CN111635879B - L-赖氨酸高产菌株及其构建方法和应用 - Google Patents

L-赖氨酸高产菌株及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种构建L‑赖氨酸生产菌株的方法，所述方法包括使得所述赖氨酸生产菌株中的咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中的一种或几种在胞内不能正常发挥功能。本发明还公开了利用所述方法构建的L‑赖氨酸生产菌株和利用所述菌株制备L‑赖氨酸的方法。本发明构建的L‑赖氨酸生产菌株的赖氨酸产量显著提高，从而能够显著降低成本。

Description

L-赖氨酸高产菌株及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及L-赖氨酸高产菌株、这种高产菌株的构建方法和应用。
背景技术
L-赖氨酸是人类和动物营养中重要的必需氨基酸，在医药、健康、食品、动物饲料和化妆品等行业中有着十分重要的地位。全球产业分析(GIA)公司《氨基酸：全球战略商业报告》显示，到2018年，全球赖氨酸的市场规模将达到60亿美元。L-赖氨酸主要采用微生物发酵法来生产，已知的可生产氨基酸的微生物包括埃希氏菌属(Escherichia)，棒杆菌属(Corynebavterium)、短杆菌属(Brevibacterium)等。近年来，在原料处理、发酵工艺和分离提取工艺方面的不断改进，在一定程度上降低了氨基酸发酵生产的成本，而作为发酵工业的核心，发酵菌种的改造技术也在不断开发。例如解除氨基酸合成途径关键酶的底物反馈抑制提高产量(WO1995016042、WO1995006114)，氨基酸降解相关基因的弱化或敲除(WO1996017930)、运输蛋白的过表达(WO2005073390)、底物摄入相关蛋白活性的加强(WO2002029080)，以及将这些改造策略相结合生产氨基酸等等。因此，在公众已知的赖氨酸代谢相关的各个方面都已经进行了大量的改造和研发，当前赖氨酸工业生产菌株的产酸能力已达到很高的水平。
众所周知，细胞是一个复杂的代谢网络集合体，在某一化合物的合成过程中人们通常对其代谢直接相关途径(包括底物运输、代谢途径、产物运输、等)进行改造，而不会去改造细胞中的其他不相关的途径，因为不相关途径的改变对菌株造成的影响是不可知的，且细胞中的代谢途径众多，想要从众多的途径中挖掘出与赖氨酸生产相关的可改造点难度巨大，尤其是在当前赖氨酸工业菌株已达到高水平的情况下，想要进一步提升，甚至是小幅提升都十分困难。
因此，本领域急需全新的L-赖氨酸生产菌株的构建方法，以便进一步提高L-赖氨酸的产量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种全新的L-赖氨酸生产菌株的构建方法，采用所述构建方法构建的L-赖氨酸生产菌株以及利用所构建的L-赖氨酸生产菌株生产L-赖氨酸的方法。
在第一方面，本发明提高一种L-赖氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，修饰所述L-赖氨酸生产菌株细胞中的咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中的一种或几种，使之在胞内不能正常发挥功能。
在具体的实施方式中，与内源性咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶相比，所述L-赖氨酸生产菌株的L-赖氨酸产量提高至少8％、优选至少15％、更优选至少20％、更优选至少25％、更优选至少30％、最优选至少35％。
在优选的实施方式中，所述使得细胞中的咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶在胞内不能正常发挥功能可以通过以下方法之一或组合实现：部分敲除或完全敲除咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中一种或几种的编码基因；咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中一种或几种的编码基因突变引起氨基酸残基变化；改变咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中一种或几种的编码基因启动子、翻译调控区或编码区密码子令其转录或翻译弱化；改变咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中一种或几种的编码基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构不稳定；在不改变原有咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中一种或几种的编码基因序列的情况下引入新的活性降低的突变体导致胞内酶的总体活性降低；或其他任何通过修饰细胞中內源或外源引入的咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶基因编码区及其临近的上下游区域使其在胞内不能正常发挥功能的方式等。
在进一步的优选实施方式中，使得咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中一种或几种的基因编码序列发生移码突变、缺失、起始密码子改变等。
在优选的实施方式中，所述咪唑甘油磷酸酯脱水酶是指：
1)具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6所示核苷酸编码的氨基酸序列的多肽；或
2)与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6所示核苷酸编码的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同源性，且具有催化D-赤式-咪唑-甘油-磷酸酯生成咪唑丙酮-磷酸酯功能或具有咪唑甘油磷酸酯脱水酶活性的多肽。
在进一步的优选实施方式中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6所示核苷酸编码的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同源性，且具有催化D-赤式-咪唑-甘油-磷酸酯生成咪唑丙酮-磷酸酯功能或具有咪唑甘油磷酸酯脱水酶活性的多肽来源于大肠杆菌或者谷氨酸棒杆菌。
在优选的实施方式中，所述组氨醇磷酸化酶是指：
1)具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7所示核苷酸编码的氨基酸序列的多肽；或
2)与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7所示核苷酸编码的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同源性，且具有催化组氨酸磷酸酯生成组氨醇功能或具有组氨醇磷酸化酶活性的多肽。
在进一步的优选实施方式中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7所示核苷酸编码的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同源性且具有催化组氨酸磷酸酯生成组氨醇功能或具有组氨醇磷酸化酶活性的多肽来源于大肠杆菌或者谷氨酸棒杆菌。
在优选的实施方式中，所述组氨醛/组氨醇脱氢酶是指：
1)具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8所示核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽；或
2)与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8所示核苷酸序列编码的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同源性，且具有催化组氨醇生成组氨醛或催化组氨醛生成组氨酸功能或具有组氨醛/组氨醇脱氢酶活性的多肽。
在进一步的优选实施方式中，与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8所示核苷酸序列编码的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同源性，且具有催化组氨醇生成组氨醛或催化组氨醛生成组氨酸功能或具有组氨醛/组氨醇脱氢酶活性的多肽来源于大肠杆菌或者谷氨酸棒杆菌。
在优选的实施方式中，所述咪唑甘油磷酸酯脱水酶的编码基因如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6所示，或可与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6所述的核苷酸序列杂交的核苷酸，或可与由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6核苷酸序列制备的探针杂交的核苷酸，其中所述杂交在严格条件下发生，并且其中所述核苷酸编码具有咪唑甘油磷酸酯脱水酶活性的蛋白；
所述组氨醇磷酸化酶的编码基因如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7所示，或可与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7所述的核苷酸序列杂交的核苷酸，或可与由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7核苷酸序列制备的探针杂交的核苷酸，其中所述杂交在严格条件下发生，并且其中所述核苷酸编码具有组氨醇磷酸化酶活性的蛋白；
所述组氨醛/组氨醇脱氢酶的编码基因如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8所示，或可与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8所述的核苷酸序列杂交的核苷酸，或可与由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8核苷酸序列制备的探针杂交的核苷酸，其中所述杂交在严格条件下发生，并且其中所述核苷酸编码具有组氨醛/组氨醇脱氢酶活性的蛋白。
在具体的实施方式中，所述菌株来自埃希氏菌属(Escherichia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium sp)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)或弧菌属(Vibrio)；更优选地，所述菌株是大肠杆菌(E.coli)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
