CN115105454B - 铁皮石斛花发酵物的制备方法及包含上述发酵物的化妆品组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及铁皮石斛花发酵物的制备方法及包含上述发酵物的化妆品组合物，上述制备方法包括：步骤a)，对铁皮石斛茎进行酶处理，制备天然培养基；步骤b)，在步骤a)中得到的天然培养基中接种及培养乳酸菌；以及步骤c)，在步骤b)中，在乳酸菌培养液中添加铁皮石斛花而使其发酵。根据本发明，相比于在非天然培养基的乳酸菌发酵培养基中进行乳酸菌培养来使铁皮石斛花发酵或用纯化水提取铁皮石斛花，呈现高的皮肤弹性改善、皮肤保湿及皮肤屏障强化效果，因而通过诱导I型胶原蛋白和弹性蛋白的表达来增强皮肤弹性，强化皮肤紧密连接蛋白使皮肤屏障变得结实，诱导皮肤中天然保湿因子的生成，可提供从皮肤内部填充保湿感的化妆品组合物。
Description
技术领域
本发明涉及铁皮石斛花发酵物的制备方法及包含上述发酵物的化妆品组合物，更具体地涉及铁皮石斛花发酵物的制备方法、包含通过上述制备方法制备的铁皮石斛花发酵物的皮肤弹性、保湿或皮肤屏障强化用化妆品组合物，上述铁皮石斛花发酵物的制备方法包括：步骤a)，对铁皮石斛茎进行酶处理，制备天然培养基；步骤b)，在上述步骤a)中得到的天然培养基中接种及培养乳酸菌；以及步骤c)，在上述步骤b)中，在乳酸菌培养液中添加铁皮石斛花而使其发酵。
背景技术
铁皮石斛(Dendrobium Candidum)属于单子叶植物兰目兰科，其作为常绿多年生草，附着于岩石或死树干而长，根茎中有很多粗根。据报告，铁皮石斛主要分布于中国和韩国，包含多糖体和糖基(glycone)形态的多酚(polyphenol)、铁皮石斛素(dendrocandin)等。并且，据熟知，指标物质或有效物质有铁皮石斛素C、D及E。在中国和韩国的医学书中据传对去除或降低肠胃热，或者产生津液、解渴或使筋骨变得结实，对糖尿病和夜盲症、高血压有效。
最近，开发包含铁皮石斛花提取物的化妆品组合物，公开皱纹改善、皮肤美白、皮肤过敏改善或皮肤保湿等皮肤改善效果(KR10-2019-0026175 A)，开发包含利用芽孢杆菌或乳酸菌发酵的铁皮石斛发酵物的化妆品组合物，公开皮肤皱纹改善及美白功效(KR10-2019-0094642 A)。但是，铁皮石斛花的提取物或纯发酵物的皮肤改善效果甚微，不足以用作化妆品组合物的原料。
对此，本发明人为了克服上述现有技术的多种问题而锐意研究努力的结果，确认到对铁皮石斛茎进行酶处理的天然培养基中培养乳酸菌之后，使铁皮石斛花发酵时，具有更优秀于以往铁皮石斛提取物或发酵物的皮肤弹性改善、皮肤保湿及皮肤屏障强化效果，并完成了本发明。
根据本发明，相比于在非天然培养基的乳酸菌发酵培养基(MRS)中进行乳酸菌培养来使铁皮石斛花发酵或用纯化水提取铁皮石斛花，呈现高的皮肤弹性改善、皮肤保湿及皮肤屏障强化效果，因而通过诱导I型胶原蛋白(Collagen Type I)和弹性蛋白(Elastin)的表达来增强皮肤弹性，强化皮肤紧密连接蛋白(Tight Junction Protein)使皮肤屏障变得结实，诱导皮肤中天然保湿因子(NMF，Natural Moisturizing Factor)的生成，由此可提供从皮肤内部填充保湿感的化妆品组合物。
现有技术文献
专利文献
(专利文献1)KR10-2019-0026175 A
(专利文献2)KR10-2019-0094642 A
发明内容
因此，本发明的主要目的在于，提供具有优秀于以往方法的皮肤改善效果的铁皮石斛花发酵物的制备方法。
