CN114304379A - 一种含有复合微生物菌剂的发酵饲料的制备方法 - Google Patents

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张小龙
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Abstract

本发明公开了一种含有复合微生物菌剂的发酵饲料的制备方法。采用枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌和酵母菌复合菌剂利用红薯渣、木薯渣、马铃薯、豆粕、麸皮等粗原料混匀发酵生产制备复合微生物菌剂，制备含有复合微生物菌剂的发酵饲料，红薯渣：木薯渣：麸皮：马铃薯渣：豆渣：豆粕的配比为2:1:1:2:3:1时，发酵饲料中总菌落数达到1010cfu/g以上、粗蛋白含量24.39±0.03%、氨基酸4.34±0.02%、水分23.44±0.03%，固态发酵的时间3~5 d、温度25~45℃、初始pH为6.5时效果最佳。本发明方法与其他制备饲料相比，经济上成本低、生产操作方便、使用便捷、生产周期短等优势，从而提高饲料的营养价值和品质，显著降低生产成本，具有明显的市场应用价值。

Description

一种含有复合微生物菌剂的发酵饲料的制备方法
技术领域
本发明属于饲用复合微生物菌剂的发酵饲料的制备技术领域，具体涉及一种含有复合微生物菌剂的发酵饲料的制备方法。
背景技术
饲用复合微生物菌剂作为新型饲料添加剂，含有大量的益生菌，能够维持肠道微生物平衡，替代抗菌素，增强免疫力促进动物的健康和生长，提高饲养效率，降低饲养成本，可降低动物产品抗生素残留，抑制耐药性病原菌，提高饲料转化率，增强动物的免疫***，还能减少其疾病的发生。近年来，通过饲用复合微生物菌剂的推广，能够提高饲料转化率，改善肉质，既给养殖业带来可观的经济效益，同时还推动了畜牧业的发展。
枯草芽孢杆菌属于芽孢杆菌属之一，是一种嗜温、好氧、产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，对人畜无毒无害，可以分泌淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等活性成分和产生抗菌物质等，具有广谱抗菌活性，可在动物肠道内产生生物夺氧作用，为乳酸菌生长提供厌氧环境，并对动物的营养物质利用、生长、防病起到重要作用，同时，这类菌株已被我国农业农村部列入饲料添加剂目录名单，重点应用于微生态制剂方面；嗜酸乳杆菌可以在动物肠道内大量定植，帮助食物消化和代谢，促进营养物质的吸收和利用；同时它还能与致病菌竞争，抑制有害菌的繁殖，改善肠道内环境，调整胃肠道菌群平衡，提高动物健康水平；屎肠球菌具有耐热性强、耐药性强、粘附力强、耐胃酸等特点，由于其在生产加工上的独特优势，一直作为良好的饲用益生菌被广泛研究与应用。已有大量研究证实，饲喂屎肠球菌可以提高动物的日增重、增强机体免疫力、降低腹泻率与死亡率、维持肠道微生物区系平衡。目前，屎肠球菌微生态制剂作为抗生素的替代品已被广泛应用于畜牧业生产中，有着良好的饲用前景；酵母菌发酵培养物有明显增强干扰素效价，从而增强机体免疫功能，补充微量元素，分泌大量蛋白等优势，在动物养殖中能够提高日增重、改善料重比、增强机体抗病力，提高经济效益的效果。因此，近几年有关含有复合微生物菌剂的发酵饲料及其应用研究越来越多越来越深入，能够分解蛋白、淀粉、纤维素等组分，分解成小分子蛋白、小肽、游离氨基酸等易消化的成分，更利于畜禽肠道吸收。长期使用富含益生菌的饲料，能够改善畜禽的肠道环境，增强动物免疫力，促进动物生长的明显效果，有效地保障家畜产品的食用安全性。
目前的报道中尚未出现将多种粗原料混合一起用益生菌进行发酵生产复合微生物菌剂的饲料的先例。将粗原料利用与微生物技术相结合，能提高处理效率，改善处理效果，降低成本，进一步实现资源化利用的需求，具有广阔的市场前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有复合微生物菌剂的发酵饲料的制备方法，菌种为枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌和酵母菌复合菌，采用复合菌对多种粗原料进行发酵，将发酵产物作为饲料。
为实现本发明的目的，采用的技术方案如下：
一种含有复合微生物菌剂的发酵饲料的制备方法，将四种不同类型的菌株配成复合菌剂，利用红薯渣、木薯渣、马铃薯渣、豆渣、豆粕、麸皮等粗原料发酵生产制备复合微生物菌剂，通过优化发酵培养方式生产制备含有复合微生物菌剂的发酵饲料，所述固体发酵培养基中主要采用粗料进行发酵，成分主要包含红薯渣、木薯渣、麸皮、马铃薯渣、豆渣和豆粕。
包括如下步骤：
