CN115645349B - 一种具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115645349B CN115645349B CN202211089449.0A CN202211089449A CN115645349B CN 115645349 B CN115645349 B CN 115645349B CN 202211089449 A CN202211089449 A CN 202211089449A CN 115645349 B CN115645349 B CN 115645349B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- skin
- composition
- lactobacillus
- moisturizing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 54
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 230000008491 skin homeostasis Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 85
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 84
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims abstract description 54
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 claims abstract description 54
- 241000228347 Monascus <ascomycete fungus> Species 0.000 claims abstract description 46
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 25
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 25
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 23
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 22
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 17
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 13
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 13
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 9
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims description 7
- SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 2-methylpentane-2,4-diol Chemical compound CC(O)CC(C)(C)O SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 6
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 6
- 229940057059 monascus purpureus Drugs 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 5
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 5
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 claims description 5
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 5
- 229940015975 1,2-hexanediol Drugs 0.000 claims description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 4
- FHKSXSQHXQEMOK-UHFFFAOYSA-N hexane-1,2-diol Chemical compound CCCCC(O)CO FHKSXSQHXQEMOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 claims description 4
- 229940043375 1,5-pentanediol Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000006071 cream Substances 0.000 claims description 3
- 229940051250 hexylene glycol Drugs 0.000 claims description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 3
- WCVRQHFDJLLWFE-UHFFFAOYSA-N pentane-1,2-diol Chemical compound CCCC(O)CO WCVRQHFDJLLWFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 3