本发明的另一目的在于，提供包含通过上述制备方法制备的铁皮石斛花发酵物的皮肤弹性改善、皮肤保湿及皮肤屏障强化用化妆品组合物。
根据本发明的一实施方式，本发明提供铁皮石斛花发酵物的制备方法，其包括：步骤a)，对铁皮石斛茎进行酶处理，制备天然培养基；步骤b)，在上述步骤a)中得到的天然培养基中接种及培养乳酸菌；以及步骤c)，在上述步骤b)中，在乳酸菌培养液中添加铁皮石斛花而使其发酵。
在本发明中，提供如下铁皮石斛花发酵物的制备方法，其特征在于，在上述步骤a)中，上述酶可以为可分解铁皮石斛茎的任何酶，但优选为纤维素酶(Cellulase)。
在本发明中，提供如下铁皮石斛花发酵物的制备方法，其特征在于，在上述步骤b)中，上述乳酸菌可以为可使铁皮石斛发酵的任何乳酸菌，但优选为双歧杆菌(Bifidobacterium)。
在本发明中，提供如下铁皮石斛花发酵物的制备方法，其特征在于，在上述步骤c)中，上述乳酸菌培养液的光密度(OD)值优选为0.1至2.0。在上述OD值范围内具有适合发酵铁皮石斛的乳酸菌菌种数，当小于上述OD值范围时，不易发酵，当大于上述OD值范围时，存在pH及气味问题。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含根据上述本发明制备的铁皮石斛花发酵物作为有效成分的皮肤弹性、保湿或皮肤屏障强化用化妆品组合物。
在本发明中，提供如下皮肤弹性、保湿或皮肤屏障强化用化妆品组合物，其特征在于，优选地，包含上述铁皮石斛花发酵物0.001至1.0重量百分比。
在本发明中，提供如下皮肤弹性、保湿或皮肤屏障强化用化妆品组合物，其特征在于，优选地，增加I型胶原蛋白和弹性蛋白的表达，增强皮肤弹性。
在本发明中，提供如下皮肤弹性、保湿或皮肤屏障强化用化妆品组合物，其特征在于，优选地，上述组合物通过诱导皮肤中天然保湿因子(NMF，Natural MoisturizingFactors)的生成，填充皮肤内保湿感。
在本发明中，提供如下皮肤弹性、保湿或皮肤屏障强化用化妆品组合物，其特征在于，优选地，上述组合物通过强化紧密连接蛋白，强化皮肤屏障。
包含在本发明的化妆品组合物的成分除了作为有效成分的铁皮石斛花发酵物之外，还包含通常利用于化妆品组合物的成分，例如，可包含溶剂、稳定剂、增溶剂、乳化剂、维生素、颜料及香料之类的普通助剂及载体。
本发明的化妆品组合物的特征在于，其能够以该领域中通常制备的任何剂型制备，但优选地以选自由化妆水、营养乳液、营养霜、按摩霜、营养精华素、面膜、隔离霜、粉底、身体油、发油、洗发水、护发素组成的组中的剂型制备。与这种化妆品组合物的剂型例无关地，只要包含本发明的铁皮石斛花发酵物，就可发挥本发明的皮肤弹性、保湿或皮肤屏障强化效果。
以下，更具体说明本发明。
本发明人将使铁皮石斛，尤其铁皮石斛茎酶反应而得到的提取物作为天然培养基源制备使铁皮石斛花乳酸菌发酵的铁皮石斛花发酵物，利用该发酵物制备呈现皮肤弹性、保湿及皮肤屏障强化功效的化妆品组合物。
本发明人确认到相比于单纯用水提取的铁皮石斛花提取物或在乳酸菌发酵培养基中使铁皮石斛花乳酸菌发酵的发酵物，将使铁皮石斛茎酶反应而得到的提取物作为天然培养基使铁皮石斛花乳酸菌发酵的发酵物的皮肤改善功效卓越，确保利用在厌氧条件下确保特定菌数的菌液呈现最大的功效的生产工序。
根据本发明，相比于在非天然培养基的乳酸菌发酵培养基中进行乳酸菌培养来使铁皮石斛花发酵或用纯化水提取铁皮石斛花，呈现高的皮肤弹性改善、皮肤保湿及皮肤屏障强化效果，因而通过诱导I型胶原蛋白和弹性蛋白的表达来增强皮肤弹性，强化皮肤紧密连接蛋白使皮肤屏障变得结实，诱导皮肤中天然保湿因子的生成，由此可提供从皮肤内部填充保湿感的化妆品组合物。