在第二方面，本发明提供一种L-赖氨酸的生产菌株，所述菌株经修饰咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中的一种或几种在细胞内不能正常发挥功能。
在具体的实施方式中，与内源性咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶相比，所述L-赖氨酸高产菌株的L-赖氨酸产量提高至少8％、优选至少15％、更优选至少20％、更优选至少25％、更优选至少30％、最优选至少35％。
在优选的实施方式中，所述使得细胞中的咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶在胞内不能正常发挥功能可以通过以下方法之一或组合实现：部分敲除或完全敲除咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中一种或几种的编码基因；咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中一种或几种的编码基因突变引起氨基酸残基变化；改变咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中一种或几种的编码基因启动子、翻译调控区或编码区密码子令其转录或翻译弱化；改变咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中一种或几种的编码基因序列使其mRNA稳定性减弱或酶结构不稳定；在不改变原有咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中一种或几种的编码基因序列的情况下引入新的活性降低的突变体导致胞内酶的总体活性降低；或其他任何通过修饰细胞中內源或外源引入的咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶基因编码区及其临近的上下游区域使其在胞内不能正常发挥功能的方式等。
在进一步的优选实施方式中，使得咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中一种或几种的基因编码序列发生移码突变、缺失、起始密码子改变等。
在优选的实施方式中，所述咪唑甘油磷酸酯脱水酶是指：
1)具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6所示核苷酸编码的氨基酸序列的多肽；或
2)与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6所示核苷酸编码的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同源性，且具有催化D-赤式-咪唑-甘油-磷酸酯生成咪唑丙酮-磷酸酯功能或具有咪唑甘油磷酸酯脱水酶活性的多肽。
在进一步的优选实施方式中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6所示核苷酸编码的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同源性，且具有催化D-赤式-咪唑-甘油-磷酸酯生成咪唑丙酮-磷酸酯功能或具有咪唑甘油磷酸酯脱水酶活性的多肽来源于大肠杆菌或者谷氨酸棒杆菌。
在优选的实施方式中，所述组氨醇磷酸化酶是指：
1)具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7所示核苷酸编码的氨基酸序列的多肽；或
2)与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7所示核苷酸编码的氨基酸序列具有95％以上同源性，且具有催化组氨酸磷酸酯生成组氨醇功能或具有组氨醇磷酸化酶活性的多肽。
在进一步的优选实施方式中，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7所示核苷酸编码的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同源性，且具有催化组氨酸磷酸酯生成组氨醇功能或具有组氨醇磷酸化酶活性的多肽来源于大肠杆菌或者谷氨酸棒杆菌。
在优选的实施方式中，所述组氨醛/组氨醇脱氢酶是指：
1)具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8所示核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽；或
2)与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8所示核苷酸序列编码的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同源性，且具有催化组氨醇生成组氨醛或催化组氨醛生成组氨酸功能或具有组氨醛/组氨醇脱氢酶活性的多肽。
在进一步的优选实施方式中，与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8所示核苷酸序列编码的氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同源性，且具有催化组氨醇生成组氨醛或催化组氨醛生成组氨酸功能或具有组氨醛/组氨醇脱氢酶活性的多肽来源于大肠杆菌或者谷氨酸棒杆菌。
在优选的实施方式中，所述咪唑甘油磷酸酯脱水酶的编码基因如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6所示，或可与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6所述的核苷酸序列杂交的核苷酸，或可与由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6核苷酸序列制备的探针杂交的核苷酸，其中所述杂交在严格条件下发生，并且其中所述核苷酸编码具有咪唑甘油磷酸酯脱水酶活性的蛋白；
所述组氨醇磷酸化酶的编码基因如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7所示，或可与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7所述的核苷酸序列杂交的核苷酸，或可与由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7核苷酸序列制备的探针杂交的核苷酸，其中所述杂交在严格条件下发生，并且其中所述核苷酸编码具有组氨醇磷酸化酶活性的蛋白；
所述组氨醛/组氨醇脱氢酶的编码基因如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8所示，或可与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8所述的核苷酸序列杂交的核苷酸，或可与由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8核苷酸序列制备的探针杂交的核苷酸，其中所述杂交在严格条件下发生，并且其中所述核苷酸编码具有组氨醛/组氨醇脱氢酶活性的蛋白。
在具体的实施方式中，所述菌株来自埃希氏菌属(Escherichia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium sp)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)或弧菌属(Vibrio)；更优选地，所述菌株是大肠杆菌(E.coli)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
在第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含第一方面所述的在胞内不能正常发挥功能的咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中的一种或几种的编码核苷酸。
在第四方面，本发明提供一种制备L-赖氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)培养第一方面所述的L-赖氨酸生产菌株，使之产生L-赖氨酸；和
2)任选地从步骤1)所得到的培养液中分离L-赖氨酸。
在第五方面，本发明提供第一方面所述的构建方法构建的L-赖氨酸生产菌株、第二方面所述的L-赖氨酸生产菌株、第三方面所述的表达载体在生产L-赖氨酸中的应用。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
在细菌的代谢网络中，组氨酸代谢途径和赖氨酸代谢途径相差较远，已有文献报道，过表达咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱水酶可以增强菌株组氨酸的产量，而咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱水酶的弱化使菌株的组氨酸产量下降。目前，尚无利用咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱水酶编码基因的弱化或敲除提高菌株赖氨酸产量的报道。
发明人经过广泛而深入的研究，在对获得的新型赖氨酸生产菌株的全面解析后，出乎意料地发现弱化赖氨酸生产菌株中的组氨酸代谢相关酶即咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶活性能够显著提高赖氨酸的产量，从而降低生产成本。在此基础上完成了本发明。
咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶
咪唑甘油磷酸酯脱水酶(imidazoleglycerol-phosphate dehydratase)、组氨醇磷酸化酶(histidinol-phosphatase)是组氨酸代谢途径中的酶，咪唑甘油磷酸酯脱水酶催化组氨酸合成途径中的第六步反应，即催化D-赤式-咪唑-甘油-磷酸酯(D-erythro-imidazole-glycerol-phosphate)生成咪唑丙酮-磷酸酯(imidazole acetol-phosphate)，组氨醇磷酸化酶催化组氨酸合成途径中的第八步反应，即催化组氨酸磷酸酯(L-histidinol-phosphate)生成组氨醇(histidinol)，在大肠杆菌中，这两个酶都由hisB基因编码，而在谷氨酸棒杆菌中，咪唑甘油磷酸酯脱水酶由hisB基因编码，而组氨醇磷酸化酶由hisN基因编码。
组氨醛/组氨醇脱氢酶(histidinal dehydrogenase/histidinoldehydrogenase)，由hisD基因编码，也是组氨酸代谢途径中的酶，催化组氨酸生物合成的最后两个步骤，即催化组氨醇(histidinol)生成组氨醛(histidinal)，再催化组氨醛生成组氨酸(histidine)。