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims 4
- NCZPCONIKBICGS-UHFFFAOYSA-N 3-(2-ethylhexoxy)propane-1,2-diol Chemical compound CCCCC(CC)COCC(O)CO NCZPCONIKBICGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims 2
- 229940100524 ethylhexylglycerin Drugs 0.000 claims 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims 2
- 229960005150 glycerol Drugs 0.000 claims 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims 1
- ACCCMOQWYVYDOT-UHFFFAOYSA-N hexane-1,1-diol Chemical compound CCCCCC(O)O ACCCMOQWYVYDOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 claims 1
- UWJJYHHHVWZFEP-UHFFFAOYSA-N pentane-1,1-diol Chemical compound CCCCC(O)O UWJJYHHHVWZFEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 claims 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 21
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 abstract description 6
- 230000008591 skin barrier function Effects 0.000 abstract description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 5
- 238000005282 brightening Methods 0.000 abstract description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract 1
- 230000001680 brushing effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 33
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 101150063233 FLG gene Proteins 0.000 description 9
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 6
- 241000736262 Microbiota Species 0.000 description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 4
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 102100028314 Filaggrin Human genes 0.000 description 3
- 101710088660 Filaggrin Proteins 0.000 description 3
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 3
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 3
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 3
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 229940026314 red yeast rice Drugs 0.000 description 3
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 3
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000036548 skin texture Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- ANZUDYZHSVGBRF-UHFFFAOYSA-N 3-ethylnonane-1,2,3-triol Chemical compound CCCCCCC(O)(CC)C(O)CO ANZUDYZHSVGBRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 239000007933 dermal patch Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 2
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010013786 Dry skin Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 206010040880 Skin irritation Diseases 0.000 description 1
