CN112980704B - 一种用于制备天然香气发酵大米滤液的酵母菌及其应用 - Google Patents

一种用于制备天然香气发酵大米滤液的酵母菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于制备天然香气发酵大米滤液的酵母菌及其应用，酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera)CGMCC No：21316，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No：21316。该菌种具有较高的淀粉酶和蛋白酶活性，并且在复筛时表现出较高的酪氨酸酶抑制活性。该菌发酵大米，得到的发酵后大米滤液的香气化合物种类增多，含量升高，明显加强了发酵后大米滤液的花果香气，使得发酵大米滤液香气更加丰富，令人愉悦。

Description

一种用于制备天然香气发酵大米滤液的酵母菌及其应用
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体涉及到一种用于制备天然香气发酵大米滤液的酵母菌及其应用。
背景技术
发酵，指人们借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身、或者直接代谢产物或次级代谢产物的过程。原料是发酵的一个重要因素，不同原料的成分会赋予发酵产品不同的特色。大米是我国大部分地区人民的主食，其营养丰富，富含碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素B等。
因此，其也被广泛用作发酵原料，应用于食品、化工等领域，在化妆品领域，大米发酵产品具有美白、保湿、抗氧化等热门功效。菌种也是发酵的一个重要因素，菌种在满足安全性外，还需要具有较强的、较丰富的酶系，可以全面的分解利用原料的营养，转化为目的产物，提高原料的利用率。但是目前，用于大米发酵的大部分菌种产生的发酵香气并不十分愉悦。
因此，本领域亟需一种能产生愉悦发酵香气菌种，同时还可以产生天然香气，减少化妆品对皮肤的刺激。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种用于制备发酵天然香气的得大米滤液的酵母。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：酵母菌 (Saccharomycopsisfibuligera)CGMCC No：21316，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No：21316。
本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera)CGMCC No：21316在制备大米发酵滤液中的应用。
作为本发明所述的酵母菌在制备大米发酵滤液中的应用的一种优选方案，其中：所述制备大米发酵滤液，包括，将添加2～3％的大米粉，1％葡萄糖的发酵培养基于121℃灭菌20min；灭菌后接种3％～5％的酵母菌液，然后于30℃条件下发酵24h，pH控制在6.0～6.5；发酵完成后，先将发酵液进行离心去除菌体，然后再将滤液经200nm的陶瓷膜进行过滤，得到具有天然香气的大米滤液。
作为本发明所述的酵母菌在制备大米发酵滤液中的应用的一种优选方案，其中：所述大米发酵滤液，香气化合物种类增多，含量升高，加强了发酵后大米滤液的花果香气，使得发酵大米滤液香气更加丰富，令人愉悦。
作为本发明所述的酵母菌在制备大米发酵滤液中的应用的一种优选方案，其中：所述大米发酵滤液，对弹性蛋白酶的抑制效果强，用来做改善皮肤皱纹的产品添加剂。
作为本发明所述的酵母菌在制备大米发酵滤液中的应用的一种优选方案，其中：所述大米发酵滤液对胶原蛋白抑制活性强，用来做改善皮肤皱纹的产品添加剂。
作为本发明所述的酵母菌在制备大米发酵滤液中的应用的一种优选方案，其中：所述发酵后大米滤液的酪氨酸酶抑制活性较发酵前得到提高。
作为本发明所述的酵母菌在制备大米发酵滤液中的应用的一种优选方案，其中：所述发酵后大米滤液能够增强大米滤液的抗UVB，对角质细胞具有保护作用。
作为本发明所述的酵母菌在制备大米发酵滤液中的应用的一种优选方案，其中：所述发酵后大米滤液能够增强大米对损伤细胞的修复作用。
作为本发明所述的酵母菌在制备大米发酵滤液中的应用的一种优选方案，其中：所述发酵后大米滤液提高了大米滤液的保湿效果。
本发明有益效果：
