CN115485387A

CN115485387A - 增加精细化学品生产中的时空产率、碳转化效率和碳底物灵活性

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Publication number: CN115485387A
Application number: CN202080096521.5A
Authority: CN
Inventors: H·施罗德; A-C·海勒; B·霍夫; O·泽尔德; P·厄德曼; G·B·旺德利; C·迪奇; M·库马尔; D·萨托里; M·D·布兰克希恩; J·K·普拉斯迈尔
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2020-12-16
Publication date: 2022-12-16
Also published as: KR20220116504A; EP4077699A1; US20230042456A1; CA3161898A1; JP2023506284A; WO2021122687A1

Abstract

增加精细化学品生产中的时空产率、碳转化效率和碳底物灵活性。本发明的发明人已经发现增加cAMP水平和/或操纵PTS***对宿主生物的精细化学品生产的时空产率、碳转化效率和碳底物灵活性的令人惊奇的积极作用。这通过缺失C‑端调节区去调节腺苷酸环化酶cyaa导致调节碳水化合物利用***的cAMP水平增加或缺失Crr蛋白活性(碳水化合物阻抑抗性)而实现。二者导致增加的2‑岩藻糖基乳糖和6‑唾液酰乳糖生产(人乳寡糖)并增加碳水化合物使用。

Description

增加精细化学品生产中的时空产率、碳转化效率和碳底物灵活性

本发明的发明人发现增加的cAMP水平对宿主生物的精细化学品生产的时空产率、碳转化效率和碳底物灵活性具有令人惊奇的积极作用。此外，发明人发现，不进行其内源调节及因此在cAMP生产中总是活性的腺苷酸环化酶活性有利于宿主生物的精细化学品生产的时空产率和碳底物灵活性。

此外，本发明的发明人还发现了降低crr基因或其变体的表达和/或Crr蛋白或其变体的失活或减少对于原核生物寡糖生产的碳转化效率、碳底物灵活性和时空产率的令人惊讶的作用。

Crr蛋白是微生物PTS碳水化合物利用***的部分，其也与微生物细胞中的cAMP水平相关。

现有技术已知，降低PTS碳水化合物利用***(PTS***)的蛋白质表达对于除寡糖以外的某些化合物的生产有影响。

Flores等(Nature Biotechnology(1996),Volume 14,pages 620–623)描述了对在大肠杆菌中芳香族化合物生产的途径工程化。对参与大肠杆菌中芳香族化合物生产的途径的理论分析表明这种化合物的产量受限于磷酸烯醇丙酮酸(PEP)可用性。这种化合物是一些生物合成途径中的主要组成部件之一，是PTS***中用于葡萄糖内化的供体。从糖酵解途径1摩尔葡萄糖产生2分子PEP。然而，如果随后在葡萄糖转运期间PTS***使用1mol的PEP，则每消耗1mol葡萄糖仅剩下1mol PEP可用于其它代谢反应。Flores等发现当缺乏ptsH、ptsI和crr基因的大肠杆菌菌株在发酵罐中在以葡萄糖为唯一碳源的基本培养基中培养时，两天后可以检测到异质的PTS-Glucose+回复体群。这些回复体能够通过GalP转运葡萄糖，并且在细胞质中，葡萄糖被葡萄糖激酶使用ATP磷酸化。

本发明的另一方面涉及不进行其内源调节的腺苷酸环化酶活性与crr基因或其变体的表达降低和/或Crr蛋白或其变体的失活或减少的组合，以及这种组合在一个宿主细胞内对原核宿主生物生产寡糖的碳转化效率、碳底物灵活性和时空产率的影响。

发明详述

时空产率被定义为单位时间内产物形成率。其可以是关于由其体积或重量定义的反应混合物或发酵物的空间或量。典型的定义包括重量，例如每单位时间(如小时)每体积(如升)或重量(如kg)发酵液生产的产物克数。

增加作为产物的给定精细化学品的时空产率是通过在给定反应空间中增加由其体积或重量定义的随时间的产物形成率来增加特定产物的生产率。在给定时期内，当时空产率增加时，在相同设置下会生产更大量的精细化学产物。当时空产率增加时，在给定的设置中在更短的时间内也可以生产同样数量的精细化学品。

碳转化效率被称为特定产物形成量与每消耗的碳源量的比率。其可以是关于摩尔比，例如每消耗1摩尔碳源产生的产物的摩尔数。碳转化效率也可以描述为最终分子中功能部分与每分子产物的比率。

在一个优选的定义中，根据本发明的碳转化效率被定义为在所述方法中使用的每碳源重量产生的特定产物的重量。这种计算可能是有利的，因为可以直接比较使用具有不同分子量的不同碳源的碳转化效率(例如麦芽糖、葡萄糖、甘露糖、甘油、蔗糖、葡萄糖酸盐)。

此外，精细化学品生产的碳转化效率通过本发明的方法和在本发明的宿主细胞中增加。使用cAMP增加的宿主细胞，提供给细胞的碳原子百分比增加被导入所需的精细化学产品中，因此由于不需要的副反应而损耗较少的碳或者通过细胞呼吸作用使较少的碳损耗为二氧化碳。在更加气候友好型经济的道路上，减少碳损耗为二氧化碳是所需的。

优选地，与对照即只含有正常调节的腺苷酸环化酶的未修饰细胞相比，碳转化效率和/或时空产率增加1％、2％、3％…，更优选增加4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。

更优选地，碳转化效率和/或时空产率提高了1.1、1.2、1.25、1.3、1.4、1.5、1.75、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。

提高宿主生物生产一种或多种精细化学品的碳转化效率的方法也是本发明的一部分，其中与未修饰的宿主生物相比，所述宿主生物的cAMP水平提高。

碳底物灵活性由宿主细胞使用多于一种的特定碳源的能力定义。适用于精细化学品生产菌株的典型碳源可见于Escherichia coli(E.coli)and Salmonella:Cellular andMolecular Biology ASM press 1996。如本文通篇所用，增加的碳底物灵活性的特征是修饰的宿主细胞在未修饰的宿主细胞在其上不能生长的碳源上生长，或与对照相比在碳源上实质更好生长，所述对照可以是野生型细胞或未修饰的宿主细胞。

碳源被分批加入培养基和/或在进料阶段进料。典型的精细化学品生产周期从24小时到100小时。

宿主生物的cAMP水平优选为细胞内cAMP水平，更优选为宿主生物的细胞质cAMP水平。

cAMP水平可以通过本领域已知的许多方法确定，例如使用cAMP特异性抗体，然后可以与包括基于荧光素酶的测定在内的一系列检测方法一起使用。可使用用于测量细胞、组织和生物样品中cAMP水平的商业试剂盒(例如得自Sigma Aldrich CA200 cAMP EnzymeImmunoassay Kit)。其它测定cAMP的方法参见：Crasnier 1990,Journal of GeneralMicrobiology 136:1825-1831，Guidi-Rontani et al.1981J.Bacteriology 148:753-761，或J.Chromatogr.B.Analyt.Technol.Biomed.Life Sci.2012 909:14-21。

在一个实施方案中，cAMP水平通过外部添加cAMP和/或通过将cAMP导入或重新导入宿主细胞而增加。在另一个实施方案中，宿主生物的cAMP水平通过使在野生型腺苷酸环化酶中发现的调节活性失活和/或引入缺乏在野生型腺苷酸环化酶中发现的调节活性的突变腺苷酸环化酶的步骤来增加。在另一个实施方案中，cAMP水平可以通过降低具有3’,5’cAMP磷酸二酯酶(EC 3.1.4.53)和任选作用于3,5cAMP的其它二酯酶如EC 3.1.4.17或EC3.1.4.16类别酶活性的酶的活性而增加。活性降低可以通过例如基因敲除、反义或RNAi技术、引入活性降低或活性消除突变或通过抑制剂来实现。3’,5’cAMP磷酸二酯酶的一个实例是由大肠杆菌的基因cpdA编码的酶。增加细胞中cAMP水平的另一种方式是使用百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)的腺苷酸环化酶毒素的腺苷酸环化酶结构域或完整的腺苷酸环化酶毒素蛋白。

本发明的方法是与未修饰的宿主生物相比增加宿主生物生产的一种或多种精细化学品的时空产率以及增加宿主生物生产一种或多种精细化学品的碳底物灵活性和碳转化效率的方法，所述方法包括以下步骤：提供能够生产所述一种或多种精细化学品的宿主生物，增加所述宿主生物的腺苷3’,5’-环单磷酸(cAMP，CAS编号：60-92-4)水平，将所述宿主生物维持在允许其生长的环境中，将所述宿主生物在存在底物和营养素的情况下以及在适合生产一种或多种精细化学品的条件下生长，并且任选从所述宿主生物或其剩余物中分离一种或多种精细化学品，其中所述宿主生物适于以未修饰和修饰形式生产所述一种或多种精细化学品。

在一个实施方案中，宿主生物的cAMP水平以可诱导方式增加并且所述增加是与没有这种诱导的宿主生物进行比较的。本领域已知例如通过诱导物异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导物依赖性基因表达的方法。

在一个优选的实施方案中，可以通过在宿主细胞中提供腺苷酸环化酶蛋白来实现增加的cAMP水平，所述腺苷酸环化酶蛋白具有无活性的、受抑制的或缺失的调节结构域(本文称为无活性调节结构域或无活性调节部分)和功能性催化结构域以产生cAMP。由于抑制剂的存在，或由于失活突变或由于腺苷酸环化酶蛋白的调节域的全部或部分缺失，因此无活性调节结构域可以是无活性的。可以通过多种方式实现腺苷酸环化酶蛋白的部分或全部调节结构域的缺失，例如通过引入截短的腺苷酸环化酶基因的拷贝，如本发明中以多种方式所示，或通过改变腺苷酸环化酶的mRNA或通过提前终止转录物的蛋白质翻译或通过在翻译后去除部分或全部调节结构域而实现。

腺苷酸环化酶(adenylate cyclase)也称为3’,5’-环AMP合成酶、腺苷环化酶(Adenyl cyclase)、腺苷酸环化酶(Adenylyl cyclase)或ATP焦磷酸裂解酶。

以WO 98/29538公开的国际专利申请公开了棉病囊菌(Ashbya gossypii)的腺苷酸环化酶基因并且所述腺苷酸环基因可用于微生物中以生产精细化学品如核黄素。此外，在所述申请中公开了当腺苷3’,5’-环单磷酸(3’,5’-环AMP或cAMP，CAS编号:60-92-4)生产部分中内源性腺苷酸环化酶基因已经被破坏时，在含葡萄糖培养基上生长的真菌棉病囊菌的核黄素生产增加。还公开了通过添加cAMP增加cAMP水平对被破坏的菌株中核黄素生产有负面影响。

已经表明，改变腺苷酸环化酶的活性对碳源的吸收有影响，无论是利用所谓的磷酸转移酶***(PTS)还是使用其它机制，都受到编码腺苷酸环化酶的cyaA基因突变影响。已经表明，cyaA中的突变导致无法利用碳源如乳糖、麦芽糖、***糖、甘露醇或甘油，并且在葡萄糖、果糖和半乳糖上发酵较弱且生长缓慢(Perlman R,et al.1969Biochemical andBiophysical Research Communications 37(1),pp.151-157)。

以前没有表明精细化学品、特别是寡糖的生产受到增加cAMP合成的cyaA基因改变的积极影响。

如上所述，失活在野生型腺苷酸环化酶中发现的调节活性可以通过多种方式实现，例如通过使用抑制剂，或在腺苷酸环化酶野生型蛋白质的全部或部分调节结构域中由于失活突变或由于缺失所致，例如通过部分改变或缺失宿主生物中编码腺苷酸环化酶的mRNA、腺苷酸环化酶的mRNA翻译或通过突变或缺失编码腺苷酸环化酶的调节部分的基因序列。例如，可以使用CRISPR/CAS技术(Wang,HH.(2013),Mol.Syst.Biol.9(1):641)特异性消除或以非功能性方式置换负责腺苷酸环化酶蛋白的调节部分的腺苷酸环化酶的部分基因序列。

以WO2011102305公开的国际专利申请公开了大肠杆菌cyaA基因第432位亮氨酸的特异性突变可用于氨基酸生产。Reddy et al.(Analytical Biochemistry 231,282–286(1995))和Crasnier et al.(J.Gen.Microbiol.1990；136:1825-31,Mol.Gen.Genet.1994；243:409-16)公开了大肠杆菌腺苷酸环化酶的催化结构域位于蛋白质的N末端部分并且C末端部分的缺失可能会增加腺苷酸环化酶活性或可能干扰效应物的负调节。Lindner(Biochem.J.(2008),415,449-454)公开了对包含氨基酸位置1至412的大肠杆菌腺苷酸环化酶催化部分残基的详细研究结果。

优选地，调节部分或结构域被定义为具有腺苷酸环化酶活性的蛋白质部分，其不直接参与cAMP的生产，但控制含有活性位点的cAMP生产部分的活性。

可用于本发明的方法和宿主细胞的腺苷酸环化酶生产部分是具有EC 4.6.1.1的酶活性并且具有产生腺苷3’,5’-环单磷酸(cAMP)的能力的蛋白质或其部分。

在大肠杆菌细胞中，发现了两种腺苷酸环化酶蛋白的变体和编码其的基因。一种是广泛发现的蛋白质，长度为848个氨基酸(SEQ ID NO:19，由SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列编码)，以及这种全长蛋白质的变体，其具有6个氨基酸的重复并因此具有854个氨基酸(SEQ ID NO:20，由SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列编码)。在较长变体中，氨基酸基序GEQSMI重复存在(见图2，第2部分带下划线的氨基酸序列)，而具有848个氨基酸的变体仅含有一次这个基序。这个基序是在腺苷酸环化酶中发现的PFAM结构域PF01295的部分。在本发明中公开了大肠杆菌的这两种腺苷酸环化酶变体任一种的去调节形式导致增加的时空产率、碳转化效率和碳源灵活性。

在本发明上下文中，大肠杆菌的cyaA基因被理解为SEQ ID NO 9或10所示的任何基因或编码SEQ ID NO:19或20的蛋白质序列或与SEQ ID NO:19或20任一序列的全长具有70％相同性、优选至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、更优选至少95％、至少97％、至少98％或至少99％相同性的蛋白质以及最优选编码具有腺苷酸环化酶活性即EC 4.6.1.1活性的蛋白质的DNA。

具有降低的或失活的调节部分但具有cAMP形成活性的截短的腺苷酸环化酶蛋白在本发明的方法和宿主细胞中是有益的。

在本发明的方法和宿主细胞中特别有用的是腺苷酸环化酶蛋白，其对应于由大肠杆菌cyaA基因编码的蛋白质，但缺乏调节活性、优选缺乏对应于SEQ ID NO:19或20提供的CyaA蛋白的C-末端部分的部分，或与SEQ ID NO:19或20提供的蛋白质序列的位置1至412、更优选SEQ ID NO:19或20提供的蛋白质序列的第1至420位具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％序列相同性的腺苷酸环化酶蛋白，以及优选缺少在SEQID No:19或20提供的蛋白质序列的位置420、450、558、585、653、709、736或776、更优选450、558、585、653、709或736、甚至更优选在SEQ ID No:19或20提供的蛋白质序列的位置558、582、585、653、709、736或776之后的大肠杆菌腺苷酸环化酶部分。在给定位置之后应理解为在感兴趣的蛋白质中发现的在对应于SEQ ID NO:19或20给定位置的氨基酸之后的所有氨基酸。