- 206010070835 Skin sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 102000019259 Succinate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010012901 Succinate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- MKYNHKOAYQRSBD-UHFFFAOYSA-N dioxouranium;nitric acid Chemical compound O=[U]=O.O[N+]([O-])=O.O[N+]([O-])=O MKYNHKOAYQRSBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000037336 dry skin Effects 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 210000000245 forearm Anatomy 0.000 description 1
- 238000003633 gene expression assay Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000036074 healthy skin Effects 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 230000037384 skin absorption Effects 0.000 description 1
- 231100000274 skin absorption Toxicity 0.000 description 1
- 230000036556 skin irritation Effects 0.000 description 1
- 231100000475 skin irritation Toxicity 0.000 description 1
- 244000005714 skin microbiome Species 0.000 description 1
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 description 1
- 231100000370 skin sensitisation Toxicity 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000036572 transepidermal water loss Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Landscapes
- Cosmetics (AREA)
Abstract
本发明属于化妆品技术领域,公开了一种具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物及其制备方法和应用。本发明具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物包含红曲发酵液和乳酸菌发酵溶胞产物,所述红曲发酵液与乳酸菌发酵溶胞产物的质量比为1‑15:1‑10。本发明提供的组合物具有保湿提亮、修复皮肤屏障、恢复肌肤微生态平衡的作用,尤其是针对刷酸或者过度清洁等造成的皮肤屏障受损,皮肤酸碱环境失衡,以及皮肤表面微生物失衡,该组合物具有协同增效作用,更多关注到皮肤本身的新陈代谢过程,以及在这个过程中“新微生物组”的快速建立,并且通过改善微生物组生存的pH值、湿度等外部环境,焕亮肌肤,帮助皮肤恢复稳态。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品技术领域,具体是涉及一种具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物及其制备方法和应用。
背景技术
表皮是人体最为活跃的部分,在健康的皮肤内,随时都有大约14%的基底层角质形成细胞处于细胞***中,它们会经历细胞***、分化,并向上移动,在这个的过程中,细胞成为角质层的一部分。尽管角质层是强大有效的物理屏障,但它不断受到波动的环境温度和湿度、紫外线、微生物、日常卫生(水、表面活性剂)、异物分子等因素的挑战。为了维持物理屏障这个至关重要的功能,表皮必须不断自我更新,这使它成为了人体中最活跃的部分。如果表皮更新过程能够成功进行,皮肤就会获得最佳的屏障功能、水合程度与美感。
皮肤上生活着多种微生物,许多皮肤常驻微生物会与皮肤相互作用。微生物产生的各种分子与皮肤细胞(例如分化中的角质形成细胞)相互作用,这些细胞做出反应,使皮肤受益,同时角质形成细胞产生对“健康”微生物有益的分子。例如,产生调节皮肤pH值的分子,以及能够杀死互利微生物竞争物种的抗微生物肽等。皮肤与有益互利微生物之间的作用是双向的,两方处于动态平衡的共生关系中。
每天都有数十亿个皮肤微生物被杀死、洗掉、擦掉或与死亡的皮肤细胞一起脱落。尽管如此,皮肤上仍然还有大量微生物,而且其组成惊人地稳定,原因是皮肤微生物群也会像表皮那样自我更新。在皮肤表面发生的任何损失均由微生物更新过程来弥补,表皮的状态与皮肤表面微生态环境息息相关,干燥的皮肤角质层较厚,不易脱落,因此不利于新陈代谢的进行,而湿润的皮肤环境有利于表皮正常新陈代谢的进行。因此,湿润的环境能够维持皮肤正常的新陈代谢,进而促进“新微生物组”相对快速到达皮肤表面。皮肤的pH值、湿度、温度、所需食物的供应情况等也能让环境变的对这些微生物更有利,健康平衡的皮肤微生物群能够与皮肤细胞(例如分化中的角质形成细胞)相互作用,最终使皮肤受益。然而,现有微生态友好护肤产品中,只针对某一种或某一类菌的提升或抑制,来达到微生态环境的平衡。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述背景技术的不足,提供一种具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物及其制备方法和应用。本发明的组合物更多关注到皮肤本身的新陈代谢过程,以及在这个过程中“新微生物组”的快速建立。并且通过改善微生物组生存的pH值、湿度等外部环境,帮助皮肤恢复稳态。
