CN115746127B - 一种x-聚松露蛋白组合物、x-聚松露蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及头皮护理技术领域，具体涉及一种X‑聚松露蛋白组合物、X‑聚松露蛋白及其制备方法和应用，该组合物中含有各自独立保存或者两者以上混合保存的以下组分：白松露提取物、β‑葡聚糖、纤连蛋白。本发明提供的X‑聚松露蛋白具有优异的抗氧化能力及保湿能力。

Description

一种X-聚松露蛋白组合物、X-聚松露蛋白及其制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及头皮护理技术领域，具体涉及一种X-聚松露蛋白组合物、X-聚松露蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

头皮作为头发生长的土壤，是人体第二薄皮肤，其衰老的速度是脸部肌肤的6倍，身体肌肤的12倍。头皮上密布70多个穴位，是人体最重要的神经元聚集地之一。

健康的头皮不干燥，皮脂分泌正常，有正常的微生物生态环境。现代人通常工作压力大、生活饮食不规律，环境污染严重，加之各种染发、烫发带来的化学品侵扰，在不知不觉中破坏了头皮环境，产生了血液循环不畅、头皮干燥、毛孔堵塞、皮脂过剩、头皮屑、头皮瘙痒、脱发等各种问题。为了保持秀发的光彩，拥有健康的头皮显得更加重要和迫切。

目前，人们对头皮护理的观念还比较淡薄，对于头皮的护理还是以清洁为主，在清洁头皮的同时会引入一些具有去屑、杀菌功效的活性物，起到杀菌、去屑、止痒、控油等功效，但事实上头皮的护理更应该是提前预防，增加头皮抵抗力，而不是等到头皮出现症状以后再去补救。

同时，头皮的结构虽然与脸部皮肤一样，包含了毛孔、毛囊和皮脂腺，但是相比脸部皮肤，头皮的毛孔更大，毛囊密度更高，皮脂腺密度更为丰富，皮脂分泌更旺盛，同时也是人体最顶层的皮肤，是抵抗紫外光损害最关键的天然屏障，因此，头皮的护理非常重要，维稳头皮屏障功能尤其重要。

此外，由于头皮毛囊密度高，毛发覆盖导致头皮的清洁较脸部皮肤更困难；而头皮毛孔大，也更容易藏污纳垢被堵塞，因此，头皮的护理不适合选用用于脸部皮肤护理的高油脂含量的膏霜。用于脸部皮肤护理的膏霜用于头皮护理，容易导致毛囊堵塞，并且容易滋生细菌、真菌等微生物感染，引发毛囊炎等炎症反应，不利于头皮健康。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺陷，提供一种能够用于头皮护理的X-聚松露蛋白组合物和X-聚松露蛋白。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种X-聚松露蛋白组合物，该组合物中含有各自独立保存或者两者以上混合保存的以下组分：白松露提取物、β-葡聚糖、纤连蛋白；

相对于100重量份的所述组合物，所述白松露提取物的含量为90-97重量份，所述β-葡聚糖的含量为2-8重量份，所述纤连蛋白的含量为1-2重量份；

其中，所述β-葡聚糖由蘑菇提供，所述β-葡聚糖的重均分子量为200万-250万道尔顿；所述纤连蛋白的重均分子量为3万-5万道尔顿。

本发明第二方面提供一种制备X-聚松露蛋白的方法，该方法包括：

将前述第一方面所述的组合物中的各组分进行混合；所述混合的操作包括以下步骤：

(1)将白松露提取物与β-葡聚糖进行混合I，得到产物A；

(2)将所述产物A与纤连蛋白进行混合II，得到所述X-聚松露蛋白。

本发明第三方面提供由前述第二方面所述的方法制备得到的X-聚松露蛋白。

本发明第四方面提供前述第三方面所述的X-聚松露蛋白在头皮护理中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的X-聚松露蛋白至少具有如下优势：

本发明提供的X-聚松露蛋白具有优异的抗氧化能力以及保护性，能够调节头皮油脂分泌，帮助头皮有效保湿。

本发明的其它特征和优点将通过随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

需要说明的是，在本发明的各方面中，针对各方面中的相同的组分，本发明仅在其中一方面中描述一次而不重复进行描述，本领域技术人员不应理解为对本发明的限制。

如前所述，本发明的第一方面提供了一种X-聚松露蛋白组合物，该组合物中含有各自独立保存或者两者以上混合保存的以下组分：白松露提取物、β-葡聚糖、纤连蛋白；

相对于100重量份的所述组合物，所述白松露提取物的含量为90-97重量份，所述β-葡聚糖的含量为2-8重量份，所述纤连蛋白的含量为1-2重量份；

其中，所述β-葡聚糖由蘑菇提供，所述β-葡聚糖的重均分子量为200万-250万道尔顿；所述纤连蛋白的重均分子量为3万-5万道尔顿。

本发明中，所述蘑菇是指食用真菌，示例性地可以为松茸、双孢菇、平菇、香菇。

优选地，所述白松露提取物为由包括以下步骤的方法制备得到的白松露提取物：

将平均粒径为100-500μm、含水量为15-25质量％的白松露颗粒与水混合20-28h，温度为20-30℃，得到混合物I；

将所述混合物I进行过滤，将得到的滤液与酶催化剂进行酶水解反应，得到所述白松露提取物。

优选地，所述白松露与所述水的固液比为1g：90-110mL；

所述酶催化剂选自果胶酶、纤维素酶中的至少一种；

所述酶水解反应的条件至少满足：温度为60-90℃，时间为2-4h。

优选地，所述β-葡聚糖为由包括以下步骤的方法制备得到的β-葡聚糖：

将平均粒径为100-500μm、含水量为25-35质量％的蘑菇颗粒与水混合20-28h，温度为20-30℃，得到混合物II；

将所述混合物II进行过滤，将得到的滤液与发酵菌种混合，依次进行发酵、提取，得到所述β-葡聚糖。

优选地，所述蘑菇与所述水的固液比为1g：45-55mL；

所述发酵菌种选自酵母菌、乳酸菌中的至少一种。

优选地，所述蘑菇为松茸。

优选地，所述发酵的条件至少满足：温度为20-40℃，时间为24-48h；

所述提取的条件至少满足：温度为20-40℃，时间为8-12h。

优选地，所述纤连蛋白为由包括以下步骤的方法制备得到的纤连蛋白：

将重组表达载体接入大肠杆菌表达菌株，得到所述纤连蛋白；所述重组表达载体为重组纤连蛋白基因表达载体。

本发明中，先通过分子生物学技术构建重组纤连蛋白基因表达载体，再在大肠杆菌细胞中可溶性表达重组纤连蛋白。

如前所述，本发明的第二方面提供了一种制备X-聚松露蛋白的方法，该方法包括：

将前述第一方面所述的组合物中的各组分进行混合；所述混合的操作包括以下步骤：

(1)将白松露提取物与β-葡聚糖进行混合I，得到产物A；

(2)将所述产物A与纤连蛋白进行混合II，得到所述X-聚松露蛋白。

优选地，所述混合I的条件至少满足：温度为20-40℃，时间为0.5-1h，搅拌转速为20-30rpm；

所述混合II的条件至少满足：温度为20-40℃，时间为0.5-1h，搅拌转速为20-30rpm。

根据一种特别优选的具体实施方式，将所述组合物中的各组分进行混合的操作包括以下步骤：

(1)将所述白松露提取物与所述β-葡聚糖在20-40℃、20-30rpm下搅拌混合0.5-1h，得到产物A；

(2)将所述产物A与所述纤连蛋白在20-40℃、20-30rpm下搅拌混合0.5-1h，得到所述X-聚松露蛋白。

在该优选的实施方式下，发明人发现能够获得抗氧化、保湿效果更好的X-聚松露蛋白。

如前所述，本发明的第三方面提供了由前述第二方面所述的方法制备得到的X-聚松露蛋白。

如前所述，本发明的第四方面提供了前述第三方面所述的X-聚松露蛋白在头皮护理中的应用。

优选地，所述应用为X-聚松露蛋白在头皮护理精华产品中的应用。

以下将通过实例对本发明进行详细描述。

以下实例中，在没有特别说明的情况下，涉及到的实验仪器和原料均为市售品。

原料

白松露：衢州市展宏生物科技有限公司；

酶催化剂：果胶酶，S10007，上海源叶生物科技有限公司；

松茸：韩国百朗德公司；

发酵菌种：酿酒酵母，复合功能菌Q3/G3/N3，安琪酵母公司；

大肠杆菌：BL21，暨南大学。

以下实例中的组分用量均以重量份表示。在没有特别说明的情况下，每重量份为1g。

制备例1

按照如下所述的方法制备白松露提取物A1，该方法包括以下步骤：

将1g白松露进行粉碎，得到平均粒径为300μm的白松露颗粒，在25℃下于水中浸泡24h，得到混合物I，所述白松露与所述水的固液比为1g：95mL；

将所述混合物I进行过滤，将得到的滤液与酶催化剂果胶酶在80℃下进行酶水解反应3h，得到所述白松露提取物A1。

制备例2

按照如下所述的方法制备β-葡聚糖B1，该方法包括以下步骤：

将1g松茸进行粉碎，得到平均粒径为300μm的松茸颗粒，在25℃下与水混合24h，得到混合物II，所述松茸与所述水的固液比为1g：48mL；

将所述混合物II进行过滤，将得到的滤液与发酵菌种酿酒酵母混合，在30℃下进行发酵36h，再在30℃下进行提取10h，得到所述β-葡聚糖B1。

制备例3

按照CN103255151A和CN101705241A公开的方法制备纤连蛋白C1，具体步骤如下：

(1)设计如下引物：

F-suma(SEQ ID NO:1)：

5’-GGAATTCCATATGGGCATGTCGGACTCAGAAGTC-3’；

R-CVN(SEQ ID NO:2)：

5’-

TTCCGCGGCCGCTATGGCCGACGTCGACTTCGTATTTCAGGGTACCGTC-3’；

F1-mutant(SEQ ID NO:3)：

5’-

GACGACCACATCGCTAACAGACGGTACACTAAAATACGAATGATGAGTCGAC-3’；

R1-mutant(SEQ ID NO:4)：

5’-

GTCGACTCATCATTCGTATTTTAGTGTACCGTCTATGTTAGCGATGTGGTCGTC-3’；

F2-mutant(SEQ ID NO:5)：

5’-

GTTTCTACCAAAATCAACCTAGACGACCATATAGCTAACATCGACGGTAC-3’；

R2-mutant(SEQ ID NO:6)：

5’-

GTACCGTCGATATTAGCTATATGGTCGTCTAGGTTGATTTTGGTAGAAAC-3’；

(2)第一次PCR扩增：

以pET-3c-SUMA-CVN质粒为模板，以F-suma/R-CVN为引物进行扩增，得到的PCR产物纯化后使用NdeI和SalI双酶切，将双酶切后的PCR产物与经过NdeI和SalI双酶切的载体pET-28b链接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选，得到重组载体pET-28b-CVN；

(3)第二次PCR扩增：

以pET-28b-CVN为PCR扩增模板，F1-mutant/R1-mutant为引物进行PCR扩增，得到的PCR产物纯化经DpnI酶切，cycle pure Kit试剂盒纯化的酶切产物直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选，得到重组载体pET-28b-CVN-M1；

(4)第三次PCR扩增：

以pET-28b-CVN-M1为PCR扩增模板，F2-mutant/R2-mutant为引物进行PCR扩增，得到的PCR产物纯化经DpnI酶切，cycle pure Kit试剂盒纯化的酶切产物直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选，得到重组载体pET-28b-CVN-M2；

(5)诱导表达：

将重组载体pET-28b-CVN-M1或pET-28b-CVN-M2转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达菌株；接着使用含有卡拉霉素的LB培养基对该表达菌株于37℃，180-200rpm的条件下进行培养，在OD600＝0.8时，加入IPTG，IPTG的终浓度为1mM，37℃诱导表达4h后，收集菌体；

(6)纯化：

将菌体沉淀按体积比1:10比例重新悬浮于NTA-10缓冲液后对菌体进行破碎，离心，收集上清，上清上样Ni-NTA亲和层析柱中，首先使用NTA-10缓冲液洗回基线，再用NTA-40缓冲液洗杂蛋白，最后用NTA-20缓冲液洗脱，得到目的蛋白CVN突变体。

实施例1

按照如下所述的方法制备X-聚松露蛋白S1，该方法包括以下步骤：

(1)将白松露提取物A1与β-葡聚糖B1在30℃、25rpm下搅拌混合1h，得到产物A；

(2)将所述产物A与纤连蛋白C1在30℃、25rpm下搅拌混合1h，得到X-聚松露蛋白S1；

其中，白松露提取物A1的用量为95重量份，β-葡聚糖B1的用量为4重量份，纤连蛋白C1的用量为1重量份。

实施例2

按照如下所述的方法制备X-聚松露蛋白S2，该方法包括以下步骤：

(1)将白松露提取物A1与β-葡聚糖B1在40℃、30rpm下搅拌混合1h，得到产物A；

(2)将所述产物A与纤连蛋白C1在40℃、30rpm下搅拌混合1h，得到X-聚松露蛋白S2；

其中，白松露提取物A1的用量为93重量份，β-葡聚糖B1的用量为5重量份，纤连蛋白C1的用量为2重量份。

对比例1

本对比例采用与实施例1相似的步骤进行，所不同的是：白松露提取物A1的用量为70重量份，β-葡聚糖B1的用量为20重量份，纤连蛋白C1的用量为10重量份；得到X-聚松露蛋白DS1。

对比例2

本对比例采用与实施例1相似的步骤进行，所不同的是：白松露提取物A1的用量为80重量份，β-葡聚糖B1的用量为20重量份，配方中不含有纤连蛋白C1；得到X-聚松露蛋白DS2。

对比例3

本对比例采用与实施例1相似的步骤进行，所不同的是：白松露提取物A1的用量为90重量份，纤连蛋白C1的用量为10重量份，配方中不含有β-葡聚糖B1；得到X-聚松露蛋白DS3。

测试例1

抗氧化能力测试

采用清除DPPH法进行抗氧化能力测试，具体步骤如下：

在反应管中加入2mL的浓度为0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液，再加入2mL的待测样品，混合均匀，室温避光反应30min后在517nm处读取吸光度，为实验组，同时以2mL的DPPH乙醇溶液+2mL缓冲溶液混合后的吸光度为对照组，2mL双蒸水+2mL乙醇混合后的吸光度为正常组，通过以下公式计算DPPH清除率：

DPPH清除率％＝[1－(实验组A517－正常组A517)/对照组A517]×100％。

测定结果见表1。

测试例2

经表皮失水率(TEWL)测试

经表皮失水率(TEWL)和皮肤水分含量数据由德国CK公司的皮肤水分流失测试仪Tewameter TM300搭配头皮水分流失测试探头Tewameter TM Nano测得。

选取年龄在18-40岁志愿者共50名，随机分为10组，每组5人，在受试者头顶头皮选取1个测试点，并采用定位膜记录测试点位置；

通过Tewameter TM Nano测定使用前的TEWL值，记为D0；测定使用后的第14天和第28天的TEWL值，记为D14和D28，每个测试点的TEWL值取平均值。测定结果见表1。

测试例3

体外称重法保湿性能测试

分别称取上述实例制备所得的样品0.2g，均匀涂敷在贴有微孔通气胶带的5cm×5cm的玻璃板上，并将玻璃板放入恒温恒湿的干燥器中，分别称量玻璃板放置2h、4h后的质量，通过以下公式计算保湿率：

保湿率％＝(M₂－M₀)/(M₁－M₀)×100％，

其中，M₀为玻璃板质量(g)，M₁为加样后玻璃板质量(g)，M₂为干燥器中放置若干小时后玻璃板质量(g)。

测定结果见表1。

表1

从以上结果可以看出，本发明提供的X-聚松露蛋白具有优异的抗氧化能力及保湿能力。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种X-聚松露蛋白组合物，其特征在于，该组合物中混合以下组分：白松露提取物、β-葡聚糖、纤连蛋白；

相对于100重量份的所述组合物，所述白松露提取物的含量为93-95重量份，所述β-葡聚糖的含量为4-5重量份，所述纤连蛋白的含量为1-2重量份；

其中，所述β-葡聚糖由蘑菇提供，所述β-葡聚糖的重均分子量为200万-250万道尔顿；所述纤连蛋白的重均分子量为3万-5万道尔顿；

所述白松露提取物为由包括以下步骤的方法制备得到的白松露提取物：

将平均粒径为100-500μm、含水量为15-25质量%的白松露颗粒与水混合20-28h，得到混合物I；将所述混合物I进行过滤，将得到的滤液与酶催化剂进行酶水解反应；所述白松露颗粒与所述水的固液比为1g：90-110mL；所述酶催化剂选自果胶酶；所述酶水解反应的条件至少满足：温度为60-90℃，时间为2-4h；得到所述白松露提取物。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述β-葡聚糖为由包括以下步骤的方法制备得到的β-葡聚糖：

将平均粒径为100-500μm、含水量为25-35质量%的蘑菇颗粒与水混合20-28h，得到混合物II；

将所述混合物II进行过滤，将得到的滤液与发酵菌种混合，依次进行发酵、提取，得到所述β-葡聚糖。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述蘑菇颗粒与所述水的固液比为1g：45-55mL；

所述发酵菌种选自酵母菌、乳酸菌中的至少一种。

4.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述蘑菇为松茸。

5.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述发酵的条件至少满足：温度为20-40℃，时间为24-48h；

所述提取的条件至少满足：温度为20-40℃，时间为8-12h。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述纤连蛋白为由包括以下步骤的方法制备得到的纤连蛋白：

将重组表达载体接入大肠杆菌表达菌株，得到所述纤连蛋白；所述重组表达载体为重组纤连蛋白基因表达载体。

7.一种制备权利要求1-6中任意一项所述的X-聚松露蛋白组合物的方法，其特征在于，该方法包括：

将权利要求1-6中任意一项所述的组合物中的各组分进行混合；所述混合的操作包括以下步骤：

（1）将白松露提取物与β-葡聚糖进行混合I，得到产物A；

（2）将所述产物A与纤连蛋白进行混合II，得到所述X-聚松露蛋白组合物；

所述混合II的条件至少满足：温度为20-40℃，时间为0.5-1h，搅拌转速为20-30rpm。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述混合I的条件至少满足：温度为20-40℃，时间为0.5-1h，搅拌转速为20-30rpm。

9.由权利要求7或8所述的方法制备得到的X-聚松露蛋白组合物。

10.权利要求9所述的X-聚松露蛋白组合物在头皮护理中的应用。