S1、将枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌和酵母菌分别进行液态发酵培养，然后按比例复合为复合微生物菌剂；
S2、将S1的复合微生物菌剂接种到固体培养基中进行混菌发酵；发酵温度25℃～45℃，发酵时间为3～5天，获得发酵饲料。
所述枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌和酵母菌按(1～6)：(1～6)：(1～6)：(1～6)的质量比混合。
所述发酵中，先好氧发酵12h-20h，再将氧浓度降低一倍继续发酵52h～100h。
所述固体培养基中主要成分为处理后的红薯渣、木薯渣、麸皮、马铃薯渣、豆渣和豆粕中的至少一种。
进一步优选地，所述枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌和酵母菌按1：1：1：1的质量比混合。
所述固体培养基为处理后的红薯渣、木薯渣、麸皮、马铃薯渣、豆渣和豆粕按质量比(1～10)：(1～10)：(1～10)：(1～10)：(1～10)：(1～10)混合而成。
将枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌和酵母菌分别进行液态发酵培养，按照2％～15％(W/W)接入固体发酵培养基中，进行发酵。
所得发酵饲料中，总菌落数达到1010cfu/g以上。
进一步优选地，所述固体培养基为处理后的红薯渣、木薯渣、麸皮、马铃薯渣、豆渣和豆粕按质量比2:1:1:2:3:1混合而成。
所述制备方法制备得到的含有复合微生物菌剂的发酵饲料。
本发明一个实施例中所得的发酵饲料中，总菌落数达到1010cfu/g以上、粗蛋白含量24.39±0.03％、氨基酸4.34±0.02％、水分23.44±0.03％。
本发明所采用的四株菌株均为本领域中常用菌株，可以从商业途径直接获得或者从保藏机构获得。
所述四株菌株发酵的方法，包括如下步骤，
所述枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌和酵母菌菌株单独液态发酵的方法，包括如下步骤，
(1)菌株固体、液体培养基
枯草芽孢杆菌液体培养基：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，定容至1L；固体培养基为液体培养基加20％琼脂。
酵母菌液体培养基：胰蛋白胨20g，酵母粉10g，葡萄糖20g，定容至1L，pH 7.2-7.4；固体培养基为液体培养基加20％琼脂。
嗜酸乳杆菌、屎肠球菌液体培养基：：蛋白胨10.0克、牛肉浸取物(牛肉膏)10.0克、酵母提取液(酵母膏或酵母粉)5.0克、葡萄糖20.0克、乙酸钠5.0克、柠檬酸氢二胺2.0克、吐温-80 1.0ml、磷酸氢二钾2.0克、七水硫酸镁0.2克、七水硫酸锰0.05克，定容至1000ml，pH6.2-6.4。培养时间为18-20小时；固体培养基为液体培养基加20％琼脂。
灭菌方法：进行高压蒸汽灭菌，其中糖类灭菌条件为115℃，15min，其余成分灭菌条件为121℃，20min。
(2)菌株固体平板培养
从超低温冰箱中取出枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌和酵母菌的甘油管，在超净台中移取100到300微升菌液，在固体培养基平板上涂布培养。
(3)种子液培养
将四种培养完成的不同的菌株分别接入各自的种子液培养基中，放入30℃～37℃摇床进行培养，其中枯草芽孢杆菌种子液培养，200rpm，培养约12h；嗜酸乳杆菌及屎肠球菌150rpm，培养约18～20h；酵母菌的种子液培养，200rpm，培养约24h。
所述枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌和酵母菌单独液态发酵后再转接入固体培养基后再进行发酵的过程，将四株不同的菌株单独液态发酵的种子液按照体积比(1～6)：(1～6)：(1～6)：(1～6)进行混合配比，将混合配比后的液体菌种按照2％～12％(V/W)接入固体发酵培养基中，分装到塑料袋中，温度25℃～45℃，敞开袋口，好氧发酵12h-20h，半封闭袋口，发酵52h～100h，即得到含有复合微生物菌剂的发酵饲料。
所述固体发酵制备含有复合微生物菌剂的发酵饲料中，总菌落数达到1010cfu/g以上、粗蛋白含量24.39±0.03％、氨基酸4.34±0.02％、水分23.44±0.03％。所述固体发酵制备得到的动物饲料中，粗蛋白含量及氨基酸含量均高于国家标准(GB/T 5916-2008)中动物营养需求的必须氨基酸。
有益效果：
本发明的产品既能将生产废弃物变废为宝，实现废弃资源的再利用，减少废弃材料对环境的污染，大大降低生产成本，经济可行，具有广阔的市场应用价值，所述固体发酵制备得到的动物饲料中，粗蛋白含量及氨基酸含量均高于国家标准(GB/T 5916-2008)中动物营养需求的必须氨基酸。