为达到本发明的目的,本发明具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物包含红曲发酵液和乳酸菌发酵溶胞产物。
进一步地,在本发明的一些实施例中,所述红曲发酵液与乳酸菌发酵溶胞产物的质量比为1-15:1-10。
优选地,在本发明的一些实施例中,所述红曲发酵液与乳酸菌发酵溶胞产物的质量比为1-10:1-3。
更优选地,在本发明的一些实施例中,所述红曲发酵液与乳酸菌发酵溶胞产物的质量比为3-4:1。
进一步地,在本发明的一些实施例中,所述红曲发酵液的制备方法为:红曲霉菌株在斜面培养基上培养后用无菌水洗下孢子,过滤后振荡制成均一孢子悬液,将孢子悬液接种到液体培养基中,摇床培养得到液体种子液;将大米洗净,沥干并粉碎后,加水搅拌,糊化处理并冷却至室温后接种红曲霉菌液体种子液,在25~45℃温度下搅拌发酵,完成后进行喷雾干燥,得红曲霉发酵产物;所得红曲霉发酵产物加入去离子水,接种乳酸杆菌,搅拌发酵;发酵完成后,灭菌,离心,得上清液,即为红曲发酵液。
进一步地,在本发明的一些实施例中,所述乳酸菌发酵溶胞产物的制备方法为:取乳酸菌菌种在斜面培养基中划线恒温培养后,洗涤菌种,进行离心,得乳酸菌悬液;将乳酸菌悬液接种于液体培养基中,进行活化种子培养,得乳酸菌种子液,接种于发酵罐中,搅拌,通气,培养至发酵结束;过滤得到菌体后,进行破壁,即得乳酸菌发酵溶胞产物。
进一步地,在本发明的一些实施例中,所述组合物中还包含稳定剂。
优选地,在本发明的一些实施例中,所述稳定剂为甘油、乙基己基甘油、1,2-己二醇、己二醇、戊二醇中的一种或多种。
更优选地,在本发明的一些实施例中,所述红曲发酵液和乳酸菌发酵溶胞产物的质量与稳定剂的比为0.3-5:1。
另一方面,本发明还提供了一种前述具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物的制备方法,所述方法包含以下步骤:
1)种子液制备:红曲霉菌株在斜面培养基上培养后用无菌水洗下孢子,过滤后振荡制成均一孢子悬液,将孢子悬液以1-10%的接种量接种到液体培养基中,摇床培养1-3d,得到液体种子液;
2)将大米洗净,沥干并粉碎后,加水搅拌,控制水料比为8-12:1,糊化处理并冷却至室温后,以接种量4-10%接种红曲霉菌液体种子液;
3)在25-45℃温度下发酵2.5-3.5d,搅拌发酵,完成后进行喷雾干燥,得红曲霉发酵产物;
4)在所得红曲霉发酵产物中加入25-35倍的去离子水,接种8-12%的乳酸杆菌,搅拌发酵;
5)发酵完成后,灭菌,离心,得上清液,即为红曲发酵液;
6)取乳酸菌菌种在斜面培养基中划线培养,恒温培养后洗涤菌种,进行离心,得乳酸菌悬液;
7)将乳酸菌悬液接种于液体培养基中,进行活化种子培养;
8)将乳酸菌种子液接种于发酵罐中,搅拌,通气,培养至发酵结束;
9)过滤得到菌体后,进行破壁,即得乳酸菌发酵溶胞产物;
10)将所得乳酸菌发酵溶胞产物混入所得红曲发酵液中,搅拌混匀后,加入稳定剂及添加剂,混合后,过滤,即得。
进一步地,在本发明的一些实施例中,所述步骤1)中孢子悬液浓度为1×105-1×107CFU/mL。
进一步地,在本发明的一些实施例中,所述步骤8)中搅拌速率为100-300r/min,通气量为0.3-0.6L/min。
优选地,在本发明的一些实施例中,所述稳定剂为甘油、乙基己基甘油、1,2-己二醇、己二醇、戊二醇中的一种或多种。
更优选地,在本发明的一些实施例中,所述红曲发酵液和乳酸菌发酵溶胞产物的质量与稳定剂的比为0.3-5:1。
再一方面,本发明还提供了一种前述具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物的应用,所述应用为将所述组合物添加到化妆品中。
进一步地,在本发明的一些实施例中,所述化妆品为水剂、乳剂、喷雾、膏霜、面膜、粉底液,但本领域技术人员理应知晓这些仅为例举,本发明所述化妆品包括但不限于水剂、乳剂、喷雾、膏霜、面膜、粉底液。
与现有技术相比,本发明的优点如下:
(1)相对于传统提取方式,本发明双发酵的方法能够减弱红曲的颜色,提高红曲的稳定性,同时又能避免传统提取工艺对红曲中活性物质的损失,并且乳酸杆菌体超声裂解后释放出有利于有益菌生长的营养物质,超声及高压均质的破壁方式能够减少引入对皮肤有刺激的成分。
(2)本发明组合物中红曲霉菌联合乳酸杆菌的方式可以更多地释放小分子活性物质,便于皮肤吸收利用,提升保湿效果,更快的恢复皮肤稳态环境。
(3)本发明中乳酸菌与红曲发酵物组合可以协同增效,不仅能够平衡皮肤微生态,另外还营造了皮肤微生物组适宜的生存环境。
(4)本发明中乳酸菌与红曲发酵物组合物相较于一般微生态调节组合物,更多的促进皮肤新陈代谢,提升表皮分化、再生的功效,通过表皮的分化再生,促进皮肤本身“新微生物组”的快速建立,在保湿、恢复皮肤屏障功能、提亮方面表现优异。
附图说明
图1是使用本发明实施例6、9中组合物后微生物丰富度恢复情况(%);
图2是使用本发明实施例6、9中组合物后微生物多样性恢复情况(%);
图3是使用本发明实施例6、9中组合物后经表皮水分流失Tewl值减少率(%)图;