示例的缩短的腺苷酸环化酶蛋白和基因在表1中示出。

表1：序列表中全长和缩短的腺苷酸环化酶蛋白和基因的概述。FL是全长的缩写。

蛋白质	DNA SEQ ID NO:	蛋白质SEQ ID NO:	蛋白质含有蛋白质的调节部分
				cyaA420	1	11	否
cyaA450	2	12	否
				cyaA558	3	13	否
cyaA585	4	14	否
				cyaA653	5	15	否
cyaA709	6	16	否
				cyaA736	7	17	否
cyaA776	8	18	否
				FL cyaA	9&10	19&20	是

缩短的蛋白质cyaA653、cyaA709、cyaA736和cyaA776(SEQ ID NO:15至18)含有在854个氨基酸的全长形式(SEQ ID NO:20)中发现的重复GEQSMI基序。其它缩短的形式根本没有这个基序。如以下实施例部分中详细所示，发现本发明的方法和宿主细胞中的有利效果与存在单个或重复GEQSMI基序无关。

在一个优选实施方案中，本发明的方法是增加宿主生物产生一种或多种精细化学品的时空产率以及增加宿主生物产生一种或多种精细化学品的碳底物灵活性和碳转化效率的方法，包括以下步骤：提供能够产生所述一种或多种精细化学品的宿主生物，提供能够在宿主生物中产生cAMP的去调节的腺苷酸环化酶，将宿主生物维持在允许其生长的环境，将宿主生物在存在底物和营养物的情况下并在适合产生一种或多种精细化学品的条件下生长并任选从宿主生物或其剩余物中分离一种或多种精细化学品。

在一个实施方案中，可用于本发明的方法和宿主细胞的去调节的腺苷酸环化酶蛋白是具有腺苷酸环化酶活性的酶，而没有在宿主细胞的野生型腺苷酸环化酶蛋白中发现的调节部分。优选地，其是宿主细胞的腺苷酸环化酶蛋白-或是有活性的腺苷酸环化酶但不像所述宿主细胞的未修饰的腺苷酸环化酶那样受到至少一些调节机制影响的其变体或部分-并且对应于如SEQ ID NO:19或20提供的大肠杆菌腺苷酸环化酶。优选地，可用于本发明的方法和宿主细胞的去调节的腺苷酸环化酶缺少对应于SEQ ID NO:19或20提供的CyaA蛋白的C-末端部分的部分，或者是与SEQ ID NO:19或20提供的蛋白质序列的位置1至412具有至少80％序列相同性的腺苷酸环化酶蛋白，更优选与SEQ ID NO:19或20提供的蛋白质序列的位置1至420具有至少80％序列相同性的腺苷酸环化酶蛋白。更优选地，其缺少对应于大肠杆菌腺苷酸环化酶部分的腺苷酸环化酶部分，其在SEQ ID NO:19或20提供的蛋白质序列的位置420、450、558、585、653、709、736或776之后、更优选在位置450、558、585、653、709或736之后、甚至更优选在SEQ ID NO:19或20提供的蛋白质序列的位置558、582、585、653、709、736或776之后，以及最优选缺少对应于SEQ ID NO 19或20的位置777及其后的氨基酸的氨基酸。在另一个优选实施方案中，去调节的腺苷酸环化酶蛋白是宿主生物的内源性腺苷酸环化酶的部分，其对应于SEQ ID NO:11至18的任何序列，更优选是SEQ ID NO:11至18所示的任何序列或由SEQ ID NO:1至8的任何序列编码，或其变体，包括具有标签的蛋白质和包含去调节的腺苷酸环化酶的融合蛋白。在一个实施方案中还包括与SEQ ID NO:11至18的序列相比具有一个至几个氨基酸变化的氨基酸序列，只要这些氨基酸序列具有腺苷酸环化酶活性而没有如在对应于SEQ ID NO 19或20蛋白质的宿主细胞的未修饰的CyaA蛋白中发现的所述活性的调节。优选地，去调节的腺苷酸环化酶导致宿主细胞的cAMP水平升高。

优选地，这种氨基酸序列的变体不包含在对应于国际申请WO2011102305中公开的SEQ ID NO:2序列的第432位的位置处的腺苷酸环化酶部分中L-赖氨酸残基被L-谷氨酰胺取代。

含有去调节的腺苷酸环化酶蛋白的经修饰的宿主细胞可以通过多种方式例如突变和选择、重组方法例如引入缩短的cyaA基因和基因编辑方法如CRISPR/CAS实现。

本发明的或可用于本发明方法的宿主细胞优选为细菌或真菌宿主细胞，更优选为选自革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的细菌细胞或酵母细胞，甚至更优选选自芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、肠球菌属(Enterococcus)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、支原体属(Mycoplasma)、巴氏杆菌属(Pasteurella)、红杆菌属(Rhodobacter)、红假单胞菌属(Rhodoseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、弧菌属(Vibrio)和黄单胞菌属(Xanthomonas)，或者毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluveromyces)或酵母属(Saccharomyces)的酵母细胞，甚至更优选大肠杆菌细胞、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)细胞或酵母属(Saccharomyces sp.)细胞。

在一个实施方案中，本发明的宿主细胞是细菌或真菌宿主细胞，优选细菌细胞，优选利用cAMP调节细胞途径的细胞，更优选具有功能性腺苷酸环化酶的细胞，更优选变形杆菌(proteobacterium)、γ变形杆菌、肠杆菌科细菌，更优选埃希氏菌属细菌，更优选大肠杆菌种细菌。

根据本发明的精细化学品是包含两个或更多个糖单元的生化物质。优选地，精细化学品是由遗传修饰的生物产生的生化物质。更优选地，本发明的精细化学品包含或由一种或多种寡糖组成。甚至更优选地，由本发明的宿主细胞和方法产生的精细化学品包含或由人乳寡糖(HMO)组成，甚至更优选中性或唾液酸化HMO，甚至更优选岩藻糖基化或唾液酸化HMO，甚至更优选所述精细化学品为3’-唾液酸乳糖(3’-SL)、6’-唾液酸乳糖(6’-SL)、2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、二岩藻糖基乳糖(2,3-DFL)、3’-岩藻糖基乳糖(3’-FL)、乳-N-丙糖、乳-N-四糖(LNT)或乳-N-新四糖(LNnT)。在

MR et al.(2006).J.Agric.FoodChem.54:7471–7480、Bode L(2009)Nutr.Rev.67:183–191、Bode L(2012)Glycobiology22:1147–1162、Bode L(2015)Early Hum.Dev.91:619–622中可以找到人乳寡糖的实例。

在最优选的实施方案中，本发明的精细化学品是2’-FL或6’-SL。

术语和含义

除非另有说明，否则本文使用的术语应由相关领域普通技术人员根据常规用法来理解。除了本文提供的术语定义之外，分子生物学中常用术语的定义也可见于Rieger etal.,1991Glossary of genetics:classical and molecular,5th Ed.,Berlin:Springer-Verlag；和Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel et al.,Eds.,Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,(1998Supplement)。

应当理解，如在说明书和权利要求书中使用的，“a”或“an”可以表示一个或多个，这取决于使用其的上下文。因此，例如，提及“一个细胞”可以意味着可以使用至少一个细胞。应当理解，本文使用的术语仅是为了描述特定实施方案的目的，而不意图是限制性的。

在本发明的描述中，使用大肠杆菌中相应基因的名称来鉴别基因和蛋白质。然而，除非另有说明，这些名称的使用根据本发明具有更一般的含义并涵盖在其它生物体、特别是微生物中的所有相应基因和蛋白质。

用于克隆、DNA分离、扩增和纯化、涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶等的酶促反应的标准技术以及各种分离技术是本领域技术人员已知和常用的那些技术。许多标准技术描述于M.Green&J.Sambrook(2012)Molecular Cloning:a laboratorymanual,4th Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press,CSH,New York；Ausubelet al.,Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Online Library；Maniatiset al.,1982Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,N.Y.；Wu(Ed.)1993Meth.Enzymol.218,Part I；Wu(Ed.)1979Meth Enzymol.68；Wu et al.,(Eds.)1983Meth.Enzymol.100and 101；Grossman and Moldave(Eds.)1980Meth.Enzymol.65；Miller(Ed.)1972Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.；Old and Primrose,1981Principles of GeneManipulation,University of California Press,Berkeley；Schleif and Wensink,1982Practical Methods in Molecular Biology；Glover(Ed.)1985DNA Cloning Vol.Iand II,IRL Press,Oxford,UK；Hames and Higgins(Eds.)1985Nucleic AcidHybridization,IRL Press,Oxford,UK；以及Setlow and Hollaender 1979GeneticEngineering:Principles and Methods,Vols.1-4,Plenum Press,New York。

如果本文没有另外说明，缩写和命名在使用时被视为该领域的标准并且通常用于专业期刊例如本文引用的那些。

与属性或值有关的术语“实质上”、“约”、“大约”、“基本上”等也分别定义精确属性或精确值。在相同功能活性或基本相同功能的上下文中，术语“基本上”是指与参考功能相比，功能差异优选在20％的范围内，更优选在10％的范围内，最优选在5％或更小的范围内。在制剂或组合物的上下文中，术语“基本上”(例如“基本上由化合物X组成的组合物”)在本文中可以用为在制剂或组合物中基本上含有具有给定作用的所提及的化合物，并且没有具有这种作用的其它化合物或这种化合物的最多量不表现出可测量的或相关作用。在给定数值或范围的上下文中，术语“约”特别涉及在给定值或范围的20％、10％或5％内的值或范围。如本文所用，术语“包括”还涵盖术语“由…组成”。

术语“分离的”是指所述材料基本上不含在其原始环境中与其天然相关的至少一种其它组分。例如，存在于活体动物中的天然存在的多核苷酸、多肽或酶不是分离的，但是与天然***中的一些或所有共存材料分开的相同多核苷酸、多肽或酶是分离的。作为进一步的实例，分离的核酸例如DNA或RNA分子是不与5’和3’侧翼序列直接邻接的核酸，而当其存在于其从中衍生的生物体的天然存在的基因组中时，通常是直接邻接。这种多核苷酸可以是引入具有不相关遗传背景的细胞基因组中载体的一部分(或引入具有基本相似遗传背景的细胞基因组中、但位于与其天然存在的位点不同的位点)，或通过PCR扩增或限制性内切酶消化产生，或通过体外转录产生的RNA分子，和/或这种多核苷酸、多肽或酶可以是组合物的一部分，并且仍然是分离的，因为这种载体或组合物不是其天然环境的一部分。

“纯化的”是指材料处于相对纯的状态，例如至少约90％纯、至少约95％纯、或至少约98％或99％纯。优选地，“纯化的”是指材料处于100％纯状态。

“合成”或“人工”化合物是通过体外化学或酶合成产生的。其包括但不限于用对于宿主生物体例如酵母细胞宿主或其它表达选择宿主的最佳密码子使用制成的变体核酸或与野生型蛋白质序列相比具有氨基酸修饰例如取代的变体蛋白质序列，例如以优化多肽的性质。

术语“非天然存在的”是指不存在于其原始环境或来源中的(多)核苷酸、氨基酸、(多)肽、酶、蛋白质、细胞、生物体或其它材料，尽管其可以最初源自其原始环境或来源，然后通过其它方式再生。这种非天然存在的(多)核苷酸、氨基酸、(多)肽、酶、蛋白质、细胞、生物体或其它材料可以在结构和/或功能上与其天然对应物相似或相同。

术语“天然”(或“野生型”或“内源”)细胞或生物体和“天然”(或野生型或内源)多核苷酸或多肽是指在自然界中发现的细胞或生物体以及分别以其天然形式和遗传环境的细胞中发现(没有任何人为干预)的所述多核苷酸或多肽。一方面，野生型腺苷酸环化酶应理解为是具有腺苷酸环化酶活性的蛋白质(EC 46.1.1)，包含其正常调节部分或结构域并进行自然界中发现的调节。

“同源”是指例如在位置、结构、功能或特征上具有高度相似性的基因、多肽、多核苷酸，但不一定具有高度的序列相同性。“同源”不能与“内源”互换使用或作为“异源”的反义词(见下文)。

术语“异源”(或外源或外来或重组)多肽在本文中定义为：

(a)不是宿主细胞天然的多肽。这种异源多肽的蛋白质序列是合成的、非天然存在的“人造”蛋白质序列；

(b)宿主细胞天然的多肽，其中已经进行结构修饰例如缺失、取代和/或***以改变天然多肽；或

(c)宿主细胞天然的多肽，其表达被定量改变或者其表达与天然宿主细胞不同的基因组位置定向，这是通过重组DNA技术例如更强的启动子操作宿主细胞DNA的结果。

上面的描述b)和c)是指天然形式的序列，但不是由用于其生产的细胞天然表达的。因此产生的多肽更准确地定义为“重组表达的内源多肽”，这与上述定义并不矛盾，而是反映了合成或操作的不是蛋白质序列而是产生多肽分子的方式的特定情况。

类似地，术语“异源”(或外源或外来或重组)多核苷酸是指：

(a)宿主细胞非天然的多核苷酸；

(b)宿主细胞天然的多核苷酸，其中已经进行结构修饰例如缺失、取代和/或***以改变天然多核苷酸；

(c)宿主细胞天然的多核苷酸，其表达由于通过重组DNA技术例如更强的启动子操纵多核苷酸的调节元件而被定量改变；或

(d)宿主细胞天然的多核苷酸，但由于重组DNA技术的遗传操作而未整合到其天然遗传环境中。

对于两个或多个多核苷酸序列或两个或多个氨基酸序列，术语“异源”用于表征所述两个或多个多核苷酸序列或两个或多个氨基酸序列不天然存在彼此的特定组合。

术语“基因”是指参与产生多肽链的DNA片段；其包括在编码区前后的区域(前导和尾随序列)以及在各个编码片段(外显子)之间的***序列(内含子)。

术语“基因”是指含有遗传信息的DNA片段，其从父母传给后代并促成生物体的表型。基因对生物体的形成和功能的影响是通过转录成RNA(tRNA、rRNA、mRNA、非编码RNA)来介导的，在mRNA的情况下，通过翻译成肽和蛋白质来介导。

术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换使用，是指核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或两者的组合，以任何长度的聚合无支链形式。

对于核苷酸序列，例如共有序列，使用IUPAC核苷酸命名法(NomenclatureCommittee of the International Union of Biochemistry(NC-IUB)(1984)."Nomenclature for Incompletely Specified Bases in Nucleic Acid Sequences")，与本发明相关的核苷酸和核苷酸歧义定义如下：A，腺嘌呤；C，胞嘧啶；G，鸟嘌呤；T，胸腺嘧啶；K，鸟嘌呤或胸腺嘧啶；R，腺嘌呤或鸟嘌呤；W，腺嘌呤或胸腺嘧啶；M，腺嘌呤或胞嘧啶；Y，胞嘧啶或胸腺嘧啶；D，不是胞嘧啶；N，任意核苷酸。

此外，符号“N(3-5)”表示所指示的共有位置可以具有3至5个任意(N)核苷酸。例如，共有序列“AWN(4-6)”代表3种可能变体，末端有4、5或6个任意核苷酸：AWNNNN、AWNNNNN、AWNNNNNN。

如本文所定义的术语“杂交”是其中基本上互补的核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程可以完全在溶液中发生，即两个互补核酸都在溶液中。杂交过程也可以用固定在基质如磁珠、琼脂糖珠或任何其它树脂上的互补核酸之一来进行。此外，杂交过程可以通过将互补核酸之一固定于固体支持物如硝化纤维素或尼龙膜或通过例如光刻于例如硅质玻璃支持物(后者称为核酸阵列或微阵列或核酸芯片)固定而发生。为了使杂交发生，通常将核酸分子进行热或化学变性以将双链熔解成两个单链和/或从单链核酸去除发夹或其它二级结构。

术语“严格性”是指发生杂交的条件。杂交的严格性受如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成等条件的影响。通常，低严格性条件选择为在低于特定序列的热解链温度(Tm)约30℃在限定的离子强度和pH值的条件。中等严格性条件是低于Tm温度20℃，高严格性条件是低于Tm温度10℃。高严格性杂交条件通常用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。然而，由于遗传密码的简并性，核酸可能在序列上发生偏差但仍编码基本相同的多肽。因此，有时可能需要中等严格性杂交条件来鉴定这种核酸分子。

“Tm”是在限定的离子强度和pH值下的温度，在此50％的靶序列与完美匹配的探针杂交。Tm取决于溶液条件以及探针的碱基组成和长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性杂交。在低于Tm约16℃至最高32℃时获得最大杂交率。杂交溶液中单价阳离子的存在降低了两个核酸链之间的静电排斥，从而促进杂交体形成；这种影响对于高达0.4M的钠浓度是可见的(对于更高浓度，这种影响可忽略)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的熔解温度，每百分比甲酰胺降低0.6至0.7℃，加入50％甲酰胺允许在30-45℃进行杂交，尽管杂交率降低。碱基对错配降低了双链体的杂交率和热稳定性。平均而言，对于大型探针，Tm为每％碱基错配降低约1℃。Tm可以使用以下等式计算，取决于杂交体的类型：

·DNA-DNA杂交体(Meinkoth and Wahl,Anal.Biochem.,138:267-284,1984)：

T_m＝81.5℃+16.6xlog[Na⁺]^a+0.41x％[G/C^b]-500x[L^c]^-1-0.61x％甲酰胺

·DNA-RNA或RNA-RNA杂交体：

T_m＝79.8+18.5(log₁₀[Na⁺]^a)+0.58(％G/C^b)+11.8(％G/C^b)²-820/L^c

·寡-DNA或寡-RNA^d杂交体：

对于<20个核苷酸：T_m＝2(l_n)

对于20-35个核苷酸：T_m＝22+1.46(l_n)

^a或对于其它单价阳离子，但仅在0.01-0.4M范围内精确，

^b仅对于30％至75％范围内的％GC精确，

^cL＝碱基对中双链体的长度，

^dOligo，寡核苷酸；l_n，引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。

可以使用多种已知技术中的任何一种来控制非特异性结合，例如，用含蛋白质的溶液封闭膜，向杂交缓冲液中加入异源RNA、DNA和SDS，以及用Rnase处理。对于不相关探针，可以通过改变(i)逐渐降低退火温度(例如从68℃至42℃)或(ii)逐渐降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)之一进行一系列杂交。熟练技术人员知道在杂交期间可以改变的各种参数，这些参数将保持或改变严格性条件。

除了杂交条件外，杂交的特异性通常还取决于杂交后洗涤的功能。为去除得自非特异性杂交产生的背景，用稀释盐溶液洗涤样品。这种洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低及洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件通常在或低于杂交严格性条件下进行。阳性杂交产生的信号至少是背景信号的两倍。通常，核酸杂交测定或基因扩增检测程序的合适严格条件如上所述。也可以选择或多或少严格的条件。熟练技术人员知道在洗涤期间可以改变的各种参数，这些参数将保持或改变严格性条件。

例如，长度超过50个核苷酸的DNA杂交体的典型高严格性杂交条件包括在65℃在1×SSC中或在42℃在1×SSC和50％甲酰胺中杂交，然后在65℃在0.3×SSC中洗涤。长度超过50个核苷酸的DNA杂交体的中等严格性杂交条件的实例包括在50℃在4×SSC中或在40℃在6×SSC和50％甲酰胺中杂交，然后在50℃在2×SSC中洗涤。杂交体的长度是杂交核酸的预期长度。当已知序列的核酸杂交时，杂交体长度可以通过比对序列和鉴定本文所述的保守区域来确定。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可另外包括5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。高严格性条件的另一个实例是在65℃在0.1×SSC(包含0.1SDS和任选包含5×Denhardt试剂、100μg/ml变性片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠)中杂交，然后在65℃在0.3×SSC中洗涤。

为定义严格性水平，可以参考Sambrook et al.(2001)Molecular Cloning:alaboratory manual,3rd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,CSH,NewYork or to Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989和每年更新)。

“重组”(或转基因)就细胞或生物体而言是指所述细胞或生物体含有通过基因技术引入的外源多核苷酸，而对于多核苷酸而言是指通过基因技术/重组DNA技术带来的所有那些构建，其中以下任一不在其野生型遗传环境中或已被修饰

(a)多核苷酸的序列或其一部分，或

(b)一种或多种与多核苷酸例如启动子可操作地连接的遗传控制序列，或

(c)a)和b)二者。

还应注意，术语“分离的核酸”或“分离的多肽”在某些情况下可分别被认为是“重组核酸”或“重组多肽”的同义词，分别是指不位于其天然遗传环境或细胞环境中的核酸或多肽，和/或已通过重组方法修饰。分离的核酸序列或分离的核酸分子是不在其天然环境周围或其天然核酸邻域中，但其在物理上和功能上与其它核酸序列或核酸分子连接并且被发现作为核酸构建体、载体序列或染色体的一部分。通常，分离的核酸是通过在实验室条件下从细胞中分离RNA并将其转化为拷贝DNA(cDNA)获得的。

术语“控制序列”在本文中定义为包括影响多核苷酸表达包括但不限于编码多肽的多核苷酸的表达的所有序列。每个控制序列对于所述多核苷酸而言可以是天然的或外来的，或者对于彼此而言可以是天然的或外来的。这种控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、5’-UTR、核糖体结合位点(RBS、shine dalgarno序列)、3’-UTR、信号肽序列和转录终止子。所述控制序列最低限度包括启动子和转录起始和终止信号。

术语“可操作地连接”是指所述组分处于允许其以其预期的方式起作用的关系。例如，与编码序列可操作地连接的调节序列以这样的方式连接，由此在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。

核酸、蛋白质、酶或生物体的“亲本”(或“参考”或“模板”)(也称为“亲本核酸”、“参考核酸”、“模板核酸”、“亲本蛋白”、“参考蛋白”、“模板蛋白”、“亲本酶”、“参考酶”、“模板酶”、“亲本生物”、“参考生物”或“模板生物”)是引入变化的起点(例如通过引入一个或多个核酸或氨基酸取代)获得亲本的“变体”。因此，诸如“酶变体”或“序列变体”或“变体蛋白”之类的术语用于将修饰的或变体序列、蛋白质、酶或生物体与作为相应的变体序列、蛋白质、酶或生物体来源的亲本序列、蛋白质、酶或生物体区分开来。因此，亲本序列、蛋白质、酶或生物体包括野生型序列、蛋白质、酶或生物体，以及用于开发进一步变体的野生型序列、蛋白质、酶或生物体的变体。变体蛋白质或酶与亲本蛋白质或酶的氨基酸序列存在一定差异，但变体至少保持了各自亲本的功能性质，例如酶性质。在一个实施方案中，当与相应的亲本酶相比时，变体酶的酶性质得以改善。在一个实施方案中，变体酶与相应的亲本酶相比具有至少相同的酶活性，或者变体酶与相应的亲本酶相比具有增加的酶活性。

在描述变体时，使用如下描述的命名法：本发明中使用的单个氨基酸的缩写是根据公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。虽然下面的定义描述了氨基酸变化背景下的变体，但核酸可以被类似地修饰，例如通过核苷酸的取代、缺失和/或***修饰。

“取代”通过提供原始氨基酸、随后是氨基酸序列中的位置编号、随后是取代的氨基酸来描述。例如，用丙氨酸取代位置120的组氨酸被称为“His120Ala”或“H120A”。

“缺失”通过提供原始氨基酸、随后是氨基酸序列中的位置编号、随后是*来描述。因此，位置150的甘氨酸的缺失被称作“Gly150*”或G150*”。或者，缺失由例如“缺失D183和G184”指示。

“***”通过提供原始氨基酸、随后是氨基酸序列中的位置编号、随后是原始氨基酸和附加氨基酸来描述。例如，在位置180甘氨酸之后***赖氨酸被称作“Gly180GlyLys”或“G180GK”。当***多于一个氨基酸残基时，例如在Gly180后***Lys和Ala可表示为：Gly180GlyLysAla或G180GKA。

在同一位置发生取代和***的情况下，这可以表示为S99SD+S99A或简称为S99AD。

在***与现有氨基酸残基相同的氨基酸残基的情况下，很明显会出现命名法的简并。例如，如果在上述示例中的甘氨酸之后***甘氨酸，则这将由G180GG指示。

包含多个改变的变体由“+”分隔，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。或者，多个改变可以用空格或逗号分隔，例如分别为R170Y G195E或R170Y,G195E。

在一个位置可以引入不同改变时，所述不同改变用逗号分隔，例如“Arg170Tyr,Glu”表示在位置170的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。或者，可以在括号中指出不同的改变或任选的取代，例如Arg170[Tyr,Gly]或Arg170{Tyr,Gly}或简称R170[Y,G]或R170{Y,G}。

变体可以包括一个或多个改变，或者是相同类型，例如均是取代，或者是取代、缺失和/或***的组合。可以将改变引入核酸或氨基酸序列。

在一个实施方案中，去调节的腺苷酸环化酶的变体包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40或更多个改变并且具有腺苷酸环化酶活性。

去调节的腺苷酸环化酶序列的变体包括分别与SEQ ID NO:1至10或10至20的任何序列具有约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性并具有腺苷酸环化酶活性的核酸和多肽，并且优选不具有或具有无活性的或下调的或不存在野生型腺苷酸环化酶的调节部分。

对于取代选自SEQ ID NO:1至10或26任何序列的碱基序列的氨基酸，而无关乎在其它这些序列中氨基酸的出现，以下适用，其中字母使用其常用缩写表示L氨基酸，括号内的数字表示置换的优先级(数字越大表示优先级越高)：A可以由选自S(1)、C(0)、G(0)、T(0)或V(0)的任何氨基酸置换。C可以由A(0)置换。D可以由选自E(2)、N(1)、Q(0)或S(0)的任何氨基酸置换。E可以由选自D(2)、Q(2)、K(1)、H(0)、N(0)、R(0)或S(0)的任何氨基酸置换。F可以由选自Y(3)、W(1)、I(0)、L(0)或M(0)的任何氨基酸置换。G可以由选自A(0)、N(0)或S(0)的任何氨基酸置换。H可以由选自Y(2)、N(1)、E(0)、Q(0)或R(0)的任何氨基酸置换。I可以由选自V(3)、L(2)、M(1)或F(0)的任何氨基酸置换。K可以由选自R(2)、E(1)、Q(1)、N(0)或S(0)的任何氨基酸置换。L可以由选自I(2)、M(2)、V(1)或F(0)的任何氨基酸置换。M可以由选自L(2)、I(1)、V(1)、F(0)或Q(0)的任何氨基酸置换。N可以由选自D(1)、H(1)、S(1)、E(0)、G(0)、K(0)、Q(0)、R(0)或T(0)的任何氨基酸置换。Q可以由选自E(2)、K(1)、R(1)、D(0)、H(0)、M(0)、N(0)或S(0)的任何氨基酸置换。R可以由选自K(2)、Q(1)、E(0)、H(0)或N(0)的任何氨基酸置换。S可以由选自A(1)、N(1)、T(1)、D(0)、E(0)、G(0)、K(0)或Q(0)的任何氨基酸置换。T可以由选自S(1)、A(0)、N(0)或V(0)的任何氨基酸置换。V可以由选自I(3)、L(1)、M(1)、A(0)或T(0)的任何氨基酸置换。W可以由选自Y(2)或F(1)的任何氨基酸置换。Y可以由选自F(3)、H(2)或W(2)的任何氨基酸置换。

核酸和多肽可以被修饰以包括标签或结构域。标签可用于多种目的，包括用于检测、纯化、溶解或固定，并且可包括例如生物素、荧光团、表位、交配因子或调节序列。结构域可以是任何大小并且提供所需功能(例如赋予增加的稳定性、溶解度、活性，简化纯化)并且可以包括例如结合结构域、信号序列、启动子序列、调节序列、N末端扩展，或C30末端扩展。也可以使用标签和/或结构域的组合。

术语“融合蛋白”是指通过本领域已知的任何方式连接在一起的两个或更多个多肽。这些方法包括化学合成或通过重组工程剪接编码核酸。

基因编辑

基因编辑或基因组编辑是一种遗传工程，其中在基因组中***、置换或移除DNA，可以通过使用多种技术获得，例如“基因改组”或“定向进化”，包括DNA改组、然后进行适当的筛选和/或选择以产生编码具有修饰的生物活性的蛋白质的核酸或其部分的变体(Castle et al.,(2004)Science 304(5674):1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)，或者使用“T-DNA激活”标签(Hayashi et al.Science(1992)1350-1353)，其中所得转基因生物由于修饰的基因表达靠近引入的启动子而显示显性表型，或者使用“TILLING”(定向诱导基因组局部突变)并且是指可用于产生和/或鉴定编码具有修饰的表达和/或活性的蛋白质的核酸的诱变技术。TILLING还允许选择携带这种突变变体的生物。TILLING方法是本领域熟知的(McCallum et al.,(2000)Nat Biotechnol 18:455-457；由Stemple(2004)NatRev Genet 5(2):145-50回顾)。另一种技术使用人工工程化的核酸酶，如锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas***和工程化的大范围核酸酶如重新工程化的归巢核酸内切酶(Esvelt,KM.；Wang,HH.(2013),Mol Syst Biol 9(1):641；Tan,WS.etal.(2012),Adv Genet 80:37–97；Puchta,H.；Fauser,F.(2013),Int.J.Dev.Biol 57:629–637)。

“酶活性”是指酶发挥的至少一种催化作用。在一个实施方案中，酶活性表示为每毫克酶的单位(比活性)或每个酶分子每分钟转化的底物分子(分子活性)。在腺苷酸环化酶活性的情况下，所述分子酶活性可以理解为每分子腺苷酸环化酶或含有腺苷酸环化酶的蛋白质部分每分钟产生的cAMP分子数。

序列的比对优选使用Needleman和Wunsch算法进行—Needleman,Saul B.&Wunsch,Christian D.(1970)."A general method applicable to the search forsimilarities in the amino acid sequence of two proteins".Journal of MolecularBiology.48(3):443–453。例如，这个算法在“NEEDLE”程序中实施，该程序执行两个序列的全局比对。NEEDLE程序包含在例如The European Molecular Biology Open SoftwareSuite(EMBOSS)中，其是多种程序的集合：The European Molecular Biology OpenSoftware Suite(EMBOSS),Trends in Genetics 16(6),276(2000)。

当与亲本酶比较时，酶变体可以通过其序列相同性来定义。序列相同性通常以“序列相同性％”或“相同性％”提供。为在第一步中确定两个氨基酸序列之间的相同性百分比，在这两个序列之间产生成对序列比对，其中将两个序列在其全长上比对(即成对全局比对)。比对是使用实施Needleman-Wunsch算法的程序生成的(J.Mol.Biol.(1979)48,p.443-453)，优选使用程序“NEEDLE”(The European Molecular Biology Open Software Suite(EMBOSS)，使用程序默认参数(gapopen＝10.0，gapextend＝0.5和matrix＝EBLOSUM62)。用于本发明目的的优选比对是从中可以确定最高序列相同性的比对。

以下示例旨在说明两个核苷酸序列，但相同计算适用于蛋白质序列：

Seq A:AAGATACTG长度：9个碱基

Seq B:GATCTGA长度：7个碱基

因此，较短的序列是序列B。

产生成对全局比对，在全长上显示两个序列，获得：

比对中的符号“|”表示相同残基(对于DNA表示碱基或对于蛋白质表示氨基酸)。相同残基数为6。

比对中的符号“-”表示空位。在Seq B内通过比对引入的空位数为1。在Seq B的边界通过比对引入的空位数为2，在Seq A的边界引入的空位数为1。

显示比对序列在其全长上的比对长度为10。

根据本发明产生在其全长上显示较短序列的成对比对结果导致：

根据本发明产生在其全长上显示序列A的成对比对结果导致：

根据本发明产生在其全长上显示序列B的成对比对结果导致：

显示较短序列在其全长上的比对长度为8(存在一个空位，这是较短序列的比对长度的因子)。

因此，显示Seq A在其全长上的比对长度为9(意味着Seq A是本发明的序列)。

因此，显示Seq B在其全长上的比对长度为8(意味着Seq B是本发明的序列)。

在比对两个序列后，在第二步中，应从比对中确定相同性值。因此，根据本描述，应用以下相同性百分比计算：

相同性％＝(相同残基/比对区域的长度，该区域在其全长上显示较短序列)*100。因此，根据这个实施方案，与两个氨基酸序列的比较相关的序列相同性通过将相同残基数除以比对区域的长度来计算，该比对区域在其全长上显示较短序列。这个值乘以100得到“相同性％”。根据上面提供的示例，相同性％为：(6/8)*100＝75％。

基因编辑

已知许多在生物体基因组中进行靶向修饰的技术。最广为人知的是称为CRIPR或CRISPR/CAS的技术：

CRISPR(成簇规则间隔短回文重复序列)技术可用于修饰靶生物的基因组，例如将任何给定DNA片段引入基因组的几乎任何位点，用所需序列置换部分基因组或精确缺失靶生物基因组中的给定区域。这样可以前所未有的精度进行基因组操作。

CRISPR***最初被确定为属于链球菌属的细菌适应性防御机制(WO2007/025097)。这些细菌CRISPR***依赖于与切割蛋白复合的引导RNA(gRNA)来指导入侵病毒DNA中存在的互补序列的降解。现已示出CRISPR***在各种真核生物中用于遗传操作的应用(WO2013/141680；WO2013/176772；WO2014/093595)。Cas9是CRISPR/Cas***中第一个被识别的蛋白质，是一种大单体DNA核酸酶，通过两种非编码RNA：CRSIPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的复合物引导至与PAM(原型间隔区相邻基序)序列基序相邻的DNA靶序列。此外，通过crRNA与tracrRNA融合产生的合成RNA嵌合体(单向导RNA或sgRNA)示出具有同等功能(WO2013/176772)。来自包含不同于Cas9的DNA核酸酶例如Cpf1、C2c1p或C2c3p的其它来源的CRISPR***已被描述为具有相同功能性(WO2016/0205711、WO2016/205749)。其它作者描述了核酸酶由DNA分子而不是RNA分子引导的***。这种***例如是US2016/0046963公开的AGO***。

一些研究小组发现CRISPR切割性质可用于以前所未有的轻松方式破坏几乎任何生物体基因组中的靶区域。最近，变得清晰的是提供修复模板允许在几乎任何位点编辑具有几乎任何所需序列的基因组，从而将CRISPR转变为强大的基因编辑工具(WO2014/150624、WO2014/204728)。修复模板被称为供体核酸，其在3’和5’末端包含与靶区域互补的序列，使得可以在通过相应核酸酶在靶核酸中引入双链断裂后在相应模板中进行同源重组。

在给定基因组中选择靶区域的主要限制是必须存在靠近CRISPR相关核酸酶引入双链断裂的区域的PAM序列基序。然而，各种CRISPR***识别不同PAM序列基序。这样可以为相应靶区域选择最合适的CRISPR***。此外，AGO***根本不需要PAM序列基序。

例如，该技术可以应用于改变任何生物体的基因表达，例如通过用不同强度或特异性的启动子置换靶基因上游的启动子。现有技术公开的其它方法描述了激活或阻抑转录因子与核酸酶减CRISPR核酸酶蛋白的融合。这种融合蛋白可以与一种或多种引导核酸一起在靶生物中表达，所述引导核酸将融合蛋白的转录因子部分引导至靶生物中的任何所需启动子(WO2014/099744；WO2014/099750)。通过将点突变或缺失引入相应靶基因，例如通过诱导通常导致基因破坏的非同源末端连接(NHEJ)，可以容易地实现基因的敲除(WO2013/176772)。

重组生物体

术语“重组生物体”是指真核生物体(酵母、真菌、藻类、植物、动物)或原核微生物(例如细菌)，其已被遗传改变、修饰或工程化以使其与其从中衍生的野生型生物体相比表现出改变的、修饰的或不同的基因型。优选地，“重组生物体”包含外源核酸。“重组生物体”、“遗传修饰的生物体”和“转基因生物体”在本文中可互换使用。外源核酸可以位于染色体外DNA片段(例如质粒)上或者可以整合到生物体的染色体DNA中。重组被理解为意指所使用的核酸不存在于或源自所述生物体的基因组，或存在于所述生物体的基因组中但不在所述生物体基因组中其天然基因座处，核酸可以在一种或多种内源和/或外源控制元件的控制下表达。

“宿主细胞”

宿主细胞也称为宿主生物，可以是选自细菌细胞、酵母细胞、真菌、藻类或蓝藻细胞、非人动物或哺乳动物细胞或植物细胞的任何细胞。本领域技术人员非常了解所述遗传构建体上必须存在的遗传元件，以成功转化、选择和繁殖含有感兴趣序列的宿主细胞。

在一个实施方案中，宿主细胞或宿主生物可互换使用。

典型的宿主细胞是细菌，例如***：芽孢杆菌、链霉菌。可用的***包括但不限于芽孢杆菌细胞，例如嗜碱性芽孢杆菌(Bacillus alkalophius)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。最优选地，原核生物是芽孢杆菌细胞，优选枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或迟缓芽孢杆菌的芽孢杆菌细胞。一些其它优选的细菌包括放线菌目(Actinomycetales)菌株，优选链霉菌，优选类球形链霉菌(Streptomycesspheroides，ATTC 23965)、热紫链霉菌(Streptomyces thermoviolaceus，IFO 12382)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)或链轮丝菌属亚种轮枝菌(Streptoverticillum verticillium ssp.verticillium)。其它优选的细菌包括类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、沼泽红假单胞菌(Rhodomonas palustri)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)。进一步优选的细菌包括属于粘球菌属(Myxococcus)的菌株，例如变绿粘球菌(M.virescens)。

其它典型的宿主细胞是革兰氏阴性菌：大肠杆菌、假单胞菌属，优选的革兰氏阴性菌是大肠杆菌和假单胞菌属，优选吡咯菌素假单胞菌(Pseudomonas pyrrocinia)(ATCC15958)或荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(NRRL B-11)。

其它典型的宿主细胞是真菌，例如曲霉属、镰刀菌属、木霉属。所述微生物可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和半知菌亚门(Deuteromycotina)真菌以及所有丝***孢子真菌。子囊菌门的代表性组包括例如链孢霉属(Neurospora)、正青霉属(Eupenicillium，＝青霉属(Penicillium))、裸孢壳属(Emericella，＝曲霉属(Aspergillus))、散囊菌属(Eurotium，＝曲霉属)和下面列出的真酵母。担子菌门的实例包括蕈类、锈菌类和黑粉菌(smuts)。壶菌门的代表性组包括例如异水霉属(Allomyces)、芽枝霉属(Blastocladiella)、雕蚀菌属(Coelomomyces)和水生真菌。卵菌门的代表性组包括例如水霉属(Saprolegniomycetous)水生真菌(水霉菌)，如绵霉属(Achlya)。有丝***孢子真菌的实例包括曲霉属、青霉属、假丝酵母属(Candida)和链格孢属(Alternaria)。接合菌门的代表性组包括例如根霉属(Rhizopus)和毛霉属(Mucor)。

一些优选的真菌包括属于半知菌亚门(Deuteromycotina)丝孢纲(Hyphomycetes)菌株，例如镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、木霉属(Tricoderma)、漆斑菌属(Myrothecium)、轮枝菌属(Verticillum)、Arthromyces、Caldariomyces、细基格孢属(Ulocladium)、Embellsia、枝孢菌属(Cladosporium)或Dreschlera，特别是尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum，DSM 2672)、特异腐质霉(Humicola insolens)、里氏木霉菌(Trichoderma resii)、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucana，IFO 6113)、黄萎轮枝孢菌(Verticillum alboatrum)、大丽轮枝菌(Verticillum dahlie)、Arthromyces ramosus(FERM P-7754)、Caldariomyces fumago、纸龈枝孢(Ulocladium chartarum)、Embellisiaalli或Dreschlera halodes。

其它优选的真菌包括属于担子菌亚门(Basidiomycotina)担子菌纲(Basidiomycetes)的菌株，例如鬼伞属(Coprinus)、平革菌属(Phanerochaete)、革盖菌属(Coriolus)或栓菌属(Trametes)，特别是灰盖鬼伞微孢子(Coprinus cinereusf.microsporus)(IFO 8371)、长根鬼伞菌(Coprinus macrorhizus)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)(例如NA-12)或栓菌属(以前称为多孔菌属(Polyporus))，例如变色栓菌(T.versicolor)(例如PR4 28-A)。

进一步优选的真菌包括属于接合菌亚门(Zygomycotina)毛霉菌科(Mucoraceae)科的菌株，例如根霉属或毛霉属，尤其是冻土毛霉(Mucor hiemalis)。

其它典型的宿主细胞是酵母。例如毕赤酵母属(Pichia)或酵母属(Saccharomyces)。真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如本文所用，“酵母”包括产子囊孢子酵母(内孢霉目(Endomycetales))、产担子孢子酵母和属于半知菌(Fungi lmperfecti)(芽孢菌纲(Blastomycetes))的酵母。产子囊孢子酵母分为蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母科(Saccharomycetaceae)。后者由4个亚科组成，裂殖酵母亚科(Schizosaccharomycoideae)(例如裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))、拿逊酵母亚科(Nadsonioideae)、油脂酵母菌亚科(Lipomycoideae)和酵母菌亚科(Saccharomycoideae)(例如克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属和酵母属)。产担子孢子酵母包括白冬孢酵母属(Leucosporidim)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、线黑粉酵母属(Filobasidium)和拟线黑粉酵母属(Filobasidiella)。属于半知菌的酵母分为两个科，掷孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如，掷孢酵母属(Sporobolomyces)和布勒掷孢酵母属(Bullera))和隐球酵母科(Cryptococcaceae)，例如假丝酵母属。

典型的宿主细胞还有真核生物，例如非人动物、非人哺乳动物、鸟类、爬行动物、昆虫、植物、酵母、真菌或植物。

优选地，根据本发明的宿主生物可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性原核微生物。

可用的革兰氏阳性原核微生物包括但不限于芽孢杆菌细胞，例如嗜碱性芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。最优选地，原核生物是芽孢杆菌细胞，优选枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或迟缓芽孢杆菌的芽孢杆菌细胞。一些其它优选的细菌包括放线菌目菌株，优选链霉菌，优选类球形链霉菌(ATTC 23965)、热紫链霉菌(IFO 12382)、变铅青链霉菌或鼠灰链霉菌或链轮丝菌属亚种轮枝菌。其它优选的细菌包括类球红细菌、沼泽红假单胞菌、乳酸链球菌。进一步优选的细菌包括属于粘球菌属的菌株，例如变绿粘球菌。

其它典型的原核生物是革兰氏阴性菌：大肠杆菌、假单胞菌属，优选的革兰氏阴性原核微生物是大肠杆菌和假单胞菌属，优选吡咯菌素假单胞菌(ATCC 15958)或荧光假单胞菌(NRRL B-11)。

最优选的原核微生物是大肠杆菌。

术语“单糖”优选是指5至9个碳原子的糖，其是醛糖(例如D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-核糖、D-***糖、L-***糖、D-木糖等)、酮糖(例如D-果糖、D-山梨糖、D-塔格糖等)、脱氧糖(例如L-鼠李糖、L-岩藻糖等)、脱氧氨基糖(例如N-乙酰葡糖胺、N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰半乳糖胺等)、糖醛酸、酮糖醛酸(例如唾液酸)或等价物。

术语“寡糖”优选是指含有至少三个单糖单位的糖聚合物(参见上文)。寡糖可以具有包含通过糖苷间键相互连接的单糖单位的线性或支链结构。实例是但不限于麦芽糖糊精、纤维糊精、人乳寡糖、低聚果糖和低聚半乳糖。

优选地，所述寡糖是人乳寡糖(HMO)。

术语“人乳寡糖”或“HMO”优选是指在人乳中发现的复合碳水化合物(Urashima etal.:Milk Oligosaccharides.Nova Science Publishers,2011)。HMO具有核心结构，其是还原端的乳糖单位，可以由一个或多个β-N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个或多个β-乳糖-N-二糖基单位延长，并且所述核心结构可以由α-L-吡喃岩藻糖基和/或α-N-乙酰基-神经氨酸基(唾液酸基)部分取代。在这方面，非酸性(或中性)HMO没有唾液酸残基，而酸性HMO在其结构中具有至少一个唾液酸残基。

非酸性(或中性)HMO可以是岩藻糖基化的或非岩藻糖基化的。这种中性非岩藻糖基化HMO的实例包括乳-N-丙糖(LNTri，GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc)，乳-N-四糖(LNT)，乳-N-新四糖(LNnT)，乳-N-新六糖(LNnH)，对-乳-N-新六糖(pLNnH)，对-乳-N-六糖(pLNH)和乳-N-六糖(LNH)。中性岩藻糖基化HMO的实例包括2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)，乳-N-岩藻五糖I(LNFP-I)，乳-N-二岩藻六糖I(LNDFH-I)，3-岩藻糖基乳糖(3’-FL)，二岩藻糖基乳糖(2,3-DFL)，乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II)，乳-N-岩藻五糖III(LNFP-III)，乳-N-二岩藻六糖III(LNDFH-III)，岩藻糖基-乳-N-六糖II(FLNH-II)，乳-N-岩藻五糖V(LNFP-V)，乳-N-二岩藻六糖II(LNDFH-II)，岩藻糖基-乳-N-六糖I(FLNH-I)，岩藻糖基-对-乳-N-六糖I(FpLNH-I)，岩藻糖基-对-乳-N-新六糖II(F-pLNnHII)和岩藻糖基-乳-N-新六糖(FLNnH)。酸性HMO的实例包括3’-唾液酸基乳糖(3’-SL)，6’-唾液酸基乳糖(6’-SL)，3-岩藻糖基-3’-唾液酸基乳糖(FSL)、LST a，岩藻糖基-LST a(FLST a)，LST b，岩藻糖基-LST b(FLST b)，LST c，岩藻糖基-LST c(FLST c)，唾液酸基-LNH(SLNH)，唾液酸基-乳-N-六糖(SLNH)，唾液酸基-乳-N-新六糖I(SLNH-I)，唾液酸基-乳-N-新六糖II(SLNH-II)和二唾液酸基-乳-N-四糖(DSLNT)。

人乳寡糖的实例也可见于

MR et al.(2006).J.Agric.Food Chem.54:7471–7480，Bode L(2009)Nutr.Rev.67:183–191，Bode L(2012)Glyco-biology 22:1147–1162，Bode L(2015)Early Hum.Dev.91:619–622。

更优选地，HMO是中性或酸性HMO。

甚至更优选地，所述寡糖是2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、6’-唾液酸基乳糖(6’-SL)和/或乳-N-四糖(LNT)。

在cAMP的酶活性或量或精细化学品生产、碳转化效率、时空产率或生长或碳源灵活性方面，术语“增加”、“改善”或“增强”是可互换的并且在本申请的意义上应是指与对照(例如但不限于未修饰的宿主生物)相比增加至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，优选至少15％或20％，更优选25％、30％、35％或40％或更多。

在基因表达或蛋白质存在或蛋白质丰度或失活的上下文中，术语“降低”、“减少”或“下降”是可互换的并且在本申请的意义上应是指与本文定义的对照相比降低至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，优选至少15％或20％，更优选25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、94％、95％或98％或更多。

术语“增强的寡糖生产”是指与其亲本菌株相比增强的寡糖生产力和/或增强的寡糖滴度和/或增强的碳转化效率。可以通过本领域技术人员已知的标准分析方法明确记录培养基中所述微生物生产的寡糖。在对于大肠杆菌以WO 2016/008602、WO2013/182206、EP2379708、US9944965、WO2012/112777、WO2001/04341和US2005019874公布的专利申请中公开了一些具有增强的寡糖(例如HMO)生产的遗传修饰的微生物。所有这些公开内容通过引用并入本文。

此外，本发明人惊奇地发现通过降低或阻止crr基因((SEQ ID NO:25)或其变体的表达、或通过失活或减少Crr蛋白(SEQ ID NO:26)或其变体阻止所述原核生物的参与PTS的Crr蛋白或对应于Crr蛋白的蛋白质的方式来操纵PTS***，可以增加原核生物生产寡糖的碳转化效率、碳底物灵活性和时空产率。在一个实施方案中，具有这种失活或减少的Crr家族蛋白或crr基因家族的基因表达减少或阻止的宿主生物是原核微生物。

在本发明的一个方面，增加的碳底物灵活性是修饰的微生物在未修饰的微生物不能在之上生长的碳源上生长或在碳源上比对照基本上更好生长的特征，所述对照可以是野生型细胞或没有关于腺苷酸环化酶活性的改变和/或关于分别对应于crr基因(SEQ ID NO:25)或Crr蛋白(SEQ ID NO:26)的基因或蛋白质的改变的经遗传修饰的微生物。

在一个实施方案中，本发明的方法是与在分别对应于crr基因(SEQ ID NO:25)或Crr蛋白(SEQ ID NO:26)的基因或蛋白质没有改变的微生物相比，用于增加经遗传修饰的微生物生产一种或多种精细化学品、优选一种或多种寡糖的时空产率的方法和/或用于增加经遗传修饰的微生物生产一种或多种精细化学品、优选一种或多种寡糖的碳底物灵活性和/或用于增加经遗传修饰的微生物生产一种或多种精细化学品、优选一种或多种寡糖的碳转化效率的方法，包括以下步骤：提供能够生产所述一种或多种精细化学品的微生物，通过在失活或不存在Crr蛋白或对应于大肠杆菌Crr蛋白(SEQ ID NO:26)的内源蛋白来增加所述微生物的腺苷3’,5’-环单磷酸(cAMP，CAS号：60-92-4)水平，将所述改变的微生物保持在允许其生长的环境中，在存在底物和营养物的情况下并在适合生产一种或多种精细化学品的条件下生长所述改变的微生物，并且任选地从所述改变的微生物或其剩余物中分离一种或多种精细化学品。在一个实施方案中，所述改变的微生物适合生产所述未修饰和修饰形式的一种或多种精细化学品。

在一个实施方案中，与未修饰的Crr蛋白或对应于Crr蛋白的蛋白相比，变体CRR蛋白包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40或更多个改变，以及所述变体的丰度、活性和/或寿命与该微生物的未修饰的CRR蛋白家族成员相比是降低的。

变体包括与SEQ ID NO:25或26的序列具有约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列相同性的核酸和多肽。

术语“遗传修饰的微生物”是指原核微生物(例如细菌)，其经过遗传改变、修饰或工程化，使其与衍生自之中的野生型生物体相比表现出改变的、修饰的或不同的基因型。“遗传修饰的微生物”、“重组微生物”和“转基因微生物”在本文中可互换使用。所述遗传修饰的微生物中的外源核酸可以位于染色体外DNA片段(例如质粒)上，或者可以整合到生物体的染色体DNA中。

根据本发明的遗传修饰的微生物可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性原核微生物。

可用于产生本发明的经遗传修饰的微生物的革兰氏阳性原核微生物和可用于本发明方法的那些原核微生物包括但不限于芽孢杆菌属细胞，例如例如嗜碱性芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。最优选地，原核生物是芽孢杆菌细胞，优选枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或迟缓芽孢杆菌的芽孢杆菌细胞。一些其它优选的细菌包括放线菌目菌株，优选链霉菌，优选类球形链霉菌(ATTC23965)、热紫链霉菌(IFO12382)、变铅青链霉菌或鼠灰链霉菌或链轮丝菌属亚种轮枝菌。其它优选的细菌包括类球红细菌、沼泽红假单胞菌、乳酸链球菌。进一步优选的细菌包括属于粘球菌属的菌株，例如变绿粘球菌。

可用于产生本发明的经遗传修饰的微生物和可用于本发明方法的其它典型原核生物是革兰氏阴性的：大肠杆菌、假单胞菌，优选的革兰氏阴性原核微生物是大肠杆菌和假单胞菌属物种，优选吡咯菌素假单胞菌(ATCC 15958)或荧光假单胞菌(NRRL B-11)。

最优选地，可用于产生本发明的经遗传修饰的微生物和可用于本发明方法的原核微生物是大肠杆菌。

PTS碳水化合物利用***(PTS)是一种充分表征的碳水化合物转运***，可被微生物如细菌利用。见Postma et al.1993(Postma P W,Lengeler J W,Jacobson GR.Phosphoenolpyruvate:carbohydrate phosphotransferase systemsofbacteria.Microbiol Rev.1993September；57(3):543-94.)和Tchieu et al.2001(Tchieu J H,Norris V,Edwards J S,Saier M H Jr.The complete phosphotransferasesystem in Escherichia coli.J Mol Microbiol Biotechno.2001July；3(3):329-46)，通过引用将其全部并入本文。包含PTS的示例细菌包括来自以下属的那些细菌：芽孢杆菌属、梭菌属、肠杆菌科、肠球菌属、欧文氏菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌属、乳球菌属、支原体属、巴氏杆菌属、红杆菌属、红假单胞菌属、沙门氏菌属、葡萄球菌属、链球菌属、弧菌属和黄单胞菌属。示例的物种包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、肉葡萄球菌(Staphylococcus camosus)、枯草芽孢杆菌、山羊支原体(Mycoplasma capricolum)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、血链球菌(Streptococcus sanguis)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、菊欧文氏杆菌(Erwiniachrysanthemi)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、球形红假单胞菌(Rhodoseudomonassphaeroides)、胡萝卜欧文氏菌(Erwinia carotovora)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)和丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。

令人惊奇地，本发明人首次发现Crr蛋白丰度的降低导致由修饰的微生物、优选遗传修饰的微生物生产寡糖的时空产率、碳底物灵活性或碳转化效率增加。

可通过多种方式(例如降低crr基因表达包括基因敲除或部分或全部缺失、反义或RNAi方法或其它重组方法例如基因编辑方法如CRISPR/CAS、甚至通过不寻常的结合配偶体例如抗体分离Crr蛋白)获得修饰的微生物，优选遗传修饰的微生物，所述微生物具有降低或不存在Crr蛋白丰度。

在一个实施方案中，以诱导方式进行操作、优选降低Crr蛋白的水平或完全去除Crr蛋白，并且与没有这种诱导的遗传修饰的微生物进行对比，时空产率、碳底物灵活性和/或碳转化效率增加。本领域已知例如通过诱导物异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导物依赖性基因表达的方法。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法是增加微生物生产一种或多种精细化学品的时空产率以及增加微生物生产一种或多种精细化学品的碳底物灵活性和碳转化效率的方法，包括以下步骤：提供能够生产所述一种或多种精细化学品的微生物，失活或下调微生物中对应于SEQ ID NO:25的基因或其变体的基因座，或失活或去除对应于由SEQ ID NO:25编码的Crr蛋白或其变体的蛋白质，将所述经遗传修饰的微生物维持在允许其生长的环境中，在存在底物和营养物以及在适合生产一种或多种精细化学品的条件下生长所述经遗传修饰的微生物，并任选地从所述经遗传修饰的微生物或其剩余物中分离一种或多种精细化学品。

微生物中Crr蛋白、其变体或对应于Crr蛋白的蛋白的活性应理解为Crr蛋白或其变体或对应于Crr蛋白的蛋白的正常生物学功能。这可以涉及例如激酶活性，因为已知Crr蛋白包含激酶结构域。失活应理解为所述活性不以相同的正常水平存在，而是实质上降低或完全不存在。这些感兴趣的蛋白质在正常水平的丰度也是正常生物学功能所必需的。如果所述感兴趣蛋白质的丰度实质上降低，则生物学功能和因此整体活性将降低。如果感兴趣的蛋白质不存在，例如由于编码其的基因已失去功能、部分或全部缺失、已被敲除或其表达被阻止，则生物学功能迟早也会被消除。

在本发明的一个优选方面，可用于本发明的方法和用途的宿主细胞携带本发明的去调节的腺苷酸环化酶连同crr基因或其变体的表达降低和/或对原核生物生产寡糖的碳转化效率、碳底物灵活性和时空产率的Crr蛋白或其变体的失活或减少。

在一个实施方案中，本发明的方法包括如前文定义在所述遗传修饰的微生物生长之前，失活或去除所述遗传修饰的微生物中Crr蛋白或对应于大肠杆菌Crr蛋白(SEQ IDNO:26)的内源蛋白的步骤。CRR蛋白家族成员的失活或去除可以在去调节的腺苷酸环化酶首次存在于微生物中之前、同时或之后进行，即在以下任何操作之前、同时或之后进行：

a.失活在宿主生物中野生型腺苷酸环化酶中发现的调节活性，和/或

b.在宿主生物中产生突变的腺苷酸环化酶，该酶缺乏在野生型腺苷酸环化酶中发现的调节活性，和/或

c.将突变的腺苷酸环化酶引入宿主生物，该酶缺乏在野生型腺苷酸环化酶中发现的调节活性。

本发明的另一个优选实施方案是包含一种或多种类型的宿主细胞的组合物，所述宿主细胞与对照宿主细胞相比包含去调节的腺苷酸环化酶和/或Crr蛋白(SEQ ID NO:26)、其变体或对应于所述Crr蛋白的内源蛋白的丰度和/或活性降低，所述对照宿主细胞即所述微生物中具有野生型腺苷酸环化酶和/或Crr蛋白(SEQ ID NO:26)、其变体或对应于所述Crr蛋白的内源蛋白的野生型水平和活性的宿主细胞。在一个更优选的实施方案中，本发明的组合物还包含一种或多种精细化学品，优选一种或多种人乳寡糖。

优选地，本发明的生产2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)并且可用于本发明的方法的宿主细胞或经遗传修饰的微生物是大肠杆菌菌株并且至少包含：

-1,2-岩藻糖基转移酶，和

-为适合生产2’-FL的岩藻糖基转移酶提供岩藻糖部分和乳糖的方式。

优选地，本发明的生产6’-唾液酸乳糖(6’-SL)并且可用于本发明的方法的宿主细胞或经遗传修饰的微生物是大肠杆菌菌株并且至少包含：

-唾液酸转移酶，和

-为适合生产6’-SL的唾液酸转移酶提供唾液酸部分和乳糖的方式。

优选地，本发明的生产乳-N-四糖(LNT)并且可用于本发明的方法的宿主细胞或经遗传修饰的微生物是大肠杆菌菌株并且至少包含：

-β1,3-半乳糖基转移酶，和

-为适合生产LNT的β1,3-半乳糖基转移酶提供核苷酸活化的半乳糖和LNT2的方式。

培养宿主细胞或微生物通常需要在含有各种营养源例如碳源、氮源和其它营养物质包括但不限于这些细胞生长所需的氨基酸、维生素、矿物质的培养基中培养细胞。发酵培养基可以是例如WO 98/37179中描述的基本培养基，或者发酵培养基可以是包含复合氮源和碳源的复合培养基，其中复合氮源可以如WO 2004/003216中所述被部分水解。

因此，发酵培养基包含培养的微生物或宿主细胞生长所需的组分。在一个实施方案中，发酵培养基包含一种或多种选自氮源、磷源、硫源和盐的组分，以及任选一种或多种选自微量营养素如维生素、氨基酸、矿物质和微量元素的其它组分。在一个实施方案中，发酵培养基还包含碳源。这种组分在本领域中通常是众所周知的(见例如Ausubel,et al,Short Protocols in Molecular Biology,3rd ed.,Wiley&Sons,1995；Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,1989Cold Spring Harbor,N.Y.；Talbot,Molecular and Cellular Biology of Filamentous Fungi:A PracticalApproach,Oxford University Press,2001；Kinghom and Turner,Applied MolecularGenetics of Filamentous Fungi,Cambridge University Press,1992；和Bacillus(Biotechnology Handbooks)by Colin R.Harwood,Plenum Press,1989)。给定细胞类型的培养条件也可见于科学文献和/或细胞来源，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)和真菌遗传学库存中心(Fungal Genetics Stock Center)。

作为氮源，可以单独或组合使用无机和有机氮化合物。合适的有机氮源包括但不限于含蛋白质的物质，例如来自微生物、动物或植物细胞的提取物，包括但不限于植物蛋白制品、大豆粉、玉米粉、豌豆粉、玉米麸质、棉籽粉、花生粉、马铃薯粉、肉和酪蛋白、明胶、乳清、鱼粉、酵母蛋白、酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、细菌胰蛋白胨、细菌蛋白胨、微生物细胞、植物、肉类或动物体加工产生的废物，以及其组合。无机氮源包括但不限于铵、硝酸盐和亚硝酸盐，以及其组合。在一个实施方案中，发酵培养基包含氮源，其中氮源是复合氮源或限定氮源或其组合。在一个实施方案中，复合氮源选自植物蛋白，包括但不限于马铃薯蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白、花生、棉花蛋白和/或豌豆蛋白、酪蛋白、胰蛋白胨、蛋白胨和酵母提取物及其组合。在一个实施方案中，限定氮源选自氨、铵、铵盐(例如氯化铵、硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵、乙酸铵)、尿素、硝酸盐/酯、硝酸盐、亚硝酸盐、和氨基酸包括但不限于谷氨酸，及其组合。

在一个实施方案中，发酵培养基还包含至少一种碳源。碳源可以是复合碳源或限定碳源或其组合。各种糖和含糖物质是合适的碳源，并且糖可以不同聚合阶段存在。复合碳源包括但不限于糖蜜、玉米浆、蔗糖、糊精、淀粉、淀粉水解物和纤维素水解物，以及其组合。限定碳源包括但不限于碳水化合物、有机酸和醇。在一个实施方案中，限定碳源包括但不限于葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、***糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖酸盐、乙酸、丙酸、乳酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、甘油、肌醇、甘露醇和山梨糖醇，以及其组合。在一个实施方案中，限定碳源以糖浆的形式提供，其可以包含最多20％、最多10％或最多5％的杂质。在一个实施例中，碳源是甜菜糖浆、甘蔗糖浆、玉米糖浆，包括但不限于高果糖玉米糖浆。复合碳源包括但不限于糖蜜、玉米浆、糊精和淀粉，或其组合。在一个优选的实施方案中，限定碳源包括但不限于葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、***糖、蔗糖、麦芽糖、糊精、乳糖、葡糖酸盐或其组合。

在另一个优选的实施方案中，一种碳源或所述碳源是蔗糖，使用这种碳源，本发明的方法和本发明的宿主细胞或经遗传修饰的微生物与本领域已知的生物体和方法相比提供了更大的优势。

在一个实施方案中，发酵培养基还包含磷源，包括但不限于磷酸盐，和/或硫源，包括但不限于硫酸盐。在一个实施方案中，发酵培养基还包含盐。在一个实施方案中，发酵培养基包含一种或多种无机盐，包括但不限于碱金属盐、碱土金属盐、磷酸盐和硫酸盐。在一个实施方案中，所述一种或多种盐包括但不限于NaCl、KH₂PO₄、MgSO₄、CaCl₂、FeCl₃、MgCl₂、MnCl₂、ZnSO₄、Na₂MoO₄和CuSO₄。在一个实施方案中，发酵培养基还包含一种或多种维生素，包括但不限于氯化硫胺素、生物素、维生素B12。在一个实施方案中，发酵培养基还包含微量元素，包括但不限于Fe、Mg、Mn、Co和Ni。在一个实施方案中，发酵培养基包含一种或多种盐阳离子，所述盐阳离子选自Na、K、Ca、Mg、Mn、Fe、Co、Cu和Ni。在一个实施方案中，发酵培养基包含一种或多种二价或三价阳离子，包括但不限于Ca和Mg。

在一个实施方案中，发酵培养基还包含消泡剂。

在一个实施方案中，发酵培养基还包含选择剂，包括但不限于抗生素，包括但不限于氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、潮霉素、博来霉素、氯霉素、链霉素或腐草霉素或除草剂，细胞的选择标记对其提供抗性。

发酵可以分批、重复分批、补料分批、重复补料分批或连续发酵方法进行。在补料分批方法中，在发酵开始之前，不将或将部分包含一种或多种结构和/或催化元件如碳或氮源的化合物加入培养基中，以及在发酵过程中分别补料全部或剩余部分的包含一种或多种结构和/或催化元件的化合物。在发酵过程中，选择用于补料的化合物可以一起进料或彼此单独进料。在重复补料分批或连续发酵过程中，在发酵期间额外补料完整的起始培养基。所述起始培养基可以与补料一起进料或单独进料。在重复补料分批方法中，包含生物质的部分发酵液以固定的时间间隔被去除，而在连续方法中，持续去除部分发酵液。从而在发酵过程中补充与提取的发酵液量相对应的一部分新鲜培养基。

在发酵期间许多细胞培养物并入碳源如葡萄糖作为细胞培养中的底物补料。因此，在一个实施方案中，培养微生物的方法包括包含碳源的补料。含碳源的补料可包含如本文详细描述的限定碳源或复合碳源，或其混合物。

可以根据本领域已知的标准条件应用发酵时间、pH、电导率、温度或其它特定发酵条件。在一个实施方案中，调节发酵条件以获得最大产量的感兴趣的蛋白质。

在一个实施方案中，发酵期间所述发酵液的温度为30℃至45℃。

在一个实施方案中，将发酵培养基的pH调节至pH 6.5至9。

在一个实施方案中，发酵培养基的电导率在pH调节后为0.1-100mS/cm。

在一个实施方案中，发酵时间为1至200小时。

在一个实施方案中，发酵是在搅拌和/或摇动发酵培养基下进行的。在一个实施方案中，发酵是在以50-2000rpm搅拌发酵培养基进行的。

在一个实施方案中，在培养期间向发酵培养基加入氧气，包括但不限于通过搅拌和/或搅动或通过充气进行，包括但不限于用0至3巴的空气或氧气充气。在一个实施方案中，发酵在氧饱和条件下进行。

在一个实施方案中，发酵培养基和使用发酵培养基的方法用于工业规模的发酵。在一个实施方案中，本发明的发酵培养基可用于具有至少20升、至少50升、至少300升或至少1000升培养基的任何发酵。

在一个实施方案中，发酵方法用于以相对高的产率生产感兴趣的蛋白质，包括但不限于以至少2g蛋白质(干物质)/kg未处理的发酵培养基、至少3g蛋白质(干物质)/kg未处理的发酵培养基、至少5g蛋白质(干物质)/kg未处理的发酵培养基、至少10g蛋白质(干物质)/kg未处理的发酵培养基或至少20g蛋白质(干物质)/kg未处理的发酵培养基的量表达感兴趣的蛋白质。

在一个优选的实施方案中，与对照相比，生产一种或多种精细化学品、优选一种或多种寡糖的时空产率、碳底物灵活性和/或碳转化效率增加至少20％、30％、40％、50％、60％、65％或70％，所述对照即cAMP水平未明显改变和腺苷酸环化酶具有调节活性和/或Crr蛋白(SEQ ID NO:26)、其变体或对应于所述Crr蛋白的内源蛋白的丰度和/或活性未改变的宿主细胞的时空产率、碳底物灵活性和/或碳转化效率。

优选地，增加的cAMP水平被理解为与未修饰的宿主细胞中的水平相比增加至少5％，优选至少10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，所述未修饰的宿主细胞例如是仅具有在正常调节下而无一去调节的腺苷酸环化酶的那些宿主细胞，和/或具有正常crr基因座或对应于大肠杆菌crr基因的内源基因正常基因座和野生型水平的丰度或活性的相应蛋白质的那些宿主细胞。例如，将经修饰以具有降低的CRR蛋白水平的修饰的微生物的cAMP水平与未修饰微生物的cAMP水平进行比较。在另一个优选的实施方案中，能够生产一种或多种精细化学品、优选一种或多种寡糖的宿主生物的cAMP水平与宿主生物的正常水平相比增加了1.1、1.2、1.25、1.3、1.4、1.5、1.75、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。

宿主生物的cAMP水平优选理解为细胞内cAMP水平，更优选宿主生物的细胞质cAMP水平。cAMP水平可以如上文公开的那样确定。

另一个优选的实施方案是使用去调节的腺苷酸环化酶和/或失活的和/或丰度降低的Crr蛋白(SEQ ID NO:26)、其变体或对应于SEQ ID NO:26的Crr蛋白的内源蛋白，以增加根据本发明的宿主生物生产一种或多种精细化学品的时空产率、碳底物灵活性和/或碳转化效率。

另一个实施方案涉及本发明的方法或本发明的宿主细胞，其中Crr蛋白(SEQ IDNO:26)、其变体或对应于SEQ ID NO:26的Crr蛋白的内源蛋白的活性和/或丰度与对照相比降低15％或20％，更优选25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、94％、95％或98％或更多，所述对照即具有野生型水平活性和/或丰度的Crr蛋白(SEQ IDNO:26)、其变体或对应于SEQ ID NO:26的Crr蛋白的内源蛋白的那些细胞。

附图描述

图1示出可用于本发明的方法和宿主细胞的不同长度的各种DNA蛋白质序列的图示。

图2：

部分1)示出SEQ ID NO:1至8和10的DNA序列的比对，显示了与全长基因的最长变体相比不同的缩短的cyaA DNA序列的长度；

部分2)示出SEQ ID NO:11至18和20的蛋白质序列的比对，显示了与全长蛋白质的最长变体相比不同的缩短的CyaA蛋白质序列的长度。相比之下，SEQ ID NO:19的略短的全长野生型蛋白质仅具有一个GEQSMI基序，代替全长腺苷酸环化酶的854-变体的重复的GEQSMIGEQSMI(在图2第2部分中加下划线示出)。

图3描述了产生2’FL生产大肠杆菌菌株的示例构建体。

图4：

A描述了引入的第一个构建体，以产生6’-SL生产大肠杆菌菌株。上图是没有改变的CyaA的菌株中的构建体，下图是具有去调节的CyaA的菌株中的构建体；

B描述了用于产生6’-SL生产大肠杆菌菌株的第二个构建体。上图是没有改变的CyaA的菌株中的构建体，下图是具有去调节的CyaA的菌株中的构建体。

图5描述了crr基因大部分缺失后的crr基因座，如以下实施例详细解释。

进一步的实施方案

I.增加宿主生物的一种或多种精细化学品的时空产率、宿主生物生产一种或多种精细化学品的碳转化效率和/或宿主生物生产一种或多种精细化学品的碳底物灵活性的方法，通过提供去调节的腺苷酸环化酶蛋白和/或失活的和/或丰度降低的宿主生物中Crr蛋白(SEQ ID NO:26)、其变体或对应于SEQ ID NO:26的Crr蛋白的内源蛋白，其中与未修饰的宿主生物相比，经修饰的宿主生物的时空产率、碳转化效率和/或碳底物灵活性是增加的。

II.增加宿主生物生产一种或多种精细化学品的碳底物灵活性的方法，其中与未修饰的宿主生物相比，所述宿主生物中的cAMP水平是增加的。

III.增加宿主生物生产一种或多种精细化学品的碳转化效率的方法，其中与未修饰的宿主生物相比，所述宿主生物中的cAMP水平是增加的。

1.增加适于生产一种或多种精细化学品的宿主生物生产一种或多种精细化学品的时空产率的方法，包括以下步骤：与未修饰的宿主生物相比增加宿主生物的腺苷3’,5’-环单磷酸(cAMP，CAS编号：60-92-4)水平，将所述宿主生物保持在允许其生长的环境中，在存在底物及在适于生产一种或多种精细化学品的条件下生长所述宿主生物，及任选地将一种或多种精细化学品与所述宿主生物或其剩余部分分离。

2.增加适于生产一种或多种精细化学品的宿主生物生产一种或多种精细化学品的碳底物灵活性的方法，包括以下步骤：与未修饰的宿主生物相比增加所述宿主生物中cAMP水平，将所述宿主生物保持在允许其生长的环境中，在存在底物及在适合生产一种或多种精细化学品的条件下生长所述宿主生物，及任选地将一种或多种精细化学品与所述宿主生物或其剩余部分分离。

3.增加适于生产一种或多种精细化学品的宿主生物生产一种或多种精细化学品的碳转化效率的方法，包括以下步骤：与未修饰的宿主生物相比增加所述宿主生物中cAMP水平，将所述宿主生物保持在允许其生长的环境中，在存在底物及在适合生产一种或多种精细化学品的条件下生长所述宿主生物，及任选地将一种或多种精细化学品与所述宿主生物或其剩余部分分离。

4.根据前述实施方案任一项的方法，其中所述宿主生物的cAMP水平通过以下方式增加：

a.使在野生型腺苷酸环化酶中发现的调节活性失活，和/或

b.产生缺乏在野生型腺苷酸环化酶中发现的调节活性的突变的腺苷酸环化酶，和/或

c.将缺乏在野生型腺苷酸环化酶中发现的调节活性的突变的腺苷酸环化酶引入所述宿主生物；和/或

d.降低具有3’,5’cAMP磷酸二酯酶(EC 3.1.4.53)活性的酶的活性；和/或

e.使用百日咳博德特菌的腺苷酸环化酶毒素或其腺苷酸环化酶结构域或其变体；和/或

f.失活的和/或丰度降低的Crr蛋白(SEQ ID NO:26)、其变体或对应于SEQ ID NO:26的Crr蛋白的内源蛋白。

5.根据前述实施方案任一项的方法，其中所述宿主生物的cAMP水平以可诱导的方式增加，并且所述增加是与没有诱导的宿主生物进行比较的。

6.根据前述实施方案任一项的方法，其中突变的腺苷酸环化酶是通过引入转基因而引入的。

7.根据前述实施方案任一项的方法，其中突变的腺苷酸环化酶或具有失活的调节活性的腺苷酸环化酶与宿主生物的野生型形式的腺苷酸环化酶相比具有缺失。

8.根据实施方案7的方法，其中所述缺失是去除腺苷酸环化酶的调节部分而不破坏产生cAMP的部分。

9.根据实施方案7或8的方法，其中所述缺失是蛋白质调节部分的缺失，其对应于由大肠杆菌cyaA基因编码的腺苷酸环化酶的C末端部分、优选对应于SEQ ID NO:19或20提供的cyaA蛋白的C末端部分，或与SEQ ID NO:19所示蛋白质序列的位置1至412、优选位置1至420具有至少80％序列相同性的腺苷酸环化酶蛋白；并且优选所述缺失是蛋白质调节部分的缺失，其对应于SEQ ID No:19或20提供的蛋白质序列的位置420、450、558、582、585、653、709、736或776之后的大肠杆菌腺苷酸环化酶部分，更优选SEQ ID NO:19或20提供的蛋白质序列的位置558、582、585、653、709、736或776之后，最优选氨基酸缺失对应于SEQ IDNO:19或20的位置777及其后的氨基酸。

10.根据前述实施方案任一项的方法，其中所述方法包括为所述宿主生物体供应碳源的步骤，其中所述碳源是复合或限定碳源或其组合。

11.适于生产精细化学品的经修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞能在甘油和/或葡萄糖和/或麦芽糖和/或果糖和/或蔗糖、优选在蔗糖、甘油、葡萄糖和/或果糖上生长，其中所述经修饰的宿主细胞具有腺苷酸环化酶，所述酶的调节活性失活或缺失，但具有腺苷酸环化酶活性，和/或Crr蛋白(SEQ ID NO:26)、其变体或对应于SEQ ID NO:26的Crr蛋白的内源蛋白失活和/或丰度降低，及其中所述宿主生物与未修饰的宿主细胞相比具有增加的cAMP水平，其中所述未修饰的宿主细胞基本上不能在甘油和/或葡萄糖和/或麦芽糖和/或果糖和/或蔗糖上生长。

12.实施方案11的经修饰的宿主细胞，其中至少一种对应于由大肠杆菌cyaA基因编码的蛋白质的腺苷酸环化酶蛋白缺少调节活性，优选缺少对应于SEQ ID NO:19或20提供的cyaA蛋白的C-末端部分的部分，或与SEQ ID NO 19或20提供的蛋白质序列的位置1至412具有至少80％序列相同性的腺苷酸环化酶蛋白，更优选与SEQ ID NO 19或20提供的蛋白质序列的位置1至420具有至少80％序列相同性的腺苷酸环化酶蛋白，并且优选缺少对应于在SEQ ID No:19或20提供的蛋白质序列的位置420、450、558、585、653、709、736或776之后、更优选位置450、558、585、653、709或736之后、甚至更优选在SEQ ID No:19或20提供的蛋白质序列的位置558、582、585、653、709、736或776之后的大肠杆菌腺苷酸环化酶部分的腺苷酸环化酶部分，以及最优选对应于SEQ ID NO 19或20的位置777及其后的氨基酸的氨基酸缺失。

13.任何前述实施方案，其中所述宿主细胞是细菌或真菌宿主细胞，优选细菌细胞，更优选细菌细胞，甚至更优选革兰氏阴性细菌细胞，最优选大肠杆菌细胞。

14.去调节的腺苷酸环化酶和/或失活的和/或丰度降低的Crr蛋白(SEQ ID NO:26)、其变体或对应于SEQ ID NO:26的Crr蛋白的内源蛋白用于增加宿主生物生产一种或多种精细化学品的时空产率、碳底物灵活性和/或碳转化效率的用途。

15.任何前述实施方案，其中至少一种精细化学品是人乳寡糖，优选中性或唾液酸化HMO，更优选2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、3’-岩藻糖基乳糖(3’-FL)、乳-N-四糖(LNT)、乳-N-新四糖(LNnT)、二岩藻糖基乳糖(2,3-DFL)或3’-唾液酸乳糖(3’-SL)、6’-唾液酸乳糖(6’-SL)，或任何前述实施方案的方法，其中所述方法包括为所述宿主生物提供碳源，其中所述碳源是以下的一种或多种：复合或限定碳源，优选葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、***糖、蔗糖、麦芽糖、糊精、乳糖、葡糖酸盐，更优选甘油、葡萄糖或甘露糖，甚至更优选葡萄糖或甘油。

16.一种通过在发酵过程中转化碳源来生产寡糖的方法，包括以下步骤：

-在包含至少一种碳源的适当培养基中培养经遗传修饰的用于生产寡糖的微生物；

-从培养基中回收人乳寡糖，

其中所述经遗传修饰的微生物包含编码PTS碳水化合物利用***的功能基因，并且其中在所述经遗传修饰的微生物中，Crr蛋白(SEQ ID NO:26)、其变体或对应于SEQ IDNO:26的Crr蛋白的内源蛋白的丰度降低和/或所述微生物中存在如任何前述实施方案中定义的去调节的腺苷酸环化酶。

17.任何前述实施方案，其中所述碳源选自甘油、单糖和二糖。

18.任何前述实施方案，其中与不具有Crr蛋白(SEQ ID NO:26)、其变体或对应于SEQ ID NO:26的Crr蛋白的内源蛋白改变的微生物相比，腺苷3’,5’-环单磷酸(cAMP，CAS号：60-92-4)的水平是增加的。

19.提高精细化学品生产的经遗传修饰的微生物，其中所述经遗传修饰的微生物能生产人乳寡糖，其中所述经遗传修饰的微生物包含编码PTS碳水化合物利用***的功能基因并且其中在所述经遗传修饰的微生物中Crr蛋白的表达降低，优选至少实质上降低。

20.根据实施方案19的微生物，其中编码Crr蛋白的基因在所述经遗传修饰的微生物中被弱化或缺失。

21.根据任何前述实施方案的微生物，其中所述微生物选自肠杆菌科。

实施例

在下面给出的实施例中，使用本领域熟知的方法构建含有复制载体和/或各种染色体缺失和取代的大肠杆菌菌株，使用由Datsenko&Wanner,(2000)关于大肠杆菌充分描述的同源重组方法。以同样方式，使用质粒或载体在重组微生物中表达或过表达一种或几种基因是本领域技术人员熟知的。

方法

可以使用以下技术将DNA构建体或载体引入宿主细胞中，所述技术例如转化、电穿孔、核显微注射、转导、转染(例如脂染介导的或DEAE-Dextrin介导的转染或使用重组噬菌体病毒的转染)、与磷酸钙DNA沉淀温育、用DNA包被的微粒高速轰击以及原生质体融合。一般转化技术是本领域已知的(见例如Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.(eds)Chapter 9,1987；Sambrook et al,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor,1989；和Campbell et al,Curr.Genet.16:53-56,1989，所述文献各自通过引用整体并入本文，特别是关于转化方法)。异源多肽在木霉菌属(Trichoderma)中的表达描述于美国专利号6,022,725；美国专利号6,268,328；美国专利号7,262,041；WO 2005/001036；Harkki et al.,EnzymeMicrob.Technol.13:227-233,1991；Harkki et al,Bio Technol 7:596-603,1989；EP244,234；EP 215,594；和Nevalainen et al,"The Molecular Biology of Trichodermaand its Application to the Expression of Both Homologous and HeterologousGenes,"in Molecular Industri-al Mycology,Eds.Leong and Berka,Marcel DekkerInc.,NY pp.129-148,1992，所述文献均通过引用整体并入本文，特别是关于转化和表达方法)。还可以参考Cao et al,(Sd.9:991-1001,2000；EP 238023；和Yelton et al,Proceedings.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474,1984(所述文献均通过引用整体并入本文，特别是关于转化方法)以转化曲霉属菌株。引入的核酸可以整合到染色体DNA中或保持为染色体外复制序列。

增加的cAMP和去调节的腺苷酸环化酶活性的实施例

1.缩短的cyaA DNA构建体的产生

通过生成具有用于整合的同源性的合成DNA构建体并通过基因合成将TAA终止密码子引入cyaA基因的编码序列来制备缩短的DNAcyaA构建体。然后如Wang J,et al.2006,Mol.Biotechnol.,32,43所述，通过同源重组将这些遗传构建体引入大肠杆菌菌株的基因组中。

2.菌株构建

具有增强的寡糖(例如HMO)生产的经遗传修饰的微生物在以下发布的专利申请中公开：WO 2016/008602，WO2013/182206，EP2379708，US9944965，WO2012/112777，WO2001/04341和US2005019874。所有这些公开均通过引用并入本文。

2’-FL生产微生物

如下所述构建大肠杆菌菌株2’-FL过生产菌株：在充分表征的大肠杆菌菌株JM109中，构建含有以下遗传元件的人工操纵子：PTAC启动子，人工核糖体结合位点(RBS)，fucT2基因(源自幽门螺杆菌菌株26695，Wang et al,Mol.microbiol.1999,31 1265-1274)，人工核糖体结合位点，gmd基因(源自大肠杆菌K12)，具有其真实核糖体结合位点的wcaG基因(源自大肠杆菌K12)，人工核糖体结合位点(RBS)，manC基因(源自大肠杆菌K12，具有适合的密码子使用)，人工核糖体结合位点(RBS)，manB基因(源自大肠杆菌K12，具有适合的密码子使用)和源自大肠杆菌16s rRNA基因座的转录终止子rrnBT1，使用熟知的lambda red技术进行(例如描述于Datsenko l and Wanner B.PNAS,2000 97(12)6640-6645，Wang J,etal.2006,Mol.Biotechnol.,32,43)。将人工操纵子整合到大肠杆菌的fuc基因座中，其中包括fuc I和K的基因被缺失。用于产生2’FL生产菌株的示例构建体如SEQ ID NO:21所示。

使用lambda-red技术通过同源重组将SEQ ID NO:1至8所示截短的腺苷酸环化酶基因序列引入大肠杆菌宿主细胞中。用于产生2’FL生产菌株的示例构建体如SEQ ID NO:21所示。

6’-SL生产微生物

如下所述构建过量产生6’-SL的大肠杆菌菌株：在充分表征的大肠杆菌菌株W3110中，编码β半乳糖苷酶LacZ的lacZ基因和编码乙酰转移酶LacA的lacA基因、编码nan基因nanAETK的基因被缺失，因为使用熟知的lambda red技术缺失了所有编码序列(例如描述于Datsenko l and Wanner B.PNAS,2000 97(12)6640-6645，Wang J,et al.2006,Mol.Biotechnol.,32,43)，而lacI等位基因被已知的lacIq等位基因置换。将人工操纵子(见SEQ ID NO:22)整合到紧邻菌株W3110的atoB基因。所述人工操纵子含有以下遗传元件：PTAC启动子，人工核糖体结合位点(RBS)，St6基因(源自发光杆菌属(Photobacteriumspp.)ISH 224)，人工核糖体结合位点，neuA基因(源自空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)ATCC 43438)，人工核糖体结合位点(RBS)，博来霉素(zeocin)抗性基因及源自大肠杆菌16s rRNA基因座的转录终止子rrnBT1。此外，将人工操纵子整合在紧邻fabI基因。所述人工操纵子含有PTAC启动子，人工核糖体结合位点(RBS)，neuB基因(源自空肠弯曲杆菌ATCC 43438，见SEQ ID NO:23)，人工核糖体结合位点，neuC基因(源自空肠弯曲杆菌ATCC43438，见SEQ ID NO:24)，人工核糖体结合位点(RBS)，氯霉素抗性盒(CAT)及源自大肠杆菌16s rRNA基因座的转录终止子rrnB。

这个6’-SL生产菌株被称作GN488。

基于菌株GN488构建另一个名为GN782的大肠杆菌菌株。再次利用lambda red技术从菌株GN488基因组的人工操纵子中缺失博来霉素抗性基因和CAT。此外，cyaA的变化在于在密码子582处引入终止密码子，从而产生长度为581个氨基酸的翻译的蛋白质。

3.去调节的腺苷酸环化酶：HMO生产中的时空产率

发酵***和程序

发酵条件：

基于所描述的大肠杆菌发酵实例选择发酵培养基并且可见于：(Riesenberg etal.(1991),Journal of Biotechnology 20,17-27,D.J.Korz,et al.1995),J.Biotechnol.,39pp.59-65,Biener,R.et al.2010,Journal of Biotechnology 146(1-2),pp.45-53。具体而言，改变培养基以基于乳糖生产寡糖，其中根据实验加入20-100g/l范围内的不同浓度的乳糖。

为分析碳转化效率和时空产率方面的菌株性能，使用了以下***：

250***和4l

发酵罐(均来自Sartorius AG，Otto-Brenner-Str.20，D-37079

Germany)。一般而言，发酵通常在以下方案下进行：将种子培养物从冷冻原种中生长。在充分利用其碳含量之前，将种子培养物接种到相应的发酵***(AMBR或Biostat)。或者，主要培养物直接从冷冻原种开始。发酵***中的发酵以补料分批模式进行，即发酵经历两个阶段，第一个阶段是使用批量碳源，第二个阶段是在整个发酵过程中在发酵液中没有或只有少量碳源积累的条件下补加碳源。

为种子培养物(含10ml/L微量元素溶液和65g/L甘油的基本培养基)接种1ml WCB培养物(冷冻保存)。

将种子培养物移至主培养物，接种体积比为1％至10％。

主发酵培养基由以下培养基成分组成：基本培养基：柠檬酸1.1g/L，甘油10.8g/L，KH₂PO₄ 15.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 4.6g/L，Na₂SO₄ 3g/L，MgSO₄*7H₂O 1.5g/L，硫胺素0.02g/L，维生素B12 0.0001g/L，0.5mM IPTG。

微量元素溶液组成为：Na₂-EDTA*2H2O 4g/L，CaSO₄*2H₂O 1g/L，ZnSO₄*7H₂O 0.3g/L，FeSO₄*7H₂O 3.7g/L，MnSO₄*H₂O 0.2g/L，CuSO₄*5H₂O 0.15g/L，Na₂MoO₄*2H₂O 0.04g/L，Na₂SeO₄ 0.04g/L。微量金属溶液的用量为30ml/l发酵培养基。

接种后开始发酵，当测得的CTR超过40mmol/Lh时，开始加入碳源如甘油(86％w/w浓度)或葡萄糖(60％w/w浓度)。碳源进料速率可以在每小时每升初始发酵液体积2-8g/l碳源之间变化。注意在整个发酵过程中不要积累碳源。在主发酵阶段，通过控制搅拌和气体添加，将溶解氧浓度(pO₂)控制在>20％。在15％NH₄OH水溶液中使用碱NH₄OH将pH值保持在6.1至6.9范围内，更特别在6.7。发现这两种发酵***中提到的参数(碳转化效率和时空产率)的结果是完全可叠加的，并且可以理解为完全可互换的。

令人惊奇的是，具有导致功能性去调节的CyaA蛋白的截短的cyaA基因的cAMP过生产细胞确实在甘油上生长并很好地生产2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)。与此相反，发现没有功能性腺苷酸环化酶的cyaA缺失突变体(来自Keio collection,Baba T,Ara T,Hasegawa M,Takai Y,Okumura Y,Baba M,Datsenko KA,Tomita M,Wanner BL,Mori H(2006)Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Mol.Syst.Biol.2:2006 0008)无法在甘油上生长。具有调节部分的腺苷酸环化酶的未修饰的大肠杆菌细胞与具有去调节的腺苷酸环化酶及因此cAMP生产增加的宿主细胞细胞生长更慢，并且未修饰的细胞与具有去调节的腺苷酸环化酶及因此cAMP生产增加的宿主细胞相比2’-FL生产较低，碳转化效率和时空产率也降低。

2’-FL

表2A：2’-FL生产中的碳转化效率。FL是全长的缩写。

通常，当使用

和

容器时，连续加入或重复加入碳源。原则上，可以在主培养开始时一次加入典型量的葡萄糖或甘油，这在例如使用摇瓶发酵时是有利的。

当葡萄糖或甘油用作具有去调节的cyaA基因及因此cAMP水平增加的菌株的碳源时，时空产率增加。

表2B：2’-FL生产中的时空产率

使用生产6’-唾液酸乳糖而不是2’-FL的大肠杆菌菌株也获得了类似结果，这些菌株参见上面的实施例1和2。

4.增加的2’-FL生产菌株的碳源灵活性

将碳源在2小时至100小时的进料阶段期间分批加入培养基并补料。所述碳源以纯方式(例如甘油)或在水中稀释的方式(甘油以及其它碳源)应用。所述碳源的进料率与发酵罐的搅拌和通气条件相适应。

在发酵过程中，取样并通过等度HPLC洗脱法进行分析。

使用以下培养基成分对2’-FL生产进行碳源灵活性分析：

将在100mL带挡板的摇瓶中的20mL培养基(10g/L各个碳源，5g/L乳糖，1g/L(NH₄)₂H-柠檬酸盐，2g/L Na₂SO₄，2.68g/L(NH₄)₂SO₄，0.5g/L NH₄Cl，14.6g/L K₂HPO₄，4g/LNaH₂PO₄*H₂O，0.5g/L MgSO₄*7H₂O，10g/mL MnSO₄，由8.0g/L Na₂-EDTA*2H₂O、1g/L CaSO₄*2H₂O、0.3g/L ZnSO₄*7H2O、7.4g/L(NH₄)₂Fe(SO₄)₂、0.2g/L MnSO₄*H₂O、0.15g/L CuSO₄*5H₂O、0.04g/L Na₂MoO₄*2H₂O、0.04g/L Na₂SeO₄组成的3mL微量金属溶液，10mg/L硫胺素*HCl，0.1mg/L维生素B12，1mM IPTG，pH 7.0)，用如实施例2的2’-FL生产菌株的过夜培养物(在上述不含乳糖和IPTG的培养基中)接种，起始OD为0.5并在上述包括乳糖和IPTG的培养基中在200rpm、37℃温育24小时。取样并分析碳利用和产物形成。

碳源选自以下列表：

葡萄糖、甘油、甘露糖、果糖。

表3：不同碳源的相对碳转化率

5.6’-唾液酸乳糖(6’-SL)生产菌株

将实施例2的菌株GN488和菌株GN782在含有实施例3所述培养基的

容器中生长。

表4：提高的6’-SL生产中的碳转化效率和时空产率

结果表明，对碳转化效率和时空产率的惊奇影响可转移到其它HMO生产菌株和去调节的腺苷酸环化酶增加cAMP水平的广泛应用性，因为已经成功使用了对应于具有848个氨基酸的全长CyaA蛋白(SEQ ID NO:19)的氨基酸1至581的另一形式的去调节的CyaA蛋白。

此外，当检测含有cyaA585形式的蛋白质(SEQ ID NO:14)的菌株时，6’-SL的时空产率与含有未修饰的CyaA蛋白的菌株相比类似地增加。

6.cAMP补料试验

具有cyaA基因缺失的Keio收藏的大肠杆菌菌株(Baba T,Ara T,Hasegawa M,Takai Y,Okumura Y,Baba M,Datsenko KA,Tomita M,Wanner BL,Mori H(2006)Construction of Escherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection.Mol.Syst.Biol.2:2006 0008)显示在甘油作为碳源的情况下通常生长不良。这个菌株在存在甘油和cAMP条件下生长，并且缺失菌株的生长得到改善。上述实施例1和2的具有缩短的腺苷酸环化酶的2’-FL生产宿主细胞与仅具有未修饰的cyaA基因的细胞相比，显示出在含有甘油的培养基上增加的2’-FL生产。如果为后者供应cAMP，则2’-FL的生产增加。

具有改变的cAMP信号传导和PTS的实施例

实施例7：构建过生产2’-FL的菌株

如上文实施例2所述构建具有野生型腺苷酸环化酶和野生型crr基因的过生产2’-FL的大肠杆菌菌株。

携带crr基因缺失的过生产菌株的构建

如下所述构建携带crr基因缺失的大肠杆菌菌株2’-FL过生产菌株：由Datsenko land Wanner B.PNAS,2000 97(12)6640-6645、Wang J,et al.2006,Mol.Biotechnol.,32,43A描述的熟知的方法用于用一种遗传构建体置换2’FL生产菌株中完整全长crr基因，所述遗传构建体由从转录起始位点(得自FLP重组事件的FRT位点)开始的crr的5’编码区的50bp以及以翻译终止密码子的TAA序列结束的crr基因的50bp组成。所得基因(SEQ ID NO:29)因此不编码活性crr蛋白，因为其缺少其编码区的410bp。

使用SEQ ID NO:3和4给出的引物确认crr基因的缺失。

实施例8：构建具有crr基因缺失的生产6’SL的菌株

如上文实施例2中所述创建过生产6’-SL的菌株GN488并用于进一步修饰。在这个菌株中，大肠杆菌菌株中crr基因(SEQ ID NO:1)的缺失通过P1病毒转导及随后在含有卡那霉素的琼脂平板上进行选择而进行。

P1裂解物由来自Keio收藏(Baba et al.2006,Mol Syst Biol.2:2006.0008)的delta crr菌株(JW2410/b2417)crr::kan)制成。使用crr:Kan P1裂解物转导实施例1和2描述的菌株并且在含有卡那霉素的琼脂平板上选择转导体。使用对crr的上游和下游区域具有选择性的引物通过PCR筛选菌落以确认crr的缺失。具有预期条带大小的菌落表明crr基因的正确缺失。

大肠杆菌菌株中crr基因(SEQ ID NO:1)的缺失通过P1病毒转导实现(Miller,J.H.1992.A Short Course in Bacterial Genetics:A Laboratory Manual andHandbook for Escherichia coli and Related Bacteria.Cold Spring HarbourLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)，然后在含有卡那霉素-柠檬酸盐的琼脂板上进行选择。

P1裂解物由来自Keio收藏的菌株(JW2410/b2417)(delta crr::kan(FRT))制成(Baba et al.2006,Mol.Syst.Biol.2:2006.0008)。使用delta crr:Kan P1裂解物转导实施例1和2描述的菌株(分别为2’-FL和6’-SL菌株)并在含有卡那霉素-柠檬酸盐的琼脂板上选择转导体。使用引物Crr ver.F(SEQ ID NO:27)和Crr ver.R(SEQ ID NO:28)通过PCR筛选菌落以确认crr的缺失。选择一个正确的菌落并命名为Ec 6’-SL delta crr。

实施例9：增加的HMO生产中的时空产率

发酵条件、***和程序如上文实施例3所述。

表5：具有野生型(wt)crr或crr功能基因缺失(delta crr)的2’-FL生产的时空产率

菌株	相关基因型	应用的碳源	时空产率(相对值[％])
				N8_2	Crr wt	葡萄糖	100
N16_1	Delta crr	葡萄糖	146
				N8_2	crr wt	甘油	100
N16_1	Delta crr	甘油	227

通常，当使用

和

容器时，碳源连续加入或重复加入。原则上，可以在主培养开始时一次加入典型量的葡萄糖或甘油，这在例如使用摇瓶发酵时是有利的。

实施例10：增加的生产2’FL的修饰的菌株的碳源灵活性

将碳源在2小时至100小时的进料阶段分批加入培养基并补料。碳源以纯方式(例如甘油)或在水中稀释形式(甘油以及其它碳源)应用。碳源的进料率与发酵罐的搅拌和通气条件相适应。

在发酵过程中，取样并通过等度HPLC洗脱法进行分析。

使用以下培养基成分进行碳源灵活性分析：

碳源选自以下列表：

葡萄糖、甘油、甘露糖、果糖。

将在100mL带挡板的摇瓶中的20mL培养基(10g/L各个碳源，5g/L乳糖，1g/L(NH₄)₂H-柠檬酸盐，2g/L Na₂SO₄，2.68g/L(NH₄)₂SO₄，0.5g/L NH₄Cl，14.6g/L K₂HPO₄，4g/LNaH₂PO₄*H₂O，0.5g/L MgSO₄*7H₂O，10g/mL MnSO₄，由8.0g/L Na₂-EDTA*2H₂O、1g/L CaSO₄*2H₂O、0.3g/L ZnSO₄*7H2O、7.4g/L(NH₄)₂Fe(SO₄)₂、0.2g/L MnSO₄*H₂O、0.15g/L CuSO₄*5H₂O、0.04g/L Na₂MoO₄*2H₂O、0.04g/L Na₂SeO₄组成的3mL微量金属溶液，10mg/L硫胺素*HCl，0.1mg/L维生素B12，1mM IPTG，pH 7.0)接种实施例1的2’-FL生产菌株的过夜培养物(在不含乳糖和IPTG的上述培养基上生长)，起始OD为0.5并在包括乳糖和IPTG的上述培养基中以200rpm、37℃温育24小时。取样并分析碳利用和产物形成。类似地，对具有crr缺失的2’-FL生产菌株进行培养取样和分析。

表6：具有wt crr或crr功能基因缺失(delta crr)的2’-FL生产菌株的碳转化效率和碳底物灵活性

Claims

1.增加适合生产一种或多种精细化学品的宿主生物生产的所述一种或多种精细化学品的生产的碳底物灵活性和/或增加适合生产一种或多种精细化学品的宿主生物生产的所述一种或多种精细化学品的碳转化效率和/或增加适合生产一种或多种精细化学品的宿主生物生产的所述一种或多种精细化学品的时空产率的方法，包括以下步骤：与未经修饰的宿主生物相比，增加所述宿主生物的3’,5’-环单磷酸腺苷(cAMP，CAS编号：60-92-4)水平，将所述宿主生物维持在允许其生长的环境中，使所述宿主生物在存在底物及在适于生产一种或多种精细化学品的条件下生长，并且任选将一种或多种精细化学品与所述宿主生物或其剩余物分离。

2.根据前述权利要求的方法，其中所述宿主生物的cAMP水平通过以下方式增加：

a.失活在野生型腺苷酸环化酶中发现的调节活性，和/或

c.将缺乏野生型腺苷酸环化酶中发现的调节活性的突变的腺苷酸环化酶引入所述宿主生物。

3.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述宿主生物的cAMP水平以可诱导方式增加并且所述增加是与没有诱导的宿主生物进行比较的。

4.根据权利要求2的方法，其中所述突变的腺苷酸环化酶通过引入转基因而引入。

5.根据权利要求2、3或4的方法，其中所述突变的腺苷酸环化酶或具有失活的调节活性的腺苷酸环化酶与所述宿主生物的野生型形式的腺苷酸环化酶相比具有缺失。

6.根据权利要求5的方法，其中所述缺失是去除腺苷酸环化酶的调节部分而不破坏产生cAMP的部分。

7.根据权利要求5或6的方法，其中所述缺失是蛋白质对应于由大肠杆菌cyaA基因编码的腺苷酸环化酶的C末端部分的调节部分、优选对应于SEQ ID NO：19或20提供的CyaA蛋白的C末端部分的部分的缺失、或与位置1至412具有至少80％序列相同性的腺苷酸环化酶蛋白。

8.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述方法包括为所述宿主生物供应碳源的步骤，其中所述碳源是复合或指定碳源或其组合。

9.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述宿主生物是经遗传修饰的微生物细胞及其中优选所述一种或多种精细化学品是一种或多种寡糖，以及其中所述方法包括在所述经遗传修饰的微生物生长之前，在经遗传修饰的微生物中失活或去除Crr蛋白或对应于大肠杆菌中Crr蛋白(SEQ ID NO:26)的内源蛋白的步骤。

10.适用于生产精细化学品的经修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够在甘油和/或葡萄糖和/或麦芽糖和/或果糖和/或蔗糖上、优选在蔗糖、甘油、葡萄糖和/或果糖上生长，其中所述经修饰的宿主细胞包含具有失活的或不存在的调节活性的腺苷酸环化酶，其具有腺苷酸环化酶活性，并且其中所述宿主生物与未经修饰的宿主细胞相比具有增加的cAMP水平，其中所述未经修饰的宿主细胞基本上不能在甘油和/或葡萄糖和/或麦芽糖和/或果糖和/或蔗糖上生长。

11.根据权利要求10的经修饰的宿主细胞，其中对应于由大肠杆菌的cyaA基因编码的蛋白的至少一种腺苷酸环化酶蛋白缺乏调节活性，优选缺乏对应于SEQ ID NO：19或20提供的CyaA蛋白的C-末端部分的部分，或是与位置1至412具有至少80％序列相同性的腺苷酸环化酶蛋白。

12.根据权利要求10或11任一项的经修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞是经遗传修饰的微生物以用于增强寡糖生产，其中所述经遗传修饰的微生物能够生产寡糖，其中所述经遗传修饰的微生物包含编码PTS碳水化合物利用***的功能基因，其中在所述经遗传修饰的微生物中Crr蛋白(SEQ ID NO:26)、其变体或所述微生物中对应于Crr蛋白的内源蛋白的丰度和/或活性降低，并且其中与具有未改变的Crr蛋白(SEQ ID NO:26)、其变体或对应于Crr蛋白的内源蛋白的丰度和/或活性的对照相比，通过所述经遗传修饰的微生物的寡糖生产的时空产率、碳底物灵活性或碳转化效率增加。

13.根据权利要求10至12任一项的经修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞是经遗传修饰的微生物，并且编码Crr蛋白、其变体或所述微生物中对应于Crr蛋白的内源蛋白的基因在所述经遗传修饰的微生物中被弱化或缺失。

14.根据前述权利要求的任一项，其中至少一种精细化学品是人乳寡糖。

15.根据前述权利要求的任一项，其中生产一种或多种精细化学品、优选一种或多种寡糖的时空产率、碳底物灵活性和/或碳转化效率与对照相比增加至少20％。