本发明筛选出一株酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera)CGMCC No：21316，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No：21316，该菌种具有较高的淀粉酶和蛋白酶活性，并且在复筛时表现出较高的酪氨酸酶抑制活性。该菌发酵大米，得到的发酵后大米滤液的香气化合物种类增多，含量升高，明显加强了发酵后大米滤液的花果香气，使得发酵大米滤液香气更加丰富，令人愉悦。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明实施例中发酵前后大米滤液中的氨基酸含量对比图。
图2为本发明实施例中发酵前后的大米滤液对弹性蛋白的抑制效果对比图。
图3为本发明实施例中发酵前后的大米滤液对胶原蛋白酶的抑制效果对比图。
图4为本发明实施例中发酵前后的大米滤液对酪氨酸酶抑制活性效果对比图。
图5为本发明实施例中发酵前后的大米滤液抗UVB效果对比图。
图6为本发明实施例中发酵前后的大米滤液对损伤细胞的修复作用对比图。
图7为本发明实施例中发酵前后的大米滤液对皮肤角质层水分含量对比图。
图8为本发明实施例中发酵前后的大米滤液对皮水分流失效果对比图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。本发明的扣囊复膜孢酵母Saccharomycopsis fibuligera，于2020年12月7日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为 CGMCC No：21316，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例1
1.发酵培养基的制备
将大米用粉碎机进行粉碎后过100目筛，制成大米粉。发酵培养基(大米粉2-3％，葡萄糖1％)高压蒸汽121℃，灭菌20min，待用。
2.目标菌株的获取：
2.1高酶活菌株的筛选
将菌株接种于YPD培养基(酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％，琼脂 2％)于30℃，培养24h。然后将活化的菌株对应接入淀粉酶筛选培养基(淀粉1％，牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，氯化钠5％，琼脂1.5％，1.5％脱脂奶粉)、蛋白酶筛选培养基(牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，氯化钠5％，琼脂1.5％)中筛选具有淀粉酶、蛋白酶活性的菌株，将出现透明圈的菌株选出，然后通过计算确定各菌株的酶活力。
2.2酪氨酸抑制活性菌株的筛选
将2.1筛选出的菌株接种到添加有多巴胺的大米培养基中，筛选具有酪氨酸抑制活性的菌株。
2.3产香菌株的筛选
在2.2筛选的基础上剔除产生不愉悦发酵香气的菌株。
3.目标菌株的诱变
3.1紫外诱变
将2.3中菌株接种到含10ml YPD液体培养基及磁力搅拌转子的50ml三角瓶中，并置于功率为15W、波长253nm、照射距离30cm的紫外灯下诱变处理30s，将诱变菌液再次涂布到YPD培养基上。培养1～2天，然后重复2.1-2.3 中的筛选步骤。
3.2摇瓶复筛
将3.1中筛选出的菌株接种到1(发酵培养基)中的培养基，于30℃培养 24h。筛选香气最为丰富的菌株，并将发酵液离心后测定其护肤活性。
本发明最终在所有的菌株中筛选出酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera)CGMCC No：21316，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No：21316，该菌种具有较高的淀粉酶和蛋白酶活性，并且表现出较高的酪氨酸酶抑制活性。
将添加2-3％的大米粉，1％的葡萄糖发酵培养基于121℃灭菌20min；灭菌后接种3％-5％的目标酵母菌液，然后于30℃，发酵24h，pH控制在6.0-6.5。发酵完成后，先将发酵液进行离心去除菌体，然后再将滤液经200nm的陶瓷膜进行过滤，滤液为具有天然香气的大米滤液。
其发酵大米滤液特性如下：
氨基酸含量检测：
使用Waters H-Class超高效液相色谱仪，测定发酵前后大米滤液中的氨基酸含量，结果见图1。
可以看出，经过发酵后大米滤液氨基酸含量明显增加，小分子的氨基酸可以滋养皮肤，使皮肤光滑，提升皮肤含水量。
实施例2
将添加3％的大米粉，1％的葡萄糖发酵培养基于121℃灭菌20min；灭菌后依次接种5％(种子液与发酵培养基的体积比)的本发明制得的酵母菌(Saccharomycopsisfibuligera)CGMCC No：21316菌液、菌种1和菌种2菌液，然后于30℃，发酵24h，pH控制在6.0-6.5；