图4是使用本发明实施例6、9中组合物前后皮肤纹理图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。应当理解,以下描述仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形,意在覆盖非排它性的包括。例如,包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素,而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时,这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围,而不论该范围是否单独公开了。例如,当公开了范围“1至5”时,所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时,除非另外说明,否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个,并且单数形式的要素或组分也包括复数形式,除非所述数量明显只指单数形式。
此外,下面所描述的术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不是必须针对相同的实施例或示例。而且,本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
一种前述具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物的制备方法,所述方法包含以下步骤:
(1)将红曲霉菌株在斜面培养基上培养后,用无菌水洗下孢子,过滤后转入带有玻璃珠的无菌三角瓶中,振荡制成均一孢子悬液,浓度为1×105-1×107CFU/mL,将孢子悬液以4%接种量接种到液体培养基中,摇床培养3d,得到液体种子液;
(2)将大米洗净,沥干并粉碎后加水搅拌,控制水料比为10:1,以10%接种量接种步骤(1)所得种子液;
(3)在步骤(2)完成后,30℃温度下搅拌发酵3d,完成后进行喷雾干燥,得红曲霉发酵产物;
(4)取步骤(3)所得红曲霉发酵产物加入30倍的去离子水,接种10%乳酸杆菌,搅拌发酵;
(5)发酵完成后,灭菌,离心,得上清液;
(6)取菌种在斜面培养基中划线恒温培养后,洗涤菌种,进行离心,得乳酸菌悬液,菌悬液浓度1×106-1×108CFU/mL CFU/mL;
(7)将菌悬液接种于液体培养基中,进行活化种子培养24h;
(8)将乳酸菌种子液以10%接种量接种于发酵罐中,以100-300r/min的速率进行搅拌,通气0.5L/min,培养至发酵结束;
(9)过滤得到菌体后,进行破壁,即得乳酸菌发酵溶胞产物;
(10)将步骤(9)所得乳酸菌发酵溶胞产物按照比例混入步骤(5)所得上清液中,搅拌混匀后,加入稳定剂及添加剂,混合后,过滤,即得;
(11)其中步骤(4)中接种10%乳酸杆菌为对比例1-1,不接种10%乳酸杆菌为对比例1-2,其余制备方法如上步骤。
表1实施例1-10及对比例1-2中各组合物的组成比例(以质量计)
根据表1并采用上述方法制备各实施例及对比例的组合物,并对所得组合物进行功效测试。
细胞毒性测评试验:
MTT assay是通过对活细胞数进行测定,在检测细胞毒性或细胞增殖时广泛使用的实验方法,其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使水溶性的黄色盐MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)还原为水不溶性的蓝色的甲臜,并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。生成的结晶甲臜一般加入DMSO(二甲亚砜),溶解后测定吸光度。具体的实验方法是在96多孔板中按照1X104个/孔的密度接种含有10%牛血清的DMEM培养基和角质形成细胞(HaCaT)各100μl,培养24小时后换成无血清培养基。在无血清培养基中分别加入不同浓度的组合物进行处理后培养24小时。之后去除培养基,用20μl的MTT溶液进行处理,在37℃下使其反应2小时。在去除MTT溶液的细胞中加入200μl异丙醇,轻轻地震荡30min,完全溶解结晶甲臜,在570nm处测定吸光度,根据如下公式计算细胞存活率。
空白组不加入组合物进行试验。
表2实施例1-10和对比例1-1、1-2、2所得的组合物的细胞毒性结果
角质细胞基因表达试验:
丝聚蛋白Filaggrin(FLG)是角质细胞终末分化的重要条件,对表皮的分化形成有重要作用,可作为评价皮肤屏障功能以及表皮分化状态的指标。
采用实时荧光定量PCR法检测组合物对靶标基因表达量的调节,待测样品为:实施例1-10、对比例1-1、1-2、对比例2,浓度:1%。HaCaT细胞以3*105/孔接种至6孔板上,培养24h,细胞贴壁生长。将待测样品配制成1X,每孔2ml加入细胞板,于37℃5%CO2恒温培养箱继续孵育24h之后,收集细胞,应用PureLink mini RNA抽提试剂盒对细胞总RNA进行提取,核酸浓度定量,每管200-800ng RNA作为模板,Taqman一步法反应(逆转录+Real Time-PCR)进行实时定量荧光PCR检测各个基因的相对表达量(20μl体系)。
计算公式:Fold change=2-ΔΔCT;
-ΔΔCT=[(CT靶标基因–CT内参基因)treated sample-(CT靶标基因–CT内参基因)untreated sample]。此试验中,靶标基因1个,为FLG,内参基因1个,为GAPDH。
表3组合物对靶标基因表达量的调节检测结果
由上表可知:
1)实施例1-10所得组合物的FLG基因表达量均高于对比例,说明本发明所得红曲发酵液和乳酸菌发酵溶胞产物通过组合方式可获得更好的FLG基因表达效果,另外对比例1-1相对于对比例1-2,促进FLG基因表达有明显提升,说明红曲霉菌联合乳酸杆菌的发酵方式更具优势;
2)FLG基因的表达和本发明所得红曲发酵液和乳酸菌发酵溶胞产物均具有一定量效关系,质量份数增加到一定范围后,上升趋势减缓。经过对比实施例1、2、3、6、8、9发现,红曲发酵液质量份数为1、8、15的FLG基因表达差别不大,而在红曲发酵液质量份数为2、3、4时,FLG基因表达出现较大提升;由实施例6、7以及实施例9、10对比发现乳酸菌发酵溶胞产物质量份数为1、5的FLG基因表达差别不大;实施例6、9的FLG基因表达量最高。因此,优选实施例6(4:1)和实施例9(3:1).