具体实施方式
通过下述实施例，可以更好地理解本发明。然后，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书说所详细描述的本发明。
以下实施例中所涉及的菌株为：枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌和酵母菌；
实施例中采用的枯草芽孢杆菌CICC 24713、嗜酸乳杆菌CICC 20709购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；
酵母菌CGMCC No.1189来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏；
屎肠球菌为屎肠球菌AS1.130，购自于瑞楚生物科技(江苏)有限公司；
以下实施例中所述红薯渣、木薯渣、麸皮、马铃薯渣、豆渣和豆粕，自行采购。
以下实施例中所述红薯渣、木薯渣、麸皮、马铃薯渣、豆渣和豆粕，其处理方法为：将其混合均匀后进行物理粉碎处理，使其颗粒均匀。
所述枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌和酵母菌菌株单独液态发酵的方法，包括如下步骤，
枯草芽孢杆菌液体培养基：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，定容至1L；固体培养基为液体培养基加20％琼脂。
酵母菌液体培养基：胰蛋白胨20g，酵母粉10g，葡萄糖20g，定容至1L，pH 7.2-7.4；固体培养基为液体培养基加20％琼脂。
嗜酸乳杆菌、屎肠球菌液体培养基：：蛋白胨10.0克、牛肉浸取物(牛肉膏)10.0克、酵母提取液(酵母膏或酵母粉)5.0克、葡萄糖20.0克、乙酸钠5.0克、柠檬酸氢二胺2.0克、吐温-80 1.0ml、磷酸氢二钾2.0克、七水硫酸镁0.2克、七水硫酸锰0.05克，定容至1000ml，pH6.2-6.4。培养时间为18-20小时；固体培养基为液体培养基加20％琼脂。
灭菌方法：进行高压蒸汽灭菌，其中糖类灭菌条件为115℃，15min，其余成分灭菌条件为121℃，20min。
从超低温冰箱中取出枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌和酵母菌的甘油管，在超净台中移取100到300微升菌液，在固体培养基平板上涂布培养。
将四种培养完成的不同的菌株分别接入各自的种子液培养基中，放入30℃～37℃摇床进行培养，其中枯草芽孢杆菌种子液培养，200rpm，培养约12h；嗜酸乳杆菌及屎肠球菌150rpm，培养约18～20h；酵母菌的种子液培养，200rpm，培养约24h。
所述枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌和酵母菌单独液态发酵后再转接入固体培养基后再进行发酵的过程，将四株不同的菌株单独液态发酵的种子液按照体积比(1～6)：(1～6)：(1～6)：(1～6)进行混合配比，将混合配比后的液体菌种按照2％～12％(V/W)接入固体发酵培养基中，分装到塑料袋中，温度25℃～45℃，敞开袋口，好氧发酵12h-20h，半封闭袋口，发酵52h～100h，即得到含有复合微生物菌剂的发酵饲料。
实施例1
本实施例对枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌和酵母菌的接种比例进行了考察，分别按照4％(V/W)接种量将不同比例的枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌和酵母菌的种子液接入红薯渣、木薯渣、麸皮、马铃薯渣、豆渣和豆粕比例为1:1:1:2:3:1的固体发酵培养基中，进行发酵实验，前期20h，后期52h。枯草芽孢杆菌：嗜酸乳杆菌：屎肠球菌：酵母菌比例分别为1:0:0:1、0:1:1:1、1:1:1:0、1:1:0:1、1:0:1:1、1:1:1:1、2:2:2:2，测定发酵产物的总菌落数、粗蛋白质(干基计)、水分(干基计)、氨基酸(干基计)，结果见表1。
表1不同菌种比例对发酵产物各理化指标的影响
Figure BDA0003462758530000061
实施例2
本发明对固体发酵培养基中红薯渣、木薯渣、麸皮、马铃薯渣、豆渣和豆粕比例进行了考察，将枯草芽孢杆菌：嗜酸乳杆菌：屎肠球菌：酵母菌比例为1:1:1:1的液体种子液，按照4％(V/W)接种量加入不同比例的固体发酵培养基中，进行发酵实验，前期20h，后期52h。红薯渣、木薯渣、麸皮、马铃薯渣、豆渣和豆粕比例分别为1:1:1:2:3:1、1:2:1:1:1:1、2:1:1:2:3:1、1:1:2:2:3:1、1:1:1:2:3:2，1:1:1:1:3:1，测定发酵产物的总菌落数、粗蛋白质(干基计)、水分(干基计)、氨基酸(干基计)，结果见表2。由表2所知，最佳红薯渣、木薯渣、麸皮、马铃薯渣、豆渣和豆粕的比例为2:1:1:2:3:1。
