CN113041200A

CN113041200A - 一种含释迦果多重发酵液的化妆品及其制备方法

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Publication number: CN113041200A
Application number: CN202110384568.8A
Authority: CN
Inventors: 何秋星; 罗婷婷; 孔祥灵; 黄俊紫; 易小梅; 曹华
Original assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Current assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Priority date: 2021-04-09
Filing date: 2021-04-09
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2041-04-09
Also published as: CN113041200B

Abstract

本发明提供了一种含释迦果多重发酵液的化妆品及其制备方法，属于化妆品技术领域。本发明针对释迦果发酵液成分分析、发酵工艺探究，利用分批发酵逐一获得不同阶段发酵液，对发酵菌种发酵协同作用探究从而提升发酵液的功效，获得一种释迦果多重发酵滤液，该发酵液属天然植物，营养丰富，不易过敏、安全可靠，且有良好的保湿作用，可以有效清除自由基，抑制酪氨酸酶，还原黑色素，进而达到美白的目的；发酵过程中使用的菌株来源可靠易得，非致病菌，多为人体肠道益生菌，制备方法简单，无有机试剂残留，具有易吸收、保湿、美白、改善肌肤状况的功效，可以作为功效原料添加剂应用于化妆品中，用途广泛，具有极大的市场价值。

Description

一种含释迦果多重发酵液的化妆品及其制备方法

技术领域

本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种含释迦果多重发酵液的保湿美白化妆品及其制备方法。

背景技术

近年来随着消费思想的转变，化妆品更加崇尚自然、远离化学污染的理念，特别是日本化妆品工业的发展趋势来看,各化妆品公司使用的中草药植物原料已达200余种，中草药因其天然药效温和且不良作用少而被广泛认同。目前，在日本含天然中草药的化妆品已占整个化妆品市场的50％以上。而国内，做得好的中草药化妆品企业屈指可数。因此，寻找开发高效且对人体无副作用或副作用小的天然中草药皮肤美容剂，这已成为目前化妆品领域的一个较被重视的课题。所以，开发一种多功效、安全级别高、稳定性好的天然植物源化妆品原料成为科研工作者的新方向之一。

释迦果(Annona squamosa L.)又名番荔枝、佛头果，属于番荔枝科(Annonaceae)。中国浙江、台湾、福建、广东、广西、海南和云南等省区均有栽15培。为热带地区著名水果，根可药用，治急性赤痢、精神抑郁、脊髓骨病；果实可治恶疮肿痛，补脾，始载于《植物名实图考长编》，因果能食用，外形似释迦佛。

释迦果内含丰富的多糖、多酚和黄酮类及其他有机酸类等物质，有非常广阔的应用场景。根据国内外数据库资料所得，大部分学者利用亲水性有机溶剂处理释迦果，此类方法存在较多问题，例如：利用单一溶剂提取并不十分有效地一次性把释迦果中有价值成分提取出来，且提取液活性物分子量大，杂质过多，造成极大地浪费；提取溶剂如甲醇、丙酮、乙醇等在化妆品应用中比较受限，并且容易引发消防安全问题等，使得释迦果这一营养丰富原料在化妆品使用场景十分受限。

由于微生物在生长代谢过程中会产生大量的纤维素酶、果胶酶以及其他具有特种活性的胞外酶，他们可以分解植物细胞的细胞壁，使植物细胞破裂、活性成分溶出、大分子杂质被代谢转化等过程，使得植物提取液的功效大大增加。此外，部分微生物在生长代谢过程中释放的胞外多糖物质具有优秀的化妆品功效，微生物发酵法具有生产工艺简单安全，生产要求低，能增效减毒，使产物分子质量小，皮肤易吸收等优点，逐渐引起国内外化妆品原料商的关注。由于利用微生物对植物进行发酵处理，其产物对比溶剂提取而言，有着更好的功效，更多的应用场景，该方法已经是目前研究学者追捧的热点方法。

如中国公开专利CN110731941A中公开了一种有益菌护肤的化妆品,它由以下质量百分比的原料组成：乳酸杆菌/北美圣草发酵产物提取物1-3％、乳酸杆菌/大豆发酵产物提取物1-3％、乳酸杆菌/大米发酵产物1-3％、乳酸杆菌/凤眼兰发酵产物1-3％、乳酸杆菌/黑麦细粉发酵产物1-3％、抗氧化剂1-3％、吸附剂0.5-3％、皮肤调理剂1-10％、保湿剂1-10％、防腐剂0.01-1％、香精0.01-1％,余量为水；该发明能增进上皮细胞新陈代谢的速度,促使肌肤更新,具有抑制黑色素酶的活性、强化肌肤屏障。

中国公开专利CN109843263A中公开了利用黑酵母菌(Aureobasidium pullulansCXHB-8)及乳酸菌来对人参果进行双重发酵而获得的人参果发酵产物的化妆品组合物。其组合物具有促进细胞增殖,使受损的细胞恢复,抑制胶原蛋白降解,从而可抑制皮肤衰老并改善皱纹。

中国授权专利CN108245479B中公开了一种含有乳双歧杆菌发酵活性提取物的面膜，该发明通过优化发酵工艺，并结合科学配比，获得抗敏具有突破性的超越氢化可的松的效果，此外还兼具刺激胶原蛋白再生的效果的面膜。其在发酵阶段加入白酒草皂苷R,结合其他优化的工艺条件，改变了乳双歧杆菌的生理性能，产生具有极强活性的抗敏促进再生的生物活性的生物多糖等活性物质。