综上所述,红曲发酵液质量份数为不同比例组合对应的促进FLG基因表达的能力不同,本发明所得红曲发酵液和乳酸菌发酵溶胞产物的质量比为1-10:1-3,更优选地,本发明所得红曲发酵液与乳酸菌发酵溶胞产物的质量比为4:1和3:1。
安全性斑贴测试:
滴加20μl的待测液于斑试器中,对照孔为空白对照(纯水);将加有受试物的斑试器贴到受试人员前臂屈侧,用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上,持续24小时;分别于去除受试物斑试器后30min、24小时、48小时后按表4观察皮肤刺激性和致敏性,并记录观察结果。
表4皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准
实验结果:对实施例6、9进行人体皮肤斑贴测试。
表5实施例6、9人体皮肤斑贴
试验结果显示,30人中无皮肤不良反应。
微生物丰富度及多样性恢复情况试验:
占据人体的细菌保留了16S核醣体RNA(rRNA)基因,其特殊的基因区域可以用于***分类。这使得16S rRNA基因成为一种分子标签,可以用来识别细菌群落的各个成员。采用无创拭子收集皮肤微生物。将微生物细胞溶解后,分离出微生物DNA。然后使用以16S rRNA基因为靶标的引物对DNA进行选择性PCR(聚合酶链式反应)扩增,对PCR产物进行测序,获得DNA序列后,使用生物信息工具进行基本序列处理、物种分类、多样性分析和群落比较。
选取志愿者15名,在第0天,对四个部位(A、B、C、D)进行胶带剥离,第五个部位(E)不进行剥离。然后用试验产品处理A、B、C部位,在随后的七天中让志愿者继续在选定部位使用试验产品两次(早上和晚上)。在胶带剥离操作之前、以及胶带剥离后第2天和第7天对微生物群落进行分析。其中A为安慰剂组、B为实施例6、C为实施例9、D为阴性对照组(未处理,受损)、E为阳性对照组(未处理,未受损)。将E部位的丰富度及多样性设为100%,观察微生物组的丰富度及多样性的恢复情况。
如图1-2,实施例6、9在微生物丰富度方面,在第二天即有较大程度的恢复,在第七天时恢复至几乎接近阳性对照组,而安慰剂恢复较慢,且恢复程度较差;在微生物多样性方面,实施例6、9相对于安慰剂组在第七天时有更高的恢复程度,更加接近阳性对照组。上述结果证明组合物在恢复皮肤微生物群的丰富度及多样性方面有积极作用,能够恢复皮肤微生物群的稳态。
皮肤屏障修复测试和纹理测试:
1)皮肤屏障修复测试:
选取25至45岁之间的女性志愿者30名,使用含1%(质量计)实施例6、实施例9和对比例1-2所得组合物的乳液和空白乳液,每天2次,连续使用28天,使用仪器测试各项指标,结果如图3所示。
2)皮肤纹理测试:
图4为使用不同组合物前后的皮肤纹理图。由图4可知,实施例6和实施例9所得组合物对皮肤纹理有明显的改善作用。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (15)
1.一种具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物,其特征在于,所述组合物中包含红曲发酵液和乳酸菌发酵溶胞产物;所述红曲发酵液的制备方法为:红曲霉菌株在斜面培养基上培养后用无菌水洗下孢子,过滤后振荡制成均一孢子悬液,将孢子悬液接种到液体培养基中,摇床培养得到液体种子液;将大米洗净,沥干并粉碎后,加水搅拌,糊化处理并冷却至室温后接种红曲霉菌液体种子液,在25~45℃温度下搅拌发酵,完成后进行喷雾干燥,得红曲霉发酵产物;所得红曲霉发酵产物加入去离子水,接种乳酸杆菌,搅拌发酵;发酵完成后,灭菌,离心,得上清液,即为红曲发酵液。
2.根据权利要求1所述的具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物,其特征在于,所述红曲发酵液与乳酸菌发酵溶胞产物的质量比为1-15:1-10。
3.根据权利要求1所述的具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物,其特征在于,所述红曲发酵液与乳酸菌发酵溶胞产物的质量比为1-10:1-3。
4.根据权利要求1所述的具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物,其特征在于,所述红曲发酵液与乳酸菌发酵溶胞产物的质量比为3-4:1。
5.根据权利要求1所述的具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物,其特征在于,所述乳酸菌发酵溶胞产物的制备方法为:取乳酸菌菌种在斜面培养基中划线恒温培养后,洗涤菌种,进行离心,得乳酸菌悬液;将乳酸菌悬液接种于液体培养基中,进行活化种子培养,得乳酸菌种子液,接种于发酵罐中,搅拌,通气,培养至发酵结束;过滤得到菌体后,进行破壁,即得乳酸菌发酵溶胞产物。
6.根据权利要求1所述的具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物,其特征在于,所述组合物中还包含稳定剂。
7.根据权利要求6所述的具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物,其特征在于,所述稳定剂为甘油、乙基己基甘油、1,2-己二醇、己二醇、戊二醇中的一种或多种。