附图说明
图1是为了比较评价实施例和比较例的皮肤弹性功效而测定I型胶原蛋白的表达量的图表。
图2是为了比较评价实施例和比较例的皮肤弹性功效而测定弹性蛋白的表达量的图表。
图3是为了比较评价实施例和比较例的皮肤保湿功效而测定透明质酸合成酶-2(HAS-2，Hyaluronic acid synthase-2)的表达量的图表。
图4是为了比较评价实施例和比较例的皮肤保湿功效而测定丝聚蛋白原(proFilaggrin)的表达量的图表。
图5是为了比较评价实施例和比较例的皮肤保湿功效而测定半胱天冬酶-14(caspase-14)的表达量的图表。
图6是为了比较评价实施例和比较例的皮肤屏障强化功效而测定密封蛋白(CLDN-1，Claudin-1)的表达量的图表。
图7是为了比较评价实施例和比较例的皮肤屏障强化功效而测定闭合蛋白(OCDN，Occludin)的表达量的图表。
具体实施方式
以下，通过实施例更详细说明本发明。这些实施例仅用于例示本发明，因而不被解释为本发明的范围局限于这些实施例。
实施例1.对铁皮石斛茎进行酶处理，制备天然培养基的步骤
在50℃的温度下利用纯化水10kg，将铁皮石斛(干燥、茎)粉末1kg、纤维素酶(Cellulase)TC 100g进行酶反应1天，以高温/高压处理条件结束酶反应之后过滤。将以固体成分最终达到1.0至10.0重量百分比的方式浓缩滤液而得的浓缩液作为铁皮石斛天然液体培养基。
实施例2.在实施例1中得到的天然培养基中接种/培养乳酸菌的步骤
在本发明中，培养增殖双歧杆菌(Bifidobacterium)。在MRS肉汤(Broth)培养基中接种韩国微生物保藏中心(KCCM)分发的冷冻干燥状态的双歧杆菌菌株之后，在10至50℃下培养3天至5天。洗涤上述菌种培养液之后，在对实施例1中得到的铁皮石斛茎进行酶处理来制备的天然培养基中添加上述菌种培养液使其达到50至80重量百分比，在10至50℃厌氧条件下进行乳酸菌发酵3天至5天。
实施例3.利用确保特定菌数的菌液来发酵铁皮石斛花的步骤
在600nm波长下，测定上述实施例2中得到的乳酸菌培养液的吸光度(AbsorbanceDensity)，其结果，OD以0.1至2.0为基准。
当OD数值为0.1至2.0时，相对于乳酸菌培养液重量，添加相当于1.0至10重量百分比的重量的铁皮石斛(干燥、灭菌)花粉碎物。在去除氧并填充氮的厌氧条件下，在30至40℃的静置培养条件下进行乳酸菌发酵1天至7天，利用乳酸菌得到铁皮石斛发酵提取物。
比较例1.通过实施例1至3得到的发酵物(A)、利用乳酸菌发酵培养基来发酵铁皮
石斛的发酵物(B)、利用纯化水提取的提取物(C)
A)通过实施例1至3制备铁皮石斛花发酵物。具体地，在50℃的温度下利用纯化水10kg，将铁皮石斛(干燥、茎)粉末1kg、纤维素酶TC 100g进行酶反应1天，以高温/高压处理条件结束酶反应之后过滤。将以固体成分达到0.1至10.0重量百分比的方式浓缩滤液而得的浓缩液作为天然培养基，接种培养双歧杆菌之后，相对于乳酸菌培养液，添加1.0至10重量百分比的铁皮石斛花，在厌氧条件下进行乳酸菌发酵2天。过滤发酵液之后浓缩，最终得到粉末45g。