市面上化妆品用途的发酵液大多采用单一菌种发酵处理，或是受限于发酵条件，或是受限于发酵菌种的选择上，往往未能将发酵底物最大效用化；因此出现了多种菌株发酵方法；复合菌种发酵除了对操作人员技能水平要求极高外，其复合发酵的多种菌株之间的竞争作用较不可控，其发酵条件苛刻，其产品质量会存在不同批次之间的差异，会对化妆品生产企业带来不良影响；对于复合菌株一次发酵而言，本发明中针对释迦果发酵液成分分析、发酵工艺探究，利用分批发酵逐一获得不同阶段发酵液，对发酵菌种发酵协同作用探究从而提升发酵液的功效，从而获得一具有广泛应用场景的释迦果多重发酵滤液。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了制备一种利用菌种组合对释迦果进行多重发酵，从而获得的释迦果多重发酵液的方法及其在化妆品中的应用。

本发明采用以下技术方案：

一种含释迦果多重发酵液的保湿美白化妆品，按重量百分比计包括以下组分：丙二醇1-5％、甘油1-6％、乙二胺四乙酸二钠0.01-0.05％、肉豆蔻酸异丙酯2-10％、苯氧乙醇0.05-0.1％、乙基己基甘油0.1-0.15％、释迦果发酵滤液4-15％、氢化蓖麻油0.05-0.25％和余量水。

优选地，所述的保湿美白化妆品，按重量百分比计包括以下组分：丙二醇1.5-3％、甘油2-4％、乙二胺四乙酸二钠0.02-0.04％、肉豆蔻酸异丙酯4-6％、苯氧乙醇0.05-0.08％、乙基己基甘油0.12-0.15％、释迦果发酵滤液6-8％、氢化蓖麻油0.08-0.15％和余量水。

再优选地，所述的保湿美白化妆品，按重量百分比计包括以下组分：丙二醇2％、甘油3.2％、乙二胺四乙酸二钠0.03％、肉豆蔻酸异丙酯5％、苯氧乙醇0.05％、乙基己基甘油0.15％、释迦果发酵滤液7.5％、氢化蓖麻油0.1％和余量水。

其中，所述的释迦果发酵滤液和氢化蓖麻油的质量比为50-100:1；优选为75:1。

所述的苯氧乙醇和乙基己基甘油的质量比为1:1-3；优选为1:3。

所述化妆品为膏霜剂、乳剂、爽肤水、精华液、啫喱或面膜。

本发明所述的释迦果发酵滤液为释迦果多重发酵液，所述的发酵菌种包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、乳酸杆菌(Lactobacillus iners)、双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae Hansen)。

本发明还公开了所述的释迦果多重发酵液的制备方法：具体包括以下步骤：

(1)菌种复壮；

(2)菌种纯化；

(3)种子液扩大培养：

(3.1)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)纯化培养：取0.1g菌株冻干粉加入1ml无菌生理盐水混合，平均吸取至2个TSA固体平板上，摇匀，30℃培养50h；挑选生长较旺盛的菌落，接入TSA斜面培养基于25-38℃培养24-48h，取5-10mL无菌生理盐水冲洗获得菌悬液A；

(3.2)乳酸杆菌(Lactobacillus iners)纯化培养：取0.1g菌株冻干粉加入1ml无菌生理盐水混合，平均吸取至2个血平皿上，摇匀，37℃培养50h；挑选生长较旺盛的菌落，接入斜面血培养基于25-38℃培养24-48h，取5-10mL无菌生理盐水冲洗获得菌悬液B；

(3.3)双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)纯化培养：取0.1g菌株冻干粉加入1ml无菌生理盐水混合，平均吸取至2个特制培养基上，摇匀，37℃厌氧培养50h；挑选生长较旺盛的菌落，接入斜面培养基培养基25-38℃培养24-48h，取5-10mL无菌生理盐水冲洗获得菌悬液C；

(3.4)酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae Hansen)纯化培养：取0.1g菌株冻干粉加入1ml无菌生理盐水混合，平均吸取至2个TSA平皿上，摇匀，37℃培养50h；挑选生长较旺盛的菌落，接入斜面培养基25-38℃培养24-48h，取5-10mL无菌生理盐水冲洗获得菌悬液D；

(4)释迦果发酵物的获得：

(4.1)选取成熟释迦果洗净，并将整果打碎成浆，然后加入无菌水，摇匀灭菌后得到灭菌后释迦果浆，即为发酵底物1；

(4.2)将步骤(4.1)中得到的发酵底物1接入菌悬液A中，摇匀，密封，通入无菌大气，在温度为25-38℃，pH为5-8的条件下震荡培养5-15天，发酵结束后进行灭菌，调节pH为5-8，超声波处理5-10min，摇匀，得发酵物2；

(4.3)将步骤(4.2)得到的发酵物2接入菌悬液B中，摇匀，密封，通入无菌二氧化碳，在温度25-38℃，pH为5-8的条件下震荡培养20-30h，发酵结束后进行灭菌，调节pH为5-8，超声波处理5-10min，摇匀，得发酵物3；

(4.4)将步骤(4.3)得到的发酵物3接入菌悬液C中，摇匀，密封，通入无菌二氧化碳，在温度25-38℃，pH为5-8条件下震荡培养20-30h，发酵结束后进行灭菌，调节pH为5-8，超声波处理5-10min，摇匀得发酵物4；

(4.5)将步骤(4.4)得到的发酵物4接入菌悬液D中，摇匀，密封，通入无菌二氧化碳，在温度25-38℃，pH为5-8条件下震荡培养1-5天，发酵结束后，灭菌，超声破壁2min，8000rpm离心20min，得发酵物5，即为释迦果多重发酵液。

优选地，上述步骤(3.1)中所述的TSA固体平板的培养基为胰酪蛋白胨15g/L，大豆胨5g/L，氯化钠4g/L，酵母提取物2g/L，琼脂15g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，K₂HPO₄ 1g/LKH₂PO₄ 1g/L，葡萄糖2g/L；

步骤(3.2)中所述的血平皿的培养基为胰酪蛋白胨4g/L，大豆胨5g/L，氯化钠4g/L，NaH₂PO₄ 1g/L，牛肉浸粉10g/L，5％脱脂纤维羊血，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，K₂HPO₄ 1g/LKH₂PO₄ 1g/L，琼脂15g/L；

步骤(3.3)中所述的特制培养基为大豆蛋白胨4g/L，氯化钠10g/L，NaH₂PO₄ 1g/L，酵母提取物10g/L，胰胨5g/L，葡萄糖8g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，K₂HPO₄ 1g/L KH₂PO₄ 1g/L，琼脂15g/L，L-半胱氨酸0.5g/L；

上述步骤(3.4)中所述的平皿的培养基为胰酪蛋白胨15g/L，大豆胨5g/L，酵母提取物2g/L，氯化钠4g/L，葡萄糖2g/L，K₂HPO₄ 1g/L KH₂PO₄ 1g/L，琼脂15g/L。

优选地，所述的步骤(3.1)-(3.4)中所制备得到的菌悬液A-D用细菌浊度仪进行比浊，其浊度为1-5MCF。

上述步骤(4.1)中所述的将整果打碎成浆得温度为20-30℃，释迦果浆和无菌水的配比为10g：50g。

优选地，上述步骤(4.2)中所述的发酵底物1与菌悬液A的质量体积比为50-100：1-5；

上述步骤(4.3)中所述的发酵底物2与菌悬液B的质量体积比为50-100：1-5；

上述步骤(4.4)中所述的发酵底物3与菌悬液C的质量体积比为50-100：1-5；

上述步骤(4.5)中所述的发酵底物4与菌悬液D的质量体积比为50-100：1-5。

本发明在实施过程中控制发酵底物与菌悬液的质量体积比，能够保证发酵底物较好的发酵，得到的发酵产物具有多糖、多酚以及黄酮、蛋白质含量比较高，具有更好的美白保湿效果。

将所述的释迦果多重发酵液置于冷冻干燥机中在-20℃--30℃预冻5-10h，可得冻干粉。

本发明还公开了上述释迦果多重发酵液在制备保湿美白化妆品中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明的释迦果多重发酵液，有良好的保湿作用，可以有效清除自由基，抑制酪氨酸酶，还原黑色素，进而达到美白的目的；

(2)本发明使用天然植物，营养丰富，不易过敏、安全可靠，无副作用，适合各类人群长期使用；

(3)本发明所得的释迦果多重发酵液，活性物分子量较小，由微生物发酵后其产物滤液中的多糖和多肽在面对受损肌肤有着良好的促进修复作用；

(4)本发明使用的分批多次发酵对于一次复合发酵而言，在对人员的操作技能水平要求低，重现性好；

(5)本发明中所述的释迦果多重发酵液经多次发酵，微生物产生的酶、胞外多糖和菌丝代谢物会在发酵物中累积，上一步发酵为下一步的发酵做准备，得到的多重发酵液中多糖、蛋白质、黄酮等含量明显提高；

(6)本发明使用的菌株来源可靠易得，非致病菌，多为人体肠道益生菌，制备方法简单，无有机试剂残留，具有易吸收、保湿、美白、改善肌肤状况的功效，可以作为功效原料添加剂应用于化妆品中，用途广泛，具有极大的市场价值。

附图说明

图1为0.8mg/mL释迦果发酵物2-5对分别HSF、HaCat细胞作用；

图2为1.0g/mL释迦果多重发酵物保湿性能体外评价。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

本发明对所采用原料的来源不作限定，如无特殊说明，本发明所采用的原料

均为本技术领域普通市售品。其中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为ATCC6633、乳酸杆菌(Lactobacillus iners)为ATCC 55195、双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentic)为ATCC 15703、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae Hansen)为ATCC9763，酪氨酸酶(25ku)、L-DOPA、HSF、HaCat细胞等购自上海宝曼生物科技有限公司。

实施例1、释迦果发酵提取物的制备：

(1)菌种复壮：

挑取枯草芽孢杆菌落一环于液体培养基中，放入摇床中活化，得活化的枯草芽孢杆菌。

挑取乳酸杆菌落一环于液体培养基中，放入摇床中活化，得活化的枯草芽孢杆菌。

挑取双歧杆菌落一环于液体培养基中，放入摇床中活化，得活化的枯草芽孢杆菌。

挑取酿酒酵母菌落一环于液体培养基中，放入摇床中活化，得活化的枯草芽孢杆菌。

(2)菌种纯化：

将步骤(1)中所得活化后的菌液分别稀释，均匀涂布于上述培养平皿，以便检测菌株的情况，获得纯化后的四种益生菌。

(3)种子液扩大培养

(3.1)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)纯化培养：取0.1g菌株冻干粉加入1ml无菌生理盐水混合，平均吸取至2个TSA固体平板上，培养基为胰酪蛋白胨15g/L，大豆胨5g/L，氯化钠4g/L，酵母提取物2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，K₂HPO₄ 1g/L KH₂PO₄ 1g/L，葡萄糖2g/L，琼脂15g/L，摇匀，30℃培养50h；挑选生长较旺盛的菌落，接入TSA斜面培养基于28℃培养48h，取10mL无菌生理盐水冲洗获得菌悬液A，所述菌悬液A的麦氏浊度值为2.10MCF；

(3.2)乳酸杆菌(Lactobacillus iners)纯化培养：取0.1g菌株冻干粉加入1ml无菌生理盐水混合，平均吸取至2个血平皿上，培养基为胰酪蛋白胨4g/L，大豆胨5g/L，氯化钠4g/L，NaH₂PO₄ 1g/L，牛肉浸粉10g/L，5％脱脂纤维羊血，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，K₂HPO₄ 1g/LKH₂PO₄ 1g/L，琼脂15g/L，摇匀，37℃培养50h；挑选生长较旺盛的菌落，接入斜面血培养基于36.5℃培养48h，取10mL无菌生理盐水冲洗获得菌悬液B，所述菌悬液B的麦氏浊度值为2.50MCF；

(3.3)双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)纯化培养：取0.1g菌株冻干粉加入1ml无菌生理盐水混合，平均吸取至2个特制培养基上，培养基为大豆蛋白胨4g/L，氯化钠10g/L，NaH₂PO₄ 1g/L，酵母提取物10g/L，胰胨5g/L，葡萄糖8g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，K₂HPO₄ 1g/L KH₂PO₄ 1g/L，琼脂15g/L，L-半胱氨酸0.5g/L，摇匀，37℃厌氧培养50h；挑选生长较旺盛的菌落，接入斜面培养基培养基36.5℃培养48h，取10mL无菌生理盐水冲洗获得菌悬液C，所述菌悬液C的麦氏浊度值为1.10MCF；

(3.4)酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae Hansen)纯化培养：取0.1g菌株冻干粉加入1ml无菌生理盐水混合，平均吸取至2个平皿上，培养基为酪蛋白胨15g/L，大豆胨5g/L，酵母提取物2g/L，氯化钠4g/L，葡萄糖2g/L，K₂HPO₄ 1g/L KH₂PO₄ 1g/L，琼脂15g/L，摇匀，37℃培养50h；挑选生长较旺盛的菌落，接入斜面培养基28℃培养48h，取10mL无菌生理盐水冲洗获得菌悬液D，所述菌悬液D的麦氏浊度值为1.50MCF。

(4)释迦果发酵物的获得：

(4.1)选取成熟释迦果洗净，并将整果打碎成浆，然后取20g释迦果浆加入80g无菌水，摇匀灭菌后得到灭菌后释迦果浆，即为发酵底物1；

(4.2)将步骤(4.1)中得到的发酵底物1以质量体积比100:5接入菌悬液A中，摇匀，密封，通入无菌大气，在温度为32℃，pH为6.8的条件下震荡培养180h，发酵结束后121℃条件下灭菌15min，调节pH为7.2，超声波处理5min，摇匀，得发酵物2；

(4.3)将步骤(4.2)得到的发酵物2以质量体积比100:5接入菌悬液B中，摇匀，密封，通入无菌二氧化碳，在温度36.5℃，pH为7.2的条件下震荡培养24h，发酵结束后80℃条件下灭菌30min，调节pH为6.8，超声波处理5min，摇匀，得发酵物3；

(4.4)将步骤(4.3)得到的发酵物3以质量体积比100:5接入菌悬液C中，摇匀，密封，通入无菌二氧化碳，在温度36.5℃，pH为6.8条件下震荡培养20h，发酵结束后80℃条件下灭菌30min，调节pH为7.2，超声波处理5min，摇匀得发酵物4；

(4.5)将步骤(4.4)得到的发酵物4以质量体积比100:5接入菌悬液D中，摇匀，密封，通入无菌二氧化碳，在温度30℃，pH为7.2条件下震荡培养50h，发酵结束后121℃条件下灭菌15min，超声破壁2min，8000rpm离心20min，得发酵物5，即为释迦果多重发酵液。

同时，同批同法分别制作发酵物2、3、4备用。

对比例1释迦果水提取物的制备

取与实施例1中发酵底物1等量的释迦果浆，将果浆与去离子水的质量比为1:4，加热至80℃，回流提取2.0h，得到释迦果水提取物。

对比例2释迦果50％乙醇提取物的制备

取与实施例1中发酵底物1等量的释迦果浆，按1:4(质量比)的料液比,加入体积分数为50％的乙醇，加热至90℃，回流提取2.0h，得到释迦果50％乙醇提取物。

对比例3释迦果发酵液a的制备

取与实施例1中发酵底物1等量的释迦果浆，以质量体积比100:5接入菌悬液A、菌悬液B、菌悬液C和菌悬液D，通入无菌二氧化碳，在温度30℃，pH为7.2条件下震荡培养50h，发酵结束后121℃条件下灭菌15min，超声破壁2min，8000rpm离心20min，得释迦果发酵液a。

对比例4释迦果多重发酵液Ⅴ的制备

与实施例1的区别在于：各菌悬液的加入顺序不同，具体步骤为：

(4.2)将步骤(4.1)得到的发酵物2以质量体积比100:5接入菌悬液B中，摇匀，密封，通入无菌二氧化碳，在温度36.5℃，pH为7.2的条件下震荡培养24h，发酵结束后80℃条件下灭菌30min，调节pH为6.8，超声波处理5min，摇匀，得发酵物Ⅱ；

(4.3)将步骤(4.2)中得到的发酵底物Ⅱ以质量体积比100:5接入菌悬液A中，摇匀，密封，通入无菌大气，在温度为32℃，pH为6.8的条件下震荡培养180h，发酵结束后121℃条件下灭菌15min，调节pH为7.2，超声波处理5min，摇匀，得发酵物Ⅲ；

(4.4)将步骤(4.3)得到的发酵物Ⅲ以质量体积比100:5接入菌悬液D中，摇匀，密封，通入无菌二氧化碳，在温度30℃，pH为7.2条件下震荡培养50h，发酵结束后121℃条件下灭菌15min，超声破壁2min，8000rpm离心20min，得发酵物Ⅳ；

(4.5)将步骤(4.4)得到的发酵物Ⅳ以质量体积比100:5接入菌悬液C中，摇匀，密封，通入无菌二氧化碳，在温度36.5℃，pH为6.8条件下震荡培养20h，发酵结束后80℃条件下灭菌30min，调节pH为7.2，超声波处理5min，摇匀得发酵物Ⅴ。

该实施例1制备所得的释迦果发酵液提取物外观为粘稠液体，震荡发泡、颜色为黄色至棕黄色，有一定的花芳香味道。pH在4.0-7.0，平板菌落计数小于50CFU/mL，无致病菌检出，符合化妆品卫生标准GB7916-87。

试验例1、该释迦果发酵液进行成分分析

蛋白质检测方法参照GB5009.5-2010；多糖检测采用苯酚硫酸法；总黄酮、多酚等测量方法参考行业方法，具体见下表1。

表1

试验例2释迦果各阶段发酵液的生物学性能检测

采用MTT法考察不同发酵时期的释迦果发酵液(释迦果多重发酵液，发酵物2，发酵物3，发酵物4)在同一质量浓度下对人皮肤成纤维细胞(HSF)和人永生化角质形成细胞(HaCat)细胞活力的影响，HSF细胞、HaCat细胞分别是人体皮肤真皮层、表皮层的重要组成部分。通过细胞水平实验验证实验例一中的多重发酵液的生物学性能，验证其在皮肤状况改善的效用。将一定浓度下的HSF和HaCat接种于96孔板中，孵育24h后，移除孔中溶液。加入以DMEM为溶液配制的0.8mg/mL液，每孔100μL，置于培养箱中培养24h，以不含样品的培养液为对照。移除孔中溶液，使用PBS冲洗2-3次，使用酶标仪测定其在490nm处的OD值，按下式子计算细胞活力。

式中:A_S—样品组吸光值；A₀—空白组吸光值；A_i—对照组吸光值。

释迦果发酵液对HSF和HaCat细胞作用24h后，细胞活力分别如附图1所示，在0.8mg/mL的释迦果发酵物2-5对分别HSF、HaCat细胞作用，释迦果多重发酵液(即发酵液5)作用细胞24h后，通过MTT法测定其对HSF细胞增值率达到了121.1％，HaCat细胞增殖率达118.3％。同时实验数据也可以得出，由实验例1所得其余阶段的释迦果发酵液对于空白对照组和水提取组，对于HSF与HaCat均有不同的增殖作用，但其效果比本发明的实验例1所得释迦果多重发酵液略差，表明实施例1的发酵方法可以获得促进人皮肤成纤维细胞与人永生化角质形成细胞增殖效果更好的发酵液。

试验例3释迦果发酵提取物的安全性检测：

1、实验方法：

鸡胚***实验主要分为鸡胚绒毛膜***试验(CAMVA)和鸡胚绒毛***试验(HET-CAM)。鸡胚***具有丰富的血管网络，与眼结膜的结构相似，鸡胚***试验是一种灵敏度很高的刺激实验体外代替方法。本实验操作严格按照中国人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2329—2009执行，详见此标准。

2、实验结果：

实验结果判断选择反应时间法。

将释迦果多重发酵提取滤液浓缩至不同梯度，最高为2g/mL(原料与滤液之比)，滴加0.3ml发酵滤液于绒毛***表面，范围约为1.5cm直径，接触30S后用生理盐水轻轻冲洗，然后观察5min内CAM血管变化，并记录出现出血、溶血和凝血的初始时间，根据观察结果应用式(1)计算刺激评分(IS)，结果保留小数点后两位：

式中：

sec H(出血时间)-CAM膜上观察到开始发生出血的平均时间，单位为秒(s)；

sec L(血管融解时间)-CAM膜上观察到开始发生血管融解的平均时间，单位为秒(s)；

sec C(凝血时间)-CAM膜上观察到开始出现凝血的平均时间，单位为秒(s)。

ps：出血：血液从CAM膜血管内流出血管外，可以表现为血管外出现点状出血或絮状的弥漫性出血等多种形式。

凝血：血管内和血管外蛋白的变性，表现为血管内血流变慢或血栓形成，血管呈现棕黑色，血管外出现混浊和不透明。

血管融解：CAM膜上小血管壁破裂，小血管融解消失。

根据计算的IS数值按下表2对受试物眼刺激性进行分类。

表2刺激评分法结果评价

刺激评分	刺激性分类
		IS＜1	无刺激性
1≤IS＜5	轻刺激性
		5≤IS＜9	中度刺激性
IS≥10	强刺激性/腐蚀性

实验结果显示各浓度下均IS＜1，显示出了实施例一得到的释迦果发酵提取物无刺激性，说明本发明提供的释迦果发酵提取物均具有安全性，不会给人体带来不良反应。

试验例4、释迦果发酵提取滤液抗氧化性能检测

用不同量实施例一获得的释迦果多重发酵提取物，溶于蒸馏水中，制得一系列浓度(0.10g/mL，0.25g/mL，0.5g/mL，0.75g/mL，1.0g/mL)的释迦果发酵滤液，并进行抗氧化性能检测。

4.1、ABTS+清除能力的测定

将ABTS+溶液用磷酸缓冲液(10mmol/L，pH7.4)稀释，使其在734nm波长下的吸光度为0.700±0.020，即得到ABTS+工作液。分别取1mL2mg/mL的具有抗氧化功能的释迦果发酵提取滤液的样品至试管中，加入ABTS+工作液3mL，充分混合均匀，室温避光保存10min，在734nm处测定吸光度磷酸缓冲液为空白对照)，每个样品做3个平行样，清除率计算公式如下：

其中，Ai为1mL样品溶液+3mL ABTS+液的吸光度值；Aj为1mL样品溶液+3mL磷酸缓冲液的吸光度值；Ac为1mL磷酸缓冲液+3mLABTS+溶液的吸光度值。

4.2、羟自由基清除能力的测定

在0.40mL6mmol/L硫酸亚铁溶液中，加入1mL 8.8mmol/L的过氧化氢溶液，再加入1mL9 mmol/L水杨酸溶液和1.60mL蒸馏水，混合均匀，37℃下水浴加热15min(蒸馏水为空白对照)，在510nm波长下测定吸光度值Ac。Ai为以2.0mg/mL的具有抗氧化功能的释迦果发酵提取滤液的样品代替1.60mL蒸馏水测得的吸光度值，取1mL蒸馏水代替过氧化氢溶液测定吸光度值为Aj。Vc溶液作为阳性对照，计算样品对羟自由基的清除率。

4.3、超氧阴离子自由基清除能力测定

向1.40mLTris-HCl缓冲溶液(0.05mol/L，pH 8.2)中加入1mL蒸馏水，再加入0.2mL5 mmol/L的邻苯三酚溶液，混合均匀，静置5min后在320nm波长处测定吸光度值Ac。Ai为以2mg/mL的具有抗氧化功能的释迦果发酵提取滤液的样品代替1mL蒸馏水测得的吸光度值，取0.2mL10 mmol/L盐酸溶液代替邻苯三酚溶液测定吸光度值为Aj。每个样品做3个平行样，计算样品对超氧阴离子自由基的清除率。

结果如表3所示。

表3释迦果发酵提取滤液抗氧化性能检测结果

由上表数据可知，本发明实施例一制备的具有具有抗氧化功能的释迦果发酵提取滤液对ABTS+、羟自由基和超氧阴离子自由基都有较好的清除能力，其中，当提高释迦果发酵提取液浓度时，其发酵液抗氧化均对应增加，在1.0g/mL的发酵液，其ABTS+清除率为93.6％，羟自由基清除率90.1％，超氧阴离子自由基清除率93.3％。未发酵的释迦果提取滤液ABTS+清除率为61.1％，羟自由基清除率42.9％，超氧阴离子自由基清除率36.4％，表明通过本发明的方法处理后，各个浓度的释迦果发酵提取液的自由基清除率均大幅增加了。

试验例5、释迦果发酵提取液体外保湿性能研究

不同的保湿剂分子对水分子的作用力不同，吸收水分和保持水分的能力也不相同，作用力大的，对水分子的结合力强，吸收和保持水分的量也比较大。

实验方法：

1、于实验进行前12h，制备氯化镁或氯化钙过饱和溶液、氯化钠过饱和溶液、磷酸氢二钠或氯化钾过饱和溶液，制备相对湿度分别为30％、75％、98％的恒湿环境。

2、将称量瓶做好标记，置于105℃的干燥箱中干燥至恒重，待其冷却至室温后称重，计为m1。分别称取0.0200g葡聚糖(对照组)、释迦果发酵提取物冻干粉，使粉末或液面刚好没过瓶底，记为m2(称量瓶+样品)。将装有样品的称量瓶放置于湿度约为98％的恒湿器内(磷酸氢二钠过饱和溶液)，放置3h。

3、将称量瓶做好标记，置于105℃的干燥箱中干燥至恒重，待其冷却至室温后称。计为m1。分别称取适量10％葡聚糖、1.0g/mL释迦果发酵提取物，使液面刚好没过瓶底记为m2(称量瓶+样品)。将装有样品的称量瓶放置于湿度约为30％的恒湿器(氯化钙过饱和溶液)内，放置3h。

4、放置3h后，迅速拿出样品称量，记为m3(称量瓶+样品)。

5、计算样品吸湿率和失水率或保湿率。

吸湿率＝(m3-m2)/(m2-m1)×100％

失水率＝(m2-m3)/(m2-m1)×100％

实验结果如附图2所示，由附图2可以看出本发明制备的释迦果发酵提取液具有更好的保湿效果。

综上所述，本发明制备的释迦果发酵提取物滤液，可以有效清除自由基，同时数据表明其具有保湿等功效，可以作为功效原料添加剂应用于化妆品中，用途广泛，具有极大的市场价值。

试验例6、酪氨酸酶活性抑制效果试验

在各试管中加入阴性对照pH6.8的PBS磷酸缓冲液、样品液、100U/mL酪氨酸酶，于37℃水浴恒温10min，再加入1.5mmol/L L-DOPA溶液，37℃反应到5min时立即测定475nm处的吸光度值，平均实验3次，求平均值，以pH6.8的PBS磷酸缓冲液为阴性对照。

实验体系设计见表4，A1为空白调零，A2为空白对照，A3为样品调零，A4为样品管样品为实施例1中的释迦果发酵液。各样品抑制酪氨酸酶活性检测结果见表5所示。

表4

组别	样品/mL	PBS/mL	L-DOPA/mL	酪氨酸酶/mL
					A1	0	2.0	1	0
A2	0	1.5	1	0.5
					A3	0.5	1.5	1	0
A4	0.5	1.0	1	0.5

表5

由上表数据可知，本发明制备的具有美白功能的释迦果多重发酵提取滤液不同浓度的酪氨酸酶的抑制率为56.2-84.2％，美白效果较好。由1-6组实验可当浓度越高时，其酪氨酸酶抑制率越高，上述实验列举的浓度1.0g/mL下，其酪氨酸酶抑制率达到84.2％。

实施例2一种释迦果发酵滤液护肤精华液

包括以下质量百分含量的组分：

制备方法：将A相搅拌至90℃后，冷却降温，待冷却至50℃后，加入B相，搅拌3分钟，加入C相搅拌均匀，即得到释迦果多重发酵滤液精华，编号为精华A。

实施例3一种释迦果发酵滤液护肤精华液

制备方法：将A相搅拌至90℃后，冷却降温，待冷却至50℃后，加入B相，搅拌3分钟，加入C相搅拌均匀，即得到释迦果多重发酵滤液精华，编号为精华B。

对比例5

与实施例3的区别在于：将发酵物5替换为发酵物2，其他组分以及含量与实施例3相同，编号为精华C。

对比例6

与实施例3的区别在于：将发酵物5替换为发酵物3，其他组分以及含量与实施例3相同，编号为精华D。

对比例7

与实施例3的区别在于：将发酵物5替换为发酵物4，其他组分以及含量与实施例3相同，编号为精华E。

对比例8

与实施例3的区别在于：将发酵物5替换为释迦果发酵液a，其他组分以及含量与实施例3相同，编号为精华F。

对比例9

与实施例3的区别在于：将发酵物5替换为释迦果多重发酵液Ⅴ，其他组分以及含量与实施例3相同，编号为精华M。

对比例10

与实施例3的区别在于：将发酵物5替换为普通去离子水，其他组分以及含量与实施例3相同，编号为对照组。

试用检测效果：

选取40名受试者，男女各半，年龄在18-40岁之间，且生活习惯均为长期熬夜，面部皮肤不同程度地存在干燥、鳞屑、色素沉着等问题，随机分成4组，每组10人，清水洁面后，取本品涂抹于面部至吸收，无需清洗；每天使用1次，连续使用4周，使用期间，不使用其他任何产品；在测试前，受试人群需用清水清洁面部，用面巾纸擦拭干净，在恒温恒湿实验室(温度20±1℃，湿度55±3)中静坐30分钟后开始测量。选取每个受试人的右脸中下部4*4cm区域，用Miravex公司研发的Antera 3D成像***测试该区域的皮肤状况。

Antera 3D具有多种检测功能，包括皮肤皱纹、肌理、黑色素、血红蛋白水平等，能从与皮肤的三维图形相关的图像中抽取相关数据，从而确定治疗功效，并监测随着时间的推移，治疗的变化情况。

评价方法：本示例根据Antera 3D中的皱纹深度、肌理、黑色素、血红蛋白水平分析其实验结果。

其中在皱纹方面，以小型(1mm滤光器)分析受试者右脸中下部细纹所得数为评价基准，通过使用上述精华液后，其皱纹的变化情况进行评分。

在肌肤纹理方面，在理想的形式下，通过皮肤表面的垂直偏差进行量化测量—偏差越大，表面越粗糙；偏差越小，表面越平坦。利用Antera软件，使用一个粗糙面休整选项，测量皮肤的平均粗糙程度Sa，从而确定皮肤的肌理。

利用Antera 3D中的多光谱分析功能，可测量黑色素与血红蛋白的浓度变化功能。选中右脸中下部同一区域测量黑色素、与血红素变化情况，即可得对应肤色变化。

其评分结果以百分制加权计算，90-100分表明肌肤改善情况非常显著，70-90表示肌肤改善明显，50-70表示肌肤状况有所改善，40以下表示肌肤改善不明显。测试前肌肤评分为10。

测其结果以平均值如表7所示。

表7

根据上表的检测数据可以看出，本发明实施例和对照例制备的精华液均具改善肌肤状态的效果，具体体现在肌肤纹理和肌肤美白程度上，同时可以看出，实施例3制备的释迦果发酵滤液所得的精华液对皮肤护理的效果更加明显。

综上所述，本发明制备的释迦果发酵液精华，在对于皮肤日常护理28天后，有明显的改善肌肤状况的效果，其表现在肌肤纹理改善，细纹减少，其黑色素水平有所降低，光泽度有着明显的改善。同时由实验例二中的细胞水平的实验表明，本发明所得的释迦果发酵液在作用HSF和HaCat细胞24h后，其细胞的活力有相应的增加，表明释迦果发酵液在对于HSF和HaCat细胞上有促进增殖作用，

这一效果在实验例五中也相应地表现出来，具体在于其肌肤的粗糙度和光泽度上有所体现。因此本发明所得的释迦果发酵滤液可以作为功效原料添加剂应用于化妆品中，其用途广泛，具有极大的市场价值。

以上是结合具体实施例对本发明进一步的描述，但这些实施例仅仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种含释迦果多重发酵液的保湿美白化妆品，其特征在于：按重量百分比计包括以下组分：丙二醇1-5％、甘油1-6％、乙二胺四乙酸二钠0.01-0.05％、肉豆蔻酸异丙酯2-10％、苯氧乙醇0.05-0.1％、乙基己基甘油0.1-0.15％、释迦果发酵滤液4-15％、氢化蓖麻油0.05-0.25％和余量水；

所述的释迦果发酵滤液为释迦果多重发酵液。

2.根据权利要求1所述的保湿美白化妆品，其特征在于：按重量百分比计包括以下组分：丙二醇2％、甘油3.2％、乙二胺四乙酸二钠0.03％、肉豆蔻酸异丙酯5％、苯氧乙醇0.05％、乙基己基甘油0.15％、释迦果发酵滤液7.5％、氢化蓖麻油0.1％和余量水；

所述的释迦果发酵滤液为释迦果多重发酵液。

3.根据权利要求2所述的保湿美白化妆品，其特征在于：所述的释迦果发酵滤液和氢化蓖麻油的质量比为50-100:1；优选为75:1。

4.一种释迦果发酵滤液，其特征在于：所述的释迦果发酵滤液为权利要求2中所述的释迦果多重发酵液，所述的释迦果多重发酵液的发酵菌种包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、乳酸杆菌(Lactobacillus iners)、双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentic)和酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae Hansen)。

5.一种权利要求4所述的释迦果发酵滤液的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：

(1)菌种复壮；

(2)菌种纯化；

(3)种子液扩大培养：

(3.4)酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae Hansen)纯化培养：取0.1g菌株冻干粉，加入1ml无菌生理盐水混合，平均吸取至2个TSA平皿上，摇匀，37℃培养50h；挑选生长较旺盛的菌落，接入斜面培养基25-38℃培养24-48h，取5-10mL无菌生理盐水冲洗获得菌悬液D；

(4)释迦果发酵物的获得：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(3.1)中所述的TSA固体平板的培养基为蛋白胨4g/L，氯化钠10g/L，NaH₂PO₄ 1g/L，琼脂15g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，K₂HPO₄1g/L KH₂PO₄ 1g/L；

步骤(3.2)中所述的血平皿的培养基为蛋白胨4g/L，氯化钠10g/L，NaH₂PO₄1g/L，牛肉浸粉10g/L，5％脱脂纤维羊血，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，K₂HPO₄ 1g/LKH₂PO₄ 1g/L，琼脂15g/L；

步骤(3.3)中所述的特制培养基为蛋白胨4g/L，氯化钠10g/L，NaH₂PO₄ 1g/L，酵母提取物10g/L，胰胨5g/L，葡萄糖8g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，K₂HPO₄ 1g/LKH₂PO₄ 1g/L，琼脂15g/L；

上述步骤(3.4)中所述的平皿的培养基为：胰酪蛋白胨15g/L，大豆胨5g/L，酵母提取物2g/L，氯化钠4g/L，葡萄糖2g/L，磷酸氢二钾1-3g，琼脂15g/L。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(3.1)-(3.4)中所制备得到的菌悬液A-D用细菌浊度仪进行比浊，其浊度为1-5MCF。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(4.2)中所述的发酵底物1与菌悬液A的质量体积比为50-100：1-5；

步骤(4.3)中所述的发酵底物2与菌悬液B的质量体积比为50-100：1-5；

步骤(4.4)中所述的发酵底物3与菌悬液C的质量体积比为50-100：1-5；

步骤(4.5)中所述的发酵底物4与菌悬液D的质量体积比为50-100：1-5。

9.权利要求4所述的释迦果发酵液和权利要求5-8所述的制备方法制备的释迦果发酵液在制备保湿美白化妆品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的化妆品为膏霜剂、乳剂、爽肤水、精华液、啫喱或面膜。