8.根据权利要求6所述的具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物,其特征在于,所述红曲发酵液和乳酸菌发酵溶胞产物的质量与稳定剂的比为0.3-5:1。
9.权利要求1-8任一项所述具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物的制备方法,其特征在于,所述方法包含以下步骤:
1)种子液制备:红曲霉菌株在斜面培养基上培养后用无菌水洗下孢子,过滤后振荡制成均一孢子悬液,将孢子悬液以1-10%的接种量接种到液体培养基中,摇床培养1-3d,得到液体种子液;
2)将大米洗净,沥干并粉碎后,加水搅拌,控制水料比为8-12:1,糊化处理并冷却至室温后,以接种量4-10%接种红曲霉菌液体种子液;
3)在25-45℃温度下发酵2.5-3.5d,搅拌发酵,完成后进行喷雾干燥,得红曲霉发酵产物;
4)在所得红曲霉发酵产物中加入25-35倍的去离子水,接种8-12%的乳酸杆菌,搅拌发酵;
5)发酵完成后,灭菌,离心,得上清液,即为红曲发酵液;
6)取乳酸菌菌种在斜面培养基中划线培养,恒温培养后洗涤菌种,进行离心,得乳酸菌悬液;
7)将乳酸菌悬液接种于液体培养基中,进行活化种子培养;
8)将乳酸菌种子液接种于发酵罐中,搅拌,通气,培养至发酵结束;
9)过滤得到菌体后,进行破壁,即得乳酸菌发酵溶胞产物;
10)将所得乳酸菌发酵溶胞产物混入所得红曲发酵液中,搅拌混匀后,加入稳定剂及添加剂,混合后,过滤,即得。
10.根据权利要求9所述具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物的制备方法,其特征在于,所述步骤1)中孢子悬液浓度为1×105-1×107CFU/mL。
11.根据权利要求9所述具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物的制备方法,其特征在于,所述步骤8)中搅拌速率为100-300r/min,通气量为0.3-0.6L/min。
12.根据权利要求9所述具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物的制备方法,其特征在于,所述稳定剂为甘油、乙基己基甘油、1,2-己二醇、己二醇、戊二醇中的一种或多种。
13.根据权利要求9所述具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物的制备方法,其特征在于,所述红曲发酵液和乳酸菌发酵溶胞产物的质量与稳定剂的比为0.3-5:1。
14.权利要求1-8任一项所述具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物的应用,其特征在于,所述应用为将所述组合物添加到化妆品中。
15.根据权利要求14所述具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物的应用,其特征在于,所述化妆品为水剂、乳剂、喷雾、膏霜、面膜、粉底液中的一种或多种。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211089449.0A CN115645349B (zh) | 2022-09-07 | 2022-09-07 | 一种具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211089449.0A CN115645349B (zh) | 2022-09-07 | 2022-09-07 | 一种具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物及其制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115645349A CN115645349A (zh) | 2023-01-31 |
CN115645349B true CN115645349B (zh) | 2024-04-12 |
Family
ID=84984159
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211089449.0A Active CN115645349B (zh) | 2022-09-07 | 2022-09-07 | 一种具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115645349B (zh) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106399192A (zh) * | 2016-10-25 | 2017-02-15 | 江苏微康生物科技有限公司 | 一种乳酸菌发酵溶胞产物、制备方法及其应用 |
CN108186422A (zh) * | 2018-01-15 | 2018-06-22 | 北京东方淼森生物科技有限公司 | 红曲霉发酵产物提取物、制备方法及其用途 |
CN111534455A (zh) * | 2020-04-02 | 2020-08-14 | 广州栋方生物科技股份有限公司 | 一种乳酸杆菌溶孢产物的制备及其在化妆品的应用 |