发酵完成后，先将发酵液进行离心去除菌体，然后再将滤液经200nm的陶瓷膜进行过滤，得滤液，依次进行挥发性香气化合物测定。
其中，本发明制得的酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera)CGMCC No：21316 菌液的制备工艺为：将本酵母菌接种到200ml的YPD培养基中，待菌悬液浓度达到1×108CFU/mL时，以4℃，5000r/min离心十分钟，弃上清液，并使用无菌水洗涤沉淀菌体2次，后加入100ml无菌水，配置成种子液待用。
菌种1菌液的制备工艺为：菌种1为乳杆菌(Lactobacilus plantarum)CICC No：24202，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心；将本酵母菌接种到200ml 的YPD培养基中，待菌悬液浓度达到1×108CFU/mL时，以4℃，5000r/min 离心十分钟，弃上清液，并使用无菌水洗涤沉淀菌体2次，后加入100ml无菌水，配置成种子液待用。
菌种2菌液的制备工艺为：菌种2为另一株酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)CICC No：1210，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心；将本酵母菌接种到200ml的YPD培养基中，待菌悬液浓度达到1×108CFU/mL时，以4℃， 5000r/min离心十分钟，弃上清液，并使用无菌水洗涤沉淀菌体2次，后加入 100ml无菌水，配置成种子液待用。
使用Agilent 6890气相色谱对发酵前后大米滤液中挥发性香气化合物进行测定。测定结果，见表1。
表1大米滤液香气化合物种类及含量
Figure RE-GDA0003062412380000061
通过测定发酵前后滤液中挥发性香气化合物发现，经过发酵后大米滤液的香气化合物种类增多，含量升高。表1中展示了发酵前后含量增加的果香味化合物，这些化合物的增加，明显加强了发酵后大米滤液的花果香气，使得发酵大米滤液香气更加丰富，令人愉悦。
实施例3
(1)弹性蛋白酶抑制活性
方法：弹性蛋白酶底物为meosuc-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide,缓冲体系为含0.1M三羟甲基氨基甲烷的0.5M氯化钠溶液(pH＝7.5)。以等体积的弹性蛋白酶(E.C.-3.4.21.36，终浓度4.5μM)与抑制剂溶液(6μL)混合,37℃保温 5min,加入200μL底物溶液(浓度0.02M),37℃保温1h。用8.0M的醋酸溶液终止反应,采用分光光度法测定被分解出的p-nitroanilide在405nm处的吸光度值。抑制剂对弹性蛋白酶的抑制活性经计算求得(n＝3)。
抑制率(100％)＝[1-(测试-空白)/(对照-空白)]，空白用缓冲液代替。
结果见图2。可以看出，分别在浓度10％、20％、40％下，发酵前的大米滤液对弹性蛋白的抑制效果微弱或无，但发酵后大米滤液可提升对弹性蛋白酶的抑制效果，其抑制率分别为22.82％，43.15％，79.00％。因此可以说明发酵后的大米滤液可用来做改善皮肤皱纹的产品添加剂来使用。
(2)胶原蛋白抑制活性
方法：胶原蛋白酶底物为N-[3-(2-furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala(FALGPA),缓冲体系为含400mM氯化钠和10mM的氯化钙溶液(pH＝7.5)。
以胶原蛋白酶(E.C.-3.4.23.3；终浓度0.8units/mL；50μL)与抑制剂溶液(50 μL)混合,37℃保温5min,加入100μL底物溶液(浓度0.8mM),37℃保温20 min。采用分光光度法在335nm处的测定其吸光度值。抑制剂对胶原蛋白酶的抑制活性经计算求得(n＝3)。
抑制率(100％)＝[1-(测试-空白)/(对照-空白)]，空白用缓冲液代替。
结果见图3。结论：分别在浓度10％、20％、40％下，发酵前无胶原蛋白的抑制效果，但发酵后可提升对胶原蛋白酶的抑制效果，其抑制率分别为13.47％， 30.86％，33.42％。其效果在20％以上可达到酶促反应的最高值，因此可以说明发酵后的大米滤液可用来做改善皮肤皱纹的产品添加剂来使用。
(3)酪氨酸酶抑制活性：
1)缓冲溶液：80mM PBS；pH＝6.8
2)6.0mM L-DOPA(M.W.197.2，L-多巴)：精确称取7.1mg L-DOPA溶于 50μL的1.0MHCl，然后用PBS补充至6.0mL。
3)250U/mL酪氨酸酶：酪氨酸酶用PBS配置成浓度为250U/mL.