就本发明的目的而言，咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶可以来源于大肠杆菌或者谷氨酸棒杆菌。此外，显然，具有与SEQ ID NO:1-8所示核苷酸编码多肽活性等同活性的任何序列，虽然它不是来源于大肠杆菌或者谷氨酸棒杆菌，也包括在本发明的范围内。例如，可包括SEQ ID NO:1-8所示核苷酸编码的氨基酸序列，或包括SEQ ID NO:1-8所示核苷酸编码的多肽的保守序列和在一个或多个位置一个氨基酸或者几个氨基酸(可依据蛋白质三维结构中氨基酸残基的位置和类型的变化，优选2-20个，更优选2-10个，最优选2-6个氨基酸残基)的置换、缺失、***、添加或倒位的氨基酸序列，只要能具有其催化反应的活性；还可以包括与SEQ ID NO:1-8所示核苷酸编码的多肽同源性大于80％，优选90％，更优选95％以上且具有咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶或组氨醛/组氨醇脱氢酶活性的多肽，并且氨基酸的置换、缺失、***、添加或倒位还包括天然存在于具有咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶或组氨醛/组氨醇脱氢酶活性的微生物中的突变序列或者人工修饰的序列。
术语定义
多核苷酸，一般是指多核糖核苷酸和多脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。本发明的核苷酸可以是SEQ ID NO:1-8所述的核苷酸序列，也可以是在严格条件下与SEQ ID NO:1-8所述的核苷酸序列杂交的核苷酸，也可以是与由SEQ IDNO:1-8制备的探针杂交的核苷酸并且可以编码具有咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶活性的蛋白。这里所说的“严格条件”是指特异性杂交可发生而非特异性杂交不发生的条件。如，在一定浓度的盐溶液中洗涤，洗涤1次，优选洗涤2次或3次，相应地浓度为1*SSC、0.1％SDS，优选60℃下0.1*SSC、0.1％SDS，更优选68℃下0.1*SSC、0.1％SDS，探针长度可根据杂交条件选择，通常为100bp到1kb。
本文所用的术语“内源性”指的是在微生物中多肽处于未修饰状态的活性，即自然状态下的活性。
多肽，应理解为包括经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。本发明的多肽是具有SEQ ID NO:1-8所述核苷酸编码的氨基酸序列的多肽。本领域技术人员知晓，生物，例如微生物体内的多肽存在自然突变的现象，但这些包含自然突变的多肽能够具备与原多肽相同或相似的活性；或者，本领域技术人员基于现有技术的知识也可以制备具有突变的多肽，这种具有突变的多肽依然可以具备与原多肽相同或相似的活性；或者，本领域技术人员也可以知晓在不同物种之间，具有某一功能的多肽在序列上可能有一定差异，即，具有一定同源性，但这些多肽能够具备相同或相似的功能。因此，本发明的多肽也应包括具有SEQ ID NO:1-8所示核苷酸编码的氨基酸序列的变异体的突变多肽。本领域技术人员不难制备这样的多肽，例如SEQ ID NO:1-8所示核苷酸编码的氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失、***或添加的氨基酸序列，且具有与SEQ ID NO:1-8所示核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽相同或相似活性的多肽。这里所说的“数个”是指2-20个，优选2-10个，更优选2-5个。这里所说的取代、缺失、***或添加可以通过公众所知的保守型突变获得。
基于本发明的教导，本领域技术人员应该理解，本发明通过将L-赖氨酸生产菌株细胞中的咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中的一种或几种的活性降低、甚至完全失活来提高L-赖氨酸生产菌株的L-赖氨酸产量。因此，本文所述的“使得L-赖氨酸生产菌株细胞中的咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中的一种或几种在胞内不能正常发挥功能”表示通过技术手段，例如遗传修饰等使得L-赖氨酸生产菌株细胞中的咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中的一种或几种的胞内活性降低、减弱甚至完全消失，或者咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶的功能被去除。
本发明所述“修饰”是指任何对野生型菌株或亲本菌株进行的遗传操作，包括但不限于各种分子生物学手段。
本发明中术语“基因表达弱化或失活”是指微生物中由DNA所编码的一种或多种酶或蛋白质的胞内活性降低或消除，包括但不限于通过删除部分或全部编码基因、基因阅读框移码突变、弱化转录或翻译强度、或使用编码具有较低活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因，或使对应基因或酶失去活性，及任选地组合使用这些方法。采用合适的培养方法或基因表达的信号结构的遗传修饰(突变)可以实现基因表达的降低，例如基因表达的信号结构是阻遏基因，活性基因，操纵基因，启动子，弱化子，核糖体结合位点，起始密码子和终止子。
基于本发明的教导，本领域技术人员知晓，本文所述的“弱化”是指相比于原多肽，突变的多肽的活性降低。例如，相比于内源性咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶，突变的咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶的活性降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％；甚至完全失活。
基于本发明的教导，本领域技术人员知晓，可以通过弱化咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶的活性，或者使得咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶在细胞中不能正常发挥功能来提高L-赖氨酸的产量。本领域技术人员可以通过本领域已知的技术手段使得咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶在细胞中不能正常发挥功能。例如，本发明所述的“经修饰使咪唑甘油磷酸酯脱水酶在细胞中不能正常发挥功能”是指细菌经过修饰后使咪唑甘油磷酸酯脱水酶的功能被去除，或者与未经修饰的菌株如野生型菌株/亲本菌株相比该咪唑甘油磷酸酯脱水酶活性降低或减弱。该咪唑甘油磷酸酯脱水酶不能正常发挥功能的情况可以是，比如编码该酶基因的转录或翻译被抑制，因此其基因产物咪唑甘油磷酸酯脱水酶不能产生或者产量减少的情况；或是细菌染色体上的所述咪唑甘油磷酸酯脱水酶编码基因经突变和/或该基因的表达调控序列经突变，因此，该咪唑甘油磷酸酯脱水酶活性降低或减弱；也可以是指减少每个细胞内咪唑甘油磷酸酯脱水酶分子的数量和减弱每个酶分子的活性，具体地，可以通过使染色体上的酶编码基因缺陷，或者通过修饰一个表达控制序列如启动子或SD序列来实现；也可以通过向编码区域引入氨基酸取代(错义突变)、终止密码子(无义突变)，或向编码区引入一个或两个碱基的***或缺失(移码突变)或缺失部分基因来实现(Journal of Biological Chemistry 1997，272:8611-8617)。
同样，所述“经修饰使组氨醇磷酸化酶在细胞中不能正常发挥功能”，可以是编码该酶基因的转录或翻译被抑制，因此其基因产物组氨醇磷酸化酶不能产生或者产量减少的情况；或是细菌染色体上的所述组氨醇磷酸化酶编码基因经突变和/或该基因的表达调控序列经突变，因此，该组氨醇磷酸化酶活性降低或减弱；也可以是指减少每个细胞内组氨醇磷酸化酶分子的数量和减弱每个酶分子的活性，具体地，可以通过使染色体上的酶编码基因缺陷，或者通过修饰一个表达控制序列如启动子或SD序列来实现；也可以通过向编码区域引入氨基酸取代(错义突变)、终止密码子(无义突变)，或向编码区引入一个或两个碱基的***或缺失(移码突变)或缺失部分基因来实现(Journal of Biological Chemistry1997，272:8611-8617)。
同样，本发明所述的“经修饰使组氨醛/组氨醇脱水酶在细胞中不能正常发挥功能”是指细菌经过修饰后使组氨醛/组氨醇脱水酶的功能被去除，或者与未经修饰的菌株如野生型菌株/亲本菌株相比该组氨醛/组氨醇脱水酶活性降低或减弱。该组氨醛/组氨醇脱水酶不能正常发挥功能的情况可以是，比如编码该酶基因的转录或翻译被抑制，因此其基因产物组氨醛/组氨醇脱水酶不能产生或者产量减少的情况；或是细菌染色体上的所述组氨醛/组氨醇脱水酶编码基因经突变和/或该基因的表达调控序列经突变，因此，该组氨醛/组氨醇脱水酶活性降低或减弱；也可以是指减少每个细胞内组氨醛/组氨醇脱水酶分子的数量和减弱每个酶分子的活性，具体地，可以通过使染色体上的酶编码基因缺陷，或者通过修饰一个表达控制序列如启动子或SD序列来实现；也可以通过向编码区域引入氨基酸取代(错义突变)、终止密码子(无义突变)，或向编码区引入一个或两个碱基的***或缺失(移码突变)或缺失部分基因来实现(Journal of Biological Chemistry 1997，272:8611-8617)。这里所说的“减弱”包含但不限于活性的完全消失，对本发明来说，咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶活性比亲本菌株或未修饰的菌株的活性降低就已经足够，但优选的是，活性完全消失。
本文所用的术语“宿主细胞”或“生产菌株”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中的一种或几种经修饰后不能正常发挥功能，且能够生产L-赖氨酸的细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要所述细胞中的咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中的一种或几种不能正常发挥功能，且能够生产L-赖氨酸。所述宿主细胞可以来自埃希氏菌属(Escherichia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacteriumsp)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)或弧菌属(Vibrio)。例如，在具体的实施例中，本发明利用的是包含天冬氨酸激酶lysC基因的宿主细胞。但本领域普通技术人员应该知道，本发明不限于包含外源性编码基因的宿主细胞。例如，本发明的宿主细胞中包含的天冬氨酸激酶的编码基因不仅可以是重组载体或质粒，还有可能是基因组上整合有所述酶的编码基因，即，在基因组整合上的酶的编码基因可能是通过转入质粒进行同源重组得到，也有可能在基因组上定点突变相应的位点而得到。