KR102235334B1 (ko) * | 2020-05-27 | 2021-04-02 | 최정엽 | 전복, 굴껍질을 이용한 칼슘분말의 제조방법, 이에 의해 제조된 칼슘분말 및 이를 포함하는 식품, 화장료, 의약품 |
-
2022
- 2022-09-07 CN CN202211089449.0A patent/CN115645349B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106399192A (zh) * | 2016-10-25 | 2017-02-15 | 江苏微康生物科技有限公司 | 一种乳酸菌发酵溶胞产物、制备方法及其应用 |
CN108186422A (zh) * | 2018-01-15 | 2018-06-22 | 北京东方淼森生物科技有限公司 | 红曲霉发酵产物提取物、制备方法及其用途 |
CN111534455A (zh) * | 2020-04-02 | 2020-08-14 | 广州栋方生物科技股份有限公司 | 一种乳酸杆菌溶孢产物的制备及其在化妆品的应用 |
KR102235334B1 (ko) * | 2020-05-27 | 2021-04-02 | 최정엽 | 전복, 굴껍질을 이용한 칼슘분말의 제조방법, 이에 의해 제조된 칼슘분말 및 이를 포함하는 식품, 화장료, 의약품 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
红曲代谢产物的研究现状和前景;陈平;;广西轻工业(第9期);第4-5页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN115645349A (zh) | 2023-01-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102112106B (zh) | 包含经发酵和酶处理的绿豆种子提取物、用于皮肤抗老化的化妆品组合物 | |
CN115105452B (zh) | 一种红茶发酵滤液及其制备方法和应用 | |
US20200308662A1 (en) | Bifidobacterium animalis subsp. lactis gfc-b09 strain and cosmetic composition containing same | |
CN108653059A (zh) | 一种益生菌发酵制备海藻发酵液的方法及该海藻发酵液在化妆品中的应用 | |
CN112980704B (zh) | 一种用于制备天然香气发酵大米滤液的酵母菌及其应用 | |
CN111534455B (zh) | 一种乳酸杆菌溶孢产物的制备及其在化妆品的应用 | |
CN114072128B (zh) | 具有皮肤保湿以及皮肤再生功能的皮肤益生菌块组合物的制造方法 | |
CN110964673B (zh) | 一种具有高抗氧化性及美白效果的戊糖片球菌及其应用 | |
CN111088174A (zh) | 一种具有抗氧化性及美白效果的扣囊复膜孢酵母菌及其应用 | |
CN112870151B (zh) | 一种含聚谷氨酸钠的皮肤屏障修复组合物及其应用 | |
CN115637235A (zh) | 具有良好抗氧化抗炎效果的表皮葡萄球菌及其应用 | |
JP2009029788A (ja) | 海水由来酵母培養物含有皮膚外用用組成物 | |
KR20130114808A (ko) | 콜라겐 천연 발효액을 포함하는 화장료 조성물 | |
CN115645349B (zh) | 一种具有保湿修护、恢复肌肤稳态功效的组合物及其制备方法和应用 | |
CN115927128B (zh) | 一种透明颤菌发酵产物及其制备方法与应用 | |
CN115105454B (zh) | 铁皮石斛花发酵物的制备方法及包含上述发酵物的化妆品组合物 | |
CN114891699A (zh) | 调节菌群平衡的唾液乳杆菌 | |
CN114561438A (zh) | 一种糖脂及其制备方法和应用 | |
CN113041200A (zh) | 一种含释迦果多重发酵液的化妆品及其制备方法 | |
JP2022027391A (ja) | 髪のダメージを修復し、頭皮の老化を遅らせる松茸発酵物、組成物及びその使用 | |
CN117051048B (zh) | 一种二裂酵母发酵产物溶胞产物及其制备方法和应用 | |
KR102524935B1 (ko) | 락토바실러스 퍼멘툼 j2k-193 균주 및 이를 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물 | |
KR102544440B1 (ko) | 피부 상재균으로부터 유래된 엔테로박터 에어로게네스 j2k-739 균주 및 피부 상재균 유래 엔테로박터속을 자극원으로 처리하는 신규한 항주름평가 방법 | |
CN114146040B (zh) | 一种强化皮肤屏障、抗衰老的组合物及其制备方法和应用 | |
CN115746127B (zh) | 一种x-聚松露蛋白组合物、x-聚松露蛋白及其制备方法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |