p=0,03).
La población de linfocitos que se recupera primero es la de las células NK. En los experimentos de los inventores después del tratamiento con ciclofosfamida, las células NK se recuperaron parcialmente en ausencia de cualquier otra intervención. La administración de IL-15/15Rα aceleró esta recuperación. La mejor recuperación se observó después de dos inyecciones de IL-15 los días 0 y 10. El examen al día 14 mostró un aumento significativo de NK por IL-15 en comparación con Cyp (p = 0,03). Véase la figura 8.
Efectos sobre las células T de pulmón
55 En contraste con las células NK, las células T de pulmón no se recuperan tan rápido. Los ratones se trataron y se analizaron como se ha indicado en lo que antecede. Las células T de pulmón T se enumeraron el día 14 después de la primera inyección de ADN. Se encontró que las células T totales aumentaron el día 14 después de dos administraciones IL-15/Rα los días 0 y 10, en comparación con los animales tratados con Cyp. Véase la figura 9.
Las células T de pulmón también se distinguieron según la expresión de CD4 o CD8 y se compararon entre los diferentes grupos de ratones. Se descubrió que las células T CD8+ aumentaron preferentemente después de la administración de IL-15/15Rα el día 14 (p = 0,0357). Además, los días 6 y 14 se incrementó la relación CD8/CD4, lo que demuestra la estimulación preferente de las células T CD8+ por la IL-15. La relación vuelve a la normalidad
65 hacia el día 26, en el grupo que IL-15/15Rα. Véanse las Figuras 10 y 11.
18
imagen10
imagen11
células T de bazo. Por el contrario, IL-15/IL-15RαFc fue menos eficaz en el aumento de CD44 en las células T de bazo en comparación con IL-15/IL-15Rα de longitud completa o IL-15/IL-15sRα (Figura 21).
Ejemplo 5. Liberación de proteínas
5 Como método alternativo para proporcionar IL-15, se puede usar la liberación de la proteína purificada. Se ha realizado purificación de proteínas a partir de líneas celulares que sobreproducen complejos de IL-15/IL-15Rα. Similar al ADN, se pueden usar diferentes formas del heterodímero solo o en combinaciones para la obtención de los efectos apropiados.
10 1 Liberación de IL-15/IL-15Rα soluble (s) purificada, tales como las SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12. 2 Liberación de la proteína de IL-15/IL-15RαFc purificada (fusión con la región constante de una molécula de inmunoglobulina, tal como la SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 20).
15 La IL-15/sIL-15Rα se purificó mediante sobreproducción de células 293 humanas y se liberó en ratones con depleción de linfocitos. Los resultados mostraron que este heterodímero es bioactivo y que estimuló la proliferación de los linfocitos transferidos de forma adoptiva (células T, células NK, pero no células B).
Procedimiento experimental (Figura 22): Se trató a los ratones con ciclofosfamida (Cyp) y dos días más tarde se les
20 administró 3 µg de proteína IL-15/s15Ra purificada mediante HPLC por vía intraperitoneal durante 6 días. Los esplenocitos se purificaron a partir de ratones Bl/6 jóvenes, se marcaron con CFSE y se inyectaron 107 células por vía i.v. a los animales con depleción linfocitaria. A la proliferación de las células transferidas de forma adoptiva le siguió dilución de CFSE.
25 Por lo tanto, estos resultados indican que las diferentes formas del heterodímero IL-15/IL-15Rα tienen una estabilidad, interacciones en el cuerpo, procesamiento y estabilidad diferentes. Esto ofrece la oportunidad de explotar estas propiedades para el uso de estas citocinas para proporcionar el máximo beneficio. De acuerdo con ello, las diferentes formas se pueden combinar en diferentes relaciones y esquemas de administración. Las diferentes formas se pueden administrar ya sea simultáneamente o secuencialmente.
30 Las fusiones IL-15Rα – Fc previamente empleadas se han utilizado con diversos grados de eficacia. Los estudios ilustrados en la Figura 23 muestran que la fusión Fc utilizada tiene una semivida en plasma mayor en comparación con IL-15/s15Rα.
35 En los ejemplos de las secuencias, descritas en el presente documento, la fusión 205FC (SEQ ID NO:17) contiene el sitio de procesamiento natural que genera s15Rα de la forma unida a la membrana, mientras que la fusión 200FC (SEQ ID NO:20) no tiene un sitio de procesamiento intacto. Estos son ejemplos de fusiones de Fc que pueden procesarse de manera diferente para generar formas no asociadas a células después de la escisión entre la región 15Rα y la región constante del anticuerpo. Se pueden generar moléculas adicionales que tienen sitios de
40 procesamiento para la escisión y se generan las formas de la citocina tanto asociadas con las células como solubles. En la materia se conocen métodos adicionales para la unión a las células, con excepción de la región Fc y también se pueden emplear.
Se entiende que los ejemplos y formas de realización descritos en la presente memoria descriptiva son con fines
45 ilustrativos únicamente y que varias modificaciones o cambios a la luz de los mismos se sugerirán a personas expertas en la técnica y se deben incluir dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
EJEMPLOS DE SECUENCIAS
50
SEQ ID Nº 1
Secuencia de ácido nucleico de IL-15 humana de tipo silvestre
imagen12
SEQ ID Nº 2 Secuencia de aminoácidos de IL-15 humana de tipo silvestre
21
imagen13
SEQ ID Nº 3 Secuencia de ácido nucleico de IL-15 humana mejorada (opc. 1)
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SEQ ID Nº 4 Secuencia de ácido nucleico de IL-15 humana mejorada (opc. 2)
imagen15
SEQ ID NO:5 Receptor alfa de interleucina 15 de homo sapiens (IL15RA), variante 1 del transcrito, ARNm, n.º de accesoen GenBank NM_002189
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  1. imagen1
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