B)由乳酸菌发酵培养基取代实施例1的天然培养基，使剩余实施例2、3相同，制备铁皮石斛花发酵物。具体地，在MRS肉汤培养基中接种韩国微生物保藏中心分发的冷冻干燥状态的双歧杆菌菌株之后，在10至50℃下培养3天至5天。相对于乳酸菌培养液量，添加1.0至10重量百分比的铁皮石斛花，在厌氧条件下进行乳酸菌发酵2天。过滤发酵液之后浓缩，最终得到粉末55g。
C)制备并非是实施例1、2、3的乳酸菌发酵的铁皮石斛花提取物。具体地，过滤在50℃条件下利用纯化水10kg提取1天铁皮石斛1kg来得到的提取液之后浓缩，最终得到铁皮石斛花提取物粉末120g。
比较例2.在天然培养基中培养菌株的培养液(A)和在乳酸菌发酵培养基中培养菌
株的培养液(B)
A)省略实施例3，仅制备实施例1、2的培养液。具体地，在50℃的温度下利用纯化水10kg，将铁皮石斛(干燥、茎)粉末1kg、纤维素酶TC 100g进行酶反应1天，以高温/高压处理条件结束酶反应之后过滤。将以固体成分达到0.1至10.0重量百分比的方式浓缩滤液而得的浓缩液作为天然培养基，接种双歧杆菌之后，在10至50℃的厌氧条件下进行乳酸菌发酵3天至5天。过滤发酵液之后浓缩，最终得到粉末41g。
B)省略实施例1、3，仅制备实施例2的培养液。具体地，在MRS肉汤培养基中接种韩国微生物保藏中心分发的冷冻干燥状态的双歧杆菌菌株之后，在10至50℃下培养3天至5天。过滤培养液之后浓缩，最终得到粉末16g。
<实验例1.皮肤弹性功效评价-I型胶原蛋白(Collagen Type I)和弹性蛋白表达的调查>
在本实验例中，为了确认上述实施例1至3和比较例1至2提取物的皮肤弹性功效，进行实时聚合酶链式反应(Real time PCR)。
在细胞板(Cell plate)中接种成纤维细胞(Fibroblast cell)培养24小时之后，将培养的细胞的培养基更换为无血清(serum free)培养基，将试样处理于细胞使其最终浓度达到50μg/ml，培养24小时。利用QIAzol◎裂解试剂(QIAzol Lysis Reagent)(Qiagen)聚集细胞，根据制造商的方法分离核糖核酸(RNA)。将分离的RNA定量之后，合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)，实施实时聚合酶链式反应(Real-Time PCR)。将其示于下列表1、图1、图2中。
表1
针对各个试样，确认I型胶原蛋白和弹性蛋白的表达的结果，确认到通过使I型胶原蛋白和弹性蛋白的基因表达明显增加，比较例1-A呈现最突出的皮肤弹性改善功效。
<实验例2.皮肤保湿功效评价-透明质酸合成酶-2(HAS-2)、天然保湿因子相关基因(丝聚蛋白原和半胱天冬酶-14)表达的调查>
在本实验例中，为了确认上述实施例1至3和比较例1至2提取物的皮肤保湿功效，进行实时聚合酶链式反应。
首先，为了确认对与皮肤内保湿及真皮的弹性相关的透明质酸的功效，在60mm板(plate)中接种成纤维细胞培养24小时之后，将培养的细胞的培养基更换为无血清(serumfree)培养基，将试样处理于细胞使其最终浓度达到50μg/ml，培养24小时。并且，为了确认对存在于皮肤内的天然保湿因子的功效，在60mm板中接种人正常角质形成细胞(Humannormal keratinocyte cell)培养24小时之后，将培养的细胞的培养基更换为无血清(serum free)培养基，将试样处理于细胞使其最终浓度达到250μg/ml，培养24小时。
利用QIAzol◎裂解试剂(Qiagen)聚集培养的细胞，根据制造商的方法分离RNA。将分离的RNA定量之后，合成cDNA，实施实时聚合酶链式反应。将其示于下列表2和图3、图4、图5中。
表2