方法：样品组(50μL PBS、20μL样品和50μL酪氨酸酶依次加到96孔板中)空白组(100μL PBS和20μL样品)于室温下放置10min，加入50μL L-DOPA，反应15min，于475nm处检测吸光度。
计算：Inhibition％＝[1-(As-Asb)/(Ac-Acb)]×100
结果见图4。
结论：发酵后大米滤液的酪氨酸酶抑制活性较发酵前得到提高，其中在 40％浓度下，发酵前和发酵后的酪氨酸酶抑制率分别为63.30％和84.91％，因此发酵提高了大米滤液的酪氨酸酶抑制活性，增强美白作用。
实施例4
UVB损伤的保护作用
仪器
Scientz03-II紫外交联仪
实验方法
接种：HaCaT细胞按照1.5×105个/mL接种到96孔板，每孔加入100μL，于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。
加样：去培养基，并用PBS洗3次。向每孔加入100μL DMEM配置的样品，于培养箱中培养6h。
UV损伤：去培养液，用PBS洗3次。向每孔加入100μL PBS，UVB(312 nm)照射8min或UVA(365nm)照射70min。去PBS并加100μL DMEM，于培养箱中放16～18h。
对照组：细胞不进行处理；
阴性对照：未处理细胞进行光照损伤；
样品组：细胞样品孵育后进行光照损伤。
细胞活力检测：去DMEM，每孔加入150μL浓度为0.5mg/mL的MTT溶液(DMEM配置)。培养箱中放置4h后，吸去溶液并加入100μL DMSO，于 490nm下测吸光度。
结果见图5。结论：发酵前的大米滤液在10％和20％的浓度下具有防护UVB 损伤的显著作用，细胞存活率分别为55.25％和59.78％(阳性对照组为46.23％)，浓度为2.5％、5％、10％和20％的大米滤液都具有显著的UVB损伤防护作用，细胞存活率分别为55.80％、61.91％、71.45％和78.65％。
因此发酵能够增强大米滤液的抗UVB，从而对角质细胞具有一定的保护作用。
实施例5
UVB损伤的修复作用
仪器
Scientz03-II紫外交联仪
实验方法
接种：HaCaT细胞按照1.5×105个/mL接种到96孔板，每孔加入100μL，于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。
UV损伤：去培养液，用PBS洗3次。向每孔加入100μL PBS，UVB(312 nm)照射8min或UVA(365nm)照射70min。
加样：去培养基，并用PBS洗3次。向每孔加入100μLDMEM配置的样品，于培养箱中培养16～18h。
对照组：细胞不进行处理；
阴性对照：未处理细胞进行光照损伤；
样品组：细胞光照损伤后进行样品孵育。
细胞活力检测：去培养液，PBS洗3次，每孔加入150μL浓度为0.5mg/mL 的MTT溶液(DMEM配置)。培养箱中放置4h后，吸去溶液并加入100μL DMSO，于490nm下测吸光度。
结果见图6。结论：UVB损伤后，发酵前的大米滤液不具有修复作用；浓度为5％、10％和20％的大米滤液显著提高了HaCaT细胞在UVB损伤后的存活率，分别为56.86％、61.48％和67.36％。因此发酵能够增强大米对损伤细胞的修复作用。
实施例6
保湿测定
方法：检测人员在合格的斑试器中加入3％SLS水溶液(用量：0.020g-0.025g), 帖敷于受试者前臂屈侧(3×3cm)，24小时去除斑试器。去除斑试器后、涂用样品后2小时、连续使用样品后1、2、3天时进行皮肤角质层水分含量、皮肤经皮水分流失检测，数据记为0h、2h、1d、2d、3d。
计算：
角质层含水量提升率＝(Wn-W0)/W0*100
W0为0h的含水量，Wn为n h的含水量。
TEWL减少值＝(T0-Tn)/T0*100
TEWL：经皮失水，Trans-epidermal Water Loss
样品使用方法：每天使用2次。
志愿者：30人
结果见图7和图8。结论：使用大米发酵滤液后的角质层含水量提升率相比发酵前大米更高，TEWL减少值更低，因此认为发酵提高了大米滤液的保湿效果。