表2不同固体培养基对发酵产物各理化指标的影响
Figure BDA0003462758530000071
实施例3
本发明对固态发酵时间进行了考察，将枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌和酵母菌的接种比例为1:1:1:1的液体种子液接入红薯渣、木薯渣、麸皮、马铃薯渣、豆渣和豆粕的比例为2:1:1:2:3:1的固体培养基中，按照4％(V/W)接种量加入红薯渣、木薯渣、麸皮、马铃薯渣、豆渣和豆粕的比例为2:1:1:2:3:1的固体培养基中，发酵温度37℃，发酵时间分别为A：前期好氧0h，后期半封袋72h；B：前期好氧10h，后期半封袋62h；C：前期好氧20h，后期半封袋52h；D：前期好氧36h，后期半封袋36h；E：前期好氧52h，后期半封袋20h。测定发酵产物的总菌落数、粗蛋白质(干基计)、水分(干基计)、氨基酸(干基计)，结果见表3。由表3所知，最佳固态发酵时间为前期好氧20h，后期半封袋52h。
表3不同固体发酵时间对发酵产物各理化指标的影响
Figure BDA0003462758530000072
实施例4
本发明对发酵产物中的总菌落数、粗蛋白质(干基计)、水分(干基计)、氨基酸(干基计)、赖氨酸、蛋氨酸含量进行了测量，与未发酵的原料进行了对比，结果见表4结果表明发酵产物中总菌落数达到8.2×1010cfu/g，粗蛋白质(干基计)含量可达24.39％。
表4发酵产物指标检测结果
Figure BDA0003462758530000081
本发明的检测方法如下：
菌落数的测定：利用LB固体平板采用稀释平板涂布法进行计数。
发酵产物中水分的测定：参考国标GB 5009.3-2016饲料水分和其它挥发性物质含量的测定。
氨基酸的测定：氨基酸的测定采用HPLC法进行测定。
粗蛋白的测定：参考国标GB 5009.5-2016。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种含有复合微生物菌剂的发酵饲料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌和酵母菌分别进行液态发酵培养，然后按比例复合为复合微生物菌剂；
S2、将S1的复合微生物菌剂接种到固体培养基中进行混菌发酵；发酵温度25 ℃~45℃，发酵时间为3~5天，获得发酵饲料。
2.根据权利要求1所述含有复合微生物菌剂的发酵饲料的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌和酵母菌按（1~6）：（1~6）：（1~6）：（1~6）的质量比混合。
3.根据权利要求1所述含有复合微生物菌剂的发酵饲料的制备方法，其特征在于，所述固体培养基中主要成分为处理后的红薯渣、木薯渣、麸皮、马铃薯渣、豆渣和豆粕中的至少一种。
4.根据权利要求2所述含有复合微生物菌剂的发酵饲料的制备方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌和酵母菌按1： 1： 1： 1的质量比混合。
5.根据权利要求3所述含有复合微生物菌剂的发酵饲料的制备方法，其特征在于，所述固体培养基为处理后的红薯渣、木薯渣、麸皮、马铃薯渣、豆渣和豆粕按质量比（1~10）：（1~10）：（1~10）：（1~10）：（1~10）：（1~10）混合而成。
6.根据权利要求1所述含有复合微生物菌剂的发酵饲料的制备方法，其特征在于，将枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、屎肠球菌和酵母菌分别进行液态发酵培养，按照2%~15%（W/W）接入固体发酵培养基中，进行发酵。
7.根据权利要求1所述含有复合微生物菌剂的发酵饲料的制备方法，其特征在于，所得发酵饲料中，总菌落数达到1010cfu/g以上。
8.根据权利要求5所述含有复合微生物菌剂的发酵饲料的制备方法，其特征在于，所述固体培养基为处理后的红薯渣、木薯渣、麸皮、马铃薯渣、豆渣和豆粕按质量比2:1:1:2:3:1混合而成。
9.根据权利要求1所述含有复合微生物菌剂的发酵饲料的制备方法，其特征在于，所述发酵中，先好氧发酵12 h-20 h，再将氧浓度降低一倍继续发酵52 h~100 h。
10.权利要求1至9中任意一项制备方法制备得到的含有复合微生物菌剂的发酵饲料。
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