本文所说的“赖氨酸生产菌株”是指，当细菌在培养中培养时可以生产L-赖氨酸并且能够积累L-赖氨酸，或者能够将L-赖氨酸分泌到培养基中，也就是能够得到胞外的游离赖氨酸的菌株。例如，可以是天然存在的赖氨酸生产菌株，也可以是经过遗传改造获得的赖氨酸生产工程菌株，这些改造包括但不限于所述菌株中的选自以下的一个或几个基因被增强或多表达：
a.编码解除赖氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶lysC基因；
b.编码解除赖氨酸反馈抑制的二氢二吡啶合成酶的dapA基因；
c.编码二氢二吡啶二羧酸还原酶的dapB基因；
d.编码二氨基庚二酸脱水酶的ddh基因；
e.编码四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶的dapD和编码琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的dapE；
f.编码天冬氨酸-半醛脱水酶的asd基因；
g.编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因；或
h.编码烟酸胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的pntAB基因。
此外，包含但不限于所述菌株中选自以下的一个或几个基因被弱化或表达降低：
a.编码乙醇脱水酶的adhE基因；
b.编码乙酸激酶的ackA基因；
c.编码磷酸乙酰转移酶的pta基因；
d.编码乳酸脱水酶的ldhA基因；
e.编码甲酸转运蛋白的focA基因；
f.编码丙酮酸甲酸裂解酶的pflB基因；
g.编码丙酮酸氧化酶的poxB基因；
h.编码天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱水酶I双功能酶的thrA基因；
i.编码高丝氨酸激酶的thrB基因；
j.编码赖氨酸脱羧酶的ldcC基因；和
h.编码赖氨酸脱羧酶的cadA基因。
本发明的优点：
1.本发明提供了一种构建L-赖氨酸生产菌株的全新方法，从而为L-赖氨酸高产菌株的构建开辟了新的思路；
2.本发明构建的L-赖氨酸生产菌株的赖氨酸产量显著提高；和
3.通过本发明方法生产L-赖氨酸的成本能够显著降低。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选本文所述的方法和材料。
实施例
实施例1.大肠杆菌BW25113中hisB基因的弱化和失活
采用CRISPR/Cas9的大肠杆菌基因组快速操作技术【Zhao,D.,et al.(2017).Sci Rep 7(1):16624.】，利用表1中的引物HisB-F和HisB-Ra，以氯霉素抗性基因加N20PAM片段【Zhao,D.,et al.(2017).Sci Rep 7(1):16624.】为模板，通过PCR扩增，获得了用于将BW25113的hisB基因(SEQ ID NO:1)起始密码子atg替换为gtg的重组片段hisBgtg。将质粒pCAGO【Zhao,D.,et al.(2017).Sci Rep 7(1):16624.】转化到BW25113中，获得菌株BW25113(pCAGO)。制备用于电转化的BW25113(pCAGO)感受态细胞，制备感受态所用的培养基为：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，10g/L葡萄糖，终浓度为0.1mM的IPTG。转化上述重组片段hisBgtg到BW25113(pCAGO)感受态细胞中，30摄氏度培养2小时，挑选能够在含有100mg/L氨苄青霉素，30mg/L氯霉素，10g/L葡萄糖的LB平板上生长的菌落。获得的菌落进一步在含有100mg/L氨苄青霉素，0.1mM的IPTG，2g/L***糖的LB液体培养基中，30摄氏度培养6小时，然后涂布到含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，挑选单菌落，测序验证，获得hisB基因的起始密码子atg突变为gtg的菌株，然后在37摄氏度培养，丢掉pCAGO质粒，获得菌株，命名为BW25113-hisBgtg。
利用上述基于CRISPR/Cas9的大肠杆菌基因组快速操作技术【Zhao,D.,et al.(2017).Sci Rep 7(1):16624.】，利用表1中的引物HisB-F和HisB-Rn，以氯霉素抗性基因加N20PAM片段【Zhao,D.,et al.(2017).Sci Rep 7(1):16624.】为模板，通过PCR扩增，获得用于将hisB基因(SEQ ID NO:1)的第15位碱基到第21位碱基敲除的重组片段△hisB。利用上述提到的基因重组步骤，利用质粒pCAGO和本实施例中获得的重组片段△hisB，对大肠杆菌BW25113进行基因编辑，采用实施例1中提到的筛选步骤，获得敲除hisB基因的第15位碱基到第21位碱基的菌株，该菌株中hisB基因的第13-15位为TAA，形成终止密码子，使hisB基因无法正常表达，从而造成hisB的失活，该菌株命名为BW25113ΔhisB。
表1.用于构建大肠杆菌中hisB基因的弱化和失活所用重组片段的引物
Figure BDA0001983430210000141
实施例2.大肠杆菌中hisD基因的弱化和失活
利用实施例1中提到的基于CRISPR/Cas9的大肠杆菌基因组快速操作技术，对大肠杆菌BW25113的hisD基因(SEQ ID NO:2)起始密码子进行atg到gtg的替换，所用引物为表2中的HisD-F和HisD-Ra，所构建的菌株命名为BW25113-hisDgtg；另外，利用表2中的HisD-F和HisD-Rn，采用同样的基因组快速操作技术，对hisD基因(SEQ ID NO:2)的第8位到第14位碱基进行编辑，编辑后hisD基因的第7-9位为TAA，形成终止密码子，使hisD基因无法正常表达，从而造成hisD的失活，获得的菌株命名为BW25113ΔhisD。
表2.用于构建大肠杆菌中hisD基因的弱化表达和失活所用重组片段的引物
Figure BDA0001983430210000142
Figure BDA0001983430210000151
实施例3.谷氨酸棒杆菌B253(GeneBank accession number CP010451)以及13032(lysCT311I)中hisB、hisN、hisD基因的敲除
首先，利用文献中报道的方法，通过两步重组将谷氨酸棒杆菌13032的天冬氨酸激酶(aspartokinase，lysC)基因第311位的苏氨酸密码子替换为异亮氨酸密码子【Ohnishi,J.,et al.(2002).Appl Microbiol Biotechnol 58(2):217-223】，获得能够生产赖氨酸的菌株13032(lysCT311I)。
利用文献中报道的CRISPR/Cas9以及活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase,AID)【Wang,Y.,et al.(2018).Metab Eng 47:200-210.】，对B253以及13032(lysCT311I)中hisB、hisN、hisD基因分别进行失活。
分别合成表3中用于将B253中的hisB基因(SEQ ID NO:3)以及13032(lysCT311I)中的hisB基因(SEQ ID NO:6)第238位碱基C突变为T的引物hisBF和hisBR，用于将B253中的hisN基因(SEQ ID NO:4)以及13032(lysCT311I)中hisN基因(SEQ ID NO:7)的第381位碱基G突变为A的引物hisNF和hisNR，以及用于将B253中的hisD基因(SEQ ID NO:5)以及13032(lysCT311I)中hisD基因(SEQ ID NO:8)的第487位碱基C突变为T的引物hisDF和hisDR。根据文献中的步骤【Wang,Y.,et al.(2018).Metab Eng 47:200-210.】，将上述每一对引物分别退火后，分别与pgRNA-ccdB质粒混合，然后进行酶切连接，分别获得质粒pgRNA-hisB，pgRNA-hisN，pgRNA-hisD，将上述质粒分别与带有nCas9-AID基因的质粒pnCas9(D10A)-AID共转化到谷氨酸棒杆菌B253以及13032(lysCT311I)中，根据文献中的步骤，分别对hisB，hisN，hisD基因进行编辑，最后去除质粒，获得菌株B253-hisBC238T，B253-hisNG381A，B253-hisDC487T，13032(lysCT311I)-hisBC238T，13032(lysCT311I)-hisNG381A，以及13032(lysCT311I)-hisDC487T。hisBC238T，hisNG381A以及hisDC487T基因突变后分别在基因内部形成提前的终止密码子，因此，突变致使菌株中对应的酶活性丢失。
表3.用于构建谷氨酸棒杆菌B253中hisB、hisN、hisD基因失活的引物
Figure BDA0001983430210000152
Figure BDA0001983430210000161
以上实施例中述及的序列如下所示：
SEQ ID NO:1：大肠杆菌BW25113的hisB:imidazoleglycerol-phosphatedehydratase/histidinol-phosphatase(其中，下划线示出起始密码子atg，斜体字示出待敲除的第15位碱基到第21位碱基)
AtgAGTCAGAAGTATCTTTTTATCGATCGCGATGGAACCCTGATTAGCGAACCGCCGAGTGATTTTCAGGTGGACCGTTTTGATAAACTCGCCTTTGAACCGGGCGTGATCCCGGAACTGCTGAAGCTGCAAAAAGCGGGCTACAAGCTGGTGATGATCACTAATCAGGATGGTCTTGGAACACAAAGTTTCCCACAGGCGGATTTCGATGGCCCGCACAACCTGATGATGCAGATCTTCACCTCGCAAGGCGTACAGTTTGATGAAGTGCTGATTTGTCCGCACCTGCCCGCCGATGAGTGCGACTGCCGTAAGCCGAAAGTAAAACTGGTGGAACGTTATCTGGCTGAGCAAGCGATGGATCGCGCTAACAGTTATGTGATTGGCGATCGCGCGACCGACATTCAACTGGCGGAAAACATGGGCATTACTGGTTTACGCTACGACCGCGAAACCCTGAACTGGCCAATGATTGGCGAGCAACTCACCAGACGTGACCGTTACGCTCACGTAGTGCGTAATACCAAAGAGACGCAGATTGACGTTCAGGTGTGGCTGGATCGTGAAGGTGGCAGCAAGATTAACACCGGCGTTGGCTTCTTTGATCATATGCTGGATCAGATCGCTACCCACGGCGGTTTCCGCATGGAAATCAACGTCAAAGGCGACCTCTATATCGACGATCACCACACCGTCGAAGATACCGGCCTGGCGCTGGGCGAAGCGCTAAAAATCGCCCTCGGAGACAAACGCGGTATTTGCCGCTTTGGTTTTGTGCTACCGATGGACGAATGCCTTGCCCGCTGCGCGCTGGATATCTCTGGTCGCCCGCACCTGGAATATAAAGCCGAGTTTACCTACCAGCGCGTGGGCGATCTCAGCACCGAAATGATCGAGCACTTCTTCCGTTCGCTCTCATACACCATGGGCGTGACGCTACACCTGAAAACCAAAGGTAAAAACGATCATCACCGTGTAGAGAGTCTGTTCAAAGCCTTTGGTCGCACCCTGCGCCAGGCCATCCGCGTGGAAGGCGATACCCTGCCCTCGTCGAAAGGAGTGCTGtaa
SEQ ID NO:2：大肠杆菌BW25113的HisD:histidinal dehydrogenase/histidinoldehydrogenase(其中，下划线示出起始密码子atg，斜体字示出待敲除的第8位碱基到第14位碱基)
atgAGCTTTAACACAATCATTGACTGGAATAGCTGTACTGCGGAGCAACAACGCCAGCTGTTAATGCGCCCGGCGATTTCCGCCTCTGAAAGCATTACCCGCACTGTTAACGATATTCTCGATAACGTGAAAGCACGCGGCGATGAGGCCCTGCGGGAATACAGCGCGAAGTTTGATAAAACCACGGTTACCGCGCTGAAGGTGTCTGCAGAGGAGATCGCCGCCGCCAGCGAACGCCTGAGCGACGAGCTAAAACAGGCGATGGCGGTGGCAGTAAAGAATATTGAAACCTTCCACACTGCGCAAAAACTGCCGCCGGTAGATGTAGAAACGCAGCCAGGCGTGCGTTGCCAGCAGGTCACGCGTCCGGTAGCTTCAGTTGGGTTGTATATTCCTGGCGGCTCCGCCCCGCTCTTCTCAACGGTATTAATGCTGGCGACTCCGGCGAGTATTGCGGGCTGTAAAAAAGTGGTGCTGTGCTCACCGCCGCCGATTGCCGATGAGATCCTTTATGCGGCGCAGCTGTGCGGTGTGCAGGACGTGTTTAACGTCGGCGGCGCACAGGCCATTGCCGCACTGGCGTTTGGTACGGAATCTGTGCCAAAAGTGGACAAAATCTTCGGGCCGGGTAACGCCTTTGTCACCGAAGCGAAACGTCAGGTGAGCCAGCGTCTGGACGGTGCGGCGATCGATATGCCCGCAGGCCCGTCGGAAGTGCTGGTGATTGCTGACAGCGGCGCTACGCCGGATTTCGTGGCTTCTGATTTGCTCTCTCAGGCTGAACACGGCCCGGACTCACAGGTGATTTTACTGACGCCCGCTGCTGATATGGCGCGTCGCGTTGCCGAGGCCGTCGAACGCCAACTGGCAGAACTGCCGCGTGCCGAAACCGCCCGCCAGGCACTGAACGCCAGCCGCCTGATCGTGACTAAAGATTTAGCGCAGTGCGTGGAGATCTCCAACCAGTACGGCCCGGAGCACCTGATCATTCAGACCCGCAACGCCCGTGAACTGGTCGATAGCATCACCAGCGCCGGTTCGGTATTTCTTGGTGACTGGTCACCGGAATCGGCAGGTGATTACGCCTCCGGCACCAACCACGTTCTACCGACTTACGGTTACACCGCCACCTGTTCCAGCCTCGGGCTGGCAGATTTCCAGAAGCGCATGACCGTACAGGAACTGTCGAAAGAGGGGTTCTCCGCGCTGGCTTCAACCATAGAAACACTGGCCGCCGCCGAGCGCCTGACCGCCCACAAAAATGCCGTTACTTTGCGTGTTAACGCCCTTAAGGAGCAAGCAtga
SEQ ID NO:3：谷氨酸棒状杆菌B253的hisB：imidazoleglycerol-phosphatedehydratase(其中下划线示出待突变为T的第238位碱基C)
ATGACTGTCGCACCAAGAATTGGTACCGCAACCCGCACCACCAGCGAATCCGACATCACCGTCGAGATCAACCTGGACGGCACCGGCAAAGTAGATATCGATACCGGCCTGCCATTTTTCGACCACATGCTCACTGCATTCGGCGTGCACGGCAGTTTTGATCTGAAAGTCCATGCCAAGGGCGACATCGAGATCGACGCACACCACACCGTGGAAGATACCGCCATCGTGCTCGGCCAAGCACTCCTTGACGCTATTGGCGACAAGAAAGGCATCCGCCGTTTCGCATCCTGCCAGCTGCCCATGGATGAGGCATTAGTGGAGTCCGTGGTGGATATCTCCGGTCGCCCATACTTCGTGATCTCCGGCGAACCAGACCACATGATCACCTCCGTGATCGGTGGACACTACGCAACCGTGATCAACGAGCACTTCTTTGAAACCCTCGCGCTCAACTCCCGAATCACCCTCCACGTGATCTGCCACTACGGCCGCGACCCTCACCACATCACCGAAGCAGAATACAAGGCTGTTGCCCGTGCGCTGCGCGGTGCCGTAGAGATGGATCCTCGTCAAACAGGAATCCCATCCACTAAGGGAGCGCTCTAG
SEQ ID NO:4：谷氨酸棒状杆菌B253的hisN：histidinol phosphatase(其中下划线示出待突变为A的第381位碱基G)
ATGAGCAAATATGCAGACGATTTAGCCTTAGCCCTCGAACTCGCCGAACTTGCCGATTCCATCACCCTCGACCGTTTCGAAGCCTCTGACCTGGAAGTATCCTCCAAGCCAGACATGACTCCCGTCAGCGATGCCGACCTGGCGACCGAAGAAGCACTCCGTGAGAAAATCGCCACCGCCCGCCCCGCCGACTCCATCCTCGGTGAAGAATTCGGTGGCGACGTAGAATTCAGCGGCCGCCAGTGGATCATCGACCCCATCGACGGCACCAAAAACTACGTCCGCGGCGTCCCCGTATGGGCAACCCTGATCGCGCTGCTCGACAACGGCAAGCCCGTCGCAGGTGTCATCTCCGCACCCGCACTGGCTAGGCGTTGGTGGGCATCCGAAGGGGCCGGCGCATGGCGCACCTTCAACGGCAGCTCCCCACGCAAGCTGTCCGTGTCCCAGGTGTCCAAGCTTGACGACGCCTCCCTCTCCTTCTCCTCCCTCTCCGGCTGGGCCGAACGAGATTTGCGCGATCAGTTCGTCTCCCTAACTGATACCACCTGGCGACTCCGCGGCTACGGCGACTTCTTCTCCTACTGCCTCGTTGCTGAAGGTGCCGTCGATATCGCCGCTGAACCAGAAGTCAGTCTCTGGGATCTCGCTCCCCTATCAATTCTGGTTACTGAGGCCGGCGGAAAATTCACCTCGCTAGCGGGTGTCGATGGACCACACGGTGGCGATGCAGTAGCCACCAACGGAATCCTGCACGATGAGACGCTGGATCGTTTAAAATAG
SEQ ID NO:5：谷氨酸棒状杆菌B253的HisD：histidinol dehydrogenase(其中下划线示出待突变为T的第487位碱基C)
ATGTTGAATGTCACTGACCTGCGAGGTCAAACACCATCCAAGAGCGACATCCGACGTGCTTTGCCACGTGGTGGCACTGACGTGTGGTCTGTGCTTCCCATAGTGCAGCCTGTTGTAGAAGATGTCCAAAACCGCGGCGCTGAAGCTGCTTTGGATTACGGCGAGAAGTTCGACCATATTCGCCCCGCCTCGGTGCGGGTGCCAGCTGAGGTTATTGCTGCAGCAGAAAACACCTTGGATCCGTTGGTGCGTGAATCGATTGAAGAGTCGATTCGTCGCGTCCGCAAGGTTCACGCTGAGCAAAAGCCAGCCGAGCACACCACTGAACTTTCACCAGGTGGCACCGTCACTGAGCGTTTCATGCCGATTGATCGCGTGGGACTGTACGTTCCAGGCGGCAATGCGGTGTACCCATCAAGCGTGATTATGAATACTGTCCCAGCTCAAGAGGCTGGTGTGAACTCCCTTGTGGTTGCGTCGCCTCCTCAGGCTGAGCACGGTGGCTGGCCTCACCCCACCATTTTGGCGGCGTGTTCCATCTTGGGTGTTGATGAGGTGTGGGCTGTCGGCGGCGGTCAGGCCGTGGCGTTGCTGGCTTATGGTGATGACGCTGCAGGTCTCGAGCCTGTGGATATGATCACTGGACCTGGCAATATCTTTGTCACCGCTGCGAAGCGCCTGGTCAGGGGAGTGGTAGGTACTGATTCTGAGGCTGGCCCTACAGAAATCGCTGTGCTTGCTGATGCCTCTGCCAACGCCGTCAACGTTGCCTACGATCTGATCAGCCAAGCAGAACACGATGTCATGGCTGCGTCCGTGCTCATCACTGACTCCGAGCAGCTTGCCAAGGACGTAAACAGGGAAATCGAGGCGCGTTACTCAATCACGCGCAACGCCGAGCGCGTCGCAGAAGCTTTGCGCGGGGCCCAGAGTGGCATCGTGCTTGTCGACGACATTTCCGTGGGTATCCAAGTAGCCGATCAATACGCAGCGGAACACCTGGAAATCCACACTGAGAACGCGCGCGCCGTAGCAGAGCAGATCACCAACGCGGGTGCGATCTTCGTGGGCGATTTCTCACCAGTACCACTGGGTGATTACTCCGCAGGATCCAACCACGTGCTGCCAACCTCTGGATCCGCTCGTTTCTCCGCAGGTCTATCCACGCACACGTTCCTTCGCCCAGTCAACCTCATTGAATACGATGAGGCTGCTCTGAAGGACGTCTCGCAGGTTGTCATCAACTTTGCCAACGCCGAAGATCTTCCAGCGCACGGCGAAGCAATCCGTGCACGCTTTGAAAACCTCCCCACCACCGACGAGGCCTAA
SEQ ID NO:6：谷氨酸棒状杆菌13032的hisB：imidazoleglycerol-phosphatedehydratase(其中下划线示出待突变为T的第238位碱基C)
ATGACTGTCGCACCAAGAATTGGTACCGCAACCCGCACCACCAGCGAATCCGACATCACCGTCGAGATCAACCTGGACGGCACCGGCAAAGTAGATATCGATACCGGCCTGCCATTTTTCGACCACATGCTCACTGCATTCGGCGTGCACGGCAGTTTTGATCTGAAAGTCCATGCCAAGGGCGACATCGAGATCGACGCACACCACACCGTGGAAGATACCGCCATCGTGCTCGGCCAAGCACTCCTTGACGCTATTGGCGACAAGAAAGGCATCCGCCGTTTCGCATCCTGCCAGCTGCCCATGGATGAGGCATTAGTGGAGTCCGTGGTGGATATCTCCGGTCGCCCATACTTCGTGATCTCCGGCGAACCAGACCACATGATCACCTCCGTGATCGGTGGACACTACGCAACCGTGATCAACGAGCACTTCTTTGAAACCCTCGCGCTCAACTCCCGAATCACCCTCCACGTGATCTGCCACTACGGCCGCGACCCTCACCACATCACCGAAGCAGAGTACAAGGCTGTTGCCCGTGCGCTGCGCGGTGCCGTAGAGATGGATCCTCGTCAAACAGGAATCCCATCCACTAAGGGAGCGCTCTAG
SEQ ID NO:7：谷氨酸棒状杆菌13032的hisN：histidinol phosphatase(其中下划线示出待突变为A的第381位碱基G)
ATGAGCAAATATGCAGACGATTTAGCCTTAGCCCTCGAACTTGCCGAACTTGCCGATTCCATCACCCTCGACCGCTTCGAAGCCTCTGACCTGGAAGTATCCTCCAAGCCAGACATGACTCCCGTCAGCGATGCCGACCTGGCGACCGAAGAAGCACTCCGTGAGAAAATCGCCACCGCCCGCCCCGCCGACTCCATCCTCGGTGAAGAATTCGGTGGCGACGTAGAATTCAGCGGCCGCCAGTGGATCATCGACCCCATCGACGGCACCAAAAACTACGTCCGCGGCGTCCCCGTATGGGCAACCCTGATCGCGCTGCTCGACAACGGCAAACCCGTCGCAGGTGTCATCTCCGCACCCGCACTGGCTAGGCGTTGGTGGGCATCCGAAGGGGCCGGCGCATGGCGCACCTTCAACGGCAGCTCCCCACGCAAACTGTCCGTGTCCCAGGTGTCCAAGCTTGACGACGCCTCCCTCTCCTTCTCCTCCCTCTCCGGCTGGGCCGAACGAGATTTGCGCGATCAGTTCGTCTCCCTAACTGATACCACCTGGCGACTCCGCGGCTACGGCGACTTCTTCTCCTACTGCCTCGTCGCCGAAGGTGCCGTCGATATCGCCGCTGAACCAGAAGTCAGCCTCTGGGATCTTGCTCCCCTGTCCATCCTGGTCACCGAAGCCGGAGGAAAGTTCACCTCACTGGCTGGCGTCGATGGACCACACGGTGGCGATGCAGTAGCCACCAACGGCATCCTGCACGATGAGACGCTGGATCGTTTAAAATAG
SEQ ID NO:8：谷氨酸棒状杆菌13032的HisD：histidinol dehydrogenase(其中下划线示出待突变为T的第487位碱基C)
ATGTTGAATGTCACTGACCTGCGAGGTCAAACACCATCCAAGAGCGACATCCGACGTGCTTTGCCACGTGGTGGCACTGACGTGTGGTCTGTGCTTCCCATAGTGCAGCCTGTTGTAGAAGATGTCCAAAACCGCGGCGCTGAAGCTGCTTTGGATTACGGCGAGAAGTTCGACCATATTCGCCCCGCCTCGGTGCGGGTGCCAGCTGAGGTTATTGCTGCAGCAGAAAACACCTTAGATCCGTTGGTGCGTGAATCGATTGAAGAGTCGATTCGTCGCGTCCGCAAGGTTCACGCTGAGCAAAAGCCATCCGAGCACACCACTGAACTTTCACCAGGTGGCACCGTCACTGAGCGTTTCATGCCGATTGATCGCGTGGGACTGTACGTTCCAGGCGGCAATGCGGTGTACCCATCAAGCGTGATTATGAATACTGTCCCAGCTCAAGAGGCTGGTGTGAACTCCCTTGTGGTTGCGTCGCCTCCTCAGGCTGAGCACGGTGGCTGGCCTCACCCCACCATTTTGGCGGCGTGTTCCATCTTGGGTGTTGATGAGGTGTGGGCTGTCGGCGGCGGTCAGGCCGTGGCGTTGCTGGCTTATGGTGATGACGCTGCAGGTCTCGAGCCTGTGGATATGATCACTGGACCTGGCAATATCTTTGTCACCGCTGCGAAGCGCCTGGTCAGGGGAGTGGTAGGTACTGATTCTGAGGCTGGCCCTACAGAAATCGCTGTGCTTGCTGATGCCTCTGCCAACGCCGTCAACGTTGCCTACGATCTGATCAGCCAAGCAGAACACGATGTCATGGCTGCGTCCGTGCTCATCACTGACTCCGAGCAGCTTGCCAAGGACGTAAACAGGGAAATCGAGGCGCGTTACTCAATCACGCGCAACGCCGAGCGCGTCGCAGAAGCTTTGCGCGGGGCCCAGAGTGGCATCGTGCTTGTCGACGACATTTCCGTGGGTATCCAAGTAGCCGATCAATACGCAGCGGAACACCTGGAAATCCACACTGAGAACGCGCGCGCCGTAGCAGAGCAGATCACCAACGCGGGTGCGATCTTCGTGGGCGATTTCTCACCAGTACCACTGGGTGATTACTCCGCAGGATCCAACCACGTGCTGCCAACCTCTGGATCCGCTCGTTTCTCCGCAGGTCTATCCACGCACACGTTCCTTCGCCCAGTCAACCTCATTGAATACGATGAGGCTGCTCTGAAGGACGTCTCGCAGGTTGTCATCAACTTTGCCAACGCCGAAGATCTTCCAGCGCACGGCGAAGCAATCCGTGCACGCTTTGAAAACCTCCCCACCACCGACGAGGCCTAA
实施例4.产赖氨酸大肠杆菌的构建和测试
为了构建赖氨酸生产菌株，可以将带有解除赖氨酸反馈抑制的dapA E84T和lysCT253R的pTrc99A质粒导入野生型大肠杆菌，使其获得赖氨酸生产能力，我们将之前构建的质粒pTrc99A-dapAE84T-lysCT253R[Geng,F.,et al.(2013).Appl Microbiol Biotechnol 97(5):1963-1971]分别转化到大肠杆菌BW25113-hisBgtg、BW25113△hisB、BW25113-hisDgtg、BW25113△hisD以及BW25113中，获得菌株BW25113-hisBgtg(pTrc99A-dapAE84T-lysCT253R)、BW25113△hisB(pTrc99A-dapAE84T-lysCT253R)、BW25113-hisDgtg(pTrc99A-dapAE84T-lysCT253R)、BW25113△hisD(pTrc99A-dapAE84T-lysCT253R)、BW25113(pTrc99A-dapAE84T-lysCT253R)。
同时，鉴于大肠杆菌中hisC基因编码的酶催化的反应是组氨酸代谢途径的第七步反应，而hisB基因催化的是第六和第八步反应，为了验证hisC的失活是否有助于赖氨酸生产，我们将质粒pTrc99A-dapAE84T-lysCT253R转化到BW25113的单基因敲除库Keiocollection【Baba,T.,et al.(2006).Mol Syst Biol,2,2006 0008】中的一个hisC基因失活的菌株BW25113ΔhisC中，获得菌株BW25113ΔhisC(pTrc99A-dapAE84T-lysCT253R)，对其发酵产赖氨酸情况进行了测试。
利用赖氨酸发酵培养基对这些菌株发酵产赖氨酸情况进行测试，发酵培养基成份为(g/L)：葡萄糖，40；KH2PO4，5；MgSO4，1；(NH4)2SO4，10；FeSO4，0.003；MnSO4，0.003；玉米浆50；KCl，0.7；3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)，42。首先，利用LB培养基过夜培养上述菌株，培养物作为种子接种到每孔含有200μl发酵培养基的96孔深孔板中，接种量为5％，37度培养24小时，孔板摇床转速为800rpm，每个菌株3个平行，发酵结束后检测赖氨酸浓度和葡萄糖消耗量，结果如表4所示。可以看出，与对照菌株相比，hisB、hisD基因分别弱化和失活的菌株其赖氨酸产量大幅提升，耗糖量降低，转化率相应大幅提升。hisC基因失活的菌株，其赖氨酸产量下降。
表4.各工程菌株的赖氨酸生产情况
Figure BDA0001983430210000201
实施例5.产赖氨酸谷氨酸棒杆菌的发酵测试
为了测试谷氨酸棒杆菌中hisB，hisN，hisD基因失活对菌株产赖氨酸的影响，分别将B253，13032(lysCT311I)，以及实施例3中构建的菌株B253-hisBC238T，B253-hisNG381A，B253-hisDC487T，13032(lysCT311I)-hisBC238T，13032(lysCT311I)-hisNG381A，以及13032(lysCT311I)-hisDC487T进行发酵测试，发酵培养基成份为(g/L)：葡萄糖，80；酵母粉8；尿素，9；L-组氨酸，0.25；K2HPO4，1.5；MnSO4，0.01；MgSO4，0.6；FeSO4，0.01；MOPS，42。首先将菌株接种到含有10g/L葡萄糖的LB培养基中过夜培养，培养物作为种子接种到每孔含有200μl发酵培养基的96孔深孔板中，接种量为5％，30度培养24小时，孔板摇床转速为800rpm，每个菌株3个平行，发酵结束后检测赖氨酸产量和葡萄糖消耗量。结果如表5所示，可以看出，与对照菌株相比，谷氨酸棒杆菌中hisB，hisD基因失活能够显著提高赖氨酸产量，hisN基因失活也能够提高菌株生产赖氨酸的能力。
表5.谷氨酸棒杆菌B253中hisB，hisN，hisD基因失活后对赖氨酸生产的影响
菌株 赖氨酸产量(g/L) 葡萄糖消耗(g/L)
B253 5.3±0.12 41.21±0.98
B253-hisB<sup>C238T</sup> 7.45±0.44 40.98±1.13
B253-hisN<sup>G381A</sup> 5.5±0.12 40.49±0.47
B253-hisD<sup>C487T</sup> 5.88±0.24 40.57±1.16
13032(lysC<sup>T311I</sup>) 4.53±0.11 33.91±1.02
13032(lysC<sup>T311I</sup>)-hisB<sup>C238T</sup> 6.04±0.17 32.57±0.95
13032(lysC<sup>T311I</sup>)-hisN<sup>G381A</sup> 4.79±0.08 33.01±1.27
13032(lysC<sup>T311I</sup>)-hisD<sup>C487T</sup> 5.16±0.25 33.26±0.68
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> L-赖氨酸高产菌株及其构建方法和应用
<130> P2018-1786
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1068
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 1
atgagtcaga agtatctttt tatcgatcgc gatggaaccc tgattagcga accgccgagt 60
gattttcagg tggaccgttt tgataaactc gcctttgaac cgggcgtgat cccggaactg 120
ctgaagctgc aaaaagcggg ctacaagctg gtgatgatca ctaatcagga tggtcttgga 180
acacaaagtt tcccacaggc ggatttcgat ggcccgcaca acctgatgat gcagatcttc 240
acctcgcaag gcgtacagtt tgatgaagtg ctgatttgtc cgcacctgcc cgccgatgag 300
tgcgactgcc gtaagccgaa agtaaaactg gtggaacgtt atctggctga gcaagcgatg 360
gatcgcgcta acagttatgt gattggcgat cgcgcgaccg acattcaact ggcggaaaac 420
atgggcatta ctggtttacg ctacgaccgc gaaaccctga actggccaat gattggcgag 480
caactcacca gacgtgaccg ttacgctcac gtagtgcgta ataccaaaga gacgcagatt 540
gacgttcagg tgtggctgga tcgtgaaggt ggcagcaaga ttaacaccgg cgttggcttc 600
tttgatcata tgctggatca gatcgctacc cacggcggtt tccgcatgga aatcaacgtc 660
aaaggcgacc tctatatcga cgatcaccac accgtcgaag ataccggcct ggcgctgggc 720
gaagcgctaa aaatcgccct cggagacaaa cgcggtattt gccgctttgg ttttgtgcta 780
ccgatggacg aatgccttgc ccgctgcgcg ctggatatct ctggtcgccc gcacctggaa 840
tataaagccg agtttaccta ccagcgcgtg ggcgatctca gcaccgaaat gatcgagcac 900
ttcttccgtt cgctctcata caccatgggc gtgacgctac acctgaaaac caaaggtaaa 960
aacgatcatc accgtgtaga gagtctgttc aaagcctttg gtcgcaccct gcgccaggcc 1020
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<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
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ttaatgcgcc cggcgatttc cgcctctgaa agcattaccc gcactgttaa cgatattctc 120
gataacgtga aagcacgcgg cgatgaggcc ctgcgggaat acagcgcgaa gtttgataaa 180
accacggtta ccgcgctgaa ggtgtctgca gaggagatcg ccgccgccag cgaacgcctg 240
agcgacgagc taaaacaggc gatggcggtg gcagtaaaga atattgaaac cttccacact 300
gcgcaaaaac tgccgccggt agatgtagaa acgcagccag gcgtgcgttg ccagcaggtc 360
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acggtattaa tgctggcgac tccggcgagt attgcgggct gtaaaaaagt ggtgctgtgc 480
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gttgccgagg ccgtcgaacg ccaactggca gaactgccgc gtgccgaaac cgcccgccag 900
gcactgaacg ccagccgcct gatcgtgact aaagatttag cgcagtgcgt ggagatctcc 960
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agcatcacca gcgccggttc ggtatttctt ggtgactggt caccggaatc ggcaggtgat 1080
tacgcctccg gcaccaacca cgttctaccg acttacggtt acaccgccac ctgttccagc 1140
ctcgggctgg cagatttcca gaagcgcatg accgtacagg aactgtcgaa agaggggttc 1200
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<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
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cccatggatg aggcattagt ggagtccgtg gtggatatct ccggtcgccc atacttcgtg 360
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gcgctgcgcg gtgccgtaga gatggatcct cgtcaaacag gaatcccatc cactaaggga 600
gcgctctag 609
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<212> DNA
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atcaccctcg accgtttcga agcctctgac ctggaagtat cctccaagcc agacatgact 120
cccgtcagcg atgccgacct ggcgaccgaa gaagcactcc gtgagaaaat cgccaccgcc 180
cgccccgccg actccatcct cggtgaagaa ttcggtggcg acgtagaatt cagcggccgc 240
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<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<400> 8
atgttgaatg tcactgacct gcgaggtcaa acaccatcca agagcgacat ccgacgtgct 60
ttgccacgtg gtggcactga cgtgtggtct gtgcttccca tagtgcagcc tgttgtagaa 120
gatgtccaaa accgcggcgc tgaagctgct ttggattacg gcgagaagtt cgaccatatt 180
cgccccgcct cggtgcgggt gccagctgag gttattgctg cagcagaaaa caccttagat 240
ccgttggtgc gtgaatcgat tgaagagtcg attcgtcgcg tccgcaaggt tcacgctgag 300
caaaagccat ccgagcacac cactgaactt tcaccaggtg gcaccgtcac tgagcgtttc 360
atgccgattg atcgcgtggg actgtacgtt ccaggcggca atgcggtgta cccatcaagc 420
gtgattatga atactgtccc agctcaagag gctggtgtga actcccttgt ggttgcgtcg 480
cctcctcagg ctgagcacgg tggctggcct caccccacca ttttggcggc gtgttccatc 540
ttgggtgttg atgaggtgtg ggctgtcggc ggcggtcagg ccgtggcgtt gctggcttat 600
ggtgatgacg ctgcaggtct cgagcctgtg gatatgatca ctggacctgg caatatcttt 660
gtcaccgctg cgaagcgcct ggtcagggga gtggtaggta ctgattctga ggctggccct 720
acagaaatcg ctgtgcttgc tgatgcctct gccaacgccg tcaacgttgc ctacgatctg 780
atcagccaag cagaacacga tgtcatggct gcgtccgtgc tcatcactga ctccgagcag 840
cttgccaagg acgtaaacag ggaaatcgag gcgcgttact caatcacgcg caacgccgag 900
cgcgtcgcag aagctttgcg cggggcccag agtggcatcg tgcttgtcga cgacatttcc 960
gtgggtatcc aagtagccga tcaatacgca gcggaacacc tggaaatcca cactgagaac 1020
gcgcgcgccg tagcagagca gatcaccaac gcgggtgcga tcttcgtggg cgatttctca 1080
ccagtaccac tgggtgatta ctccgcagga tccaaccacg tgctgccaac ctctggatcc 1140
gctcgtttct ccgcaggtct atccacgcac acgttccttc gcccagtcaa cctcattgaa 1200
tacgatgagg ctgctctgaa ggacgtctcg caggttgtca tcaactttgc caacgccgaa 1260
gatcttccag cgcacggcga agcaatccgt gcacgctttg aaaacctccc caccaccgac 1320
gaggcctaa 1329
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<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gccagcgcgt cattgacgcc ttacgtgcgg agcaagtttg gtgagtcaga agttcatgtg 60
cagctccatc ag 72
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gttcgctaat cagggttcca tcgcgatcga taaaaagata cttctgactc accaaacttg 60
ctccgcacgt aaggcgcaac gtcatctcgt tctccg 96
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcactcggcg gttcgctaat cagggttcca tcgcgatcga ttacttctga ctcaccaaac 60
ttgctccgca cgtaaggcgc aacgtcatct cgttctccg 99
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caattctggt cctgccgatt gagaagatga tggagtgatc gccgtgagct tcatgtgcag 60
ctccatcag 69
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gttgctccgc agtacagcta ttccagtcaa tgattgtgtt aaagctcacg gcgatcactc 60
catcatcttc tcaatcggca acgtcatctc gttctccg 98
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<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcgttgttgc tccgcagtac agctattcca gtcaatgatt agctcacggc gatcactcca 60
tcatcttctc aatcggcaac gtcatctcgt tctccg 96
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttcacaagca ctccttgacg ctat 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaacatagcg tcaaggagtg cttg 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttcactcagg ctgagcacgg tggc 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aaacgccacc gtgctcagcc tgag 24

Claims (17)

1.一种L-赖氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，遗传改造所述L-赖氨酸生产菌株细胞中的咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中的一种或几种，使之在胞内弱化或失活；所述菌株是大肠杆菌 (E. coli)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)；
所述大肠杆菌中的咪唑甘油磷酸酯脱水酶和组氨醇磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ IDNO: 1所示核苷酸序列编码，所述谷氨酸棒状杆菌的咪唑甘油磷酸酯脱水酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 6所示核苷酸序列编码；
所述大肠杆菌中的组氨醛/组氨醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列编码，所述谷氨酸棒状杆菌中的组氨醛/组氨醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:8所示核苷酸序列编码。
2.如权利要求1所述的L-赖氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，与内源性咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶相比，所述L-赖氨酸生产菌株的L-赖氨酸产量提高至少8%。
3.如权利要求2所述的L-赖氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，与内源性咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶相比，所述L-赖氨酸生产菌株的L-赖氨酸产量提高至少15%。
4.如权利要求3所述的L-赖氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，与内源性咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶相比，所述L-赖氨酸生产菌株的L-赖氨酸产量提高至少20%。
5.如权利要求4所述的L-赖氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，与内源性咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶相比，所述L-赖氨酸生产菌株的L-赖氨酸产量提高至少25%。
6.如权利要求5所述的L-赖氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，与内源性咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶相比，所述L-赖氨酸生产菌株的L-赖氨酸产量提高至少30%。
7.如权利要求6所述的L-赖氨酸生产菌株的构建方法，其特征在于，与内源性咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶相比，所述L-赖氨酸生产菌株的L-赖氨酸产量提高至少35%。
8.一种L-赖氨酸的生产菌株，所述菌株经遗传改造咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中的一种或几种在细胞内弱化或失活；所述菌株是大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌；
所述大肠杆菌中的咪唑甘油磷酸酯脱水酶和组氨醇磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ IDNO: 1所示核苷酸序列编码，所述谷氨酸棒状杆菌的咪唑甘油磷酸酯脱水酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 6所示核苷酸序列编码；
所述大肠杆菌中的组氨醛/组氨醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列编码，所述谷氨酸棒状杆菌中的组氨醛/组氨醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:8所示核苷酸序列编码。
9.如权利要求8所述的L-赖氨酸生产菌株，其特征在于，与内源性咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶相比，所述L-赖氨酸高产菌株的L-赖氨酸产量提高至少8%。
10.如权利要求9所述的L-赖氨酸生产菌株，其特征在于，与内源性咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶相比，所述L-赖氨酸高产菌株的L-赖氨酸产量提高至少15%。
11.如权利要求10所述的L-赖氨酸生产菌株，其特征在于，与内源性咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶相比，所述L-赖氨酸高产菌株的L-赖氨酸产量提高至少20%。
12.如权利要求11所述的L-赖氨酸生产菌株，其特征在于，与内源性咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶相比，所述L-赖氨酸高产菌株的L-赖氨酸产量提高至少25%。
13.如权利要求12所述的L-赖氨酸生产菌株，其特征在于，与内源性咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶相比，所述L-赖氨酸高产菌株的L-赖氨酸产量提高至少30%。
14.如权利要求13所述的L-赖氨酸生产菌株，其特征在于，与内源性咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶相比，所述L-赖氨酸高产菌株的L-赖氨酸产量提高至少35%。
15.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求1所述的在胞内弱化或失活的咪唑甘油磷酸酯脱水酶、组氨醇磷酸化酶、组氨醛/组氨醇脱氢酶中的一种或几种的编码核苷酸。
16.一种制备L-赖氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
1) 培养权利要求8-14中任一项所述的L-赖氨酸生产菌株，使之产生L-赖氨酸；和
2) 任选地从步骤1)所得到的培养液中分离L-赖氨酸。
17.利用权利要求1-7中任一项所述的构建方法构建的L-赖氨酸生产菌株、权利要求8-14中任一项所述的L-赖氨酸生产菌株、权利要求15所述的载体在生产L-赖氨酸中的应用。
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