针对各个试样，确认到透明质酸合成酶HAS-2和两种天然保湿因子(naturalmoisturizing factor)形成相关基因半胱天冬酶-14和丝聚蛋白原的表达。其结果，比较例1-A处理组对三种基因呈现最突出的功效。因此，在比较例1-A中确认到由皮肤内而外诱导透明质酸和天然保湿因子合成并由保湿因子填满，作为皮肤保湿原料具有卓越的功效。
<实验例3.皮肤屏障强化功效比较实验-皮肤屏障结构要素紧密连接蛋白相关基因(密封蛋白(CLDN-1)、闭合蛋白(OCDN))表达的确认>
在本实验例中，为了确认上述实施例1至3和比较例1至2提取物对作为皮肤屏障的结构成分中之一的对皮肤屏障功能起到非常重要的作用的紧密连接蛋白中CLDN-1和OCDN的功效，进行实时聚合酶链式反应。
在60mm板中接种人正常角质形成细胞培养24小时之后，将培养的细胞的培养基更换为无血清(serum free)培养基，将试样处理于细胞使其最终浓度达到250μg/ml，培养24小时。
利用QIAzol◎裂解试剂(Qiagen)聚集培养的细胞，根据制造商的方法分离RNA。将分离的RNA定量之后，合成cDNA，实施实时聚合酶链式反应。将其示于下列表3和图6、图7中。
表3
其结果，在比较例1-A处理组中，将CLDN-1和OCDN的表达量增加到最高，由此呈现突出的功效。因此，比较例1-A通过强化构成皮肤屏障的结构成分而被确认为对皮肤屏障功能呈现积极功效的原料。
参照上述实施例说明本发明，但其只不过是例示性的，只要是本发明所属技术领域的普通技术人员，就能理解能够从中实现多种变形及等同的其他实施例。因此，本发明的真正技术保护范围应根据所附的权利要求书的技术事项而定。
工作实用性
如上所述，根据本发明可提供比起市场上高价现有培养基组合物低廉，而且在皮肤组合物的制备及功效方面上也呈现卓越的效果的天然液体培养基。并且，包含利用以上的天然液体培养基进行乳酸菌发酵的铁皮石斛花发酵物的化妆品组合物，诱导I型胶原蛋白和弹性蛋白的表达来增强皮肤弹性，强化皮肤紧密连接蛋白，使皮肤屏障变得结实，诱导皮肤中天然保湿因子的生成，由此可提供从皮肤内部填充保湿感的化妆品组合物。
Claims (6)
1.一种铁皮石斛花发酵物的制备方法，其特征在于，包括：
步骤a)，对铁皮石斛茎进行酶处理，制备天然培养基；
步骤b)，在所述步骤a)中得到的天然培养基中接种及培养乳酸菌；以及
步骤c)，在所述步骤b)中，在乳酸菌培养液中添加铁皮石斛花而使其发酵；
在所述步骤a)中，所述酶为纤维素酶，在所述步骤b)中，所述乳酸菌为双歧杆菌，在所述步骤c)中，所述乳酸菌培养液的OD值为0.1至2.0。
2.一种皮肤弹性、保湿或皮肤屏障强化用化妆品组合物，其特征在于，包含根据权利要求1制备的铁皮石斛花发酵物作为有效成分。
3.根据权利要求2所述的皮肤弹性、保湿或皮肤屏障强化用化妆品组合物，其特征在于，包含所述铁皮石斛花发酵物0.001至1.0重量百分比。
4.根据权利要求2所述的皮肤弹性、保湿或皮肤屏障强化用化妆品组合物，其特征在于，所述组合物增加I型胶原蛋白和弹性蛋白的表达，增强皮肤弹性。
5.根据权利要求2所述的皮肤弹性、保湿或皮肤屏障强化用化妆品组合物，其特征在于，所述组合物通过诱导皮肤中天然保湿因子的生成，填充皮肤内保湿感。
6.根据权利要求2所述的皮肤弹性、保湿或皮肤屏障强化用化妆品组合物，其特征在于，所述组合物通过强化紧密连接蛋白，强化皮肤屏障。
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