目前用于大米发酵液的菌种有乳酸菌(CN110623899A、CN111437235A、CN111358735A)、出芽短梗霉(CN105379824A)、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌混合(CN 110484569 A)、臭氧化酵母菌与枯草芽孢杆菌组合形成酒曲(CN110812302A)、蝉棒束孢(CN111494273A)，但是针对无添加大米发酵滤液功效只有保湿与酪氨酸酶抑制两个功效，其中 CN111358735A与熊果苷对比酪氨酸还原法结果为24.72±1.22％， CN105379824A中酪氨酸酶抑制率39.3％，CN111494273A中酪氨酸酶抑制率在2.85mg/ml时最高为89.07％，而本发明中酪氨酸酶抑制率在40％浓度下为 84.91％，本发酵液在酪氨酸酶抑制活性有很优异的表现。
本发明筛选出一株酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera)CGMCC No：21316，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No：21316，该菌种具有较高的淀粉酶和蛋白酶活性，并且在复筛时表现出较高的酪氨酸酶抑制活性。该菌发酵大米，得到的发酵后大米滤液的香气化合物种类增多，含量升高，明显加强了发酵后大米滤液的花果香气，使得发酵大米滤液香气更加丰富，令人愉悦。
普通酵母菌产淀粉酶、蛋白酶能力较差，本发明根据大米的营养成分的组成，需要筛选同时具有淀粉酶、蛋白酶活力的菌种，并且发酵香气作为另一个重要的筛选依据，已经将部分酵母菌淘汰。为了确保底物成分的更高效的利用，采用紫外诱变对菌种进行诱变，筛选出产淀粉酶、蛋白酶能力更强的菌种。通过本发明酵母菌发酵的大米发酵滤液，对弹性蛋白酶的抑制效果强，可用来做改善皮肤皱纹的产品添加剂；对胶原蛋白抑制活性强，可用来做改善皮肤皱纹的产品添加剂；对酪氨酸酶抑制活性较发酵前得到提高、能够增强大米滤液的抗UVB；对角质细胞具有保护作用，能够增强大米对损伤细胞的修复作用，同时提高了大米滤液的保湿效果。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.酵母菌Saccharomycopsis fibuligera，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No：21316。
2.如权利要求1所述的酵母菌在制备大米发酵滤液中的应用。
3.如权利要求2所述的酵母菌在制备大米发酵滤液中的应用，其特征在于：所述制备大米发酵滤液，包括，
将添加2~3%的大米粉，1%的葡萄糖发酵培养基于121℃灭菌20min；
灭菌后接种3%~5%的酵母菌液，然后于30℃条件下发酵24h，pH控制在6.0~6.5；
发酵完成后，先将发酵液进行离心去除菌体，然后再将上清液经200nm的陶瓷膜进行过滤，得到具有天然香气的大米滤液。
4.如权利要求2所述的酵母菌在制备大米发酵滤液中的应用，其特征在于：所述大米发酵滤液，香气化合物种类增多，含量升高，加强了发酵后大米滤液的花果香气，使得发酵大米滤液香气更加丰富，令人愉悦。
5.如权利要求2所述的酵母菌在制备大米发酵滤液中的应用，其特征在于：所述大米发酵滤液，对弹性蛋白酶的抑制效果强，用来做改善皮肤皱纹的产品添加剂。
6.如权利要求2所述的酵母菌在制备大米发酵滤液中的应用，其特征在于：所述大米发酵滤液对胶原蛋白抑制活性强，用来做改善皮肤皱纹的产品添加剂。
7.如权利要求2所述的酵母菌在制备大米发酵滤液中的应用，其特征在于：所述大米发酵滤液的酪氨酸酶抑制活性较发酵前得到提高。
8.如权利要求2所述的酵母菌在制备大米发酵滤液中的应用，其特征在于：所述大米发酵滤液能够增强大米滤液的抗UVB，对角质细胞具有保护作用。
9.如权利要求2所述的酵母菌在制备大米发酵滤液中的应用，其特征在于：所述大米发酵滤液能够增强对UVB损伤细胞的修复作用。
10.如权利要求2所述的酵母菌在制备大米发酵滤液中的应用，其特征在于：所述大米发酵滤液提高了大米滤液的保湿效果。
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